KR101523698B1 - 사람 암 줄기세포 - Google Patents

사람 암 줄기세포 Download PDF

Info

Publication number
KR101523698B1
KR101523698B1 KR1020097017268A KR20097017268A KR101523698B1 KR 101523698 B1 KR101523698 B1 KR 101523698B1 KR 1020097017268 A KR1020097017268 A KR 1020097017268A KR 20097017268 A KR20097017268 A KR 20097017268A KR 101523698 B1 KR101523698 B1 KR 101523698B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
stem cells
cells
cell
cancer stem
human
Prior art date
Application number
KR1020097017268A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20100033471A (ko
Inventor
제니 피. 마더
페넬로프 로버츠
Original Assignee
마크로제닉스 웨스트 인코퍼레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 마크로제닉스 웨스트 인코퍼레이티드 filed Critical 마크로제닉스 웨스트 인코퍼레이티드
Publication of KR20100033471A publication Critical patent/KR20100033471A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101523698B1 publication Critical patent/KR101523698B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0693—Tumour cells; Cancer cells
    • C12N5/0695—Stem cells; Progenitor cells; Precursor cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

본 발명은 사람 암 줄기세포의 분리된 집단을 개시한다. 또한, 사람 암 줄기세포의 특성화, 분리 및 배양 방법이 개시된다. 사람 암 줄기세포의 용도가 제공된다.
Figure 112009050594253-pct00001
사람 암 줄기세포, 항원, 항체, 치료, 종양, 면역반응

