CN104995518A

CN104995518A - Nme变体物种表达和抑制

Info

Publication number: CN104995518A
Application number: CN201380049792.5A
Authority: CN
Inventors: 辛西娅·巴姆达德
Original assignee: Minerva Biotechnologies Corp
Current assignee: Minerva Biotechnologies Corp
Priority date: 2012-07-24
Filing date: 2013-07-24
Publication date: 2015-10-21
Also published as: CA2880010A1; JP2019141100A; AU2013295811A1; CN111849874A; AU2019203098B2; EP4206318A1; EP2877586A2; JP7386210B2; WO2014018679A2; WO2014018679A3; IL236901A0; SG11201606118SA; IL236901B; EP2877586A4; AU2019203098A1; SG10201700593YA; US20150203823A1; JP2015529454A; US20230049461A1; JP6546087B2

Abstract

本申请公开了用于由起始细胞产生较不成熟细胞的方法，包括诱导起始细胞回复至较不成熟状态，包括增加其多聚化状态是生物学活性状态的NME家族成员的量或减少其多聚化状态是生物学无活性状态的NME家族成员的相对量。

Description

NME变体物种表达和抑制

技术领域

本申请涉及操纵NME家族蛋白质以及它们的相关因子的表达以调节干细胞样生长和治疗癌症的领域。

背景技术

NM23以蛋白质家族存在，其中，这些蛋白质之间的共性是存在催化ATP转化为ADP的核苷二磷酸激酶(NDPK)结构域。先前，已知NM23作为肿瘤转移因子。其中近来识别的十个NM23家族成员，现在它们还以NME蛋白质1-10为人熟知(Mol Cell Biochem(2009)329:51-62,“Themammalian Nm23/NDPK family:from metastasis control to cilia movement,”Mathieu Boissan,Sandrine Dabernat,Evelyne Peuchant,Uwe Schlattner,IoanLascu,and Marie-Lise Lacombe)。

科学家首先从人白血病细胞分离了分化抑制因子并且表明添加这种因子阻断某些类型的白血病细胞和髓系细胞的化学诱导的分化(Okabe-Kado,1985,Cancer Research 45,4848-4852,“Characterization of aDifferentiation-inhibitory Activity from Nondifferentiating Mouse MyeloidLeukemia Cells)，随后，将该抑制因子确定为NME1(NM23-H1)(Okabe-Kado,1992,“Identity of a differentiation inhibiting factor for mousemyeloid leukemia cells with NM23/nucleoside diphosphate kinase”,BiochemBiophys Res Comm,182No.3987-994)。白血病细胞是受阻于终末分化的血细胞。有趣地，示出抑制白血病细胞的分化的能力不依赖于其催化结构域。终止其酶活性的NDPK结构域中的突变对蛋白质阻断一些类型的白血病细胞的分化的能力不具有影响。然而，关于NM23是否抑制分化、加速分化或根本不具有影响，随后数十年的科学文献描绘了完全混乱的图画。

多篇研究文章提供了表明NM23诱导分化的证据。Rosengard等，1989；Dearolf等，1993；以及Timmons等，1993报导了对于适当的分化，需要体内果蝇NM23同源物awd。Lakso等，1992，报导了随着组织分化的开始，NM23(小鼠体内)增加，表明其诱导分化。Yamashiro等，1994报导了在人红白血病细胞的分化过程中体外NM23水平增加。Lombardi等，1995得出的结论是随着细胞分化的开始NM23(小鼠体外)增加，再次表明NM23诱导分化。Gervasi，1996报导了NM23(大鼠体外)的过表达诱导了神经元分化，并且利用反义DNA下调NM23抑制了分化。Amendola等，1997表明在人神经母细胞瘤细胞中转染NM23增加了分化。

与报导了NM23诱导分化的多篇研究文章直接矛盾的是，在同一时间段内出版的相等数量的文章报导了相反的结果：NM23抑制分化。Munoz-Dorado等，1990发现了ndk(粘球菌(Myxococcus)NM23同源物，体内)对于生长是必要的，但在发育过程中被下调，表明它的存在将抑制分化。Okabe-Kado，1992示出体外分化抑制因子(随后由相同的组确定为NM23)抑制了小鼠白血病的分化。Yamashiro等，1994报导了在人原始巨核细胞(megakaryoblast)的分化过程中NM23水平下降，符合NM23抑制分化。Okabe-Kado，1995示出重组NM23抑制白血病细胞系HEL、KU812以及K562的红系细胞分化(erythroid differentiation)，而不是祖细胞HL60、U937或HEL/S细胞的单核细胞或粒细胞分化。Venturelli等，1995报导了NM23过表达抑制了人造血祖细胞的G-CSF依赖性粒细胞分化。Willems等，1998发现了当来自骨髓细胞的人CD34⁺造血祖细胞分化时，NM23表达降低。在2002年，Willems等表明了NM23对细胞增殖不具有影响，不诱导或抑制分化，但使CD34+细胞的分化偏好红系细胞世系。

在2000的综述文章中，Lombardi总结了关于NM23在分化中的作用的这些和其他矛盾的结果，并且得出结论，“尽管NM23基因在控制细胞分化中的作用正处于广泛地调查中，但NM23表达水平和这种过程之间的功能关系仍待完全阐明”。换句话说，没有理解NM23和分化之间的功能关系。

在生物系统中，蛋白质常常组成指导细胞以特定方式行为的复杂信号级联。例如，指导细胞开始分裂过程的常见方式是蛋白质(配体)结合至跨膜蛋白质受体的胞外结构域，其中，配体与胞外结构域的结合赋予受体构象的变化。配体诱导的构象变化能够发生在胞外结构域、胞内结构域或两者中，并且引起其中蛋白质或分子能够结合至受体的变化。这种由外向内的信号传递是用于向细胞发出分裂信号、引发程序性细胞死亡以及多个其他过程的共同机制。

调节生长因子受体的活性的一种常用的机制是受体胞外结构域的配体诱导的二聚化，所述二聚化反过来将细胞内尾部紧密连接在一起，这为修饰蛋白质如激酶制造了良好的停靠位点，该激酶启动信号级联，其结果为引起细胞分裂的针对细胞核的信号。

生长因子受体的胞外结构域的配体诱导的二聚通常通过结合配体二聚体完成，即，两种配体非共价地彼此结合以形成同源二聚体或异源二聚体，其随后结合至相同(同源)或不同(异源)的两种受体。

配体诱导的受体二聚化的重要实例是结合至并且使MUC1*的胞外结构域二聚化的NM23二聚体，MUC1*是MUC1跨膜蛋白质的截短形式，MUC1跨膜蛋白质是肿瘤细胞和干细胞专一性的。无论配体是否是单体，除了别的之外，二聚体或高阶多聚体是其浓度的函数。对于多个生长因子受体，仅配体的二聚体形式激活生长因子受体。此外，在原始生物系统中，存在其中高阶多聚体阻碍(关闭，turn off)由二聚体促进的功能的反馈环。例如，当噬菌体λ的CI蛋白质以四聚体结合至DNA时，其启动(turn on)一组基因的转录，但当作为增加的浓度的函数CI蛋白质变成八聚体时，其阻碍那些基因的转录。因此，将有利的是发现调节功能的这种多聚化调节的反馈环是否存在于高阶有机体如人类中，以及根据每个多聚体的功能的知识开发操纵功能的方法。

发明内容

在一个方面，本发明指向用于由起始细胞产生较不成熟细胞的方法，包括诱导起始细胞回复至较不成熟状态，包括增加其多聚化状态是生物学活性状态的NME家族成员的量或减少其多聚化状态是生物学无活性状态的NME家族成员的相对量。

在另一个方面，发明指向抑制胚胎干细胞、诱导的多能干细胞或祖细胞的分化的方法，包括增加其多聚化状态是生物学活性状态的NME家族成员的量或减少其多聚化状态是生物学无活性状态的NME家族成员的相对量。

在另一个方面，发明指向维持或诱导细胞中的多能性的方法，包括减少其多聚化状态是生物学无活性状态的NME家族成员的相对量。

在又一个方面，发明指向抑制胚胎干细胞、诱导的多能干细胞或祖细胞的分化的方法，包括减少其多聚化状态是生物学无活性状态的NME家族成员的相对量。

在以上描述的任何方法中，NME家族成员的处于生物学无活性状态的多聚化状态可以是六聚体或高阶多聚体。在一个方面，这种NME家族成员可以是NME1(NM23-H1)或NME2(NM23-H2)。

在以上描述的任何方法中，NME家族成员的处于生物学活性状态的多聚化状态可以是包含能够结合至相同靶受体的两种单元的二聚体或单体。在该方面，这种NME家族成员可以是有利于二聚化或具有两个用于其同源配体的结合结构域的NME1的突变体或变体，或者NME6或NME7。

在以上描述的任何方法中，通过添加其多聚化状态是生物学活性状态的NME家族成员可以减少其多聚化状态是生物学无活性状态的NME家族成员的相对量。通过引入引起其多聚化状态是生物学活性状态的所述NME家族成员被表达的核酸或小分子可以增加其多聚化状态是生物学活性状态的NME家族成员。

并且进一步地，在以上描述的任何方法中，通过引入下调其表达的核酸或小分子可以减少其多聚化状态是生物学无活性状态的NME家族成员的相对量。

在另一个方面，在以上描述的任何方法中，通过同时引入下调形成无活性状态的第一NME的第一核酸和上调形成活性状态的NME的第二核酸可以减少其多聚化状态是生物学无活性状态的NME家族成员并且可以增加其多聚化状态是生物学活性状态的NME家族成员。

在以上描述的任何方法中，下调的核酸可以是反义DNA、抑制性RNA、siRNA或shRNA，并且上调的核酸是编码DNA、RNA、mRNA或质粒。可以修饰这种核酸以促进进入细胞。在该方面，可以被下调的NME家族成员可以包括NME1、NME2、或NME1和NME2。在该方面，可以被上调的NME家族成员可以是偏好(prefer)二聚化的NME1、NME2的突变体或变体、NME6或NME7。

在另一个方面，本发明指向引起偏好二聚体形成或具有两个相同配体的结合结构域的NME1突变体或变体的表达的核酸；和/或

a.NME7；和/或

b.引起NME7的表达的核酸；和/或

c.NME6；和/或

d.引起NME6的表达的核酸；和/或

e.下调NME1或NME1和NME2的核酸。

在又一个方面，发明指向用于培养干细胞或祖细胞的培养基，其中，培养基包含：

a.偏好二聚体形成或具有两个相同配体的结合结构域的NME1突变体或变体；和/或

b.引起偏好二聚体形成或具有两个相同配体的结合结构域的NME1突变体或变体的表达的核酸；和/或

c.NME7；和/或

d.引起NME7的表达的核酸；和/或

e.NME6；和/或

f.引起NME6的表达的核酸；和/或

g.下调NME1或NME1和NME2的核酸。

在又一个方面，发明指向用于诱导多能性或用于诱导细胞回复至较不成熟状态的培养基，其中，培养基包含：

c.NME7；和/或

d.引起NME7的表达的核酸；和/或

e.NME6；和/或

f.引起NME6的表达的核酸；和/或

g.包含下调NME1或NME1和NME2的核酸。

培养基还可以包含编码一些或全部诱导多能性的基因或小分子的核酸，所述基因或小分子包括：OCT4、SOX2、NANOG、KLF4以及c-Myc。

在又一个方面，发明指向宿主细胞，所述宿主细胞携带引起其多聚化状态是生物学无活性状态的NME家族成员的表达降低的合成核酸。NME家族成员可以是NME1、NME2、或NME1和NME2。

在又一个方面，发明指向宿主细胞，所述宿主细胞携带引起其多聚化状态是生物学活性状态的NME家族成员的表达增加的合成核酸。在该方面，NME家族成员可以包括偏好二聚体形成或具有两个相同配体的结合结构域的NME1突变体或变体、NME6或NME7。

在另一个方面，发明指向宿主细胞，所述宿主细胞携带引起其多聚化状态是生物学无活性状态的NME家族成员的表达降低的合成核酸以及引起其多聚化状态是生物学活性状态的NME家族成员的表达增加的合成核酸。在该方面，其表达将被降低的NME家族成员可以是NME1、或NME1和NME2，并且其表达将被增加的NME家族成员可以是偏好二聚体形成或具有两个相同配体的结合结构域的NME1突变体或变体、和/或NME6、和/或NME7。细胞还可以携带引起不在宿主细胞中表达或在宿主细胞中突变的基因的表达的核酸。宿主细胞还可以携带核酸以下调不想要的基因并且上调期望的或校正的基因。宿主细胞可以是胚胎干细胞、诱导的多能干细胞、祖细胞或体细胞。

在另一个方面，发明指向治疗患者的方法，其中，将以上描述的细胞给予至患者。可以通过骨髓移植、移植到特定位点、输液、注射或局部治疗给予细胞。治疗可以针对通过用干细胞、祖细胞治疗，或者通过校正遗传异常或缺陷会减轻的任何疾病或病况。或，在给予患者之前可以将细胞分化，并且其中，在分化过程中将NME1、NME6、或NME7撤出(withdraw)。

在又一个方面，发明指向治疗患者中的癌症的方法，包括将药剂给予至所述患者使得药剂增加其多聚化状态是生物学无活性状态的NME家族成员的量或减少其多聚化状态是生物学活性状态的NME家族成员的相对量。在该方面，其多聚化状态是生物学活性状态的NME家族成员可以是NME7，并且其多聚化状态是生物学无活性状态的NME家族成员可以是NME1、NME2或NME8。

附图说明

将通过在下文给出的详细描述和仅通过说明方式给出因而不限制本发明的附图而更全面地理解本发明，并且在附图中：

图1A-图1F示出在MUC1*拉下实验中检测在NM23-S120G二聚体中培养的、在MEF或人乳癌细胞上的bFGF中培养的人干细胞中的NME1(A，D)、NME6(B，E)、或NME7(C，F)的存在，或NME同种型的存在的蛋白质印迹照片。

图2是用针对NME7的特异性抗体探测的人胚胎干细胞裂解物的蛋白质印迹照片。

图3示出在以一定范围的浓度存在的NME1-S120G二聚体中培养数天后仍保持多能性的、并且未分化的人BGO1v胚胎干细胞的照片。

图4示出在以一定范围的浓度存在的NME1-野生型六聚体中培养数天后已经分化并且不再是多能性的人BGO1v胚胎干细胞的照片。

图5示出在以一定范围的浓度存在的20％的NME1-S120G二聚体和80％的NME1-野生型六聚体中培养数天后已经分化并且不再是多能性的人BGO1v胚胎干细胞的照片。

图6是示出与在bFGF中培养的相同来源细胞相比的在NME1-S120G二聚体中培养最高达37代的人胚胎H9干细胞中多能性、原始态和始发态(primed)基因的表达水平的定量PCR测量的图。

图7A-图7B示出其中已经将针对NME1、NME6和NME7特异的siRNA用于抑制这三种NM23同种型的表达的人干细胞的照片。

图8A-图8F示出其中已经将针对NME1、NME6和NME7特异的siRNA单独或组合地用于抑制这三种NM23同种型的表达的人干细胞的照片。

图9A-图9D示出人干细胞的照片，其中，如果用纯化为稳定的二聚体的重组NME1处理细胞，则拯救了由抑制NME7诱导的分化。

图10A-图10B示出人干细胞的照片，其中，已经将针对NME1、NME6和NME7特异的siRNA用于抑制所有三种NM23同种型的表达，并且通过用纯化为稳定的二聚体的重组NME1处理细胞，拯救了细胞生长的抑制和通过抑制所有三种NME诱导的分化。

图11A-图11D示出人干细胞的放大照片，其中，已经使用siRNA抑制了NME1(A，C)或NME7(B，D)的表达，或受到抑制，但其中用纯化为稳定的二聚体的重组NME1处理抑制的细胞(C，D)。

图12A-图12D示出人干细胞的放大照片，其中，已经使用siRNA抑制NME1(A，C)或NME7(B，D)的表达，或受到抑制但也通过用纯化为稳定的二聚体的重组NME1处理细胞而被拯救(C，D)。

图13A-图13D示出人干细胞的放大照片，其中，NME1、NME6和NME7的表达受到抑制(A，C)，或NME1和NME7受到抑制(B，D)，其中，通过在纯化为稳定的二聚体的重组NME1中培养细胞，将在一定程度上拯救细胞(C，D)。

图14示出RT-PCR实验的图，其中，在人干细胞中测量多能性基因NANOG、OCT4和KLF4，或分化标志物FOXA2，加上NME1、NME6和NME7基因的表达，其中，NME1、NME6或NME7已经受到抑制或“敲除(Knocked Out)”；对照是模拟转染和已经分化的相同干细胞。在NME敲除细胞和分化对照中看到分化标志物FOXA2的显著增加。当NME6或NME7被抑制时，观察到NME1的表达的显著增加。

图15示出RT-PCR实验的图，其中，在人干细胞中测量多能性基因NANOG、OCT4和KLF4，或分化标志物FOXA2，加上NME1、NME6和NME7基因的表达，其中，已经将NME1敲除(KO)，其中，已经在补充有人重组NME1二聚体形式的培养基中培养了一组NME1抑制的细胞；对照是已经允许分化的相同干细胞。在NME1敲除细胞和分化对照中看到分化标志物FOXA2的显著增加。

