JP6640086B2 - 腫瘍成長を増強する方法 - Google Patents

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Description

本発明は実験動物での腫瘍の生着を増強する方法に関係する。本発明は、さらに癌幹細胞を作る方法に関係する。
創薬において使用されるマウス、げっ歯動物および他の動物は、伝統的にマウス・モデルあるいは異種生着片実験を使用しており、制癌剤研究において、正確にはヒトを模倣していない。
まず、第一に、マウスが薬剤候補に対して持つ反応性は、「悪い」薬のために製薬会社に対する訴訟の数によって証拠づけられるように、それらの薬剤候補が人体研究でどのように反応するかを反映していない。FDAと製薬会社は、臨床試験でテストされる患者の数を増加させることと同様に、ヒトでテストすることの許可に必要な前臨床実験のレベルの基準を著しく上げた。それにもかかわらず、マウスおよび他の試験動物で毒性を示さなかった化合物が、ヒトに処理された時、死を含む著しい有害事象を引き起こし続けている。他の試験動物、特に非霊長類試験動物と同様に、マウスでの薬物安全性試験を混乱させるマウスとヒト生物学間の重大な差異が、特にあるように見える。
現在の実用におけるなされるべき大きな改良は、動物、特にげっ歯動物に、植えつけされた細胞へのよりヒトのように反応させる或は基礎科学、薬効、毒性または投与の研究のための方法を開発することであるだろう。
第二に、いくつかの癌細胞あるいは癌細胞株を、マウスで生着させるのは難しい。生体外実験で慣例的に単に使用される多くの癌細胞株は、信頼できる動物研究にはあまりに低すぎる生着率をもつ。例えば、T47D乳癌細胞株は、腫瘍誘発遺伝子MUC1のその過剰発現のために生体外の研究に典型的に使用される。しかしながら、T47D細胞は、それらの貧弱な生着率のためにマウス異種生着片研究で希にしか使用されない。動物モデルは、それらがあるヒト疾病を模倣するように選択され又は遺伝子組み換えされる。いくつかの動物モデルは自然にあるタイプの癌をもたらす。しかしながら、これらのモデルは、特定の突然変異から発生する又は正確にはヒトの疾病を模倣しない疾患の研究のためのみに有用である。従来のマウス研究でのように、マウスでの薬剤候補の効果は、多くの場合、薬がヒトでもたらすだろう効果を予言していない。したがって、当該分野での技術上の著しい改良目標は、試験動物、特にげっ歯動物試験動物へのヒト癌細胞の生着率を増加させる方法の開発にある。
関連する問題では、腫瘍始原細胞若しくは癌幹細胞において、化合物、生物学的製剤あるいは薬の効能、毒性あるいは投薬を評価するための実際的方法は現在いまだ存在しない。たとえば、長い方法であるが、そこでは、第一の動物からの生きた腫瘍が第二の動物に植えつけられ、次いで、抗がん剤での処置で生き延びた、第二の動物からの生きた腫瘍が、癌幹細胞あるいは腫瘍始原細胞であることが提案されるが、生存癌細胞の成長を阻害する能力をテストするために薬剤で試験される第三の動物に生着された。これらの方法は、癌細胞のほんの小割合だけが転移する能力をもち、およびCD44の高発現のような、癌幹細胞のマーカーの同定は、CD24の低発現を伴うということを示す研究に基づく(Clarke MFet al 2006, Chen K et al 2013)。レセプターCXCR4は、又、癌幹細胞においてその発現が上昇される転移レセプターと同定された(Darash-Yahana M, Pikarsky E,Abramovitch R, Zeira E et al 2004)。しかしながら、現在まで、それらを癌幹細胞に形質転換させる、一つの作用薬若しくは複数の作用薬に癌細胞をさらすことが可能であるという証拠はなかった。したがって、最先端技術上の著しい改良は、癌細胞に加えられた時、細胞のいくつかを癌幹細胞に形質転換させる作用薬または方法を開発若しくは同定することである。その後、これらの癌幹細胞において転移性癌の治療か進行のための薬および薬剤候補をテストすることができるだろう。さらに、該作用薬と方法は、それが抗がん剤の新標的になりうる、いまだ未知の転移性癌細胞のマーカーの同定に使用されるだろう、癌幹細胞のために、癌細胞の個体群をふやす実用的な方法を提供できるであろう。
さらに、高度に攻撃的および転移性癌幹細胞へのローカル癌細胞の形質転換を加速する生体外の方法を開発することは重要であり、それは転移に対する薬剤標的を同定することができ、及び化学療法を回避することができる癌幹細胞を特異的に殺すことができる薬が開発することが可能となる。しかしながら、それは、植え付けられ癌細胞の大変少ない量から腫瘍を生成されるだけでなく、植え付けサイトから遠い位置でのものを含めて、多腫瘍展開をもつ転移性癌にもなる、特徴のNME-7誘導化癌幹細胞で異種生着された重要な動物である。
本質的に、癌生物学の基礎的科学を研究のために、かつ薬剤毒性と同様に薬効の試験のためにも繰り返し使用されるほんの1握りの癌細胞株がある。これは、ヒト細胞がマウス細胞と異なり、それらが老化する前に、限られた数の回数だけを、培養で分割することができるからである。研究者が今日使用する癌細胞株は、しばしばマウス起源に、あるいはより最近では不死化遺伝子を備えた癌細胞をトランスフェクトすることにより、不死になった細胞株に融合することにより不死になるように導かれたか、あるいは単一の転移性癌患者の胸水から単離された自然に不死になった癌細胞である。要点は、これらの細胞を実質的に自己再生させ続けるために使用される方法は、オリジナルの細胞か原発性癌細胞の分子特性を変更するということである。現実は、これらの細胞株は、生きていた、数年前に死んだ、及び特定の患者が被る特定の癌に全く似ていない患者からの癌細胞においてあるということである。したがって、最先端技術上の著しい改良は、患者の癌細胞の分子の特性を変更しない方法で患者からの癌細胞を研究する方法を開発することである。あるいは、分子の特性が変更されれば、それらの変更は理想的に患者の体でのその癌の進行を模倣する。例えば、許容可能な変更は、患者の癌細胞が、癌細胞または細胞をその癌のより攻撃的な形態あるいはその癌の転移性の形態への、形質転換を受けうる株分け数を増加させる方法かどうかである。かくして、患者自身の癌細胞上で、化合物、生物学的製剤あるいは薬剤の、効能、毒性あるいは投与を評価することができる。
同様に、候補薬の効能、安全性試験および投薬スケジュールは、ほんの少数の不死化癌細胞株を使用して、げっ歯動物で最初のオーダー近似に確立され、それは、上述のように、特定の患者の特定の癌にほとんどあるいはまったく似ていない。したがって、最先端技術上の著しい改良は、患者の癌細胞の、動物、好適にはげっ歯動物に、生着を可能にし、そして、任意に、化合物、生物学的薬剤若しくは薬剤の、効能、毒性若しくは投与を評価することを、試験動物に存在する患者癌をおこなえる方法を開発することである。
現在の方法を使用して、試験動物への患者癌細胞への生着を本質的に妨げる、上記の問題に加えて、およそ4〜600万の癌細胞が、宿主動物で腫瘍を確立するために試験動物へ植え付けされねばならない。この理由は、腫瘍内のすべての細胞が腫瘍を生じさせる能力を持っているとは限らない、大部分はできない、ことを科学者が最近発見したということである。もし植え付けされれば腫瘍を生じさせることができる癌細胞の小個体群は、「腫瘍始原細胞」あるいは「癌幹細胞」と呼ばれる。100,000の癌細胞のうちほんの1が腫瘍を生じさせることができると推測され、また、確立しているプロトコルは、通常試験動物に腫瘍を生成するために何百万もの癌細胞の植え付けを必要とする。かくして、試験動物中で患者癌細胞を研究する問題は、以前に記述され不死化の問題に加えて、数が問題となる。典型的な腫瘍生検では、提案された候補薬の効能、毒性あるいは投薬の適切な評価を行うために各々4-6百万の癌細胞において何百ものマウスに植え付けることに十分な細胞を産出していない。プライマリーな患者細胞は、評価実験の間中、ある患者でのようには、そのように不死にはならない、成長しないだろうということは思い出される。したがって、最先端技術上の著しい改良は、動物への全くわずかの患者癌細胞の生着を可能にする方法を開発することである。
1つの態様では、本発明は、次のものを含む非ヒト哺乳動物での癌細胞に対する潜在的な薬剤の効能のためのテスト方法を提供する:
(i) 非ヒト哺乳動物での癌細胞の生成;
(ii) 哺乳動物への潜在的な薬剤の投与によって、潜在的な薬剤と癌細胞をコンタクトさせること;及び
(iii)癌細胞においての潜在的な薬剤の効果を測定すること、
ここで、哺乳動物での癌細胞の数の減少は癌細胞に対する潜在的な薬剤の有効性を示すことができ、そこで該方法は、ステップ(i)を行う前、ステップ(i)を実行後、若しくはステップ(i)を行う前と実行後の両方で、ナイーブ状態に幹細胞を維持する又は刺激受け（プライムド）肝細胞をナイーブ状態に戻す、薬剤と癌細胞をコンタクトさせることを含む。
上記の方法では、ナイーブ状態に幹細胞を維持するか、ナイーブ状態へプライムド幹細胞を戻らせる作用薬は、NMEタンパク質、2i、5i、化学物質あるいは核酸でありうる。NMEタンパク質は、NME1二量体、NME7モノマー、NME7-AB、NME6二量体あるいはバクテリアNMEでありうる。
哺乳動物はマウスかラットのようなげっ歯動物でありうる。癌は、自然に生成され若しくはヒトから植え付けされえる。
上記の方法では、非ヒト哺乳動物は遺伝子組み換えでありうる。そこでは哺乳動物はヒトMUC1あるいはMUC1*あるいはNMEタンパク質を、生殖細胞か体細胞において発現する。そこでは生殖細胞と体細胞は、前述の哺乳動物へ導入された、組み換えヒトMUC1あるいはMUC1*あるいはNME遺伝子配列を含む。ヒトMUC1あるいはMUC1*あるいはNMEタンパク質を発現する遺伝子は、誘導可能なプロモータのコントロール下にありうる。プロモータは、非ヒト哺乳動物で自然発生のタンパク質に誘導可能に反応可能である。哺乳動物へ植え付けされた細胞の量は、少なくとも約30、約30〜約1,000,000、約50〜約500,000、約50〜100,000、あるいは約1,000から約1,000,000でありうる。NMEタンパク質は、単一の成長因子として無血清培地中に存在することが可能である。
別の態様では、本発明は、非ヒト哺乳動物でのヒト腫瘍を生着する方法を提供し、それは哺乳動物へヒト腫瘍細胞を注入すること若しくは植え付けることを含み、その方法は、注入若しくは植え付けステップをする前に、注入若しくは植え付けするステップを行なった後、又は注入若しくは植え付けするステップを行なう前と注入若しくは植え付けをするステップを行なった後の両方で、ナイーブ状態に幹細胞を維持する若しくはプライムド幹細胞をナイーブ状態に戻す作用薬と腫瘍細胞をコンタクトさせることを含む。
上記の方法では、ナイーブ状態に幹細胞を維持するか、ナイーブ状態へプライムド幹細胞を戻す作用薬は、NMEタンパク質、2i、5i、化学薬品あるいは核酸でありうる。NMEタンパク質は、NME1二量体、NME7モノマー、NME7-AB、NME6二量体あるいはバクテリアNMEでありうる。哺乳動物はマウスかラットのようなげっ歯動物でありうる。
上記の方法では、非ヒト哺乳動物は遺伝子組み換えでありうる。そこでは哺乳動物はヒトMUC1あるいはMUC1*あるいはNMEタンパク質を生殖細胞か体細胞において発現し、そこでは生殖細胞と体細胞は、該哺乳動物に導入された組み換えヒトMUC1かMUC1*あるいはNME遺伝子配列を含む。ヒトMUC1あるいはMUC1*あるいはNMEタンパク質を発現する遺伝子は、誘導可能なプロモータにコントロールされることができる。プロモータは、非ヒト哺乳動物で自然発生のタンパク質に誘導可能に反応可能である。哺乳動物に植え付けされた細胞の量は、少なくとも約30、約30〜約1,000,000、約50〜約500,000、約50〜100,000、あるいは約1,000〜約1,000,000でありうる。NMEタンパク質は単一の成長因子として無血清培地中に存在することが可能である。
また別の態様では、本発明は、ナイーブ状態に幹細胞を維持するか、ナイーブ状態にプライムド幹細胞を戻す作用薬と癌細胞をコンタクトさせることを含む癌幹細胞を生成する方法を提供する。
上記の方法では、ナイーブ状態に幹細胞を維持するか、ナイーブ状態にプライムド幹細胞を戻す作用薬は、NMEタンパク質、2i、5i、化学薬品あるいは核酸でありうる。NMEタンパク質は、NME1二量体、NME7モノマー、NME7-AB、NME6二量体あるいはバクテリアNMEでありうる。
この方法では、作用薬は、MBD3、CHD4、BRD4あるいはJMJD6の発現を抑制することができる。作用薬は、MBD3、CHD4、BRD4あるいはJMJD6の発現をアップレギュレートするタンパク質をコードするあらゆる遺伝子に対して作られたsiRNA 、又はMBD3、CHD4、BRD4あるいはJMJD6に対して作られたsiRNAでありうる。癌細胞または正常細胞と比較して、癌幹細胞は、CXCR4あるいはE-カドヘリン(CDH1)の増加した発現によって特徴付けられる。
また別の態様では、本発明は、哺乳動物へ癌細胞を移送（transfer）することを含む、非ヒト哺乳動物での転移性腫瘍を生成する方法を提供する。そこでは該方法は、移送するステップをする前に、移送するステップを行なった後、又は移送するステップを行なう前と移送するステップを行なった後の両方で、ナイーブ状態に幹細胞を維持する若しくはプライムド幹細胞をナイーブ状態に戻す作用薬と癌細胞をコンタクトさせることを含む。
上記の方法では、ナイーブ状態に幹細胞を維持するか、ナイーブ状態にプライムド幹細胞を戻す作用薬は、NMEタンパク質、2i、5i、化学薬品あるいは核酸でありうる。NMEタンパク質は、NME1二量体、NME7モノマー、NME7-AB、NME6二量体あるいはバクテリアNMEでありうる。
この方法では、作用薬は、MBD3、CHD4、BRD4あるいはJMJD6の発現を抑制することができる。作用薬は、MBD3、CHD4、BRD4あるいはJMJD6に対して作られたsiRNAでありうる。あるいは、MBD3、CHD4、BRD4あるいはJMJD6の発現をアップレギュレートするタンパク質をコードするあらゆる遺伝子に対して作られたsiRNAでありうる。癌細胞または正常細胞と比較して、癌幹細胞は、CXCR4あるいはE-カドヘリン(CDH1)の増加した発現が特徴でありうる。
上記の方法では、哺乳動物はマウスかラットのようなげっ歯動物でありうる。非ヒト哺乳動物は遺伝子組み換えでありうる。そこでは哺乳動物はヒトMUC1あるいはMUC1*あるいはNMEタンパク質を生殖細胞か体細胞において発現する。そこでは生殖細胞と体細胞は、該哺乳動物へ導入された組み換えヒトMUC1あるいはMUC1*あるいはNME遺伝子配列を含む。ヒトMUC1あるいはMUC1*あるいはNMEタンパク質を発現する遺伝子は、誘導可能なプロモータにコントロールされることができる。プロモータは、非ヒト哺乳動物での自然発生のタンパク質に誘導可能に反応可能である。哺乳動物へ植え付けされた細胞の量は、少なくとも約30、約30〜約1,000,000、約50〜約500,000、約50〜100,000、あるいは約1,000〜約1,000,000でありうる。NMEタンパク質は単一の成長因子として無血清培地中に存在することが可能である。
別の態様では、本発明は、次のものを含む患者の非ヒト哺乳動物での癌細胞に対する潜在的な薬剤の効能のためにテストする方法を提供する:
(i) 非ヒト哺乳動物へ患者の癌細胞を移送する(transferring)こと;
(ii) 哺乳動物への潜在的な薬剤の投与により潜在的な薬剤と癌細胞をコンタクトさせること;また
(iii)癌細胞に対する潜在的な薬剤の効果を測定すること、
そこでは哺乳動物での患者の癌細胞の数の減少は、癌細胞に対する潜在的な薬剤の有効を示し、そこで該方法は、ステップ(i)を行う前、ステップ(i)を実行後、若しくはステップ(i)を行う前と実行後の両方で、ナイーブ状態に幹細胞を維持する又はプライムド肝細胞をナイーブ状態に戻す、薬剤と癌細胞をコンタクトさせることを含む。
上記の方法では、ナイーブ状態に幹細胞を維持するか、ナイーブ状態にプライムド幹細胞を戻す作用薬は、NMEタンパク質、2i、5i、化学薬品あるいは核酸でありうる。NMEタンパク質は、NME1二量体、NME7モノマー、NME7-AB、NME6二量体あるいはバクテリアNMEでありうる。
この方法では、作用薬は、MBD3、CHD4、BRD4あるいはJMJD6の発現を抑制することができる。作用薬はMBD3、CHD4、BRD4あるいはJMJD6に対して作られたsiRNAでありうる。あるいは、MBD3、CHD4、BRD4あるいはJMJD6の発現をアップレギュレートするタンパク質をコードするあらゆる遺伝子に対して作られたsiRNAでありうる。癌細胞または正常細胞と比較して、癌幹細胞は、CXCR4あるいはE-カドヘリン(CDH1)の増加した発現が特徴でありうる。
上記の方法では、哺乳動物はマウスかラットのようなげっ歯動物でありうる。非ヒト哺乳動物は遺伝子組み換えでありうる。そこでは哺乳動物はヒトMUC1あるいはMUC1*あるいはNMEタンパク質を生殖細胞か体細胞において発現する。そこでは生殖細胞と体細胞は該哺乳動物へ導入された組み換えヒトMUC1あるいはMUC1*あるいはNME遺伝子配列を含む。ヒトMUC1あるいはMUC1*あるいはNMEタンパク質を発現する遺伝子は、誘導可能なプロモータにコントロールされることができる。プロモータは、非ヒト哺乳動物での自然発生のタンパク質に誘導可能に反応可能である。哺乳動物へ植え付けされた細胞の量は、少なくとも約30、約30〜約1,000,000、約50〜約500,000、約50〜100,000、あるいは約1,000〜約1,000,000でありうる。NMEタンパク質は単一の成長因子として無血清培地中に存在することが可能である。
別の態様では、本発明は、次のものを含む非ヒト哺乳動物で異種生着片から組織を生成する方法を提供する:
(i) 遺伝子組み換え非ヒト哺乳動物の生成であって、ここで該哺乳動物はヒトMUC1あるいはMUC1*あるいはNMEタンパク質を生殖細胞と体細胞において発現し、該生殖細胞と体細胞は該哺乳動物に導入された組み換えヒトMUC1あるいはMUC1*あるいはNME遺伝子配列を含んでおり、そこでは遺伝子配列の発現は誘導可能で抑制可能な調節配列にコントロールされることができる;
(ii)遺伝子が幹若しくは原始細胞の数を増加させるように発現・誘導可能なように、非ヒト哺乳動物に、起源において異種である、幹細胞あるいは始原細胞を移送する(transferring)こと; また
(iii)異種植え付けされた幹細胞から組織を生成するように遺伝子発現を抑制すること。
この方法では、ステップ(iii)で、遺伝子発現の抑制が、組織分化因子と幹細胞をコンタクトさせることにより実行されることができる、あるいはステップ(iii)で、遺伝子発現の抑制が、哺乳動物で、自然発生宿主組織分化因子への反応で自然に実行されうる。移送された細胞はヒトでありうる。組織は器官でありうる。NMEタンパク質は、NME1二量体、NME7モノマー、NME7-AB、NME6二量体あるいはバクテリアNMEでありうる。哺乳動物はマウスかラットのようなげっ歯動物でありうる。
別の態様では、本発明は次のものを含む癌予防ペプチドを生成する方法を提供する:
(i) 非ヒト遺伝子組み換えの宿主哺乳動物の生成、そこでは哺乳動物はヒトMUC1あるいはMUC1*あるいはNMEタンパク質を生殖細胞か体細胞において発現し、生殖細胞と体細胞は該哺乳動物へ導入された組み換えヒトMUC1あるいはMUC1*あるいはNME遺伝子配列を含む;
(ii)NMEタンパク質の断片で哺乳動物を免疫すること;
(iii)哺乳動物へヒト腫瘍細胞を植え付けすること; 及び
(iv)有意に減少した腫瘍生着、腫瘍成長率若しくは腫瘍惹起潜在能をもたらすペプチドが免疫のためのペプチドとして選択されたコントロール遺伝子組み換え非ヒト哺乳動物に対して、哺乳動物での細胞の腫瘍生着、腫瘍成長率若しくは腫瘍惹起潜在能を比較すること。
この方法では、NMEタンパク質の断片は、図61-63におけるペプチドNo.1〜53から選ばれたペプチドでありうる。NMEタンパク質は、NME1二量体、NME7モノマー、NME7-AB、NME6二量体あるいはバクテリアNMEでありうる。哺乳動物はマウスかラットのようなげっ歯動物でありうる。
本発明は、以下に記述される詳細な説明及び図面から完全に理解され、これらは本発明を限定するものではない。
図1は、マウスでの腫瘍細胞成長のグラフを示す。パネル(A)は、標準MatrigelあるいはNME7とMatrigelのいずれかと混合され、免疫許容(nu/nu)マウスへ異種植え付けされたT47D乳がん細胞の成長のグラフを示す。経過日14の後に、腫瘍細胞がNME7と混合されたマウスも、ヒト組み換えNME7を毎日1回注入された。パネル(B)は、NME7とMatrigelが混合され、免疫許容マウスへ異種植え付けされたT47D乳がん細胞の成長のグラフを示す。経過日14の後に、マウスの半分も、ヒト組み換えNME7を毎日1回注入された。
図2は、個々のマウスにおけるヒト腫瘍細胞の成長のグラフを示す。パネル(A)は、標準Matrigelと混合されたT47D乳癌細胞の成長のグラフを示す。6匹の植え付けされたマウスのうちの2つだけが生着に特有の腫瘍成長を示した。パネル(B)は、MatrigelとNME7が混合されたT47D乳癌細胞の成長のグラフを示す。6匹の植え付けされたマウスのうちの4つは生着に特有の腫瘍成長を示した。点線は、経過日14の後にNME7を注入されたマウスを示す。
図3は、標準Matrigelと混合され、免疫許容(nu/nu)マウスへ異種植え付けされたT47D腫瘍細胞のグラフを示す。グラフは、腫瘍容積であって衰微傾向の22%の平均増加をもって、各20匹のマウスの2つの同一グループの平均を示す。
図4は、腫瘍生着約25%を示す、40匹の個々のマウスのT47Dヒト乳がん細胞の成長のグラフを示す。
図5は、Matrigelと混合され、NOD/SCIDマウスの横腹へ異種植え付けされたT47D乳癌細胞の成長のグラフを示す。パネル(A)は平均腫瘍成長を示す。パネル(B)は、6匹のマウスのうちの1つだけが標準法を使用してよい腫瘍生着を持っていたことを明らかにし、個々のマウスの腫瘍成長を示す。
図6は、通常のRPMI成長培地において、あるいは単一の成長因子として組み替えヒトNME7-ABを添加された無血清最小培地で培養された、MUC1陽性のT47D乳癌細胞における遺伝子パネル発現のRT-PCR測定グラフを示し、報告によると、いくつかの癌幹細胞あるいは転移性癌細胞において過剰発現する。それらの細胞の一部は非付着になり、表面から浮かび、そして集められた。そこで「+ Ri」は、培地に添加されたロー・キナーゼ阻害剤を意味し、その結果、細胞がすべて表面に付着され、それにより、付着および非付着細胞の平均リーデイングを与える。
図7は、通常のRPMI成長培地において、あるいは単一の成長因子としてヒト組み替えNM23、NME1とも呼ばれる、二量体若しくはNME7-ABを添加された無血清最小培地で培養された、MUC1陽性のT47D乳癌細胞における遺伝子パネルの発現についてのRT-PCR測定グラフを示し、報告によると、いくつかの癌幹細胞あるいは転移性癌細胞において過剰発現する。「浮遊物」は、非付着になり、そして集められた細胞を指し、その一方、「+ Ri」は、それらを表面に付着させるためにいくつかの細胞に加えられたロー・キナーゼ阻害剤を指す。
図8は、通常のRPMI成長培地において、あるいは単一の成長因子として種HSP593由来の組み替えバクテリアNME1二量体を添加された無血清最小培地で培養された、MUC1陽性のT47D乳癌細胞における遺伝子パネル発現のRT-PCR測定グラフを示し、報告によると、いくつかの癌幹細胞あるいは転移性癌細胞において過剰発現する。「浮遊物」は、非付着になり、集められた細胞を指し、その後、分析された。
図9は、通常のRPMI成長培地において、あるいは‘２i’（これは、以前プライムド状態にある幹細胞初期のナイーブ状態に戻すことが示されたMAPキナーゼとGSK3の生化学的阻害剤である）、‘２i’プラス組み換えヒトNM23二量体若しくは‘２i’プラス組み換えヒトNME7-ABを添加された無血清最小培地で培養された、MUC1陽性のT47D乳癌細胞における遺伝子パネル発現のRT-PCR測定グラフを示し、報告によると、いくつかの癌幹細胞あるいは転移性癌細胞において過剰発現する。「浮遊物」は、非付着になり、集められた細胞を指し、その後、分析された。
図10は、通常のRPMI成長培地において、あるいは‘２i’（これは、以前プライムド状態にある幹細胞初期のナイーブ状態に戻すことが示されたMAPキナーゼとGSK3の生化学的阻害剤である）、‘２i’プラス組み換えヒトNME7-AB若しくはNME7-AB単独を添加された無血清最小培地で培養された、MUC1陽性のT47D乳癌細胞における遺伝子パネル発現のRT-PCR測定グラフを示し、報告によると、いくつかの癌幹細胞あるいは転移性癌細胞において過剰発現する。「浮遊物」は、非付着になり、集められた細胞を指し、その後、分析された。
図11aは、通常のRPMI成長培地において、あるいは単一の成長因子としてヒト組み替えNM23、NME1とも呼ばれる、二量体若しくはNME7-ABを添加された無血清最小培地で培養された、MUC1陽性のDU145前立腺癌細胞における遺伝子パネル発現のRT-PCR測定グラフを示し、報告によると、いくつかの癌幹細胞あるいは転移性癌細胞において過剰発現する。測定を「浮遊物」および付着細胞になるものの平均にして、多数は単に緩く付着したが、これらの細胞は表面から浮遊しなかった。
図11bは、DU145前立腺癌細胞が組み換えヒトNME7-AB、バクテリアHSP593 NME1あるいはヒトNME1/NM23二量体での9あるいは10継代培養された後での、遺伝子パネル発現のRT-PCR測定グラフを示す。グラフは、延長された作用薬での培養の後に、前立腺癌マーカーCDH1/E-カドヘリンおよび幹細胞マーカーの発現の増加を示す。
図12aは、通常のRPMI成長培地において、あるいは単一の成長因子として組み替えヒトNME1/NM23、二量体若しくはNME7-ABを添加された無血清最小培地で培養された、MUC1陰性のPC3前立腺癌細胞における遺伝子パネル発現のRT-PCR測定グラフを示し、報告によると、いくつかの癌幹細胞あるいは転移性癌細胞において過剰発現する。