Description

사람 암 줄기세포{HUMAN CANCER STEM CELLS}
본 출원은 2007년 1월 22일자 제출된 제60/881,497호, 2007년 3월 23일자 제출된 제60/907,180호, 2007년 5월 4일자 제출된 제60/924,247호, 2007년 7월 19일자 제출된 제60/950,714호, 2007년 9월 14일자 제출된 제60/972,613호의 가 출원의 우선권을 주장하며, 이들 모두는 그 전문이 본원에 참고자료로 포함된다.
기술분야
본 발명은 일반적으로 사람 암 줄기세포 및 이들의 분리, 특성화 및 사용을 위한 방법에 관한 것이다. 더 구체적으로, 본 발명은 또한 사람 암 줄기세포를 확인하는 방법, 및 치료법, 표적/약물 발견, 항종양 백신 그리고 암의 진단과 치료에서 이들을 사용하는 것에 관한 것이다.
환자의 몸에서 암을 제거하는 것은 힘든 일인데, 왜냐하면 암 세포가 통제되지 않는 방식으로 증식함에도 신체가 암 세포를 반드시 "이물질"로서 인식하지는 않기 때문에 표적화하기가 어렵기 때문이다. 기존 암 치료는 암 세포에 대한 표적화가 충분하지 않아서 환자의 건강한 조직까지 파괴되는 경향이 있다. 이러한 치료는 전형적으로 X-선, 화학요법, 양성자요법, 및 수술을 포함한다. 신체의 면역 시스템을 자극하여 이러한 암 세포들에 대항하는 양성 면역반응을 이끌어내는 치료 가 바람직할 것이다.
암 세포는 암-관련 항원을 발현하지만, 암 항원을 면역 시스템에게 숨길 수 있고 및/또는 노출된 항원이 사람의 면역 시스템이 정상적으로 인식하거나 견디어내는 돌연변이되지 않은 정상적인 분화 분자 또는 단백질이기 때문에 암 세포는 대체로 면역반응을 피해갈 수 있다. 또한, 암 줄기세포는 현재의 화학요법 및 방사선요법들에 내성인 것으로 보고되었다(예를 들어, 암 줄기세포에 대한 표적 요법: 패치 경로 및 ABC 수송인자. Oncogene, (2007) 26(9): 1357-60.; 뇌종양에서의 방사선 내성 및 줄기-유사 세포. Cancer Cell, (2006); 10(6):454-6.; WNT/베타-카테닌에 의한 마우스 유방 선조세포의 방사선 내성 매개. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2007) 104(2):618-23. Epub 2007 Jan 3. 참조).
면역요법을 효과적으로 사용하여 암을 치료하기 위해서는 암 부위에 도달할 수 있고 또한 암 세포의 파괴가 가능한 이펙터 메커니즘을 가질 수 있는 암-반응성 림프구를 환자가 충분한 수만큼 가지거나, 또는 이러한 림프구가 환자에게 제공되어야 한다.
조사 중인 일부 요법은 일반적으로 면역반응의 증강을 목표로 하며, 예를 들어 사이토카인(예를 들어, IL-2 및/또는 IL-12), 텔로머라제 특이적 림프구, 면역 시스템을 증강시키는 박테리아 추출물 또는 약물과 같은 화학적 메신저의 투여를 포함한다. 면역반응을 종양 세포에 더욱 특이적으로 만들기 위한 시도로서, 일부 치료는 사이토카인 - 예를 들어, GM-CSF, 감마 인터페론 또는 IL-2, 개별적으로 또는 조합하여 - 과 조합된, 또는 이들 사이토카인을 암호화하는 유전자로 트랜스펙 션된 자기조직 종양 세포를 투여한다. 자기조직 림프구를 생체외에서 암 세포에 감응하게 만든 다음 환자에게 다시 주입하는 세포-전달 요법에서 일부 성공 사례가 관찰되었다. 유사한 접근법은 자기조직 종양 세포 대신에 종양 셀라인을 이용한다.
암 백신 면역요법은 흔히 보조제와 함께 사용된다. 한 접근법은 매우 효능 있는 항원-제시 세포인 수지상 세포(DC)를 사용하여 환자에서 양성 항암 면역반응을 일으킨다. 수지상 세포는 MHC I 형 및 MHC II 형 분자, 공-자극 분자 및 유착 분자를 발현하며, 이들은 자생 T 세포, CD4+ T-헬퍼 세포, CD8+ 세포독성 T 림프구(CTL), 자연살상(NK) 및 흉선 유래 NK 세포(NKT)의 자극에 대한 신호를 제공한다. DC는 다양한 타입의 분자를 흡수하는 능력을 가진다. 따라서, DC에 다양한 형태의 종양-관련 항원(TAA)을 적재시켜 백신으로서 투여할 수 있다.
한 DC-기반 접근법은 지속적인 암 항원 발현과 DC의 항원-제시 및 면역자극 능력을 조합하기 위해 암 세포와 수지상 세포를 융합시켜 만든 DC-암 세포 하이브리드를 사용한다. 동물 모델에서 DC-암 세포 하이브리드를 사용한 면역화는 어떤 형태의 항암 보호를 제공하거나 확립된 질환을 근치시킨다. 암 셀라인 또는 원발성 사람 암 세포(유방 암종 세포를 포함하는)로 이루어진 자기조직 DC 하이브리드는 시험관내에서 자기조직 암 세포 타입에 대항하는 CTL 반응을 유도하는 것으로 나타났다. 신장세포 암종 및 신경교종 치료에 대한 임상 연구는 DC-암 세포 하이브리드를 사용한 백신접종이 환자에서 항암 면역반응을 안전하게 유도할 수 있음을 증명했다.
종양이 어떻게 성장하고 전이되는지 설명하는 한 가설이 바로 암 줄기세포 가설인데, 이 가설은, 비교적 복제 능력에 제한되어 무한히 자기-재생할 수 있고 더욱 성장한 종양 세포(들)로 발달될 수 있는, 세포들의 분리된 작은 하위부분이 각 종양 내에 있음을 말하고 있다. 이런 암 줄기세포(CSC)는 화학요법제, 방사선 또는 다른 독성 조건에 더 내성일 가능성이 있으며, 따라서 임상 요법 후에도 지속되고, 이후에도 속발성 종양으로 성장하거나, 전이되거나 또는 재발을 일으킨다는 것이 가설로 세워졌다. CSC는 조직 줄기세포 또는 더 분화된 조직 선조세포(들)로부터 발생할 수 있다고 제안되었다. 조혈줄기세포 및 선조세포 및 조혈성 종양에 대해서는 이런 가설을 지지하는 강력한 데이터가 있지만, 고상 종양 및 이들 각각의 CSC에 대해서는 덜 알려져 있다.
고상 종양은 줄기세포 집단을 함유하는 기관에서 발생된다고 생각된다. 이들 조직의 종양은 새로운 종양을 증식하고 형성하는 능력이 현저히 다른 이종성 암 세포 집단들로 구성된다. 이런 종양-형성 능력의 차이는, 예를 들어 유방암 세포와 중추신경계 종양에서 보고되었다. 대부분의 암 세포는 제한된 분할 능력을 가지지만, 최근의 문헌은 암 줄기세포라고 명명된 암 세포 집단이 광범하게 자기-재생하여 새로운 종양을 형성할 수 있는 독점적인 능력을 가진다고 제안한다. 점점 많아지고 있는 증거는 정상 줄기세포의 자기-재생을 조절하는 경로가 암 줄기세포에서는 조절이 되지 않거나 변경됨으로써, 자기-재생 암 세포의 계속적인 확장과 종양 형성을 이끌어낸다는 것을 시사한다.
암 환자의 예후가 줄기세포 표현형/생태학과 관련된다는 것이 제안되었다(예 를 들어, 분자 프로파일링에 의해 소아 아교모세포종의 예후적 하위그룹이 확인되며, 종양에서 YB-1 발현 증가가 나타난다. J. Clin. Oncol. (2007) 25(10): 1196-208.; 암 줄기세포는 암 치사율의 90%를 차지하는 전이에서 중추적 역할을 한다. Cell Res. (2007) 17:3-14. 참조). 또한, 자기-줄기세포에 대한 자가면역반응을 가진 환자는 암 진행이 감소된다는 것이 관찰되었다(예를 들어, "암 줄기세포에 대한 면역성은 전암성 상태를 가진 사람에서 완전히 성숙된 질환으로 발전하는 것을 막는데 도움이 될 수 있다" Exp. Med. (2007) 204(4):831-40. 참조).
조직 줄기세포는 이들을 적합한 발달 및 대사 상태로 유지하는데 중요한 특정 니치(niche) 또는 미세환경에 존재한다. 이런 미세환경들은 아직 완전히 이해되지 않았지만, 중요한 인자의 유전적 녹아웃에 의한 이들의 파괴는 발생과정 동안과 성체에서 모두 줄기세포 항상성의 조절을 불가능하게 할 수 있다. 조직 줄기/선조세포를 지원하는 미세환경을 이해하기 위한 시도로서, 많은 연구자들이 배지, 기질 및 물리적 환경에 의해 특정한 태아 및 신생아 조직 줄기/선조세포(SPC)를 SPC가 복제는 되지만 분화될 수는 없는 한정된 상태로 유지하기 위한 최적화된 환경을 만드는 혈청 무함유 배양조건을 유도하는 접근법을 취하고 있다(예를 들어, 미국특허 제6,436,704호 및 제6,416,999호 참조). 상이한 타입의 SPC에 대해서 각기 다른 최적화된 배지 및 배양 조건은 이들 세포가 생체내에서 점유하는 줄기세포 니치를 다시 만들어서 찾을 수 있다. 이런 배지 및 최적화된 조건은 이들이 SPC만을 특정하게 선별하고, 조직 내 다른 세포 타입의 생존 및/또는 성장은 지원할 수 없다는 점에서 SPC에 특정하게 맞춰진다. 결국, 비-SPC 세포는 SPC-선호 조건 하 에서는 생존 및 복제될 수 없을 것이고, 배양 및 계대 동안 손실되며, 이로써 출발 배양물질에 SPC가 매우 적은 퍼센트로 존재할 때에도 순수한 SPC 집단만이 남게 된다. 또한, 이런 조건은 SPC의 추가의 분화에 대한 어떤 신호를 제거하여 SPC가 더 오랜 시간 동안 배양물에 유지되도록 함에 틀림없다.
종양이 발원하는 방식에 대한 한 가설은 종양이 일련의 돌연변이에 의해 조직 SPC로부터 발생한다는 것이다. 일부 종양 세포가 특정한 SPC 니치에 "본거지를 두고" 있으면서 전이 과정 동안 체내를 돌아다닐 것이라는 것을 시사하는 데이터가 존재한다. 또한, SPC의 생존 및 성장을 지원하도록 유도된 배지 및 최적화된 배양 조건은 CSC의 성장 및 생존을 우선적으로 지원할 가능성도 있어서, 배양물에 종양을 분산시켜 놓았을 때 이 타입의 세포를 선별할 수 있을 것이다. 이러한 배지 및 최적화된 배양 조건에 의해 희귀한 CSC 표현형의 특징들의 장기적 또는 광범한 성장 및 유지가 가능한 순수한 CSC 배양물을 확립할 수 있다.
종양 줄기세포는 가설이며, 이들 세포를 확인하는 신뢰할 만한 길은 아직 존재하지 않고, 이들의 특징들에 대한 합의 또한 존재하지 않는다. 일부 연구자들은 암 줄기세포가 마커 발현에 기초하여 확인될 수 있다는 것을 제안하였다(예를 들어, Al-Hajj et al. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:3983-3988.; O'Brien et al. (2007) Nature 445:106-110.; 및 Clarke et al. (2006) Cell 124:1111-5. 참조). CD133이 뇌종양의 암 줄기세포 및 사람 전립선 상피 줄기에서 발견되는 마커로서 제안되었다. 아주 적은 CD24 발현에 수반된 CD44 발현은 일부 고상 암 줄기세포(예를 들어, 유방암)에 의해 발현되는 것으로 가설이 세워졌다. CD34는 혈 관 표면 및 미성숙 혈액 세포에 존재하는 마커로서, 조혈 줄기세포와도 관련된다.
순수한 CSC 배양물의 확립은 종양형성 및 전이의 조절을 연구하고 이해하는데 있어서 그리고 암의 CSC-관련 요법을 발견하고 개발하는데 있어서 매우 유리할 것이다. 따라서, 암 줄기세포를 확인, 분리, 배양 및 특성화하는 방법이 필요하다.
여기 설명된 본 발명은 상기 언급된 충족되지 않은 요구 및 단점들을 대부분 극복하였으며, 사람 암 줄기세포의 분리, 유지 및 성장 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 암 줄기세포 특징들의 유형을 설명하는 한편, CSC의 생물학적 특징을 가진 결장, 전립선, 폐, 췌장, 유방, 맨틀세포 림프종, 및 Merkel 종양으로부터의 새로운 세포 집단의 특징들을 구체적으로 설명한다.
또한, 본 발명은 CSC-기반 백신의 투여와 상기 설명된 치료법들을 통해 암을 치료하고, 암을 예방하고, 암의 발병을 지연시키고, 또는 암의 진행을 지연시키기 위한 간단하며 효과적이고 유능한 방법을 제공한다.
도 1은 규정된 세포배양 배지를 사용한 전립선 암종 종양(PRCA)로부터 CSC 콜로니의 선택적 성장을 나타낸다.
도 2는 해당 암 줄기세포 타입에 선택적인 규정된 배지에서 배양된 기저세포 암종(BCCA1)으로부터 유래된 일련의 CSC 콜로니를 나타낸다.
도 3은 결장(패널 A-C, F), Merkel 세포(패널 D) 및 전립선(패널 E) 종양으로부터 성장한 유사하지만 구별되는 형태를 가진 CSC 콜로니를 나타낸다. 패널 A 및 B는 결장 종양으로부터 유래된 배양물을 나타낸다: 배양 42일째의 일차 배양물(A) 및 3일 후의 동일한 배양 영역(B). A에서 보이는 작은 원형 세포(화살표 삽입)는 여전히 분할중이지만, 배양물 중의 다른 세포는 모두 죽었음을(B) 유의한다. 도 3C는 거의 완전히 줄기세포가 된 1회 계대 후의 결장 CSC를 나타낸다. 패널 A, B 및 D-F는 CSC가 보이기 시작하고, 종양의 비-줄기 성분은 정지 상태거나 죽고 있는 중이거나 이미 죽은 1차 배양물을 나타낸다. 이들 배양물을 계속 계대하여 모두 본 발명의 CSC 라인으로 만들었으며, CRCA1115(A, B), RECA0515(C), MCC(D), PRCA0611(E), 및 CRCA0404(F)로 표시한다.
도 4는 SCID 마우스의 신장 캡슐 밑의 다양한 셀라인으로부터 형성된 종양의 사진을 나타낸다. 왼쪽은 7주(A - RECA1208) 또는 8주(B - RECA0515) 동안 성장시킨 2개 결장 CRC의 각 100개 세포로부터 형성된 종양이다. 두 경우 모두 실질적인 종양이 보인다. 가운데 패널은 5x104개의 CRCA1115 결장 CSC(C) 세포를 이식한 동물에서 4.5주 후의 종양 형성 또는 10배(5x105)의 비-CSC RECA0705(D)를 이식한 동물에서 8주 후의 종양 형성을 나타낸다. D에서 보이는 흰색의 섬유질 물질은 이식물의 콜라겐으로부터 유래한 것이다; 굴절성인 물질은 지방이다. 이 종양에서 사람 DNA 아웃/인 비는 <1.0이다. 마지막 2개 패널은 CSC로부터의 5x105 개의 전립선 종양 세포를 이식한 후의 신장이다. CSC(E - PRCA0425) 세포-유래 종양은 8주 후에 나타난다. 이들 세포는 분명히 4.5주에 패널 C에 보인 결장 CSC보다 더 느리게 성장하지만, 100개 세포로부터 종양을 형성한다. 마지막으로, 패널 F는 5주 동안 2.5x105 개의 PRCA0312-43STR 세포를 이식한 후의 신장이다. 종양은 보이지 않는다. 따라서, 이 SRC 이종이식편 모델을 사용하여 비-CSC 라인과 CSC 라인이 분명히 구별된다.
도 5는 본 발명의 결장(CRCA0404) 및 Merkel 암 줄기세포 라인을 사용하여, KID24로 알려진 항체가 마우스의 신피막하(subrenal capsule)에 확립된 암 줄기세포 전이 모델에서 종양의 성장을 감소시킨다는 것을 나타낸다.
도 6은 전이에 대한, 구체적으로 신피막하에 확립된 종양으로부터 췌장을 포함한 다수의 기관으로 전이한 Merkel 세포 암에 대한 KID24로 알려진 항체의 효과를 나타낸다. 실시예에 설명된 huDNA에 대한 QPCR을 사용하여 전이를 정량한다.
본 발명은 종양 생태학 및 세포 생태학의 분야에 관한 것이다. 한 양태로서, 본 발명은 종양 조직으로부터 배양된 분리된 암 줄기세포 집단에 관한 것이다. 이 세포들은 혈청 무함유 영양 배지에서 배양될 수 있으며, 세포 표면에 혈청 생체분자가 실질적으로 없을 수 있다. 이 세포들은 노쇠하거나 성장 능력을 손실하지 않고 연장된 시간 동안 배양물에 유지될 수 있다.
본 발명의 암 줄기세포는 약물 스크리닝에, 질환 조직의 게놈 및 단백체 프로파일(시험관내, 생체내 및 전이 상태)의 도구로서, 다가 암 줄기세포 백신의 도구로서, 암-관련 항원의 진단 및 조영 도구로서, 그리고 항체 및 약물과 같은 치료제의 확인을 위한 도구로서 유용하다.
본 발명의 다른 양태는 노쇠하거나 성장 능력(자기-재생 능력)을 손실하지 않고 배양물에서 유지될 수 있는 실질적으로 순수한 사람 암 줄기세포 집단을 분리하는 방법에 관한 것이다. 이들 방법은 이들의 성장을 위해 최적화된 환경에서 사람 암 줄기세포를 배양하는 것에 기초한다. 사람 암 줄기세포의 배양을 위한 영양 배지는 상응하는 태아 선조/줄기세포의 성장을 지원하도록 최적화된 배지 조제물에 기초한다.
본 발명의 다른 양태는 기능 분석을 통해 이와 같은 실질적으로 순수한 사람 암 줄기세포 집단을 특성화하는 방법들에 관한 것이다. 이러한 방법들은 본 분야에 공지되어 있으며, 본 발명의 사람 암 줄기세포의 특성화에 적합하다. 일반적인 이러한 방법은 적은 수의 사람 암 줄기세포를 이식하여 면역-손상 숙주 동물에서 종양을 형성하는 이종이식편 모델이다.
본 발명의 다른 양태는 종양(암) 줄기세포 배양물의 특성화 방법을 제공한다. 이러한 특성화는, 제한은 아니지만 조혈 줄기세포와 본래 관련이 있는 마커인 CD34를 포함한 어떤 마커의 발현을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 비-사람 포유동물 수용자에 사람 암 줄기세포 집단을 도입함으로써 사람 종양 이종이식편 모델을 생성하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 사람 암 줄기세포 또는 그 단편을 면역원으로 사용하는 방법 및 면역원으로 사용될 수 있는 분리된 암 줄기세포를 적절히 제공하는 방법에 관한 것이다. 이들 방법은 항암 줄기세포 치료제 및 진단제를 만드는데 유용하며, 개체의 면역반응을 증강시키기 위한 백신으로서도 유용하다. 백신은 치료적으로 또는 예방적으로 사용될 수 있다. 치료 백신은 암을 치료하기 위해 암 환자에게 투여된다. 암 환자에서 백신은 환자 자신의 암 세포로부터, 또는 동종성 암 세포 또는 종양 셀라인으로부터 제조될 수 있다. 예방 백신은 암이 발생할 위험을 감소시키기 위해 암이 없는 피험자에 투여된다.
본 발명의 또 다른 양태는 제약학적 약물의 개발을 위한 생물학적 성분으로서 사람 암 줄기세포의 공급원을 제공하는 방법을 제공하며, 이때 사람 암 줄기세포 배양물이 암 줄기세포 생물학적 성분의 공급원으로서 사용되고, 이들 사람 암 줄기세포 생물학적 성분 중 하나 이상이 개발 중인 약물의 표적이 된다.
본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 생물학적 분석 개발에 사용하기 위한 사람 암 줄기세포 배양물을 제공하는 방법에 관한 것이다. 사람 암 줄기세포 배양물은 사람 암 줄기세포의 성장 및/또는 생존에 영향을 미칠 수 있는 인자, 제제, 또는 성분을 확인하기 위해 생물학적 분석에 사용될 수 있다. 이러한 영향은 성장 촉진, 성장 정지, 정체, 죽음, 세포자살, 대사 변화, 유전자 발현 변화, 단백질 발현 변화, 또는 성장/대사 경로의 변경을 포함할 수 있다. 암 줄기세포는 종양형성, 종양확립, 종양성장 및 전이의 분자 경로를 이해하기 위한 생물학적 분석 및/또는 약물 발견에 사용될 수 있다.
본 발명의 상세한 설명
이하, 당업자가 본 발명을 실시하는데 도움이 되도록 본 발명을 상세히 설명한다. 이런 상세한 설명은 본 발명을 제한하지 않으며, 당업자는 본 발명의 사상과 범위를 벗어나지 않고 여기 개시된 구체예를 변형시킬 수도 있다. 본 명세서 곳곳에서 여러 간행물, 특허, 및 공개된 명세서가 인용 참조된다. 이런 간행물, 특허, 및 공개된 특허의 내용은 그 전체가 본 명세서에 포함된다.
다른 언급이 없다면 본 발명의 실시에는 면역학, 분자생물학, 미생물학, 세포생물학 및 재조합 DNA 분야의 종래 기술이 사용되며, 이런 기술은 당업자의 기술범위 내이다. 예를 들어, Molecular Cloning : a laboratory manual, 2nd edition, Sambrook, et al.(1989); Current Protocols In Molecular Biology, F.M. Ausubel, et al., eds., (1987); the series Methods In Enzymology, Academic Press, Inc.; PCR 2: A Practical Approach, M. J. MacPherson, B. D. Hames and G.R. Taylor, eds., (1995); Antibodies, A Laboratory Manual, Harlow and Lane, eds. (1988); Adult and Pediatric Urology, J. Gillenwater et al., eds., (2002); 및 Animal Cell Culture, R. I. Freshney, ed. (1987)를 참조한다.
명세서와 청구범위에 사용된 단수형태 "한", "어떤", 및 "그"는 문맥상 분명히 다른 의미가 아니라면 복수를 포함한다. 예를 들어, 용어 "한 세포"는 세포 혼합물을 포함하여 복수의 세포를 포함한다.
명세서와 청구범위에서 사용된 용어 "암 줄기세포(들)" 및 "CSC"는 상호 교환 가능하며, 고상 암 줄기세포를 말한다. CSC는 포유동물의 것이며, 바람직한 구체예에서 이들 CSC는 사람 기원이지만, 그것에 제한되는 것은 아니다. 본원에서 사용된 "종양 줄기세포"는 전형적으로 사람의 고상 종양으로부터 분리되어 배양된 세포를 말하며, 암 줄기세포와 상호 교환하여 사용된다.
암 줄기세포는 적합한 조건 하에 시험관내에서 무한히 성장할 수 있고(자기-재생 능력), 아주 적은 수의 세포를 사용하여 생체내에서 종양을 형성할 수 있는 종양 세포의 작은 하위부분으로서 정의되고 기능적으로 특성화된다. CSC를 특성화하는 다른 보편적인 접근법은 형태학 및 세포 표면 마커, 전사 프로파일, 및 약물 반응의 시험을 포함한다.
본 발명의 구체예에서, 다수의 종양 타입으로부터 다수의 CSC 라인이 확립되었다. 이들 CSC는 어떤 특징적인 세포 표면 항원을 공유하며, 그 외에는 상이하다. 본 발명의 CSC 라인의 일부 구체예는 무한히 성장할 수 있고, 20개 미만의 세포로부터 생체내에서 종양을 형성할 수 있다. 일부 CSC는 신피막하 동물 모델 또는 오르토토픽(orthotopic) 방식 이종이식편에서 자발적으로 전이된다. 본 발명의 CSC 라인 및 CSC 전이부로부터 유래된 셀라인은 CD34 및 CD44 발현과 같은 세포 표면 마커 발현에 특징적인 변화를 가진다. 마커 발현은 동물에서 배양 조건 및 셀라인 계대에 따라서 변할 수 있다.
여기 설명된 암 줄기세포 라인들은 세포 표면 항원의 차등 출현에 대해 시험되었다. 또한, 세포 표면 항원의 출현 패턴은 동물에서 셀라인의 계대 후에, 상이한 배양 조건에서(동물-유래 산물이 있든 없든), 그리고 원발성 종양과 전이 종양 간에 다르지만, 설명된 바람직한 배지에 세포가 유지된 때에는 다수의 시험관내 계대 이상에서 안정하다. 세포 표면 항원 및 세포 마커 변화의 이런 패턴은 본 발명의 암 줄기세포를 확인하고 특성화하는데 유용하다.
"항체"는 항원과 결합할 수 있는 면역글로불린 분자이다. 이 용어는 본원에서 완전한 면역글로불린 분자뿐만 아니라, 항-유전자형(anti-idiotypic) 항체, 돌연변이, 단편, 융합 단백질, 사람화 단백질 및 필요한 특이성을 지닌 항원 인식 부위를 포함하는 면역글로불린 분자의 변형을 모두 포괄하여 사용된다.
"단클론성 항체"는 동종성 항체 집단을 말하며, 이때 단클론성 항체는 선택적 항원 결합에 관련되는 아미노산(자연발생 및 비-자연발생)들로 이루어진다. 단클론성 항체는 고도로 특이적이며, 단일 항원 부위에 대해 지정된다. 용어 "단클론성 항체"는 완전한 단클론성 항체 및 전장 단클론성 항체뿐만 아니라, 이들의 단편(Fab, Fab', F(ab')2, Fv), 단쇄(ScFv), 돌연변이, 항체 일부를 포함하는 융합 단백질, 사람화 단클론성 항체, 키메라 단클론성 항체, 및 필요한 특이성과 항원 결합 능력을 지닌 항원 인식 부위를 포함하는 면역글로불린 분자의 어떤 다른 변형된 형태를 포괄한다. 이것은 항체의 공급원 또는 항체가 만들어진 방식(예를 들어, 하이브리도마, 파지 선택, 재조합 발현, 트랜스제닉 동물 등에 의한)에 관한 제한을 의도하지는 않는다.
"사람화" 항체는 비-사람 종의 면역글로불린으로부터 유래된 항원-결합 부위를 가지고, 분자의 나머지 면역글로불린 구조는 사람 면역글로불린의 구조 및/또는 서열에 기초한 분자를 말한다. 항원-결합 부위는 불변 도메인 위에 융합된 완전 가변 도메인을 포함하거나, 또는 가변 도메인 내의 적합한 프레임워크 영역 위에 접목된 상보성 결정 영역(CDR)만을 포함할 수 있다.
용어 "항원"은 항체가 결합할 수 있는 1개 또는 복수의 항원 결정소 또는 에피토프를 포함할 수 있는 분자이다. 항원은 면역원성을 가질 수 있는, 즉 면역반응을 유도할 수 있는 물질이다. 항원은 일종의 면역원인 것으로 간주된다. 본원에서 사용된 용어 "항원"은 전장 단백질뿐만 아니라 1개 또는 복수의 에피토프를 함유하거나 포함하는 그것의 펩티드 단편을 의미한다. 또한, 항원은 하나 이상의 항원 결정소 부위를 포함하거나, 또는 이러한 부위의 하나 이상의 단편, 이러한 부위의 변이체, 또는 이러한 부위의 펩티드의태체(peptidomimetics)를 포함할 수 있다. 항원은 단백질, 부분적으로 단백질, 또는 비-단백질성일 수 있다. 이들 화합물은 글리코실화될 수 있다.
본원에서 용어 "표면 항원"과 "세포 표면 항원"은 상호 교환하여 사용되며, 세포의 원형질막 성분을 말한다. 이들 성분은, 제한은 아니지만, 통합(integral) 막 단백질 및 주변(peripheral) 막 단백질, 당단백질, 다당류, 지질, 및 글리코실포스파티딜이노시톨(GPI)-결합 단백질을 포함한다. "통합 막 단백질"은 세포의 원형질막의 지질 이중층을 가로질러 뻗어 있는 막통과 단백질이다. 전형적인 통합 막 단백질은 일반적으로 소수성 아미노산 잔기들로 이루어진 적어도 하나의 막-스파닝 세그먼트(membrane-spanning segment)으로 구성된다. 주변 막 단백질은 지질 이중층의 소수성 내부로는 뻗어 있지 않고, 다른 막 단백질과의 비-공유 상호작용에 의해 막 표면에 결합된다. GPI-결합 단백질은 지질 이중층에 삽입된 지질 꼬리에 의해 세포 표면에 고정된 단백질이다.
"면역원"은 면역반응을 유도하는 어떤 물질을 말한다. 면역원인 물질은 "면역원성"인 것으로 설명된다. 면역반응의 유도는, 제한은 아니지만, 체액성 반응(예를 들어, 항체 생성) 또는 세포성 반응(예를 들어, 세포독성 T 세포의 촉발)의 활성화, 염증성 반응(예를 들어, 백혈구 모집), 및 사이토카인 및 림포카인의 분비를 포함한다.
면역화 또는 이식에 사용된 세포에 적용되었을 때 용어 "이종성"은 이 세포가 수용자와는 유전자형이 다른 존재로부터 유래된다는 것을 의미한다. 예를 들어, 이종성 세포는 수용자와 상이한 종으로부터, 또는 수용자와 동일한 종의 상이한 개체로부터 유래될 수 있다. 한 종의 개체로부터 유래된 배아세포는 동일한 종의 성체에게는 이종성이다. 수용자에게 적용되었을 때 "이종성"은 수용자가 수용자에게 도입될 세포 공급원과는 유전자형이 다른 존재라는 의미이다.
사람 암 줄기세포 표면의 적어도 약 50%, 더 바람직하게는 사람 암 줄기세포 표면의 적어도 약 75%, 더욱 바람직하게는 사람 암 줄기세포 표면의 적어도 약 90%, 그리고 가장 바람직하게는 사람 암 줄기세포 표면의 적어도 약 95%가 항원 부위 또는 항체 결합 부위가 결합되도록, 또는 항체 또는 항체의 일부에 의한 항원 인식에 이용할 수 없도록 세포 표면에 결합된, 혈청으로부터 유래된 혈청 생체분자를 가지지 않을 때 세포 표면에 "혈청 생체분자가 실질적으로 없다"라고 한다. 세포 표면은 현미경이나 유세포분석에 의해 세포 크기를 측정하여 결정할 수 있다. 예를 들어, 다양한 기지의 크기의 합성 비드가 유세포분석에서 캘리브레이션에 통상 사용된다. 소량의 캘리브레이션된 비드가 암 줄기세포와 혼합될 수 있으며, 결과의 집단이 유세포분석에 의해 분석된다. 다음에, 사람 암 줄기세포가 캘리브레이션된 비드의 크기와 비교될 수 있다. 비드의 크기를 알고 있으므로 세포 표면 양이 계산될 수 있다.
본원에서 사용된 "노쇠"는 세포가 분할 능력을 잃는 현상을 말한다.
본원에서 사용된 세포의 "실질적으로 순수한" 집단은 적어도 약 85%, 바람직하게는 적어도 약 90%, 더 바람직하게는 약 95% 이상의 해당 세포로 이루어진 세포 집단이다.
본원에서 사용된 "혈청"은 혈액이 응고된 후에도 남아 있는 포유동물 혈액의 유체상을 말한다.
본원에서 사용된 "혈청 생체분자"는 혈청에서 발견되는 생물학적 조성을 말한다. 예들은, 제한은 아니지만, 알부민, a1-글로불린, a2-글로불린, b-글로불린, 및 g-글로불린을 포함한다. 혈청 생체분자는 혈청에서 자연적으로 발견되거나 또는 혈청의 처리 및 취급 과정에서 유래되는 전체적인 또는 부분적인 생물학적 조성을 포함한다.
용어 "포유동물" 또는 "포유동물의"는 온혈 척추동물을 말하며, 이들은, 제한은 아니지만, 사람, 마우스, 래트, 토끼, 원숭이, 경주용 동물, 및 애완동물을 포함한다.
암 줄기세포 항원
본 발명의 구체예에서, 어떤 항원들이 여기 개시된 암 줄기세포의 표면에서 검출되었다. 이들은 공지의 항원, 신규 항원, 및 조직 또는 암 줄기세포와 이전에는 관련이 없던 항원들을 포함한다. 제한은 아니지만, 예를 들면, 이런 항원들은 B7H3(다양한 에피토프), CD46, 트랜스페린 수용체, CD112(폴리오 바이러스 수용체 관련 단백질 2), ephA2 수용체, EGFR, ALCAM(CD166), 알파-V-베타-5, JAM3, 프리오피오닐-코엔자임 A 카르복실라제 알파, 카르복시펩티다제 M, 카르복시펩티다제 C, LDL-수용체, 데스모글레인 2, ADAM9, CEA CD66e, 온코스타틴 M 수용체 베타, 알파 2 인테그린, 및 프로스타틴을 포함한다. 이들 항원을 발현하는 셀라인이 특히 본 발명의 방법에 사용하기에 바람직하다.
이들 암 줄기세포 항원을 분리하여 획득하는 방법은 보편적인 방법이다. 바람직한 방법은 이들 항원에 대해 지정된 항체를 사용한다. 이들 항원 중 일부에 대한 지정된 항체의 예들이 다음 명세서에 제공된다: B7H3(PCT WO 2004/001381 및 US 60/733,041, 특히 항체 TES7, PTA-7093), CD46(US 7,148,038, 특히 항체 PA7, PTA-3706), 트랜스페린 수용체(PCT WO 05/121179, 특히 항체 LUCA31, PTA- 6055), ephA2수용체(PCT WO06/084226, 특히 항체 SPL1, PTA-6059), JAM3(PCT WO06/084078, 특히 항체 PACA4, PTA-6510), 카르복시펩티다제 M(PCT WO 06/076584, 특히 항체 KID31, PTA-6516), ADAM9(PCT WO 06/084075, 특히 항체 KID24, PTA-5174), 및 온코스타틴 M 수용체 베타(PCT WO 06/084092, 특히 항체LUCA38, PTA-6511). 이들 항체는 특히 본원의 교시에 따른 암 줄기세포 마커로서 유용하다.
이들 항원은 일반적으로 암 줄기세포의 확인, 새로운 암 줄기세포의 발견, 또는 조직-특이적 또는 발생-단계 특이적인 것들과 같은 암 줄기세포의 선택된 하위부분의 확인에 사용하기에 바람직한 마커이다. 본 발명은 지금까지는 암 줄기세포에 특이적이라고 평가되지 않았던 항원들의 패널을 개시하며, 이로써 세포를 프로파일링하고 이들의 줄기세포성을 확인하기 위한 수단이 가능해진다. 여기 개시된 줄기세포 마커의 일부 또는 전부의 존재에 기초하여, 단독으로 또는 다른 공지된 마커와 조합하여, 유동 분석 및 다른 일반적으로 공지된 수단을 사용하여 집단으로부터 세포들이 선별될 수 있다. 통상적인 실험을 사용하여 여기 개시된 항원이 세포 표면에 존재하는지를 결정하고, 특정한 조직, 세포 또는 세포 배양물에 대한 독특한 암 줄기세포 항원의 "지문"을 수집할 수 있다.