图16示出RT-PCR实验的图，其中，在人干细胞中测量多能性基因NANOG、OCT4和KLF4，或分化标志物FOXA2，加上NME1、NME6和NME7基因的表达，其中，已经将NME6敲除(KO)，其中，已经在补充有人重组NME1二聚体形式的培养基中培养了一组NME6抑制的细胞；对照是已经允许分化的相同干细胞。

图17示出RT-PCR实验的图，其中，在人干细胞中测量多能性基因NANOG、OCT4和KLF4，或分化标志物FOXA2，加NME1、NME6和NME7基因的表达，其中，已经将NME7敲除(KO)，其中，已经在补充有人重组NME1二聚体形式的培养基中培养了一组NME7抑制的细胞；对照是已经允许分化的相同干细胞。除了NME1的表达的显著增加之外，在NME7抑制的细胞中看到了分化标志物FOXA2的显著增加。当在补充有二聚体形式的NME1的最小培养基中培养被抑制的细胞时，两者均回复至几乎正常的状态。

图18示出RT-PCR实验的图，其中，在人干细胞中测量多能性基因NANOG、OCT4和KLF4，或分化标志物FOXA2，加上NME1、NME6和NME7基因的表达，其中，NME1、NME6和NME7已经被抑制(KO)，其中，已经在补充有人重组NME1二聚体形式的培养基中培养了一组抑制的细胞；对照是已经允许分化的相同干细胞。在抑制的细胞中看到了分化标志物FOXA2的显著增加，其中，在补充有二聚体形式的NME1的最小培养基中培养的被抑制的细胞回复至接近正常基因谱。

图19示出RT-PCR实验的图，其中，在人干细胞中测量多能性基因NANOG、OCT4和KLF4，或分化标志物FOXA2，加上NME1、NME6和NME7基因的表达，其中，NME1和NME7已经被抑制(KO)，其中，已经在补充有人重组NME1二聚体形式的培养基中培养了一组被抑制的细胞；对照是已经允许分化的相同干细胞。

图20示出ELISA试验的图，其中，将MUC1*胞外结构域的合成PSMGFR肽固定在多孔板的表面上，并且针对与该肽的结合，测试三种不同的重组人NME6蛋白质，其中，一种是已经变性和复性(重折叠，refold)的野生型人NME6(NME6WT RS)，第二种是人NME6，其中，将有助于二聚化的区域替换至海绵序列(NME6HuToS)，并且第三种是突变体NME6S139G，其位于与偏好二聚化的在癌症中识别的NME1突变体的可比较的位置。所有证明结合至MUC1*的胞外结构域的肽。

图21A-图21B示出ELISA试验的图，其中，将MUC1*胞外结构域的合成PSMGFR肽固定在多孔板的表面上，并且针对与该肽的结合，测试不同的重组人NME8蛋白质，其中，一种是仅包含NME8结构域A和B的构建体(NME81-2)，并且另一种是仅包含NME8结构域B和C的构建体(NME82-3)。测试的NME变体是以可溶形式表达的或复性的(RS)。在一些情况中，添加DTT以打碎大的寡聚物。所有证明结合至MUC1*的胞外结构域的肽。添加NM23S120G二聚体，以与NME8构建体(A)的结合作比较。

图22A-图22D示出在转染siRNA以抑制NME1表达后96小时的人干细胞(A，B)和其中添加转染试剂但不具有siRNA或杂乱序列siRNA的对照细胞(C，D)的放大照片。NME1抑制的细胞与对照细胞的比较示出非常小的区别。注意，将干细胞平铺在也起到MUC1*刺激生长因子作用的二价抗-MUC1*抗体的层上。

图23A-图23D示出在转染siRNA以抑制NME7表达后96小时的人干细胞(A，B)和其中多能性基因Oct4受到抑制的对照细胞(C，D)的放大照片。NME7抑制的细胞与OCT4抑制的细胞的比较示出非常小的区别，其中，两者已经严重抑制了细胞活力(viability)并且剩余的细胞呈现成纤维细胞形态。

图24示出在转染siRNA以抑制NME6表达后96小时的人干细胞(A，B)和其中添加转染试剂但不具有siRNA或杂乱序列siRNA的对照细胞(C，D)的放大照片。尽管NME6抑制的细胞具有如以泳道B中的细胞簇的更明亮的变厚中心能够看到的分化细胞的区域，但NME6抑制的细胞与对照细胞的比较示出非常小的区别。注意，将干细胞平铺在也起到MUC1*刺激生长因子作用的二价抗-MUC1*抗体的层上。

图25示出RT-PCR实验的图，其中，在转染siRNA以抑制NME1、NME6、或NME7后的96小时，在人干细胞中测量多能性基因NANOG、OCT4和KLF4，或分化标志物FOXA2，加上NME1、NME6和NME7基因的表达。每隔48小时更换不含生长因子、血清或细胞因子的最小培养基，但注意，将干细胞平铺在也起到MUC1*刺激生长因子的作用的二价抗-MUC1*抗体的层上。NME7的抑制表明分化标志物FOXA2的表达的显著增加。

图26A-图26D示出人HES-3干细胞的放大照片，已经在不含生长因子、血清或细胞因子并且补充有NME7单体(A，C)或NME1(NM23-H1)二聚体(B，D)的最小培养基中培养所述人HES-3干细胞。

图27A-图27B示出表明NME7单体具有两个用于MUC1*胞外结构域的PSMGFR肽的结合位点的ELISA夹心式测定的图。将合成PSMGFR肽固定在多孔板的表面上，并且针对与肽的结合(A)，测试重组人NME7(A和B结构域，并且没有M前导序列)蛋白质，然后由组氨酸标记的PSMGFR肽结合，通过使用针对组氨酸标签(B)的抗体检测该肽。

图28示出作为NME1六聚体的浓度的函数的T47D乳癌细胞生长的图；实验表明NME1六聚体抑制癌细胞生长。

图29A-图29E示出响应用一定浓度范围内的NME1六聚体治疗的DU145前列腺癌细胞的入侵百分比的图(A)，以及细胞迁移试验孔的照片(B-E)，其中，穿过生长癌细胞的领域蚀刻了十字，并且作为时间的函数测定了它们迁移穿过空隙的能力。照片是在时间零(B，C)和在16小时(D，E)拍摄的，其中，将12uM的NME1六聚体添加至细胞(C，E)，并且将单独的缓冲液添加至对照细胞(B，D)。NME1六聚体抑制癌细胞迁移。

图30A-图30K示出响应用一定浓度范围内的NME1二聚体治疗的DU145前列腺癌细胞的入侵百分比的图(A)，以及细胞迁移试验孔的照片(B-K)，其中，在时间零(B-F)穿过生长癌细胞的领域蚀刻了斜线标志，并且在16小时(G-K)测定了它们迁移穿过空隙的能力。NME1二聚体没有抑制癌细胞迁移。注意，NME1二聚体诱导癌细胞在最佳浓度(4-16nM)下生长，其中，一个nME1二聚体使两个MUC1*受体二聚化；在非常高的浓度下，每个NME1二聚体结合至单个MUC1*受体并且抑制癌细胞生长和迁移。

具体实施方式

在本申请中，“一个(a)”和“一种(an)”用于指一个或多个对象。

如在本文中使用的，“生物活性的”NME多聚体包括诱导起始细胞回复至较不成熟状态或抑制未成熟细胞的分化，或维持细胞的未成熟状态的NME多聚体。

如在本文中使用的，“生物学无活性的”NME多聚体包括不诱导起始细胞回复至较不成熟状态或不抑制未成熟细胞的分化，或不维持细胞的未成熟状态的NME多聚体。

如在本文中使用的，“增加MUC1*活性”是指直接或间接增加MUC1*信号，并且包括但不限于MUC1*受体的二聚化以及通过切割MUC1受体来增加MUC1*产量。也可以通过MUC1受体的较高转录表达增加MUC1*活性，该MUC1受体被进一步切割和二聚。因此，在一个方面，可以通过使MUC1*二聚的效应分子的较高活性、或切割MUC1从而形成MUC1*的切割分子的较高活性、或MUC1的表达增加而增加MUC1*活性。因此，能够增加MUC1*二聚配体的活性的任何化学物质或生物物质、形成MUC1*的MUC1切割酶、或增强MUC1的表达的任何转录激活剂(激活子)被包含作为“增加MUC1*活性”的物质。

如在本文中使用的，“MUC1生长因子受体”(MGFR)是功能性定义，指与激活配体(如生长因子)或修饰酶(如切割酶)相互作用的MUC1受体的部分。MUC1的MGFR区域是最接近细胞表面的细胞外部分，并且将所述MGFR区域定义为以下所定义的PSMGFR的大部分或全部。MGFR包括未修饰的肽和已经经受酶修饰如，例如，磷酸化、糖基化等的肽。

如在本文中使用的，“MUC1生长因子受体的一级序列”(PSMGFR，Primary Sequence of the MUC1Growth Factor Receptor)是指在某些情况下定义MGFR的大部分或全部的肽序列，以及肽序列的功能性变体和片段。将PSMGFR定义为SEQ ID NO:6，并且其所有功能性变体和片段具有最多达20个(即，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20个)的任何整数值的氨基酸置换(替换)，和/或在其N端和/或C端的最多达20个的任何整数值的氨基酸添加或缺失。上文中的“功能性变体或片段”是指具有特异性结合至配体或以其他方式与配体特异性相互作用的能力的这种变体或片段，所述配体特异性结合至SEQID NO:6的肽或以其他方式与SEQ ID NO:6的肽特异性相互作用，同时不强力结合至与它们本身相同的其他肽分子的相同区域，使得肽分子具有与其他相同肽分子聚集(即，自聚集)的能力。作为SEQ NO:6的PSMGFR肽的功能性变体的PSMGFR的一个实例是SEQ ID NO:8，其通过包含代替-SRY-的-SPY-序列而与SEQ ID NO:6相区别。

如在本文中使用的，“MUC1*”是指其中N端被截短使得胞外结构域基本上由PSMGFR组成的MUC1蛋白质(SEQ ID NO:5)。

如在本文中使用的，“MUC1*相关因子”是指修饰、激活、调节MUC1*的活性或调节MUC1*的表达的试剂。MUC1*相关因子包括不限于影响MUC1*受体的二聚化、增加MUC1*的产量、诱导MUC1受体的切割的试剂，通过MUC1受体(其被进一步切割和二聚)的较高转录表达来增加MUC1*活性的试剂。

如在本文中使用的，“有效量”是足以影响有益的或期望的临床结果或生物化学结果的量。能够一次或多次给予有效量。对于本发明的目的，抑制剂化合物的有效量是足以诱导或保持细胞的多能性或激活MUC1*的量。

如在本文中使用的，“片段”或“功能衍生物”是指本发明的天然配体(native ligand)或受体的生物活性的氨基酸序列变体和片段以及共价修饰物，包括通过与有机衍生剂反应得到的衍生物、翻译后修饰物、具有非蛋白质性质的聚合物的衍生物以及免疫粘附素(immunoadhesins)。

如在本文中使用的，“未成熟”细胞是指能够经历至少一步或多步分化以及表达已知能够经历至少一步或多步分化的特定细胞类型的标志物的细胞。

如在本文中使用的，“具有比起始细胞较不成熟状态的细胞”是指已经去分化、从而具有比起始细胞增加的分化为不同细胞类型的能力或具有比起始细胞增加的分化为更多细胞类型的能力的细胞。通过测量多能性标志物的表达的增加、通过确定多能性标志物的表达水平与多能干细胞的表达水平相近或通过测量比起始细胞较不成熟状态的标志物可以识别较不成熟状态的细胞。例如，由CD34的表达和CD38的缺失表征能够分化为任何血细胞类型的造血干细胞。当这些细胞分化时，它们从CD34+/CD38-至CD34+/CD38-，然后至CD34-/CD38+。如果诱导CD34-/CD38+细胞回复至较不成熟状态，细胞将重新获得CD34的表达。转分化技术涉及使起始细胞回复至较不成熟状态，其中，即使起始细胞与得到的细胞在相同的相对分化水平，细胞也变得不稳定并且能够将其引导分化为相比起始细胞的分化细胞类型(Iede等，2010；Efe等，2011)。例如，心脏成纤维细胞已经通过OCT4、SOX2、KLF4和c-MYC的短暂异位表达(brief ectopicexpression)回复至较不成熟状态，然后由该不稳定状态分化为心肌细胞。

如在本文中使用的，“配体”是指特异性共价或瞬时结合至分子(如多肽)的任何分子或试剂、或化合物。当在某些情况下使用时，配体可以包括抗体。在其他情况下，“配体”可以指旨在被另一种分子以高亲和力结合的分子，如但不限于用于MUC1*的天然或非天然配体、或结合至MUC1或MUC1*的切割酶、或用于MUC1*的二聚配体。

如在本文中使用的，“原始态干细胞(stem cell)”是类似于胚泡(blastocyst)的内细胞团(inner mass)细胞并且具有胚泡的内细胞团细胞的可量化特征的那些。与始发态干细胞(primed stem cells)相比，原始态干细胞具有某些基因表达上的可量化的区别，所述始发态干细胞类似于胚泡的外胚层部分的细胞并且具有胚泡的外胚层部分的细胞的特性(trait)和特征。值得注意地是，雌性来源的原始态干细胞具有两个活性X染色体，称为XaXa，而后者雌性来源的始发态干细胞具有失活的X染色体中的一个(Nichols和Smith，)。

如在本文中使用的，“NME”家族蛋白质是十(10)种蛋白质的家族，近来已经发现了其中的一些，其中，尽管多个NME家族成员没有激酶活性，但通过它们与核苷二磷酸激酶(NDPK)结构域的共享序列同源性对它们进行分类。随着NME蛋白质的发现，先前已知它们为NM23-H1和NM23-H2，随后为NM23-H3至NM23-10。不同的NME蛋白质功能不同。在本文中，NME1和NME6结合至MUC1*受体并且当它们为二聚体形式时使MUC1*受体(其中，其胞外结构域基本上由PSMGFR序列组成)二聚；NME7具有两(2)个用于MUC1*受体胞外结构域的结合位点并且也使受体二聚。NME1二聚体、NME6二聚体和NME7是用作MUC1*配体以诱导或将细胞保持在比起始细胞较不成熟的状态的优选的NME家族成员。也考虑将能够结合至MUC1*受体并且使MUC1*受体二聚的其他NME家族成员用作MUC1*配体以诱导或将细胞保持在比起始细胞较不成熟的状态。

如在本文中使用的，“多能性标志物”是当细胞回复至比起始细胞较不成熟的状态时其表达增加的那些基因和蛋白质。多能性标志物包括OCT4、SOX2、NANOG、KLF4、KLF2、Tra 1-60、Tra 1-81、SSEA4、和REX-1以及之前描述的其他的和目前发现的那些。例如，成纤维细胞表达不可检出的或低水平的这些多能性标志物，但表达成纤维细胞分化标志物，称为CD13。为了确定细胞是否变得比起始细胞较不成熟，可以测量起始细胞和得到的细胞之间的多能性标志物的表达水平的区别。

如在本文中使用的，“始发态干细胞”是类似于胚泡的外胚层部分的细胞并且具有胚泡的外胚层部分的细胞的特性和特征的细胞。

如在本文中使用的，术语“特异性结合”是指两种分子之间的非随机结合反应，例如，抗体分子与抗原之间的免疫反应，或非抗体配体与另一种多肽(如与MUC1*特异性结合的NM23、或结合至MUC1*的抗体、或结合至MUC1或MUC1*的切割酶)反应。

如在本文中使用的，“多能”干细胞是指能够分化为所有三个种系(germline)：内胚层、外胚层和中胚层以分化为体内任何细胞类型、但不能产生完整的有机体的干细胞。全能干细胞(totipotent stem cell)是能够分化或成熟为完整的有机体(如人类)的一种(细胞)。关于胚胎多能干细胞，它们是源自胚泡的内细胞团的细胞。典型的多能性标志物是OCT4、KLF4、NANOG、Tra 1-60、Tra 1-81和SSEA4。

如在本文中使用的，“专能(multipotent)”干细胞是指能够分化为其他细胞类型的干细胞，其中，不同细胞类型的数目是有限的。

如在本文中使用的，“半多能”或“前-iPS状态(pre-iPS state)”是指具有多能干细胞的一些或所有形态特征，但其多能性标志物的表达水平或其分化为所有三个种系的能力低于多能干细胞的水平或能力的细胞。

如在本文中使用的，“干细胞样”形态是指类似于干细胞的形态、多能性基因的一种或多种的表达水平、或分化为多种细胞类型的能力的形态。干细胞样形态是当细胞具有圆形形状并且与它们的细胞核的大小相比非常小时的形态，其往往具有大的细胞核与细胞质比率，该比率是多能干细胞的特征。通过比较，成纤维细胞形态是当细胞具有长的、细长形状(纺锤形)并且不具有大的细胞核与细胞质比率时的形态。此外，多能干细胞是非粘附的，而其他细胞类型(如成纤维细胞)是粘附的。