図12bは、単一の成長因子として組み替えヒトNME1/NM23、バクテリアHSP593 NME1あるいはNME7-ABを添加された無血清最小培地で連続継体後に、MUC1陰性のPC3前立腺癌細胞における遺伝子パネル発現のRT-PCR測定グラフを示す。
図13は、通常のRPMI成長培地において、あるいは‘２i’若しくは組み換えヒトNME7-ABを添加された無血清最小培地で培養された、MUC1陽性のT47D乳癌細胞における、クロマチン再配列因子BRD4、JMJD6、MBD3およびCHD4をコードする遺伝子の発現のRT-PCR測定のグラフを示し、「浮遊物」細胞は、分析された該細胞であった。
図14は、通常のRPMI成長培地において、あるいは‘２i’、‘２i’プラス組み換えヒトNM23二量体若しくは‘２i’プラス組み換えヒトNME7-ABを添加された無血清最小培地で培養された、MUC1陽性のT47D乳癌細胞における、クロマチン再配列因子BRD4、JMJD6、MBD3およびCHD4をコードする遺伝子の発現のRT-PCR測定のグラフを示し、「浮遊物」とは、非付着になる細胞を意味し、集められ、そして分析された。
図15は、通常のRPMI成長培地において、あるいはヒト組み替えNM23、NME1とも呼ばれる、二量体、NME7-AB若しくはHSP593 バクテリアNME1二量体を添加された無血清最小培地で培養された、体細胞線維芽細胞、‘fbb’細胞における遺伝子の発現のRT-PCR測定のグラフを示し、報告によると、いくつかの癌幹細胞あるいは転移性癌細胞において過剰発現する。「+ ROCi」は、それらを表面に付着させるためにいくつかの細胞に加えられたロー・キナーゼ阻害剤を指す。「マイナスROCi」は浮遊物を指していないが、ロー・キナーゼ阻害剤がない状態で付着しているままだった細胞を指す。
図16は、通常のRPMI成長培地において、あるいはヒト組み替えNM23、NME1とも呼ばれる、二量体、NME7-AB若しくはHSP593 バクテリアNME1二量体を添加された無血清最小培地で培養された、体細胞線維芽細胞、‘fbb’細胞におけるクロマチン再配列因子BRD4、JMJD6、MBD3およびCHD4をコードする遺伝子の発現のRT-PCR測定のグラフを示す。「+ ROCi」は、それらを表面に付着させるためにいくつかの細胞に加えられたロー・キナーゼ阻害剤を指す。
図17は、通常のRPMI成長培地において、あるいはヒト組み替えNM23、NME1とも呼ばれる、二量体、NME7-AB若しくはHSP593 バクテリアNME1二量体を添加された無血清最小培地で培養された、体細胞線維芽細胞、‘fbb’細胞におけるクロマチン再配列因子BRD4、JMJD6、MBD3およびCHD4をコードする遺伝子の発現のRT-PCR測定のグラフを示し、報告によると、いくつかの癌幹細胞あるいは転移性癌細胞において過剰発現する。「+ ROCi」は、それらを表面に付着させるためにいくつかの細胞に加えられたロー・キナーゼ阻害剤を指す。「マイナスROCi」は浮遊物を指していないが、ロー・キナーゼ阻害剤がない状態で付着しているままだった細胞を指す。
図18は、多能性の形態を備えたヒト胚性幹細胞の写真を示し、そこにおいて幹細胞はただ一つの成長因子としての組み換えヒトNME1二量体を含む無血清最小培地で培養された。
図19は、多能性の形態を備えたヒト胚性幹細胞の写真を示し、そこにおいて幹細胞はただ一つの成長因子としての組み換えヒトNME7-ABを含む無血清最小培地で培養された。
図20は、多能性の形態を備えたヒト胚性幹細胞の写真を示し、そこにおいて幹細胞はただ一つの成長因子としての組み換えHSP593バクテリアNME1二量体を含む無血清最小培地で培養された。
図21は、50、100、1,000あるいは10,000細胞が横腹皮下に植え付けされた免疫許容nu/nu雌マウスの4つのグループの腫瘍容積測定のグラフを示し、ここで植え付けされた細胞は組み換えヒトNME7-ABで7日間培養されたヒトMUC1陽性乳癌細胞であり、そこで「浮遊物」は集められ、100倍以上に転移レセプターCXCR4を過剰発現することが確認された。各グループのマウスの半分は、ヒト組み換えNME7-ABを毎日注入された。グラフ内の番号はマウス・トラッキング番号を指す。「M」は、多発性腫瘍を備えたマウスを表示する。
図22は、50、100、1,000あるいは10,000細胞が横腹皮下に植え付けされた免疫許容nu/nu雌マウスの4つのグループをの腫瘍容積測定のグラフを示し、ここで植え付けされた細胞は組み換えヒトNME7-ABで7日間培養されたヒトMUC1陽性乳癌細胞であり、そこで「浮遊物」は集められ、100倍以上に転移レセプターCXCR4を過剰発現することが確認された。各グループのマウスの半分は、ヒト組み換えNME7-ABを毎日注入された。NME7-ABを毎日投与されたマウスのうち、80%は多発性腫瘍を生じた。このグラフは、同じマウスでの多発性腫瘍の結合した体積を示し、グラフ内の番号はマウス・トラッキング番号を指し、「M」は、多発性腫瘍をもつマウスを表示する。
図23は、50の癌細胞が植え付けされたマウス#1の写真を示し、また経過日28および経過日58でrhNME7-ABを毎日注入された。暗い矢は注射部位の腫瘍を指し、また、明るい矢は、経過日28と経過日63の間に生じた転移性腫瘍を指す。
図24は、50の癌細胞が植え付けされたマウス#2の写真を示し、それは経過日28および経過日58でのrhNME7-ABの毎日注入はされなかった。暗い矢は注射部位の腫瘍を指す。
図25は、50の癌細胞が植え付けされたマウス#3の写真を示し、また経過日28および経過日58でrhNME7-ABを毎日注入された。暗い矢は注射部位の腫瘍を指す。
図26は、50の癌細胞が植え付けされたマウス#4の写真を示し、それは経過日28および経過日58でのrhNME7-ABの毎日注入はされなかった。暗い矢は注射部位の腫瘍を指す。
図27は、50の癌細胞が植え付けされたマウス#5の写真を示し、また経過日28および経過日58でrhNME7-ABを毎日注入された。暗い矢は注射部位の腫瘍を指し、また、明るい矢は、経過日28と経過日63の間に生じた転移性腫瘍を指す。
図28は、50の癌細胞が植え付けされたマウス#2の写真を示し、それは経過日28および経過日58でのrhNME7-ABの毎日注入はされなかった。暗い矢は注射部位の腫瘍を指す。
図29は、100の癌細胞が植え付けされたマウス#1の写真を示し、それは経過日28でのrhNME7-ABの毎日注入はされなかった。暗い矢は注射部位の腫瘍を指す。
図30は、100の癌細胞が植え付けされたマウス#2の写真を示し、また経過日28および経過日58でrhNME7-ABを毎日注入された。暗い矢は注射部位の腫瘍を指し、また、明るい矢は、経過日28と経過日63の間に生じた転移性腫瘍を指す。
図31は、100の癌細胞が植え付けされたマウス#3の写真を示し、それは経過日28でのrhNME7-ABの毎日注入はされなかった。暗い矢は注射部位の腫瘍を指す。
図32は、100の癌細胞が植え付けされたマウス#4の写真を示し、また経過日28および経過日58でrhNME7-ABを毎日注入された。暗い矢は注射部位の腫瘍を指し、また、明るい矢は、経過日28と経過日63の間に生じた転移性腫瘍を指す。
図33は、100の癌細胞が植え付けされたマウス#5の写真を示し、それは経過日28および経過日58でのrhNME7-ABの毎日注入はされなかった。腫瘍は、経過日28と経過日63の間に生じなかった。
図34は、100の癌細胞が植え付けされたマウス#6の写真を示し、また経過日28および経過日58でrhNME7-ABを毎日注入された。暗い矢は注射部位の腫瘍を指し、また、明るい矢は、経過日28と経過日63の間に生じた転移性腫瘍を指す。
図35は、1,000の癌細胞が植え付けされたマウス#1の写真を示し、また経過日28および経過日58でrhNME7-ABを毎日注入された。暗い矢は注射部位の腫瘍を指し、また、明るい矢は、経過日28と経過日63の間に生じた転移性腫瘍を指す。
図36は、1,000の癌細胞が植え付けされたマウス#2の写真を示し、また経過日28および経過日58でrhNME7-ABを毎日注入された。腫瘍は、経過日28と経過日63の間に生じなかった。
図37は、1,000の癌細胞が植え付けされたマウス#3の写真を示し、また経過日28および経過日58でrhNME7-ABを毎日注入された。腫瘍は、経過日28と経過日63の間に生じなかった。
図38は、1,000の癌細胞が植え付けされたマウス#4の写真を示し、それは経過日28および経過日58でのrhNME7-ABの毎日注入はされなかった。暗い矢は、注射部位の腫瘍をしめす。
図39は、1,000の癌細胞が植え付けされたマウス#5の写真を示し、また経過日28および経過日58でrhNME7-ABを毎日注入された。暗い矢は、注射部位の腫瘍をしめす。
図40は、1,000の癌細胞が植え付けされたマウス#6の写真をし、また経過日28および経過日58でrhNME7-ABを毎日注入されなかった。腫瘍は経過日28と経過日63の間に生じなかった。
図41は、10,000個の細胞が植え付けされたマウス#1の写真を示し、また経過日28でrhNME7-ABを毎日注入されなかった。病気により乱切りした。暗い矢は、注射部位の腫瘍をしめす。
図42は、10,000の癌細胞が植え付けされたマウス#2の写真を示し、また経過日28および経過日58でrhNME7-ABを毎日注入された。暗い矢は注射部位の腫瘍を指し、また、明るい矢は、経過日28と経過日63の間に生じた転移性腫瘍を指す。
図43は、10,000の癌細胞が植え付けされたマウス#3の写真をし、また経過日28および経過日58でrhNME7-ABを毎日注入されなかった。暗い矢は、注射部位の腫瘍をしめす。
図44は、10,000の癌細胞が植え付けされたマウス#4の写真を示し、また経過日28および経過日58でrhNME7-ABを毎日注入された。暗い矢は注射部位の腫瘍を指し、また、明るい矢は、経過日28と経過日63の間に生じた転移性腫瘍を指す。
図45は、10,000の癌細胞が植え付けされたマウス#5の写真をし、また経過日28および経過日58でrhNME7-ABを毎日注入されなかった。暗い矢は、注射部位の腫瘍をしめす。
図46は、10,000の癌細胞が植え付けされたマウス#6の写真を示し、また経過日28および経過日58でrhNME7-ABを毎日注入された。暗い矢は、注射部位の腫瘍をしめす。
図47は、NME7-ABがMUC1*細胞外ドメインペプチドを二量化させることを示すELISAサンドイッチ測定からのHRP信号のグラフを示す。
図48A-48B。 (A)は、細菌Halomonas Sp.593からのNMEのポリアクリルアミドゲルを示し、それは大腸菌で発現され、可溶のタンパク質および自然な二量体として発現した。 (B)は、Halomonas Sp. 593からのNMEが、MUC1*細胞外ドメインのPSMGFRペプチドに結合することをELISA分析で示す。
図49は、細菌Porphyromonas gingivalis W83からのNMEのポリアクリルアミドゲルを示す。
図50A-50C。（A）は、ヒトNME-H1へのHalomonas Sp 593バクテリアNMEの配列アラインメントを示す。（B）は、ヒトNME7-A領域へのHalomonas Sp 593バクテリアNMEの配列アラインメントを示す。(C)は、ヒトNME7-B領域へのHalomonas Sp 953バクテリアNMEの配列アラインメントを示す。
図51は、後期段階のプライムド幹細胞と比較された最も初期ナイーブヒト幹細胞における転写因子BRD4およびコファクターJMJD6の発現レベルのRT-PCR測定のグラフである。
図52は、4X拡大での二量体型にあるヒトNME1を含む無血清培地での培養18日後におけるヒト線維芽細胞の写真を示す。
図53は、20X拡大での二量体型にあるヒトNME1を含む無血清培地での培養18日後におけるヒト線維芽細胞の写真を示す。
図54は、4X拡大でのHalomonas Sp 593からの細菌性NMEを含む無血清培地での培養18日後におけるヒト線維芽細胞の写真を示す。
図55は、20X拡大でのHalomonas Sp 593からの細菌性NMEを含む無血清培地での培養18日後におけるヒト線維芽細胞の写真を示す。
図56は、4X拡大でのヒトNME7-ABを含む無血清培地での培養18日後におけるヒト線維芽細胞の写真を示す。
図57は、20X拡大でのヒトNME7-ABを含む無血清培地での培養18日後におけるヒト線維芽細胞の写真を示す。
図58は、4X拡大でのNMEタンパク質のない標準培地での培養18日後におけるヒト線維芽細胞の写真を示す。
図59は、20X拡大でのNMEタンパク質のない標準培地での培養18日後におけるヒト線維芽細胞の写真を示す。
図60は、ここに記述された実験の分析に基づくNME7および関連因子の相互作用地図の漫画である。
図61は、NME1に低い配列同一性を備えたヒトNME7から免疫原性ペプチドのリストである。リストされたペプチド配列は、ヒトNME1ではなくヒトNME7をターゲットとする抗体を生じさせる免疫原性ペプチドであることが同定された。配列はヒトNME1への配列相同性のそれらの欠如のために選ばれ、癌の治療か予防用のNME7を阻害するための抗体を生成するNME7特異ペプチドとして有用である。
図62は、構造的完全性にとって、あるいはMUC1*への結合性にとって重要でありうるヒトNME7からの免疫原性ペプチドをリストする。それぞれの可変領域がNME7の異なるペプチド部分に結合する、二価および両特異抗体が好適である。そのようなペプチドは、両方に特異的な抗体を生成するために1つ以上のペプチドを使用することにより生成される。ペプチドは、癌の治療か予防用のNME7を阻害する抗体を生成するためのNME7特異的ペプチドとして有用である。
図63は、構造的完全性にとって、あるいはMUC1*への結合性にとって重要でありうるヒトNME1からの免疫原性ペプチドをリストする。リストされたペプチド配列はヒトNME1由来であり、その機能を模倣することができる他のバクテリアNMEタンパク質へのそれらの相同と同様にヒトNME7へのそれらの高い相同性によって選ばれた。特に、ペプチド50〜53は、ヒトNME7-Aあるいは-B、およびさらにHSP 593に対して高い相同性がある。
定義
ここに使用されたように、“MUC1*“細胞外ドメインは、主としてPSMGFR配列
GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(配列番号: 6)
によって定義される。MUC1開裂の正確なサイトは、その開裂する酵素に依存し、開裂酵素は細胞型、組織タイプあるいは細胞の進化における時間に依存して多様であるので、MUC1*細胞外ドメインの正確な配列はN末端で多様に変化する。
ここに使用されるように、用語「PSMGFR」は、
GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(配列番号: 6)
として述べられるMUC1成長因子レセプターの一次配列の頭字語である。この点では、「N-10 PSMGFR」、「N-15 PSMGFR」あるいは「N-20 PSMGFR」での「N-数」は、PSMGFRのN末端で削除されたアミノ酸残基の数を指す。同様に「C-10 PSMGFR」、「C-15 PSMGFR」あるいは「C-20 PSMGFR」での「C-数」は、PSMGFRのC末端で削除されたアミノ酸残基の数を指す。
ここに使用されたように、「MUC1*細胞外ドメイン」は、タンデムリピート領域が欠けているMUC1タンパク質の細胞外部分を意味する。ほとんどの場合、MUC1*は、MUC1*部分がタンデムリピート、膜貫通領域および細胞質のテイルを欠くショート細胞外ドメインからなる開裂産物である。恐らく1つを超える酵素によってそれを開裂することができるので、MUC1開裂の正確な位置は知られていない。MUC1*の細胞外ドメインは、ほとんどのPSMGFR配列を含んでいるが、さらに付加的な10-20のN-末端アミノ酸があってもよい。
ここに使用されるように、「NMEファミリータンパク質」あるいは「NMEファミリーグループタンパク質」番号１〜１０は、それらが、少なくとも1つのNDPK(ヌクレオチド・ピロ燐酸塩キナーゼ)領域をもつので、一まとめにされたタンパク質である。ある場合には、NDPK領域は、ADPへのATPの転換を触媒するという点において作用しない。NMEタンパク質は、NM23タンパク質、番号H1、H2などとして一般的に知られていた。ここに、NM23、NMEという用語は互換的である。ここに、用語NME1、NME2、NME6およびNME7は、NMEバリアントと同様に野生型蛋白質を参照するように使用される。ある場合には、これらのバリアントがより可溶か、あるいは大腸菌において一層よく発現するか、又は野生型配列タンパク質よりより可溶である。例えば、明細書で使用されるNME7は、変異が大腸菌での可溶の、適切に折り込まれたタンパク質の高収率発現を可能にするので、すぐれた商用適用可能性を持っているNME7-ABのような、野生型蛋白質あるいはバリアントを意味する場合がある。ここに引用されるように「NME1」は「NM23-H1」と互換的である。本発明は、NMEタンパク質の正確な配列によって結合されていないことはさらに意図されている。NM23-S120Gと呼ばれる突然変異体NME1-S120Gは、適用の全体にわたって互換的に使用される。S120G突然変異体およびP96S突然変異体は二量体形成に対するそれらの志向性ために好適であり、ここにNM23二量体あるいはNME1二量体に関連づけられる。
ここに引用されるNME7は、約42kDaの分子量をもつ野生型のNME7、25と33 kDaの間の分子量もつ開裂された型、DM10リーダー配列を欠くバリアント、NME7-AB若しくは組み換えNME7タンパク質、又はその配列が効率的な発現若しくはその増加した産出、溶解性或いはNME7をより有効かより商業ベースにのったようにする他の特性を可能にするように変更されたこれらのバリアントを意図する。
ここに使用される、「ナイーブ状態に幹細胞を維持するか、ナイーブ状態にプライムド幹細胞を戻す作用薬」というのは、タンパク質、低分子あるいは核酸を意図し、単独で若しくは組み合わせで、胚の内部細胞塊の細胞に似て、幹細胞をナイーブ状態に幹細胞を維持する。実施例を含み、NME1二量体（ヒト若しくはバクテリア）、NME7、NME7-AB、2i、5i、MBD3 、CHD4、BRD4あるいはJMJD6の発現を抑制するsiRNAのような核酸に限定されない。
ここに使用される、「低分子」と呼ばれる作用薬に関して、それは、50Daと2000Daの間、より好適には150daと1000daの間、さらに好適には200Daと750Daの間の分子量をもつ合成化学薬品あるいは化学理論に基づいた分子でありうる。
ここに使用される、「天然産物」と呼ばれている作用薬に関して、当該分子が自然界において存在する限り、それは化学的分子あるいは生体分子でありうる。
ここに使用される、「2i阻害剤」はMAPキナーゼ・シグナル経路のGSK3ベータ及びMEKの低分子阻害剤を指す。用語2iは、研究記事(Silva Jら、2008)で造語されたが、ここで「2i」は、GSK3ベータあるいはMEKのいずれかの任意の阻害剤を指し、それらがこれらの標的を阻害する場合、多分化能または腫瘍形成に同じ効果がある、多くの低分子あるいは生物学的因子である。
ここに使用される、FGF、FGF-2あるいはbFGFは繊維芽細胞成長因子を指す。
ここに使用されるように、「ロー関連キナーゼ阻害剤」は低分子、ペプチドあるいはタンパク質でありうる(Rath Nら、2012)。ロー・キナーゼ阻害剤は、ここでROCiかROCKi、あるいはRiと短縮される。特異的ロー・キナーゼ阻害剤の使用は、例示的であり、いかなる他のロー・キナーゼ阻害剤をも置換しうる。
ここに使用される、用語「癌幹細胞」あるいは「腫瘍始原細胞」は、より転移性の状態あるいはより攻撃的な癌にリンクされた遺伝子のレベルを発現する癌細胞を指す。用語「癌幹細胞」あるいは「腫瘍始原細胞」は、動物へ植え付けされた時腫瘍を生じさせるのに、はるかに少数の細胞が要求される癌細胞をまた指す。癌幹細胞および腫瘍始原細胞は多くの場合化学療法薬に耐性である。
ここに使用される、用語「幹/癌」、「癌様」、「幹様」は、細胞が幹細胞または癌細胞の特性を得る状態を指し、幹細胞、癌細胞あるいは癌幹細胞の遺伝子発現プロフィールの重要な要素を共有する。幹様細胞は、多分化能遺伝子の発現を増加するような、より少ない成熟した状態への誘導を受けている体細胞でありうる。幹様細胞は、さらに、ある脱分化を受けたか、それらがターミナルの分化を変更することができるメタ安定状態にある細胞を指す。癌様細胞は、アンカレッジ独立で成長することができるか、動物で腫瘍を生じさせることができるように、まだ完全には特徴づけられていない癌細胞だが癌細胞の形態および特性示すものでありうる。
配列フリーテキスト
a、g、c、t以外のヌクレオチド・シンボルの使用は、WIPO標準ST.25、付録2、表1で示された条約に従い、そこではkはtまたはgを表わし; nはa、c、tあるいはgを表わし; mはa又はcを表し; rはa又はg; sはc又はgを表わし; wはa又はt及びyはc又はtを表わす。
MTPGTQSPFF LLLLLTVLTV VTGSGHASST PGGEKETSATQRSSVPSSTE
KNAVSMTSSV LSSHSPGSGS STTQGQDVTL APATEPASGSAATWGQDVTS
VPVTRPALGS TTPPAHDVTS APDNKPAPGS TAPPAHGVTSAPDTRPAPGS
TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGSTAPPAHGVTS
APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTSAPDTRPAPGS
TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGSTAPPAHGVTS
APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTSAPDTRPAPGS
TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGSTAPPAHGVTS
APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTSAPDTRPAPGS
TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGSTAPPAHGVTS
APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTSAPDTRPAPGS
TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGSTAPPAHGVTS
APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTSAPDTRPAPGS
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APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTSAPDTRPAPGS
TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGSTAPPAHGVTS
APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTSAPDTRPAPGS
TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGSTAPPAHGVTS
APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTSAPDNRPALGS
TAPPVHNVTS ASGSASGSAS TLVHNGTSAR ATTTPASKSTPFSIPSHHSD
TPTTLASHST KTDASSTHHS SVPPLTSSNH STSPQLSTGVSFFFLSFHIS
NLQFNSSLED PSTDYYQELQ RDISEMFLQI YKQGGFLGLSNIKFRPGSVV
VQLTLAFREG TINVHDVETQ FNQYKTEAAS RYNLTISDVSVSDVPFPFSA
QSGAGVPGWG IALLVLVCVL VALAIVYLIA LAVCQCRRKNYGQLDIFPAR
DTYHPMSEYP TYHTHGRYVP PSSTDRSPYE KVSAGNGGSSLSYTNPAVAA
ASANL(配列番号: 1)は全長MUC1レセプター(ムチン1前駆物質、Genbank受入番号: P15941)を記述する。
MTPGTQSPFFLLLLLTVLT(配列番号: 2)
MTPGTQSPFFLLLLLTVLT VVTA(配列番号: 3)
MTPGTQSPFFLLLLLTVLT VVTG(配列番号: 4)
SEQ ID NOS:2、3および4は、細胞膜表面にMUC1レセプターおよびトランケートされたアイソフォームを向けるためのN末端MUC-1シグナリング配列を記述する。
3つまでのアミノ酸残基が、SEQ IDNOS:2、3および4におけるバリアントによって示されるようなC末端で欠失されうる．
GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGAGVPGWGIALLVLVCVLVALAIVYLIALAVCQCRRKNYGQLDIFPARDTYHPMSEYPTYHTHGRYVPPSSTDRSPYEKVSAGNGGSSLSYTNPAVAAASANL(配列番号: 5)は、そのN末端でnat-PSMGFRを持つ、トランケートされたMUC1レセプターのアイソフォームを記述し、全長MUC1レセプターの膜貫通及び細胞質の配列を含む。
GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(配列番号: 6)は、MUC1成長因子レセプター(nat-PSMGFR：「PSMGFR」の例)のネイティブ一次配列の細胞外ドメインを記述する:
TINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(配列番号: 7)は、配列番号: 6のN末端で単一のアミノ酸欠失を持つ、MUC1成長因子レセプター(nat-PSMGFR−「PSMGFR」の例)のネイティブ一次配列の細胞外ドメインを記述する。
GTINVHDVETQFNQYKTEAASPYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(配列番号: 8)は、増強された安定性を持っているMUC1成長因子レセプターのネイティブ一次配列の“SPY”機能的バリアントの細胞外ドメインを記述する(var-PSMGFR - 「PSMGFR」の例)。
TINVHDVETQFNQYKTEAASPYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(配列番号: 9)は、増強された安定性を持っているMUC1成長因子レセプターのネイティブ一次配列の“SPY”機能的バリアントの細胞外ドメインを記述し(var-PSMGFR - 「PSMGFR」の例)、配列番号:8のC末端で単一のアミノ酸欠失を有している。
tgtcagtgccgccgaaagaactacgggcagctggacatctttccagcccgggatacctaccatcctatgagcgagtaccccacctaccacacccatgggcgctatgtgccccctagcagtaccgatcgtagcccctatgagaaggtttctgcaggtaacggtggcagcagcctctcttacacaaacccagcagtggcagccgcttctgccaacttg(配列番号: 10)は、MUC1の細胞質ドメインのヌクレオチド配列を記述する。
CQCRRKNYGQLDIFPARDTYHPMSEYPTYHTHGRYVPPSSTDRSPYEKVSAGNGGSSLSYTNPAVAAASANL(配列番号: 11)はMUC1の細胞質ドメインのアミノ酸配列を記述する。
gagatcctgagacaatgaatcatagtgaaagattcgttttcattgcagagtggtatgatccaaatgcttcacttcttcgacgttatgagcttttattttacccaggggatggatctgttgaaatgcatgatgtaaagaatcatcgcacctttttaaagcggaccaaatatgataacctgcacttggaagatttatttataggcaacaaagtgaatgtcttttctcgacaactggtattaattgactatggggatcaatatacagctcgccagctgggcagtaggaaagaaaaaacgctagccctaattaaaccagatgcaatatcaaaggctggagaaataattgaaataataaacaaagctggatttactataaccaaactcaaaatgatgatgctttcaaggaaagaagcattggattttcatgtagatcaccagtcaagaccctttttcaatgagctgatccagtttattacaactggtcctattattgccatggagattttaagagatgatgctatatgtgaatggaaaagactgctgggacctgcaaactctggagtggcacgcacagatgcttctgaaagcattagagccctctttggaacagatggcataagaaatgcagcgcatggccctgattcttttgcttctgcggccagagaaatggagttgttttttccttcaagtggaggttgtgggccggcaaacactgctaaatttactaattgtacctgttgcattgttaaaccccatgctgtcagtgaaggtatgttgaatacactatattcagtacattttgttaataggagagcaatgtttattttcttgatgtactttatgtatagaaaataa(配列番号: 12)はNME7ヌクレオチド配列(NME7:GENBANK ACCESSION AB209049)を記述する。
DPETMNHSERFVFIAEWYDPNASLLRRYELLFYPGDGSVEMHDVKNHRTFLKRTKYDNLHLEDLFIGNKVNVFSRQLVLIDYGDQYTARQLGSRKEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGMLNTLYSVHFVNRRAMFIFLMYFMYRK(配列番号: 13)はNME7アミノ酸配列順序(NME7:GENBANK ACCESSION AB209049)を記述する。
atggtgctactgtctactttagggatcgtctttcaaggcgaggggcctcctatctcaagctgtgatacaggaaccatggccaactgtgagcgtaccttcattgcgatcaaaccagatggggtccagcggggtcttgtgggagagattatcaagcgttttgagcagaaaggattccgccttgttggtctgaaattcatgcaagcttccgaagatcttctcaaggaacactacgttgacctgaaggaccgtccattctttgccggcctggtgaaatacatgcactcagggccggtagttgccatggtctgggaggggctgaatgtggtgaagacgggccgagtcatgctcggggagaccaaccctgcagactccaagcctgggaccatccgtggagacttctgcatacaagttggcaggaacattatacatggcagtgattctgtggagagtgcagagaaggagatcggcttgtggtttcaccctgaggaactggtagattacacgagctgtgctcagaactggatctatgaatga(配列番号: 14)はNM23-H1ヌクレオチド配列(NM23-H1: GENBANK ACCESSION AF487339)を記述する。
MVLLSTLGIVFQGEGPPISSCDTGTMANCERTFIAIKPDGVQRGLVGEIIKRFEQKGFRLVGLKFMQASEDLLKEHYVDLKDRPFFAGLVKYMHSGPVVAMVWEGLNVVKTGRVMLGETNPADSKPGTIRGDFCIQVGRNIIHGSDSVESAEKEIGLWFHPEELVDYTSCAQNWIYE(配列番号: 15)は、NM23-H1のアミノ酸配列順序(NM23H1:GENBANK ACCESSION AF487339)を記述する。
atggtgctactgtctactttagggatcgtctttcaaggcgaggggcctcctatctcaagctgtgatacaggaaccatggccaactgtgagcgtaccttcattgcgatcaaaccagatggggtccagcggggtcttgtgggagagattatcaagcgttttgagcagaaaggattccgccttgttggtctgaaattcatgcaagcttccgaagatcttctcaaggaacactacgttgacctgaaggaccgtccattctttgccggcctggtgaaatacatgcactcagggccggtagttgccatggtctgggaggggctgaatgtggtgaagacgggccgagtcatgctcggggagaccaaccctgcagactccaagcctgggaccatccgtggagacttctgcatacaagttggcaggaacattatacatggcggtgattctgtggagagtgcagagaaggagatcggcttgtggtttcaccctgaggaactggtagattacacgagctgtgctcagaactggatctatgaatga(配列番号: 16)は、NM23-H1 S120G突然変異体ヌクレオチド配列(NM23H1:GENBANKACCESSION AF487339)を記述する。
MVLLSTLGIVFQGEGPPISSCDTGTMANCERTFIAIKPDGVQRGLVGEIIKRFEQKGFRLVGLKFMQASEDLLKEHYVDLKDRPFFAGLVKYMHSGPVVAMVWEGLNVVKTGRVMLGETNPADSKPGTIRGDFCIQVGRNIIHGGDSVESAEKEIGLWFHPEELVDYTSCAQNWIYE(配列番号: 17)は、NM23-H1 S120G突然変異体アミノ酸配列順序(NM23-H1: GENBANK ACCESSION AF487339)を記述する。
atggccaacctggagcgcaccttcatcgccatcaagccggacggcgtgcagcgcggcctggtgggcgagatcatcaagcgcttcgagcagaagggattccgcctcgtggccatgaagttcctccgggcctctgaagaacacctgaagcagcactacattgacctgaaagaccgaccattcttccctgggctggtgaagtacatgaactcagggccggttgtggccatggtctgggaggggctgaacgtggtgaagacaggccgagtgatgcttggggagaccaatccagcagattcaaagccaggcaccattcgtggggacttctgcattcaggttggcaggaacatcattcatggcagtgattcagtaaaaagtgctgaaaaagaaatcagcctatggtttaagcctgaagaactggttgactacaagtcttgtgctcatgactgggtctatgaataa(配列番号: 18)は、NM23-H2ヌクレオチド配列(NM23-H2: GENBANK ACCESSIONAK313448)を記述する。
MANLERTFIAIKPDGVQRGLVGEIIKRFEQKGFRLVAMKFLRASEEHLKQHYIDLKDRPFFPGLVKYMNSGPVVAMVWEGLNVVKTGRVMLGETNPADSKPGTIRGDFCIQVGRNIIHGSDSVKSAEKEISLWFKPEELVDYKSCAHDWVYE(配列番号: 19)は、NM23-H2アミノ酸配列順序(NM23-H2: GENBANK ACCESSION AK313448)を記述する。
大腸菌発現のために最適化されたヒトのNM23-H7-2配列:
(DNA)
atgcatgacgttaaaaatcaccgtacctttctgaaacgcacgaaatatgataatctgcatctggaagacctgtttattggcaacaaagtcaatgtgttctctcgtcagctggtgctgatcgattatggcgaccagtacaccgcgcgtcaactgggtagtcgcaaagaaaaaacgctggccctgattaaaccggatgcaatctccaaagctggcgaaattatcgaaattatcaacaaagcgggtttcaccatcacgaaactgaaaatgatgatgctgagccgtaaagaagccctggattttcatgtcgaccaccagtctcgcccgtttttcaatgaactgattcaattcatcaccacgggtccgattatcgcaatggaaattctgcgtgatgacgctatctgcgaatggaaacgcctgctgggcccggcaaactcaggtgttgcgcgtaccgatgccagtgaatccattcgcgctctgtttggcaccgatggtatccgtaatgcagcacatggtccggactcattcgcatcggcagctcgtgaaatggaactgtttttcccgagctctggcggttgcggtccggcaaacaccgccaaatttaccaattgtacgtgctgtattgtcaaaccgcacgcagtgtcagaaggcctgctgggtaaaattctgatggcaatccgtgatgctggctttgaaatctcggccatgcagatgttcaacatggaccgcgttaacgtcgaagaattctacgaagtttacaaaggcgtggttaccgaatatcacgatatggttacggaaatgtactccggtccgtgcgtcgcgatggaaattcagcaaaacaatgccaccaaaacgtttcgtgaattctgtggtccggcagatccggaaatcgcacgtcatctgcgtccgggtaccctgcgcgcaatttttggtaaaacgaaaatccagaacgctgtgcactgtaccgatctgccggaagacggtctgctggaagttcaatactttttcaaaattctggataattga(配列番号: 20)
(アミノ酸)
MHDVKNHRTFLKRTKYDNLHLEDLFIGNKVNVFSRQLVLIDYGDQYTARQLGSRKEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFFKILDN(配列番号: 21)
ヒトNME7-A:
(DNA)
atggaaaaaacgctagccctaattaaaccagatgcaatatcaaaggctggagaaataattgaaataataaacaaagctggatttactataaccaaactcaaaatgatgatgctttcaaggaaagaagcattggattttcatgtagatcaccagtcaagaccctttttcaatgagctgatccagtttattacaactggtcctattattgccatggagattttaagagatgatgctatatgtgaatggaaaagactgctgggacctgcaaactctggagtggcacgcacagatgcttctgaaagcattagagccctctttggaacagatggcataagaaatgcagcgcatggccctgattcttttgcttctgcggccagagaaatggagttgtttttttga(配列番号: 22)
(アミノ酸)
MEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFF(配列番号: 23)-
ヒトNME7-A1:
(DNA)
atggaaaaaacgctagccctaattaaaccagatgcaatatcaaaggctggagaaataattgaaataataaacaaagctggatttactataaccaaactcaaaatgatgatgctttcaaggaaagaagcattggattttcatgtagatcaccagtcaagaccctttttcaatgagctgatccagtttattacaactggtcctattattgccatggagattttaagagatgatgctatatgtgaatggaaaagactgctgggacctgcaaactctggagtggcacgcacagatgcttctgaaagcattagagccctctttggaacagatggcataagaaatgcagcgcatggccctgattcttttgcttctgcggccagagaaatggagttgttttttccttcaagtggaggttgtgggccggcaaacactgctaaatttacttga
(配列番号:24)
(アミノ酸)
MEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFT(配列番号: 25)-
ヒトNME7-A2:
(DNA)
atgaatcatagtgaaagattcgttttcattgcagagtggtatgatccaaatgcttcacttcttcgacgttatgagcttttattttacccaggggatggatctgttgaaatgcatgatgtaaagaatcatcgcacctttttaaagcggaccaaatatgataacctgcacttggaagatttatttataggcaacaaagtgaatgtcttttctcgacaactggtattaattgactatggggatcaatatacagctcgccagctgggcagtaggaaagaaaaaacgctagccctaattaaaccagatgcaatatcaaaggctggagaaataattgaaataataaacaaagctggatttactataaccaaactcaaaatgatgatgctttcaaggaaagaagcattggattttcatgtagatcaccagtcaagaccctttttcaatgagctgatccagtttattacaactggtcctattattgccatggagattttaagagatgatgctatatgtgaatggaaaagactgctgggacctgcaaactctggagtggcacgcacagatgcttctgaaagcattagagccctctttggaacagatggcataagaaatgcagcgcatggccctgattcttttgcttctgcggccagagaaatggagttgtttttttga(配列番号: 26)
(アミノ酸)
MNHSERFVFIAEWYDPNASLLRRYELLFYPGDGSVEMHDVKNHRTFLKRTKYDNLHLEDLFIGNKVNVFSRQLVLIDYGDQYTARQLGSRKEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFF(配列番号: 27)
ヒトNME7-A3:
(DNA)
atgaatcatagtgaaagattcgttttcattgcagagtggtatgatccaaatgcttcacttcttcgacgttatgagcttttattttacccaggggatggatctgttgaaatgcatgatgtaaagaatcatcgcacctttttaaagcggaccaaatatgataacctgcacttggaagatttatttataggcaacaaagtgaatgtcttttctcgacaactggtattaattgactatggggatcaatatacagctcgccagctgggcagtaggaaagaaaaaacgctagccctaattaaaccagatgcaatatcaaaggctggagaaataattgaaataataaacaaagctggatttactataaccaaactcaaaatgatgatgctttcaaggaaagaagcattggattttcatgtagatcaccagtcaagaccctttttcaatgagctgatccagtttattacaactggtcctattattgccatggagattttaagagatgatgctatatgtgaatggaaaagactgctgggacctgcaaactctggagtggcacgcacagatgcttctgaaagcattagagccctctttggaacagatggcataagaaatgcagcgcatggccctgattcttttgcttctgcggccagagaaatggagttgttttttccttcaagtggaggttgtgggccggcaaacactgctaaatttacttga(配列番号: 28)
(アミノ酸)
MNHSERFVFIAEWYDPNASLLRRYELLFYPGDGSVEMHDVKNHRTFLKRTKYDNLHLEDLFIGNKVNVFSRQLVLIDYGDQYTARQLGSRKEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFT(配列番号: 29)-
ヒトNME7-B:
(DNA)
atgaattgtacctgttgcattgttaaaccccatgctgtcagtgaaggactgttgggaaagatcctgatggctatccgagatgcaggttttgaaatctcagctatgcagatgttcaatatggatcgggttaatgttgaggaattctatgaagtttataaaggagtagtgaccgaatatcatgacatggtgacagaaatgtattctggcccttgtgtagcaatggagattcaacagaataatgctacaaagacatttcgagaattttgtggacctgctgatcctgaaattgcccggcatttacgccctggaactctcagagcaatctttggtaaaactaagatccagaatgctgttcactgtactgatctgccagaggatggcctattagaggttcaatacttcttctga(配列番号: 30)
(アミノ酸)
MNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFF(配列番号: 31)-
ヒトNME7-B1:
(DNA)
atgaattgtacctgttgcattgttaaaccccatgctgtcagtgaaggactgttgggaaagatcctgatggctatccgagatgcaggttttgaaatctcagctatgcagatgttcaatatggatcgggttaatgttgaggaattctatgaagtttataaaggagtagtgaccgaatatcatgacatggtgacagaaatgtattctggcccttgtgtagcaatggagattcaacagaataatgctacaaagacatttcgagaattttgtggacctgctgatcctgaaattgcccggcatttacgccctggaactctcagagcaatctttggtaaaactaagatccagaatgctgttcactgtactgatctgccagaggatggcctattagaggttcaatacttcttcaagatcttggataattagtga(配列番号: 32)
(アミノ酸)
MNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFFKILDN(配列番号: 33)-
ヒトNME7-B2:
(DNA)
atgccttcaagtggaggttgtgggccggcaaacactgctaaatttactaattgtacctgttgcattgttaaaccccatgctgtcagtgaaggactgttgggaaagatcctgatggctatccgagatgcaggttttgaaatctcagctatgcagatgttcaatatggatcgggttaatgttgaggaattctatgaagtttataaaggagtagtgaccgaatatcatgacatggtgacagaaatgtattctggcccttgtgtagcaatggagattcaacagaataatgctacaaagacatttcgagaattttgtggacctgctgatcctgaaattgcccggcatttacgccctggaactctcagagcaatctttggtaaaactaagatccagaatgctgttcactgtactgatctgccagaggatggcctattagaggttcaatacttcttctga(配列番号: 34)
(アミノ酸)
MPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFF(配列番号: 35)-
ヒトNME7-B3:
(DNA)
atgccttcaagtggaggttgtgggccggcaaacactgctaaatttactaattgtacctgttgcattgttaaaccccatgctgtcagtgaaggactgttgggaaagatcctgatggctatccgagatgcaggttttgaaatctcagctatgcagatgttcaatatggatcgggttaatgttgaggaattctatgaagtttataaaggagtagtgaccgaatatcatgacatggtgacagaaatgtattctggcccttgtgtagcaatggagattcaacagaataatgctacaaagacatttcgagaattttgtggacctgctgatcctgaaattgcccggcatttacgccctggaactctcagagcaatctttggtaaaactaagatccagaatgctgttcactgtactgatctgccagaggatggcctattagaggttcaatacttcttcaagatcttggataattagtga(配列番号: 36)
(アミノ酸)
MPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFFKILDN(配列番号: 37)--
ヒトNME7-AB:
(DNA)
atggaaaaaacgctagccctaattaaaccagatgcaatatcaaaggctggagaaataattgaaataataaacaaagctggatttactataaccaaactcaaaatgatgatgctttcaaggaaagaagcattggattttcatgtagatcaccagtcaagaccctttttcaatgagctgatccagtttattacaactggtcctattattgccatggagattttaagagatgatgctatatgtgaatggaaaagactgctgggacctgcaaactctggagtggcacgcacagatgcttctgaaagcattagagccctctttggaacagatggcataagaaatgcagcgcatggccctgattcttttgcttctgcggccagagaaatggagttgttttttccttcaagtggaggttgtgggccggcaaacactgctaaatttactaattgtacctgttgcattgttaaaccccatgctgtcagtgaaggactgttgggaaagatcctgatggctatccgagatgcaggttttgaaatctcagctatgcagatgttcaatatggatcgggttaatgttgaggaattctatgaagtttataaaggagtagtgaccgaatatcatgacatggtgacagaaatgtattctggcccttgtgtagcaatggagattcaacagaataatgctacaaagacatttcgagaattttgtggacctgctgatcctgaaattgcccggcatttacgccctggaactctcagagcaatctttggtaaaactaagatccagaatgctgttcactgtactgatctgccagaggatggcctattagaggttcaatacttcttcaagatcttggataattagtga(配列番号: 38)
(アミノ酸)
MEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFFKILDN(配列番号: 39)--
ヒトNME7-AB1:
(DNA)