본 발명자들은 고상 종양으로부터의 우세한 수의 암 줄기세포 상에 존재하는 일련의 마커를 확인하였다. 이들 마커 세트는 상기 확인된 항원의 일부 또는 전부를 포함한다. 이들은 암 줄기세포 상에만 독점적으로 존재하는 것은 아니다. 여기 교시된 방법을 사용하면 이들 마커는 정상 조직 줄기세포, 정상 조직, 종양 조직, 또는 딸세포에 (어느 정도) 결합할 것이다. 이들 항원의 대부분은 정상 줄기세포와 암 줄기세포에 모두 존재한다. B7H3(모든 에피토프)과 같은 일부 항원은 여기 개시된 암 줄기세포 라인 중 적어도 5개에 존재한다. 고상 종양-유래 암 줄기세포의 마커 프로파일은 조혈세포로부터 유래된 것들과 다를 것으로 예상된다.
또한, 이들 항원은 시간에 따른 세포 표면의 평가에 유용하다. 나타내지 않은 데이터에서, 비교 및 차등 결합 분석이 항체들의 패널과 세 쌍의 암 줄기세포 라인을 사용하여 수행되었다. 유방암 줄기세포 라인 BRCA1103은 11회 및 12회 계대에서 평가하여 분석 재현성을 나타냈다. 직장 암종 암 줄기세포 라인 RECA0515는 10회 및 16회 계대에서 평가하여 셀라인의 안정성을 나타냈고, 결직장 암종 암 줄기세포 라인 CRCA0404을 사용해서는 모 라인과 이 라인으로부터의 클론을 비교하였다. RECA0515 p10 대 p16의 항원 프로파일은 13% 상이했고, BRCA1103 p11 대 p12는 2% 상이했고, CRCA0404 대 클론 항원 프로파일은 6% 상이했다.
여기 개시된 암 줄기세포 마커 세트는 바람직한 특징을 가진 세포의 선별을 최적화하기 위해 선택된다. 예를 들어, 딸세포, 전이 침착물의 세포, 또는 생체내 계대된 세포의 마커 프로파일은 조직 또는 일차 세포 배양물로부터의 암 줄기세포의 프로파일과 다를 것이다.
어떤 항원은 종양 조직의 모든 세포에서 발현되지는 않지만, 이 종양으로부터의 암 줄기세포 상에는 존재할 것이다. 이런 종류의 차등 발현을 결정하기 위한 방법들은 본 분야에 일반적으로 공지되어 있다.
이들 암 줄기세포 항원을 마커로서 사용하기 위한 여기 개시된 방법은 세포 배양 방법을 사용한 선별, 표현형 또는 형태학적 평가와 같은 암 줄기세포를 확인하는 다른 방법과 함께 병용되는 것이 유용하다.
이런 특히 바람직한 항원은 질환의 예방, 치료 또는 진단을 위한 다가 백신에 존재하는 바람직한 백신 성분, 조합 치료 조성물, 또는 개별 치료 조성물로서 바람직하다. 이런 암 줄기세포 항원에 결합하는 제제가 치료 또는 진단 부분을 암 줄기세포에 표적화하는데 유용하다.
본 발명의 양태는 TES7, PA7, LUCA31, SPL1, PACA4, KID31, KID24 및 LUCA38 항체들 중 하나 이상에 결합하는 암 줄기세포의 형태학을 나타내는 분리된 암 줄기세포를 포함한다.
또한, 본 발명의 암 줄기세포는 리간드에 의해 결합되었을 때 혈관형성인자 및 성장인자와 같은 사이토카인의 생성을 조정하는 항원의 발견 및 스크리닝에 사용된다. 예를 들어, B7H3의 동형에 대해 지정된, TES7로서 여기 언급된 암 줄기세포-결합 항체는 기질세포와 암 줄기세포 모두에 의해 혈관형성인자 VEGF와 MIP-1 알파(CCL3)의 분비를 감소시킨다. TES7과 KID24로서 여기 언급된 항체는 둘 다 사이토카인 경로와 사이토카인 신호화를 조정하는 능력을 가진 것으로 나타났다. 이것은 종양 성장을 유도할 수 있는 신호화 메커니즘에 대한 새로운 통찰력을 제공하며, 본 발명의 암 줄기세포는 표준 성장분석에서 놓칠 수 있는 성장 조정 항체를 확인할 수 있는 능력을 제공한다. 본 발명의 교시에 따라서, 본 발명의 암 줄기세포 상에 존재하는 항원에 대해 발생한 항체를 사이토카인 분석에 사용하여 항체/항원이 사이토카인 신호화를 조정하는지를 판단할 수 있다. 본 발명의 실시에 사용하기에 적합한 매우 다양한 사이토카인 분석이 본 분야에 잘 공지되어 있다.
고상 암 줄기세포의 분리 및 유지
바람직한 구체예에서, 본 발명의 사람 암 줄기세포는 고상 사람 종양 조직으로부터 분리된다. 제한은 아니지만, 아래의 방법을 예로 들 수 있다. 다른 일반적으로 공지된 방법들도 본 발명의 실시에 사용된다.
고상 사람 종양 조직을 인산염 완충 식염수(PBS)로 바람직하게 여러 번 헹군다. PBS는 항생제 및/또는 항진균제, 제한은 아니지만, 젠타마이신 등을 함유할 수 있다. 고상 사람 종양 조직은 대략 1mm의 입방체로 잘게 썰어 해리 배지에 현탁시킨다. 해리 배지는 세포 해리제로 보충된 기본 배지이다. 광범한 해리제가 사용될 수 있으며, 제한은 아니지만, EDTA, EGTA, 트립신 및 콜라게나제-디스파제를 포함한다. 바람직한 해리제는 콜라게나제 디스파제이며, 이것은 잘게 썬 종양 조직의 세포를 부분적으로 해리할 수 있는 농도로 사용된다. 바람직한 농도는 PBS 중에 부피를 기준으로 10중량%이다. 또한, 트립신 억제제가 해리 배지에 포함될 수 있다. 바람직한 트립신 억제제는 적합한 농도로 사용되는 대두 트립신 억제제(STI)이다. 비제한적 예로서 STI의 한 전형적인 적합한 농도는 10%(v/v)이다.
세포를 37℃에서 해리 배지 중에서 인큐베이션한다. 5분 간격으로 현탁액을 피펫팅하여 세포 응집을 느슨하게 한다. 응집물이 10-20개 세포 크기일 때 효소 활성이 중지된다. 원심분리하여 세포를 펠릿으로 만들고 기본 배지로 세척한 후, 원심분리하여 펠릿으로 만든다. 상청액을 제거하고, 조직을 기본 배지에 재현탁한 다음, 배양 접시로 옮긴다.
다양한 기본 배지를 사용하여 액체의 pH를 사람 고상 암 줄기세포의 생존을 촉진하는 범위로 유지한다. 비제한적 예로서, F12/DMEM, Ham's F10(Sigma), CMRL-1066, 최소 필수 배지(MEM, Sigma), RPMI-1640(Sigma), 듈베코 변형 이글 배지 (DMEM, Sigma), OPTI-MEM®(GIBCO BRL) 및 이스코브 변형 이글 배지(IMEM)가 있다. 이에 더하여, Ham and Wallace (1979) Meth. Enz., 58:44, Barnes and Sato (1980) Anal. Biochem., 102:255, Mather, J. P. and Roberts, P. E.(1998) "Introduction to Cell and Tissue Culture", Plenum Press, New York에 설명된 기본 영양 배지 중 어느 것이 사용될 수도 있다. 어떤 예에서, 기본 배지는 특허출원 공보 WO 2005/028626에 설명된 배지와 같이 당 공급원으로서 프럭토오스를 사용할 수 있다.
기본 배지를 배양 접시에 첨가하고, 조직을 습한 분위기에서 37℃에서 인큐베이션한다. 암 줄기세포의 생존 및 성장을 촉진하는 바람직한 구체예에서, 기본 배지를 보충하기 위해 각종 영양물이 첨가되며, 이로써 "영양 배지"가 만들어진다. 사람 암 줄기세포 응집물을 이 배지에 넣는데, 바람직한 구체예에서는 CSC가 세포 응집물로부터 배지로 이동하여 배양 접시나 다른 공급된 고정재료에 고정된다. 배양 접시나 고정재료에 부착되지 않은 잘게 썬 조직의 나머지는 배지 중에서 유동하며, 단기간의 배양 후, 예를 들어 1-2주 후에 배지 교환에 의해 제거될 것이다.
다른 바람직한 구체예에서, 영양 배지에 놓인 사람 암 세포 응집물로부터의 세포가 모두 배양 접시에 부착되고, 사람 종양으로부터의 다른 세포 타입 중에서 사람 암 줄기세포가 서서히 확립되어 성장한다. 결국, 사람 암 줄기세포는 실질적으로 순수한 세포 집단을 형성할 것이며, 오염원인 나머지 세포 타입은 배양물에 더 이상 존재하지 않게 된다. 배양 과정 및 환경은 오염원인 세포 타입의 복제 및/또는 생존은 지원하지 않고, 사람 암 줄기세포의 생존 및 성장만을 촉진하여 실질적으로 순수한 사람 암 줄기세포 집단을 생성한다. 사람 암 줄기세포 집단은 배양물 중에서 장기간 성장할 수 있으며, 노쇠함 없이 광범한 증식 및 성장이 가능하다.
사람 암 줄기세포는 상이한 기질로 코팅되거나 또는 코팅되지 않은 조직배양 용기(예를 들어, 플라스크, 플레이트 등)에서 성장될 수 있다. 사용될 수 있는 기질의 비제한적 예는 피브로넥틴, 라미닌, 콜라겐, 폴리리신, 니트로셀룰로오스, 나일론, 및 폴리테트라플루오로에틸렌을 포함한다. 조직배양 용기의 크기는 용기 안에 넣을 사람 종양 조직의 양에 비례한다. 당업자는 조직배양 용기 안에 넣는 종양 조직을 단계적으로 증가시켜 조직배양 용기의 정확한 크기를 결정할 수 있다. 사람 종양 조직을 먼저 용기 안에 넣는 경우에는 배지의 전체적인 탁도가 일반적으로 투명하다. 세포가 종양 조직 조각으로부터 나와 이동함에 따라, 배지는 점점 불투명하게 되고 혼탁해진다. 배지가 아주 혼탁해진 시점에서, 더 많은 신선한 배지를 첨가하거나 또는 배지를 완전히 교환함으로써 더 많은 영양 배지를 조직배양 용기에 넣어 줌으로써 사람 종양 세포에 의해 소비된 영양물을 보충한다. 추가하여 또는 대안으로서, 배지가 혼탁해졌을 때, 조직배양 용기로부터 소량의 세포를 제거하여, 트리판 블루 염색 등에 의해서 세포 생육성을 검사한다. 조직배양 용기에 세포가 너무 많으면 세포 생육성이 감소하기 시작할 것이다.
사람 암 줄기세포의 연속 배양은 일반적으로 세포를 하나 이상의 새로운 배양 용기로 옮기는 것을 포함한다. 바람직하게, 이러한 이동은 배양 용기가 세포로 넘치기 전에 행해진다(예를 들어, 감소된 세포 생육성으로 증명됨에 따라). 세포는 증가된 양의 세포를 수용할 수 있는 더 큰 크기(예를 들어, 더 큰 입방체 부피)의 다른 용기로 옮겨질 수 있다. 또는 달리, 세포는 신선한 배양 배지를 담은 몇 개의 분리된 조직배양 용기에 "분배"될 수 있다("하위-배양(sub-culturing)"이라고도 한다). 이 방식으로 실질적으로 순수한 사람 암 줄기세포 집단이 얻어지고 증식될 수 있다.
조직배양 용기로부터 세포의 제거는 바람직하게 플라스틱 조직배양 용기 및/또는 사용된 기질(예를 들어, 피브로넥틴, 라미닌 등)의 표면(들)로부터 세포를 떼어낼 수 있는 효소 처리에 의해 달성된다. 더 바람직한 구체예에서, 콜라게나제-디스파제와 같은 효소가 조직배양 플라스크의 표면들로부터 사람 암 줄기세포를 해리시키는데 효과적인 양으로 사용된다. 효과적인 양은 부피 기준으로 적어도 약 10%, 더 바람직하게는 적어도 약 1%, 그리고 가장 바람직하게는 적어도 약 0.1%의 콜라게나제-디스파제이다. 조직배양 용기의 표면(들)으로부터 세포를 떼어낸 후, 기본 배지, 바람직하게 여기 개시된 영양 배지로 효소를 세척해서 없애고, 세포를 영양 배지, 바람직하게 여기 개시된 영양 배지가 담긴 새로운 배양 용기에 넣는다. 영양 배지는 사람 암 줄기세포와 동일한 조직 기원의 태아 줄기/선조세포에 대해 최적화된 영양 배지에 존재하는 성장인자 및 화합물을 포함할 수 있다.
사람 암 줄기세포에 영양을 공급하는 빈도는 세포의 영양물 대사 속도와 첨가된 호르몬 및 성장인자의 안정성에 따른다. 영양물 대사 속도가 높을수록 세포의 공급이 필요한 빈도가 더 크다. 일반적으로, 세포가 배지 중의 영양물을 대사할수록 배지의 산도가 증가할 것이다. 일부 영양 배지(예를 들어, RPMI-1640, DMEM, EMEM, 등)는 배지가 산성이 되었을 때 배지의 색을 변화시켜서 산도를 나타내는 pH-감응성 염료를 함유한다. 다음에, 영양 배지를 첨가하여 기존 배지의 산도를 세포의 생명을 지속시키고 세포 성장을 촉진하는 산도로 만들 수 있다. 또는 달리, 세포의 적은 부분을 조직배양 용기로부터 제거한 다음, 트리판 블루 염색 등에 의해서 세포 생육성을 평가할 수 있다. 영양 배지가 대사되었다면 세포 생육성은 불량할 것이다(예를 들어, 50% 미만). 혈청 무함유 규정 배지에서 사람 암 줄기세포의 생존 및 성장을 촉진하는데 바람직한 공급 빈도는 주당 약 2회이다. 본 발명의 사람 암 줄기세포는 노쇠하지 않고 배양물에서 장기간 성장할 수 있다.
사람 결직장 암종 줄기세포( CRCA )
사람 결직장 암종 줄기세포가 사람 결직장 암종 조직으로부터 분리된다. 일단 종양 조직을 세정하고 잘게 썰어 해리한 다음, 그것을 결직장 암종 줄기세포 육성 영양 배지에 넣어 CSC를 성장시킨다. 영양 배지는 사람 결직장 암종 줄기세포의 성장 및 증식에 최적화된 영양물을 포함하는 적합한 기본 배지이다. 바람직한 구체예는 F12/DMEM(50:50) 기본 배지를 사용한다. 보충 영양물의 예들은, 제한은 아니지만, 인슐린, 트랜스페린, 표피 성장인자, 셀레늄, 트리요도티로닌(T3), 에탄올아민, 포스포에탄올아민, 히드로코르티손, 및 I-토코페롤(비타민 E)를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 사람 결직장 암종 줄기세포의 생존 및 성장을 촉진하기 위해 아래 제시된 양의 영양물이 사용된다: 약 10ng/ml 이상의 인슐린 및 약 1mg/ml 이하의 인슐린, 더 바람직하게는 약 10㎍/ml 인슐린; 약 1㎍/ml 이상의 트랜스페린 및 약 100㎍/ml 이하의 트랜스페린, 더 바람직하게는 약 10㎍/ml 트랜스페린; 약 500pg/ml 이상의 표피 성장인자(EGF) 및 5㎍/ml 이하의 EGF, 더 바람직하게는 5ng/ ml EGF; 1x10-10M 이상의 셀레늄 및 1x10-6M 이하의 셀레늄, 더 바람직하게는 2.5x10-8M 셀레늄; 1x10-14M 이상의 트리요도티로닌(T3) 및 1x10-10M 이하의 T3, 더 바람직하게는 1x10-12M T3; 1x10-8M 이상의 에탄올아민 및 1x10-4M 이하의 에탄올아민, 더 바람직하게는 1x10-6M 에탄올아민; 1x10-8M 이상의 포스포에탄올아민 및 1x10-4M 이하의 포스포에탄올아민, 더 바람직하게는 1x10-6M 포스포에탄올아민; 1x10-11M 이상의 히드로코르티손 및 1x10-7M 이하의 히드로코르티손, 더 바람직하게는 1x10-9M 히드로코르티손; 100ng/ml 이상의 비타민 E 및 100㎍/ml 이하의 비타민 E, 더 바람직하게는 5㎍/ml 비타민 E. 또한, 젠타마이신, 페니실린, 및/또는 스트렙토마이신과 같은 항생제 및/또는 항진균제가 배지에 첨가될 수 있으며, 항생제/항진균제는 배양 초기 단계 동안(예를 들어, 처음 2-5일)에만 첨가되는 것이 바람직하다.
세포는 본 분야에 잘 공지된 다양한 배양 용기에서 성장 및 계대될 수 있다. 바람직한 구체예는 사람 결직장 암종 줄기세포가 기질로 코팅된 배양 접시에서 배양되는 것이다. 다양한 배양 기질이 본 분야에 공지되어 있다. 이러한 기질의 예들은, 제한은 아니지만, 콜라겐, 피브로넥틴, 라미닌, 비트로넥틴, Matrigel 등을 포함한다. 특히 바람직한 구체예는 사람 결직장 암종 줄기세포가 피브로넥틴이나 라미닌으로 코팅된 배양 접시에서 성장 및 계대되는 것이다.
사람 직장 암종 줄기세포( RECA )
사람 직장 암종 줄기세포가 사람 직장 암종 조직으로부터 분리된다. 일단 종양 조직을 세정하고 잘게 썰어 해리한 다음, 그것을 직장 암종 줄기세포 육성 영양 배지에 넣어 CSC를 성장시킨다. 영양 배지는 사람 직장 암종 줄기세포의 성장 및 증식에 최적화된 영양물을 포함하는 적합한 기본 배지이다. 바람직한 구체예는 F12/DMEM(50:50) 기본 배지를 사용한다. 보충 영양물의 예들은, 제한은 아니지만, 인슐린, 트랜스페린, EGF, 셀레늄, T3, 에탄올아민, 포스포에탄올아민, 히드로코르티손, 비타민 E, 및 돼지 뇌하수체 추출물(PPE)을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 사람 직장 암종 줄기세포의 생존 및 성장을 촉진하기 위해 아래 제시된 양의 영양물이 사용된다; 약 10ng/ml 이상의 인슐린 및 약 1mg/ml 이하의 인슐린, 더 바람직하게는 약 10㎍/ml 인슐린; 약 1㎍/ml 이상의 트랜스페린 및 약 100㎍/ml 이하의 트랜스페린, 더 바람직하게는 약 10㎍/ml 트랜스페린; 약 500pg/ml 이상의 표피 성장인자(EGF) 및 5㎍/ml 이하의 EGF, 더 바람직하게는 5ng/ml EGF; 1x10-10M 이상의 셀레늄 및 1x10-6M 이하의 셀레늄, 더 바람직하게는 2.5x10-8M 셀레늄; 1x10-14M 이상의 트리요도티로닌(T3) 및 1x10-10M 이하의 T3, 더 바람직하게는 1x10-12M T3; 1 x10-8M 이상의 에탄올아민 및 1x10-4M 이하의 에탄올아민, 더 바람직하게는 1x10-6 M 에탄올아민; 1x10-8M 이상의 포스포에탄올아민 및 1x10-4M 이하의 포스포에탄올아민, 더 바람직하게는 1x10-6M 포스포에탄올아민; 1x10-11M 이상의 히드로코르티손 및 1x 10-7M 이하의 히드로코르티손, 더 바람직하게는 1x10-9M 히드로코르티손; 100ng/ml 이상의 비타민 E 및 100㎍/ml 이하의 비타민 E, 더 바람직하게는 5㎍/ml 비타민 E.
사람 직장 암종 줄기세포의 성장 및 생존을 촉진하는 다른 성장인자들도 영양 배지에 첨가될 수 있다. 이러한 성장인자는, 제한은 아니지만, 동물 뇌하수체로부터의 뇌하수체 추출물을 포함할 수 있다. 많은 동물 뇌하수체 추출물이 본 분야에 공지되어 있다. 바람직한 뇌하수체 추출물의 예는, 제한은 아니지만, 사람 뇌하수체 추출물(HPE), 소 뇌하수체 추출물(BPE) 및 돼지 뇌하수체 추출물(PPE)를 포함한다. 뇌하수체 추출물의 제조는 본 분야에 잘 공지되어 있으며, 본 발명의 사람 암 줄기세포의 분리 및 성장에 적합할 수 있다.
돼지 뇌하수체 추출물을 제조하는 한 바람직한 방법은 돼지 뇌하수체 100g를 사용하며, 0.15M NaCl 250ml를 첨가하는 것을 포함한다. 뇌하수체와 NaCl 혼합물을 냉각된 식품 처리장치에서 몇 번 펄스 처리한 다음, 약 10 또는 바람직한 컨시스턴시가 달성될 때까지 식품 처리장치에서 정화시킨다. 다음에, 혼합물을 비이커로 옮기고 자기 교반장치에서 약 90분간 교반한다. 다음에, 혼합물을 적합한 시험관으로 옮겨서 4℃에서 18,000rpm에서 45분간 원심분리한다. 상청액을 가만히 따라 내고 그것을 4℃에서 20,000rpm에서 45분간 원심분리한다. 0.8㎛와 0.45㎛ 필터를 통해 차례로 상청액을 여과하고, 마지막으로 0.22㎛ 필터로 여과한다. 본 분야에 공지된 표준 방법을 사용하여 PPE ml 당 총 단백질 농도가 결정될 수 있다. 바람직하게, 단백질 농도는 PPE ml 당 약 15mg이어야 한다. 결과의 돼지 뇌하수체 추출물은 알리쿼트로 나누어 필요할 때까지 냉동 보관할 수 있다.
상기 설명된 방법으로 제조된 돼지 뇌하수체 추출물을 영양 배지에 첨가하여 본 발명의 사람 직장 암종 줄기세포의 생존 및 성장을 촉진할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 영양 배지 ml 당 7㎍ 이상의 총 단백질의 PPE 및 영양 배지 ml 당 7mg 이하의 총 단백질의 PPE, 더 바람직하게는 영양 배지 ml 당 약 75㎍의 총 단백질의 PPE가 본 발명의 사람 직장 암종 줄기세포의 생존 및 성장을 위해서 첨가된다.
또한, 젠타마이신, 페니실린, 및/또는 스트렙토마이신과 같은 항생제 및/또는 항진균제가 배지에 첨가될 수 있으며, 항생제/항진균제는 배양 초기 단계 동안(예를 들어, 처음 2-5일)에만 첨가되는 것이 바람직하다.
세포는 본 분야에 잘 공지된 다양한 배양 용기에서 성장 및 계대될 수 있다. 바람직한 구체예는 사람 직장 암종 줄기세포가 기질로 코팅된 배양 접시에서 배양되는 것이다. 다양한 배양 기질이 본 분야에 공지되어 있다. 특히 바람직한 구체예는 사람 직장 암종 줄기세포가 피브로넥틴, 라미닌 또는 피브로넥틴과 라미닌의 혼합물로 코팅된 배양 접시에서 성장 및 계대되는 것이다.
사람 폐 암종 줄기세포
사람 폐 암종 줄기세포가 사람 폐 암종 조직으로부터 분리된다. 일단 종양 조직을 세정하고 잘게 썰어 해리한 다음, 이 조직을 폐 암종 줄기세포 육성 영양 배지에 넣어 CSC를 성장시킨다. 영양 배지는 사람 폐 암종 줄기세포의 성장 및 증식에 최적화된 영양물을 포함하는 적합한 기본 배지이다. 바람직한 구체예는 F12/ DMEM(50:50) 기본 배지를 사용한다. 보충 영양물의 예들은, 제한은 아니지만, 인슐린, 트랜스페린, EGF, 셀레늄, 및 돼지 뇌하수체 추출물(PPE)을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 사람 폐 암종 줄기세포의 생존 및 성장을 촉진하기 위해 아래 제시된 양의 영양물이 사용된다: 약 10ng/ml 이상의 인슐린 및 약 1mg/ml 이하의 인슐린, 더 바람직하게는 약 10㎍/ml 인슐린; 약 1㎍/ml 이상의 트랜스페린 및 약 100㎍/ml 이하의 트랜스페린, 더 바람직하게는 약 10㎍/ml 트랜스페린; 약 500pg/ ml 이상의 표피 성장인자(EGF) 및 5㎍/ml 이하의 EGF, 더 바람직하게는 5ng/ml EGF; 1x 10-10M 이상의 셀레늄 및 1x10-6M 이하의 셀레늄, 더 바람직하게는 2.5x10-8M 셀레늄; 7㎍ 이상의 총 단백질의 PPE/ml 및 7mg 이하의 총 단백질의 PPE/ml, 더 바람직하게는 75㎍의 총 단백질의 PPE/ml. 또한, 젠타마이신, 페니실린, 및/또는 스트렙토마이신과 같은 항생제 및/또는 항진균제가 배지에 첨가될 수 있으며, 항생제/항진균제는 배양 초기 단계 동안(예를 들어, 처음 2-5일)에만 첨가되는 것이 바람직하다.
세포는 본 분야에 잘 공지된 다양한 배양 용기에서 성장 및 계대될 수 있다. 바람직한 구체예는 사람 폐 암종 줄기세포가 기질로 코팅된 배양 접시에서 배양되는 것이다. 다양한 배양 기질이 본 분야에 공지되어 있다. 이러한 기질의 예들은, 제한은 아니지만, 콜라겐, 피브로넥틴, 라미닌, 비트로넥틴, Matrigel 등을 포함한다. 특히 바람직한 구체예는 사람 폐 암종 줄기세포가 피브로넥틴으로 코팅된 배양 접시에서 성장 및 계대되는 것이다.
사람 췌장 암종 줄기세포
사람 췌장 암종 줄기세포가 사람 췌장 암종 조직으로부터 분리된다. 일단 종양 조직을 세정하고 잘게 썰어 해리한 다음, 그것을 췌장 암종 줄기세포 육성 영양 배지에 넣어 CSC를 성장시킨다. 영양 배지는 사람 췌장 암종 줄기세포의 성장 및 증식에 최적화된 영양물을 포함하는 적합한 기본 배지이다. 바람직한 구체예는 F12/DMEM(50:50) 기본 배지를 사용한다. 보충 영양물의 예들은, 제한은 아니지만, 인슐린, 트랜스페린, EGF, 셀레늄, T3, 에탄올아민, 포스포에탄올아민, 히드로코르티손, 프로게스테론, 포스콜린, 헤레굴린 및 아프로티닌을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 사람 췌장 암종 줄기세포의 생존 및 성장을 촉진하기 위해 아래 제시된 양의 영양물이 사용된다: 약 10ng/ml 이상의 인슐린 및 약 1mg/ml 이하의 인슐린, 더 바람직하게는 약 10㎍/ml 인슐린; 약 1㎍/ml 이상의 트랜스페린 및 약 100㎍/ml 이하의 트랜스페린, 더 바람직하게는 약 10㎍/ml 트랜스페린; 약 500pg/ml 이상의 표피 성장인자(EGF) 및 5㎍/ml 이하의 EGF, 더 바람직하게는 5ng/ml EGF; 1x10-10M 이상의 셀레늄 및 1x10-6M 이하의 셀레늄, 더 바람직하게는 2.5x10-8M 셀레늄; 1x10-14M 이상의 트리요도티로닌(T3) 및 1x10-10M 이하의 T3, 더 바람직하게는 1x10-12M T3; 1x10-8M 이상의 에탄올아민 및 1x10-4M 이하의 에탄올아민, 더 바람직하게는 1x 10-6M 에탄올아민; 1x10-8M 이상의 포스포에탄올아민 및 1x10-4M 이하의 포스포에탄올아민, 더 바람직하게는 1x10-6M 포스포에탄올아민; 1x10-11M 이상의 히드로코르티손 및 1x10-7M 이하의 히드로코르티손, 더 바람직하게는 1x10-9M 히드로코르티손; 1x10-10M 이상의 프로게스테론 및 1x10-6M 이하의 프로게스테론, 더 바람직하게는 1x10-8M 프로게스테론; 10nM 이상의 포스콜린 및 100μM 이하의 포스콜린, 더 바람직하게는 약 5μM 포스콜린; 10pM 이상의 헤레굴린(HRG) 및 100nM 이하의 헤레굴린, 더 바람직하게는 1-3nM 헤레굴린; 500ng/ml 이상의 아프로티닌 및 500㎍/ml 이하의 아프로티닌, 더 바람직하게는 25㎍/ml 아프로티닌. 또한, 젠타마이신, 페니실린, 및/또는 스트렙토마이신과 같은 항생제 및/또는 항진균제가 배지에 첨가될 수 있으며, 항생제/항진균제는 배양 초기 단계 동안(예를 들어, 처음 2-5일)에만 첨가되는 것이 바람직하다.
세포는 본 분야에 잘 공지된 다양한 배양 용기에서 성장 및 계대될 수 있다. 바람직한 구체예는 사람 췌장 암종 줄기세포가 기질로 코팅된 배양 접시에서 배양되는 것이다. 다양한 배양 기질이 본 분야에 공지되어 있다. 특히 바람직한 구체예에서, 사람 췌장 암종 줄기세포는 피브로넥틴으로 코팅된 배양접시에서 성장 및 계대된다. 사람 췌장 암종 줄기세포 배양물은 매일 모니터링될 수 있다. 배양 배지를 수집하여 후속 배양의 영양 배지를 보충할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 사람 췌장 암종 줄기세포의 배양 배지는 3일마다 수집되어 0.22 필터로 여과된다. 이런 컨디셔닝 배지는 후속 배양물에 1%(v/v) 이상 80%(v/v) 이하의 농도로, 더 바람직하게는 20%(v/v)의 농도로 첨가될 수 있다.
사람 췌장 암종 줄기세포는 초기 평판 후 7-10일 이내에 상피-유사 콜로니를 형성하며, 이들 상피-유사 콜로니는 비-분할 기질-유사 세포 중에 분산된다. 사람 췌장 암종 줄기세포는 계대 및 하위-배양될 수 있다. 당업자는 사람 췌장 줄기세포가 하위-배양될 준비가 되었는지 판단할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 사람 췌장 암종 줄기세포는 초기 평판 후 14일 이상에서 초기 평판 후 40일 이하에, 더 바람직하게는 초기 평판 후 21-24일에 하위-배양될 수 있다. 사람 췌장 암종 줄기세포를 하위-배양할 때, 이들은 피브로넥틴-코팅 접시 위에서 1:2 비율 이상 1:25 비율 이하, 더 바람직하게는 1:3 비율로 하위-배양될 수 있다. 아프로티틴 성장인자의 존재로 인한 더 이상의 성장 자극이 관찰되지 않을 때는 아프로티닌은 배양물에서 생략될 수 있다.
사람 Merkel 세포 암종 줄기세포
사람 Merkel 세포 암종 줄기세포가 사람 Merkel 세포 암종 조직으로부터 분리된다. 일단 종양 조직을 세정하고 잘게 썰어 해리한 다음, 그것을 Merkel 세포 암종 줄기세포 육성 영양 배지에 넣어 CSC를 성장시킨다. 영양 배지는 사람 Merkel 세포 암종 줄기세포의 성장 및 증식에 최적화된 영양물을 포함하는 적합한 기본 배지이다. 바람직한 구체예는 F12/DMEM(50:50) 기본 배지를 사용한다. 보충 영양물의 예들은, 제한은 아니지만, 인슐린, 트랜스페린, EGF, 셀레늄, T3, 에탄올아민, 포스포에탄올아민, 히드로코르티손, 포스콜린, 프로게스테론, 및 돼지 뇌하수체 추출물(PPE)을 포함한다. 선택적으로, 신경 성장인자 β(NGF-β)가 기본 배지에 보충 영양물로서 첨가될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 사람 Merkel 암종 줄기세포의 생존 및 성장을 촉진하기 위해 아래 제시된 양의 영양물이 사용된다: 약 10ng/ ml 이상의 인슐린 및 약 1mg/ml 이하의 인슐린, 더 바람직하게는 약 10㎍/ml 인슐린; 약 1㎍/ml 이상의 트랜스페린 및 약 100㎍/ml 이하의 트랜스페린, 더 바람직하게는 약 10㎍/ml 트랜스페린; 약 500pg/ml 이상의 표피 성장인자(EGF) 및 5㎍/ml 이하의 EGF, 더 바람직하게는 5ng/ml EGF; 1x10-10M 이상의 셀레늄 및 1x10-6M 이하의 셀레늄, 더 바람직하게는 2.5x10-8M 셀레늄; 1x10-14M 이상의 트리요도티로닌(T3) 및 1x10-10M 이하의 T3, 더 바람직하게는 1x10-12M T3; 1x10-8M 이상의 에탄올아민 및 1x10-4M 이하의 에탄올아민, 더 바람직하게는 1x10-6M 에탄올아민; 1x10-8M 이상의 포스포에탄올아민 및 1x10-4M 이하의 포스포에탄올아민, 더 바람직하게는 1x10-6M 포스포에탄올아민; 1x10-11M 이상의 히드로코르티손 및 1x10-7M 이하의 히드로코르티손, 더 바람직하게는 5x10-6M 히드로코르티손; 10nM 이상의 포스콜린 및 500μM 이하의 포스콜린, 더 바람직하게는 약 1-5μM 포스콜린; 1x10-10M 이상의 프로게스테론 및 1x10-6M 이하의 프로게스테론, 더 바람직하게는 1x10-8M 프로게스테론; 7㎍ 이상의 총 단백질의 PPE/ml 및 750㎍ 이하의 총 단백질의 PPE/ml, 더 바람직하게는 약 75㎍의 총 단백질의 PPE/ml. PPE 성장인자의 존재로 인한 더 이상의 성장 자극이 관찰되지 않을 때는 PPE가 배양물에서 생략될 수 있다.
어떤 경우, 신경 성장인자 β(NGF-β)가 Merkel 세포 암종 줄기세포의 성장을 촉진하기 위해 영양 배지에 첨가될 수 있다. NGF-β를 사용할 경우, 100pg/ml NGF-β 이상 및 1㎍/ml NGF-β 이하, 더 바람직하게는 10ng/ml NGF-β를 사용한다. NGF-β 성장인자의 존재로 인한 더 이상의 성장 자극이 관찰되지 않을 때는 NGF-β는 배양물에서 생략될 수 있다. 또한, 젠타마이신, 페니실린, 및/또는 스트렙토마이신과 같은 항생제 및/또는 항진균제가 배지에 첨가될 수 있으며, 항생제/항진균제는 배양 초기 단계 동안(예를 들어, 처음 2-5일)에만 첨가되는 것이 바람직하다.
세포는 본 분야에 잘 공지된 다양한 배양 용기에서 성장 및 계대될 수 있다. 바람직한 구체예는 사람 Merkel 세포 암종 줄기세포가 기질로 코팅된 배양 접시에서 배양되는 것이다. 다양한 배양 기질이 본 분야에 공지되어 있다. 특히 바람직한 구체예에서, 사람 Merkel 세포 암종 줄기세포는 피브로넥틴으로 코팅된 배양 접시에서 성장 및 계대된다.
사람 전립선 암종 줄기세포( PRCA )
사람 전립선 암종 줄기세포가 사람 전립선 암종 조직으로부터 분리된다. 일단 종양 조직을 세정하고 잘게 썰어 해리한 다음, 그것을 전립선 암종 줄기세포 육성 영양 배지에 넣어 CSC를 성장시킨다. 영양 배지는 사람 전립선 암종 줄기세포의 성장 및 증식에 최적화된 영양물을 포함하는 적합한 기본 배지이다. 바람직한 구체예는 칼슘을 첨가하지 않은 F12/DMEM(50:50) 기본 배지를 사용한다. 보충 영양물의 예들은, 제한은 아니지만, 칼슘, 인슐린, 트랜스페린, EGF, 셀레늄, T3, 에탄올아민, 포스포에탄올아민, 히드로코르티손, 테스토스테론, 및 돼지 뇌하수체 추출물(PPE)을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 사람 전립선 암종 줄기세포의 생존 및 성장을 촉진하기 위해 아래 제시된 양의 영양물이 사용된다: 약 10ng/ml 이상의 인슐린 및 약 1mg/ml 이하의 인슐린, 더 바람직하게는 약 10㎍/ml 인슐린; 약 1㎍/ml 이상의 트랜스페린 및 약 100㎍/ml 이하의 트랜스페린, 더 바람직하게는 약 10㎍/ml 트랜스페린; 약 500pg/ml 이상의 표피 성장인자(EGF) 및 5㎍/ml 이하의 EGF, 더 바람직하게는 5ng/ml EGF; 1x10-10M 이상의 셀레늄 및 1x10-6M 이하의 셀레늄, 더 바람직하게는 2.5x10-8M 셀레늄; 1x10-14M 이상의 트리요도티로닌(T3) 및 1x10-10M 이하의 T3, 더 바람직하게는 1x10-12M T3; 1x10-8M 이상의 에탄올아민 및 1x10-4M 이하의 에탄올아민, 더 바람직하게는 1x10-6M 에탄올아민; 1x10-8M 이상의 포스포에탄올아민 및 1x10-4M 이하의 포스포에탄올아민, 더 바람직하게는 1x10-6M 포스포에탄올아민; 1x10-11M 이상의 히드로코르티손 및 1x10-7M 이하의 히드로코르티손, 더 바람직하게는 1-5x10-9M 히드로코르티손; 50pg/ml 이상의 테스토스테론 및 5㎍/ml 이하의 테스토스테론, 더 바람직하게는 50ng/ml 테스토스테론; 150ng 이상의 총 단백질의 PPE/ml 및 150㎍ 이하의 총 단백질의 PPE/ml, 더 바람직하게는 약 15㎍의 총 단백질의 PPE/ml. 다른 바람직한 구체예에서, 테스토스테론은 영양 배지에 첨가되지 않는다. 당업자는 테스토스테론의 첨가가 사람 전립선 암종 줄기세포의 성장에 유리한지를 판단할 수 있다. 또한, 칼슘 수준은 사람 전립선 암종 줄기세포의 확립 및 유지에 있어서 달라질 수 있다. 어떤 경우에는 영양 배지에 칼슘을 첨가하지 않는 것이 사람 전립선 암종 줄기세포의 확립에 유리하다. 다른 경우, 적은 수준의 칼슘을 첨가하는 것이 사람 전립선 암종 줄기세포의 확립에 유리하다. 영양 배지에 낮은 수준의 칼슘을 첨가하여 사용할 때, 1nM 이상의 칼슘 및 100mM 이하의 칼슘, 더 바람직하게는 0.1mM 칼슘이 사용된다. 당업자는 또한 칼슘의 사용이 사람 전립선 암종 줄기세포의 분리 및/또는 성장에 유리한지를 판단할 수 있을 것이다.