如在本文中使用的，“载体”、“多核苷酸载体”、“构建体”和“多核苷酸构建体”在本文中可互换使用。本发明的多核苷酸载体可以是几种形式中的任一种，包括但不限于RNA、DNA、包封在逆转录病毒外壳(coat)中的RNA、包封在腺病毒外壳中的DNA、包装在另一种病毒或病毒样形式(如单纯疱疹、和腺相关病毒(AAV))中的DNA、包封在脂质体中的DNA、与聚赖氨酸复合、与合成聚阳离子分子复合、与化合物(如聚乙二醇(PEG))复合以免疫“掩蔽(mask)”分子和/或增加半衰期、或结合至非病毒蛋白质的DNA。优选地，多核苷酸是DNA。如在本文中使用的，“DNA”不仅包括碱基A、T、C、和G，而且包括它们的任何类似物或这些碱基的修饰形式，如甲基化的核苷酸、内核苷酸修饰物如不带电荷的键和硫代酯(thioate)、糖类似物的使用以及修饰的和/或可替代的骨架结构如聚酰胺。

如在本文中使用的，“多聚体”是指共价连接在一起或彼此非共价稠合的多个单体。

如在本文中使用的，“高阶多聚体”是指共价连接在一起或彼此非共价稠合的多个单体，所述高阶多聚体大于二聚体。

序列表自由文本

关于除了a、g、c、t之外的核苷酸符号的使用，它们遵循在WIPOStandard ST.25，附录2表1中列出的惯例，其中，k表示t或g；n表示a、c、t或g；m表示a或c；r表示a或g；s表示c或g；w表示a或t以及y表示c或t。

MTPGTQSPFF LLLLLTVLTV VTGSGHASST PGGEKETSAT QRSSVPSSTEKNAVSMTSSV LSSHSPGSGS STTQGQDVTL APATEPASGS AATWGQDVTSVPVTRPALGS TTPPAHDVTS APDNKPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGSTAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTSAPDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGSTAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTSAPDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGSTAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTSAPDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGSTAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTSAPDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGSTAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTSAPDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGSTAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTSAPDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGSTAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTSAPDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGSTAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTSAPDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDNRPALGSTAPPVHNVTS ASGSASGSAS TLVHNGTSAR ATTTPASKST PFSIPSHHSDTPTTLASHST KTDASSTHHS SVPPLTSSNH STSPQLSTGV SFFFLSFHISNLQFNSSLED PSTDYYQELQ RDISEMFLQI YKQGGFLGLS NIKFRPGSVVVQLTLAFREG TINVHDVETQ FNQYKTEAAS RYNLTISDVS VSDVPFPFSAQSGAGVPGWG IALLVLVCVL VALAIVYLIA LAVCQCRRKN YGQLDIFPARDTYHPMSEYP TYHTHGRYVP PSSTDRSPYE KVSAGNGGSS LSYTNPAVAAASANL(SEQ ID NO:1)描述了全长MUC1受体(粘蛋白1前体，Genbank登录号：P15941)。

MTPGTQSPFFLLLLLTVLT (SEQ ID NO:2)

MTPGTQSPFFLLLLLTVLT VVTA (SEQ ID NO:3)

MTPGTQSPFFLLLLLTVLT VVTG (SEQ ID NO:4)

SEQ ID NO:2、3和4描述了用于将MUC1受体和截短的同种型引导至细胞膜表面的N端MUC-1信号序列。如通过SEQ ID NO:2、3和4中的变体所示出的，在C末端可以缺失最多达3个氨基酸残基。

GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGAGVPGWGIALLVLVCVLVALAIVYLIALAVCQCRRKNYGQLDIFPARDTYHPMSEYPTYHTHGRYVPPSSTDRSPYEKVSAGNGGSSLSYTNPAVAAASANL(SEQ IDNO:5)描述了在其N端具有nat-PSMGFR并且包括全长MUC1受体的跨膜和细胞质序列的截短的MUC1受体同种型。

GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(SEQ IDNO:6)描述了MUC1生长因子受体的天然一级序列(primary sequence)(nat-PSMGFR-“PSMGFR”的实例)：

TINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(SEQ IDNO:7)描述了在SEQ ID NO:6的N端具有一个氨基酸缺失的MUC1生长因子受体的天然一级序列(nat-PSMGFR-“PSMGFR”的实例)。

GTINVHDVETQFNQYKTEAASPYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(SEQID NO:8)描述了具有增强的稳定性的MUC1生长因子受体的天然一级序列的“SPY”功能变体(var-PSMGFR，“PSMGFR”的实例)。

TINVHDVETQFNQYKTEAASPYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(SEQID NO:9)描述了具有增强的稳定性并且在SEQ ID NO:8的C端具有一个氨基酸缺失的MUC1生长因子受体的天然一级序列的“SPY”功能变体(var-PSMGFR，“PSMGFR”的实例)。

tgtcagtgccgccgaaagaactacgggcagctggacatctttccagcccgggatacctaccatcctatgagcgagtaccccacctaccacacccatgggcgctatgtgccccctagcagtaccgatcgtagcccctatgagaaggtttctgcaggtaacggtggcagcagcctctcttacacaaacccagcagtggcagccgcttctgccaacttg(SEQ ID NO:10)描述了MUC1细胞质结构域的核苷酸序列。

CQCRRKNYGQLDIFPARDTYHPMSEYPTYHTHGRYVPPSSTDRSPYEKVSAGNGGSSLSYTNPAVAAASANL(SEQ ID NO:11)描述了MUC1细胞质结构域的氨基酸序列。

人NM23H1

(DNA)

atggccaactgtgagcgtaccttcattgcgatcaaaccagatggggtccagcggggtcttgtgggagagattatcaagcgttttgagcagaaaggattccgccttgttggtctgaaattcatgcaagcttccgaagatcttctcaaggaacactacgttgacctgaaggaccgtccattctttgccggcctggtgaaatacatgcactcagggccggtagttgccatggtctgggaggggctgaatgtggtgaagacgggccgagtcatgctcggggagaccaaccctgcagactccaagcctgggaccatccgtggagacttctgcatacaagttggcaggaacattatacatggcagtgattctgtggagagtgcagagaaggagatcggcttgtggtttcaccctgaggaactggtagattacacgagctgtgctcagaactggatctatgaatga(SEQ ID NO:12)

(氨基酸)

MANCERTFIAIKPDGVQRGLVGEIIKRFEQKGFRLVGLKFMQASEDLLKEHYVDLKDRPFFAGLVKYMHSGPVVAMVWEGLNVVKTGRVMLGETNPADSKPGTIRGDFCIQVGRNIIHGSDSVESAEKEIGLWFHPEELVDYTSCAQNWIYE-(SEQ ID NO:13)

小鼠NM23H1

(DNA)

atggccaacagtgagcgcaccttcattgccatcaagcctgatggggtccagcgggggctggtgggcgagatcatcaagcggttcgagcagaaggggttccgccttgttggtctgaagtttctgcaggcttcagaggaccttctcaaggagcactacactgacctgaaggaccgccccttctttactggcctggtgaaatacatgcactcaggaccagtggttgctatggtctgggagggtctgaatgtggtgaagacaggccgcgtgatgcttggagagaccaaccccgcagactctaagcctgggaccatacgaggagacttctgcatccaagttggcaggaacatcattcatggcagcgattctgtaaagagcgcagagaaggagatcagcttgtggtttcagcctgaggagctggtggagtacaagagctgtgcgcagaactggatctatgagtga(SEQ ID NO:14)

(氨基酸)

MANSERTFIAIKPDGVQRGLVGEIIKRFEQKGFRLVGLKFLQASEDLLKEHYTDLKDRPFFTGLVKYMHSGPVVAMVWEGLNVVKTGRVMLGETNPADSKPGTIRGDFCIQVGRNIIHGSDSVKSAEKEISLWFQPEELVEYKSCAQNWIYE-(SEQ ID NO:15)

人NM23H2

(DNA)

atggccaacctggagcgcaccttcatcgccatcaagccggacggcgtgcagcgcggcctggtgggcgagatcatcaagcgcttcgagcagaagggattccgcctcgtggccatgaagttcctccgggcctctgaagaacacctgaagcagcactacattgacctgaaagaccgaccattcttccctgggctggtgaagtacatgaactcagggccggttgtggccatggtctgggaggggctgaacgtggtgaagacaggccgagtgatgcttggggagaccaatccagcagattcaaagccaggcaccattcgtggggacttctgcattcaggttggcaggaacatcattcatggcagtgattcagtaaaaagtgctgaaaaagaaatcagcctatggtttaagcctgaagaactggttgactacaagtcttgtgctcatgactgggtctatgaataa(SEQ ID NO:16)

(氨基酸)

MANLERTFIAIKPDGVQRGLVGEIIKRFEQKGFRLVAMKFLRASEEHLKQHYIDLKDRPFFPGLVKYMNSGPVVAMVWEGLNVVKTGRVMLGETNPADSKPGTIRGDFCIQVGRNIIHGSDSVKSAEKEISLWFKPEELVDYKSCAHDWVYE-(SEQ ID NO:17)

小鼠NM23H2

(DNA)

atggccaacctcgagcgtaccttcattgccatcaagccagatggcgtgcagcgcggcctggtgggcgagatcatcaaacggttcgagcagaaggggttccgcctggtggccatgaagttccttcgggcctctgaagaacacctgaagcagcattacatcgacctgaaagaccgtcctttcttcccggggctggtgaagtacatgaactcggggcccgtggtggccatggtctgggaggggctcaatgtggtgaaaacgggccgagtgatgctgggggagaccaatccagctgattcaaaaccaggcaccatccgtggggatttctgcattcaagttggcaggaacatcattcatggcagtgattcagtggagagtgctgagaaagagatccatctgtggtttaagcccgaagaactgatcgactacaagtcttgtgcccatgactgggtgtacgagtag(SEQ ID NO:18)

(氨基酸)

MANLERTFIAIKPDGVQRGLVGEIIKRFEQKGFRLVAMKFLRASEEHLKQHYIDLKDRPFFPGLVKYMNSGPVVAMVWEGLNVVKTGRVMLGETNPADSKPGTIRGDFCIQVGRNIIHGSDSVESAEKEIHLWFKPEELIDYKSCAHDWVYE-(SEQ ID NO:19)

小鼠NME6

(DNA)

Atgacctccatcttgcgaagtccccaagctcttcagctcacactagccctgatcaagcctgatgcagttgcccacccactgatcctggaggctgttcatcagcagattctgagcaacaagttcctcattgtacgaacgagggaactgcagtggaagctggaggactgccggaggttttaccgagagcatgaagggcgttttttctatcagcggctggtggagttcatgacaagtgggccaatccgagcctatatccttgcccacaaagatgccatccaactttggaggacactgatgggacccaccagagtatttcgagcacgctatatagccccagattcaattcgtggaagtttgggcctcactgacacccgaaatactacccatggctcagactccgtggtttccgccagcagagagattgcagccttcttccctgacttcagtgaacagcgctggtatgaggaggaggaaccccagctgcggtgtggtcctgtgcactacagtccagaggaaggtatccactgtgcagctgaaacaggaggccacaaacaacctaacaaaacctag(SEQ ID NO:20)

(氨基酸)

MTSILRSPQALQLTLALIKPDAVAHPLILEAVHQQILSNKFLIVRTRELQWKLEDCRRFYREHEGRFFYQRLVEFMTSGPIRAYILAHKDAIQLWRTLMGPTRVFRARYIAPDSIRGSLGLTDTRNTTHGSDSVVSASREIAAFFPDFSEQRWYEEEEPQLRCGPVHYSPEEGIHCAAETGGHKQPNKT-(SEQID NO:21)

人NME6：

(DNA)

Atgacccagaatctggggagtgagatggcctcaatcttgcgaagccctcaggctctccagctcactctagccctgatcaagcctgacgcagtcgcccatccactgattctggaggctgttcatcagcagattctaagcaacaagttcctgattgtacgaatgagagaactactgtggagaaaggaagattgccagaggttttaccgagagcatgaagggcgttttttctatcagaggctggtggagttcatggccagcgggccaatccgagcctacatccttgcccacaaggatgccatccagctctggaggacgctcatgggacccaccagagtgttccgagcacgccatgtggccccagattctatccgtgggagtttcggcctcactgacacccgcaacaccacccatggttcggactctgtggtttcagccagcagagagattgcagccttcttccctgacttcagtgaacagcgctggtatgaggaggaagagccccagttgcgctgtggccctgtgtgctatagcccagagggaggtgtccactatgtagctggaacaggaggcctaggaccagcctga(SEQID NO:22)

(氨基酸)

MTQNLGSEMASILRSPQALQLTLALIKPDAVAHPLILEAVHQQILSNKFLIVRMRELLWRKEDCQRFYREHEGRFFYQRLVEFMASGPIRAYILAHKDAIQLWRTLMGPTRVFRARHVAPDSIRGSFGLTDTRNTTHGSDSVVSASREIAAFFPDFSEQRWYEEEEPQLRCGPVCYSPEGGVHYVAGTGGLGPA-(SEQ ID NO:23)

人NME61：

(DNA)

Atgacccagaatctggggagtgagatggcctcaatcttgcgaagccctcaggctctccagctcactctagccctgatcaagcctgacgcagtcgcccatccactgattctggaggctgttcatcagcagattctaagcaacaagttcctgattgtacgaatgagagaactactgtggagaaaggaagattgccagaggttttaccgagagcatgaagggcgttttttctatcagaggctggtggagttcatggccagcgggccaatccgagcctacatccttgcccacaaggatgccatccagctctggaggacgctcatgggacccaccagagtgttccgagcacgccatgtggccccagattctatccgtgggagtttcggcctcactgacacccgcaacaccacccatggttcggactctgtggtttcagccagcagagagattgcagccttcttccctgacttcagtgaacagcgctggtatgaggaggaagagccccagttgcgctgtggccctgtgtga(SEQ ID NO:24)

(氨基酸)

MTQNLGSEMASILRSPQALQLTLALIKPDAVAHPLILEAVHQQILSNKFLIVRMRELLWRKEDCQRFYREHEGRFFYQRLVEFMASGPIRAYILAHKDAIQLWRTLMGPTRVFRARHVAPDSIRGSFGLTDTRNTTHGSDSVVSASREIAAFFPDFSEQRWYEEEEPQLRCGPV-(SEQ ID NO:25)

人NME62：

(DNA)

Atgctcactctagccctgatcaagcctgacgcagtcgcccatccactgattctggaggctgttcatcagcagattctaagcaacaagttcctgattgtacgaatgagagaactactgtggagaaaggaagattgccagaggttttaccgagagcatgaagggcgttttttctatcagaggctggtggagttcatggccagcgggccaatccgagcctacatccttgcccacaaggatgccatccagctctggaggacgctcatgggacccaccagagtgttccgagcacgccatgtggccccagattctatccgtgggagtttcggcctcactgacacccgcaacaccacccatggttcggactctgtggtttcagccagcagagagattgcagccttcttccctgacttcagtgaacagcgctggtatgaggaggaagagccccagttgcgctgtggccctgtgtga(SEQ ID NO:26)

(氨基酸)

MLTLALIKPDAVAHPLILEAVHQQILSNKFLIVRMRELLWRKEDCQRFYREHEGRFFYQRLVEFMASGPIRAYILAHKDAIQLWRTLMGPTRVFRARHVAPDSIRGSFGLTDTRNTTHGSDSVVSASREIAAFFPDFSEQRWYEEEEPQLRCGPV-(SEQ ID NO:27)

人NME63：

(DNA)

Atgctcactctagccctgatcaagcctgacgcagtcgcccatccactgattctggaggctgttcatcagcagattctaagcaacaagttcctgattgtacgaatgagagaactactgtggagaaaggaagattgccagaggttttaccgagagcatgaagggcgttttttctatcagaggctggtggagttcatggccagcgggccaatccgagcctacatccttgcccacaaggatgccatccagctctggaggacgctcatgggacccaccagagtgttccgagcacgccatgtggccccagattctatccgtgggagtttcggcctcactgacacccgcaacaccacccatggttcggactctgtggtttcagccagcagagagattgcagccttcttccctgacttcagtgaacagcgctggtatgaggaggaagagccccagttgcgctgtggccctgtgtgctatagcccagagggaggtgtccactatgtagctggaacaggaggcctaggaccagcctga(SEQ ID NO:28)

(氨基酸)

MLTLALIKPDAVAHPLILEAVHQQILSNKFLIVRMRELLWRKEDCQRFYREHEGRFFYQRLVEFMASGPIRAYILAHKDAIQLWRTLMGPTRVFRARHVAPDSIRGSFGLTDTRNTTHGSDSVVSASREIAAFFPDFSEQRWYEEEEPQLRCGPVCYSPEGGVHYVAGTGGLGPA-(SEQ ID NO:29)

人NM23-H7-1

(DNA)

atgaatcatagtgaaagattcgttttcattgcagagtggtatgatccaaatgcttcacttcttcgacgttatgagcttttattttacccaggggatggatctgttgaaatgcatgatgtaaagaatcatcgcacctttttaaagcggaccaaatatgataacctgcacttggaagatttatttataggcaacaaagtgaatgtcttttctcgacaactggtattaattgactatggggatcaatatacagctcgccagctgggcagtaggaaagaaaaaacgctagccctaattaaaccagatgcaatatcaaaggctggagaaataattgaaataataaacaaagctggatttactataaccaaactcaaaatgatgatgctttcaaggaaagaagcattggattttcatgtagatcaccagtcaagaccctttttcaatgagctgatccagtttattacaactggtcctattattgccatggagattttaagagatgatgctatatgtgaatggaaaagactgctgggacctgcaaactctggagtggcacgcacagatgcttctgaaagcattagagccctctttggaacagatggcataagaaatgcagcgcatggccctgattcttttgcttctgcggccagagaaatggagttgttttttccttcaagtggaggttgtgggccggcaaacactgctaaatttactaattgtacctgttgcattgttaaaccccatgctgtcagtgaaggactgttgggaaagatcctgatggctatccgagatgcaggttttgaaatctcagctatgcagatgttcaatatggatcgggttaatgttgaggaattctatgaagtttataaaggagtagtgaccgaatatcatgacatggtgacagaaatgtattctggcccttgtgtagcaatggagattcaacagaataatgctacaaagacatttcgagaattttgtggacctgctgatcctgaaattgcccggcatttacgccctggaactctcagagcaatctttggtaaaactaagatccagaatgctgttcactgtactgatctgccagaggatggcctattagaggttcaatacttcttcaagatcttggataattag(SEQ ID NO:30)