atggaaaaaacgctagccctaattaaaccagatgcaatatcaaaggctggagaaataattgaaataataaacaaagctggatttactataaccaaactcaaaatgatgatgctttcaaggaaagaagcattggattttcatgtagatcaccagtcaagaccctttttcaatgagctgatccagtttattacaactggtcctattattgccatggagattttaagagatgatgctatatgtgaatggaaaagactgctgggacctgcaaactctggagtggcacgcacagatgcttctgaaagcattagagccctctttggaacagatggcataagaaatgcagcgcatggccctgattcttttgcttctgcggccagagaaatggagttgttttttccttcaagtggaggttgtgggccggcaaacactgctaaatttactaattgtacctgttgcattgttaaaccccatgctgtcagtgaaggactgttgggaaagatcctgatggctatccgagatgcaggttttgaaatctcagctatgcagatgttcaatatggatcgggttaatgttgaggaattctatgaagtttataaaggagtagtgaccgaatatcatgacatggtgacagaaatgtattctggcccttgtgtagcaatggagattcaacagaataatgctacaaagacatttcgagaattttgtggacctgctgatcctgaaattgcccggcatttacgccctggaactctcagagcaatctttggtaaaactaagatccagaatgctgttcactgtactgatctgccagaggatggcctattagaggttcaatacttcttctga(配列番号: 40)
(アミノ酸)
MEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFF(配列番号: 41)
大腸菌発現のために最適化されたヒトNME7-A配列:
(DNA)
atggaaaaaacgctggccctgattaaaccggatgcaatctccaaagctggcgaaattatcgaaattatcaacaaagcgggtttcaccatcacgaaactgaaaatgatgatgctgagccgtaaagaagccctggattttcatgtcgaccaccagtctcgcccgtttttcaatgaactgattcaattcatcaccacgggtccgattatcgcaatggaaattctgcgtgatgacgctatctgcgaatggaaacgcctgctgggcccggcaaactcaggtgttgcgcgtaccgatgccagtgaatccattcgcgctctgtttggcaccgatggtatccgtaatgcagcacatggtccggactcattcgcatcggcagctcgtgaaatggaactgtttttctga(配列番号: 42)
(アミノ酸)
MEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFF(配列番号: 43)-
大腸菌発現のために最適化されたヒトNME7-A1配列:
(DNA)
atggaaaaaacgctggccctgattaaaccggatgcaatctccaaagctggcgaaattatcgaaattatcaacaaagcgggtttcaccatcacgaaactgaaaatgatgatgctgagccgtaaagaagccctggattttcatgtcgaccaccagtctcgcccgtttttcaatgaactgattcaattcatcaccacgggtccgattatcgcaatggaaattctgcgtgatgacgctatctgcgaatggaaacgcctgctgggcccggcaaactcaggtgttgcgcgtaccgatgccagtgaatccattcgcgctctgtttggcaccgatggtatccgtaatgcagcacatggtccggactcattcgcatcggcagctcgtgaaatggaactgtttttcccgagctctggcggttgcggtccggcaaacaccgccaaatttacctga(配列番号: 44)
(アミノ酸)
MEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFT(配列番号: 45)-
大腸菌発現のために最適化されたヒトNME7-A2配列:
(DNA)
atgaatcactccgaacgctttgtttttatcgccgaatggtatgacccgaatgcttccctgctgcgccgctacgaactgctgttttatccgggcgatggtagcgtggaaatgcatgacgttaaaaatcaccgtacctttctgaaacgcacgaaatatgataatctgcatctggaagacctgtttattggcaacaaagtcaatgtgttctctcgtcagctggtgctgatcgattatggcgaccagtacaccgcgcgtcaactgggtagtcgcaaagaaaaaacgctggccctgattaaaccggatgcaatctccaaagctggcgaaattatcgaaattatcaacaaagcgggtttcaccatcacgaaactgaaaatgatgatgctgagccgtaaagaagccctggattttcatgtcgaccaccagtctcgcccgtttttcaatgaactgattcaattcatcaccacgggtccgattatcgcaatggaaattctgcgtgatgacgctatctgcgaatggaaacgcctgctgggcccggcaaactcaggtgttgcgcgtaccgatgccagtgaatccattcgcgctctgtttggcaccgatggtatccgtaatgcagcacatggtccggactcattcgcatcggcagctcgtgaaatggaactgtttttctga(配列番号: 46)
(アミノ酸)
MNHSERFVFIAEWYDPNASLLRRYELLFYPGDGSVEMHDVKNHRTFLKRTKYDNLHLEDLFIGNKVNVFSRQLVLIDYGDQYTARQLGSRKEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFF(配列番号: 47)
大腸菌発現のために最適化されたヒトNME7-A3配列:
(DNA)
atgaatcactccgaacgctttgtttttatcgccgaatggtatgacccgaatgcttccctgctgcgccgctacgaactgctgttttatccgggcgatggtagcgtggaaatgcatgacgttaaaaatcaccgtacctttctgaaacgcacgaaatatgataatctgcatctggaagacctgtttattggcaacaaagtcaatgtgttctctcgtcagctggtgctgatcgattatggcgaccagtacaccgcgcgtcaactgggtagtcgcaaagaaaaaacgctggccctgattaaaccggatgcaatctccaaagctggcgaaattatcgaaattatcaacaaagcgggtttcaccatcacgaaactgaaaatgatgatgctgagccgtaaagaagccctggattttcatgtcgaccaccagtctcgcccgtttttcaatgaactgattcaattcatcaccacgggtccgattatcgcaatggaaattctgcgtgatgacgctatctgcgaatggaaacgcctgctgggcccggcaaactcaggtgttgcgcgtaccgatgccagtgaatccattcgcgctctgtttggcaccgatggtatccgtaatgcagcacatggtccggactcattcgcatcggcagctcgtgaaatggaactgtttttcccgagctctggcggttgcggtccggcaaacaccgccaaatttacctga(配列番号: 48)
(アミノ酸)
MNHSERFVFIAEWYDPNASLLRRYELLFYPGDGSVEMHDVKNHRTFLKRTKYDNLHLEDLFIGNKVNVFSRQLVLIDYGDQYTARQLGSRKEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFT(配列番号: 49)-
大腸菌発現のために最適化されたヒトNME7-B配列:
(DNA)
atgaattgtacgtgctgtattgtcaaaccgcacgcagtgtcagaaggcctgctgggtaaaattctgatggcaatccgtgatgctggctttgaaatctcggccatgcagatgttcaacatggaccgcgttaacgtcgaagaattctacgaagtttacaaaggcgtggttaccgaatatcacgatatggttacggaaatgtactccggtccgtgcgtcgcgatggaaattcagcaaaacaatgccaccaaaacgtttcgtgaattctgtggtccggcagatccggaaatcgcacgtcatctgcgtccgggtaccctgcgcgcaatttttggtaaaacgaaaatccagaacgctgtgcactgtaccgatctgccggaagacggtctgctggaagttcaatactttttctga(配列番号: 50)
(アミノ酸)
MNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFF(配列番号: 51)-
大腸菌発現のために最適化されたヒトNME7-B1配列:
(DNA)
atgaattgtacgtgctgtattgtcaaaccgcacgcagtgtcagaaggcctgctgggtaaaattctgatggcaatccgtgatgctggctttgaaatctcggccatgcagatgttcaacatggaccgcgttaacgtcgaagaattctacgaagtttacaaaggcgtggttaccgaatatcacgatatggttacggaaatgtactccggtccgtgcgtcgcgatggaaattcagcaaaacaatgccaccaaaacgtttcgtgaattctgtggtccggcagatccggaaatcgcacgtcatctgcgtccgggtaccctgcgcgcaatttttggtaaaacgaaaatccagaacgctgtgcactgtaccgatctgccggaagacggtctgctggaagttcaatactttttcaaaattctggataattga(配列番号: 52)
(アミノ酸)
MNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFFKILDN(配列番号: 53)-
大腸菌発現のために最適化されたヒトNME7-B2配列:
(DNA)
atgccgagctctggcggttgcggtccggcaaacaccgccaaatttaccaattgtacgtgctgtattgtcaaaccgcacgcagtgtcagaaggcctgctgggtaaaattctgatggcaatccgtgatgctggctttgaaatctcggccatgcagatgttcaacatggaccgcgttaacgtcgaagaattctacgaagtttacaaaggcgtggttaccgaatatcacgatatggttacggaaatgtactccggtccgtgcgtcgcgatggaaattcagcaaaacaatgccaccaaaacgtttcgtgaattctgtggtccggcagatccggaaatcgcacgtcatctgcgtccgggtaccctgcgcgcaatttttggtaaaacgaaaatccagaacgctgtgcactgtaccgatctgccggaagacggtctgctggaagttcaatactttttctga(配列番号: 54)
(アミノ酸)
MPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFF(配列番号: 55)-
大腸菌発現のために最適化されたヒトNME7-B3配列:
(DNA)
atgccgagctctggcggttgcggtccggcaaacaccgccaaatttaccaattgtacgtgctgtattgtcaaaccgcacgcagtgtcagaaggcctgctgggtaaaattctgatggcaatccgtgatgctggctttgaaatctcggccatgcagatgttcaacatggaccgcgttaacgtcgaagaattctacgaagtttacaaaggcgtggttaccgaatatcacgatatggttacggaaatgtactccggtccgtgcgtcgcgatggaaattcagcaaaacaatgccaccaaaacgtttcgtgaattctgtggtccggcagatccggaaatcgcacgtcatctgcgtccgggtaccctgcgcgcaatttttggtaaaacgaaaatccagaacgctgtgcactgtaccgatctgccggaagacggtctgctggaagttcaatactttttcaaaattctggataattga(配列番号: 56)
(アミノ酸)
MPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFFKILDN(配列番号: 57)-
大腸菌発現のために最適化されたヒトNME7-AB配列:
(DNA)
atggaaaaaacgctggccctgattaaaccggatgcaatctccaaagctggcgaaattatcgaaattatcaacaaagcgggtttcaccatcacgaaactgaaaatgatgatgctgagccgtaaagaagccctggattttcatgtcgaccaccagtctcgcccgtttttcaatgaactgattcaattcatcaccacgggtccgattatcgcaatggaaattctgcgtgatgacgctatctgcgaatggaaacgcctgctgggcccggcaaactcaggtgttgcgcgtaccgatgccagtgaatccattcgcgctctgtttggcaccgatggtatccgtaatgcagcacatggtccggactcattcgcatcggcagctcgtgaaatggaactgtttttcccgagctctggcggttgcggtccggcaaacaccgccaaatttaccaattgtacgtgctgtattgtcaaaccgcacgcagtgtcagaaggcctgctgggtaaaattctgatggcaatccgtgatgctggctttgaaatctcggccatgcagatgttcaacatggaccgcgttaacgtcgaagaattctacgaagtttacaaaggcgtggttaccgaatatcacgatatggttacggaaatgtactccggtccgtgcgtcgcgatggaaattcagcaaaacaatgccaccaaaacgtttcgtgaattctgtggtccggcagatccggaaatcgcacgtcatctgcgtccgggtaccctgcgcgcaatttttggtaaaacgaaaatccagaacgctgtgcactgtaccgatctgccggaagacggtctgctggaagttcaatactttttcaaaattctggataattga(配列番号: 58)
(アミノ酸)
MEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFFKILDN(配列番号: 59)
大腸菌発現のために最適化されたヒトNME7-AB1配列:
(DNA)
atggaaaaaacgctggccctgattaaaccggatgcaatctccaaagctggcgaaattatcgaaattatcaacaaagcgggtttcaccatcacgaaactgaaaatgatgatgctgagccgtaaagaagccctggattttcatgtcgaccaccagtctcgcccgtttttcaatgaactgattcaattcatcaccacgggtccgattatcgcaatggaaattctgcgtgatgacgctatctgcgaatggaaacgcctgctgggcccggcaaactcaggtgttgcgcgtaccgatgccagtgaatccattcgcgctctgtttggcaccgatggtatccgtaatgcagcacatggtccggactcattcgcatcggcagctcgtgaaatggaactgtttttcccgagctctggcggttgcggtccggcaaacaccgccaaatttaccaattgtacgtgctgtattgtcaaaccgcacgcagtgtcagaaggcctgctgggtaaaattctgatggcaatccgtgatgctggctttgaaatctcggccatgcagatgttcaacatggaccgcgttaacgtcgaagaattctacgaagtttacaaaggcgtggttaccgaatatcacgatatggttacggaaatgtactccggtccgtgcgtcgcgatggaaattcagcaaaacaatgccaccaaaacgtttcgtgaattctgtggtccggcagatccggaaatcgcacgtcatctgcgtccgggtaccctgcgcgcaatttttggtaaaacgaaaatccagaacgctgtgcactgtaccgatctgccggaagacggtctgctggaagttcaatactttttctga(配列番号: 60)
(アミノ酸)
MEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFF(配列番号: 61)
マウスNME6
(DNA)
atgacctccatcttgcgaagtccccaagctcttcagctcacactagccctgatcaagcctgatgcagttgcccacccactgatcctggaggctgttcatcagcagattctgagcaacaagttcctcattgtacgaacgagggaactgcagtggaagctggaggactgccggaggttttaccgagagcatgaagggcgttttttctatcagcggctggtggagttcatgacaagtgggccaatccgagcctatatccttgcccacaaagatgccatccaactttggaggacactgatgggacccaccagagtatttcgagcacgctatatagccccagattcaattcgtggaagtttgggcctcactgacacccgaaatactacccatggctcagactccgtggtttccgccagcagagagattgcagccttcttccctgacttcagtgaacagcgctggtatgaggaggaggaaccccagctgcggtgtggtcctgtgcactacagtccagaggaaggtatccactgtgcagctgaaacaggaggccacaaacaacctaacaaaacctag(配列番号: 62)
(アミノ酸)
MTSILRSPQALQLTLALIKPDAVAHPLILEAVHQQILSNKFLIVRTRELQWKLEDCRRFYREHEGRFFYQRLVEFMTSGPIRAYILAHKDAIQLWRTLMGPTRVFRARYIAPDSIRGSLGLTDTRNTTHGSDSVVSASREIAAFFPDFSEQRWYEEEEPQLRCGPVHYSPEEGIHCAAETGGHKQPNKT(配列番号: 63)
ヒトNME6:
(DNA)
atgacccagaatctggggagtgagatggcctcaatcttgcgaagccctcaggctctccagctcactctagccctgatcaagcctgacgcagtcgcccatccactgattctggaggctgttcatcagcagattctaagcaacaagttcctgattgtacgaatgagagaactactgtggagaaaggaagattgccagaggttttaccgagagcatgaagggcgttttttctatcagaggctggtggagttcatggccagcgggccaatccgagcctacatccttgcccacaaggatgccatccagctctggaggacgctcatgggacccaccagagtgttccgagcacgccatgtggccccagattctatccgtgggagtttcggcctcactgacacccgcaacaccacccatggttcggactctgtggtttcagccagcagagagattgcagccttcttccctgacttcagtgaacagcgctggtatgaggaggaagagccccagttgcgctgtggccctgtgtgctatagcccagagggaggtgtccactatgtagctggaacaggaggcctaggaccagcctga(配列番号: 64)
(アミノ酸)
MTQNLGSEMASILRSPQALQLTLALIKPDAVAHPLILEAVHQQILSNKFLIVRMRELLWRKEDCQRFYREHEGRFFYQRLVEFMASGPIRAYILAHKDAIQLWRTLMGPTRVFRARHVAPDSIRGSFGLTDTRNTTHGSDSVVSASREIAAFFPDFSEQRWYEEEEPQLRCGPVCYSPEGGVHYVAGTGGLGPA(配列番号: 65)
ヒトNME6 1:
(DNA)
atgacccagaatctggggagtgagatggcctcaatcttgcgaagccctcaggctctccagctcactctagccctgatcaagcctgacgcagtcgcccatccactgattctggaggctgttcatcagcagattctaagcaacaagttcctgattgtacgaatgagagaactactgtggagaaaggaagattgccagaggttttaccgagagcatgaagggcgttttttctatcagaggctggtggagttcatggccagcgggccaatccgagcctacatccttgcccacaaggatgccatccagctctggaggacgctcatgggacccaccagagtgttccgagcacgccatgtggccccagattctatccgtgggagtttcggcctcactgacacccgcaacaccacccatggttcggactctgtggtttcagccagcagagagattgcagccttcttccctgacttcagtgaacagcgctggtatgaggaggaagagccccagttgcgctgtggccctgtgtga(配列番号: 66)
(アミノ酸)
MTQNLGSEMASILRSPQALQLTLALIKPDAVAHPLILEAVHQQILSNKFLIVRMRELLWRKEDCQRFYREHEGRFFYQRLVEFMASGPIRAYILAHKDAIQLWRTLMGPTRVFRARHVAPDSIRGSFGLTDTRNTTHGSDSVVSASREIAAFFPDFSEQRWYEEEEPQLRCGPV(配列番号: 67)
ヒトNME6 2:
(DNA)
atgctcactctagccctgatcaagcctgacgcagtcgcccatccactgattctggaggctgttcatcagcagattctagcaacagttcctgattgtacgaatgagagaactactgtggagaaaggaagattgccagaggttttaccgagagcatgaagggcgttttttctatcagaggctggtggagttcatggccagcgggccaatccgagcctacatccttgcccacaaggatgccatccagctctggaggacgctcatgggacccaccagagtgttccgagcacgccatgtggccccagattctatccgtgggagtttcggcctcactgacacccgcaacaccacccatggttcggactctgtggtttcagccagcagagagattgcagccttcttccctgacttcagtgaacagcgctggtatgaggaggaagagccccagttgcgctgtggccctgtgtga(配列番号: 68)
(アミノ酸)
MLTLALIKPDAVAHPLILEAVHQQILSNKFLIVRMRELLWRKEDCQRFYREHEGRFFYQRLVEFMASGPIRAYILAHKDAIQLWRTLMGPTRVFRARHVAPDSIRGSFGLTDTRNTTHGSDSVVSASREIAAFFPDFSEQRWYEEEEPQLRCGPV(配列番号: 69)
ヒトNME6 3:
(DNA)
atgctcactctagccctgatcaagcctgacgcagtcgcccatccactgattctggaggctgttcatcagcagattctagcaacaagttcctgattgtacgaatgagagaactactgtggagaaaggaagattgccagaggttttaccgagagcatgaagggcgttttttctatcagaggctggtggagttcatggccagcgggccaatccgagcctacatccttgcccacaaggatgccatccagctctggaggacgctcatgggacccaccagagtgttccgagcacgccatgtggccccagattctatccgtgggagtttcggcctcactgacacccgcaacaccacccatggttcggactctgtggtttcagccagcagagagattgcagccttcttccctgacttcagtgaacagcgctggtatgaggaggaagagccccagttgcgctgtggccctgtgtgctatagcccagagggaggtgtccactatgtagctggaacaggaggcctaggaccagcctga(配列番号: 70)
(アミノ酸)
MLTLALIKPDAVAHPLILEAVHQQILSNKFLIVRMRELLWRKEDCQRFYREHEGRFFYQRLVEFMASGPIRAYILAHKDAIQLWRTLMGPTRVFRARHVAPDSIRGSFGLTDTRNTTHGSDSVVSASREIAAFFPDFSEQRWYEEEEPQLRCGPVCYSPEGGVHYVAGTGGLGPA(配列番号: 71)
大腸菌発現のために最適化されたヒトNME6配列:
(DNA)
atgacgcaaaatctgggctcggaaatggcaagtatcctgcgctccccgcaagcactgcaactgaccctggctctgatcaaaccggacgctgttgctcatccgctgattctggaagcggtccaccagcaaattctgagcaacaaatttctgatcgtgcgtatgcgcgaactgctgtggcgtaaagaagattgccagcgtttttatcgcgaacatgaaggccgtttcttttatcaacgcctggttgaattcatggcctctggtccgattcgcgcatatatcctggctcacaaagatgcgattcagctgtggcgtaccctgatgggtccgacgcgcgtctttcgtgcacgtcatgtggcaccggactcaatccgtggctcgttcggtctgaccgatacgcgcaataccacgcacggtagcgactctgttgttagtgcgtcccgtgaaatcgcggcctttttcccggacttctccgaacagcgttggtacgaagaagaagaaccgcaactgcgctgtggcccggtctgttattctccggaaggtggtgtccattatgtggcgggcacgggtggtctgggtccggcatga(配列番号: 72)
(アミノ酸)
MTQNLGSEMASILRSPQALQLTLALIKPDAVAHPLILEAVHQQILSNKFLIVRMRELLWRKEDCQRFYREHEGRFFYQRLVEFMASGPIRAYILAHKDAIQLWRTLMGPTRVFRARHVAPDSIRGSFGLTDTRNTTHGSDSVVSASREIAAFFPDFSEQRWYEEEEPQLRCGPVCYSPEGGVHYVAGTGGLGPA(配列番号: 73)
大腸菌発現のために最適化されたヒトNME6 1配列:
(DNA)
atgacgcaaaatctgggctcggaaatggcaagtatcctgcgctccccgcaagcactgcaactgaccctggctctgatcaaaccggacgctgttgctcatccgctgattctggaagcggtccaccagcaaattctgagcaacaaatttctgatcgtgcgtatgcgcgaactgctgtggcgtaaagaagattgccagcgtttttatcgcgaacatgaaggccgtttcttttatcaacgcctggttgaattcatggcctctggtccgattcgcgcatatatcctggctcacaaagatgcgattcagctgtggcgtaccctgatgggtccgacgcgcgtctttcgtgcacgtcatgtggcaccggactcaatccgtggctcgttcggtctgaccgatacgcgcaataccacgcacggtagcgactctgttgttagtgcgtcccgtgaaatcgcggcctttttcccggacttctccgaacagcgttggtacgaagaagaagaaccgcaactgcgctgtggcccggtctga
(配列番号:74)
(アミノ酸)
MTQNLGSEMASILRSPQALQLTLALIKPDAVAHPLILEAVHQQILSNKFLIVRMRELLWRKEDCQRFYREHEGRFFYQRLVEFMASGPIRAYILAHKDAIQLWRTLMGPTRVFRARHVAPDSIRGSFGLTDTRNTTHGSDSVVSASREIAAFFPDFSEQRWYEEEEPQLRCGPV(配列番号: 75)
大腸菌発現のために最適化されたヒトNME6 2配列:
(DNA)
atgctgaccctggctctgatcaaaccggacgctgttgctcatccgctgattctggaagcggtccaccagcaaattctgagcaacaaatttctgatcgtgcgtatgcgcgaactgctgtggcgtaaagaagattgccagcgtttttatcgcgaacatgaaggccgtttcttttatcaacgcctggttgaattcatggcctctggtccgattcgcgcatatatcctggctcacaaagatgcgattcagctgtggcgtaccctgatgggtccgacgcgcgtctttcgtgcacgtcatgtggcaccggactcaatccgtggctcgttcggtctgaccgatacgcgcaataccacgcacggtagcgactctgttgttagtgcgtcccgtgaaatcgcggcctttttcccggacttctccgaacagcgttggtacgaagaagaagaaccgcaactgcgctgtggcccggtctga(配列番号: 76)
(アミノ酸)
MLTLALIKPDAVAHPLILEAVHQQILSNKFLIVRMRELLWRKEDCQRFYREHEGRFFYQRLVEFMASGPIRAYILAHKDAIQLWRTLMGPTRVFRARHVAPDSIRGSFGLTDTRNTTHGSDSVVSASREIAAFFPDFSEQRWYEEEEPQLRCGPV(配列番号: 77)
大腸菌発現のために最適化されたヒトNME6 3配列:
(DNA)
atgctgaccctggctctgatcaaaccggacgctgttgctcatccgctgattctggaagcggtccaccagcaaattctgagcaacaaatttctgatcgtgcgtatgcgcgaactgctgtggcgtaaagaagattgccagcgtttttatcgcgaacatgaaggccgtttcttttatcaacgcctggttgaattcatggcctctggtccgattcgcgcatatatcctggctcacaaagatgcgattcagctgtggcgtaccctgatgggtccgacgcgcgtctttcgtgcacgtcatgtggcaccggactcaatccgtggctcgttcggtctgaccgatacgcgcaataccacgcacggtagcgactctgttgttagtgcgtcccgtgaaatcgcggcctttttcccggacttctccgaacagcgttggtacgaagaagaagaaccgcaactgcgctgtggcccggtctgttattctccggaaggtggtgtccattatgtggcgggcacgggtggtctgggtccggcatga(配列番号: 78)
(アミノ酸)
MLTLALIKPDAVAHPLILEAVHQQILSNKFLIVRMRELLWRKEDCQRFYREHEGRFFYQRLVEFMASGPIRAYILAHKDAIQLWRTLMGPTRVFRARHVAPDSIRGSFGLTDTRNTTHGSDSVVSASREIAAFFPDFSEQRWYEEEEPQLRCGPVCYSPEGGVHYVAGTGGLGPA(配列番号: 79)
全長OriGene-NME7-1
(DNA)
gacgttgtatacgactcctatagggcggccgggaattcgtcgactggatccggtaccgaggagatctgccgccgcgatcgccatgaatcatagtgaaagattcgttttcattgcagagtggtatgatccaaatgcttcacttcttcgacgttatgagcttttattttacccaggggatggatctgttgaaatgcatgatgtaaagaatcatcgcacctttttaaagcggaccaaatatgataacctgcacttggaagatttatttataggcaacaaagtgaatgtcttctctcgacaactggtattaattgactatggggatcaatatacagctcgccagctgggcagtaggaaagaaaaaacgctagccctaattaaaccagatgcaatatcaaaggctggagaaataattgaaataataaacaaagctggatttactataaccaaactcaaaatgatgatgctttcaaggaaagaagcattggattttcatgtagatcaccagtcaagaccctttttcaatgagctgatccagtttattacaactggtcctattattgccatggagattttaagagatgatgctatatgtgaatggaaaagactgctgggacctgcaaactctggagtggcacgcacagatgcttctgaaagcattagagccctctttggaacagatggcataagaaatgcagcgcatggccctgattcttttgcttctgcggccagagaaatggagttgttttttccttcaagtggaggttgtgggccggcaaacactgctaaatttactaattgtacctgttgcattgttaaaccccatgctgtcagtgaaggactgttgggaaagatcctgatggctatccgagatgcaggttttgaaatctcagctatgcagatgttcaatatggatcgggttaatgttgaggaattctatgaagtttataaaggagtagtgaccgaatatcatgacatggtgacagaaatgtattctggcccttgtgtagcaatggagattcaacagaataatgctacaaagacatttcgagaattttgtggacctgctgatcctgaaattgcccggcatttacgccctggaactctcagagcaatctttggtaaaactaagatccagaatgctgttcactgtactgatctgccagaggatggcctattagaggttcaatacttcttcaagatcttggataatacgcgtacgcggccgctcgagcagaaactcatctcagaagaggatctggcagcaaatgatatcctggattacaaggatgacgacgataaggtttaa(配列番号: 80)
(アミノ酸)
MNHSERFVFIAEWYDPNASLLRRYELLFYPGDGSVEMHDVKNHRTFLKRTKYDNLHLEDLFIGNKVNVFSRQLVLIDYGDQYTARQLGSRKEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFFKILDNTRTRRLEQKLISEEDLAANDILDYKDDDDKV(配列番号: 81)
全長Abnova NME7-1
(アミノ酸)
MNHSERFVFIAEWYDPNASLLRRYELLFYPGDGSVEMHDVKNHRTFLKRTKYDNLHLEDLFIGNKVNVFSRQLVLIDYGDQYTARQLGSRKEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFFKILDN(配列番号: 82)
Abnova部分NME7-B
(アミノ酸)
DRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFFKIL(配列番号: 83)
ヒスチジン・タグ
(ctcgag) caccaccaccaccaccactga(配列番号: 84)
Strept IIタグ
(accggt) tggagccatcctcagttcgaaaagtaatga(配列番号: 85)
N-10ペプチド:
QFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(配列番号: 86)
C-10ペプチド
GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDV(配列番号: 87)
LALIKPDA(配列番号: 88)
MMMLSRKEALDFHVDHQS(配列番号: 89)
ALDFHVDHQS(配列番号: 90)
EILRDDAICEWKRL(配列番号: 91)
FNELIQFITTGP(配列番号: 92)
RDDAICEW(配列番号: 93)
SGVARTDASESIRALFGTDGIRNAA(配列番号: 94)
ELFFPSSGG(配列番号: 95)
KFTNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMA(配列番号: 96)
LMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVT(配列番号: 97)
EFYEVYKGVVTEYHD(配列番号: 98)
EIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNA(配列番号: 99)
YSGPCVAM(配列番号: 100)
FREFCGP(配列番号: 101)
VHCTDLPEDGLLEVQYFFKILDN(配列番号: 102)
IQNAVHCTD(配列番号: 103)
TDLPEDGLLEVQYFFKILDN(配列番号: 104)
PEDGLLEVQYFFK(配列番号: 105)
EIINKAGFTITK(配列番号: 106)
MLSRKEALDFHVDHQS(配列番号: 107)
NELIQFITT(配列番号: 108)
EILRDDAICEWKRL(配列番号: 109)
SGVARTDASESIRALFGTDGI(配列番号: 110)
SGVARTDASES(配列番号: 111)
ALFGTDGI(配列番号: 112)
NCTCCIVKPHAVSE(配列番号: 113)
LGKILMAIRDA(配列番号: 114)
EISAMQMFNMDRVNVE(配列番号: 115)
EVYKGVVT(配列番号: 116)
EYHDMVTE(配列番号: 117)
EFCGPADPEIARHLR(配列番号: 118)
AIFGKTKIQNAV(配列番号: 119)
LPEDGLLEVQYFFKILDN(配列番号: 120)
GPDSFASAAREMELFFP(配列番号: 121)
ヒトNME7に由来した免疫原性ペプチド
ICEWKRL(配列番号: 122)
LGKILMAIRDA(配列番号: 123)
HAVSEGLLGK(配列番号: 124)
VTEMYSGP(配列番号: 125)
NATKTFREF(配列番号: 126)
AIRDAGFEI(配列番号: 127)
AICEWKRLLGPAN(配列番号: 128)
DHQSRPFF(配列番号: 129)
AICEWKRLLGPAN(配列番号: 130)
VDHQSRPF(配列番号: 131)
PDSFAS(配列番号: 132)
KAGEIIEIINKAGFTITK(配列番号: 133)
ヒトNME1に由来した免疫原性ペプチド
MANCERTFIAIKPDGVQRGLVGEIIKRFE(配列番号: 134)
VDLKDRPF(配列番号: 135)
HGSDSVESAEKEIGLWF(配列番号: 136)
ERTFIAIKPDGVQRGLVGEIIKRFE(配列番号: 137)
VDLKDRPFFAGLVKYMHSGPVVAMVWEGLN(配列番号: 138)
NIIHGSDSVESAEKEIGLWFHPEELV(配列番号: 139)
KPDGVQRGLVGEII(配列番号: 140)
「マウスに生着したヒト癌細胞をNME7若しくはNME7-ABにコンタクトさせることによる、癌細胞に対する薬物テストをよりヒト様に反応するマウスの調製」
NMEファミリータンパク質は癌を促進するように機能することができる。創薬で使用されるマウス、げっ歯動物および他の動物は、効能または毒性に関してテストされている薬に対する反応において、慣例的に正確にはヒトを模倣していない。いくつかの「悪い薬」は、死を含むヒトでの厳しい副作用を引き起こすことによる訴訟の主題であった。にもかかわらず、当該薬はマウスで毒性を示していなかったのである。マウスでの結果とヒトでの結果の間の相違の1つの理由は、健康な機能と同様に疾病の分子メカニズムがヒトと比較して、マウスにおいて異なるということである。
本発明者等は、ヒト幹細胞およびヒト癌細胞が同じメカニズムによって成長することを発見した。癌細胞と多能性幹細胞の両方は、有力な成長因子レセプターであるMUC1*を過剰発現する(Mahanta Sら、2008)。二量体である、NME1とも呼ばれるMUC1*のリガンド、NM23-H1は、ヒト幹細胞を多能性の状態で成長させるのに、フィーダー細胞、調整培地あるいは他の成長因子あるいはサイトカインの必要なしで、単独で十分である(Hikita Sら、2008)。本発明者等は、NM23-H1二量体がMUC1*成長因子レセプターのリガンドで、MUC1*というのはほとんどの細胞外ドメインが細胞表面から開裂され脱落後に、残る膜貫通部分であることを以前に示した。細胞外ドメインの残りの部分は、PSMGFR配列によって本質的に構成される。NM23二量体は、MUC1*レセプターに結合し二量化される。合成PSMGFRペプチドを使用する、NME-MUC1*相互作用の拮抗的阻害は、多能性幹細胞の分化を誘導し、それはNM23二量体およびMUC1*成長因子レセプターの間の相互作用によって多能性幹細胞の成長が仲介されることを示す。同様に、癌の大きな割合は事実上同じメカニズムによって成長する。MUC1は、すべてのヒト癌の75%以上で、MUC1*型に開裂される。ヒト幹細胞のように、ヒト癌細胞は、二量体化の後、それがMUC1*レセプターに結合し、ヒト癌細胞の成長を刺激する、NM23を分泌する。PSMGFRペプチドを加えることによる、あるいは抗MUC1*(抗PSMGFR)抗体のFabを加えることによる相互作用の拮抗的阻害は、生体外で及び生体内で、ヒト腫瘍細胞の成長に、大きな減少を引き起こした。
本発明者等は、NMEファミリーの新規な成長因子、NME7を見出し、それはFGFあるいは他の成長因子がない状態で、ヒト幹細胞を成長させ及びそれらの分化を阻害する。報告によると、NME7は、精巣以外においては何ら成人の組織には存在せず、胚で発現される。驚いたことに、本発明者等は、多くのヒト癌、特に攻撃的な癌、がNME7を発現し、~33kDaの明白な分子量で挙動する、NME7種を生産するために翻訳後の開裂を受けた、活性化された形態でそれを分泌することを発見した。これは、計算上の分子量~42kDaがあるおよび細胞質に結合されるように見える、全長NME7と対照的である。分泌されたNME7は、ヒト幹細胞およびヒト癌の成長因子として機能する。NM23二量体のように、NME7はMUC1*成長因子レセプターに結合し、それを二量化する;しかしながら、NME7はMUC1*の細胞外ドメインへの2つの結合部位をもので、モノマーとしてそのようにする。
したがって、ヒト幹細胞およびヒト癌は、同じ成長因子：二量体型にあるNM23（NME1とも呼ばれる）あるいはNME7を経て成長する。
NMEタンパク質は、幹様状態に細胞を戻すように誘導すると同様に、胚およびiPS細胞の成長および多分化能を促進する。幹様状態および癌の状態の遺伝的情報の多くが今日共有される(Kumar SM et al 2012, Liu K et al 2013, Yeo JC et al 2014, Oshima Net al 2014, Wang ML et al 2013)ので、本発明者等はさらに、NMEファミリータンパク質が癌の状態を引き起こすことができると結論する。好ましい態様では、NMEファミリータンパク質は、NME1あるいはNME1に対して30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%あるいは97%以上の配列同一性を持っているNMEタンパク質であり、そこでは該タンパク質は二量体である。もっと好ましい態様では、NMEファミリータンパク質は、NME7あるいはNME7ドメインA若しくはBの少なくとも1つに対して30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%あるいは97%以上の配列同一性を持っているNMEタンパク質であり、そしてMUC1*成長因子レセプターを二量化させることができる。
ここで、本発明者等は、二量体型のNME1、二量体型のバクテリアNME1、NME7あるいはNME7-ABが次のものに有能だったと報告する:
a)分化を阻害している間、全面的にヒトのES若しくはiPSの成長および多分化能をサポートする;
b)より幹様か、より癌様の状態へ体細胞を戻す;そして
c)腫瘍始原細胞とも呼ばれた、高度に転移性の癌幹細胞状態へ癌細胞を形質転換する。
本発明者等は、NME1とも呼ばれる組み換えヒトNM23を作った、それは二量体を安定化させるS120G突然変異を担持する二量体である。本発明者等は、ヒトNME1二量体が、MUC1*レセプターの細胞外ドメインのPSMGFR部分に結合すると以前に報告した(Smaggheら、2013)。さらに、本発明者等は、モノマーとして分泌される組み換えヒトNME7-ABを作った。図47は、NME7-ABモノマーが、MUC1*レセプターの細胞外ドメインのPSMGFR部分に結合し二量化することを示す。本発明者等は、Halomonas Sp593(HSP593)とPorphyromonas gingivalis W83で見つけられた組み換えバクテリアNMEタンパク質を調製した、それはヒトNME1に対して高い配列相同性を持っており、二量体の状態で存在することを確認した(図48および図49)。HSP 593は、大腸菌でよく発現され、その主要部分は二量体として存在した。その群はFPLCによって精製され、二量体の群であることを確認した(図48a)。直接の結合実験が行なわれ、HalomonasSp593由来のバクテリアNMEは、MUC1*細胞外ドメインのPSMGFRペプチドに結合することを示した(図48b)。HSP 593とヒトNME1又はヒトNME7領域A若しくはBとの間の配列アラインメントは、MUC1*細胞外ドメインに結合したバクテリアNMEは、ヒトNME1およびヒトNME7-Aに40-41%同一、およびNME7-Bに34%同一ということを示した(図50A-C)。
追加の実験が行なわれ、ヒトNME1若しくは NME7に30%以上あるいはより好ましくは40%以上の同一性を備えたバクテリアNMEsは、癌および幹細胞の成長と生存を促進するヒトNMEs様に機能することを示した。ヒトNMEに対してこの高い配列同一性を持っているバクテリアNMEsの多くが、ヒト癌において関係することが報告された。ここで、本発明者等は、ヒトNMEに対して高い配列同一性を持っているバクテリアNMEタンパク質が、癌の成長を促進し、かつ癌幹細胞あるいはより転移性癌細胞に癌細胞の形質転換を促進することについて、ヒトNMEのように機能することができることを見出した。バクテリアNMEは、ヒトNME1およびNME7に対する機能分析でテストされた。
しかしながら、マウス幹細胞はヒト幹細胞とは異なるメカニズムによって成長することは知られている。マウスLIF（白血病開始因子）は全面的にマウス幹細胞成長をサポートすることができるが、一方で、LIFはヒト幹細胞の成長には効果がない。ヒト幹細胞の培養で使用される主要な成長因子は、bFGF(Xu Cら、2005)、あるいはベーシック線維芽細胞成長因子である。bFGFはマウス幹細胞成長をサポートすることができない。これは、マウス幹細胞成長の基礎的な生物学的特徴がヒト幹細胞成長のそれとは非常に異なることを示す。マウスでの制癌剤の試験を考慮する場合、この事実は非常に重要になる。
マウスおよび他の動物での制癌剤をテストするための現在の手段は、動物にヒト癌細胞を注入し、直ちにあるいは数日あるいは数週間後に、被験薬を動物に投与する。しかしながら、宿主が、ヒト癌細胞が成長若しくは生着に必要とする成長因子を当然には生産しないので、このアプローチは根本的に欠陥がある。さらに、宿主が成長因子、若しくは成長因子の同じレベルあるいは成長因子のヒト型を生産しないので、動物でテストされる薬はそれらがヒトであるのと同じ効果をもたらさない。マウスNME7は、ヒトNME7にわずか84%同族で、成体では発現されない。したがって、抗癌剤試験のための現在の異種生着片方法は、それらの薬に対するヒトの反応の予測をしばしばもたらさない。この問題は、ヒト腫瘍細胞が腫瘍を育てるためにそれらの同族の成長因子を持つように、マウスへNM23二量体あるいはNME7を導入することにより、解決することができる。NM23二量体あるいはNME7は、様々な方法によって動物へ導入することができる。植え込みに先立って腫瘍細胞と混合され、あるいは、それは腫瘍を担持する動物に注入することができる。
好ましい態様では、ヒトNME7あるいはその断片を発現するトランスジェニック動物がつくられる。NME7は、誘導可能なプロモータ上に担持されることができ、その結果、動物は自然に展開することができ、しかし、NME7あるいはNME7断片の発現は、ヒト腫瘍の植え込み中に、あるいは薬効能あるいは毒性の評価のために、ターンオンされることができる。好ましい態様では、試験動物に導入されるNME7種はNME7-ABである。
互換的に、動物がヒトMUC1、MUC1*、NME7及び／又はNM23-H1若しくは-H2、二量体形成、単一鎖構築物、あるいは二量体を形成する他のバリアントを志向するH1若しくはH2のバリアントを発現するトランスジェニック動物が調製される。NMEタンパク質およびMUC1は、一つの発現が他方のアップレギュレーションを引き起こしうる、ヒトでのフィードバックループの部分であるので、ヒトNMEタンパク質(s)、MUC1あるいは開裂型MUC1*を発現するトランスジェニック動物を生成することは有利である。野生型のあるいは人工的なNME種は、マウスのような、動物へ、トランスジェニック動物の生成、野生型若しくは組み換えNMEタンパク質若しくはNMEタンパク質のバリアントの注入を含む多様な方法で、導入可能である。そこではNME1(NM23-H1)、NME6、およびNME7タンパク質又はバリアントが好適であり、及びNME NME1(NM23-H1)、NME6およびNME7タンパク質又はMUC1*、特にPSMGFRペプチド、を二量化できるバリアント、が特に好適である。好ましい態様では、NME種は、約33kDaの分子量をもつNME7のトランケート型である。もっと好ましい態様では、NME7種は、そのN末端のDM10領域が欠如している。さらにもっと好適な態様では、NME7種はヒトである。
NMEファミリータンパク質、特にNME1、NME6およびNME7は、ヒト癌の成長および転移を促進する成長因子として機能し、ヒト癌で発現される。したがって、ヒトNMEタンパク質あるいはNMEタンパク質の活性型は、ヒト癌の適切な成長、進化および評価に、および化合物、生物学的製剤あるいは薬に対するそれらの反応性の決定のためにその存在は重要である。
「NME7の存在は、非ヒト動物でのヒト癌細胞の生着率を増加させる」