또한, 젠타마이신, 페니실린, 및/또는 스트렙토마이신과 같은 항생제 및/또는 항진균제가 배지에 첨가될 수 있으며, 항생제/항진균제는 배양 초기 단계 동안(예를 들어, 처음 2-5일)에만 첨가되는 것이 바람직하다.
세포는 본 분야에 잘 공지된 다양한 배양 용기에서 성장 및 계대될 수 있다. 바람직한 구체예는 사람 전립선 암종 줄기세포가 기질로 코팅된 배양 접시에서 배양되는 것이다. 다양한 배양 기질이 본 분야에 공지되어 있다. 특히 바람직한 구체예에서, 사람 전립선 암종 줄기세포가 라미닌으로 코팅된 배양 접시에서 성장 및 계대된다.
사람 유방 암종 줄기세포( BRCA )
사람 유방 암종 줄기세포가 사람 유방 암종 조직으로부터 분리된다. 일단 종양 조직을 세정하고 잘게 썰어 해리한 다음, 그것을 유방 암종 줄기세포 육성 영양 배지에 넣는다. 영양 배지는 사람 유방 암종 줄기세포의 성장 및 증식에 최적화된 영양물을 포함하는 적합한 기본 배지이다. 바람직한 구체예는 F12/DMEM(50: 50) 기본 배지를 사용한다. 보충 영양물의 예들은, 제한은 아니지만, 인슐린, 트랜스페린, EGF, 셀레늄, T3, 에탄올아민, 포스포에탄올아민, 히드로코르티손, 프로스타글란딘 E1, 및 돼지 뇌하수체 추출물(PPE)을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 사람 유방 암종 줄기세포의 생존 및 성장을 촉진하기 위해 아래 제시된 양의 영양물이 사용된다: 약 10ng/ml 이상의 인슐린 및 약 1mg/ml 이하의 인슐린, 더 바람직하게는 약 10㎍/ml 인슐린; 약 1㎍/ml 이상의 트랜스페린 및 약 100㎍/ml 이하의 트랜스페린, 더 바람직하게는 약 10㎍/ml 트랜스페린; 약 500pg/ml 이상의 표피 성장인자(EGF) 및 5㎍/ml 이하의 EGF, 더 바람직하게는 5ng/ml EGF; 1x10-10M 이상의 셀레늄 및 1x10-6M 이하의 셀레늄, 더 바람직하게는 2.5x10-8M 셀레늄; 1x10-14M 이상의 트리요도티로닌(T3) 및 1x10-10M 이하의 T3, 더 바람직하게는 1x10-12M T3; 1x10-8M 이상의 에탄올아민 및 1x10-4M 이하의 에탄올아민, 더 바람직하게는 1x10-6M 에탄올아민; 1x10-8M 이상의 포스포에탄올아민 및 1x10-4M 이하의 포스포에탄올아민, 더 바람직하게는 1x10-6M 포스포에탄올아민; 1x10-10M 이상의 히드로코르티손 및 1x10-6M 이하의 히드로코르티손, 더 바람직하게는 1-5x10-8M 히드로코르티손; 10pg/ml 이상의 프로스타글란딘 E1(PGE1) 및 100㎍/ml 이하의 PGE1, 더 바람직하게는 100ng/ml PGE1; 150ng 이상의 총 단백질의 PPE/ml 및 150㎍ 이하의 총 단백질의 PPE/ml, 더 바람직하게는 약 15㎍의 총 단백질의 PPE/ml. 또한, 젠타마이신, 페니실린, 및/또는 스트렙토마이신과 같은 항생제 및/또는 항진균제가 배지에 첨가될 수 있으며, 항생제/항진균제는 배양 초기 단계 동안(예를 들어, 처음 2-5일)에만 첨가되는 것이 바람직하다.
세포는 본 분야에 잘 공지된 다양한 배양 용기에서 성장 및 계대될 수 있다. 바람직한 구체예는 사람 유방 암종 줄기세포가 기질로 코팅된 배양 접시에서 배양되는 것이다. 다양한 배양 기질이 본 분야에 공지되어 있다. 특히 바람직한 구체예에서, 사람 유방 암종 줄기세포가 피브로넥틴으로 코팅된 배양 접시에서 성장 및 계대된다.
배양물에 사람 유방 암종 줄기세포가 확립된 후, 세포를 본 분야에 공지된 통상적인 방법을 사용하여 냉동시킬 수 있다. 냉동된 사람 유방 암종 줄기세포를 해동하여 배양할 때는 초기 배양 단계(예를 들어, 처음 1-5일) 동안 태아 소 혈청(FBS)을 첨가하는 것이 배양물의 확립에 유리할 수 있다. 당업자는 사람 유방 암종의 해동 후 초기 배양 단계 동안 태아 소 혈청의 첨가가 유리할 것인지를 판단할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 사람 유방 암종 줄기세포의 해동 후 초기 배양 단계 동안 2% FBS(v/v)가 영양 배지에 첨가된다. 2-5일 후에 영양 배지를 교환하며 FBS는 생략된다. 초기 해동 후 사람 유방 암종 줄기세포의 성장에는 태아 소 혈청이 필요하지 않다.
사람 기저세포 암종 줄기세포( BCCA )
사람 기저세포 암종 줄기세포가 사람 기저세포 암종 조직으로부터 분리된다. 일단 종양 조직을 세정하고 잘게 썰어 해리한 다음, 그것을 기저세포 암종 줄기세포 배양 영양 배지에 넣는다. 영양 배지는 사람 기저세포 암종 줄기세포의 성장 및 증식에 최적화된 영양물을 포함하는 적합한 기본 배지이다. 바람직한 구체예는 F12/DMEM(50:50) 기본 배지를 사용한다. 보충 영양물의 예들은, 제한은 아니지만, 인슐린, 트랜스페린, EGF, 셀레늄, T3, 에탄올아민, 포스포에탄올아민, 히드로코르티손, 및 돼지 뇌하수체 추출물(PPE)을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 사람 기저세포 암종 줄기세포의 생존 및 성장을 촉진하기 위해 아래 제시된 양의 영양물이 사용된다: 약 10ng/ml 이상의 인슐린 및 약 1mg/ml 이하의 인슐린, 더 바람직하게는 약 10㎍/ml 인슐린; 약 1㎍/ml 이상의 트랜스페린 및 약 100㎍/ml 이하의 트랜스페린, 더 바람직하게는 약 10㎍/ml 트랜스페린; 약 500pg/ml 이상의 표피 성장인자(EGF) 및 5㎍/ml 이하의 EGF, 더 바람직하게는 5ng/ml EGF; 1x10-10M 이상의 셀레늄 및 1x10-6M 이하의 셀레늄, 더 바람직하게는 2.5x10-8M 셀레늄; 1x10-14M 이상의 트리요도티로닌(T3) 및 1x10-10M 이하의 T3, 더 바람직하게는 1x10-12M T3; 1x10-8M 이상의 에탄올아민 및 1x10-4M 이하의 에탄올아민, 더 바람직하게는 1x10-6M 에탄올아민; 1x10-8M 이상의 포스포에탄올아민 및 1x10-4M 이하의 포스포에탄올아민, 더 바람직하게는 1x10-6M 포스포에탄올아민; 1x10-10M 이상의 히드로코르티손 및 1x10-6M 이하의 히드로코르티손, 더 바람직하게는 1x10-8M 히드로코르티손; 7㎍ 이상의 총 단백질의 PPE/ml 및 750㎍ 이하의 총 단백질의 PPE/ml, 더 바람직하게는 약 75㎍의 총 단백질의 PPE/ml.
또한, 젠타마이신, 페니실린, 및/또는 스트렙토마이신과 같은 항생제 및/또는 항진균제가 배지에 첨가될 수 있으며, 항생제/항진균제는 배양 초기 단계 동안(예를 들어, 처음 2-5일)에만 첨가되는 것이 바람직하다.
세포는 본 분야에 잘 공지된 다양한 배양 용기에서 성장 및 계대될 수 있다. 바람직한 구체예는 사람 기저세포 암종 줄기세포가 기질로 코팅된 배양 접시에서 배양되는 것이다. 다양한 배양 기질이 본 분야에 공지되어 있다. 특히 바람직한 구체예에서, 사람 유방 암종 줄기세포는 피브로넥틴으로 코팅된 배양 접시에서 성장 및 계대된다.
사람 암 줄기세포의 특성화
여기 개시된 방식으로 분리된 본 발명의 사람 암 줄기세포는 몇몇 규정된 특징들을 가진다. 먼저, 사람 암 줄기세포는 그들의 성장 잠재력(자기-재생 능력)에 의해 특성화될 수 있다. 사람 암 줄기세포는 증식 능력의 손실 없이 세포 배양물 중에서 장기 성장하기에 적합하다.
본 발명의 사람 암 줄기세포는 이들의 성장에 최적화되도록 조제된 기본 영양 배지 중에서 증식 능력을 잃지 않고 유지될 수 있다. 여기 개시된 바람직한 영양 배지는 시험관내에서 사람 암 줄기세포를 배양하는데 사용될 수 있다. 상이한 타입의 기질이나 조직배양 플레이트를 사용하여 사람 암 줄기세포의 일부의 성장을 증진시킬 수 있다.
당업자에게 잘 공지된 대로, 일반적으로 영양 배지에 혈청을 첨가하여 세포 성장을 더 증진시킬 수 있다. 혈청 및 다른 동물-유래 단백질 또는 배지 첨가제는 혈청 생체분자를 함유하며, 본 발명의 사람 암 줄기세포는 혈청 생체분자가 전혀 첨가되지 않거나 최소한 첨가된 채로 성장되는 것이 특히 바람직하다. 여기 제공된 혈청 무함유 규정 배지는 CSC를 선별하도록 최적화된다. 이 배지는 혈청에 존재할 수 있는 어떤 상이한 신호는 제거하면서 CSC의 성장을 위한 필수 영양물 및 성장인자를 제공한다.
본 발명의 사람 암 줄기세포는 배양물 중에 장기간 유지될 수 있으며 하위-배양될 수 있다. 어떤 계대 배양 후 어떤 선택된 시간에서 사람 암 줄기세포는 면역원으로서, 생물학적 분석을 위해서, 이종이식편 모델에 사람 종양 모델을 확립하기 위해서, 또는 여기 개시된 대로 약물 발견 및/또는 개발을 위해서 사용될 수 있다.
마커를 사용한 사람 암 줄기세포의 특성화
본 발명의 사람 암 줄기세포의 다른 특징은 특이적 마커의 발현이다. CD24, CD34, CD133 및 CD44를 포함하는 광범한 마커가 사람 암 줄기세포에서 발현된다고 보고되었다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 사람 암 줄기세포는 CD34를 발현한다. CD34는 조혈 암 줄기세포 상에서 발현된다고 보고된 마커이다. 이전에는 배양물 중에서 고상 사람 암 줄기세포가 CD34를 발현하는 것이 관찰되지 않았다. 본 발명의 한 특징은 고상 종양 세포에서 CD34 발현이 고상 암 줄기세포의 확인을 위한 마커로서 사용된다는 것이다. 본 발명의 바람직한 사람 암 줄기세포는 검출가능한 수준의 CD34를 발현한다.
형태학에 의한 사람 암 줄기세포의 특성화
형태학적 특징으로 여기 개시된 방식으로 분리된 본 발명의 사람 암 줄기세포를 확인할 수 있다. 여기 개시된 대로, 사람 암 줄기세포는 사람 암 줄기세포가 분리된 종양 기원에 따라서 시험관내에서 부착된 세포로서 또는 현탁 배양물 중에서 성장할 수 있다. 사람 암 줄기세포의 형태는 대략 8-15㎛ 크기로 작다. 여기 개시된 방식으로 사람 암 줄기세포를 분리한 경우, 사람 암 줄기세포는 이들의 작은 크기로 인해 다른 세포 타입과 구별될 수 있다. 사람 암 줄기세포는 클러스터나 섬 형태로 성장할 수 있으며, 결국 단층 배양물을 형성한다. 부착된 세포로서 성장되었을 때, 사람 암 줄기세포는 입방형의 외형을 가질 수 있지만, 사람 암 줄기세포의 외형은 사람 암 줄기세포가 분리된 종양 기원 및 배양 조건에 따라서 달라질 수 있다. 현탁 배양물로서 성장되었을 때, 사람 암 줄기세포는 둥근 낭종 모양의 클러스터 형태일 수 있으며, 개별 세포는 사출물(들)을 가질 수 있다.
사람 암 줄기세포의 기능적 특성화
사람 암 줄기세포의 다른 특성은 이종이식편에서 적은 수의 세포로부터 생체내에서 종양을 형성하는 능력이다. 몇 가지 이종이식편 모델이 암 줄기세포의 기능적 특성화에 적합하며, 본 분야에 잘 공지되어 있다. 2개의 바람직한 이종이식편 모델은 면역-손상 마우스에서 세포의 피하 이식 및 면역-손상 마우스의 신장 캡슐(또는 콩팥 캡슐) 아래에 세포의 이식이다.
이종이식편 모델에 사람 암 줄기세포를 이식할 경우, 적은 수의 세포의 취급을 용이하게 하기 위해 기질이 사용될 수 있다. 적합한 기질의 예들은, 제한은 아니지만, 콜라겐, 라미닌, 피브로넥틴, 비트로넥틱, 및 Matrigel을 포함한다. 사람 암 줄기세포는 기질 안에 캡슐화될 수 있으며, 결과의 "플러그"가 숙주 동물에 직접 이식될 수 있다.
숙주 동물에 이식한 다음, 사람 암 줄기세포를 적합한 시간 동안 성장시킨다. 피하 이종이식편 모델이 사용된 경우, 결과의 종양 형성을 동물 안에서 시각적으로 관찰하거나, 또는 적합한 시간 후에 촉진할 수 있다. 신피막하 이종이식편 모델이 사용된 경우, 적합한 시간 후에 숙주 동물을 죽여서 종양 형성의 존재에 대해 신장(들)을 시각적으로 검사할 수 있다. 또한, 종양 형성을 검출하는 다른 방법들도 본 분야에 공지되어 있으며 적합할 수 있다. 예를 들어, 사람 특이적 프라이머를 사용하여 절제된 신장(들)에 대한 정량 PCR(QPCR)이 수행될 수 있다. 사람 DNA의 양을 정량하여 종양 형성 범위를 결정할 수 있다.
종양 형성을 검출하는 또 다른 방법은 종양을 절제한 다음, 형성된 종양이 사람 세포 기원을 가지는지 조직학적으로 결정하는 것이다. 이 방법은 종양 표현형에 대한 추가적 정보가 중요할 경우 특히 바람직하다.
사람 암 줄기세포의 용도
면역원
사람 암 줄기세포는 면역원으로서 사용된다. 본 발명에 개시된 대로, 독특한 혈청 무함유 배양 조건은 사람 암 줄기세포의 세포 표면에 표면과 결합할 수 있는 혈청 단백질 또는 혈청 생체분자가 없는 상태를 유지할 수 있도록 한다. 개시된 혈청 무함유 분리 및 배양 기술을 사용하여 항원 부위가 혈청 생체분자에 의해 결합되어 "가려질" 수 있는 잠재적 문제를 피할 수 있다. 따라서, 혈청을 함유하는 배양 조건을 사용할 때는 "가려져 있던" 새로 이용할 수 있는 항원들에 대한 항체들의 패널이 생성될 수 있다.
여기 개시된 방법에 의해 분리되고 배양된 사람 암 줄기세포는 이종성 수용자에게 투여되는 면역원으로서 사용될 수 있다. 이종성 수용자에게 면역원으로서 사람 암 줄기세포를 투여하는 방법은, 제한은 아니지만, 면역화, 면봉이나 스크래치 기구와 같은 직접 접촉에 의한 막 투여, 에어로졸에 의한 점막 투여, 및 경구 투여를 포함한다. 본 분야에 잘 공지된 대로, 면역화는 수동 또는 능동 면역화일 수 있다. 면역화 방법은 상이한 경로를 통해 발생할 수 있으며, 이들은, 제한은 아니지만, 복강내 주사, 진피내 주사, 풋패드 주사, 및 국소 주사를 포함한다. 면역화 대상은 마우스와 같은 포유동물을 포함할 수 있다. 면역화 경로 및 일정은 일반적으로 항체 자극 및 생성에 관한 잘 확립되어 있는 종래 기술이다. 이 구체예에서 마우스가 사용되지만, 사람이나 사람으로부터의 항체 생성 세포를 포함하는 어떤 포유동물 피험체를 본 발명의 과정에 따라서 조작하여 포유동물 하이브리도마 셀라인의 생성을 위한 기초로서 사용할 수 있다. 전형적으로, 면역원성 양의 사람 암 줄기세포를 마우스에 복강내 접종한 다음, 비슷한 양의 면역원으로 추가 접종한다. 바람직한 구체예에서, 마우스는 풋패드 주사에 의해 면역원성 양의 사람 암 줄기세포로 접종되고, 이때 보조제는 사용해도 되고 사용하지 않아도 되며, 그 다음 비슷한 양의 면역원으로 추가 접종된다. 대안으로서, 비-생물학적 막 매트릭스 상에서 성장된 세포를 수술에 의해 숙주 포유동물에 복강내 이식한다. 림프양 세포, 바람직하게는 마우스의 비장 림프양 세포를 최종 추가 주사 후 수일 내에 수집하고, 이로부터 세포 현탁액을 제조하여 융합에 사용한다.
Buck, D. W., et al, (1982) In Vitro, 18:377-381에 의해서 변형된 Kohler, B. and Milstein, C. (1975) Nature 256:495-497의 일반적인 체세포 혼성화 기술을 사용하여 림프구 및 불멸화된 골수종 세포로부터 하이브리도마가 제조된다. 제한은 아니지만, X63-Ag8.653 및 Salk Institute, Cell Distribution Center(미국 캘리포니아 샌디에고)로부터의 것들을 포함하는 이용가능한 골수종 라인들이 혼성화에 사용될 수 있다. 이 기술은 폴리에틸렌글리콜 같은 푸소겐(fusogen)을 사용하거나, 또는 당업자에게 잘 공지된 전기적 수단에 의해 골수종 세포와 림프양 세포를 융합하는 것을 포함한다. 융합 후에 세포를 융합 매질로부터 분리하고, HAT 배지 같은 선택적 성장 배지에서 성장시키고, 혼성화되지 않은 모 세포를 제거한다. 여기 설명된 배지 중 어느 것을 사용하여 단클론성 항체를 분비하는 하이브리도마를 배양할 수 있다. 세포 융합 기술의 다른 대안으로서, EBV 불멸화된 B 세포를 사용하여 본 발명의 단클론성 항체를 생성하는 것이 있다. 하이브리도마는 확장되고 하위-클로닝되며, 원한다면, 종래의 면역분석 과정(예를 들어, 방사성면역분석, 효소면역분석, 또는 형광면역분석)에 의해 상청액이 항-면역원 활성에 대해 분석된다.
이러한 항체를 생성하는 하이브리도마는 공지의 과정을 사용하여 시험관내에서 또는 생체내에서 성장될 수 있다. 원한다면, 단클론성 항체는 황산암모늄 침전, 겔 전기영동, 투석, 크로마토그래피, 및 한외여과와 같은 종래의 면역글로불린 정제 과정에 의해 배양 배지 또는 체액으로부터 분리될 수 있다. 바람직하지 않은 활성이 존재할 경우, 이것은, 예를 들어 고체상에 부착된 면역원으로 만들어진 흡착제 위에서 제조를 수행한 다음, 면역원으로부터 바람직한 항체를 용출 또는 방출시킴으로써 제거될 수 있다.
또한, 단클론성 항체는 미국특허 제4,816,567호에 개시된 것들과 같은 재조합 DNA 방법에 의해서 만들어질 수 있다. 본 발명의 단클론성 항체를 암호화하는 DNA는 종래의 과정을 사용하여 쉽게 분리되어 서열화될 수 있다(예를 들어, 뮤린 항체의 중쇄와 경쇄를 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여). 일단 분리된 후, DNA를 발현 벡터에 삽입한 다음, 이것을 다른 식으로는 면역글로불린 단백질을 생성하지 않는 원숭이 COS 세포, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, 또는 골수종 세포 같은 숙주세포에 트랜스펙션시켜 재조합 숙주세포에서 단클론성 항체의 합성을 달성한다. 또한, E. coli와 같은 원핵생물 숙주가 본원에서 항체의 재조합 생성에 적합하다. 또한, DNA는, 예를 들어 동종성 뮤린 서열 대신에 사람 중쇄 및 경쇄 불변 도메인의 코딩 서열을 치환시킴으로써(미국특허 제4,816,567호), 또는 비-면역글로불린 폴리펩티드의 코딩 서열의 전부 또는 일부를 면역글로불린 코딩 서열에 공유 결합시킴으로써 변형될 수 있다. 이러한 비-면역글로불린 폴리펩티드는 면역원으로서 본 발명의 세포를 사용하여 생성된 항체의 불변 도메인을 대신할 수 있거나, 또는 본 발명의 세포를 사용하여 키메라 2가 항체를 만들어서 생성된 항체의 1개의 항원-조합 부위의 가변 도메인을 대신할 수 있다.
이 방식으로 본 발명의 사람 암 줄기세포를 사용하여 사람 암 줄기세포에 특이적인 세포 표면 항원에 대한 새로운 항체들의 패널이 생성될 수 있다. 일단 여기 개시된 방법에 의해 사람 암 줄기세포 상의 세포 표면 항원에 대한 단클론성 항체가 만들어지고, 이 항체들이 몇 가지 용도로 사용된다.
재조합 항체 또는 사람화 항체를 생성하기 위해 항체가 서열화되고 클로닝될 수 있다. 사람 암 줄기세포-특이적 항체의 다른 용도는, 제한은 아니지만, 생물학적 시험 및 정제(예를 들어, 유세포분석 또는 패닝에 의한 사람 암 줄기세포의 분리), 치료적 용도(예를 들어, 항체와 표적 세포의 결합에 의한 세포 성장의 촉진이나 정지 또는 항체와 표적 세포의 결합에 의해 세포 덩어리 성장의 촉진이나 정지), 생물학적 마커(예를 들어, 다른 사람 암 줄기세포의 확인), 및 임상 진단(예를 들어, 사람 암 줄기세포의 확인)을 포함한다.
백신
본 발명은 능동 및 수동 면역화 모두에서 사용하기 위한 개시된 암 세포 백신을 고찰한다. 백신으로서 유용한 면역원성 조성물은 면역원성 펩티드와 선택된 암 세포로부터 가장 쉽게 제조될 수 있다. 암 세포는 숙주 암 세포에서 또는 동일한 타입의 암 세포에서 유래하며, 이들은 적합한 셀라인 또는 비-자기조직 종양 세포로부터 얻어질 수 있다.
본 종양 세포는 세포성 백신을 생성하는데 유용하다. 본 분야에 공지된 세포성 백신을 생성하는 다양한 방법을 이용할 수 있다(예를 들어, 미국 특허출원 제20050136066호, 제20050106130호, 및 제20050260208호 참조). 특히, 항원 제시 세포의 일종인 수지상 세포가 암 면역요법 분야에서 최근에 관심을 끌고 있다. 수지상 세포는 항원을 내재화할 수 있는 골수-유래 세포이며, 항원을 가공하여 MHC I 형 복합체와 MHC II 형 복합체 모두와 관련하여 항원이 제시되도록 한다. 어떤 양태에서, 본 발명에서 사용된 수지상 세포는 CD8+ T 세포(이것은 주로 세포독성 T 림프구이다)와 CD4+ T 세포(이것은 주로 헬퍼 T 세포이다)를 모두 활성화할 수 있다. I 형 MHC와 II 형 MHC 모두에서 내재화된 항원으로부터 유래된 펩티드를 제시할 수 있는 세포가 본 발명의 수지상 세포라는 것이 이해되어야 한다(Steinman, Annu. Rev. Immunol. 9:271-296 (1991)). 이런 능력으로 인하여 수지상 세포는 T 세포에 대한 관심의 항원을 제시하는데 사용될 수 있다. 성숙한 수지상 세포 위에서 종양 펩티드를 펄스 처리하는 것을 포함하여, 수지상 세포 위에 종양 항원을 직접 적재하기 위한 몇 가지 접근법이 채택되었다(Avigan, Blood Reviews 13:51-64 (1999)). 생체외에서 종양 항원을 적재시킨 수지상 세포를 분리하여 세포성 백신으로서 투여하는 것이 실험 동물에서 예방적 항-종양 면역성 및 치료적 항-종양 면역성을 유도하는 것으로 판명되었다(Timmerman et al, Annu. Rev. Med. 50:507-529 (1999)).
한 양태에서, CSC는 생체내 또는 생체외에서 수지상 세포와 같은 항원 제시 세포와 접촉된다. 수지상 세포에 의한 CSC의 항원의 흡수 시에, 항원이 제시되는 다른 림프구성 세포에 의해 세포성 백신이 생성될 것으로 예상된다. 수지상 세포에 더하여, 이런 제제를 제시하는데 유용한 다른 세포는, 제한은 아니지만, 대식세포, B 세포, 및 본 발명의 CSC와 융합된 다른 세포들을 포함한다.
다른 구체예에서, 백신접종이나 본 발명의 다른 방법에 사용되는 치료적 조성물은 본래대로의 CSC는 아니며, 대신에 그것은 정제된 세포막 제제로서, 백신으로서 작용하여 피험체에서 종양에 대한 내인성 반응을 유도하거나 증대시킨다. 이들 구체예에서 면역원은 원형질막 단편 또는 소포로 구성되며, 바람직하게는 우측 바깥쪽으로 배향되고, 암환자에서 면역원의 공급원인 세포와 환자 자신의 암 세포 사이에 공유된 에피토프에 대한 면역반응을 유도하는 방식으로 환자에게 투여된다.
원형질막 소포(PMV)에서 발원하는 세포는 이 발원 타입의 종양에 의해 일반적으로 발현되는 여러 종양태아성(oncofetal) 항원을 발현하는 본 발명의 CSC를 포함한다. 또는 달리, 이들은 암 줄기세포가 아니라 태아 조직 줄기세포일 수 있다.
암 세포 백신은 전형적으로 현탁액 형태의 주사제로서 제조된다. 세포 현탁액은 제약학적으로 허용되며 세포와 양립되는 부형제와 혼합될 수 있다. 적합한 부형제는, 예를 들어 물, 식염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등과 이들의 조합을 포함한다. 이에 더하여, 원할 경우, 백신은 습윤 또는 유화제, pH 완충제, 또는 백신의 효능을 증진시키는 보조제와 같은 조제 물질을 소량 함유할 수 있다.
백신은 비경구 경로, 주사, 예를 들어 피하 또는 근육내 주사에 의해 종래대로 투여되며, 제형과 양립되는 방식으로 치료적으로 유효하고 면역원성인 양으로 투여된다. 또는 달리, 백신의 진피내 주사가 바람직할 수 있다. 투여량은 항체를 합성하는 숙주의 면역 시스템의 능력, 및 원하는 보호 정도 등을 포함하여 치료될 대상에 따른다. 형질전환 세포의 정확한 필요량은 주치의의 판단과 숙주의 나이, 건강상태, 성별 등에 어느 정도 의존할 것이다. 그러나, 적합한 용량 범위는 동물 모델 및 초기 임상 연구로부터 결정될 수 있다. 일반적으로, 106 정도의 형질전환 세포가 필요할 것으로 고려된다.
숙주 면역 시스템이 약화 또는 손상된 경우에는 보조제가 바람직할 수 있다. 일반적으로 사용되는 보조제는 수산화 알루미늄 또는 인산알루미늄(알럼), 당의 합성 고분자들과의 혼합물(Carbopol RTM), 열처리(예를 들어, 70-101℃)에 의한 백신 내 단백질 응집물 등의 제제를 포함한다. 또한, 알부민에 대한 펩신 처리된(Fab) 항체를 사용한 불활성화에 의한 응집물, C. parvum 또는 그램-음성 박테리아의 내독소 또는 리포다당 성분과 같은 박테리아 세포와의 혼합물, 만나이드 모노-올레에이트(Aracel A)와 같은 생리학적으로 허용되는 식물유 비히클 중의 에멀젼 또는 블록 치환체로서 사용되는 퍼플루오로카본(Fluosol-DA.RTM)의 20% 용액을 사용한 에멀젼이 사용될 수 있다. 다른 보조제들도 본 분야에 잘 공지되어 있다.
어떤 예에서는 복수 용량의 백신을 투여하는 것이 바람직할 것이며, 이것은 일반적으로 10회 백신접종을 초과하지 않고, 더 일반적으로는 4회를 초과하지 않으며, 바람직하게는 1회 이상, 통상 2회 또는 3회이다. 백신접종은 일반적으로 2주 내지 12주 간격으로 이루어지며, 더 일반적으로는 3주 내지 5주 간격이다. 1-5년, 일반적으로 3년 간격으로 주기적인 추가 주사가 보호 수준의 항체 및 메모리 T 세포를 유지하기 위해 필요할 수 있다.
제약학적 백신 조성물
암 세포 백신을 함유하는 제약 조성물은 바람직하게 비경구, 복강내, 진피내 또는 근육내 경로로 투여된다. 주사에 적합한 제약 형태는 용액 또는 분산액의 즉시 준비가 가능한 멸균 수성 용액 또는 분산액을 포함한다. 모든 경우에 제약 형태는 멸균되어야 하며, 주사가 용이할 정도로 유동성이어야 한다. 제약 형태는 제조 및 보관 조건 하에서 안정해야 하고, 박테리아 및 진균 같은 미생물의 오염 작용에 대해 보호되어야 한다. 담체는, 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌글리콜 및 액상 폴리에틸렌글리콜 등), 이들의 적합한 혼합물, 및 식물유를 함유하는 용매 또는 분산매질일 수 있다. 레시틴 같은 코팅의 사용에 의해, 분산물의 경우 필요한 입자 크기의 유지에 의해, 그리고 계면활성제의 사용에 의해 적합한 유동성이 유지될 수 있다. 미생물 작용의 방지는 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 등과 같은 다양한 항균제 및 항진균제에 의해 행해질 수 있다. 많은 경우에 당 또는 염화나트륨 등의 등장제가 포함될 수 있다. 주사 조성물의 연장된 흡수작용은 조성물에 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴의 사용에 의해 야기될 수 있다.
멸균 주사 용액은, 필요에 따라 상기 언급된 여러 다른 성분들을 가진 적합한 용매에 필요한 양의 활성 화합물을 혼합한 다음, 여과 멸균하여 제조된다. 일반적으로, 분산물은 기본 분산 매질과 상기 언급된 것들로부터의 필요한 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클에 다양한 멸균된 활성 성분을 혼합하여 제조된다. 멸균 주사 용액으로 제조가 가능한 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 진공-건조 및 동결-건조 기술로서, 활성 성분과 앞서의 멸균-여과된 용액으로부터의 어떤 추가의 바람직한 성분이 더해진 분말이 수득된다.
본원에서 사용된 "제약학적으로 허용되는 담체"는 어떤 그리고 모든 용매, 분산매질, 코팅제, 항균제 및 항진균제, 등장제 및 흡수지연제 등을 포함한다. 제약학적으로 활성인 물질에 이러한 매질 및 제제의 사용은 본 분야에 잘 공지되어 있다.
어떤 종래의 매질 또는 제제가 활성 성분과 양립 불가능한 경우를 제외하고, 치료 조성물에 이들을 사용하는 것이 고려된다. 또한, 보충 활성 성분이 조성물에 혼합될 수 있다.
용어 "제약학적으로 허용되는"은 사람에게 투여되었을 때 알레르기 반응이나 유사한 불리한 반응을 야기하지 않는 분자 및 조성물을 말한다. 활성 성분으로서 단백질을 함유하는 수성 조성물의 제조는 본 분야에서 잘 이해되고 있다. 전형적으로, 이러한 조성물은 액체 용액 또는 현택액의 주사제로서 제조된다. 또한, 주사 전에 액체 중에 용액으로서, 또는 현탁액으로서 만들기 적합한 고체 형태로 제조될 수도 있다. 또한, 제제는 유화제일 수 있다.
조제된 용액은 제형과 양립되는 방식으로 치료적으로 효과적인 양으로 투여될 것이다. 조제물은 다양한 제형으로 쉽게 투여되며, 주사 용액이 바람직하다.
수성 용액으로 비경구 투여하기 위하여, 예를 들어, 용액은 필요에 따라 적합하게 완충되어야 하며, 먼저 액체 희석제를 충분한 식염수 또는 글루코오스로 등장성으로 만든다.
이들 특수한 수성 용액은 특히 정맥내, 근육내, 피하, 진피내 및 복강내 투여에 적합하다. 이와 관련하여, 사용될 수 있는 멸균 수성 매질이 본 명세서에 비추어 당업자에게 잘 공지되어 있다. 예를 들어, 1회 용량을 등장성 NaCl 용액 1ml에 용해한 다음, 피하체액주입 유체(hypodermoclysis fluid) 1000ml에 첨가하거나, 또는 제안된 주입 부위에 주사할 수 있다(예를 들어, "Remington's Pharmaceutical Sciences" 15판, 1035-1038 페이지 및 1570-1580 페이지). 치료될 대상의 조건에 따라서 용량의 어떤 변형이 필수적으로 발생할 것이다. 어떤 경우, 투여를 책임진 사람이 개별 환자에 대한 적합한 용량을 결정할 것이다. 더욱이, 사람의 투여에 대해서, 제제는 FDA 사무국에 의해 요구되는 생물학 기준에 따른 멸균성, 발열성, 일반적인 안전성 및 순도 기준을 충족해야 한다.
약물 발견
사람 암 줄기세포의 또 다른 용도는 약물 발견과 관련된다. 여기 개시된 분리된 사람 암 줄기세포 집단 및 본 발명의 교시에 따라서 얻어진 것들은 이전에는 개시된 방식으로 분리되거나 배양된 적이 없었기 때문에, 이들은 새로운 것이며, 지금까지 발견되거나 특성화되지 않았던 단백질을 이들의 표면상에 출현시키거나, 발현 또는 분비할 수 있다. 혈청을 사용한 이전의 배양 기술은 세포 표면상의 단백질 출현 및/또는 단백질의 분비를 억제할 수 있다. 추가하여, 혈청 단백질 또는 혈청 생체분자는 CSC 표현형의 변화를 일으킬 수 있고, 암 줄기세포 표면에 결합하여 내인성 CSC 항원에 대한 단클론성 항체의 발생을 방해할 수 있다. 또는 달리, 분비된 단백질이 혈청 생체분자와 상호작용함에 따라, 단백질의 기능, 형태, 또는 활성이 변할 수 있다. 규정된 혈청 무함유 배지에서 성장된 사람 암 줄기세포에 의해 출현되거나 분비된 단백질은 혈청 생체분자로 인한 방해작용이 최소한으로 되며, 따라서 생리학적으로 그리고 형태적으로 더 정확할 수 있다. 따라서, 사람 암 줄기세포에 의해 발현되거나, 분비되거나, 또는 이들 세포의 표면에 출현된 단백질은 약물 개발을 위한 바람직한 표적이다. 한 구체예에서, 약물은 사람 암 줄기세포 및/또는 세포들에 대한 표적 특이적 단백질이 생체내에서 치료되거나 거기서 분화되도록 한다. 약물의 결합은 사람 암 줄기세포의 성장 능력을 변경할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 사람 암 줄기세포를 사용하여 사람 종양 세포와 상호작용하는 소 분자 또는 다른 치료제를 개발하거나 발견할 수 있다. 이들 소 분자는 합성 소 분자 또는 천연 소 분자일 수 있으며, 사람 종양 세포의 성장을 중단, 억제 또는 촉진하는데 사용될 수 있다.