(氨基酸)

MNHSERFVFIAEWYDPNASLLRRYELLFYPGDGSVEMHDVKNHRTFLKRTKYDNLHLEDLFIGNKVNVFSRQLVLIDYGDQYTARQLGSRKEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFFKILDN-(SEQ ID NO:31)

用于大肠杆菌(E.coli)表达的优化的人NM23-H7-1序列

(DNA)

atgaatcactccgaacgctttgtttttatcgccgaatggtatgacccgaatgcttccctgctgcgccgctacgaactgctgttttatccgggcgatggtagcgtggaaatgcatgacgttaaaaatcaccgtacctttctgaaacgcacgaaatatgataatctgcatctggaagacctgtttattggcaacaaagtcaatgtgttctctcgtcagctggtgctgatcgattatggcgaccagtacaccgcgcgtcaactgggtagtcgcaaagaaaaaacgctggccctgattaaaccggatgcaatctccaaagctggcgaaattatcgaaattatcaacaaagcgggtttcaccatcacgaaactgaaaatgatgatgctgagccgtaaagaagccctggattttcatgtcgaccaccagtctcgcccgtttttcaatgaactgattcaattcatcaccacgggtccgattatcgcaatggaaattctgcgtgatgacgctatctgcgaatggaaacgcctgctgggcccggcaaactcaggtgttgcgcgtaccgatgccagtgaatccattcgcgctctgtttggcaccgatggtatccgtaatgcagcacatggtccggactcattcgcatcggcagctcgtgaaatggaactgtttttcccgagctctggcggttgcggtccggcaaacaccgccaaatttaccaattgtacgtgctgtattgtcaaaccgcacgcagtgtcagaaggcctgctgggtaaaattctgatggcaatccgtgatgctggctttgaaatctcggccatgcagatgttcaacatggaccgcgttaacgtcgaagaattctacgaagtttacaaaggcgtggttaccgaatatcacgatatggttacggaaatgtactccggtccgtgcgtcgcgatggaaattcagcaaaacaatgccaccaaaacgtttcgtgaattctgtggtccggcagatccggaaatcgcacgtcatctgcgtccgggtaccctgcgcgcaatttttggtaaaacgaaaatccagaacgctgtgcactgtaccgatctgccggaagacggtctgctggaagttcaatactttttcaaaattctggataattag(SEQ ID NO:32)

(氨基酸)

MNHSERFVFIAEWYDPNASLLRRYELLFYPGDGSVEMHDVKNHRTFLKRTKYDNLHLEDLFIGNKVNVFSRQLVLIDYGDQYTARQLGSRKEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFFKILDN-(SEQ ID NO:33)

人NM23-H7-2

(DNA)

atgcatgatgtaaagaatcatcgcacctttttaaagcggaccaaatatgataacctgcacttggaagatttatttataggcaacaaagtgaatgtcttttctcgacaactggtattaattgactatggggatcaatatacagctcgccagctgggcagtaggaaagaaaaaacgctagccctaattaaaccagatgcaatatcaaaggctggagaaataattgaaataataaacaaagctggatttactataaccaaactcaaaatgatgatgctttcaaggaaagaagcattggattttcatgtagatcaccagtcaagaccctttttcaatgagctgatccagtttattacaactggtcctattattgccatggagattttaagagatgatgctatatgtgaatggaaaagactgctgggacctgcaaactctggagtggcacgcacagatgcttctgaaagcattagagccctctttggaacagatggcataagaaatgcagcgcatggccctgattcttttgcttctgcggccagagaaatggagttgttttttccttcaagtggaggttgtgggccggcaaacactgctaaatttactaattgtacctgttgcattgttaaaccccatgctgtcagtgaaggactgttgggaaagatcctgatggctatccgagatgcaggttttgaaatctcagctatgcagatgttcaatatggatcgggttaatgttgaggaattctatgaagtttataaaggagtagtgaccgaatatcatgacatggtgacagaaatgtattctggcccttgtgtagcaatggagattcaacagaataatgctacaaagacatttcgagaattttgtggacctgctgatcctgaaattgcccggcatttacgccctggaactctcagagcaatctttggtaaaactaagatccagaatgctgttcactgtactgatctgccagaggatggcctattagaggttcaatacttcttcaagatcttggataattga(SEQ ID NO:34)

(氨基酸)

MHDVKNHRTFLKRTKYDNLHLEDLFIGNKVNVFSRQLVLIDYGDQYTARQLGSRKEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFFKILDN-(SEQ ID NO:35)

小鼠NM23-H7-1

(DNA)

atgagagcctgtcagcagggaagaagttccagtttggtttctccatatatggcacccaagaatcagagcgagagattcgctttcattgcagagtggtatgatccaaatgcttcattgctccgacgctatgagctgctgttttaccccacagacggatctgttgaaatgcatgatgtaaagaatcgtcgcaccttcttaaagcggaccaagtatgaggacctgcgcctggaagatctatttataggcaacaaagtcaatgtgttttctcgacagctggtgttgattgactatggggaccaatacacagcccgccagctgggcagcaggaaagagaaaactttagccctgatcaaaccagatgcagtgtcaaaggccggagaaatcattgagatgataaacaaaagtggatttactataaccaaactccgaatgatgactctgacaaggaaagaagcagcggactttcatgtagaccatcactcaagacctttttataacgaactgatccagtttatcacaagtgggcctgttattgccatggagatcttaagagatgacgcgatctgtgagtggaaaaggttgcttggacccgcaaactctgggctatcacggacagatgcccccggaagcatccgagccctctttgggacagatggcgtgagaaatgcagctcacggccctgatacttttgcatctgctgccagagaaatggaattgttttttccttcaagtggaggctgtgggccagcgaacactgctaaatttaccaattgcacctgttgcatcattaagcctcatgctatcagtgaaggaatgttgggaaagattttaatagctattcgggatgcatgctttggaatgtcagcgatacagatgttcaatttggatcgggctaatgttgaagaattctatgaagtctataaaggtgtagtgtctgagtataatgatatggtgacagagctgtgctccggcccttgcgtagcaatagagatccaacagagcaaccctacaaagacatttcgagaattctgcggacctgctgatcctgaaatcgcccggcatttacgacctgagaccctcagggcaatttttggtaaaactaaggttcaaaatgctgttcattgcacggatctgccggaggatgggctcctggaggtccagtatttcttcaagatcttggataattag(SEQ ID NO:36)

(氨基酸)

MRACQQGRSSSLVSPYMAPKNQSERFAFIAEWYDPNASLLRRYELLFYPTDGSVEMHDVKNRRTFLKRTKYEDLRLEDLFIGNKVNVFSRQLVLIDYGDQYTARQLGSRKEKTLALIKPDAVSKAGEIIEMINKSGFTITKLRMMTLTRKEAADFHVDHHSRPFYNELIQFITSGPVIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGLSRTDAPGSIRALFGTDGVRNAAHGPDTFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIIKPHAISEGMLGKILIAIRDACFGMSAIQMFNLDRANVEEFYEVYKGVVSEYNDMVTELCSGPCVAIEIQQSNPTKTFREFCGPADPEIARHLRPETLRAIFGKTKVQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFFKILDN-(SEQ ID NO:37)

小鼠NM23-H7-2

(DNA)

atgagagcctgtcagcagggaagaagttccagtttggtttctccatatatggcacccaagaatcagagcgagagattcgctttcattgcagagtggtatgatccaaatgcttcattgctccgacgctatgagctgctgttttaccccacagacggatctgttgaaatgcatgatgtaaagaatcgtcgcaccttcttaaagcggaccaagtatgaggacctgcgcctggaagatctatttataggcaacaaagtcaatgtgttttctcgacagctggtgttgattgactatggggaccaatacacagcccgccagctgggcagcaggaaagagaaaactttagccctgatcaaaccagatgcagtgtcaaaggccggagaaatcattgagatgataaacaaaagtggatttactataaccaaactccgaatgatgactctgacaaggaaagaagcagcggactttcatgtagaccatcactcaagacctttttataacgaactgatccagtttatcacaagtgggcctgttattgccatggagatcttaagagatgacgcgatctgtgagtggaaaaggttgcttggacccgcaaactctgggctatcacggacagatgcccccggaagcatccgagccctctttgggacagatggcgtgagaaatgcagctcacggccctgatacttttgcatctgctgccagagaaatggaattgttttttccttcaagtggaggctgtgggccagcgaacactgctaaatttaccaattgcacctgttgcatcattaagcctcatgctatcagtgaagatttatttattcattatatgtaa(SEQ ID NO:38)

(氨基酸)

MRACQQGRSSSLVSPYMAPKNQSERFAFIAEWYDPNASLLRRYELLFYPTDGSVEMHDVKNRRTFLKRTKYEDLRLEDLFIGNKVNVFSRQLVLIDYGDQYTARQLGSRKEKTLALIKPDAVSKAGEIIEMINKSGFTITKLRMMTLTRKEAADFHVDHHSRPFYNELIQFITSGPVIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGLSRTDAPGSIRALFGTDGVRNAAHGPDTFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIIKPHAISEDLFIHYM-(SEQ ID NO:39)

小鼠NME8变体1

(DNA)

atggcaagcaaaaagcgtgaagtccagctacagtcagtcgtcaatagtcagaacttgtgggatgagatgttgctgaacaaaggcttaacagtgattgatgtttaccaagcctggtgtggaccttgcaaagccgtgcaaagtttattcagaaaactaaaaaatgaactgaacgaagatgagattcttcacttcgtcgttgctgaagctgacaacattgtgactctccagccatttagagataaatgtgagcccgtgtttctctttagtcttaatggtaaaatcattgcaaagattcagggtgcaaatgctccacttatcaatagaaaagtcattaccttgatagatgaagagaggaaaattgtagcaggtgaaatggatcgtcctcagtatgttgaaattccactagtagatgcaatcgatgaagaatatggggaagtacagtatgaaagtgctgcggaagtttacaatatggcaattatcaaacctgatgctgtactcatgagaaaaaatatagaagttagggaaaaaatagccaaagaaggatttgttatagaaatacaagaaaacctgattctccctgaagaggtagtgagggaattctacactcatatagcagaccagcctgactttgaagagtttgtcgtttctatgacaaatggcctcagctgtgtgctcattgtatctcaagaagactccgaggttattcaggaagaaactctcccgcagactgatacagaagaagaacctggcgttttggaagagcctcacgttaggtttgcacctgtgatgataaagaagaaacgggacagtttgcaagagtatatggaccgacagcatatgtctgattactgcgatgtcgaggacgatgcggttaaggtctctaagctcattgacatattattccctgattttaaaactatgaaaagcacgaatgtacaaacgacgctagcattactgcatccagacatctgtgaggaagagaaagatgacgtgttgaacgttattcacaatgaagggttcaccatactgatgcagaggcaaatcgtattatcagaggaagaagcaagaacagtgtgcaagatccatgaaaacgaagagtattttgataatcttatagggcacatgaccagtaatcactcttatgtccttgctctacggagggaaaatggtgtggaatattggaaaacattaattgggccaaaaacgattgaggaagcttatgcatctcatccacagagtttatgtgtacagtttgcttcagggaattttcctaccaaccagttctacgggagcagttcaaaagcagcagctgagaaggaaatagcgcatttcttccctccccagagcacacttgcattgatcaagcctcatgtgacacacaaagaaagaatggagatcctgaagaccattaaagaggcaggatttgagctgaccctgatgaaggaaatgcacctgactccagagcatgcaaacaaaatttatttcaaaataacaggaaaagatttttataaaaatgtattggaagtcttatctttgggcatgtcgctagtcatggttttgaccaagtggaatgctgttgcagaatggaggcgaatggttggcccagtagacccagaagaagcaaaactgctctccccagaatccctccgagccaaatatggactagacattttgagaaatgctgtccatggggcgtctaacttttctgaagcatcagaaatcattagtaatgtgttcacagagggtaatcctgagaactag(SEQ ID NO:40)

(氨基酸)

MASKKREVQLQSVVNSQNLWDEMLLNKGLTVIDVYQAWCGPCKAVQSLFRKLKNELNEDEILHFVVAEADNIVTLQPFRDKCEPVFLFSLNGKIIAKIQGANAPLINRKVITLIDEERKIVAGEMDRPQYVEIPLVDAIDEEYGEVQYESAAEVYNMAIIKPDAVLMRKNIEVREKIAKEGFVIEIQENLILPEEVVREFYTHIADQPDFEEFVVSMTNGLSCVLIVSQEDSEVIQEETLPQTDTEEEPGVLEEPHVRFAPVMIKKKRDSLQEYMDRQHMSDYCDVEDDAVKVSKLIDILFPDFKTMKSTNVQTTLALLHPDICEEEKDDVLNVIHNEGFTILMQRQIVLSEEEARTVCKIHENEEYFDNLIGHMTSNHSYVLALRRENGVEYWKTLIGPKTIEEAYASHPQSLCVQFASGNFPTNQFYGSSSKAAAEKEIAHFFPPQSTLALIKPHVTHKERMEILKTIKEAGFELTLMKEMHLTPEHANKIYFKITGKDFYKNVLEVLSLGMSLVMVLTKWNAVAEWRRMVGPVDPEEAKLLSPESLRAKYGLDILRNAVHGASNFSEASEIISNVFTEGNPEN^*(SEQ ID NO:41)

小鼠NME8变体2

(DNA)

atggcaagcaaaaagcgtgaagtccagctacagtcagtcgtcaatagtcagaacttgtgggatgagatgttgctgaacaaaggcttaacagtgattgatgtttaccaagcctggtgtggaccttgcaaagccgtgcaaagtttattcagaaaactaaaaaatgaactgaacgaagatgagattcttcacttcgtcgttgctgaagctgacaacattgtgactctccagccatttagagataaatgtgagcccgtgtttctctttagtcttaatggtaaaatcattgcaaagattcagggtgcaaatgctccacttatcaatagaaaagtcattaccttgatagatgaagagaggaaaattgtagcaggtgaaatggatcgtcctcagtatgttgaaattccactagtagatgcaatcgatgaagaatatggggaagtacagtatgaaagtgctgcggaagtttacaatatggcaattatcaaacctgatgctgtactcatgagaaaaaatatagaagttagggaaaaaatagccaaagaaggatttgttatagaaatacaagaaaacctgattctccctgaagaggtagtgagggaattctacactcatatagcagaccagcctgactttgaagagtttgtcgtttctatgacaaatggcctcagctgtgtgctcattgtatctcaagaagactccgaggttattcaggaagaaactctcccgcagactgatacagaagaagaacctggcgttttggaagagcctcacgttaggtttgcacctgtgatgataaagaagaaacgggacagtttgcaagagtatatggaccgacagcatatgtctgattactgcgatgtcgaggacgatgcggttaaggtctctaagctcattgacatattattccctgattttaaaactatgaaaagcacgaatgtacaaacgacgctagcattactgcatccagacatctgtgaggaagagaaagatgacgtgttgaacgttattcacaatgaagggttcaccatactgatgcagaggcaaatcgtattatcagaggaagaagcaagaacagtgtgcaagatccatgaaaacgaagagtattttgataatcttatagggcacatgaccagtaatcactcttatgtccttgctctacggagggaaaatggtgtggaatattggaaaacattaattgggccaaaaacgattgaggaagcttatgcatctcatccacagagtttatgtgtacagtttgcttcagggaattttcctaccaaccagttctacgggagcagttcaaaagcagcagctgagaaggaaatagcgcatttcttccctccccagagcacacttgcattgatcaagcctcatgtgacacacaaagaaagaattcacagaagctcaaggaggtaatga(SEQ ID NO:42)

(氨基酸)

MASKKREVQLQSVVNSQNLWDEMLLNKGLTVIDVYQAWCGPCKAVQSLFRKLKNELNEDEILHFVVAEADNIVTLQPFRDKCEPVFLFSLNGKIIAKIQGANAPLINRKVITLIDEERKIVAGEMDRPQYVEIPLVDAIDEEYGEVQYESAAEVYNMAIIKPDAVLMRKNIEVREKIAKEGFVIEIQENLILPEEVVREFYTHIADQPDFEEFVVSMTNGLSCVLIVSQEDSEVIQEETLPQTDTEEEPGVLEEPHVRFAPVMIKKKRDSLQEYMDRQHMSDYCDVEDDAVKVSKLIDILFPDFKTMKSTNVQTTLALLHPDICEEEKDDVLNVIHNEGFTILMQRQIVLSEEEARTVCKIHENEEYFDNLIGHMTSNHSYVLALRRENGVEYWKTLIGPKTIEEAYASHPQSLCVQFASGNFPTNQFYGSSSKAAAEKEIAHFFPPQSTLALIKPHVTHKERIHRSSRR^**(SEQ ID NO:43)