げっ歯動物および他の動物においてヒト癌およびそれらを処置する薬の試験に関する別の問題は、多くのヒト癌が容易には宿主動物に生着しないということである。生体外実験で慣例的に単に使用される多くの癌細胞株は、信頼できる動物研究としては低すぎる生着率である。例えば、T47D乳癌細胞株は、腫瘍誘発遺伝子MUC1のその過剰発現のために生体外の研究に典型的に使用される。しかしながら、T47D細胞は、それらの貧弱な生着率のために、マウス異種生着研究では希にしか使用されない。
多くのヒト癌のように、T47D細胞はNME1とNME7を発現し分泌する。ヒト腫瘍を担持する動物での生体外試験結果を評価するときに生じる問題は、マウスへのT47D生着の割合が通常25-35%の間にあるということである。それは、少なくとも4度、一つの実験が必要とする同数のマウスを必要とし、腫瘍が生着するマウスを同定するために数週間待つ必要があることを意味する。より重要なことには、生着率が非常に低く、宿主がヒトを模倣する環境をもたらしていないという懸念をもたらし、それゆえ、その薬物検査結果はあまり役立たないでものでありうる。
げっ歯動物および他の試験動物へのヒト癌の生着は、NMEタンパク質の存在によって非常に増強される。そこではNMEタンパク質はNME1、NME6あるいはNME7でありえる。試験動物へNMEタンパク質を導入するには、当業者に知られる多くの方法がある。NMEタンパク質は試験動物に注入することができ、あるいはNMEタンパク質を発現するトランスジェニック動物を調製することもできる。いくつかの実例では、NMEタンパク質の発現のタイミングをコントロールすることができることは望ましい。これらのケースでは、タンパク質発現は、調整可能なプロモータのような誘導可能遺伝子要素にリンクされることができる。好ましい態様では、ヒト幹細胞あるいは癌細胞の生着を増加させるために動物へ導入されるNMEタンパク質は、ヒトNME7である。さらに好適な態様では、NME7タンパク質は~33kDaである断片である。さらに好適な態様では、NMEタンパク質はヒトNME7-ABである。
マウス研究では、ヒトNME7-ABを植え付けられた動物は、ヒト腫瘍細胞の生着率の増加を示した。MUC1*陽性の腫瘍細胞(T47D)の生着は、動物へ植え付けに先立って癌細胞をNME7と混合することにより非常に増強され、癌を担持するマウスへのNME7の毎日の注射によってさらに増強された。1つの実験では、腫瘍が植え付けに先立ってNME7と混合された時、経過日7から21日までの平均成長増加は144%で、それなしでは57%であった(図1a)。同じ研究では、癌細胞は、植え付け前のみにNME7と混合され、又は細胞植え付け後に動物に付加的NME7注射をおこなった。結果は、生着率がそれぞれ33%および66%だった (図1b)。図2は、個々のマウスでのヒト腫瘍細胞の成長のグラフを示す。パネル(A)は、標準Matrigelと混合されたT47D乳癌細胞の成長のグラフを示す。6匹の植え付けされたマウスのうちの2匹だけが生着に特有の腫瘍成長を示した。パネル(B)は、MatrigelとNME7で混合されたT47D乳癌細胞の成長のグラフを示す。6匹の植え付けされたマウスのうちの4匹が生着に特有の腫瘍成長を示した。点線は、経過日14の後にNME7をも注入されたマウスを示す。別の検討において、40匹の免疫許容マウスを使用し、NME7との予備混合なし及びNME7注入なしで植え付けされた癌細胞が約25%の真の生着率持っていたことを示した。経過日7から経過日24までの平均成長は、成長において、適度の22%の増加を示したが、腫瘍サイズは減少傾向であった。図3は、標準Matrigelと混合され、40匹の免疫許容(nu/nu)マウスへ異種植え付けされたT47D腫瘍細胞のグラフを示す。グラフは、各20匹のマウスの2つの同一のグループの平均を示し、衰微傾向だが腫瘍容積の22%の平均増加を示した。図4は、腫瘍生着約25%を示す、40匹の個々のマウスでのT47Dヒト乳がん細胞の成長のグラフを示す。図5は、Matrigelと混合され、6匹のNOD/SCIDマウスの横腹へ異種植え付けされたT47D乳癌細胞の成長のグラフを示す。パネル(A)は平均腫瘍成長を示す。パネル(B)は、6匹のマウスのうちの1匹だけが標準法を使用して、よい腫瘍生着達成していたことを示し、個々のマウスでの腫瘍成長を示す。これらの例は、宿主動物へヒト癌細胞に生着させる際の困難さを実証するものである。
「癌幹細胞」
関連する問題において、癌幹細胞とも呼ばれる腫瘍始原細胞に対しての、化合物、生物学的製剤あるいは薬剤の効能、毒性若しくは投与を評価するための実際的な方法は現在存在しない。癌幹細胞は、腫瘍形成を開始させる能力を持っている腫瘍細胞の少数部分である。これらの細胞は、腫瘍からの拘束がない単一細胞が理論上遠隔転移を生じさせうるので、転移の原因の一つであると思われる。研究者は、癌幹細胞が化学療法の殺傷効果を回避することができるという証拠をさらに証明した(Fessler S et al 2009, Lissa NurrulAbdullah and Edward Kai-Hua Chow 2013)。癌幹細胞は、CD44-ハイおよびCD24-ロウのような特異的分子マーカーの存在によって最初に同定された。より最近、レセプタCXCR4は、その発現が癌幹細胞および転移性癌細胞で上昇される転移レセプターであるとして同定された。癌幹細胞のマーカーであると思われる遺伝子のパネルが存在する(Miki J etal 2007, Jeter CR et al 2011, Hong X et al 2012, Faber A et al 2013, MukherjeeD et al 2013, Herreros-Villanueva M et al , 2013, Sefah K et al, 2013; Su H-Tet al 2013)。
癌幹細胞の決定的な証拠と考えられる実験は、非常に少数の細胞が動物で腫瘍を生成することができるかどうかである。nu/nuマウスの横腹への腫瘍生着に必要な癌細胞の典型的な数は、4,000,000〜6,000,000であり、ほとんどの公表された報告書では、これらの癌幹細胞が乳房の脂肪パッドに植え付けされ分化に数か月必要とするにもかかわらず、癌幹細胞はわずか100程度の細胞から腫瘍形成を始めることができる。今日、癌幹細胞を同定する方法はあるが、癌細胞を癌幹細胞に形質転換する作用薬若しくは複数の作用薬への癌細胞の露出する(expose)ことが可能であるという証拠はなかった。したがって、これらの転移性の癌幹細胞を阻害するそれらの能力に関して、化合物、生物学的製剤あるいは薬剤をテストする実際的な方法は現在存在しない。現在の最先端技術上の重大な改良は、一般的な癌細胞を急速に癌幹細胞になるように影響を及ぼす方法を開発することで、その結果、オリジナルの癌細胞への添加で、転移性癌幹細胞が、それらを阻害する処置を同定するために、またスクリーンされうる。この方法で、患者は、癌幹細胞が転移性化し患者を数年後に殺すことができる癌幹細胞のサブ個体群を阻害するであろう薬剤と同様に、原発性癌を阻害する薬剤で処置されうる。
さらに、ナイーブ状態へプライムド幹細胞を戻すことができる(NicholsJ, Smith A 2009, Hanna J et al 2010, Smagghe B et al 2013)又はナイーブ状態にナイーブ幹細胞を維持することが出来る薬剤は、癌細胞を、癌幹細胞あるいは腫瘍始原細胞として参照もされる、より転移性の状態に形質転換することができる。例えば、NMEタンパク質はナイーブ状態に幹細胞を維持することができ、ナイーブ状態へプライムド状態の幹細胞を戻すができる。特に、二量体の形式のNME1およびNME6又はモノマーとしてのNME7は、ナイーブ状態に幹細胞を維持することができ、さらに、より攻撃的かより転移性の状態へ癌細胞を形質転換することができる。NME7は癌細胞を癌幹細胞に形質転換する。
NME1とNME7は、腫瘍イニシエーティング（始原）細胞とも呼ばれるより転移性の癌幹細胞状態へ癌細胞を形質転換する能力を持っている。癌細胞のパネルが、ただ一つの成長因子若しくはサイトカインとしてヒトNME7-AB若しくはヒトNME1二量体 (図で「NM23」)を含む無血清最少基礎培地において培養された。この培地での数日後に、細胞は表面から浮かび始め、溶液中で成長し続けた。「浮遊物」が集められそしてPCRによって別々に分析された。他のウェルの細胞はロー・キナーゼ阻害剤で処理された(図のRi)。量的PCR測定は、癌幹細胞マーカーの増加を示し、それらのうちのいくらかは幹細胞マーカーだけと見なされるように使用された。
第三者が、「2i」(SilvaJ et al 2008)および「5i」(トイニッセンTWら、2014) (TheunissenTW et al 2014)と呼ばれる阻害剤が、ナイーブ状態に幹細胞を維持することができると報告した。本発明者等は、さらに、それらが癌幹細胞か転移性の状態へ癌細胞を形質転換することができるだろうと推論した。本発明者等の実験は、これがそうであることを実証した。7-10日間のヒト組み換えNME7-ABでの癌細胞の処置は、癌幹細胞のマーカーの発現を劇的に増加させた。同様に、NME1二量体、バクテリアNME1二量体又は「2i」阻害剤若しくは「5i」阻害剤での処置での培養は、癌細胞を癌幹細胞に形質転換した。2iは、MAPキナーゼ経路の阻害剤、およびPD0325901とCHIR99021のようなGSK3阻害剤を指す。転移レセプターCXCR4の発現は、ある場合に、E-カドヘリン、Oct4およびNanogのような癌幹細胞の他のマーカーであるように、大幅に増加された。ヒトNME7-ABで培養された癌細胞は、ほとんど200倍までCXCR4の発現を増加させた。さらに、癌細胞の形態は、NME1二量体、NME7、バクテリアNME1二量体あるいはヒトプライムド幹細胞をナイーブ状態へ戻す阻害剤への暴露の後に変更した。NMEは、それが通常表面から離れ、懸濁状態で成長する細胞を処理した。分析は、付着しているままだった細胞は、癌幹細胞のマーカーの発現の増加のより少ない数量を持っていたことを示した。
1つの実験では、MUC1陽性のT47D乳癌細胞は、通常のRPMI成長培地あるいはヒトNME7-ABが単一の成長因子として加えられた無血清最少培地のいずれかにおいて培養された。それらの細胞の一部は非付着になり、表面から浮かび、集められ、そこで、「+ Ri」は培地に加えられ、全ての細胞が表面に付着したままのロー・キナーゼ阻害剤を指し、生着及び非付着の平均値を与えた。図6は、報告によると、得られた細胞において、いくつかの癌幹細胞あるいは転移性の癌細胞で過剰発現していた、遺伝子パネル発現のRT-PCR測定グラフを示す。グラフ中で示されるように、転移性のレセプターCXCR4の発現は、正常な成長培地で培養されたT47D細胞の発現レベルのほゞ200倍である。E-カドヘリンと呼ばれるCDH1およびMUC1、それは両方とも癌の進行に関与する、の両方ともおよそ10倍まで上昇した(Hugo HJ et al 2011)。癌細胞のマーカーであることが報告された幹細胞マーカーも上昇した。OCT4とSOX2は、およそ50倍および200倍それぞれ増加した。NANOG、KLF2、KLF4およびTBX3のような他の幹細胞マーカーは、発現において適度の増加を示した。NME7のように、NM23と呼ばれるNME1二量体は、全面的に幹細胞成長をサポートすることができ、ナイーブ状態に幹細胞を維持することができる。ここで、本発明者等は、NME1二量体がまた癌細胞をより転移性の、癌幹細胞状態に形質転換することを示した。図7は、通常のRPMI成長培地あるいは単一の成長因子としてNME1と呼ばれるヒトの組み換えのNM23、二量体あるいはNME7-ABを添加された無血清最少培地のいずれかにおいて培養されたT47D乳癌細胞のRT-PCR測定のグラフを示す。「浮遊物」は、付着していない細胞をさし、集められた。そこで「+ Ri」は、それらを表面に付着させるためにある細胞に加えられたロー・キナーゼ阻害剤を指す。グラフで見ることができるように、NME1二量体あるいはNME7-ABで培養された癌細胞は、CXCR4、SOX2およびOCT4の発現の劇的な増加があり、E-カドヘリンとも呼ばれるCDH1、MUC1、及びNANOGの発現の増加もたらした。幹細胞マーカーKLF2およびKLF4の発現については適度の増加があった。
同様に、バクテリアHSP593は、二量体を形成しそして分化を阻害する間に全面的に幹細胞成長をサポートすることができるNME1を発現する。さらに、それはナイーブ状態にナイーブ幹細胞を維持することができる。本発明者等は、また、バクテリアNME1が、癌幹細胞状態へ癌細胞を形質転換することを示した（図8）。T47D、MUC1陽性乳癌細胞、に加えられた組み換えHSP593バクテリアNME1は、また細胞の形態的変化を引き起こし、さらに細胞を非付着にした。図8は、CXCR4、NANOGおよびOCT4の発現の劇的な増加を示すRT-PCR測定のグラフを示し、そしてSOX2のよりより少ない増加およびE-カドヘリン呼ばれるCDH1の5倍増加を後におこした。ある場合には、CXCR4レセプターの高い発現をもつ癌幹細胞の成長が、そのリガンドCXCL12(EpsteinRJ et al 2004, Muller, A et al 2001)を培地に加えることにより増加された。
他者は、キナーゼ阻害剤が、幹細胞をプライムド状態からナイーブ状態へ戻すができ、ナイーブ状態にそれらを維持することができた、と以前に報告した。2i阻害剤、それらはMAPキナーゼ・シグナル経路のGSK3ベータおよびMEKの低分子阻害剤である、はマウスプライムド幹細胞をナイーブ状態に戻すことが報告された(Silva J et al, 2008)。本発明者等は、これらの阻害剤がまた癌幹細胞状態へヒト癌細胞を戻すかどうかを検討した。そして、本発明者等は、2i阻害剤が、癌細胞を癌幹細胞あるいはより転移性状態に形質転換されることを、引き起こすことを見出した。本発明は、プライムド状態にあるヒト幹細胞をより少ない成熟のナイーブ状態にヒト幹細胞を戻らせる遺伝子、タンパク質、核酸あるいは化学物質のどんなコンビネーションも、しばしば癌幹細胞か癌始原細胞と呼ばれる、より転移性の状態に癌細胞を形質転換するためにも使用することができる。
本発明者等は、これらの「2i」阻害剤が、また癌細胞を転移性の状態のマーカーを表示する癌幹細胞状態へ形質転換することを本発明によって見出した。図9は、T47D乳癌細胞に加えられた2iが、他の幹細胞と癌幹細胞マーカーと同様に転移性レセプターCXCR4の発現を増加させたことを示す。2iとNM23二量体あるいは2iプラスNME7-ABのコンビネーションは、これらのマーカーの発現を増加させた。しかしながら、図10は、NME7-ABだけが癌幹細胞マーカーのさらに高い発現レベルを備えた癌細胞を生成することを示した。
NME1、NME6二量体、NME7、2iあるいは5iのような作用薬で処理された時、多くのタイプの癌細胞は、より転移性の状態へ遷移をうける。それは、プライムド状態からより少ない成熟したナイーブ状態に幹細胞を戻すができる。1つの例で、一般的な癌成長培地若しくはこれら作用薬の一つを添加された無血清培地において培養されたDU145前立腺癌細胞は、幹細胞、癌幹細胞における発現において増加を示し、およびE-カドヘリンと呼ばれるCDH1を含む転移性マーカーが、転移性の前立腺癌でしばしば上昇する。前立腺癌細胞も、上述のように、ヒトNME1二量体、バクテリアNME1二量体、NME7-ABあるいは2i阻害剤で培養された。T47D細胞と異なり、前立腺癌細胞は非付着にならなかった。したがって、癌幹細胞マーカーのRT-PCR測定はT47D細胞のそれより低く、それは形質転換細胞および非形質転換細胞の測定であることによってそれを説明することができうる。乳癌細胞の場合には、本発明者等が浮遊性の細胞を集めることにより完全に形質転換された癌幹細胞を分離することができたが、ここではそうすることができなかった。DU145 MUC1-陽性前立腺癌細胞がコントロールとしてRPMI培地および組み換えヒトNME1/NM23二量体、バクテリアのHSP593二量体あるいはヒトNME7-ABが加えられた最少培地中で培養された。図11aは、癌幹細胞マーカーの適度の増加を、10日間のrhNME1二量体あるいはrhNME7-ABでの培養がもたらしたことを示す。OCT4、MUC1およびCDH1/E-カドヘリンにおいて約2-8倍の増加があった。しかしながら、これらの同じ培養条件の下での連続継代で、癌幹細胞マーカーの発現の増加はより明白になった。本発明者等は、連続継代が、浮遊細胞を急速には集めることができなかったので、細胞が形質転換するために、より多くの時間を許してしまったと推論した。図11bは、rhNME7-ABおよびバクテリアのHSP593 NME1二量体あるいはHSP593rhNME1/NM23二量体のいずれかでの9-10回の継代後、各々9倍、8倍および6倍の増加が、しばしば前立腺癌で過剰発現される、CDH1/E-カドヘリンの発現において、あったことを示す。NANOGとOCT4の発現にもさらに著しい増加があった。
PC3 MUC1陰性前立腺癌細胞についても、ナイーブ状態に幹細胞を維持することができる作用薬で培養された時、癌幹細胞に形質転換するそれらの能力に関してテストされた。ヒトNME1二量体、バクテリアNME1二量体あるいはNME7-ABの一と、上述されるように、PC3細胞が培養された。DU145前立腺癌細胞に似て、PC3細胞では非付着にならなかった。したがって、測定は形質転換細胞および非形質転換細胞の平均になるので、癌幹細胞マーカーでのRT-PCR測定はより低いものでありうる。図12aは、rhNME1/NM23二量体、あるいはrhNME7-ABで継代の後の遺伝子サブセットのRT-PCR測定を示す。図12aのグラフは、幹細胞マーカーSOX2、OCT4およびNANOGの発現の適度の増加を示す。培地中での連続継代は、癌幹細胞若しくは幹細胞のマーカーの発現を増加させなかった、もっと正確には、図12bで示されるように、それらは減少した。
他の作用薬は、ナイーブ状態に幹細胞を維持するかあるいはナイーブ状態にプライムド幹細胞を戻すと報告された。染色質再配置ファクターMBD3とCHDは、多分化能の誘導を阻止することが最近報告された(Rais Y et al, 2013)。例えば、染色質再配置ファクターMBD3及びCHD4のsiRNA抑制は、ナイーブ状態へのヒトのプライムド幹細胞を戻すための方法の重要なコンポーネントであることが示された。報告によると、転写因子BRD4およびコファクターJMJD6は、NME7を抑制し、NME1をアップレギュレートする(Lui W et al, 2013)。本発明者等は、それらが後期段階のプライムド幹細胞にあるより、ナイーブ幹細胞においてより低いレベルでこれらのファクターが発現されたことを見出した（図51）。この結果は、NME7がNME1より早く発現された幹細胞成長因子であるという本発明者等の仮説を立証する; というのは、前者はそれ自身ターンオフ若しくはNME1が行うように自己複製を調整することができないからであり；二量体として、それは幹細胞成長を活性化する、しかし、細胞がもっと分泌し、それが六量体を形成する場合、六量体はMUC1*を結合せず、また、分化が引き起こされる。
本発明者等は、これらの4つの遺伝子、MBD3、CHD4、BRD4およびJMJD6は、2i、NME1二量体あるいはNME7において培養された癌細胞中で自然に抑制されることを見出した。図13は、MUC1陽性のT47D乳癌細胞において、染色質再配列ファクターBRD4、JMJD6、MBD3およびCHD4をコードする遺伝子の発現を記録するRT-PCR測定の実験結果のグラフを示し、該細胞は、ノーマルRPMI成長培地あるいは「2i」あるいは組み換えヒトNME7-ABが添加された無血清最小培地で培養され、「浮遊物」細胞が分析された細胞である。図14に示されるように、2iとNME1の二量体あるいはNME7のコンビネーションは、又、BRD4、JMJD6、MBD3およびCHD4を抑制した。
さらに、ナイーブ状態に幹細胞を維持することができる作用薬は、癌若しくは幹様状態への体細胞を形質転換することができる。ヒトNME1二量体あるいはヒトNME7は、幹と癌細胞のマーカーを発現して、体細胞をより少ない成熟した状態に戻らせることができる。HSP 593からのバクテリアNMEが、癌様状態へ体細胞を戻すができることにより、それがそれらの機能を模倣するかどうか判断するために、ヒトの同族体と並べてテストされた。ヒト線維芽細胞が、ただ一つの成長因子若しくはサイトカインとしてHSP 593、ヒトNME1二量体あるいはヒトNME7-ABの一を含む無血清最少基礎培地において培養された。RT-PCR測定は、ヒトNMEのように、バクテリアNME1 HSP 593が体細胞を、19日までに、OCT4-陽性ステージに戻らせたことを示した。幹細胞および転移性癌細胞が、アンカレッジ独立に成長できることを考慮し、本発明者等は実験を繰り返した。しかし、今回は、細胞を表面に付着させるために、ロー・キナーゼ阻害剤が細胞の1セットに加えられた。浮遊性の細胞が表面に付着することを強いられた時、RT-PCRは、幹/癌マーカーOCT4に7倍の増加が、および幹/癌マーカーNanogに12倍の増加と同じくらいの高さに、実際にあったことを示した。実験写真は、ヒトあるいはバクテリアNMEで培養された時、繊維芽細胞が戻るように、形態上の劇的な変化を示す(図52-59)。より少ない成熟した状態へ体細胞を戻す効率の相対的オーダーは、NME7>NME1二量体>NME1、バクテリアであった。ヒトNME1かNME7、あるいはバクテリアNME1で育てられたヒト線維芽細胞のRT-PCR測定は、NMEタンパク質が多分化能の4つのブロッカーBRD4、JMJD6、MBD3およびCHD4すべてを抑制することを示す。RT-PCR実験の合成グラフは、多分化能遺伝子を増加させて、多分化能ブロッカーを減少させる相対的な潜在能力がNME7 >NME1> HSP 593 NMEであることを示す。しかしながら、明らかに、HSP593からのバクテリアNMEは、ヒトNME7およびNME1の発現をアップレギュレートする。図15は、報告によると、ノーマル繊維芽細胞成長培地又はNME1呼ばれるヒトの組み換えNM23、NME7-ABあるいはHSP593バクテリア二量体を添加された無血清最小培地の一つで培養されたいくつかの癌幹細胞若しくは転移性癌細胞、体繊維芽細胞、「fbb」細胞で過剰発現する、遺伝子の発現のRT-PCR測定のグラフを示す。「+ ROCi」は、それらを表面に付着させるためにいくつかの細胞に加えられたロー・キナーゼ阻害剤を指す。「マイナスROCi」は浮遊物を意味していないが、ロー・キナーゼ阻害剤がない状態で付着しているままだった細胞をむしろ意味する。図16は、ノーマル繊維芽細胞成長培地又はNME1呼ばれるヒトの組み換えNM23、NME7-ABあるいはHSP593バクテリア二量体を添加された無血清最小培地の一つで培養された体繊維芽細胞、「fbb」細胞での、染色質再配列ファクターBRD4、JMJD6、MBD3およびCHD4をコードする遺伝子の発現のRT-PCR測定のグラフを示す。「+ ROCi」は、それらを表面に付着させるためにいくつかの細胞に加えられたロー・キナーゼ阻害剤を指す。図17は、ノーマル繊維芽細胞成長培地又はNME1呼ばれるヒトの組み換えNM23、NME7-ABあるいはHSP593バクテリア二量体を添加された無血清最小培地の一つで培養された体繊維芽細胞、「fbb」細胞で、染色質再配列ファクターBRD4、JMJD6、MBD3およびCHD4をコードする遺伝子、報告によると、いくつかの癌幹細胞若しくは転移性の癌細胞で過剰発現する遺伝子、の発現のRT-PCR測定のグラフを示す。「+ ROCi」は、それらを表面に付着させるためにいくつかの細胞に加えられたロー・キナーゼ阻害剤を意味する。「マイナスROCi」は、非付着になり、表面から浮かんだ細胞を意味する。
より転移性癌幹細胞状態へ癌細胞を形質転換する作用薬は、多分化能阻止遺伝子BRD4、JMJD6、MBD3およびCHD4の発現を減少させる。これらの作用薬は、さらに体細胞においてのBRD4、JMJD6、MBD3およびCHD4の発現を減少させた。したがって、NME1二量体、NME7およびバクテリアNME1二量体はより少ない成熟した癌/幹様状態に体細胞を戻らせる。
さらに、ナイーブ状態に幹細胞を維持することができる因子は、癌様か、幹様状態へ細胞を形質転換することができ、さらに、癌幹細胞状態あるいはより転移性の状態へ癌細胞を形質転換することができる。ここに、本発明者等は、ヒトNME1二量体のように機能することができるバクテリアNME1のいくつかの例を示した。それはさらにNME7あるいはNME7-ABのように機能することができる。しかしながら、大変似た方法でこれらの因子が機能する主要な例は、幹細胞の成長を促進し、分化を阻害し、そしてナイーブ状態にそれらを維持するそれらの能力である。本発明者等は、NM23-H1と呼ばれるヒトNME1二量体、バクテリアNME1およびNME7-ABが、胚性幹細胞と誘導多能性幹細胞の成長を促進し、それらの分化を阻害し、そして幹細胞ドナーがヒトならば、活性状態において両方のX染色体を持って、および宿主動物での奇形腫を形成する能力を持っていることにより、グローバルな遺伝子分析によって証拠づけられるようなナイーブ状態に、それらを維持することを実証した。ヒトのHES-3胚性幹細胞が、ただ一つの成長因子若しくはサイトカインとしてHSP 593、ヒトNME1あるいはNME7二量体あるいはヒトNME7-ABの一を備えた無血清最小基礎培地において培養された。ちょうどヒトNME1およびNME7が全面的にヒト幹細胞成長をサポートしたように、HSP 593からのバクテリアNMEもサポートした。図18は、組み換えヒトNME1二量体で連続的に培養された多能性のヒト胚性幹細胞の写真を示す。図19は、組み換えヒトNME7-ABで10以上の継代培養された多能性のヒト胚性幹細胞の写真を示す。図20は、組み換えバクテリアNME1で10以上の継代培養された多能性のヒト胚性幹細胞の写真を示す。
ここで示されたいくつかの実施例は、幹細胞をプライムド状態からより少ない成熟のナイーブ状態へ戻すことのできる作用薬または複数の作用薬と細胞のコンタクトは、また多様な細胞タイプをより少ない成熟した状態へ戻すことができることを示し、体細胞を幹若しくは先祖細胞又は癌細胞をいわゆる癌幹細胞状態とも呼ばれるより転移性の状態へである。したがって、本発明は、特定の細胞型あるいは特定の癌細胞タイプに限定される意図はない。同様に、プライムド状態からナイーブ状態へ幹細胞を戻すことが示された、ここに開示の作用薬のサブセットの使用に本発明が限定されることは意図していない。