치료 방법
본 발명의 다른 양태는 암 줄기세포(전체 또는 부분), 또는 본 발명의 종양 줄기세포의 표면에 존재하는 표적 항원의 조정제(제한은 아니지만 항체를 포함하는)로 질환 상태를 치료하는 것을 포함한다.
다른 양태로서, 본 발명은 질환으로 진단된 대상에게 어떤 양의 방사선요법제와 CSC 또는 CSC 세포 표면 항원의 조정제를 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 바람직한 구체예에서, 방사선요법제는 방사성 활성 동위원소(예를 들어, At-211, I-131, I-125, Y-90, Re-186, Re-188, Sm-153, Bi-212, P-32 및 Lu의 방사성 활성 동위원소들)로 구성되는 군으로부터 선택되지만, 다른 구체예에서는 다른 제제, 예를 들어 화학요법제, 독소, 예를 들어 소 분자 독소 또는 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소 활성 독소, 이들의 단편 및/또는 변이체, 자유 라디칼, 전기 전하, 허혈, 산화체 손상, 열 충격, 심장비대, 발열, 염증, 대사질환, 감염, 사이토카인, 성장인자, 호르몬, 병원균(예를 들어, 박테리아, 기생충, 세포내 기생충, 진균, 바이러스, 프리온 및 비로이드), 세포-세포 상호작용, 가용성 인자, 및 다른 원인의 세포 및 조직 손상이 투여된다.
본 치료 방법은 여기 개시된 다양한 치료 조성물을 사용하거나, 또는 본 분야에 공지된 어떤 치료법과 조합하여 사용할 수 있다. 한 구체예에서, 항체 집단 및/또는 이러한 항체를 생성하는 하이브리도마가 질환 상태의 치료에 사용된다.
다른 구체예에서, 본 발명의 치료 조성물은 질환 세포 또는 손상 세포를 보체 의존성 세포독성(CDC), 항체 의존성 세포 매개 세포독성(ADCC) 또는 다른 숙주 감독 면역성에 대해 더욱 민감하게 만드는데 효과적이다.
다른 구체예에서, 본 발명의 치료 조성물은 동일한 또는 상이한 부류에 속하는 다른 제제들과 조합하여 사용된다. 조합 치료는 동시에 일어날 수 있거나, 또는 한 치료가 다른 치료에 선행할 수 있다. 이들이 필요한 대상에는 상이한 치료 조성물을 상이한 치료 시점에서 순환시켜가며 사용할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 본 발명의 치료 조성물을 사용한 개인 맞춤 치료를 포함하는데, 이 경우 환자의 질환 세포 상에서 발현되는 항원(들)을 판단한 다음, 특정 해당 항원을 조정하는 본 발명의 치료 조성물을 여기 개시된 방법에 따라서 환자에게 투여한다. 한 구체예에서, 본 발명의 치료 조성물은 개인 맞춤 치료를 위해 사용된다.
신생물성 상태의 치료
신생물성 상태는 양성 및 악성 종양(예를 들어, 신장, 간, 콩팥, 방광, 유방, 위, 난소, 결직장, 전립선, 췌장, 폐, 음문, 갑상선, 간의 암종; 육종; 아교모세포종; 및 각종 두경부 종양); 백혈병 및 림프양 악성질환; 기타 장애, 예를 들어 신경세포, 아교세포, 성상세포, 시상하부 및 다른 선, 대식세포, 상피, 기질 및 포배낭 장애; 및 염증, 혈관형성, 면역학적 장애 및 병원균으로 인한 장애를 포함한다. 본 발명의 치료 조성물 및 방법을 사용한 치료를 위한 특히 바람직한 표적은 신생물성 상태이다.
본 발명은 몇 가지 특이적 신생물성 상태를 치료하기 위한 방법을 제공한다. 어떤 구체예에서, 신생물성 상태는, 제한은 아니지만, 부신 종양, AIDS-관련 암들, 연부포상(alveolar soft part) 육종, 성상세포 종양, 방광암(편평세포 암종 및 과도기 세포 암종), 골암(사기질종, 동맥류성 골낭종, 뼈연골종, 골육종), 뇌척수암, 전이성 뇌종양, 유방암, 경동맥 소체 종양, 자궁경부암, 연골육종, 척삭종, 혐색소성 신장세포 암종, 투명세포 암종, 결장암, 결직장암, 피부의 양성 섬유성 조직구종, 결합조직형성성 원형 소 세포 종양, 뇌실막세포종, 유잉씨 종양, 골격외 점액양 연골육종, 골성 불완전 섬유형성증, 뼈의 섬유성 이형성증, 담낭담관암, 임신성 융모성 질환, 생식세포 종양, 두경부암, 섬 세포 종양, 카포시 육종, 콩팥암(콩팥모세포종, 유두상 신장세포 암종), 백혈병, 지방종/양성 지방종성 종양, 지방육종/악성 지방종성 종양, 간암(간모세포종, 간세포 암종), 림프종, 폐암(소 세포 암종, 선암종, 편평세포 암종, 대 세포 암종 등), 속질모세포종, 흑색종, 수막종, 다발성 내분비 신생물, 다발성 골수종, 골수형성이상 증후군, 신경모세포종, 신경내분비 종양, 난소암, 췌장암, 유두상 갑상선 암종, 부갑상선 종양, 소아암, 말초 신경초종, 갈색세포종, 뇌하수체 종양, 전립선암, 후방 포도막 흑색종, 희귀 혈액학적 장애, 신장의 전이성 암, 횡문근 종양, 횡문근육종, 육종, 피부암, 연조직 육종, 편평세포암, 위암, 활액 육종, 고환암, 흉선 육종, 흉선종, 갑상선의 전이성 암, 및 자궁암(자궁경부 암종, 자궁내막 암종, 및 평활근종)을 포함하는 군으로부터 선택된다. 어떤 바람직한 구체예에서, 암성 세포는, 제한은 아니지만, 유방암, 결장암, 전립선암, 폐암, 육종, 신장의 전이성 암, 갑상선의 전이성 암, 및 투명세포 암종을 포함하는 고상 종양의 군으로부터 선택된다.
갑상선의 암종은 내분비 시스템의 가장 흔한 악성질환이다. 갑상선의 암종은 분화된 종양(유두상 또는 소포성) 및 불량하게 분화된 종양(골수성 또는 미분화성)을 포함한다. 질의 암종은 편평세포 암종, 선암종, 흑색종 및 육종을 포함한다. 고환암은 생식세포종 타입과 비-생식세포종 타입으로 광범하게 나눠진다.
흉선종은 흉선의 상피 종양으로서, 비신생물성 림프구에 의해 광범하게 침윤될 수도 있고 그렇지 않을 수도 있다. 용어 "흉선종"은 분명한 상피 성분 부정형을 나타내지 않는 신생물을 설명하기 위해 관례적으로 사용된다. 윤곽이 뚜렷한 세포 부정형과 더 이상 흉선에 특이적이지 않은 조직학적 특징을 나타내는 흉선 상피 종양은 흉선 암종(또는 C 타입 흉선종)으로 알려져 있다.
한 바람직한 구체예에서, 본 발명은 유방암, 예를 들어 유방선의 맥관 조직의 맥관 암종, 골수성 암종, 교질 암종, 관상 암종, 및 염증성 유방암을 치료하는 방법을 제공한다. 이런 유방암 환자에게 이용될 수 있는 기존의 치료는 수술, 면역요법, 방사선요법, 화학요법, 내분비요법, 또는 이들의 조합이다. 본 치료 조성물은 환자를 이런 치료들 또는 이들의 조합 중 어느 것으로 치료한 후에 투여될 수 있다. 어떤 구체예에서, 본 치료 조성물은 환자를 독소루비신, 시클로포스파미드, 메토트렉세이트, 파클리탁셀, 티오테파, 메토산트론, 빈크리스틴, 또는 이들의 조합과 같은 하나 이상의 화학치료제로 치료한 후에 투여될 수 있다. 다른 구체예에서, 본 치료 조성물은 환자를 타목시펜, 메제스트롤 아세테이트, 아미노글루테티미드, 플루옥시메스테론, 류프롤라이드, 고세렐린, 및 프레드니손과 같은 하나 이상의 내분비요법제로 치료한 후에 투여될 수 있다.
다른 구체예에서, 본 발명은 상피 난소 종양을 포함하는 난소암, 예를 들어 난소의 선암종 및 난소로부터 복강으로 전이된 선암종의 치료를 제공한다. 본 치료 조성물은 환자를 면역요법, 방사선요법, 화학요법, 내분비요법, 또는 이들의 조합을 포함하는 기존의 치료 중 어느 것으로 치료한 후에 투여될 수 있다. 어떤 구체예에서, 치료 조성물은 환자를 시클로포스파미드, 에토포시드, 알트레타민, 및 이포스파미드와 같은 하나 이상의 화학치료제로 치료한 후에 투여될 수 있다. 다른 구체예에서, 본 치료 조성물은 환자를 타목시펜과 같은 하나 이상의 호르몬 요법제로 치료한 후에 투여될 수 있다.
추가하여, 본 발명은 자궁경부암, 예를 들어 편평세포 암종 및 선암종을 포함하는 자궁경부 상피의 선암종을 치료하는 방법을 제공한다. 자궁경부암에 이용할 수 있는 주된 치료는 수술(저온수술, 자궁절제술, 및 근치적 자궁절제술), 면역요법, 방사선요법(외부 빔 방사선요법 및 근접치료) 및 화학요법이다. 어떤 구체예에서, 본 치료 조성물은 환자를 시스플라틴, 카르보플라틴, 히드록시유레아, 이리노테칸, 블레오마이신, 빈크리스틴, 미토마이신, 이포스파미드, 플루오로우라실, 에토포시드, 메토트렉세이트, 또는 이들의 조합과 같은 하나 이상의 화학치료제로 치료한 후에 투여될 수 있다.
또한, 본 발명은 전립선암, 예를 들어 선암종 또는 뼈로 전이된 선암종으로부터 선택된 전립선암을 위한 치료를 제공한다. 수술, 면역요법, 방사선요법, 저온수술, 호르몬요법, 및 화학요법이 전립선암 환자에게 이용될 수 있는 일부 치료이다. 어떤 방사선요법 옵션은 3-차원 등각 방사선요법, 집중 조정 방사선요법, 및 등각 양성자 빔 방사선요법을 포함하는 외부 빔 방사선이다. 근접치료 및 저온수술이 전립선암을 치료하는데 사용될 수 있는 다른 가능한 방법이다. 본 치료 조성물은 환자를 이들 치료 또는 이들의 조합 중 어느 것으로 치료한 후에 투여될 수 있다. 어떤 구체예에서, 본 치료 조성물은 환자를 황체형성 호르몬-방출 호르몬(LHRH) 유사체, 예를 들어 류프롤라이드, 고세렐린, 트립토렐린, 및 히스렐린, 및 LHRH 길항제, 예를 들어 아바렐릭스를 포함하는 하나 이상의 호르몬 요법제로 치료한 후에 투여될 수 있다. 다른 구체예에서, 본 치료 조성물은 환자에게 안드로겐 결핍 요법 또는 안드로겐 억제 요법, 예를 들어 고환절제술을 행한 후에 투여될 수 있다. 다른 구체예에서, 본 치료 조성물은 환자를 피우타미드, 바이칼루타미드, 및 닐루타미드와 같은 항-안드로겐제로 치료한 후에 투여될 수 있다. 다른 구체예에서, 본 치료 조성물은 환자를 독소루비신, 에스트라뮤스틴, 에토포시드, 미톡산트론, 빈블라스틴, 파클리탁셀, 도세탁셀, 카르보플라틴, 프레드니손, 또는 이들의 조합과 같은 하나 이상의 화학치료제로 치료한 후에 투여될 수 있다.
또한, 본 발명은 췌장암, 예를 들어 췌장관 조직의 상피양 암종 및 췌장관의 선암종을 치료하는 방법을 제공한다. 본 치료 조성물은 환자를 화학요법 및 방사선요법, 또는 이들의 조합을 포함하는 기존의 치료법 중 어느 것으로 치료한 후에 투여될 수 있다. 본 치료 조성물은 환자를 5-플루오로우라실(5-FU), 미토마이신, 이포스파미드, 독소루비신, 스텝토조신, 클로로조토신, 또는 이들의 조합과 같은 하나 이상의 화학요법제로 치료한 후에 투여될 수 있다.
본 발명은 방광암, 예를 들어 방광의 과도기 세포 암종, 요로상피세포 암종(과도기 세포 암종), 방광 안쪽의 요로상피세포의 종양, 편평세포 암종, 선암종, 및 소세포 암을 치료하는 추가의 방법을 제공한다. 어떤 구체예에서, 본 치료 조성물은 환자를 바실러스 칼메트-구에린(BCG: Bacillus Calmete-Guerin), 인터페론 및 당단백질과 같은 하나 이상의 면역요법제로 치료한 후에 투여될 수 있다. 다른 구체예에서, 본 치료 조성물은 환자를 시테파, 메토트렉세이트, 빈블라스틴, 독소루비신, 시클로포스파미드, 파클리탁셀, 카르보플라틴, 시스플라틴, 이포스파미드, 젬시타빈, 또는 이들의 조합과 같은 하나 이상의 화학요법제로 치료한 후에 투여될 수 있다.
더욱이, 본 발명은 편평세포암종, 선암종, 및 대세포 미분화 암종, 및 소세포 폐암으로 분할되는 비-소세포 폐암(NSCLC) 같은 폐암의 치료를 제공한다. 폐암의 치료 옵션은 수술, 면역요법, 방사선요법, 화학요법, 광역학요법, 또는 이들의 조합을 포함한다. 폐암의 치료를 위한 어떤 가능한 수술 옵션은 절편상 또는 쐐기상 절제, 폐엽절제술, 또는 폐절제술이다. 방사선요법은 외부 빔 방사선요법 또는 근접치료일 수 있다. 어떤 구체예에서, 본 치료 조성물은 시스플라틴, 카르보플라틴, 파클리탁셀, 도세탁셀, 젬시타빈, 비노렐빈, 이리노테칸, 에토포시드, 빈블라스틴, 제피티닙, 이포스파미드, 메토트렉세이트, 또는 이들의 조합과 같은 하나 이상의 화학요법제로 환자를 치료하기 이전에, 이후에, 또는 동시에 투여될 수 있다.
본 치료 방법은 신생물성 세포, 특히 이전에 항암제에 노출된 적이 있는 신생물성 세포의 성장을 억제하는데 특히 효과적일 수 있다. 또한, 본 방법은 항암 치료제에 대한 세포 감수성을 유지 또는 증가시키는데 효과적일 수 있다.
본 발명은 몇 가지 특이적인 선천적 및 후천적 면역결핍 상태를 치료하기 위한 방법을 제공한다. 예를 들어, 선천적 및 후천적 면역결핍 상태는 B 세포 (항체) 결핍, 조합된 T 세포 및 B 세포 (항체) 결핍, T 세포 결핍, 결함성 포식세포, 보체 결핍 및 면역억제제의 투여로 인한 결핍을 포함한다.
투여 방법
본 발명의 치료 조성물은 공지된 방법에 따라서, 예를 들어 볼루스로서 또는 일정한 기간에 걸친 연속 주입에 의한 정맥내 투여에 의해, 근육내, 복강내, 경점막, 뇌척수내, 피하, 관절내, 활액내, 수강내, 경구, 국소, 또는 흡입 경로에 의해 포유동물, 바람직하게는 사람에게 투여된다. 정맥내 항체 투여가 바람직하다. 본 발명의 치료 조성물은 치료적 치료, 예를 들어 화학치료제와 조합하여 상기 설명된 대로 투여될 수 있다. 이 치료제는 동일한 또는 상이한 투여 경로로 투여될 수 있다.
치료적 치료는 항원 조정제를 사용한 치료에 앞서거나 또는 그러한 치료 이후일 수 있으며, 동시에 일어날 수도 있다. 치료제의 효과적인 양은 통상적인 시험에 의해 결정될 수 있다. 병용-투여는 동시 투여, 또는 두 가지 제제의 어떤 순서로의 연속 투여를 포함한다.
조합 투여는 동일한 제형 내의 둘 이상의 제제의 동시 투여, 별도의 제형으로의 동시 투여, 그리고 개별 투여를 포함할 수 있다. 즉, 본 치료 조성물과 또 다른 치료제는 같은 제형 내에 함께 조제되어 동시에 투여될 수 있다. 또는 달리, 본 치료 조성물과 또 다른 치료제는 별도의 조제물로서 존재하는 두 제제로서 동시에 투여될 수 있다. 다른 대안으로서, 치료제를 투여한 직후 나머지 치료제를 투여하거나, 또는 그 반대일 수도 있다. 개별적 투여 프로토콜에서, 본 치료 조성물과 또 다른 치료제는 수 분 간격으로, 또는 수 시간 간격으로, 또는 수 일 간격으로 투여될 수 있다.
신생물성 상태의 치료와 관련하여, 신생물성 상태의 단계에 따라서, 신생물성 상태의 치료는 수술에 의해 신생물성 조직을 제거하는 요법, 방사선요법, 및 화학요법 중 하나 또는 이들의 조합을 포함한다. 본 발명의 치료 방법은 화학요법 등의 치료제의 치료지수를 개선하여 감소된 유효 용량이 투여될 수 있도록 한다. 따라서, 본원의 치료 방법은 노인 환자 및 화학요법의 독성과 부작용을 잘 견디지 못하는 환자들의 치료에 특히 유용하며, 또한 방사선요법이 제한된 유용성을 가지는 전이성 질환에서 특히 유용하다.
다른 치료 섭생들도 치료 조성물 및 화학치료제와 같은 항암제의 투여와 조합될 수 있다. 예를 들어, 이러한 항암제로 치료될 환자는 또한 방사선요법을 받을 수도 있고 및/또는 수술을 받을 수도 있다.
질환의 예방이나 치료를 위해서, 치료 조성물, 예를 들어 본원의 항체의 적합한 용량은 상기 정의된 바의 치료될 질환의 타입, 질환의 중증도 및 진행과정, 제제가 예방 목적으로 투여되는지 치료 목적으로 투여되는지의 여부, 이전에 받은 요법, 환자의 임상 병력 및 제제에 대한 반응성, 및 주치의의 판단에 따를 것이다. 제제는 환자에게 1번 또는 일련의 치료 과정에 걸쳐서 적합하게 투여된다.
조제물
본 발명의 치료 조성물의 여러 조제물이 투여에 사용될 수 있다. 어떤 구체예에서, 치료 조성물은 순수한 상태로 투여될 수 있다. 약리학적 활성제에 더하여, 본 발명의 조성물은 약리학적 유효 물질의 투여를 촉진하거나, 또는 작용 부위로의 송달을 위해 제약학적으로 사용될 수 있는 제제로 활성 화합물의 가공을 용이하게 하는 비교적 불활성인 물질로서 본 분야에 잘 공지된 부형제 및 조제를 포함하는 적합한 제약학적으로 허용되는 담체를 함유할 수 있다. 예를 들어, 부형제는 형태나 컨시스턴시를 제공하거나, 또는 희석제로서 작용할 수 있다. 적합한 부형제는, 제한은 아니지만, 안정제, 습윤 및 유화제, 오스몰농도를 변화시키는 염, 캡슐화제, 완충제, 및 피부침투 증진제를 포함한다.
비경구 투여를 위한 적합한 조제물은 수용성 형태, 예를 들어 수용성 염 형태의 활성 화합물의 수성 용액을 포함한다. 이에 더하여, 유성 주사 현탁액으로 적합한 활성 화합물의 현탁액이 투여될 수 있다. 적합한 친유성 용매 또는 비히클은 지방 오일, 예를 들어 참깨유, 또는 합성 지방산 에스테르, 예를 들어 에틸 올레에이트 또는 트리글리세리드를 포함한다. 수성 주사 현탁액은 현탁액의 점도를 증진시키는 물질을 함유할 수 있으며, 예를 들어 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스, 소르비톨, 및/또는 덱스트란을 포함한다. 선택적으로, 현탁액은 또한 안정제를 함유할 수 있다. 또한, 세포로의 송달을 위해 리포솜을 사용하여 제제를 캡슐화될 수 있다.
본 발명에 따른 전신 투여를 위한 제약 조제물은 장관, 비경구 또는 국소 투여에 알맞게 조제될 수 있다. 사실 모두 세 가지 타입의 조제물을 동시에 사용하여 활성 성분의 전신 투여를 달성할 수 있다. 비경구 및 비-비경구 약물 송달에 알맞은 부형제 및 조제물은 Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 20판, Mack Publishing (2000)에 제시된다.
경구 투여를 위한 적합한 조제물은 경질 또는 연질 젤라틴 캡슐, 알약, 정제, 코팅 정제, 엘리시르, 현탁액, 시럽, 또는 이들의 흡입 및 제어 방출 형태를 포함한다.
일반적으로, 이들 제제는 주사(예를 들어, 복강내, 정맥내, 피하, 근육내 등)에 의한 투여에 알맞게 조제되지만, 다른 투여 형태(예를 들어, 경구, 점막 등)도 사용될 수 있다. 따라서, 치료 조성물은 바람직하게 식염수, 링거 용액, 덱스트로스 용액 등과 같은 제약학적으로 허용되는 비히클과 조합된다.
특정 투약 섭생, 즉 용량, 타이밍 및 반복회수는 특정 개체 및 그 개체의 의학적 병력에 따른 것이다. 일반적으로 항체와 관련하여, 적어도 약 100ug/kg 체중, 더 바람직하게는 적어도 약 250ug/kg 체중, 더욱 바람직하게는 적어도 약 750ug/kg 체중, 더욱 더 바람직하게는 적어도 약 3mg/kg 체중, 더욱 더 바람직하게는 적어도 약 5mg/kg 체중, 더욱 더 바람직하게는 적어도 약 10mg/kg 체중의 용량이 투여된다.
반감기와 같은 경험적 고려사항이 투약 결정시에 일반적으로 고려될 것이다. 항체와 관련하여, 사람화 항체 또는 완전 사람 항체와 같은 사람 면역 시스템과 양립하는 항체가 항체의 반감기를 연장하고 항체가 숙주의 면역 시스템에 의해 공격받는 것을 방지하기 위해 사용될 수 있다. 투여 빈도는 치료법의 진행과정에 걸쳐서 결정되고 조정될 수 있으며, 신생물성 세포의 수를 감소시키고, 신생물성 세포의 감소 상태를 유지하고, 신생물성 세포의 증식을 감소시키고, 또는 전이의 발생을 지연시키는 것을 기초로 한다. 또는 달리, 본 치료 조성물의 지속적인 연속 방출 조제물이 적합할 수 있다. 지속 방출을 달성하기 위한 각종 조제물 및 장치가 본 분야에 공지되어 있다.
한 구체예에서, 치료 조성물의 용량은 1회 이상의 투여(들)를 받은 개체에서 경험적으로 결정될 수 있다. 개체에는 여기 설명된 대로 제조된 치료 조성물을 점증하는 용량으로 제공한다. 항체의 효능을 평가하기 위해서, 특이적 질환, 장애 또는 상태의 마커가 추적될 수 있다. 암을 가진 개체의 구체예에서, 이들은 촉진이나 시각적 관찰에 의한 종양 크기의 직접 측정, x-선이나 다른 조영 기술에 의한 종양 크기의 간접 측정, 직접 종양 생검 및 종양 샘플의 현미경 검사에 의해 평가되는 개선사항, 간접 종양 마커(예를 들어, 전립선암에서 PSA) 또는 여기 개시된 방법에 따라서 확인된 항원의 측정, 통증 또는 마비의 감소, 말하기, 시력, 호흡 또는 다른 종양 관련 무능력의 개선, 식욕 증가, 또는 승인된 검사에 의해 측정되는 삶의 질의 증가 또는 생존 연장을 포함한다. 개체, 신생물성 상태의 타입, 신생물성 상태의 단계, 신생물성 상태가 개체의 다른 장소로 전이되기 시작했는지의 여부, 그리고 과거 및 현재 동시에 사용되는 치료에 따라서 용량이 달라질 것이라는 것이 당업자에게 자명할 것이다.
다른 조제물은, 제한은 아니지만, 리포솜 같은 담체를 포함하는 본 분야에 공지된 적합한 송달 형태를 포함한다. 리포솜 제제는, 제한은 아니지만, 시토펙틴, 다층 소포 및 단층 소포를 포함한다.
어떤 구체예에서, 하나 이상의 치료 조성물이 존재할 수 있다. 이러한 조성물은 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상의 상이한 치료 조성물을 함유할 수 있다.
제조 물품
본 발명의 다른 구체예에서, 본원의 치료 조성물을 단독으로 또는 치료제 또는 컨디셔닝제와 조합하여 함유하는 제조 물품이 제공된다. 제조 물품은 용기와 라벨을 포함한다. 적합한 용기는, 예를 들어 보틀, 바이알, 주사기, 및 시험관을 포함한다. 용기는 유리 또는 플라스틱 등의 다양한 재료로부터 형성될 수 있다. 용기는 표적으로 하는 질환 상태를 치료하는데 효과적인 조성물을 보유하며, 멸균 접근 포트를 가질 수 있다(예를 들어, 용기는 피하 주사바늘로 뚫을 수 있는 마개를 가진 정맥내 용액 주머니 또는 바이알일 수 있다). 조성물 중의 활성제는 항원 조정제, 바람직하게는 항체이다. 용기 상의, 또는 용기에 결합된 라벨은 조성물이 선택된 질환 상태를 진단 또는 치료하는데 사용된다는 것을 나타낸다. 또한, 제조 물품은 동일한 용기 안에 또는 별도의 용기 안에 치료제 및 선택적으로 제약학적으로 허용되는 완충제, 예를 들어 인산염 완충 식염수, 링거 용액 및 덱스트로스 용액을 포함할 것이다. 또한, 제조 물품은 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘, 주사기, 및 사용 설명서를 가진 패키지 삽입물을 포함하여, 상업적인 관점과 사용자의 관점에서 바람직한 다른 재료들을 포함할 수 있다.
이종이식편 모델
사람 암 줄기세포의 또 다른 용도는 비-사람 포유동물에서 사람 조직 모델을 만들어 내는 것이다. 어떤 구체예에서, 사람 암 줄기세포는 이종이식편 수용자의 콩팥 캡슐 아래에 놓여 성장된다. 다른 구체예에서, 사람 암 줄기세포는 동물 수용자의 피하에 놓여 성장된다. 당업자는, 먼저 여기 개시된 방법을 사용하여 사람 암 줄기세포를 분리한 다음, 이들을 원하는 이종이식편 부위에 이식함으로써, 단계적 방식으로 최적의 조합을 결정할 수 있다.
다른 구체예에서, 사람 암 줄기세포는 동물 수용자의 오르토토픽 부위에 놓인다. 당업자는, 먼저 여기 개시된 방법을 사용하여 사람 암 줄기세포를 분리한 다음, 이들을 원하는 오르토토픽 부위에 이식함으로써, 단계적 방식으로 최적의 조합을 결정할 수 있다. 이 과정의 예들은 본 분야에 잘 공지되어 있으며, 제한은 아니지만, 예를 들어, 포유동물 지방 패드에 유방암 줄기세포를 두는 것이 있다.
이종이식편으로 사용되는 사람 암 줄기세포는 먼저 기질과 조합될 수 있다. 많은 적합한 기질이 본 분야에 잘 공지되어 있으며, 제한은 아니지만, 피브로넥틴, Matrigel, 콜라겐 및 라미닌을 포함한다.
적합한 수용자 포유동물은, 제한은 아니지만 마우스 및 래트를 포함한다. 전형적으로, 이식 상황에서, 공여자 조직은 수용자의 면역 시스템에 의해 공격받기 쉽다. 이식 거부를 완화하기 위해서 몇 가지 기술이 사용된다. 한 방법은 치사량 이하의 방사선을 수용자에게 조사하여 이식편을 공격할 수 있는 면역세포를 파괴하는 것이다. 다른 방법은 수용자에게 시클로스포린 또는 다른 T 세포 면역억제 약물을 주는 것이다. 수용자 포유동물로서 마우스를 사용하면 이식 거부를 완화시킬 수 있는 더 광범한 방법의 사용이 가능하다. 한 이러한 방법은 면역결핍 마우스(누드 또는 중증 조합 면역결핍 또는 SCID)의 사용이다. 사람 암 줄기세포 이종이식은 생체내 종양 형성 및/또는 성장의 연구에 사용되거나, 또는 약물 발견 또는 개발에 사용될 수 있다.
생물학적 분석
여기 개시된 사람 암 줄기세포는 여러 생물학적 분석에 사용될 수 있다. 한 구체예에서, 사람 암 줄기세포는 생물학적 인자가 사람 암 줄기세포의 성장 능력에 영향을 미치는지를 결정하는데 사용된다. 여러 다른 생물학적 화합물(예를 들어, 호르몬, 특이적 성장인자 등)과 조합하여 단계적 방식으로 암 줄기세포를 평가함으로써, 사람 암 줄기세포의 성장 능력 또는 잠재력에 변경 또는 변화를 일으키는 하나 이상의 특이적 생물학적 화합물을 찾을 수 있다.
생물학적 분석에서 암 줄기세포의 다른 용도는 차등 출현(예를 들어, mRNA 차등 출현) 및 암 줄기세포로부터 분비된 단백질을 사용한 단백질-단백질 상호작용이다. 단백질-단백질 상호작용은 효모 2-하이브리드 시스템 같은 기술에 의해 결정될 수 있다. 사람 암 줄기세포로부터의 단백질을 사용하여 암 줄기세포와 상호작용하는 다른 미지의 단백질 또는 다른 세포 타입을 확인할 수 있다. 이들 미지의 단백질은 성장인자, 호르몬, 효소, 전사인자, 번역인자, 및 종양 억제인자 중 하나 이상일 수 있다. 사람 암 줄기세포 및 단백질-단백질 상호작용과 관련되는 생물학적 분석에서, 이들 세포 형태 및 단백질-단백질 또는 심지어 세포-세포 접축의 효과를 사용하여 이들 세포가 어떻게 생체내에서 종양의 확립, 성장 및 형성에 기여하는지를 결정할 수 있다. 다음의 실시예들이 사람 암 줄기세포의 분리, 특성화, 및 용도의 상세한 설명을 제공한다. 이들 실시예는 어떤 식으로도 본 발명을 제한하지 않는다.
실시예 1
결직장 암종 세포( CRCA )의 분리 및 배양
결직장 암종으로부터의 조직을 100㎍/ml 젠타마이신을 함유하는 멸균된 인산염 완충 식염수(PBS)로 간단히 헹구고, 100mm 조직배양 접시에 놓고 작은(< 1mm) 조각들로 잘게 썰었다. 잘게 썬 조직을 100㎍/ml 젠타마이신과 대두 트립신 억제제(STI, 10%(v/v)를 함유한 200㎕ 콜라게나제-디스파제(PBS 중의 10% wt/vol)를 함유하는 해리 배지(F12/DMEM) 5ml에 현탁하고 37℃에서 인큐베이션했다. 5분 간격으로 현탁액을 피펫팅하여 세포 응집을 느슨하게 했다. 10-20개 세포의 응집물이 조직으로부터 해리된 것으로 보일 때 효소 활성을 중단시켰다.
현탁액을 원심분리(900rpm에서 4분)하여 F12/DMEM으로 세척하고, 결과의 세포 펠릿을 배양 배지(인슐린(10㎍/ml), 트랜스페린(10㎍/ml), 표피 성장인자(EGF) (5ng/ml), 셀레늄(2.5x10-8M), 트리요도티로닌(T3)(1x10-12M), 에탄올아민(1x 10-6M), 포스포에탄올아민(1x10-6M), 히드로코르티손(5x10-8M), 비타민 E(5/ml), 및 선택적으로 젠타마이신(50㎍/ml)으로 보충한 혈청 무함유 F12/DMEM)에 재현탁했다.
세포 현탁액을 5개의 100mm 라미닌 또는 피브로넥틴-코팅 접시에 나누어 옮겼다. 배양 배지를 접시 당 10ml의 최종 부피로 첨가하고, 접시를 표준 인큐베이션 조건에서 인큐베이션했다.
결직장 암종 줄기세포는 느슨한 클러스터로 성장하였고, 상피세포 형태를 가진다. 배양물 안의 다른 세포와 비교하여, 결직장 암종 줄기세포는 훨씬 작은 크기를 가졌으며, 따라서 이런 형태적 특징을 이용하여 더 구별되었다. 처음에 배양물에 두었을 때, 결직장 암종 조직으로부터의 세포는 배양 접시에 빠르게(8-24시간) 부착되었다. 배지를 규칙적으로(바람직하게는 3일마다) 교환하였고, 작은 조밀하게 모여 있는 줄기세포 콜로니가 보일 때까지 현미경으로 배양물을 관찰하였다. 수 주 후에, 작은 느슨한 클러스터의 결직장 암종 줄기세포를 볼 수 있었다. 결직장 암종 줄기세포는 즉시 지수 비율로 성장하기 시작했고, 배양물에서 약 2주 더 지난 후에 세포를 같은 배지에 하위-배양하여 실질적으로 정제된 결직장 암종 줄기세포 배양물을 얻을 수 있었고, 이것을 확립된 셀라인으로서 같은 배지에 계속해서 하위-배양할 수 있다.
이 시점에서, 결직장 암종 줄기세포를 분배하고, 콜라게나제-디스파제를 사용하여 본 분야에 공지된 표준 기술에 의해 계대하여, 단일 세포라고 할 정도로는 분해되지 않도록 하여 배양 접시로부터 세포를 들어올렸다. 한 결직장 암종 줄기세포 배양물은 노쇠의 징후 없이 30회 이상 계대되었다.
실시예 2
직장 암종 세포( RECA )의 분리 및 배양
직장 암종으로부터의 조직을 100㎍/ml 젠타마이신을 함유하는 멸균된 인산염 완충 식염수(PBS)로 간단히 헹구고, 100mm 조직배양 접시에 놓고 작은(< 1mm) 조각들로 잘게 썰었다. 잘게 썬 조직을 100㎍/ml 젠타마이신과 대두 트립신 억제제 (STI, 10%(v/v)를 함유한 200㎕ 콜라게나제-디스파제(PBS 중의 10% wt/vol)를 함유하는 해리 배지(F12/DMEM) 5ml에 현탁하고 37℃에서 인큐베이션했다. 5분 간격으로 현탁액을 피펫팅하여 세포 응집을 느슨하게 했다. 10-20개 세포의 응집물이 조직으로부터 해리된 것으로 보일 때 효소 활성을 중단시켰다.
현탁액을 원심분리(900rpm에서 4분)하여 F12/DMEM으로 세척하고, 결과의 세포 펠릿을 배양 배지(인슐린(10㎍/ml), 트랜스페린(10㎍/ml), EGF(5ng/ml), 셀레늄 (2.5x10-8M), T3(1x10-8M), 에탄올아민(1x10-6M), 포스포에탄올아민(1x10-6M), 히드로코르티손(5x10-8M), 비타민 E(5㎍/ml), 및 돼지 뇌하수체 추출물(PPE)(75㎍ 총 단백질의 PPE/mL)로 보충한 혈청 무함유 F12/DMEM)에 재현탁했다.
세포 현탁액을 5개의 100mm 라미닌/피브로넥틴(50:50)-코팅 접시에 나누어 옮겼다. 배양 배지를 접시 당 10ml의 최종 부피로 첨가하고, 접시를 결장 암 배양물에 대해 상기 설명된 표준 인큐베이션 조건에서 인큐베이션했다. 줄기세포가 발생하면, 설명된 배지에 하위-배양하여 선별하는데, 이때 셀라인은 다음과 같이 처리될 수 있다. 세포가 80-95% 컨플루언시가 되고 하위-배양될 준비가 될 때까지 2-3일마다 성장 배지를 교환했다. 콜라게나제-디스파제를 사용하여 본 분야에 공지된 표준 조건에 따라서 사람 직장 암종 줄기세포를 계대하여 배양 접시로부터 세포를 들어올렸다. 한 직장 암종 줄기세포 라인은 노쇠의 징후 없이 50회 이상 계대되었다.
실시예 3
폐 암종 줄기세포( CRCA )의 분리 및 배양
폐 선암종으로부터의 조직을 100㎍/ml 젠타마이신을 함유하는 멸균된 인산염 완충 식염수(PBS)로 간단히 헹구고, 100mm 조직배양 접시에 놓고 작은(< 1mm) 조각들로 잘게 썰었다. 잘게 썬 조직을 100㎍/ml 젠타마이신과 대두 트립신 억제제 (STI, 10%(v/v)를 함유한 200㎕ 콜라게나제-디스파제(PBS 중의 10% wt/vol)를 함유하는 해리 배지(F12/DMEM) 5ml에 현탁하고 37℃에서 인큐베이션했다. 5분 간격으로 현탁액을 피펫팅하여 세포 응집을 느슨하게 했다. 10-20개 세포의 응집물이 조직으로부터 해리된 것으로 보일 때 효소 활성을 중단시켰다.
현탁액을 원심분리(900rpm에서 4분)하여 F12/DMEM으로 세척하고, 결과의 세포 펠릿을 배양 배지(인슐린(10㎍/ml), EGF(5ng/ml), 셀레늄(2.5x10-8M), 소 뇌하수체 추출물(BPE) 또는 돼지 뇌하수체 추출물(PPE()75㎍ 총 단백질의 PPE/ml)로 보충한 혈청 무함유 F12/DMEM)에 재현탁했다.