人NME8

(DNA)

atggcaagcaaaaaacgagaagtccagttacagacagtcatcaataatcaaagcctgtgggatgagatgttgcagaacaaaggcttaacagtgattgatgtttaccaagcctggtgtggaccttgcagagcaatgcaacctttattcagaaaattgaaaaatgaactgaacgaagacgaaattctgcattttgctgtcgcagaagctgacaacattgtgactttgcagccatttagagataaatgtgaacctgtttttctctttagtgttaatggcaaaattatcgaaaagattcagggtgcaaatgcaccgcttgttaataaaaaagttattaatttgatcgatgaggagagaaaaattgcagcaggtgaaatggctcgacctcagtatcctgaaattccattagtagactcagattcagaagttagtgaagaatcaccatgtgaaagtgttcaggaattatacagtattgctattatcaaaccggatgctgtgattagtaaaaaagttctagaaattaaaagaaaaattaccaaagctggatttattatagaagcagagcataagacagtgctcactgaagaacaagttgtcaacttctatagtcgaatagcagaccagcgtgacttcgaagagtttgtctcttttatgacaagtggcttaagctatattctagttgtatctcaaggaagtaaacacaatcctccctctgaagaaaccgaaccacagactgacaccgaacctaacgaacgatctgaggatcaacctgaggtcgaagcccaggttacacctggaatgatgaagaacaaacaagacagtttacaagaatatctggaaagacaacatttagctcagctctgtgacattgaagaggatgcagctaatgttgctaagttcatggatgctttcttccccgattttaaaaaaatgaaaagcatgaaattagaaaagacattggcattacttcgaccaaatctctttcatgaaaggaaagatgatgttttgcgtattattaaagatgaagacttcaaaatactggagcaaagacaagtagtattatcggaaaaagaagcacaagcactgtgcaaggaatatgaaaatgaagactattttaataaacttatagaaaacatgaccagtggtccatctctagcccttgttttattgagagacaatggcttgcaatactggaaacaattactgggaccaagaactgttgaagaagccattgaatattttccagagagtttatgtgcacagtttgcgatggacagtttgccggtcaaccagttgtatggcagcgattcattagaaaccgctgaaagggaaatacagcatttctttcctcttcaaagcactttaggcttgattaaacctcatgcaacaagtgaacaaagagagcagatcctgaagatagttaaggaggctggatttgatctgacacaggtgaagaaaatgttcctaactcctgagcaaacggagaaaatttatccaaaagtaacaggaaaagacttttataaagatttattggaaatgttatctgtgggtccatctatggtcatgattctgaccaagtggaatgctgttgcagaatggagacgattgatgggcccaacagacccagaagaagcaaaattactttcccctgactccatccgagcccagtttggaataagtaaattgaaaaacattgtccatggagcatctaacgcctatgaagcaaaagaggttgttaatagactctttgaggatcctgaggaaaactaa(SEQ ID NO:44)

(氨基酸)

MASKKREVQLQTVINNQSLWDEMLQNKGLTVIDVYQAWCGPCRAMQPLFRKLKNELNEDEILHFAVAEADNIVTLQPFRDKCEPVFLFSVNGKIIEKIQGANAPLVNKKVINLIDEERKIAAGEMARPQYPEIPLVDSDSEVSEESPCESVQELYSIAIIKPDAVISKKVLEIKRKITKAGFIIEAEHKTVLTEEQVVNFYSRIADQRDFEEFVSFMTSGLSYILVVSQGSKHNPPSEETEPQTDTEPNERSEDQPEVEAQVTPGMMKNKQDSLQEYLERQHLAQLCDIEEDAANVAKFMDAFFPDFKKMKSMKLEKTLALLRPNLFHERKDDVLRIIKDEDFKILEQRQVVLSEKEAQALCKEYENEDYFNKLIENMTSGPSLALVLLRDNGLQYWKQLLGPRTVEEAIEYFPESLCAQFAMDSLPVNQLYGSDSLETAEREIQHFFPLQSTLGLIKPHATSEQREQILKIVKEAGFDLTQVKKMFLTPEQTEKIYPKVTGKDFYKDLLEMLSVGPSMVMILTKWNAVAEWRRLMGPTDPEEAKLLSPDSIRAQFGISKLKNIVHGASNAYEAKEVVNRLFEDPEEN^*(SEQ ID NO:45)

NME8大肠杆菌(E.coli)优化的

(DNA)

atgctggtcaataaaaaagtcatcaacctgatcgacgaagaacgcaaaatcgccgctggtgaaatggcacgcccgcaatacccggaaatcccgctggttgatagcgactctgaagtttcagaagaatcgccgtgcgaatcagtgcaggaactgtattcgatcgcaattatcaaaccggatgctgtcatttccaaaaaagtgctggaaatcaaacgtaaaatcaccaaagcgggtttcattatcgaagccgaacataaaaccgtgctgacggaagaacaggtggttaatttttattcacgtatcgcggatcagcgcgactttgaagaatttgtttcgtttatgaccagcggcctgtcttacattctggtcgtgagtcagggttccaaacacaatccgccgagcgaagaaacggaaccgcagaccgatacggaaccgaacgaacgttctgaagaccagccggaagtggaagcacaagttaccccgggcatgatgaaaaataaacaggatagtctgcaagaatacctggaacgccagcatctggctcaactgtgtgatatcgaagaagacgcggccaacgtggcgaaattcatggatgcctttttcccggacttcaagaaaatgaaaagcatgaaactggaaaaaaccctggccctgctgcgtccgaacctgttccacgaacgtaaagatgacgttctgcgcatcatcaaagatgaagacttcaaaatcctggaacagcgccaagttgtcctgtctgaaaaagaagcacaggctctgtgcaaagaatacgaaaacgaagattacttcaacaaactgatcgaaaacatgacctcaggtccgtcgctggcactggttctgctgcgtgataatggcctgcagtattggaaacaactgctgggtccgcgcacggtcgaagaagccattgaatacttcccggaaagcctgtgtgcacagtttgctatggattctctgccggtgaaccaactgtatggcagtgactccctggaaaccgcggaacgtgaaatccagcatttctttccgctgcaaagtaccctgggtctgattaaaccgcacgcgacgtccgaacagcgcgaacaaattctgaaaatcgtcaaagaagccggcttcgatctgacccaggtgaagaaaatgtttctgaccccggaacaaacggaaaaaatctatccgaaagtcacgggcaaagatttctacaaagacctgctggaaatgctgagtgttggtccgtccatggtcatgattctgaccaaatggaatgcggttgcagaatggcgtcgcctgatgggtccgacggatccggaagaagcaaaactgctgagcccggactctattcgcgctcagtttggcatcagcaaactgaaaaacattgttcatggtgcgtccaatgcgtatgaagcgaaagaagttgtgaaccgcctgtttgaagacccggaagaaaattaa(SEQ ID NO:46)

(氨基酸)

MLVNKKVINLIDEERKIAAGEMARPQYPEIPLVDSDSEVSEESPCESVQELYSIAIIKPDAVISKKVLEIKRKITKAGFIIEAEHKTVLTEEQVVNFYSRIADQRDFEEFVSFMTSGLSYILVVSQGSKHNPPSEETEPQTDTEPNERSEDQPEVEAQVTPGMMKNKQDSLQEYLERQHLAQLCDIEEDAANVAKFMDAFFPDFKKMKSMKLEKTLALLRPNLFHERKDDVLRIIKDEDFKILEQRQVVLSEKEAQALCKEYENEDYFNKLIENMTSGPSLALVLLRDNGLQYWKQLLGPRTVEEAIEYFPESLCAQFAMDSLPVNQLYGSDSLETAEREIQHFFPLQSTLGLIKPHATSEQREQILKIVKEAGFDLTQVKKMFLTPEQTEKIYPKVTGKDFYKDLLEMLSVGPSMVMILTKWNAVAEWRRLMGPTDPEEAKLLSPDSIRAQFGISKLKNIVHGASNAYEAKEVVNRLFEDPEEN^*(SEQ ID NO:47)

NME81-2大肠杆菌(E.coli)优化的

(DNA)

Atgctggtcaataaaaaagtcatcaacctgatcgacgaagaacgcaaaatcgccgctggtgaaatggcacgcccgcaatacccggaaatcccgctggttgatagcgactctgaagtttcagaagaatcgccgtgcgaatcagtgcaggaactgtattcgatcgcaattatcaaaccggatgctgtcatttccaaaaaagtgctggaaatcaaacgtaaaatcaccaaagcgggtttcattatcgaagccgaacataaaaccgtgctgacggaagaacaggtggttaatttttattcacgtatcgcggatcagcgcgactttgaagaatttgtttcgtttatgaccagcggcctgtcttacattctggtcgtgagtcagggttccaaacacaatccgccgagcgaagaaacggaaccgcagaccgatacggaaccgaacgaacgttctgaagaccagccggaagtggaagcacaagttaccccgggcatgatgaaaaataaacaggatagtctgcaagaatacctggaacgccagcatctggctcaactgtgtgatatcgaagaagacgcggccaacgtggcgaaattcatggatgcctttttcccggacttcaagaaaatgaaaagcatgaaactggaaaaaaccctggccctgctgcgtccgaacctgttccacgaacgtaaagatgacgttctgcgcatcatcaaagatgaagacttcaaaatcctggaacagcgccaagttgtcctgtctgaaaaagaagcacaggctctgtgcaaagaatacgaaaacgaagattacttcaacaaactgatcgaaaacatgacctcaggtccgtcgctggcactggttctgctgcgtgataatggcctgcagtattggaaacaactgctgggtccgcgcacggtcgaagaagccattgaatacttcccggaaagcctgtgtgcacagtttgctatggattctctgccggtgaaccaactgtatggcagtgactccctggaaaccgcggaacgtgaaatccagcatttctttctcgagcaccaccaccaccaccactga(SEQ ID NO:48)

(氨基酸)

MLVNKKVINLIDEERKIAAGEMARPQYPEIPLVDSDSEVSEESPCESVQELYSIAIIKPDAVISKKVLEIKRKITKAGFIIEAEHKTVLTEEQVVNFYSRIADQRDFEEFVSFMTSGLSYILVVSQGSKHNPPSEETEPQTDTEPNERSEDQPEVEAQVTPGMMKNKQDSLQEYLERQHLAQLCDIEEDAANVAKFMDAFFPDFKKMKSMKLEKTLALLRPNLFHERKDDVLRIIKDEDFKILEQRQVVLSEKEAQALCKEYENEDYFNKLIENMTSGPSLALVLLRDNGLQYWKQLLGPRTVEEAIEYFPESLCAQFAMDSLPVNQLYGSDSLETAEREIQHFFLEHHHHHH^*(SEQ ID NO:49)

NME82-3大肠杆菌(E.coli)优化的

(DNA)

Atgctggaaaaaaccctggccctgctgcgtccgaacctgttccacgaacgtaaagatgacgttctgcgcatcatcaaagatgaagacttcaaaatcctggaacagcgccaagttgtcctgtctgaaaaagaagcacaggctctgtgcaaagaatacgaaaacgaagattacttcaacaaactgatcgaaaacatgacctcaggtccgtcgctggcactggttctgctgcgtgataatggcctgcagtattggaaacaactgctgggtccgcgcacggtcgaagaagccattgaatacttcccggaaagcctgtgtgcacagtttgctatggattctctgccggtgaaccaactgtatggcagtgactccctggaaaccgcggaacgtgaaatccagcatttctttccgctgcaaagtaccctgggtctgattaaaccgcacgcgacgtccgaacagcgcgaacaaattctgaaaatcgtcaaagaagccggcttcgatctgacccaggtgaagaaaatgtttctgaccccggaacaaacggaaaaaatctatccgaaagtcacgggcaaagatttctacaaagacctgctggaaatgctgagtgttggtccgtccatggtcatgattctgaccaaatggaatgcggttgcagaatggcgtcgcctgatgggtccgacggatccggaagaagcaaaactgctgagcccggactctattcgcgctcagtttggcatcagcaaactgaaaaacattgttcatggtgcgtccaatgcgtatgaagcgaaagaagttgtgaaccgcctgtttgaagacccggaagaaaatctcgagcaccaccaccaccaccactga(SEQ ID NO:50)

(氨基酸)

MLEKTLALLRPNLFHERKDDVLRIIKDEDFKILEQRQVVLSEKEAQALCKEYENEDYFNKLIENMTSGPSLALVLLRDNGLQYWKQLLGPRTVEEAIEYFPESLCAQFAMDSLPVNQLYGSDSLETAEREIQHFFPLQSTLGLIKPHATSEQREQILKIVKEAGFDLTQVKKMFLTPEQTEKIYPKVTGKDFYKDLLEMLSVGPSMVMILTKWNAVAEWRRLMGPTDPEEAKLLSPDSIRAQFGISKLKNIVHGASNAYEAKEVVNRLFEDPEENLEHHHHHH*(SEQID NO:51)

NME家族蛋白质的结构和功能

发明者先前发现MUC1切割产物MUC1*的生长因子受体功能由其胞外结构域的配体诱导的二聚激活，并且发现MUC1*的配体是NM23(Mahanta等，2008)。发明者进一步证明了结合至MUC1*的PSMGFR部分(图21和图27)、并且抑制分化以及支持干细胞和祖细胞生长的是NM23-H1的二聚体形式(Hikita等，2008；Smagghe等，2013)。相反地，作为六聚体的NM23-H1不促进或维持多能性，而是其诱导分化。在图3-图5中示出示例性实验。不同于二聚体形式，NM23-H1六聚体不结合至MUC1胞外结构域的PSMGFR部分。因此，尽管NME1六聚体具有的生物功能在于它们诱导分化，但在此为了简便起见，我们将NME1六聚体称为“生物学无活性的”多聚体，这是因为其是不诱导起始细胞回复至较不成熟状态或不抑制未成熟细胞分化，或不维持细胞的未成熟状态的NME多聚体。类似地，在此我们将NME1二聚体称为“生物活性的”NME多聚体，是诱导起始细胞回复至较不成熟状态或抑制未成熟细胞分化，或维持细胞的未成熟状态的NME多聚体。

此外，发明者发现，与NME1(NM23-H1)二聚体相似，NME7(NM23-H7)单体(Lacombe等，2000)也结合至MUC1*的胞外结构域并且使MUC1*的胞外结构域二聚，并且单独地就足以促进或维持干细胞或干细胞样细胞中的多能性(参见图26和图27)。进一步地，发明者发现NME1二聚体或NME7单体诱导多能性或诱导细胞回复至较不成熟状态。

现在我们已经发现几个NM23家族成员具有的干细胞相关功能(stem-related functions)在于它们促进或诱导多能性，而相同NME蛋白的其他或其他多聚化状态促进或诱导分化。当NME1(NM23-H1)仅是二聚体时，其促进干细胞生长并且抑制分化。NME6具有与NME1大致相同的分子量，并且据报导，在海绵(寄居蟹皮海绵(Suberites domuncula))中其以二聚体存在(Perina et al,2011,“Characterization of Nme6-likegene/protein from marine sponge Suberites domuncula”Naunyn-Schmiedeberg’s Arch Pharmacol,384:451-460)。我们表达了NME6，并且在ELISA试验中，我们表明了NME6结合至衍生自MUC1*胞外结构域的PSMGFR肽(图20)。在该结合实验中，由于据报导NME6在海绵中以二聚体存在，因此，测试了人NME6野生型蛋白质，连同其中突变类似于使得NME1偏好二聚体形式的S120G突变(Chang等，1986)的变体(S139G)，以及其中使得NME1偏好二聚体形式的相同区域发生突变以匹配海绵中存在的序列的另一种变体(S139A、V142D、V143A)。

尽管NME7(NM23-H7)是单体蛋白质，但发明者已经发现其像二聚体一样起作用。NME7包含两个NDPK催化结构域，分子量约是NME1或NME6单体的两倍，并且由人胚胎干细胞(ES)、和诱导的多能干(iPS)细胞以及癌细胞表达和分泌(参见图1、图2和图27)。NME8是对于MUC1胞外结构域具有一些结合亲和力的另一个NME家族成员。NME8(Miranda-Vizuete等，2003)具有3个结构域：A、B和C。当仅以结构域A和结构域B表达NME8时，其是单体，而以B与C表达时形成寡聚体。NME8可以结合至MUC1并且重新聚集MUC1以阻碍干细胞样增长。

进行了ELISA实验，其中，针对NME8的结构域A和结构域B(图21中的“1”和“2”)，或结构域B和结构域C(图21中的“2”和“3”)结合至来自MUC1*胞外结构域的PSMGFR肽的能力，对它们进行了测试，并且与NME1二聚体(图21A中的NM23S120G)的结合进行比较。如在图中能够看出的，观察到了一些结合，但当其是二聚体形式时，其远小于NME1的结合。如在图21B中能够看出的，当NME8是寡聚体时，看到了最多的结合，这可以表明像NME1六聚体、NME8多聚体或寡聚体通过结合至MUC1的胞外结构域以及重新聚集受体以堵塞生物活性NME多聚体的结合位点来诱导分化。