癌、特に転移性癌を処置のための作用薬の同定若しくは試験のための方法は、次の工程を含む:
1) ナイーブ状態に幹細胞を維持することができる物質（エンティティ）と癌細胞をコンタクトさせること;
2) 作用薬と癌細胞をコンタクトさせること;
3) 作用薬の癌細胞の成長若しくは転移性能を阻害する能力を評価すること;
4) 癌細胞の成長若しくは転移性能を阻害する作用薬は、癌患者を治療するのに適当であると決定すること; そして
5）決定された作用薬を該患者に投与すること。
癌細胞の転移性能の阻害は、CXCR4、E-カドヘリン、MUC1、NME1、NME7あるいは幹細胞マーカーOCT4、SOX2、NANOG、KLF2あるいはKLF4の発現における減少、あるいはMBD3、CHD4、BRD4あるいはJMJD6の発現の増加によって示される。
あるいは、ナイーブ状態に幹細胞を維持することができる作用薬の存在下で培養された細胞は、その後、試験動物へ移植される。ナイーブ状態に幹細胞を維持する作用薬の存在下で培養された癌細胞は、癌幹細胞及びより転移性になるので、それらは、試験動物への非常に少ない数で植え付けすることができる。その後、薬剤および薬剤候補は、効能、毒性若しくは投与計画に関して、この方法で調製された癌幹細胞で移植された動物によってテストすることができる。
1つの実験では、T47D乳癌細胞は、7日間、ヒト組み換えNME7-ABで培養された。浮遊性の細胞が集められ、癌幹細胞に関連した遺伝子の発現の増加を示したRT-PCRによって分析された。特に、転移性レセプターCXCR4の発現、それは転移性能のキー指標である、は親細胞より130倍高かった。これらの細胞は、免疫欠損nu/nu、雌マウスに植え付けられた。植え付けされた細胞の数は50、100、1,000あるいは10,000であった。腫瘍生着を得るのに4,000,000〜6,000,000の細胞が通常要求されるのに対し、腫瘍展開数か月のようなまさに低成長率であるとはいえ、わずか100の癌幹細胞が免疫許容マウスで腫瘍を生じさせた。
さらに、マウスの半分は、組み換えヒトNME7-ABを毎日注入された。腫瘍生着は50個の細胞だけが植え付けされたグループでさえ達成された。驚いたことに、NME7を毎日注入されたグループは、生着の割合を増加させ、そのグループの動物のいくつかではさらに多発性腫瘍を形成した。すなわち、NME7を毎日注入されたグループの癌は約50日の後に転移し、最初の生着サイトから遠隔のサイトで多発性腫瘍を生じさせた。特にこの実験では、NME7誘導癌幹細胞が植え付けされた24匹のマウスの67%が、腫瘍を生じさせた。しかしながら、データをより詳細に見ると、循環NME7持たないマウスの50%のみが癌を形成し、その一方でNME7の毎日の投与を受けたマウスの83%が腫瘍を形成した。腫瘍を形成したその83%のうち80%は、ほぼ実験50日までに多発性腫瘍を持っていたとともに、癌転移をおこしていた。図21は、NME7、NME7-ABの組み換え型を含んでいる培地中で培養された癌細胞の生着63日後に測定された腫瘍容積のグラフである。各データポイントに並んぶ数字は、それぞれマウス・トラッキング番号を指し、また、「M」は動物が多発性腫瘍をもつことを示す。図22は、転移性癌をもつ1つのマウスでのすべての腫瘍の体積が、ともに加えられた腫瘍体積の総合計のグラフである。図23- 46は、腫瘍成長の進行を示す経過日28および経過日58での各マウスの写真を示し、そして、マウスがNME7-ABを毎日注入されたほとんどの場合、転移の進行を示している。図23-46では、暗い矢は最初の癌細胞の注射部位を指す。また、明るい矢は、経過日28と経過日63の間に展開した遠隔転移を指す。
一般に、NME1二量体、NME7-AB、2i、5iおよびその他同種のもののようなナイーブ状態に幹細胞を戻らせる作用薬を動物にそれ自身を注入する必要はない。代替アプローチでは、作用薬は注射、吸着あるいは食物摂取によって動物に投与することができる。
したがって、癌幹細胞へ癌細胞を形質転換する方法は、NME1二量体、NME7、バクテリアNME1二量体あるいはプライムド幹細胞をナイーブ状態に戻らせる阻害剤で、癌細胞を培養することである。好ましい態様では、プライムド幹細胞をナイーブ状態に戻らせる作用薬は、2i阻害剤あるいは5i阻害剤である。好ましい態様では、NME7はヒトNME7である。もっと好ましい態様では、NME7はNME7-ABである。癌の治療のため、あるいは、癌、特に転移性の癌の進行を阻害するための、薬剤および薬剤候補は、これらの癌幹細胞上でテストされる。さらに、これらの方法によって生成された癌幹細胞は、転移性の癌細胞の未知マーカーを同定するために分析することができ、それは抗癌剤の新しい標的になる。
したがって、癌の治療のための、又は転移の予防、又は転移の抑制のための化合物、生物学的製剤あるいは薬剤を評価する方法は、次のものを含む:
１）ヒト若しくはバクテリアでありうるＮＭＥ１二量体、NME7あるいはその断片あるいはNME7-AB、2i阻害剤あるいは5i阻害剤を含む培地中で、癌細胞を培養することによる癌細胞のより転移性の癌細胞へ形質転換をさせること;
２）該細胞を生体外で試験薬と接触させる、又は動物に該細胞を植え付け、そして試験薬で該動物を処置すること;
３）腫瘍成長または転移性に関する試験薬の効果を評価すること;
４）腫瘍成長あるいはリモートサイトへの転移を阻害する試験薬が、癌と診断された患者、再発癌若しくは転移性の癌をもつ患者、又は癌発症のリスクを持つ患者の処置に適した薬剤であると結論すること。
好ましい態様では、試験動物はNMEタンパク質、2iあるいは5iを注入されるか、あるいはヒトNMEかヒトNME7、あるいはNME7-ABを発現するトランスジェニック動物である。あるいは、動物は、2iまたは5iによって阻害されたキナーゼが抑制される、あるいは、キナーゼを抑制する作用薬が試験動物に投与されるトランスジェニック動物である。
「マウスでの癌転移」
上述で説明されたように、癌細胞の低い数で、動物での腫瘍を開始することができ、あるいは、NME7-ABを注入された動物で癌細胞は転移した。しかしながら、同じ結果は、ヒトNME7あるいはNME7-ABを発現するトランスジェニック動物の生成により容易に遂行される。本発明の1つの態様では、動物はげっ歯動物である。
ヒトNME7、ヒトNME1若しくは二量体化を志向する突然変異体、バクテリアNME、ヒトMUC1あるいはMUC1*を発現するトランスジェニックマウスは、生体内で癌細胞を成長させるために、また抗癌ワクチンの材料としてのNME由来ペプチドの免疫効果のテストのために、またヒトの心臓組織などを担持するマウスのような動物を作り出すためにその分化においてヒト幹細胞の成長をサポートできる動物の作成のために、創薬において大きく役に立つだろう。ネズミ科のNMEタンパク質は、ヒト癌成長、およびヒト幹細胞成長に必要であるヒトNMEタンパク質と著しく異なる。したがって、正常なマウスは、ヒト癌細胞かヒト幹細胞の成長をサポートするために必要なタンパク質を生産していない。自然に腫瘍を形成するか、テストされている薬剤へのヒトでのように反応するあるいはそれがよりよくヒト腫瘍生着を可能にするマウスあるいは他の哺乳動物は価値がある。したがって、ヒト癌細胞かヒト幹細胞の成長をよりよくサポートするトランスジェニック動物は、動物にヒトNME遺伝子を発現させることにより作成される。好ましい態様では、ヒトNME遺伝子はヒトNME7である。もっと好ましい態様では、ヒトNME遺伝子はヒトNME7-ABである。トランスジェニック動物は多くの方法を使用して作成される。一般に、外来遺伝子は宿主動物の生殖細胞へ移入される。トランスジーンは宿主動物のゲノムへ統合することができる。トランスジーン統合のための方法のうちのいくつかはサイト特異的統合を可能にする。サイト特異的な統合のいくつかの方法の利点のうちの1つは、宿主動物での自然発生の遺伝子の発現によってトランスジーンの発現がコントロールされることをそれらが可能にするということである。トランスジェニック動物を作成する方法は、当業者に知られている。そのような方法は、ノックイン、ノックアウト、CRISPR、TALENSおよびその他同種のものを含んでいる。本発明は、哺乳動物に、ヒトNME1、バクテリアNME1、NME7あるいはNME7-ABを発現させるいずれの方法も使用すること意図する。
好ましい態様では、ヒトNME7あるいはNME7-ABを発現するトランスジェニック動物が作成される。NME1（ヒトあるいはバクテリア）又はNME7は、幹細胞の分化を阻害するので、NMEタンパク質、好適にはNME7あるいはNME7抗体のトランスジェニック動物での発現のタイミングをコントロールすることができる技術を使用することは有利である。例えば、動物の分化の間にNME7発現の潜在的な問題を回避するために誘導可能なプロモータの上にヒトNME7を持つことは有利である。外来遺伝子の発現を宿主動物において誘導可能にする方法は、当業者に知られている。当該技術で知られているトランスジーンの発現をコントロールする多くの方法のうちのいずれか1つを使用して、NME7あるいはNME7-ABの発現は誘導可能になりえる。
あるいは、NME7の発現若しくは発現のタイミングは、哺乳動物によって当然に発現する別の遺伝子の発現によってコントロールされることができる。例えば、それは、心臓のようなある組織で発現されることがNME7若しくはNME7バリアントにとって望ましいものでありうる。例えば、NME7の遺伝子が、MHCのような心臓で発現されるタンパク質の発現に操作可能にリンクされる。この実例では、MHC遺伝子産物が発現される場合および場所で、NME7の発現がターンオフされる。同様に、人は、その発現の位置およびタイミングが、例えば前立腺特異的タンパク質の発現によって、コントロールされるように、ヒトNME1、NME6あるいはNME7の発現を、前立腺でターンオン若しくはオフすることを所望するかもしれない。同様に、非ヒト哺乳動物でのヒトNME6あるいはNME7の発現は、乳腺組織で発現した遺伝子によってコントロールすることができる。例えば、トランスジェニックマウスで、ヒトNME6あるいはヒトNME7はプロラクチン・プロモーター、あるいは類似遺伝子から発現される。このように、サイト特異的なやり方でヒトNMEタンパク質の発現を誘導する若しくは抑制することが可能である。
ヒト腫瘍で異種植え付けされ、さらにヒトNME7を注入された動物は、転移性癌になった。したがって、癌転移を展開させるための動物モデルは、ヒトNME7あるいはより好ましくはNME7-ABを発現するトランスジェニック動物を作ることにより、調製される。最良には、NME7は、動物が正確に分化することを可能にする誘導性プロモータ上にある。あるいは、転移性の動物モデル、好適にはげっ歯動物は、ヒトNMEかヒトNME7あるいはNME7-ABを発現するトランスジェニック動物を作ることにより調製される。あるいは、動物は、2iまたは5iによって抑制されたキナーゼが誘導可能なプロモータによって抑制されるか、キナーゼを抑制する作用薬が試験動物に投与されるトランスジェニック動物である。その結果、転移性の動物モデルは、癌の進行における化合物、生物学的製剤、薬剤などの効果をテストするのと同様に、癌の分化若しくは進行の基礎科学を研究するために使用される。
したがって、癌、特に転移性癌を処置する、作用薬の同定および選択のための方法は、次のステップで構成される:
1) NMEまたはNME7の型を発現するトランスジェニック動物を生成する;
2) ヒト癌細胞を該動物に植え付ける;
3) 癌または転移性癌の治療のために候補薬で動物を処置する;
4) 癌のサイズ若しくは広がりについて、候補薬の効果を評価する;及び
5) 試験動物での癌の成長若しくは広がりを阻害する候補薬がヒトでの癌若しくは転移性癌の治療に適していると結論を下す。
「候補薬に対する反応性についてテストするために、患者癌細胞が増殖する期間を延長することによる個別化された創薬」
ほぼ全ての前臨床薬剤検査と薬剤選別は、わずかに確立している癌細胞株を使用して行われる。それらの細胞株は、数十年前に生きそして死んだものであり、そして、何百万もの世代を通じて広められた患者の腫瘍に由来し、その結果、得られたテスト細胞は、ドナーのオリジナルの癌との類似点を担持しておらず、ましてや新しい患者の癌との類似点をほとんどあるいはまったく担持していない。したがって、処置される患者の細胞を試験細胞として使い、薬剤を選別し、投与を確立できることは大きな有益性を提供する。残念ながら、不可能でないとしても、ディッシュで患者由来の癌細胞を育てるのは困難であり、動物で患者細胞をふやすことはさらに困難である。これは、ヒト細胞がマウス細胞と異なり、それが老化する前に、非常に限られた回数だけしか培養によってに分割できないからである。研究者が今日使用する癌細胞株は、単一の転移性癌患者の胸水から分離された天然不死化癌細胞か、不死化細胞株に融合することにより、あるいは不死化遺伝子を備えた癌細胞をトランスフェクトすることにより不死になるように誘導された癌細胞である。後者の方法は、著しくオリジナルの細胞か原発性癌細胞の分子的特性を変更する。
特別の患者からの癌細胞を増やすのに役立つ方法は、癌細胞を癌幹細胞に形質転換する方法を使用して、細胞を培養することである。別の方法は、ナイーブ状態にプライムド幹細胞を戻すために使用される試薬および方法を使用して、患者細胞を培養することである。得られた癌幹細胞は、より元気で、より長く生き、より長い間増殖する。上記のセクションで述べられているように、患者癌細胞は、ヒト若しくはバクテリアのNME1二量体、NME7あるいはその断片あるいはNME7-AB、2i阻害剤あるいは5i阻害剤で、培養することで、増殖されうる。得られた癌細胞は2つの画分に分割する：表面に付着するもの、および表面から浮かぶもの。付着細胞は、非常によく、オリジナルの腫瘍細胞に似ており、一方、フロートするものは癌幹細胞であり及び患者が将来展開するかもしれない若しくは化学療法薬での処理への反応において展開するかもしれない転移性癌細胞のように見える。そして、これらの患者細胞は、癌細胞の癌幹細胞の生存によっておこされる転移性状態への進展を阻害するだろう薬剤の同定と同様に、特別な患者癌を有効に阻害する薬剤及び候補薬剤を同定及び選択するために使用される。本発明の別の態様では、この方法で増殖された患者の癌細胞が、特別な患者癌を有効に阻害するだろう複数薬剤の最適組合せを決定のために使用され、又は単一薬剤若しくは複数薬剤の投与量を確立するために使用される。
「薬物検査用のために、生着用に必要された細胞の少量による、多数の動物へ患者癌細胞を移植することによる個別化された創薬」
ヒトあるいはバクテリアでありうるNME1二量体、NME7あるいはその断片、あるいはNME7-AB、2i阻害剤あるいは5i阻害剤で培養された癌細胞は、移植された極少量の細胞で、実験動物における腫瘍を開始できるということに留意がいる。何百万ではなく、わずか50あるいは100の細胞を1つのマウス当たりに必要とするので、これらの方法を使用して培養された患者癌細胞は、そのとき多数の試験動物での腫瘍を形成することができる。その後、腫瘍を開始するのに必要な細胞の減少は、患者癌細胞の試験動物への移植を可能にし、そのいくらかは、ヒトあるいはバクテリアでありうるNME1二量体、NME7あるいはその断片、あるいはNME7-AB、2i阻害剤あるいは5i阻害剤を注入することができ、又は、例えば動物がヒトNME7あるいはNME7-ABを発現する、上述されるようなトランスジェニック動物でありうる。
1つの態様では、宿主動物は候補薬あるいは化合物を注入され、そして、効能が候補薬若しくは化合物を用いた治療に対する反応を予知するために評価される。別の実例では、患者に投与されているか、患者の治療のために考慮されている第一選択治療あるいは薬剤が、より少ない成熟した状態に戻されている患者癌細胞を担持する動物に投与される。癌細胞が第一選択治療を回避するために適合するどのような突然変異をとるのかが、第一選択治療にほぼ影響する。その後、得られた癌細胞は宿主動物から取り除くことができ、ある治療に応じて生じる突然変異を同定するために分析及び特徴付けをなしうる。あるいは、癌細胞は宿主動物に残すことができ、該宿主細胞は、耐性細胞若しくは癌幹細胞を阻害若しくは殺す薬剤を決定するために他の治療剤で処理されうる。
かくして、患者癌の成長若しくは拡大を阻害する適切な治療方法を同定するための本発明の方法は、次のステップを含む:
1) 患者から癌細胞を得ること;
2) ヒト若しくはバクテリアでありうるNME1二量体、NME7あるいはその断片、NME7-AB、2i阻害剤あるいは5i阻害剤の存在下で患者癌細胞を培養すること;
3) 癌または転移の抑制のために該細胞を試験薬と接触させること;
4) 患者の癌細胞での化合物、生物学的製剤あるいは薬剤の、効能、毒性あるいは投与量を評価する、又は細胞によって発現される癌幹細胞マーカーのレベルで試験薬の効果を評価すること;そして
5) 癌細胞の生存能力を減少させる又は癌幹細胞マーカーとして既知の遺伝子の発現を減少させる試験薬が該患者の最適治療であると決定する。
患者の癌の成長若しくは拡大を阻害する適切な治療方法を同定する本発明の別の方法は、次のステップを含む:
1) 患者から癌細胞を得ること;
2) ヒト若しくはバクテリアでありうるNME1二量体、NME7あるいはその断片、NME7-AB、2i阻害剤あるいは5i阻害剤の存在下で患者癌細胞を培養すること;
3) ヒト若しくはバクテリアでありうるNME1二量体、NME7あるいはその断片、NME7-AB、2i阻害剤あるいは5i阻害剤をまた注入できる試験動物に、又はNMEタンパク質、NME7、NME7-ABを発現する、あるいは2iまたは5iの標的の発現を抑制するトランスジェニック動物である試験動物に、該細胞を移植すること；
4) 試験動物に、癌または転移の抑制のための試験薬を投与すること;
5) 動物における患者の癌細胞の増殖能、腫瘍サイズ、又は転移展開に関し、化合物、生物学的製剤あるいは薬剤の、効能、毒性あるいは投与量を評価すること;そして
6) 生着率、腫瘍成長率、若しくは転移展開性を減少させる試験薬剤が、患者にふさわしい治療剤であると決定する。
あるいは、患者癌細胞を増殖若しくは移植可能にする上述された方法は、ドナー以外の患者のために使用されてもよい。本発明の方法によって増殖若しくは移植された患者癌細胞は、より正確に自然発生の癌に似ており、したがって、不死化遺伝子でトランスフェクトすることにより人為的に不死になった今日つかわれる標準癌細胞株に置き換わることができる。特に、幹細胞マーカー、癌幹細胞マーカーあるいはCXCR4を高いレベルで発現する、NME1二量体、NME7、NME7-AB、2i阻害剤あるいは5i阻害剤で培養された癌細胞は、試験管で、生体外で、若しくは生体内で、転移性癌を処置するための薬剤の発見、試験及び選択に使用することができる。
「ヒト組織を発現する動物の生成」
他の適用においては、ヒトNME1、バクテリアNME1あるいはヒトNME7、好適にはNME7-ABのための遺伝子組み換え動物が、幹細胞若しくは始原細胞でありうるヒト細胞を植え付けされる若しくは生着されることを意図する。例えば、あるケースでは、心臓、肝臓、皮膚あるいは他の器官でヒト組織を成長させる、例えばマウスのような、動物を作り出すことが所望される。そうする1つの方法は、ヒトNME7かヒトNME7-ABを発現するために作られた動物へヒト幹細胞を植え付けすることにより、一種のキメラ動物を作り出すことである。ヒト幹細胞あるいは始原細胞は、分化の胚盤胞、胚あるいは胎児期で、試験管及び生体内を含めて、動物の分化の様々な時期で植え付けできる。NME7は分化を阻害するので、NME7あるいはNME7 ABトランスジーンは、その発現のタイミングが制御可能な方法にリンクされる。分化または成熟を生じさせることが望ましい位置若しくは時に、ヒトNME7かNME7-ABの発現が、ターンオフ若しくは減少するような、使用可能な方法は、当業者に既知である。好適にはNME7を誘導可能か抑制可能であるトランスジーンを作る一つの方法は、生育において後にのみ発現する遺伝子の発現にその発現若しくは抑制をリンクさせることである。そのような場合、人は、NME7あるいはNME7-ABの発現が心臓あるいは心臓始原細胞で発現した後期遺伝子の発現にリンクされるトランスジェニック動物を作りうる。したがって、NME7の発現若しくは発現のタイミングは、哺乳動物によって当然に発現する別の遺伝子の発現によってコントロールされる。例えば、それは、心臓のようなある組織で発現されることが、NME7若しくはNME7バリアントには望ましい。その後、NME7の遺伝子は、MHCのような心臓で発現されたタンパク質の発現に操作可能にリンクされる。この実例では、MHC遺伝子産物が発現される時及び場合に、NME7の発現は減少されるかターンオフされる。同様に、人は、その発現の位置およびタイミングが、例えば、前立腺の特異的タンパク質の発現によってコントロールされるように、前立腺において、ヒトNME1、NME6あるいはNME7の発現をターンオンさせることを所望できる。同様に、非ヒト哺乳動物でヒトNME1あるいはNME7の発現が、乳腺組織で発現した遺伝子によってコントロールすることができる。例えば、トランスジェニックマウスで、ヒトNME1あるいはヒトNME7が、プロラクチン・プロモーターあるいは類似遺伝子によって発現若しくは抑制することができる。
この方法で、ヒトNME7あるいはNME7-ABのための遺伝子組み換え動物は、あるポイントで成長することを許し、そして、ヒト幹あるいは始原細胞が植え付けられ、そこでは、それらがヒトNMEタンパク質とのコンタクトに基づき成長する。その後、ヒトNMEの発現は、該動物の特定の器官あるいは器官の一部が、ヒト組織として成長するようにターンオフされる。
本発明は、ヒトNME1、バクテリアNME1あるいはヒトNME7あるいはNME7-ABのための遺伝子組み換え動物の多くの応用を対象とする。本発明の1つの態様では、ヒトの幹若しくは始原細胞が、NMEトランスジェニック動物あるいはトランスジェニック動物になるものの生殖細胞に植え付けされる。NMEの発現は、誘導可能若しくは抑制可能でありうる。幹若しくは始原細胞の移植のサイトおよびタイミングによって、得られる動物はヒトの心臓、肝臓、ニューロン細胞あるいは皮膚を発現するために作ることができる。
したがって、ヒト組織が、遺伝子組み換え非ヒト哺乳動物で形成され、そこでは該哺乳動物は、生殖細胞若しくは体細胞で、ヒトMUC1、MUC1*、あるいは NMEタンパク質を発現し、そこでは生殖細胞または体細胞は、該哺乳動物へ導入された組み換えヒトMUC1、MUC1*あるいはNME遺伝子配列を含んでおり、そこでは、該遺伝子配列の発現が、外部組成物の導入によって、あるいはその発現若しくは抑制を、宿主動物の自然発生の遺伝子の発現若しくは抑制にリンクさせることによって、誘導若しくは抑制をすることができる。非ヒト哺乳動物に対する起源において異種の個体の幹細胞あるいは始原細胞は，遺伝子が、該幹細胞あるいは始原細胞を増殖するために発現されるべく誘導され、その結果、異種植え付けされた幹細胞からの組織を生成するために形質発現を抑制するように、トランスジェニック動物に移植される。トランスジーンの抑制が実行される1つの方法は、組織分化因子と、幹細胞あるいは始原細胞をコンタクトさせることによる。トランスジーン抑制は、また、自然に生産された宿主組織分化因子に反応して哺乳動物で自然に実行される。
これらの動物は創薬に使用可能である。さらに、それらは毒性試験に使用することができ、ヒト組織において、あるいはヒト組織の成長において、化合物、生物学的製剤、及び薬剤の効果を決定するために動物を使うことができる。あるいは、ヒトの幹若しくは始原細胞が植え付けされたトランスジェニック動物は、ヒト患者への移植のためのヒト組織を育てるために使用される。ある場合には、植え付けされる幹若しくは始原細胞は、トランスジェニック動物から得られたヒト組織の受容体になる患者由来である。
1つの態様では、移植された幹若しくは始原細胞の量が十分に多くなるまで、MUC1、MUC1*あるいはNMEタンパク質の発現は誘導されうる。その後、MUC1、MUC1*あるいはNMEタンパク質の発現は、MUC1、MUC1*あるいはNMEタンパク質の発現を抑制する物質を宿主哺乳動物に注入することによりシャット・ダウンされうる。幹若しくは始原細胞の個体群は、特別の組織か器官タイプのための分化誘導因子のマウスでの発現によるように、自然な方法によって分化するように誘導でき、あるいは化学若しくは蛋白質が所望のタイプに分化をもたらすために幹若しくは始原細胞転移のサイトで宿主に注入されることができる。
内胚葉細胞組織のための、誘導、分化/形質転換剤は、限定ではなく、次の細胞型：肝臓、肺、膵臓、甲状腺および腸細胞、のために、次の作用薬：肝細胞成長因子、オンコスタチン-M、表皮成長因子、繊維芽細胞成長因子-4、塩基性線維芽細胞成長因子、インシュリン、トランスフェリン、セレノウス酸、BSA、リノール酸、アスコビル酸2-リン酸塩、VEGF及びデキサメサゾン、を含む。
中胚葉組織のための 、誘導、分化/形質転換剤は、限定ではなく、次の細胞型：軟骨、硬骨、脂肪、筋肉、及び血液細胞、のために、次の作用薬：インシュリン、トランスフェリン、セレノウス酸、BSA、リノール酸、TGF-β1、TGF-β3、アスコビル酸2-リン酸塩、デキサメサゾン、β-グリセロリン酸、BMP及びインドメタシン、を含む。
外胚葉組織のための、誘導、分化/形質転換剤は、限定ではなく、次の細胞型：神経、皮膚、脳および眼細胞、のために、次の作用薬：ジブチリル・サイクリンAMP、イソブチルメチルキサンチン、ヒト表皮成長因子、塩基性線維芽細胞成長因子、繊維芽細胞成長因子-8、脳由来神経栄養因子および／または他の神経栄養成長因子、を含む。
「ワクチンの発見および試験用のNMEタンパク質のための遺伝子組み換え動物」