세포 현탁액을 5개의 100mm 피브로넥틴-코팅 접시에 나누어 옮겼다. 배양 배지를 접시 당 10ml의 최종 부피로 첨가하고, 접시를 표준 인큐베이션 조건에서 인큐베이션했다.
세포가 80-95% 컨플루언시가 되고 하위-배양될 준비가 될 때까지 2-3일마다 성장 배지를 교환했다. 콜라게나제-디스파제를 사용하여 본 분야에 공지된 표준 조건에 따라서 사람 폐 암종 줄기세포를 계대하여 배양 접시로부터 세포를 들어올렸다. 한 폐 암종 줄기세포 라인은 노쇠의 징후 없이 25회 이상 계대되었다.
실시예 4
췌장관 암종 줄기세포( CRCA )의 분리 및 배양
췌장관 암종으로부터의 조직을 멸균된 인산염 완충 식염수(PBS)로 간단히 헹구고, 100mm 조직배양 접시에 놓고 작은(< 1mm) 조각들로 잘게 썰었다. 잘게 썬 조직을 100㎍/ml 젠타마이신과 대두 트립신 억제제(STI, 10%(v/v)를 함유한 200㎕ 콜라게나제-디스파제(PBS 중의 10% wt/vol)를 함유하는 해리 배지(F12/DMEM) 5ml에 현탁하고 37℃에서 인큐베이션했다. 5분 간격으로 현탁액을 피펫팅하여 세포 응집을 느슨하게 했다. 10-20개 세포의 응집물이 조직으로부터 해리된 것으로 보일 때 효소 활성을 중단시켰다.
현탁액을 원심분리(900rpm에서 4분)하여 F12/DMEM으로 세척하고, 결과의 세포 펠릿을 배양 배지(인슐린(10㎍/ml), 트랜스페린(10㎍/ml), EGF(5ng/ml), 셀레늄 (2.5x10-8M), T3(1x10-12M), 에탄올아민(1x10-6M), 포스포에탄올아민(1x10-6M), 포스콜린(1-5μM), 히드로코르티손(1x10-9M), 프로게스테론(1x10-8M), 헤레굴린(HRG)(1-3 nM), 및 아프로티닌(25㎍/ml))으로 보충한 혈청 무함유 F12/DMEM)에 재현탁했다.
세포 현탁액을 3개의 100mm 피브로넥틴-코팅 접시에 나누어 옮겼다. 배양 배지를 접시 당 10ml의 최종 부피로 첨가하고, 접시를 표준 인큐베이션 조건에서 인큐베이션했다. 3일마다 소비된 배지를 수집하여 0.22㎛ 필터로 여과하고, 세포를 복원하기 위해 첨가했다(20% v/v). 초기 평판 후 7-10일 이내에 아주 적은 상피-유사 콜로니가 형성되었고, 이들 콜로니는 비-분할 기질-유사 세포 중에 분산되 기 시작하였다. 다시 14일 이내에 배양물을 하위-컨플루언시에서 하위-배양하였고, 본 분야에 공지된 표준 방법을 사용하여 100mm 피브로넥틴-코팅 접시에 1:3으로 분배하였다. 배양물 중에 췌장관 암종 줄기세포가 배양물에 확립된 후(2차 또는 3차 계대 후)에는 이전 배양으로부터의 컨디셔닝 배지는 더 이상 사용할 필요가 없었다. 당업자는 세포의 성장 및 외형의 관찰에 기초하여 컨디셔닝 배지의 사용이 더 이상 필요하지 않은 때를 결정할 수 있을 것이다. 아프로니틴 인자의 존재 하에 더 이상의 성장 자극이 관찰되지 않을 때는 배양 배지에 아프로니틴을 더 이상 첨가하지 않았다. 연속 성장 연구는 26시간에 배로 증가하는 것을 나타냈다. 한 췌장관 암종 줄기세포 배양물은 노쇠의 징후 없이 60회 이상 계대되었다.
실시예 5
Merkel 세포 암종 줄기세포( CRCA )의 분리 및 배양
Merkel 세포 암종으로부터의 조직을 100㎍/ml 젠타마이신을 함유하는 멸균된 인산염 완충 식염수(PBS)로 간단히 헹구고, 100mm 조직배양 접시에 놓고 작은(< 1mm) 조각들로 잘게 썰었다. 잘게 썬 조직을 100㎍/ml 젠타마이신과 대두 트립신 억제제(STI, 10%(v/v)를 함유한 200㎕ 콜라게나제-디스파제(PBS 중의 10% wt/vol)를 함유하는 해리 배지(F12/DMEM) 5ml에 현탁하고 37℃에서 인큐베이션했다. 5분 간격으로 현탁액을 피펫팅하여 세포 응집을 느슨하게 했다. 10-20개 세포의 응집물이 조직으로부터 해리된 것으로 보일 때 효소 활성을 중단시켰다.
현탁액을 원심분리(900rpm에서 4분)에 의해 F12/DMEM으로 세척하고, 결과의 세포 펠릿을 배양 배지(인슐린(10㎍/ml), 트랜스페린(10㎍/ml), EGF(5ng/ml), 셀레 늄(2.5x10-8M), T3(1x10-12M), 에탄올아민(1x10-6M), 포스포에탄올아민(1x10-6M), 포스콜린(5μM), 히드로코르티손(1x10-9M), 프로게스테론(1x10-8M), PPE(15㎍ 총 단백질의 PPE)로 보충한 혈청 무함유 F12/DMEM)에 재현탁했다. Merkel 세포 암종 줄기세포의 일부 배양물은 배양물이 확립된 후에는 성장을 위해 PPE가 필요하지 않다. 이것은 Merkel 세포 암종 줄기세포 배양물의 3차 또는 4차 계대 후에 시험될 수 있다. 어떤 경우에는 신경 성장인자 β(NGF-β)의 첨가가 Merkel 세포 암종 줄기세포 배양물의 성장에 유리할 수 있다. NGF-β는 배양물이 확립된 후 10ng/ml의 농도로 사용될 수 있다.
세포 현탁액을 5개의 100mm 피브로넥틴-코팅 접시에 나누어 옮겼다. 배양 배지를 접시 당 10ml의 최종 부피로 첨가하고, 접시를 표준 인큐베이션 조건에서 인큐베이션했으며, 이때 줄기세포 콜로니가 보일 때까지(도 1-3 참조) 3일마다 배지를 교환하였다. 이 시점에서, 대부분의 비-줄기세포가 죽고, 줄기세포 콜로니가 1:3의 밀도로 하위-배양될 수 있는 충분한 세포밀도(50%)까지 성장될 수 있다.
일단 Merkel 세포 암종 줄기세포 배양물이 약 85-95% 컨플루언시가 되면, 배양물을 TrypLE Express(Invitrogen)을 사용하여 하위-배양하여 배양 접시로부터 세포를 들어올렸다. 용도에 따라서 세포를 1:5 내지 1:20 비율로 분배하였다. 계대 사이에 성장 배지는 2-3일마다 교환하였다. 한 Merkel 세포 암종 줄기세포 배양물은 노쇠의 징후 없이 30회 이상 계대되었다.
실시예 6
전립선 암종 세포( CRCA )의 분리 및 배양
전립선 암종으로부터의 조직을 100㎍/ml 젠타마이신을 함유하는 멸균된 인산염 완충 식염수(PBS)로 간단히 헹구고, 100mm 조직배양 접시에 놓고 작은(< 1mm) 조각들로 잘게 썰었다. 잘게 썬 조직을 100㎍/ml 젠타마이신과 대두 트립신 억제제(STI, 10%(v/v)를 함유한 200㎕ 콜라게나제-디스파제(PBS 중의 10% wt/vol)를 함유하는 해리 배지(F12/DMEM) 5ml에 현탁하고 37℃에서 인큐베이션했다. 5분 간격으로 현탁액을 피펫팅하여 세포 응집을 느슨하게 했다. 10-20개 세포의 응집물이 조직으로부터 해리된 것으로 보일 때 효소 활성을 중단시켰다.
현탁액을 원심분리(900rpm에서 4분)하여 F12/DMEM으로 세척하고, 결과의 세포 펠릿을 배양 배지(칼슘(0.1mM), 인슐린(10㎍/ml), 트랜스페린(10㎍/ml), EGF(5 ng/ml), 셀레늄(2.5x10-8M), T3(1x10-12M), 에탄올아민(1x10-6M), 포스포에탄올아민(1 x10-6M), 히드로코르티손(1x10-8M), 테스토스테론(50ng/ml), 및 PPE(약 15㎍ 총 단백질의 PPE/ml)로 보충한 혈청 무함유, 칼슘 무함유 F12/DMEM)에 재현탁했다.
세포 현탁액을 5개의 100mm 라미닌-코팅 접시에 나누어 옮겼다. 배양 배지를 접시 당 10ml의 최종 부피로 첨가하고, 접시를 표준 인큐베이션 조건에서 인큐베이션했다.
전립선 암종 세포의 초기 배양물은 배양물에서 3일이 지난 후에도 잘 부착되지 않았다. 이들 세포에서 배지를 교환할 때는 소비된 배양 배지를 수집하고, 콜라게나제-디스파제를 사용하여 어떤 부착된 세포를 제거하였다. 소비된 배양 배지 와 세포를 원심분리하고, 결과의 세포 펠릿을 신선한 성장 배지 10ml에 재현탁한 다음, 새로운 라미닌-코팅 배양 접시에 두었다. 또, 신선한 성장 배지 10ml를 본래 접시 플레이트에 넣고, 이 접시(와 이어서 사용된 접시들)에 대해서 전립선 암종 줄기세포의 확립된 배양물이 생성될 때까지 2-3일마다 배지를 교환하였다. 1차 전립선암 배양시에 전립선 암종 줄기세포의 콜로니가 나타나는 평균 시간은 4-6주였다.
도 1A는 배양 약 5주 후에 배양물 중의 다른 세포 타입과 구별되어 성장한 전립선 암종 줄기세포의 작은 콜로니를 나타낸다. 배양 배지는 2-3일마다 교환하였지만, 세포는 계대하거나 분배하지 않았다. 흰색 원으로 강조된 대로, 전립선 암종 줄기세포는 이들의 형태로 인해 배양물 중의 다른 세포와 구별될 수 있다. 이들은 우선적으로 조밀한 콜로니 형태로 성장했으며, 상피 세포 형태를 가졌다. 배양물 중의 다른 세포와 비교하여, 전립선 암종 줄기세포는 훨씬 크기가 작았으며, 따라서 이런 형태적 특징을 이용하여 더 구별되었다.
작은 콜로니의 확립 후, 일반적으로 전립선 암종 줄기세포는 최적화된 성장 배지에서 지수 성장기로 진입할 것이다. 도 1B는 지수 성장기를 시작한 전립선 암종 줄기세포의 작은 콜로니를 나타낸다. 도 1C는 전립선 암종 줄기세포의 동일한 콜로니의 지수 성장기의 3일 후를 나타낸다. 도 1D는 전립선 암종 줄기세포의 동일한 콜로니의 지수 성장기의 6일 후를 나타낸다. 마침내, 전립선 암종 줄기세포는 고립된 실질적으로 순수한 세포 집단을 형성했고, 나머지 세포 타입은 배양물에 존재하지 않았다.
일단 실질적으로 순수한 전립선 암종 줄기세포 집단이 확립되면, 세포를 콜라게나제-디스파제를 사용하여 본 분야에 공지된 표준 기술에 따라서 계대하여 배양 접시로부터 세포를 들어올렸다. 계대 사이에 배지는 3일마다 교환하였다. 한 전립선 암종 줄기세포 라인은 노쇠의 징후 없이 30회 이상 계대되었다.
실시예 7
기저세포 암종 줄기세포( CRCA )의 분리 및 배양
기저세포 암종으로부터의 조직을 100㎍/ml 젠타마이신을 함유하는 멸균된 인산염 완충 식염수(PBS)로 간단히 헹구고, 100mm 조직배양 접시에 놓고 작은(< 1mm) 조각들로 잘게 썰었다. 잘게 썬 조직을 100㎍/ml 젠타마이신과 대두 트립신 억제제(STI, 10%(v/v)를 함유한 200㎕ 콜라게나제-디스파제(PBS 중의 10% wt/vol)를 함유하는 해리 배지(F12/DMEM) 5ml에 현탁하고 37℃에서 인큐베이션했다. 5분 간격으로 현탁액을 피펫팅하여 세포 응집을 느슨하게 했다. 10-20개 세포의 응집물이 조직으로부터 해리된 것으로 보일 때 효소 활성을 중단시켰다.
현탁액을 원심분리(900rpm에서 4분)하여 F12/DMEM으로 세척하고, 결과의 세포 펠릿을 배양 배지(인슐린(10㎍/ml), 트랜스페린(10㎍/ml), EGF(5ng/ml), 셀레늄 (2.5x10-8M), T3(1x10-12M), 에탄올아민(1x10-6M), 포스포에탄올아민(1x10-6M), 트리요도티로닌(T3)(1x10-12M), 히드로코르티손(1x10-8M), 및 PPE(약 75㎍ 총 단백질의 PPE /ml)로 보충한 혈청 무함유 F12/DMEM)에 재현탁했다.
세포 현탁액을 5개의 100mm 피브로넥틴-코팅 접시에 나누어 옮겼다. 배양 배지를 접시 당 10ml의 최종 부피로 첨가하고, 접시를 표준 인큐베이션 조건에서 인큐베이션했다. 작은 조밀하게 모인 형태의 줄기세포(도 1-3 참조)가 보일 때까지 배지를 3일마다 교환한다. 이 시점에서, 다른 암 타입과 마찬가지로, 줄기세포는 더 빠르게 성장하기 시작한다. 다음에, 이들이 하위-배양될 수 있고, 수회의 하위-배양 후에는 이들이 배양물에 남은 유일한 세포 타입이 될 것이다.
일단 기저세포 암종 줄기세포 배양물이 약 85-95% 컨플루언시가 되면, 배양물을 TrypLE Express(Invitrogen)을 사용하여 하위-배양하여 배양 접시로부터 세포를 들어올렸다. 또는 달리, 트립신이나 콜라게나제-디스파제가 사용될 수도 있다. 세포는 용도에 따라 1:3 내지 1:5 비율로 분배하였다. 계대 사이에 성장 배지는 3일마다 교환하였다. 한 기저세포 암종 줄기세포 배양물은 노쇠의 징후 없이 15회 이상 계대되었다.
실시예 8
유방 암종 세포( CRCA )의 분리 및 배양
유방 암종으로부터의 조직을 100㎍/ml 젠타마이신을 함유하는 멸균된 인산염 완충 식염수(PBS)로 간단히 헹구고, 100mm 조직배양 접시에 놓고 작은(< 1mm) 조각들로 잘게 썰었다. 잘게 썬 조직을 100㎍/ml 젠타마이신과 대두 트립신 억제제 (STI, 10%(v/v)를 함유한 200㎕ 콜라게나제-디스파제(PBS 중의 10% wt/vol)를 함유하는 해리 배지(F12/DMEM) 5ml에 현탁하고 37℃에서 인큐베이션했다. 5분 간격으로 현탁액을 피펫팅하여 세포 응집을 느슨하게 했다. 10-20개 세포의 응집물이 조직으로부터 해리된 것으로 보일 때 효소 활성을 중단시켰다.
현탁액을 원심분리(900rpm에서 4분)하여 F12/DMEM으로 세척하고, 결과의 세포 펠릿을 배양 배지(인슐린(10㎍/ml), 트랜스페린(10㎍/ml), EGF(5ng/ml), 셀레늄 (2.5x10-8M), T3(1x10-12M), 에탄올아민(1x10-6M), 포스포에탄올아민(1x10-6M), 히드로코르티손(1x10-8M), 프로스타글란딘 E1(PGE1)(100ng/ml), 및 PPE(약 15㎍ 총 단백질의 PPE/ml)로 보충한 혈청 무함유 F12/DMEM)에 재현탁했다.
세포 현탁액을 5개의 100mm 피브로넥틴-코팅 접시에 나누어 옮겼다. 배양 배지를 접시 당 10ml의 최종 부피로 첨가하고, 접시를 표준 인큐베이션 조건에서 인큐베이션했다. 사람 유방 암종 줄기세포는 일단 배양물이 확립된 다음, 표준 방법을 사용하여 냉동될 수 있다. 세포를 해동하여 배양물에 다시 넣을 경우, 소량의 태아 소 혈청(약 2%(v/v))이 사람 유방 암종 줄기세포의 생존을 확보하는데 유리할 수 있다. 초기 해동 및 배양 후(예를 들어, 1-2일), 태아 소 혈청을 함유한 배양 배지를 제거하고, 혈청 무함유 배지로 대체할 수 있다. 사람 유방 암종 줄기세포의 계속 배양에는 태아 소 혈청이 필요하거나 바람직하지 않다. 2% 이상의 FBS를 함유하는 배양 조건이 사람 유방 암종 줄기세포의 성장을 억제하는 것으로 나타났다.
사람 유방 암종 줄기세포는 하위-배양될 수 있다. 소비된 배지를 흡입하여 제거하고, DME/F12 배지 5ml를 사용하여 세포를 세척했다. 세척 배지를 흡입하여 제거하고, 트립신 1ml를 세포에 첨가하고, 세포가 플레이트로부터 떨어질 때까지(약 5분) 37℃에서 세포를 인큐베이션했다. 1ml 대두 트립신 억제제(STI)를 가하 여 트립신을 중화하고, 세포를 수집하여 원심분리해서 펠릿으로 만들었다. 세포 펠릿을 신선한 성장 배지에 재현탁하고, 피브로넥틴-코팅 접시에 용도에 따라 1:3 내지 1:5의 비율로 분배했다. 성장 배지는 2-3일마다 교환하였고, 이들이 80-90% 컨플루언시가 될 때까지 세포를 계대하거나 하위-배양하였다. 한 유방 암종 줄기세포 배양물은 노쇠의 징후 없이 25회 이상 계대되었다.
실시예 9
사람 암 줄기세포의 특성화
사람 암 줄기세포를 특성화하기 위한 실험을 수행하여, 일부 암 세포 상에서 발현된다고 보고된 마커의 세포 표면 발현을 찾았다. 형태학적으로 암 줄기세포로서 확인된 세포들에 대한 CD24, CD34, CD44 및 CD133 발현 분석을 유세포분석을 사용하여 수행하였다.
5분간 또는 세포가 플라스크에서 해리되거나 방출될 때까지 0.2% 콜라게나제/디스파제 2ml를 사용하여 세포를 플라스크로부터 들어올렸다. 5ml 피펫을 사용하여 세포를 분쇄하여 어떤 세포 덩어리를 제거한 다음, 15ml 원뿔형 시험관으로 옮겨 1200rpm에서 5분간 회전시켰다. 상청액을 제거하고 세포를 Analysis Buffer(1% BSA를 함유한 Hank 균형 염 용액)의 1ml/T75 플라스크 또는 5ml/T175 플라스크에서 재현탁했다. 혈구계를 사용하여 세포를 계수했다.
50,000 내지 100,000 세포를 1차 항체 및 대조군과 아래 나타낸 농도로 혼합하였다:
1. 항-CD24/PE, 100㎕/108 세포(Miltenyi)
2. 항-CD44/PE, 100㎕/105 세포(Miltenyi)
3. 항-CD34/PE, 10㎕/105 세포(Miltenyi)
4. 항-CD133/PE, 2㎕/5x104 세포(Miltenyi)
5. 동형 대조군
6. FC 블록, 100㎕/108 세포(Miltenyi)
다음에, 세포를 20분간 4℃ 암소에서 인큐베이션했다.
인큐베이션 후, Analysis Buffer로 부피를 200로 조정하고, 1200rpm에서 5초간 회전시켰다. 상청액을 제거하고, 세포를 신선한 Analysis Buffer 200㎕에 재현탁했다. 7-아미노악티노마이신-D(7-AAD) 또는 요오드화 프로피듐 5㎕를 분석 직전에 세포에 가하고, 살아 있는 세포/죽은 세포 게이팅을 분석했다. FACSCalibur 또는 Guava 기계를 사용하여 세포를 분석했다.
이 셀라인들에서 CD24, CD34, CD44 및 CD133 발현의 결과를 아래 표 1 및 표 2에 요약한다. 이들 표에서, "+"는 형광 강도의 1 log 이상의 이동을 나타내고, "med"는 형광 강도의 0.5 내지 1 log 이동을 나타내고, "low"는 형광 강도의 0.5 log 이하의 이동을 나타내고, "-"는 형광 강도의 이동이 없음을 나타낸다.
표 1에 나타낸 내로, 대부분의 암 줄기세포가 이전에는 고상 암 줄기세포와 관련되지 않았던 공지된 조혈 줄기세포 마커인 CD34를 발현했다. CD34는 또한 내 피세포 상에서 발현되는 것으로 알려져 있으므로, 대조군으로서 다른 내피세포 마커(CD141)의 발현을 시험하였다. 이들 암 줄기세포 중 어느 것도 CD141을 발현하지 않았으며, 따라서 이들은 내피세포 또는 조혈세포일 가능성은 없다.
암 줄기세포 마커에 대한 전이 효과를 연구하기 위하여, 동물 이종이식편 실험에서 전이되었던 암 줄기세포 상에서 CD24, CD34 및 CD44 발현 분석을 수행하였다. Merkel 세포 암종 줄기세포와 9926(췌장 암종 줄기세포)를 면역-손상 마우스 숙주의 신피막하에 이식했다. 약 6-8주 후에 동물을 죽여서 종양 형성을 검사했다. 숙주의 콩팥에 형성된 1차 종양에 더하여, Merkel 및 9926 세포 모두에서 숙주의 체강에 자발적인 전이가 관찰되었다. 이들 전이부를 제거하고 원래 성장 배지에서 배양하였다. 세포를 배양물에서 성장시킨 후, 세포를 분산시키고, 상기 설명된 방법에 따라서 유세포분석을 이용하여 CD24, CD34, 및 CD44 발현에 대해 분석하였다. 이들 실험의 결과를 아래 표 2에 요약한다.
Merkel 및 9926 세포 타입 모두에서, 모 세포는 전이 부착물의 세포 상에서의 마커 패턴과는 상이한 세포 표면 마커 발현의 패턴을 나타냈다. 전이로부터 유래된 Merkel 세포 암종 라인은 높은 CD44 발현, 낮은 CD24 발현을 나타냈고, CD34는 발현하지 않았다. 비교하면, Merkel 모 세포(동물 계대되지 않았던)는 CD44, CD24는 발현하지 않았고, 높은 CD34 발현을 나타냈다(표 1 참조). 또한, 9926 췌장 암종 전이에서도 유사한 결과가 보였으며, 이 경우 모 9926 췌장 암종 줄기세포가 CD44는 발현하지 않고 CD34의 발현은 높았던 것과 비교하여 CD44 발현은 높았고, CD34 발현은 낮았다.
암 줄기세포 마커에 대한 동물 계대의 효과를 연구하기 위하여, 동물 숙주에서의 이종이식편을 통해 계대된 암 줄기세포에서의 CD24, CD34 및 CD44 발현 분석을 또 수행하였다. 3개의 사람 암 줄기세포 배양물(Merkel 세포 암종, CRCA0404 및 PRCA629a)을 이종이식편(신피막하 또는 피하)으로서 각각 마우스 숙주에 삽입하고, 종양을 형성시킨 다음, 1차 종양을 제거하여 각 세포 타입별로 적합한 배지에서 배양하였다. 배양물 중에서 성장시킨 후, 세포를 분산시키고, 유세포분석을 사용하여 CD24, CD34 및 CD44 발현 수준을 분석하였다. 결과를 아래 표 2에 요약한다.
이들의 모세포와 비교하여 새로운 1차 종양에서 세포 표면 마커의 발현 변화를 관찰하였다. Merkel 세포 암종과 CRCA0404 결직장 암종으로부터의 1차 종양의 세포는 CD34 발현의 상실(모 암 줄기세포와 비교하여)과 CD44 발현의 획득을 나타냈다. 생체내에서 매우 서서히 성장하는 PRCA629a 종양으로부터의 세포는 높은 CD34 발현을 유지했고, 낮은 CD44 발현을 가졌다. 이들 실험의 결과는 동물을 통한 계대가 이들의 상응하는 암 줄기세포와 관련된 마커의 세포 표면 발현을 변화시킬 수 있음을 시사한다.
제시하지 않은 추가의 데이터에서, 세포 배양 조건의 변화가 또한 세포 표면 마커에 대해 영향력을 가질 수 있었는데, 포스콜린의 존재 하에 유방 암종 셀라인 BRCA1103은 포스콜린이 없을 때의 수준과 비교하여 CD44와 CD24 세포 표면 마커가 모두 감소하였다.
사람 암 줄기세포 배양물에서 CD24, CD34, CD44 및 CD133 발현
세포 CD34 CD44 CD24 CD133
CRCA0404 + med - -
CRCA1115 - + - -
RECA0515 - + - -
RECA1208 - + - -
폐 암종
(CA130T308)		 + - - -
췌장 암종
(9926c5)		 + - - -
Merkel
세포 암종		 + - - -
PRCA1004 + - - -
PRCA629a + - - ND
PRCA0312-58 + - - ND
PRCA0425-72 + - - ND
BRCA1103 - med + -
동물 계대 후 사람 암 줄기세포에서 CD24, CD34 및 CD44 발현
(전이 및 새로운 1차 종양)
세포 CD34 CD44 CD24
Merkel 전이 - + low
9926 전이 low + -
Merkel 원발성 종양 - + -
CRCA0404 원발성 종양 - + -
PRCA629a 원발성 종양 + low -
실시예 10
사람 종양 이종이식편 모델: 사람 암 줄기세포의 종양형성 잠재력
암 줄기세포는 자기-재생할 수 있고, 소수의 세포로부터 생체내에서 종양을 형성하는 능력을 가진 종양 세포의 작은 하위부분(배양 조건에 의한 초기 선별)에 의해 정의된다. 암 줄기세포의 종양 형성 잠재력을 시험하였다.
이들 실험에서, 20개 세포 내지 5x104세포/콜라겐 버튼 범위의 세포 수를 면역-결핌 마우스에 이식하였다. 콜라겐 버튼은 I 형 래트-꼬리 콜라겐을 사용하여 제조했다. I 형 래트-꼬리 콜라겐의 제조는 본 분야에 잘 공지되어 있다. 간단히 말해서, 성숙한 사육 래트의 꼬리를 잘라내고 힘줄을 분리하여 칭량했다. 힘줄 1g으로 100ml의 콜라겐 용액으로 만들 수 있으며, 각 꼬리로부터 약 1-1.5g의 힘줄을 얻는다. 콜라겐을 추출하기 위해, 힘줄을 페니실린, 스트렙토마이신 및 펀지존을 함유하는 묽은 아세트산 용액(100ml 물 중에 힘줄 g 당 200㎕ 결정 아세트산)에 넣은 다음, 적어도 1주 동안 4에서 서서히 교반하였다. 다음에, 이 용액을 원심분리하고, 콜라겐 상청액을 사용할 때까지 4℃에 보관했다.
이 연구를 위하여, Earle 균형 염 용액(EBSS), NaOH 및 NaHCO3를 함유하는 셋팅 용액에서 래트-꼬리 콜라겐을 중합하여 5㎕ 콜라겐 버튼을 제조했다. 중합 후, 콜라겐 버튼 당 세포 수를 다르게 하여(20 내지 200) 첨가하였다. 이식하기 전에 세포를 37℃에서 콜라겐 중에서 하룻밤 인큐베이션했다.
콩팥 아래 캡슐에 세포를 이식하기 위하여 트리브로모에탄올로 마우스를 완전히 마취시켰다. 우측 및/또는 좌측 콩팥에 허리주변의 수술적 접근법을 통해 신장 캡슐에 주머니를 만들어 세포를 배치하였다. 수술 후, 동물을 가열된 표면에서 회복시키고, 마취로부터 완전히 회복될 때까지 관찰하였다. 수술 10일 후에 상처 클립을 제거하였다. 6-12주 후에 동물의 콩팥을 제거하고, 종양 형성을 시각적으로 검사하였다. 또한, 사람 Alu 특이적 서열을 사용하여 콩팥에 대해서 정량 PCR (QPCR)을 수행하여 종양 형성을 확인하고 정량하였다. 이 결과를 아래 표 3에 요약한다.
약 200개 세포의 접종량에서 암 줄기세포는 모두 면역-결핍 마우스에서 종양을 형성할 수 있었다. 이들 종양은 일반적으로 시각적으로 알아차릴 수 있었으며, QPCR을 사용하여 확인하였다. 지금까지 시험된 모든 암 줄기세포는 20개 세포의 접종량에서 종양을 형성할 수 있었다(아래 표 3 참조). 모든 실험에서, 사람 암 줄기세포가 이식된 동물의 100%에서 종양 형성이 관찰되었다. 일반적으로, 매 실험마다 조건 별로 적어도 3마리의 동물을 사용하였다. 이들 결과는 매우 적은 수의 세포로부터 생체내에서 종양을 형성하는 능력으로 인해 이들 세포가 암 줄기세포라는 특성화와 일치한다.
반대로, 2개의 암-유래 배양물은 종양을 형성하지 않았다(도 4 참조). 분산된 전립선 종양 세포가 설명된 선택적 배지 대신에 혈청(10%) 함유 배지에서 2-4주 동안 성장된 경우, 결과의 배양물은 SRC 중에서 250,000세포/콜라겐 버튼 이하로 이식되었을 때 종양을 형성하지 않을 것이다. 결장 배양물 중 하나는 상이한 형태, 성장 특성, 및 세포 표면 단백질 결합 특성을 가진 변칙적인 셀라인(CRCA0705)을 제공한다. 이들 세포는 < 200 내지 500,000세포/콜라겐 버튼의 접종량에서 종양을 형성하지 않을 것이다(도 4 참조).
사람 암 줄기세포를 사용한 생체내 종양 형성
세포 타입 접종된 세포수 접종 부위 생체내 시간 종양 형성?
Merkel
세포 암종		 ≤200 신피막하 6주 예
20 7주 예
결직장 암종 ≤ 200 신피막하 6-8주 예
20 예
직장 암종 ≤ 200 신피막하 6-8주 예
20 예
폐 암종 ≤ 200 신피막하 8주 예
20 7주 예
전립선 암종 ≤ 200 신피막하 8주 예
20 신피막하 7주 예
유방 암종 ≤ 200 신피막하 6-8주 예
췌장 암종 ≤ 200 신피막하 6-8주 예
도 4는 다양한 셀라인으로부터 SCID 마우스의 콩팥 아래 캡슐에 형성된 종양의 사진을 나타낸다. 이 도면에 나타낸 대로, 이 신장밑 암 이종이식편 모델을 사용하여 암 줄기세포 라인과 비-암 줄기세포 라인을 분명히 구별할 수 있다.
실시예 11
사람 종양 이종이식편 모델: 사람 암 줄기세포의 전이 잠재력
본 연구는 사람 종양 이종이식편 모델에서 Merkel 세포 암종(피부의 신경내분비 암)으로부터 배양된 Merkel 세포 암종 줄기세포를 사용하도록 설계되었다. 신피막하에 이식되었을 때 MCC 세포는 종양을 형성하며, 이것은 복강 및 흉강의 여러 기관으로 자발적으로 전이된다. 전이는 시각적으로 볼 수 있거나, 또는 사람 DNA에 대한 QPCR을 사용하여 정량된다.
I 형 래트-꼬리 콜라겐을 상기 설명된 방법에 의해 제조했다. 이 연구를 위해서, Earle 균형 염 용액(EBSS), NaOH 및 NaHCO3를 함유하는 셋팅 용액 중에서 래트-꼬리 콜라겐을 중합하여 50㎕ 콜라겐 버튼을 제조했다. 중합 후, 콜라겐 버튼 당 5x105 Merkel 세포를 첨가하였다. 이식 전에 37℃에서 세포를 콜라겐 중에서 하룻밤 인큐베이션했다.
콩팥 아래 캡슐에 세포를 이식하기 위하여 트리브로모에탄올로 마우스를 완전히 마취시켰다. 우측 및/또는 좌측 콩팥에 paralumbar 수술적 접근법을 통해 신장 캡슐에 주머니를 만들어 세포를 배치하였다. 일부 연구에서는 양쪽 콩팥에 이종이식편을 이식했다. 수술 후, 동물을 가열된 표면에서 회복시키고, 마취로부터 완전히 회복될 때까지 관찰하였다. 수술 10일 후에 상처 클립을 제거하였다.
종양을 약 5-8주 동안 성장시켰다. 연구 마지막에 마우스를 죽여서 종양을 제거하였다. 상당한 수의 전이가 마우스에서 발견되었다. 전이는 Merkel 세포 암종 세포 배양물이 이식된 마우스의 장막, 횡격막, 비장, 난소 및 폐에서 발견될 수 있었다. 일반적으로, 전이는 크기가 컸고, 육안으로 쉽게 알아차릴 수 있었다.
RECA0515 세포 및 CRCA1115 세포를 사용하여 유사한 실험을 수행하였다. 두 세포 타입은 모두 신피막하로부터 여러 부위로 전이될 것이다. 9926 췌장암 줄기세포를 사용한 실험 결과도 신피막하로부터 마우스의 다른 부위들로 전이되었다. 또한, 9926 췌장암 줄기세포는 신피막하에 이식된 것과 비교하여 마우스 전립선에 이식되었을 때 더 많은 빈도로 전이되었다. 전체적으로 종합해 보면, 이들 결과는 사람 암 줄기세포 배양물이 생체내에서 사람 종양의 확립, 성장 및 전이를 이해하기 위한 성공적인 이종이식편 모델로 사용될 수 있음을 나타낸다.
흥미롭게도 유사한 실험에서 PRCA 라인들 중 4개는 (어떤 경우) 매우 적은 (< 500) 세포가 이식되었을 때도 동물에서 4 내지 12주 후에 SRC로부터 자발적으로 전이될 것이다.
암 줄기세포는 먼 부위까지 전이되는 종양 내의 세포 타입일 것으로 예측되었다(Li, F. Tiede, B., Massague, J. & Kang, Y. (2007) Cell Res 17, 3-14 참조). 이것을 마음에 두고, 여기 설명된 전립선 CSC 중 4개가 SRC에 이식된 세포로부터 성장된 종양으로부터 여러 기관으로 자발적으로 전이될 것이라는 점을 주목하는 것이 흥미롭다. 이에 더하여, CRCA1115 결장 종양-유래 라인, Merkel-유래 라인, 및 CTLY(피부 T 세포 림프종-유래 라인)은 모두 SRC 종양으로부터 전이한다. PACA 췌장 유래 라인은 췌장에 전형적으로 이식된 종양으로부터 전이할 것이다. 따라서, 이들 CSC 라인은 ATCC 종양 유래 셀라인과 대부분의 다른 라인에서는 드물게 보이는 특징인 1차 고상 종양 이종이식편으로부터 자발적 전이의 성질이 빈번히 나타난다. 본 발명의 교시에 따라서 획득된, 이들의 조직 및 셀라인 표현형을 가진, 종양-유래 셀라인의 일부 리스트를 표 4에 나타낸다.
종양 유래 셀라인
셀라인
명칭		 조직 및 셀라인 표현형 계대 수 생체내 성장
및 전이
PRCA629* 전립선 줄기세포-유사 > 20 √
PRCA1004* 전립선 줄기세포-유사 > 30 √
PRCA0312-
58*		 전립선 줄기세포-유사 20 √
PRCA0312-
43e*		 전립선 줄기세포-유사 6 √전이
PRCA0425* 전립선 줄기세포-유사 17 √전이
PRCA0611* 전립선 줄기세포-유사 10 √
PRCA0806 전립선 줄기세포-유사 3 √전이
PRCA0702 전립선 줄기세포-유사 7 √전이
PRCA0312-
43STR*		 전립선 기질-혼합
배양물		 2 NO
CRCA0404* PA 결장 줄기세포-유사 22 √
CRCA1115* 결장 줄기세포-유사 > 30 √전이
RECA0515* 직장 줄기세포-유사 21 √
RECA1208* 직장 줄기세포-유사 9 √
RECA0705* 직장 5 NO
PA9926* 췌장관 줄기세포-유사 > 50 √전이
CA130* 폐 선암종 줄기세포-유사 > 50 √
LUCA9979 폐 선암종 줄기세포-유사 > 20 √
MCLY* 맨틀세포
림프종		 림프종 > 20 √
CTLY 피부 T 세포 림프종 4 √전이
BRCA1103 유방 맥관
암종		 줄기세포-유사 > 30 √
BCC 기저세포 암종 줄기세포-유사 4
BCC2 기저세포 암종 줄기세포-유사 4
BCCA0517 기저세포 암종 줄기세포-유사 2
Aβcc/MEL 흑색종 줄기세포-유사 12
MCC*(MRKL) Merkel 세포 줄기세포-유사 > 30 √전이
* 이들 셀라인을 사용하여 나타낸 데이터
또한, 암 세포 전이부의 성장에 대한 항체의 효과를 측정하기 위한 실험을 수행하였다. 도 5 및 6에 나타낸 대로, 어떤 암의 표면에 결합한다고 알려진 항체 KID24(PTA-5174)는 신피막하 모델에서 확립된 암 줄기세포 라인 암으로부터의 종양 전이부의 성장을 감소시켰다.
여기 설명된 실시예들과 구체예들은 단지 예시의 목적을 위한 것이며, 이들에 비추어 다양한 변형이나 변화가 당업자에게 제안되고, 본 출원의 사상과 범위 내에 포함된다는 것이 이해된다. 여기 인용된 모든 간행물, 특허 및 특허출원은 각 간행물, 특허 또는 특허출원이 참고로서 인용되도록 구체적으로 그리고 개별적으로 나타내고 있는 것과 동일한 범위의 모든 목적을 위해 그 전체가 참고자료로서 본원에 인용된다.