NME家族蛋白质在细胞和组织发育的不同时间差异表达。然而，我们在胚胎干细胞中检测NME6、NME7和NME1，仅NME1和NME2在成体细胞或成体干细胞中常规地表达。由于NME1形成诱导而不是抑制干细胞分化的六聚体，由此得出的结论是NME7在胚胎形成和原始状态干细胞中进行早期表达，这是因为它们不能形成诱导分化的六聚体。在胚胎形成的最早期阶段中，生长和分化的抑制将是默认的(default)，当达到某一密度的干细胞、想要开始分化时，六聚体的调节功能在晚期阶段中变得重要。支持我们的发现，Boyer等(Boyer et al,2005,“Core TranscriptionalRegulatory Circuitry in Human Embryonic Stem Cells”,Cell,Vol.122,947-956)报导了多能性诱导蛋白质SOX2和NANOG结合至NME7而不是其他NME家族成员的启动子，表明NME7是表达的第一个NME蛋白质，并且与其可以诱导或维持多能性而不能形成阻碍其的六聚体的观念一致。Boyer等还报导了多能性诱导蛋白质SOX2和OCT4结合至MUC1(NME7的靶受体，随后切割为MUC1*)的启动子。SOX2和OCT4也结合至MUC1切割酶MMP-16的启动子。这些多能性诱导蛋白质冗余地结合至MUC1、其切割酶和其配体(NME7)的启动子的事实证明蛋白质的该子集对于多能性是至关重要的，并且NME7是在发育中的胚胎中表达的第一种多能性蛋白质。如果将人干细胞在偏好二聚体形成的NM23变体中培养，由人干细胞高度表达NME7。

实施例1描述了这样一个实验：其中，BGO1v人胚胎干细胞在抗-MUC1*单克隆抗体MN-C3的涂层上的NM23-S120G(已经进行了复性和纯化以主要以二聚体存在)中生长；或在小鼠成纤维细胞饲养细胞上的bFGF中培养。所得细胞的蛋白质印迹表明，NME7在已经在NM23-S120G二聚体中培养的干细胞中高度表达(图1，部分I.C-泳道1)，但在bFGF中培养的干细胞中仅弱表达(泳道2)。我们已经表明，在NM23二聚体中培养的干细胞回复至原始态(Smagghe等，2013)，由于均是商业上可获得的干细胞系，因此与在bFGF中培养的人干细胞的始发态相比，所述原始态是较不成熟状态。与始发状态干细胞相比，NME7在原始状态干细胞中更多表达的事实与NME7优先在胚胎形成的非常早期阶段而不是在胚胎或胎儿发育的晚期表达一致。

成体组织的分析已经表明，NME7在成体组织中根本不存在或几乎不能够检测到。实施例4描述了这样一个实验：其中，在MUC1*抗体表面上的NM23-S120G二聚体中或在小鼠成纤维细胞饲养细胞表面上的bFGF中培养人胚胎干细胞，然后，通过RT-PCR对其进行分析以测量原始态基因相对始发态基因的表达水平。图6表明，在NM23二聚体中培养的干细胞表达较高的原始态基因水平以及较低的分化的、始发态基因的水平。这些结果与图1C中示出的发现一致。比较泳道1与泳道2表明，NME7在期望的原始态干细胞中表达至较大的程度，所述原始态干细胞能够分化成人体中的任何细胞类型。因此，例如，经由引入能够引起NME7的表达的核酸或增加NME7蛋白质的方法、或偏好二聚体形成的NME1突变体或变体提高NME7在细胞中的表达的策略是维持多能性、维持胚胎或诱导多能干细胞中的原始态干细胞状态、和/或在更多成熟细胞类型(包括，体细胞、成皮细胞和成纤维细胞)中诱导多能性的策略。除了NME7或NME1二聚体形成或二聚体模拟变体之外，这些策略可以包括一种或多种多能性基因Oct4、Sox2、Nanog、Klf4或c-myc的异位表达。这些实验得出的结论是，NME7是在更原始态干细胞中表达的NM23的早期形式。

我们已经表明，二聚体形式的NM23诱导干细胞回复至通常称为原始状态的更多能状态。我们的实验和其他的那些已经表明，在bFGF中培养干细胞，或在小鼠成纤维细胞饲养细胞(MEF)的层上培养干细胞驱使或维持干细胞处于称为“始发”状态的较少多能状态。参照图1(C)，这些始发态干细胞表达少得多的NME7，与NME7与更原始并且因此是真正的多能干细胞状态相关的观点一致。由于预期原始状态人干细胞能够较好地分化为功能性成体细胞，因此原始态干细胞是用于研究以及用于治疗应用的期望细胞。因此，期望涉及诱导NME7的表达的策略以获得用于治疗应用的细胞。相反地，减少NME7在癌症中的表达的策略将是抗癌疗法。

NME7以单个蛋白质存在，但结构上由两种单体组成，并且因此起二聚体的作用。NME7包含两个NDPK结构域，其部分结合至MUC1*生长因子受体。实施例1还描述了称为拉下实验的结合实验。在该实验中，将MUC1*胞外结构域肽结合至随后用来自BGO1v人胚胎干细胞的裂解产物孵育的珠。在洗涤步骤和从珠释放之后，在SDS-PAGE凝胶上分离通过与MUC1*肽的相互作用而捕获的物质，然后，用抗-NME7抗体探测。图1(F)-泳道1示出NME7结合至MUC1*胞外结构域。NME7中的双NDPK结构域的部分结合至MUC1*生长因子受体并且使其二聚，这激活了维持多能性、诱导多能性和抑制干细胞和祖细胞的分化的通路。

NME6以二聚体存在，并且抵抗高阶多聚体的形成。NME6二聚体结合至MUC1*生长因子受体并且使其二聚，这激活了维持多能性、诱导多能性和抑制干细胞和祖细胞的分化的通路。像偏好二聚体形成的NME1突变体和变体那样，NME6和NME7能够维持和诱导多能性并且抑制干细胞和祖细胞(包括，iPS细胞)的分化。

像偏好二聚体形成的NME1突变体和变体那样，可以将NME6和NME7外源地添加至干细胞(胚胎干细胞或诱导的多能干细胞)或祖细胞以诱导生长、将它们维持在未分化状态或抑制它们的分化。可以将NME6和NME7外源地添加至干细胞或祖细胞以诱导多能性。此外，可以将编码偏好二聚体形成的NME1突变体和变体、NME6和/或NME7、或它们的变体(包括，起二聚体作用的单链变体)的核酸引入细胞中以诱导细胞回复至较少分化状态或将细胞维持在较不成熟状态。

NME1和NME2野生型蛋白质形成四聚体、六聚体和高阶多聚体。我们已经发现，仅NME二聚体结合至MUC1*生长因子受体的PSMGFR部分以支持干细胞和祖细胞生长同时抑制分化。我们还已经发现，NME二聚体或NME7单体引起细胞回复至较不成熟状态，例如诱导更成熟细胞(包括，体细胞、成皮细胞和成纤维细胞等)中的多能性。我们还发现，主要以六聚体和高阶多聚体存在的NME1野生型蛋白质不结合至MUC1*生长因子受体的PSMGFR部分并且不诱导干细胞和祖细胞的分化[Smagghe等，2013]。NME1形成多聚体，包括二聚体、四聚体和六聚体。我们已经表明，NME1的二聚体形式将干细胞维持在未分化状态并且还诱导更成熟细胞中的多能性。然而，随着干细胞密度增加，从干细胞分泌的NME1的量引起局部浓度的增加，有利于不支持多能性并且事实上可以结合至不同的细胞表面受体并积极地引发分化的六聚体的形成。因此，对于维持或诱导多能性，有利的是抑制NME1同种型以避免有害的六聚体的积聚。相反，NME7似乎起NME1二聚体的作用。因此，对于维持或诱导多能性，有利的是提高NME7的表达或外源地添加NME7。对于维持或诱导多能性，甚至更优选的是抑制NME1并且提高NME7的表达，或抑制NME1并且增加NME7或NME1二聚体的相对浓度。这些实验还表明，用于有意地诱导分化的方法是添加NME1六聚体，或暂停NME1的抑制。因此，当期望使干细胞或祖细胞自我复制而不分化时，体外或体内下调野生型NME1在干细胞或祖细胞中的表达将是非常有利的。由于NME2也形成六聚体和高阶多聚体，因此还期望的是除了下调NME1之外还下调NME2，同时维持或诱导多能性，并且其中，期望抑制分化。在另一个实施方式中，下调NME1或NME1和NME2，同时外源地添加偏好二聚体形成的NME1突变体和变体如NME1S120G或P96S，或者NME6或NME7中的类似突变，或引起编码它们的核酸在细胞中表达。

在一种优选的实施方式中，抑制了能够形成高阶多聚体(大于二聚体)的NME家族成员。在一种更优选的实施方式中，抑制了NME1的表达以促进或维持细胞处于多能状态或诱导细胞回复至较不成熟状态。能够通过本领域技术人员已知的多个方法进行特定种类(species)的抑制。可以在蛋白质水平或核酸水平抑制目标种类：DNA或RNA。可以通过使用抗体或者抑制或阻断活性或蛋白质的结合位点的小分子抑制表达的蛋白质。可替代地，通过使用反义核酸、反义DNA、反义RNA、抑制RNA(如RNAi、shRNA、或siRNA)可以抑制蛋白质的表达。还可以将小分子用于阻断或抑制靶蛋白质的表达。

存在用于将核酸引入细胞以引起靶基因的表达或抑制的本领域中已知的若干技术。例如，可以用包括编码期望的或不期望的基因的序列的载体转染或转导细胞。载体可以是自然界中的病毒、DNA或RNA。其他方法包括将编码感兴趣的基因的mRNA引入细胞。可以使用shRNA或siRNA、反义核酸等下调目标用于抑制的基因。用于促进编码基因的核酸进入的一些方法包括使用去垢剂以便将编码核酸封装在脂质体中。再其他的方法包括用诸如O-甲基化或胆固醇的部分修饰编码基因的核酸，这促进核酸进入细胞(参见2008年7月11日提交的US专利申请号US2010/0173359，通过引用将其内容合并于此用于其部分公开)。与去垢剂相比，后一种方法较不苛刻，因此能够反复用于引起细胞连续表达或抑制靶基因。例如，针对稳定性、靶专一性以及不存在转染试剂下的细胞吸收，特定地修饰了Accell^TMsiRNA(Dharmacon,Inc.-Layfayette,Colorado)。Accell^TM系统可以用于下调基因如抑制多能性的NME1或NME1和NME2。Accell^TM系统的修饰可以用于修饰带有对干细胞或祖细胞的生长或诱导多能性有益的基因的序列的核酸。用于基因上调或下调的多种技术对于本领域技术人员而言是已知的，并且能够用于下调能够形成高阶多聚体如诱导分化的六聚体的NME家族蛋白质。例如，为了促进多能性或回复至较不成熟状态，在存在或不存在上调维持或诱导多能性的基因如偏好二聚体形成的NME1突变体和变体、NME6和/或NME7、或它们的变体(包括，起二聚体作用的单链变体)的情况下，抑制NME1和/或NME2。

是否下调NME1或NME2，或上调偏好二聚体形成的NME1突变体和变体、NME6和/或NME7、或它们的变体(包括，起二聚体作用的单链变体)，或添加偏好二聚体形成的NME1突变体或变体、NME6和/或NME7、或它们的变体(包括，起二聚体作用的单链变体)的外源蛋白质形式，这些蛋白质和核酸能够在时间释放制剂中制备或被封装用于在一段时间内递送至细胞。使用以上描述的方法，在极大地减少时间和劳动下，能够极大地简化细胞培养，尤其是干细胞或祖细胞培养。如果抑制了诱导分化的NME1和/或NME2的表达，那么在存在或不存在添加外源的偏好二聚体形成的NME1突变体和变体、NME6和/或NME7的情况下，仅需要添加足够的缓冲剂以促进多能干细胞或祖细胞生长、抑制分化或诱导更成熟细胞中的多能性。在一种优选的实施方式中，抑制了NME1和/或NME2，同时上调或外源地添加了NME7以促进、维持或诱导多能性，或诱导细胞回复至较不成熟状态。

NME7的抑制极大地抑制了干细胞样生长。人干细胞中NME7的siRNA抑制导致剩余的这些细胞中的极大的生长抑制和分化诱导。观察到了定量生长并且用照相记录。细胞生长的抑制量以及从干细胞样形态至成纤维细胞样形态的变化类似于其中抑制了多能性基因Oct4的细胞的那些。此外，RT-PCR表明，NME7的抑制引起作为分化状态的标志物的FoxA2的表达显著增加。在这些实验中，没有添加生长因子，并且每隔24小时表征细胞直至添加转染试剂之后的96小时。在图23和图25中能够看到示例性图像。

相反地，NME1的抑制对于干细胞样生长或形态具有非常小的影响。RT-PCR表明分化标志物FoxA2的表达没有显著增加。细胞生长的量和干细胞样形态的持久性与负对照实验的那些一致，在所述负对照实验中添加转染试剂，但杂乱的siRNA取代靶向NME1的siRNA。在图22和图25中能够看到示例性图像。NME6的抑制对干细胞样生长具有小量(modestly)不利影响，观察到了一些区域的分化。作为表现得非常厚的白色的变厚区域或作为堆在彼此的顶部上的厚细胞的变暗区域看到分化区域。在图24和图25中能够看到示例性图像。

这些结果表明，可以抑制NME1以消除在增加的浓度下NME1形成的六聚体的负面影响。事实上，当抑制NME1时，NME1在siRNA敲低(knockdown)实验中通常仅减少50-75％，这很可能降低NME1的局部浓度并且因此降低六聚体形成的可能性。如果抑制NME1，但没有敲低NME7或NME6和NME7，干细胞生长继续进行并且甚至增强，使得不需要添加另外的重组生长因子。事实上，NME1的暂时抑制引起NME7的浓度增加，这促进了多能性并且没有形成可以阻碍多能性生长并诱导分化的六聚体。

因此，在一种优选的实施方式中，在多能干细胞中抑制了NME1而不是NME7，这使得在不添加外源添加的生长因子(包括添加重组NME)的情况下，它们能够生长并且抑制分化。然而，可以外源地添加NME7或二聚体形式的NME1，以增加细胞数目。

即使在没有将生长因子添加至培养基中的96小时之后，NME1的敲低也具有非常小的影响。众所周知，如果在缺乏干细胞生长因子如bFGF或二聚体形式的NME1的最小培养基中培养干细胞，干细胞不晚于48小时即快速分化。当仅将NME1敲低时，留下怀疑起NME1二聚体作用的NME6和NME7将有效促进多能性，这没有发生(参见图11、图22和图25)。

NME家族成员、同种型或变体的表达可以是短暂的、稳定的或受控的，如能够通过诱导性表达系统使得NME家族成员或变体的表达是短暂的，并且可以以可控的方式开启或关闭。生物活性NME家族成员或变体、尤其是NME6或NME7同种型或变体的持续表达促进自我更新、维持或诱导多能性，同时抑制分化。相反地，生物活性NME家族成员或变体、尤其是NME6或NME7同种型或变体的短暂表达维持或诱导多能性，同时抑制分化持续有限时期，此后，细胞将分化。可替代地，随着生物学无活性的NME1的六聚体形式的产生，可以激活NME1野生型的表达以引起细胞进入分化。类似地，可以抑制NME6和/或NME7的表达以诱导分化。使用本领域技术人员已知的几个技术，包括使用表达质粒、用于表达或抑制的线性核酸(例如，可以用诸如胆固醇的部分衍生以促进进入细胞或核的siRNA)，可以进行NME蛋白质的表达或抑制。

本发明的NME家族成员、同种型或变体外源地添加至其或引起其表达NME家族成员或变体的细胞包括但不限于，体细胞、成皮细胞、成纤维细胞、干细胞、多能干细胞、骨髓细胞、外周动员血细胞、造血干细胞、祖细胞、患者细胞、携带遗传缺陷或改变的细胞、或旨在提供具有分泌的NME家族成员或变体的邻近细胞的饲养细胞。此外，本发明的NME家族成员、同种型或变体外源地添加至其或引起其表达NME家族成员或变体的细胞可以是患者细胞。患者细胞可以携带遗传缺陷或改变，对于患者细胞，期望将细胞回复至较不成熟状态、校正或替换缺陷基因，并且引起携带矫正基因的细胞的自我复制。使用本发明的NME家族成员或变体，可以将患者细胞诱导成为多能的用于治疗需要用干细胞或祖细胞治疗的患者或另一患者。外源地添加NME家族成员或变体，或使其由患者细胞表达用于产生iPS细胞，该iPS细胞随后能够被引导分化成期望的细胞类型。随后，可以将这种细胞给予患者或另一患者用于治疗目的。

NME家族蛋白质和癌症的治疗

NME7是由癌细胞以及干细胞分泌的。一些癌细胞表达偏好形成二聚体并且抵抗六聚体的形成的突变体NME1是指，在这些情况中，由于二聚的NME1生长因子，其不形成六聚体，并且因此不诱导分化，癌细胞表现出干细胞样生长。在其他癌症中，NME7的干细胞样生长因子功能可以克服六聚体的诱导分化的作用。因此，作为癌症的治疗，NME7被抑制。可替代地，NME1或NME2，它们容易形成六聚体，被过表达用作癌症的治疗。在本发明的一个方面，抑制NME7并且过表达NME1和/或NME2或外源地引入受影响的细胞以抑制干细胞样生长。通常，抑制抵抗诱导分化的多聚化状态(如六聚体形式)的任何NME家族成员以治疗癌症。将诱导分化的NME家族成员如高浓度的NME1或NME2引入或过表达以治疗癌症或特征在于干细胞样生长的其他疾病。本发明预期体外、离体和体内实施这些方法。本发明还预期将抑制或诱导NME家族成员表达的药剂给予患者以诱导干细胞样生长(例如，在损伤的部位)，或抑制干细胞样生长(例如，作为癌症的治疗)。