ヒトNME、特にNME7-AB、を発現するトランスジェニック動物は、免疫化のためのペプチドがNME1、バクテリアNMEおよびNME7を含むNMEタンパク質に対する抗体の生成に安全に使用することができるか評価するのに役立つ。例えば、ヒトNME1、NME7あるいはNME7-ABのための遺伝子組み換えマウスは、図61~63、ペプチドNo.1-53のように記述された、免疫化のためのペプチドの1つ以上で免疫することができる。コントロール群マウスは、抗NME抗体が生産されることを保証するために分析される。その後、ヒト腫瘍細胞はトランスジェニックマウスへ植え付けされ、そこでは誘導可能なプロモータを使用する場合、宿主動物でのヒトNMEタンパク質の発現が誘導される。その後、免疫化のためのペプチドの効能および潜在的な毒性は、誘導可能なNMEプロモータがターンオンされなかったコントロール・マウスと比較され、トランスジェニックマウスに移植された細胞の腫瘍生着、腫瘍成長率及び腫瘍開始潜在性を比較することにより評価される。毒性は、骨髄細胞へ細胞毒性をもつ作用薬での処置に応じて、全体の骨髄細胞数、循環血球の数とタイプおよび骨髄細胞の再生への反応時間を決定することに加えて、心臓、肝臓およびその他同種のもののような器官の検査により評価される。耐えうる副作用で、腫瘍生着、腫瘍成長率、あるいは腫瘍開始潜在性を有意に減ずる、図61-63、ペプチドNo.1-53にリストされたものに由来する免疫化のためのペプチドは、患者の外側で若しくは人で、抗癌治療、予防若しくはワクチンとして、抗体の生成のための免疫化のためのペプチドとして選択される。
「NMEタンパク質のレギュレーターあるいはNMEタンパク質の下流エフェクターはNMEタンパク質の代わりになることができる」
これらの研究は、NMEタンパク質が、幹様若しくは癌様の成長を促進するように機能する1つの方法は、主にPSMGFR配列からなる、MUC1*と呼ばれた、MUC1膜貫通型タンパク質の短縮型への結合によることが示された。MUC1*細胞外ドメインの二量体化は、体細胞、幹細胞および癌細胞、それらをより転移性にする成長および脱分化を刺激する。
NMEタンパク質がそれらの効果を及ぼす別の方法は、それらが他の遺伝子を刺激するか抑制するために直接あるいは間接的に機能するところの核に移送されることによる。OCT4とSOX2が、MUC1およびその開裂酵素MMP16のプロモータ・サイトへ結合することは以前に報告された(Boyer et al,2005)。同じ研究は、SOX2とNANOGが、NME7のプロモータ・サイトへ結合することを報告した。本発明者等は、これらの「山中」多分化能因子(Takahashi and Yamanaka, 2006)が、MUC1、その開裂酵素MMP16およびその活性化配位子NME7をアップレギュレートすることを本発明の実験に基づいて結論付けた。BRD4がNME7を抑制し、その一方でそのコファクターJMJD6が、（本発明者等が胚発生でのNME7より遅く発現される自動調整の幹細胞成長因子であることを実証した）NME1 (Thompson et al)をアップレギュレートしていることは以前に報告された。さらに、最近の他の報告では、Mbd3あるいはChd4のsiRNA抑制が、iPS生成(Rais Y et al 2013 et al.)への抵抗性を大幅に縮小させ、及びナイーブ状態に幹細胞を維持することができたことを報告している。ここで示された証拠は、さらに多分化能阻害剤Mbd3およびCHD4を抑制している間、NME7がBRD4とJMJD6を抑制する相互的フィードバックループがあることを示している。本発明者等は、ナイーブヒト幹細胞において、これらの4つの因子、BRD4、JMJD6、Mbd3とCHD4は、より後期段階の「プライムド」幹細胞におけるそれらの発現にくらべ、抑制されることに注目した。さらに、本発明者等は、マウスプライムド幹細胞をナイーブ状態に戻す2i阻害剤(Gsk3とMEKの阻害剤)が、同じ4つの因子、BRD4、JMJD6、Mbd3およびCHD4をダウンレギュレートすることに注目した。
さらに、本発明者等は、NME7が、SOX2(>150X)、NANOG(~10X)、OCT4(~50X)、KLF4(4X)およびMUC1(10X)をアップレギュレートすることを見出した。重要なことには、本発明者等は、NME7が、CXCR4(~200X)およびE-カドヘリン(CDH1)を含む癌幹細胞マーカーをアップレギュレートすることを示した。ともに得られた、証拠ポイントのこれらの多数のラインが以下の結論をもたらした；NME7は最も原始的な幹細胞成長および多分化能媒介物質である、またそれ、それは、癌細胞をより転移性の癌幹細胞へ形質転換するのと同様に、体細胞の癌化状態への形質転換の強力な因子である。図60は、実験によって証拠づけられた、NME7と幹/癌様状態の関連レギュレーターの相互作用地図の図である。二量体型のNME1は、体細胞を幹/癌様の状態に変換することができることにおいては、わずかにより劣った程度ではあるが、癌細胞を転移性癌幹細胞へ形質転換できることにおいては、ほぼNME7と同様に機能した。同様に、ヒトNME1への高い相同性を備えたバクテリアNME二量体あるいはHalomonas Sp 593のようなNME7は、NME1二量体およびNME7モノマーのように、全面的に、ヒト幹細胞成長、多分化能および生存癌細胞の成長を、および生存戻り体細胞を癌／幹細胞状態へ及び形質転換された癌細胞をより転移性の癌幹細胞へ、サポートすることができた。
したがって、本発明は、NME7のために、NME7の発現を増加させる遺伝子および遺伝子産物を代用することをも包含する。同様に、本発明は、NME7のために、NME7の下流のエフェクターを用いることをも包含する。例えば、単独であるいはコンビネーションで、MBD3、CHD4、BRD4あるいはJMJD6を抑制する作用薬は、本発明者等が示した、MBD3、CHD4、BRD4あるいはJMJD6を抑制するNME7に関し、本発明で開示の方法のうちのいずれかで、代用することができる。
実施例１
乳がん細胞の生着および成長を促進するために、４０〜６０日齢の免疫許容nu/nuマウスに、９０日エストロジェンリリース・ペレットを植え付けした。ヒトのT47D乳癌細胞が、Matrigelと1:2に混合され、1グループ当たり6匹のマウスの横腹に注入された（マウスあたり400万)。第２のグループで、癌細胞は同じ1:2比率(100μL細胞: 200μl Matrigel)でMatrigelと混合された以外は、ヒト組み換えNME7-ABが細胞/Matrigelミックスへ16nMのNME7終濃度で、加えられた(6匹のマウス)。それらの6匹のマウスのうち、3匹は、14日後に、NME7注射 (32μMの100μL)を日毎投与するように、無作為に選ばれた。図1は、マウスの腫瘍細胞成長のグラフを示す。パネル(A)は、標準MatrigelあるいはNME7とMatrigelが混合され、免疫許容(nu/nu)マウスへ異種植え付けされたT47D乳がん細胞の成長のグラフを示す。経過日14の後に、その腫瘍細胞がNME7と混合されたグループのマウスも、ヒト組み換えNME7を毎日1回注入された。パネル(B)は、T47D乳がん細胞がNME7及びMatrigelと混合され、そして免疫許容マウスへ異種植え付けされたT47D乳がん細胞の成長のグラフを示す。経過日14の後に、マウスの半分も、ヒト組み換えNME7を毎日1回注入された。図2は、個々のマウスについて、ヒト腫瘍細胞の成長のグラフを示す。パネル(A)は、標準Matrigelと混合されたT47D乳癌細胞の成長のグラフを示す。6匹の植え付けされたマウスのうちの2つだけが、生着に特有の腫瘍成長を示した。パネル(B)は、Matrigel及びNME7と混合されたT47D乳癌細胞の成長のグラフを示す。6匹の植え付けされたマウスの4が生着に特有の腫瘍成長を示した。点線は、経過日14の後にNME7を注入されたマウスを示す。
実施例２
４０〜６０日齢の免疫許容マウスのいくつかのグループに乳がん細胞の生着と成長を促進するために９０日エストロジェンリリース・ペレット剤が植え付けされ、また各マウスの横腹へ植え付けされた。ヒトのT47D乳癌細胞が、Matrigel(100μL細胞: 200μl Matrigel)1と１：２で混合され、その後各マウス(400万、各マウス)の横腹の１に注入された。複数動物を未処理とし、腫瘍成長の割合を追跡するために、かつこの細胞株の腫瘍生着率を評価するために、腫瘍成長を測定した。図3は、標準Matrigelと混合され、40匹の免疫許容(nu/nu)マウスへ異種植え付けされたT47D腫瘍細胞のグラフを示す。グラフは、腫瘍容積における、衰微傾向の、22%の平均増加を示し、20匹のマウス各々の2つの同一グループの平均を示す。図4は、約25%の腫瘍生着を示し、40匹の個々のマウスでT47Dヒト乳がん細胞の成長のグラフを示す。図5は、Matrigelと混合され、6匹のNOD/SCIDマウスの横腹へ異種植え付けされたT47D乳癌細胞の成長のグラフを示す。パネル(A)は平均腫瘍成長を示す。パネル(B)は、6匹のマウスのうちの1匹だけが、標準分析法を使用して、よい腫瘍生着を持っていたことを明らかにし、個々のマウスでの腫瘍成長を示す。
実施例３
ナイーブ状態に幹細胞を維持することができる作用薬は、癌細胞を、少数の細胞数を生着に必要とする癌幹細胞に形質転換する。癌細胞は標準的技法によって培養された。コントロールでは、癌細胞はそれらの一般的な培地によって培養された：T47D乳癌細胞、DU145およびPC3前立腺癌細胞用のRPMI。しかし、試験薬、組換え型タンパク質ヒトNME1二量体、バクテリアHSP593 NME1二量体、ヒトNME7-ABおよび2iが、血清中の多くの成長因子およびサイトカインからの干渉可能性を除去するために、無血清最小培地に添加された。さらなるコントロールとして、癌細胞は、NME1、NME7あるいは2iを含まない最小培地で培養され、増殖せず、また、得られた細胞は、癌幹細胞のマーカーをアップレギュレートもしなかった。
無血清最小培地500 mLは下記成分を含む：
394mL DMEM/F12、GlutaMAX; 100mL KnockoutTM血清代替物; 5.0mL 100x MEM非必須アミノ酸溶液; 0.9mL β-メルカプトエタノール、55mMストック。
この無血清最小培地に、rhNME1(aka NM23)が8nMの終濃度に加えられ、あるいはバクテリアHSP593組み換えNME1が8nMの終濃度に加えられ、あるいはrhNME7-ABが4nMの終濃度に加えられ、あるいは2i阻害剤、PD0325901およびCHIR99021、それはMAPキナーゼ経路およびGSK3をそれぞれ阻害する、が3μMと1μMの終濃度に加えられた。
ロー・キナーゼ阻害剤、“Ri”あるいは“ROCi”が加えられた時、それはStemgent(ケンブリッジ、MA)からのY27632であり、使用直前に、10μMの終濃度で加えられた。
実施例３ａ
乳癌T47D細胞が、一般的なRPMI成長培地、あるいはNM23-H1として知られたヒトNME1二量体、バクテリアHSP593 NME1二量体、ヒトのHSP593 NME7ABあるいは「2i」として知られているキナーゼ阻害剤が加えられた最小幹細胞培地で、培養された。これらの作用薬が共通に持っていることは、それらがナイーブ状態のでの幹細胞の成長を各々促進することができるか、より少ない成熟したナイーブ状態へプライムド状態幹細胞を戻すができるということである。本発明者等は、これらの作用薬のうちのいずれかで培養されたT47D癌細胞のうちのいくつかが非付着になることを見出した。さらに、これらの「浮遊物」は形態学的に異なっていた。ロー・キナーゼ阻害剤、「Ri」あるいは「ROCi」と呼ばれた、の添加は、表面にほとんどの細胞を付着させた。図6-10のグラフ中で示されるRT-PCR測定は、浮遊性の細胞が、癌幹細胞マーカーあるいは幹細胞マーカーの最も高い発現をしているものであることを示す。ロー・キナーゼ阻害剤が加えられる場合、細胞はすべて付着し続けるが、しかし、RT-PCR測定は、得られる測定は、形質転換された細胞およびなかったか、まだなかったもとの混合物であることを示す。結果は、図6-10に示される。
図6は、報告によると、いくつかの癌幹細胞あるいは転移性癌細胞中で過剰発現する、通常RPMI成長培地あるいは単一の成長因子として組み替えヒトNME7-ABを添加された無血清最小培地で培養されたMUC1陽性のT47D乳癌細胞の遺伝子パネルの発現のRT-PCR測定のグラフを示す。それらの細胞の一部は非付着になり、表面から浮かび、集められ、ここで「+ Ri」は、細胞がすべて表面へ付着し続けるように培地に添加されたロー・キナーゼ阻害剤を指し、その結果、付着および非付着細胞の平均数値を与える。グラフで示されるように、転移レセプターCXCR4の発現は、通常の成長培地で培養したT47D細胞の発現レベルのほとんど200倍である。E-カドヘリンと呼ばれるCDH1、およびMUC1、それは両方とも癌の進行に関与する、は、両方とも、およそ10倍まで上昇した。癌細胞のマーカーであることが報告された幹細胞マーカーも上昇した。OCT4とSOX2は、およそ50倍および200倍それぞれ増加した。NANOG、KLF2、KLF4およびTBX3のような他の幹細胞マーカーは、発現の適度の増加を示した。
図７は、報告によると、いくつかの癌幹細胞あるいは転移性癌細胞中で過剰発現する、通常RPMI成長培地あるいは単一の成長因子として組み替えヒトNM23、NME１とも呼ばれる、二量体又はNME7-ABを添加された無血清最小培地で培養されたMUC1陽性のT47D乳癌細胞の遺伝子パネルの発現のRT-PCR測定のグラフを示す。「浮遊物」は、非付着となるような細胞を指し、回収され、ここで「+Ri」は、それらが表面へ付着し続けるようにある細胞に添加されたロー・キナーゼ阻害剤を指す。グラフで見ることができるように、NME1二量体あるいはNME7-ABで培養された癌細胞は、CXCR4、SOX2およびOCT4の発現に劇的な増加があり、E-カドヘリンとも呼ばれるCDH1、MUC1およびNANOGの発現の増加に続いた。幹細胞マーカーKLF2およびKLF4の発現は適度の増加があった。
図8は、ヒトNME1のそれに似ている方法で、バクテリアNME1が作用することを確認できる。T47D、MUC1陽性の乳癌細胞、に加えられた組み換えHSP593バクテリアNME1は、細胞の形態変化をも引き起こし、さらに細胞を非付着とした。図8は、CXCR4、NANOGおよびOCT4の発現の劇的な増加を示し、SOX2の少量の増加およびE-カドヘリンとも呼ばれるCDH1の5倍増加につづく、RT-PCR測定のグラフを示す。
「2i」キナーゼ阻害剤が存在する状態でT47D乳癌細胞を培養する結果は、図9に示される。2iは、プライムド状態の幹細胞をより初期のナイーブ状態に戻す、MAPキナーゼおよびGSK3の生化学的阻害剤である。2iは、T47D細胞に、次の順に、CXCR4、SOX2、OCT4、MUC1およびCDH1/Ecadherinの発現を強く増加させた。NME1二量体あるいはNME7-ABが2iに加えられた場合、最も大きな効果があるNME7-ABと共に、これらの癌幹細胞マーカーの発現の増加があった。しかし、図10は、NME7-ABだけが、癌幹細胞マーカーのさらに高い発現レベルを備えた癌細胞を生成することを示す。
実施例３ｂ
ヒトNME1二量体、バクテリアNME1二量体、NME7-AB、又は2i阻害剤の何れかを伴って、上述されるように、前立腺癌細胞も培養された。T47D細胞と異なり、前立腺癌細胞は非付着にならなかった。したがって、癌幹細胞マーカーのRT-PCR測定はT47D細胞のそれより低く、形質転換細胞および非形質転換細胞の測定をなすことで、それを説明することができる。乳癌細胞の場合には、本発明者等が浮遊性の細胞を集めることにより、完全に形質転換された癌幹細胞を単離することができたが、ここではそうすることができなかった。DU145 MUC1陽性前立腺癌細胞を、コントロールとして、RPMI培地で、および組み換えヒトNME1/NM23二量体、バクテリアHSP593二量体あるいはヒトNME7-ABを添加された最少培地で、培養した。図11aは、10日間のrhNME1二量体あるいはrhNME7-ABでの培養が、癌幹細胞のマーカーの適度の増加をもたらしたことを示す。OCT4、MUC1およびCDH1/E-カドヘリンにおいて、約2-8倍の増加があった。しかしながら、これらの同じ培養条件下での連続継代後、癌幹細胞マーカーの発現の増加はより明白になった。本発明者等は、浮遊細胞を急速には回収できないので、連続継代が、細胞に形質転換のためにより多くの時間を許容したと推論した。図11bは、rhNME7-AB、バクテリアHSP593 NME1二量体あるいは rhNME1/NM23二量体のいずれかでの、9-10継代の後、しばしば前立腺癌で過剰発現する、CDH1/E-cadherinの発現が、そえぞれ9倍、8倍および6倍の増加することを示した。NANOGとOCT4の発現にさらに著しい増加があった。
PC3 MUC1陰性前立腺癌細胞もまた、ナイーブ状態に幹細胞を維持することができる作用薬で培養された時、癌幹細胞へ形質転換するそれらの能力に関してテストされた。PC3細胞が、ヒトNME1二量体、バクテリアNME1二量体あるいはNME7-ABの何れか共に、上述されるように、培養された。DU145前立腺癌細胞のように、PC3細胞は非付着にならなかった。かくして、癌幹細胞マーカーのRT-PCR測定は、測定が形質転換細胞および非形質転換細胞の平均になるので、より低い。図12aは、rhNME1/NM23二量体で、あるいはrhNME7-ABで、継代の後に遺伝子サブセットのRT-PCR測定を示す。図12aのグラフは、幹細胞マーカーSOX2、OCT4およびNANOGの発現の適度の増加を示す。培地中での連続継代は、癌幹細胞若しくは幹細胞マーカーの発現を増加させなかった、もっと正確に言えば、図12bで示されるように、それらは減少した。
実施例３ｃ
この実施例において、癌細胞における「2i」阻害剤の効果がテストされた。2iは、MAPキナーゼ経路およびGSK3をそれぞれ阻害する、2つの低分子、CHIR99021およびPD0325901に与えられた名前である。幹細胞実験では、より少ない成熟したナイーブ状態に、2iがプライムド状態の幹細胞を戻すができることは実証された。この実験で、本発明者等は、2iあるいはNME7-ABが添加された最少培地でMUC1陽性T47D乳癌細胞を培養した。RT-PCR測定は、NME7-ABと同様に2iも、クロマチン再配列ファクターMBD3とCHD4の発現を抑制したことを示した、図13を参照。MBD3およびCHD4のsiRNA抑制が、ナイーブ状態へ幹細胞を戻す培地のキー添加物であることが報告された。MBD3とCHD4は、2i とrhNME1/NM23あるいはrhNME7-ABのいずれかとで培養された時、同様に抑えられた(図14)。
実施例３ｄ
この実施例において、繊維芽細胞が、組み換えヒトNME1/NM23二量体、バクテリアHSP593 NME1二量体あるいはNME7-ABが存在する状態で培養された。繊維芽細胞は、コントロールとしてそれらの通常培地において培養され、それは、500 mLあたり、ウシ胎児血清(FBS)の50 mL、445mL DMEM高グルコース基礎培地、5mL GlutaMAXである。NME1/NM23二量体、バクテリアHSP593 NME1二量体あるいはNME7-ABのいずれかでの培養15-20日後に、それらが繊維芽細胞としてもはや認識可能でない、細胞の形態は完全に変わった。RT-PCRは、得られた細胞が、非常に幹細胞マーカー遺伝子OCT4およびNANOGの発現の増加を示した。図15を参照。ちょうど癌細胞がそうであるように、さらに、それらはBRD4、JMJD6、MBD3およびCHD4の発現を減少させた。図16は、クロマチン再配列ファクターBRD4、JMJD6、MBD3およびCHD4をコードする遺伝子の発現のRT-PCR測定のグラフを示す。図17は、報告によると、ある癌幹細胞あるいは転移性癌細胞で過剰発現する、クロマチン再配列ファクターBRD4、JMJD6、MBD3およびCHD4をコードする遺伝子の発現のRT-PCR測定のグラフを示す。ここで、「マイナスROCi」は、非付着になり、表面から浮遊した細胞を指す。
実施例４
NME7-ABでの培養によって生成された癌幹細胞は、わずか50細胞の植え付けでマウスでの腫瘍としての活動を開始する。
上記の実施例3aに述べられているように、T47D乳癌細胞が培養された。4nMの終濃度にrhNME7-ABを添加された最少培地で7-10日間培養した後、浮遊細胞が集められた。RT-PCR測定は、CXCR4の発現が、RPMI培地において培養されたコントロール細胞での130倍増加したことを示した。浮遊性の細胞は、数えられそしてPBSで再懸濁された。NME7誘導癌幹細胞は、減少させた成長因子Matrigel と1：２で混合された：それは1パートの細胞に対し2パートのMatrigelである。NME7への癌細胞の比率の範囲あるいはNME7の注入スケジュールは、あるマウス株と別の株で、およびある腫瘍タイプと別のタイプで、変わることが予想される。
癌幹細胞は、先に90日リリースエストジェンペレット（90-day release estrogenpellet）でショルダー・エリアに植え付けされていた雌のnu/nu・マウスの横腹に植え付けされた。6匹のマウスの4つのグループに各々、50、100、1,000あるいは10,000のいずれかのT47D癌幹細胞が植え付けされた。各ケースで、各マウスに植え付けされた全容積は100μLであった。各グループでのマウスの半分は、癌幹細胞植え付けサイトではなく、横腹に組み換えヒトNME7ABの200μLを毎日注入した。
動物は食物摂取量と体重についてモニターされ、それは正常で安定であった。2つの独立のブラインド化腫瘍測定が週に一度得られ記録した。
腫瘍生着は50個の細胞だけが植え付けされたグループでさえ達成された。驚いたことに、NME7を毎日注入されたグループは、生着の割合が上昇し、そのグループの動物のいくつかがさらに多発性腫瘍を形成した。すなわち、NME7を毎日注入されたグループの癌は約50日の後に転移し、最初の生着サイトから離れたサイトで多発性腫瘍を生じさせた。特にこの実験では、NME7誘導癌幹細胞が植え付けされた24匹のマウスの67%が、腫瘍を生じさせた。しかしながら、データをより詳細に見ると、循環NME7を持たないマウスの50%のみが腫瘍を形成し、NME7の毎日注入を受けたマウスの83%が腫瘍を形成したことをしめした。腫瘍を形成したその83%のうち、それらがほぼ実験の経過日50までに多発性腫瘍を持つように80%は癌転移をおこした。図21は、NME7、NME7-ABの組み換えの形式を含んでいる培地で培養された癌細胞の植え付け63日後に測定された腫瘍容積のグラフである。各データポイントの側の番号はマウス・トラッキング番号を指し、また、「M」は、動物が多発性腫瘍を持っていたことを示す。図22は、腫瘍容積の合計のグラフであり、転移性癌をもつ1つのマウスでのすべての腫瘍の体積がともに加えられた。図23〜46は、腫瘍成長の進行を示すために、そして、NME7ABを毎日注入されたマウスにおいて、転移の進行を示すために、経過日28および経過日58での各被験マウスの写真を示す。図23-46で、暗い矢は最初の癌細胞の注入部位を指し、また、明るい矢は、経過日28と経過日63の間に展開した遠隔転移を指す。
ここに引用された参照のすべては、参照によって本発明の実施態様として挿入される。
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当業者は、特にここに記述された発明の特定の実施態様への多くの等価物を、ルーチン実験を使い認識するかあるいは確認することができる。そのような等価物は、本願請求の範囲で権利として包含されることを意図する。

Claims (12)

  1. 次のものを含む非ヒト哺乳動物での癌細胞に対する潜在的な薬剤の効能についてのテスト方法：
    (i) 非ヒト哺乳動物での癌細胞の生成；
    (ii) 該哺乳動物への潜在的な薬剤の投与により潜在的な薬剤と癌細胞をコンタクトさせること；そして
    (iii) 癌細胞での潜在的な薬剤の効果を測定することであって、そこで該哺乳動物での癌細胞の数の減少は癌細胞に対する該潜在的な薬剤の有効性を示し、そこでは該方法は、ステップ(i)を実行する前に、ステップ(i)を実行した後に、あるいはステップ(i) を実行する前と後の両方に、ナイーブ状態に幹細胞を維持するか若しくはナイーブ状態にプライムド幹細胞を戻す作用薬と癌細胞をコンタクトさせることを含み、
    該作用薬は、NME1二量体、NME7モノマー、NME7-AB、NME6二量体、バクテリアNME、または2iであって、
    癌細胞が、自然に生成される癌細胞若しくは非ヒト動物への植え付けに使用されるヒトから採取された癌細胞であり、非ヒト哺乳動物への植え付けに使用されるヒトから採取された癌細胞の量は、30〜1,000,000、50〜500,000、50〜100,000、あるいは1,000〜1,000,000である、
    方法。
  2. 潜在的な薬剤は、MBD3、CHD4、BRD4またはJMJD6の発現を抑制する、請求項１に記載の方法。
  3. 潜在的な薬剤は、MBD3、CHD4、BRD4若しくはJMJD6に対して作られたsiRNA、あるいはMBD3、CHD4、BRD4若しくはJMJD6の発現をアップレギュレートするタンパク質をコードする何らかの遺伝子に対して作られたsiRNAである、請求項２に記載の方法。
  4. 哺乳動物が、げっ歯動物である請求項１に記載のテスト方法。
  5. げっ歯動物が、マウス若しくはラットである請求項４に記載のテスト方法。
  6. 非ヒト哺乳動物は、遺伝子組み換えであり、該哺乳動物はヒトMUC1あるいはMUC1*あるいはNMEタンパク質を生殖細胞若しくは体細胞において発現し、生殖細胞と体細胞は該哺乳動物へ導入された組み換えヒトMUC1あるいはMUC1*あるいはNME遺伝子配列を含む、請求項１に記載のテスト方法。
  7. ヒトMUC1あるいはMUC1*あるいはNMEタンパク質を発現する遺伝子は、誘導可能なプロモータにコントロールされる請求項６に記載のテスト方法。
  8. プロモータは、非ヒト哺乳動物において自然発生のタンパク質に誘導可能に反応する請求項７に記載のテスト方法。
  9. ナイーブ状態に幹細胞を維持する若しくはナイーブ状態にプライムド幹細胞を戻す作用薬は、ステップ(i)を行なう前に癌細胞とコンタクトする請求項１に記載のテスト方法。
  10. ナイーブ状態に幹細胞を維持する若しくはナイーブ状態にプライムド幹細胞を戻す作用薬は、ステップ(i)を行なった後に癌細胞とコンタクトする請求項１に記載のテスト方法。
  11. ナイーブ状態に幹細胞を維持する若しくはナイーブ状態にプライムド幹細胞を戻す作用薬は、ステップ(i)を行なう前及び後に癌細胞とコンタクトする請求項１に記載のテスト方法。
  12. NMEタンパク質は、単一の成長因子として無血清培地中に存在する請求項１に記載のテスト方法。
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