Claims (13)

  1. 고상(solid) 사람 종양 조직으로부터 분리되고, 사람 암 줄기세포의 성장에 최적화된 영양 배지에서 성장된 사람 암 줄기세포의 집단으로서, 상기 사람 암 줄기세포의 집단은 200개의 상기 암 줄기세포의 접종물이 면역-결핍 마우스에서 8주 이내에 종양을 형성할 수 있을 정도로 충분하게 다른 세포 타입이 없으며, 상기 암 줄기세포는:
    (a) 세포 표면 마커 CD34를 발현하지만 CD24는 발현하지 않는 결직장 암종 줄기세포;
    (b) 세포 표면 마커 CD34를 발현하지만 CD24는 발현하지 않는 폐 암종 줄기세포;
    (c) 세포 표면 마커 CD34를 발현하지만 CD24는 발현하지 않는 췌장 암종 줄기세포;
    (d) 세포 표면 마커 CD44는 발현하지만 CD24는 발현하지 않는 직장 암종 줄기세포;
    (e) 세포 표면 마커 CD34는 발현하지만 CD24는 발현하지 않는 머켈(Merkel) 세포 암종 줄기세포;
    (f) 세포 표면 마커 CD34는 발현하지만 CD24는 발현하지 않는 전립선 암종 줄기세포; 또는
    (g) 세포 표면 마커 CD24는 발현하지만 CD34는 발현하지 않는 유방 암종 줄기세포
    인 것을 특징으로 하는 사람 암 줄기세포의 집단.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 세포는 노쇠 없이 계대-배양이 가능한 능력을 보유하는 것을 특징으로 하는 사람 암 줄기세포의 집단.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 세포는 결직장 암종 줄기세포, 직장 암종 줄기세포 또는 전립선 암종 줄기세포인 것을 특징으로 하는 사람 암 줄기세포의 집단.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 세포는 폐 암종 줄기세포인 것을 특징으로 하는 사람 암 줄기세포의 집단.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 세포는 췌장 암종 줄기세포인 것을 특징으로 하는 사람 암 줄기세포의 집단.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 세포는 머켈(Merkel) 세포 암종 줄기세포인 것을 특징으로 하는 사람 암 줄기세포의 집단.
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 세포는 유방 암종 줄기세포인 것을 특징으로 하는 사람 암 줄기세포의 집단.
  8. 제 1 항에 있어서, 상기 암 줄기세포는 상기 사람 암 줄기세포의 상기 집단을 얻기 위해 계대-배양되어진 것을 특징으로 하는 사람 암 줄기세포의 집단.
  9. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항의 상기 사람 암 줄기세포의 집단을 분리하는 방법으로서,
    (a) 고상(solid) 사람 종양 조직으로부터 분리된 사람 암 줄기세포의 공급원을 해리시키는 단계;
    (b) 사람 암 줄기세포의 성장에 최적화된 영양 배지 중에 사람 암 줄기세포의 해리된 공급원을 넣는 단계;
    (c) 상기 영양 배지에서 사람 암 줄기세포의 성장을 지원하기에 충분한 적합한 배양 조건을 유지하는 단계; 및
    (d) 상기 사람 암 줄기세포의 집단을 얻기 위해 상기 사람 암 줄기세포의 집단을 계대-배양하는 단계
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항의 사람 암 줄기세포의 집단을 포함하는 암 세포 백신으로서, 상기 백신은 선택된 암의 위험이 있거나 이러한 암을 가진 포유동물에 투여되었을 때 선택된 암에 대한 예방적 또는 치료적 면역반응을 생성하는 것을 특징으로 하는 암 세포 백신.
  11. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항의 사람 암 줄기세포의 집단을 이용하는 생물학적 분석방법.
  12. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항의 사람 암 줄기세포의 집단을 포함하는 이종이식편 모델.
  13. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항의 사람 암 줄기세포의 집단 및 제약학적으로 허용되는 조제물을 포함하는, 암 치료용 약학적 조성물.
KR1020097017268A 2007-01-22 2008-01-22 사람 암 줄기세포 KR101523698B1 (ko)