我们已经表明，二聚体形式的NME1起多能性因子和生长因子的作用，当添加至不含血清的最小培养基时，刺激干细胞和癌细胞的生长。在此，我们报导了用六聚体形式的NME1治疗癌细胞抑制癌细胞生长和转移，而用NME1二聚体治疗则不这样。在图28-图30中示出示例性实验。

不同的NME多聚体可以在不同的位点处结合至MUC1。不同的切割酶可以切割MUC1，使得不存在诱导分化的多聚体的结合位点。例如，对于癌细胞，或表现出干细胞样生长的其他细胞，切割MUC1的酶可以不同于干细胞中的切割酶，并且因此可以在阻碍干细胞样生长的多聚体的结合位点以下切割MUC1。在这种情况下，有利的是抑制在始发态干细胞中不存在的MUC1切割酶。为了治疗癌症，可以有利的是引起在始发态干细胞中存在的切割酶的癌细胞中的表达。

因此，增加其多聚化状态是生物学活性状态的NME家族成员的量或减少其多聚化状态是生物学无活性状态的NME家族成员的相对量是用于由起始细胞产生较不成熟细胞的方法，或用于将细胞维持在可以是多能状态的干细胞样状态的方法。类似地，增加其多聚化状态是生物学活性状态的NME家族成员的量或减少其多聚化状态是生物学无活性状态的NME家族成员的相对量是抑制胚胎干细胞、诱导的多能干细胞、或祖细胞分化的方法。

相反地，对于癌症的治疗，将增加其多聚化状态是生物学无活性状态的NME家族成员的量的药剂，或减少其多聚化状态是生物学活性状态的NME家族成员的相对量的药剂给予患者。

可以将引起其多聚化状态是生物学活性状态的NME家族成员的表达的核酸，或抑制其多聚化状态是生物学无活性状态的NME家族成员的表达的核酸引入宿主细胞以促进诱导或将其维持在较不成熟状态或干细胞样状态。宿主细胞还可以携带引起不在宿主细胞中表达或在宿主细胞中突变的基因的表达的核酸。在有缺陷的基因的情况下，还可以将下调不想要的基因和上调期望的或正确的基因的核酸引入宿主细胞。宿主细胞的来源可以是供体或患者，并且可以获得自皮肤、牙齿、骨髓、血液、胎盘、羊水、胚泡、胎儿等，并且可以是干细胞、iPS细胞、祖细胞或体细胞。可以将用于本发明的方法中的宿主细胞给予患者。将细胞给予患者的方法包括：通过骨髓移植、移植到特定位点、输液、注射或局部治疗。这些方法可以用于治疗任何病况或疾病，其中，疾病或病况通过用干细胞、祖细胞治疗，或通过校正遗传异常或缺陷而减轻。在给予患者之前，还可以将经受本发明的方法的细胞分化成祖细胞或体细胞。在其中期望分化的情况下，其多聚化状态是生物学活性状态的NME家族成员将被撤出以允许分化。

由于NME在所有物种间是高度保守的，因此，本文中描述的方法并不旨在限于人类NME物种，也不限于使用人类细胞。

本发明不限于本文中描述的具体实施方式的范围。实际上，对于本领域技术人员而言，依据以上描述和附图，可以清楚除本文描述的那些以外本发明的各种改进。这样的改进旨在落在所附权利要求的范围内。通过示出本发明的方式，而不是通过限制的方式提供以下实施例。

实施例

实施例1除了NME1(H1)和NME2(H2)之外，为了确定人干细胞是否表达NME6或NME7，我们对来自各种人干细胞系的裂解物和上清液进行了蛋白质印迹分析。在a)仅在涂覆有抗-MUC1*单克隆抗体MN-C3的细胞培养板上的二聚体形式的NM23-S120G中，或在b)小鼠饲养细胞(MEF)上的4ng/mL下的bFGF中培养人胚胎干细胞系BGO1v细胞。在培养3天之后，收获干细胞并将其裂解，然后，通过使用抗体以探测NME1、NME6和NME7的存在的蛋白质印迹分析。为了比较，在T47DMUC1*-阳性乳癌细胞上平行地进行了相同的分析。作为对照，将重组NM23-H1野生型(NM23-wt)蛋白质负载在凝胶上，并且也用识别3种不同的NME的抗体进行探测。注意，凝胶是变性凝胶，使得NM23-S120G二聚体和野生型六聚体的表观分子量表现为单体的重量。用于探测凝胶的抗体是：针对NME1:NM23-H1(C-20)；NME6:NM23-H6(L-17)和NME7:nm23-H7(B9)(均购自Santa Cruz Biotechnology,Inc)。

图1示出6种蛋白质印迹凝胶的照片。部分I.A-C示出其中通过凝胶电泳分离并且随后用针对：A)NME1，B)NME6和C)NME7的抗体探测的细胞裂解物的蛋白质印迹。在每一个板中，泳道1相应于在涂覆有抗-MUC1*单克隆抗体MN-C3的细胞培养板上的NM23-S120G(以二聚体形式)中培养的BGO1v干细胞；泳道2相应于在MEF上的bFGF中培养的BGO1v干细胞；泳道3相应于T47D乳癌细胞；泳道4相应于纯化的重组NM23-H1野生型(NM23-wt)。

图1(A)表明，无论在抗-MUC1*抗体表面上的二聚体形式的MN23中培养(泳道1)或在小鼠饲养细胞(MEF)的表面上的bFGF中培养(泳道2)，NME1存在于BGO1v人胚胎干细胞中。NME1还在人乳癌细胞存在(泳道3)。并且阳性对照泳道4表明使用的抗体事实上确实识别了NME1纯化的蛋白质。

图1(B)表明，使用这些抗体，NME6不存在于任何测试的样品中。

图1(C)表明，如果在抗-MUC1*表面上的NM23(二聚体)中培养人干细胞，NME7在它们中强烈地表达(泳道1)，但在MEF饲养细胞上的bFGF中培养的干细胞中仅弱表达(泳道2)。NME7也在人乳癌细胞中强烈地表达(泳道3)，但没有被针对H1同种型的据称特异性C-20抗体识别。

图1(D-F)示出了拉下实验的蛋白质印迹的照片以确定哪种NME结合至MUC1*胞外结构域肽。在此，组氨酸标记的MUC1*胞外结构域肽(GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA-HHHHHH)被附接至NTA-Ni琼脂糖珠子，并且然后用与图1的部分I中相同的细胞裂解物孵育。在4℃下孵育1小时之后，以15000RPM离心珠子5分钟。丢弃上清液，并且用PBS洗涤珠子以除去通过非特异性结合而结合的物种。添加咪唑以从珠子释放复合物。在离心之后，通过凝胶电泳分离上清液并且如在图1部分I中的用针对NME1(D)、NME6(E)和NME7(F)的抗体对上清液进行分析。图1(D)表明，无论是在NM23(二聚体)(泳道1)还是在bFGF(泳道2)中培养，如发明者先前已经示出的，干细胞中的NME1结合至MUC1*胞外结构域肽。泳道3表明，乳癌细胞裂解物中的NME1也结合至MUC1*胞外结构域肽，并且泳道4表明，C-20NME1特异性抗体结合至纯化的重组野生型NME1。参考图1(E)，该凝胶表明，图1的部分I中的NME6被示出不存在于这些细胞裂解物中，也没有被MUC1*肽拉下。图1(F)重要地示出NME7结合至MUC1*胞外结构域肽。与在MEF上的bFGF中培养的干细胞相比，来自在MUC1*抗体表面上的NM23二聚体中培养的干细胞的NME7表达了较大量的NME7。与图1的部分I一致，NME7被示出结合至MUC1*肽，并且通过相互作用在实验中被拉下(泳道1)。然而，NME7没有出现在泳道2中，这很可能是由于bFGF中培养的细胞中的降低的表达。泳道3表明，在乳癌细胞中表达的NME7结合至MUC1*，并且泳道4没有示出蛋白质，这是因为NME7抗体不识别NME1同种型。NME7很可能结合至两割MUC1*肽以使细胞上的MUC1*受体二聚，从而刺激多能性、生长并且抑制分化。

实施例2.人干细胞系BGO1v和HES-3细胞的蛋白质印迹分析表明，针对NME7的据称特异性NME抗体识别NME7以及具有～22-25kDa的表观分子量的另一物种(图2)。

实施例3.发明者先前表明，二聚体形式或使细胞上的MUC1*受体二聚的形式的NM23促进多能干细胞生长、抑制分化并且诱导更成熟细胞(包括体细胞)中的多能性。结合实验表明，二聚体形式的NM23结合至细胞上的MUC1*受体，并且结合至不含MUC1*胞外结构域的肽。然而，使用野生型蛋白质的六聚体形式或S120G突变体的六聚体形式的实验引起干细胞分化。细胞定位实验表明，六聚体可以结合至细胞，并且被易位至细胞核，其中，假定其结合至诱导分化的元件。因此，清楚的是，在非常低的浓度下形成六聚体的NME1(NM23-H1)以及形成六聚体或高阶多聚体的其他NME家族成员的表达对体外培养干细胞、诱导更成熟细胞如体细胞中的多能性的过程是有害的，并且对于用干细胞或祖细胞接种患者的过程(其中，扩增重组干细胞群或压制(overtake)内源干细胞群是期望的)是有害的。

为了示出NME1野生型的有害作用，我们在所有NME1-S120G二聚体(图3)、作为六聚体的所有NME-wt(图4)、或其中NME1-S120G二聚体是20％并且NME-wt是80％并且总NME浓度范围从8nM-104nM的两种的混合物(图5)中培养人干细胞、BGO1v。图3-图5是在平铺之后第4天时所得的干细胞的照片。变暗和变厚细胞区域表明，与作为具有大的细胞核与细胞质比率的清楚的小细胞的单层的多能干细胞相比，干细胞已经分化。图像清楚地表明，NM23二聚体(NME1-S120G二聚体)完全支持多能干细胞生长(图3)，而六聚形式使得细胞分化(图4)。图5表明，尽管存在二聚体，但显著量的NME1野生型(其是六聚体)的存在引起干细胞分化。因此，对人干细胞内源的并且由它们分泌的野生型NME1抑制干细胞和祖细胞的生长和维持，并且抑制在更成熟细胞如体细胞中多能性的诱导。

实施例4.与在bFGF中培养的细胞相比，针对在NM23二聚体中培养的人干细胞的原始态标志物相对始发态标志物的RT-PCR。将人胚胎H9干细胞平铺在涂覆有抗-MUC1*单克隆抗体MN-C3的塑料器具上，然后将其在NM23-S120G中培养(其被纯化为仅二聚体群体)持续37个传代。在8代、12代、14代、21代、26代、以及37代，撤出生长细胞的样品。为了比较，在小鼠饲养细胞(MEF)层上的bFGF中培养来自相同起始贮存的细胞。使用标准定量PCR技术对细胞进行分析。相对于GAPDH，测定了OCT4和NANOG(多能性基因)、KLF4和KLF2(原始态基因)和LHX2、OTX2、XIST和FOXa2(始发态基因)的表达水平，并且将其标准化至它们在MEF上的bFGF中培养的细胞的表达。如在图6中能够看出的，在NM23二聚体(NME1-S120G二聚体)中培养的干细胞表达高水平的原始态基因以及低水平的始发态基因，表明与在bFGF中培养的干细胞相比，细胞处于更始发的、原始状态。连同在图1，部分I.C)中示出的实施例1的结果一起，NME7具有原始态特性，而不是始发态特性，并且能够更好地支持多能干细胞生长。这些数据为添加外源NME7或诱导其针对维持细胞中的多能性、抑制分化或诱导细胞中的多能性的表达的核酸提供了基本原理。NME7的这种引入可以伴随着诱导分化的NME1的抑制。

实施例5.NME家族成员的抑制。

为了证明对于维持或诱导多能性的一些NME的有害作用和其他NME的有益作用，我们进行了敲低实验，其中，将siRNA用于敲低多能干细胞中的NME1、NME6和NME7中的一种或多种。添加siRNA以建立商业上可获得的ES细胞和iPS细胞。在无血清最小干细胞生长培养基中培养细胞，并且将多能干细胞平铺在干细胞表面受体(MUC1*)的抗体层上以避免引入存在于饲养细胞和基质胶中的随机的生长因子。

将NME1、NME6和NME7一起均进行敲低以在没有识别一些促进分化而其他抑制分化的情况下，评价敲低NM23的影响。如在图7A中能够看出的，NME1、NME6和NME7的抑制表达导致较差的细胞生长并且诱导分化，如通过其中细胞具有较小的细胞核并且呈现成纤维细胞样形态的细胞生长的变厚区域能够看出的。敲低NM23，而不区别对于多能性的维持哪种同种型是有害的以及哪种是有益的，在48小时之内引起分化。在对照实验中，添加等量的杂乱siRNA，但没有观察到诱导分化(图7B)。

在单个敲低实验中，抑制NME1具有很小的影响或不具有影响，并且在第一个48小时之内不存在显著的分化(图8A)。单独抑制NME6具有小量的影响，但在48小时内，没有出现与NME1敲低的显著不同(图8B)。与此形成鲜明的对比的是，下调NME7对干细胞生长具有显著的且负面的影响，并且诱导分化(图8C)。在三重和两重敲低实验(图8D-图8F)中，一起抑制NME1和NME7诱导分化并且抑制细胞生长(图8F)，但与其中抑制单独的NME1的图8A的比较表明，效应是由于添加了2倍之多的siRNA，而不是NME1和NME7之间的协同效应。

接下来，我们旨在确定添加重组NME1二聚体是否能够拯救由NME7的抑制诱导的分化。将针对NME1或NME7的特异性的siRNA(分别是图9A、图9B)添加至如已上描述的培养基中的多能干细胞。在相同的孔中，添加siRNA，但此外，添加重组NME1二聚体。如在图9D中能够看出的，重组NME1二聚体的添加防止了当抑制NME7时出现的分化。重组NME1二聚体的添加增加了其中抑制了NME1的多能细胞的生长，但在任一种情况下，都不存在显著分化。

通过添加纯化为稳定二聚体的重组NME1(图10B)，部分地拯救了细胞生长和由敲低所有三种NM23同种型诱导的分化(图10A)的抑制。

针对NME1、NME6和NME7的特异性的siRNA购自Santa CruzLaboratories,Santa Cruz,CA。使用的程序是Stemgen^tTM siRNA转染试剂盒。方法使用脂质以形成siRNA胶束，其将渗透细胞膜并且然后作用在靶RNA上以将其下调。

作为阴性对照，使用杂乱的序列siRNA并且进行模拟转染，其中，添加了试剂而没有添加siRNA。作为阳性对照，添加了OCT4siRNA。为了评估多重敲低在相同细胞中的影响，以单个敲低的3倍浓度添加了杂乱的siRNA。OCT4是多能性基因，因此抑制其表达将导致干细胞分化。

实施例6.将实施例5的实验继续进行至96个小时。细胞形态的评价证实了48小时观察，但具有另外的说明(caveats)。在96小时之后，将NME变体敲低实验扩展到分析多能性基因的表达以及分析抑制一种NME同种型对于其他NME同种型的影响。将来自每一个实验条件下的干细胞分别沉淀并且通过RT-PCR对其进行分析。测定了多能性基因Nanog、Oct4和Klf4，连同分化基因Foxa2和NME同种型NME1、NME6和NME7的表达水平。将表达水平标准化至siRNA的对照模拟转染。siRNA通常抑制靶基因50-75％。作为阳性对照，使用针对Oct4的特异性的siRNA。即使在正常干细胞培养基和生长因子中培养，用Oct4siRNA转染的干细胞也如预期的分化。

结果：参考图14，可以看出的是，在其中将多能性基因Oct4被敲低的分化对照中，分化基因Foxa2升高，并且所有三种NME基因的表达被抑制。当将NME1、NME6或NME7被敲低时，相同的分化基因Foxa2也升高。然而，还可以看出的是，当一种NME基因被敲低时，看起来其他NME基因之一或两者的增加。当NME1被敲低时，NME6增加。当NME6被敲低时，NME 1和NME7增加。当NME7被敲低时，NME1增加。

当将NME1的重组二聚体形式添加在培养基中时，存在拯救效果。图15表明，当NME1被敲低时，在分化基因Foxa2的表达中存在增加，尽管与其在分化对照中的表达水平相比增加是最小的。这与在其中已经将NME1敲低的干细胞中没有示出分化的明显迹象的图11A和图12A的照片一致。当将重组NME1二聚体添加在培养基中时，图15表明，在分化基因Foxa2中存在显著降低，并且在NME1和NME7的表达中存在增加。图11B和图12B的照片与该结果的一致之处在于，它们示出未分化的干细胞数目方面存在增加，但无论是否添加重组NME1二聚体，并不存在细胞的显著分化。该结果表明，在多能干细胞中，可以将NME1下调或敲除而不存在显著不利的影响，这是因为仍然存在起二聚体作用的NME6或NME7。