Applications Claiming Priority (11)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US88149707P 2007-01-22 2007-01-22
US60/881,497 2007-01-22
US90718007P 2007-03-23 2007-03-23
US60/907,180 2007-03-23
US92424707P 2007-05-04 2007-05-04
US60/924,247 2007-05-04
US95071407P 2007-07-19 2007-07-19
US60/950,714 2007-07-19
US97261307P 2007-09-14 2007-09-14
US60/972,613 2007-09-14
PCT/US2008/051730 WO2008091908A2 (en) 2007-01-22 2008-01-22 Human cancer stem cells

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20100033471A KR20100033471A (ko) 2010-03-30
KR101523698B1 true KR101523698B1 (ko) 2015-05-29

Family

ID=39641454

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020097017268A KR101523698B1 (ko) 2007-01-22 2008-01-22 사람 암 줄기세포

Country Status (9)

Country Link
US (1) US8309354B2 (ko)
EP (1) EP2109668A4 (ko)
JP (1) JP2010516259A (ko)
KR (1) KR101523698B1 (ko)
CN (1) CN101855339A (ko)
AU (1) AU2008207945A1 (ko)
CA (1) CA2675521C (ko)
IL (1) IL199836A (ko)
WO (1) WO2008091908A2 (ko)

Families Citing this family (65)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2675521C (en) 2007-01-22 2016-04-26 Raven Biotechnologies Human cancer stem cells
CN102203290B (zh) 2008-10-27 2015-05-06 北海道公立大学法人札幌医科大学 肿瘤干细胞分子标记
US10087236B2 (en) 2009-12-02 2018-10-02 Academia Sinica Methods for modifying human antibodies by glycan engineering
US11377485B2 (en) 2009-12-02 2022-07-05 Academia Sinica Methods for modifying human antibodies by glycan engineering
CN102821600B (zh) 2009-12-25 2016-01-20 中外制药株式会社 使用移植了nog确立癌细胞株的非人动物模型进行的抗癌药靶探索以及筛选方法
US8802091B2 (en) 2010-03-04 2014-08-12 Macrogenics, Inc. Antibodies reactive with B7-H3 and uses thereof
JP5998060B2 (ja) 2010-03-04 2016-09-28 マクロジェニクス，インコーポレーテッド Ｂ７−ｈ３と反応性のある抗体、その免疫学的に活性なフラグメントおよびその使用
WO2011129348A1 (ja) * 2010-04-13 2011-10-20 株式会社Ｒｅｉメディカル 癌組織由来細胞塊または癌細胞凝集塊から得られる癌治療用組成物およびそれを用いた免疫療法剤の製造方法ならびに免疫療法効果評価方法
JP6184865B2 (ja) 2010-07-23 2017-08-23 アステラス インスティテュート フォー リジェネレイティブ メディシン 細胞の稀少なサブ集団を検出するための方法及び細胞の高度に精製された組成物
WO2012019061A2 (en) 2010-08-05 2012-02-09 Stem Centrx, Inc. Novel effectors and methods of use
US9458231B2 (en) 2010-09-03 2016-10-04 Stemcentrx, Inc. Modulators and methods of use
US9778264B2 (en) 2010-09-03 2017-10-03 Abbvie Stemcentrx Llc Identification and enrichment of cell subpopulations
EP2689787A1 (en) 2010-09-03 2014-01-29 Stem Centrx, Inc. Identification and enrichment of cell subpopulations
WO2012046797A1 (ja) * 2010-10-06 2012-04-12 ファーマロジカルズ・リサーチ プライベート リミテッド 癌幹細胞集団及びその作製方法
RU2016123839A (ru) 2010-12-08 2018-11-30 АббВай Стемсентркс ЭлЭлСи Новые модуляторы и способы их применения
KR101182549B1 (ko) * 2010-12-16 2012-09-12 엘지이노텍 주식회사 3차원 입체 카메라 모듈
SA112330278B1 (ar) 2011-02-18 2015-10-09 ستيم سينتركس، انك. مواد ضابطة جديدة وطرق للاستخدام
CN103688175B (zh) * 2011-03-24 2015-09-09 罗戈辛研究院 用于筛选选择性降低癌干细胞数量的化合物的测定法
NZ703939A (en) 2011-05-21 2016-01-29 Macrogenics Inc Cd3-binding molecules capable of binding to human and non-human cd3
US20130058947A1 (en) 2011-09-02 2013-03-07 Stem Centrx, Inc Novel Modulators and Methods of Use
EP2749641B1 (en) 2011-09-07 2021-06-02 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Cancer stem cell isolation
JP6291254B2 (ja) 2011-10-28 2018-03-14 中外製薬株式会社 癌幹細胞特異的分子
DK2817620T3 (en) 2012-02-22 2016-09-05 Verik Bio Inc IMMUNTERY TREATMENT SYSTEM FOR TUMOR FORMATION AND PROGRESSION
CA3050672A1 (en) 2012-02-24 2013-08-29 Abbvie Stemcentrx Llc Dll3-binding antibodies and drug conjugates thereof to treat cancer
US9676850B2 (en) 2012-02-24 2017-06-13 Abbvie Stemcentrx Llc Anti SEZ6 antibodies and methods of use
JP6090735B2 (ja) * 2012-03-02 2017-03-08 国立大学法人山口大学 消化器系がん幹細胞を培養するための無血清培地、及びそれを用いた消化器系がん幹細胞の増殖方法
EP2828664B1 (en) * 2012-03-19 2018-09-26 Stemline Therapeutics Inc. Methods for treating and monitoring the status of cancer
PT3536334T (pt) 2012-05-16 2021-09-27 Stemline Therapeutics Inc Vacinas contra o cancro dirigidas a células estaminais cancerígenas
BR112015019909A2 (pt) 2013-02-22 2017-08-29 Abbvie Stemcentrx Llc Conjugados anticorpo-fármaco, composição farmacêutica, usos dos mesmos, e kit
US9487587B2 (en) 2013-03-05 2016-11-08 Macrogenics, Inc. Bispecific molecules that are immunoreactive with immune effector cells of a companion animal that express an activating receptor and cells that express B7-H3 and uses thereof
AU2014248711A1 (en) * 2013-03-13 2015-09-10 Neostem Oncology, Llc Individualized high purity colon carcinoma stem cells, methods and use of the same
JP6640086B2 (ja) * 2013-08-12 2020-02-05 ミネルバ バイオテクノロジーズ コーポレーション 腫瘍成長を増強する方法
WO2015031541A1 (en) 2013-08-28 2015-03-05 Stem Centrx, Inc. Novel sez6 modulators and methods of use
EP3038644B1 (en) 2013-08-28 2021-04-07 AbbVie Stemcentrx LLC Site-specific antibody conjugation methods and compositions
JP6486368B2 (ja) 2013-09-06 2019-03-20 アカデミア シニカＡｃａｄｅｍｉａ Ｓｉｎｉｃａ 改変されたグリコシル基を含む糖脂質を用いたヒトｉＮＫＴ細胞の活性化
CN105813650A (zh) 2013-11-06 2016-07-27 施特姆森特克斯股份有限公司 新型抗-密蛋白抗体和使用方法
PE20160993A1 (es) 2013-12-12 2016-10-14 Abbvie Stemcentrx Llc Nuevos anticuerpos anti-dpep3 y metodos de uso
WO2015127407A1 (en) 2014-02-21 2015-08-27 Stemcentrx, Inc. Anti-dll3 antibodies and drug conjugates for use in melanoma
KR20240096599A (ko) 2014-05-27 2024-06-26 아카데미아 시니카 항-ｃｄ20 글리코항체 및 이의 용도
KR20230033737A (ko) 2014-05-27 2023-03-08 아카데미아 시니카 증진된 항체 효능을 위한 범용 당형태에 관한 조성물 및 방법
CA2950440A1 (en) 2014-05-27 2015-12-03 Academia Sinica Anti-her2 glycoantibodies and uses thereof
JP7063538B2 (ja) 2014-05-28 2022-05-09 アカデミア シニカ 抗ＴＮＦα糖操作抗体群およびその使用
ES2791199T3 (es) * 2014-06-25 2020-11-03 Tel Hashomer Medical Res Infrastructure & Services Ltd Identificación de marcadores de células madre cancerosas y uso de los mismos para diagnóstico y tratamiento
EP3189133A4 (en) * 2014-09-04 2018-04-11 Agency for Science, Technology and Research A method to up-regulate cancer stem cell markers for the generation of antigen specific cytotoxic effector t cells
TW201617368A (zh) 2014-09-05 2016-05-16 史坦森特瑞斯公司 新穎抗ｍｆｉ２抗體及使用方法
US10495645B2 (en) 2015-01-16 2019-12-03 Academia Sinica Cancer markers and methods of use thereof
AU2016209056B2 (en) * 2015-01-24 2021-01-28 Academia Sinica Cancer markers and methods of use thereof
SG11201706024YA (en) 2015-01-26 2017-08-30 Macrogenics Inc Multivalent molecules comprising dr5-binding domains
KR20160109356A (ko) 2015-03-11 2016-09-21 이화여자대학교 산학협력단 자가 면역 질환 예방 또는 치료용 조성물
KR102036029B1 (ko) 2015-03-11 2019-10-24 이화여자대학교 산학협력단 골수 부전 예방 또는 치료용 조성물
KR20160109358A (ko) 2015-03-11 2016-09-21 이화여자대학교 산학협력단 면역 질환 예방 또는 치료용 조성물
JP6161828B2 (ja) * 2015-04-20 2017-07-12 国立大学法人 岡山大学 がんの非ヒトモデル動物及びその作製方法、がん幹細胞及びその製造方法
EP3208331A1 (en) * 2016-02-17 2017-08-23 PromoCell bioscience alive GmbH Biomedizinische Produkte Chemically defined medium for the culture of cancer stem cell (csc) containing cell populations
GEP20227398B (en) 2016-04-15 2022-07-25 Macrogenics Inc Novel b7-h3 binding molecules, antibody drug conjugates thereof and usage thereof
TW201805309A (zh) 2016-04-21 2018-02-16 艾伯維史坦森特瑞斯有限責任公司 新穎抗－bmpr1b抗體及使用方法
US10538592B2 (en) 2016-08-22 2020-01-21 Cho Pharma, Inc. Antibodies, binding fragments, and methods of use
GB201700952D0 (en) * 2017-01-19 2017-03-08 Univ Cape Town In vitro propagation of primary cancer cells
CN107904206A (zh) * 2017-11-17 2018-04-13 张家港澳洋医院有限公司 一种脂多糖诱导肿瘤细胞生成肿瘤干细胞的用途和方法
US20210284970A1 (en) * 2018-06-13 2021-09-16 Genex Health Co., Ltd Method for culturing colorectal cancer solid tumor primary cells and colorectal cancer ascites primary tumor cells and supporting reagents
KR102130493B1 (ko) 2018-07-11 2020-07-06 이화여자대학교 산학협력단 건선 예방 또는 치료용 조성물
KR102089476B1 (ko) 2018-07-11 2020-03-16 이화여자대학교 산학협력단 피부 염증 질환 예방 또는 치료용 조성물
CN109652377B (zh) * 2019-01-15 2023-03-28 广州医科大学 一种肺癌干细胞的制备方法及应用
KR20190120141A (ko) 2019-10-16 2019-10-23 이화여자대학교 산학협력단 골수 부전 예방 또는 치료용 조성물
CN113069547B (zh) * 2021-04-16 2023-01-24 同济大学附属第一妇婴保健院 Bap1作为肿瘤治疗靶点在制备预防或治疗肿瘤药物中的应用
CN113444690A (zh) * 2021-07-29 2021-09-28 大连大学 一种基于三维培养体系的肿瘤细胞耐照射模型的建立方法

Family Cites Families (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US20050136066A1 (en) 1996-06-12 2005-06-23 Yajun Guo Cellular vaccines and immunotherapeutics and methods for their preparation
US7348015B2 (en) 1998-01-14 2008-03-25 Morphogenesis, Inc. Antigen modified cancer cell vaccines for cancer therapy
US6416999B1 (en) 2000-04-07 2002-07-09 Raven Biotechnologies, Inc. Human Müllerian duct-derived epithelial cells and methods of isolation and uses thereof
US6436704B1 (en) 2000-04-10 2002-08-20 Raven Biotechnologies, Inc. Human pancreatic epithelial progenitor cells and methods of isolation and use thereof
US6984522B2 (en) * 2000-08-03 2006-01-10 Regents Of The University Of Michigan Isolation and use of solid tumor stem cells
EP1441766B1 (en) 2001-10-16 2011-09-14 MacroGenics West, Inc. Antibodies that bind to cancer-associated antigen cd46 and methods of use thereof
JP2005522483A (ja) 2002-04-11 2005-07-28 アルタレックス メディカル コーポレーション 結合剤及び腫瘍細胞をターゲティングする際のそれらの使用
PT1565489E (pt) 2002-06-19 2011-02-23 Raven Biotechnologies Inc Anticorpos internalizantes específicos para o alvo de superfície celular raag10
WO2005028626A2 (en) 2003-09-18 2005-03-31 Raven Biotechnologies, Inc. Cell culture media
GB0406215D0 (en) 2004-03-19 2004-04-21 Procure Therapeutics Ltd Prostate stem cell
AU2005252699B2 (en) 2004-06-07 2010-12-23 Macrogenics West, Inc. Transferrin receptor antibodies
ITRM20040438A1 (it) 2004-09-15 2004-12-15 Univ Palermo Metodo per la purificazione e l'amplificazione di cellule staminali tumorali.
CA2998412C (en) 2004-11-12 2024-01-02 Cambridge University Technical Services Ltd. Methods and means related to cancer stem cells
JP2008526256A (ja) 2005-01-12 2008-07-24 レイベン バイオテクノロジーズ，インコーポレイティド Ｋｉｄ３１およびｋｉｄ３１に結合する抗体
CA2596273C (en) 2005-02-02 2017-11-14 Raven Biotechnologies, Inc. Adam-9 modulators
US20060171952A1 (en) 2005-02-02 2006-08-03 Mather Jennie P JAM-3 and antibodies that bind thereto
JP5328156B2 (ja) 2005-02-03 2013-10-30 マクロジェニックス ウエスト， インコーポレイテッド オンコスタチンｍレセプターに対する抗体
CN104059150B (zh) 2005-02-04 2018-10-02 宏观基因有限公司 结合epha2的抗体及其使用方法
EP1907572A2 (en) * 2005-07-26 2008-04-09 Procure Therapeutics Limited Prostate stem cell markers
US20070123448A1 (en) 2005-11-23 2007-05-31 The Hospital For Sick Children Novel chemical entities affecting neuroblastoma tumor-initiating cells
EP2084267B1 (en) * 2006-09-26 2018-04-11 Cedars-Sinai Medical Center Cancer stem cell antigen vaccines and methods
CA2675521C (en) 2007-01-22 2016-04-26 Raven Biotechnologies Human cancer stem cells

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Dalerba, P. et al., Annu. Rev. Med., 2007, vol.58, pp.267-284 (2006.9.26. 온라인 공개) *

Also Published As

Publication number Publication date
WO2008091908A2 (en) 2008-07-31
AU2008207945A1 (en) 2008-07-31
IL199836A (en) 2014-02-27
CN101855339A (zh) 2010-10-06
EP2109668A2 (en) 2009-10-21
IL199836A0 (en) 2010-04-15
EP2109668A4 (en) 2011-10-05
US8309354B2 (en) 2012-11-13
US20080175870A1 (en) 2008-07-24
JP2010516259A (ja) 2010-05-20
CA2675521A1 (en) 2008-07-31
KR20100033471A (ko) 2010-03-30
WO2008091908A3 (en) 2009-12-30
CA2675521C (en) 2016-04-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101523698B1 (ko) 사람 암 줄기세포
Grange et al. Sca-1 identifies the tumor-initiating cells in mammary tumors of BALB-neuT transgenic mice
JP6630074B2 (ja) 新規に単離された細胞の治療組成物の操作および送達
KR20200003913A (ko) 액상 종양으로부터의 종양 침윤 림프구의 확장 및 그의 치료 용도
ES2432744T3 (es) Células del tejido adiposo extramedular y sus aplicaciones en la reconstitución del tejido cardiaco
JP6412933B2 (ja) 免疫調節活性を有する細胞集団、その調製方法および使用
JP2021522860A (ja) キメラ抗原受容体で修飾されたγδ Ｔ細胞を生産する方法
TW202208617A (zh) 用於產生腫瘤浸潤性淋巴球的過程及其在免疫療法中的用途
EP3684920A1 (en) In vitro generation of thymic organoid from human pluripotent stem cells
KR20210091212A (ko) 항-pd-1 항체에 불응성인 nsclc 환자의 치료
TW202239415A (zh) 腫瘤浸潤性淋巴球療法與ｃｔｌａ－４及ｐｄ－１抑制劑組合之治療
TW202208616A (zh) 改良之腫瘤反應性ｔ細胞的選擇
KR20210136050A (ko) 액상 종양으로부터의 종양 침윤 림프구의 확장 및 그의 치료 용도
KR20160093654A (ko) 종양을 치료하는 방법
TW202300014A (zh) 腫瘤儲存及細胞培養組成物
KR102032384B1 (ko) 제대혈 단핵세포에서의 자연살해세포의 제조 방법
CN109402064B (zh) 杂交瘤细胞株及其产生的单克隆抗体和应用
WO2024183144A1 (zh) 一种多重基因编辑的通用型巨噬细胞及在制备抗肿瘤药物中的应用
US20230149523A1 (en) Treatment of autoimmunity and transplant rejection through establishment and/or promotion of tolerogenic processes by fibroblast-mediated reprogramming of antigen presenting cells
EP3778875A1 (en) Immortalized myoblast cell lines and uses thereof
CN116829156A (zh) 使用肿瘤浸润性淋巴细胞疗法与ctla-4及pd-1抑制剂组合的治疗
EP4430167A1 (en) Methods of expansion treatment utilizing cd8 tumor infiltrating lymphocytes
CN117480246A (zh) 用于t细胞共培养物效力测定和配合细胞疗法产品使用的方法和组合物
CN113416701A (zh) 一种nk细胞培养基及培养方法
CN115704008A (zh) 一种ric细胞及其制备方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
N231 Notification of change of applicant
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
LAPS Lapse due to unpaid annual fee