现在，参考图16，siRNA抑制NME6仅引起分化标志物Foxa2的少量增加。然而，当将重组NME1二聚体添加至培养基中时，在分化基因Foxa2的表达中存在大幅增加，然而，这伴随着多能性基因Klf4的表达和NME6自身表达的刺激的大幅增加。相应细胞的检测表明，当抑制NME6时，在细胞生长方面存在降低，而在分化方面存在非常少量的增加。结果表明，NME6存在于多能干细胞中，但其作用可以不是关键性的，在于可以将单独的NME6敲低而不存在有害作用。然而，添加重组NME1二聚体可能不会改善生长或分化的抑制。

NME7的敲低对于细胞生长具有最大和最负面的影响，并且细胞快速分化(参见图11B和图12B)。重组NME1二聚体的添加具有少量的拯救作用，其中，细胞呈现较少的分化(图11D和图12D)。图17表明，NME7敲低已经增加了当将NME1二聚体添加在培养基中时被拯救的分化基因Foxa2的水平。重组NME1二聚体的添加还降低了NME1表达的水平以补偿NME7的缺少。

图13表明，不能将所有三种NME进行敲低而对细胞生长和分化不具有灾难性影响。三重敲低在96小时之后导致极少的存活细胞，并且这些细胞是完全分化的(图13A)。NME1和NME7的敲低具有相同的灾难性的影响(图13)，表明NME6的作用不如NME1和NME7的作用重要。二聚体形式的重组NME1的添加改善了细胞生长，但仅改善至有限的程度(图13C、图13D)。图18表明，三重敲低引起分化基因Foxa2的增加和所有NME的表达的大幅降低。当将重组NME1二聚体添加至培养基时，Foxa2的水平降低，但多能性基因和NME基因的水平与分化对照中表达的水平可比较。图19表明，当将NME1和NME7一起进行敲低时，存在基因表达的非常类似的模式。

实施例7.在如以上描述进行的另一NME敲低实验中，将人胚胎干细胞(BGO1V)平铺在抗-MUC1*抗体(MN-C3)的表面上。使用siRNA将特异性NME蛋白质进行敲低，并且图像以及RT-PCR量化了siRNA转染后96小时的结果。在siRNA转染之后，没有将生长因子或血清添加至细胞。每隔48小时更换最小干细胞培养基。图22A，图22B示出了在抑制NME1之后96小时并且缺少添加的任何生长因子或血清的干细胞的照片。注意，细胞数目和细胞形态呈现干细胞样并且与在图22C，图22D中示出的其中添加了转染试剂但添加了无意义的siRNA的阴性对照实验不能区别。这些结果表明，抑制NME1对干细胞样生长不具有有害作用。通过比较，图23A，图23B表明抑制NME7抑制了干细胞样生长并且总体上抑制了干细胞生长。如通过图23B的中心处的更厚、更白的细胞簇可以看出的，细胞的一个剩余簇正在分化。通过与抑制多能性基因Oct4(图23C，图23D)的阳性对照的比较，可以看出NME7的抑制与关键多能性基因Oct 4的抑制可比较。在图24A，图24B中示出的，抑制NME6将干细胞样生长抑制至如在图24B中示出的视野中能够看出的分化区域那样的少量程度。然而，NME6抑制看起来类似于其中添加了杂乱的siRNA的阴性对照细胞(图24C，图24D)。

以上刚刚描述的所得NME抑制实验的RT-PCR，表明仅抑制NME7引起作为分化标志物的Foxa2的表达的显著增加。

实施例8.重组人NME7促进和维持多能干细胞生长。

针对维持多能性和抑制分化的能力，测试重组NME7。如先前描述的(PCT/US12/60684，2012年10月17日提交的，通过引用将其全部内容结合)，产生并且纯化NME7的可溶性变体NME7-AB。根据制造商的指导，使人干细胞(iPS cat#SC101a-1,System Biosciences)在小鼠成纤维细胞饲养细胞层上的4ng/ml bFGF中生长持续四次传代。然后，将这些来源的干细胞平铺在已经涂覆有12.5ug/孔的单克隆抗-MUC1*抗体(MN-C3)的6孔细胞培养板(Vita^TM,Thermo Fisher)中。以300,000个细胞/孔的密度平铺细胞。基础培养基是包含(consisting of)以下的最小干细胞培养基：400ml的DME/F12/GlutaMAX I(Invitrogen#10565-018)、100ml的敲除血清替代物(KO-SR,Invitrogen#10828-028)、5ml的100x MEM非必须氨基酸溶液(Invitrogen#11140-050)和0.9ml(0.1mM)的β-巯基乙醇(55mM贮液，Invitrogen#21985-023)。基础培养基可以是任何培养基。在一种优选的实施方式中，基础培养基不含其他生长因子和细胞因子。向基础培养基添加8nM的NME7-AB或8nM的复性并纯化为稳定二聚体的NM23-H1。每隔48小时更换培养基，并且由于加速的生长不得不在平铺后的第3天时收获和传代。图26表明，在NM23-H1二聚体中或在NME7单体中培养人干细胞引起多能干细胞生长。NME7和NM23-H1(NME1)二聚体两者多能性地生长，并且即使当100％汇合(confluent)时也不具有分化。如在照片中能够看出的，与在NM23-H1二聚体中生长的细胞相比，NME7细胞生长更快。第一次收获时的细胞计数证实了，与NM23-H1二聚体中的培养相比，NME7中的培养产生了1.4倍之多的细胞。

实施例9.ELISA试验表明NME7-AB同时结合至两个MUC1*胞外结构域肽。

使用Imject马来酰亚胺活化的BSA试剂盒(Thermo Fisher)将携带C端半胱氨酸的PSMGFR肽(PSMGFR-Cys)共价结合至BSA。在0.1M的碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液(pH 9.6)中，将PSMGFR-Cys结合的BSA稀释至10ug/mL，并且将50uL添加至96孔板的每个孔。在4℃下孵育过夜之后，用PBS-T将板洗涤两次，并且添加3％的BSA溶液以堵塞孔上的剩余结合位点。在室温下1h之后，用PBS-T将板洗涤两次，并且以不同的浓度添加在PBS-T+1％BSA中稀释的NME7。在室温下1h之后，用PBS-T将板洗涤三次，并且以1/500的稀释添加在PBS-T+1％BSA中稀释的抗-NM23-H7(B-9,Santa Cruz Biotechnology)。在室温下1h之后，用PBS-T将板洗涤三次，并且以1/3333的稀释添加在PBS-T+1％BSA中稀释的山羊抗小鼠-HRP。在室温下1h之后，用PBS-T将板洗涤3次，并且使用ABTS溶液(Pierce)在415nm下测定NME7的结合。

ELISA MUC1*二聚：使用针对NME7结合的方案，并且以11.6ug/mL使用NME7。

在室温下1h之后，用PBS-T将板洗涤三次，并且以不同的浓度添加在PBS-T+1％BSA中稀释的组氨酸标记的PSMGFR肽(PSMGFR-His)或生物素化的PSMGFR肽(PSMGFR-生物素)。在室温下1h之后，用PBS-T将板洗涤三次，并且以1/5000的浓度添加在PBS-T+1％BSA中稀释的His标签-HRP(Abcam)或链霉亲和素-HRP(Pierce)。在室温下1h之后，用PBS-T将板洗涤三次，并且使用ABTS溶液(Pierce)在415nm下测定PSMGFR肽与已经结合至结合了BSA的另一PSMGFR肽(其不能由抗组氨酸抗体或由链霉亲和素发信号)的NME7的结合。

实施例10.六聚体形式的NME1抑制癌细胞生长和迁移。

T47D乳癌细胞分泌NME1和NME7。将T47D MUC1*-阳性乳癌细胞在变化量的已经纯化为基本上均是六聚体的稳定群体的NME1中培养以确定六聚体NME1是否以干细胞生长被抑制的相同方式抑制癌细胞生长和干细胞样生长。T47D细胞在10％的FBS RPMI中生长并且用胰蛋白酶收集。将细胞离心下来并且用血细胞计数器计数。将6,000个细胞/孔接种在96孔板中。24小时之后，将培养基更换为1％的FBS RPMI加上变化浓度的六聚体。48小时之后再次更换培养基。使用测量存在于细胞中的ATP的量的Vialight Plus(Lonza,Rockland ME)细胞试验在96h时测定细胞存活率。将数据绘制为相对于仅培养基对照的百分数细胞生长。作为另一对照，将我们凭借其抑制癌细胞生长的能力而识别的小分子(MN547)作为阳性对照。图28表明，六聚体形式的NME1以浓度依赖性的方式抑制乳癌细胞的增殖。

实施例11.六聚体形式的NME1抑制癌细胞迁移；NME1二聚体则不会。

通常将癌细胞迁移认为是癌细胞侵入其他组织或在各个位置植入以开始隐性转移的方法之一。测试癌细胞迁移的抑制剂的一种方法是“划痕试验”。在这些试验中，将癌细胞平铺并且允许其增殖至接近汇合。将移液管尖端或其他仪器用于刮去部分细胞。洗掉脱落的细胞，留下具有在缺乏细胞的每个孔中的“斜线”或“十字”形状区域的生长癌细胞的背景。添加纯化为六聚体或二聚体的纯的群体的NME1并且允许其生长另外的16小时或24小时。

使DU145MUC1*-阳性前列腺癌细胞在10％的FBS RPMI中生长，并且用胰蛋白酶收集。将细胞离心下来并且用血细胞计数器计数。将约1x10⁶个细胞/孔平铺在10％的FBS RPMI中的6孔板中。次日使用无菌的1000uL移液管尖端进行十字标记(NME1六聚体)或斜线标记(NME1二聚体)以除去限定区域中的细胞。轻轻洗掉脱落的细胞。将培养基更换成10％的FBS加变化浓度的六聚体或二聚体。在划痕时间(t＝0)时拍摄照片，并且在16小时之后使用十字的线作为图片中心再次拍摄。对于时间零和对于时间16小时，使用ImageJ软件测定划痕的面积。将数据表示为相对于其自身的零小时的照片，细胞侵入划痕中的百分数。

图29A示出了针对用示出的浓度下的NME1六聚体处理的癌细胞，百分数侵入的Image J量化的图。图29B-图29E示出了时间零(B，C)和16小时(D，E)的照片。通过与对照(D)的比较，清楚的是，NME1六聚体(E)抑制癌细胞侵入。

图30A示出了针对用示出的浓度下的NME1二聚体处理的癌细胞，百分数侵入的Image J量化的图。图30B-图30K示出了时间零(B-F)和16小时(G-K)的照片。通过与对照(G)的比较，清楚的是，NME1二聚体(H，I)没有抑制癌细胞侵入。回想NME1二聚体结合至癌细胞上的MUC1*生长因子受体的胞外结构域并且使其二聚以刺激生长。如我们已经用干细胞示出的，～4-16nM的NME1二聚体的浓度足以使得一个NME1二聚体结合至两个(2)MUC1*受体。在较高的浓度(J，K)下，将存在一个二聚体结合至每一MUC1*受体，而不是使两个受体二聚。因此，在非常高的NME1二聚体浓度下，存在侵入的抑制。

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本文中引用的所有参考文献的全部内容通过引用并入本文。

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本领域技术人员将认识到、或利用不超过常规的实验能够确定本文具体描述的本发明的具体实施方式的许多等效方式。这些等效方式旨在包括在权利要求的范围内。

Claims

1.一种用于由起始细胞产生较不成熟细胞的方法，包括诱导所述起始细胞回复至较不成熟状态，包括增加其多聚化状态是生物学活性状态的NME家族成员的量或减少其多聚化状态是生物学无活性状态的NME家族成员的相对量。

2.一种抑制胚胎干细胞、诱导的多能干细胞或祖细胞分化的方法，包括增加其多聚化状态是生物学活性状态的NME家族成员的量或减少其多聚化状态是生物学无活性状态的NME家族成员的相对量。

3.一种维持或诱导细胞中的多能性的方法，包括减少其多聚化状态是生物学无活性状态的NME家族成员的相对量。

4.一种抑制胚胎干细胞、诱导的多能干细胞或祖细胞分化的方法，包括减少其多聚化状态是生物学无活性状态的NME家族成员的相对量。

5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述NME家族成员的处于生物学无活性状态的多聚化状态是六聚体或高阶多聚体。

6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述NME家族成员的处于生物学活性状态的多聚化状态是包含能够结合至相同靶受体的两种单元的二聚体或单体。

7.根据权利要求5所述的方法，其中，所述NME家族成员是NME1(NM23-H1)。

8.根据权利要求5所述的方法，其中，所述NME家族成员是NME2(NM23-H2)。

9.根据权利要求6所述的方法，其中，所述NME家族成员是有利于二聚化或具有两个用于其同源配体的结合结构域的NME1的突变体或变体。

10.根据权利要求6所述的方法，其中，所述NME家族成员是NME7。

11.根据权利要求6所述的方法，其中，所述NME家族成员是NME6。

12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，通过添加其多聚化状态是生物学活性状态的NME家族成员减少其多聚化状态是生物学无活性状态的所述NME家族成员的相对量。

13.根据权利要求12所述的方法，其中，通过引入核酸或小分子增加其多聚化状态是生物学活性状态的所述NME家族成员，所述核酸或小分子引起所述NME家族成员的表达。

14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，通过引入核酸或小分子减少其多聚化状态是生物学无活性状态的所述NME家族成员的相对量，所述核酸或小分子下调所述NME家族成员的表达。

15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，通过同时引入下调形成无活性状态的第一NME的第一核酸和上调形成活性状态的所述NME的第二核酸减少其多聚化状态是生物学无活性状态的所述NME家族成员并且增加其多聚化状态是生物学活性状态的所述NME家族成员。

16.根据权利要求14或权利要求15所述的方法，其中，下调的所述核酸是反义DNA、抑制性RNA、siRNA或shRNA，并且上调的所述核酸是编码DNA、RNA、mRNA或质粒。

17.根据权利要求16所述的方法，其中，修饰所述核酸以促进进入所述细胞。

18.根据权利要求14至17所述的方法，其中，被下调的所述NME家族成员是NME1、NME2、或NME1和NME2。

19.根据权利要求14至17所述的方法，其中，被上调的所述NME家族成员是偏好二聚化的NME1、NME2的突变体或变体、NME6或NME7。

20.引起偏好二聚体形成或具有两个相同配体的结合结构域的NME1突变体或变体的表达的核酸；和/或

a.NME7；和/或

b.引起NME7的表达的核酸；和/或

c.NME6；和/或

d.引起NME6的表达的核酸；和/或

e.下调NME1或NME1和NME2的核酸。

21.一种用于培养干细胞或祖细胞的培养基，其中，所述培养基包含：

c,NME7；和/或

d.引起NME7的表达的核酸；和/或

e.NME6；和/或

f.引起NME6的表达的核酸；和/或

g.下调NME1或NME1和NME2的核酸。

22.一种用于诱导多能性或用于诱导细胞回复至较不成熟状态的培养基，其中，所述培养基包含：

c.NME7；和/或

d.引起NME7的表达的核酸；和/或

e.NME6；和/或

f.引起NME6的表达的核酸；和/或

g.包含下调NME1或NME1和NME2的核酸。

23.根据权利要求22所述的培养基，其中，所述培养基还包含编码一些或全部诱导多能性的基因或小分子的核酸，所述基因或小分子包括：OCT4、SOX2、NANOG、KLF4以及c-Myc。

24.一种宿主细胞，所述宿主细胞携带引起其多聚化状态是生物学无活性状态的NME家族成员的表达降低的合成核酸。

25.根据权利要求24所述的宿主细胞，其中，所述NME家族成员是NME1。

26.根据权利要求24所述的宿主细胞，其中，所述NME家族成员是NME1和NME2。

27.一种宿主细胞，所述宿主细胞携带引起其多聚化状态是生物学活性状态的NME家族成员的表达增加的合成核酸。

28.根据权利要求27所述的宿主细胞，其中，所述NME家族成员是偏好二聚体形成或具有两个相同配体的结合结构域的NME1突变体或变体。

29.根据权利要求27所述的宿主细胞，其中，所述NME家族成员是NME7。

30.根据权利要求27所述的宿主细胞，其中，所述NME家族成员是NME6。

31.一种宿主细胞，所述宿主细胞携带引起其多聚化状态是生物学无活性状态的NME家族成员的表达降低的合成核酸以及引起其多聚化状态是生物学活性状态的NME家族成员的表达增加的合成核酸。

32.根据权利要求31所述的宿主细胞，其中，其表达将被降低的所述NME家族成员是NME1或NME1和NME2，并且其表达将被增加的所述NME家族成员是偏好二聚体形成或具有两个相同配体的结合结构域的NME1突变体或变体、和/或NME6、和/或NME7。

33.根据以上权利要求24至32中任一项所述的宿主细胞，其中，所述细胞还携带引起不在所述宿主细胞中表达或在所述宿主细胞中突变的基因的表达的核酸。

34.根据权利要求33所述的宿主细胞，所述宿主细胞还携带核酸以下调不想要的基因并且上调期望的或校正的基因。

35.根据以上权利要求24至34中任一项所述的宿主细胞，其中，所述宿主细胞是胚胎干细胞、诱导的多能干细胞、祖细胞或体细胞。

36.一种治疗患者的方法，其中，将以上权利要求23至35中任一项所述的细胞给予至所述患者。

37.根据权利要求36所述的方法，其中，通过骨髓移植、移植到特定位点、输液、注射或局部治疗给予所述细胞。

38.根据权利要求36所述的方法，其中，所述治疗针对通过用干细胞、祖细胞治疗，或通过校正遗传异常或缺陷会减轻的任何疾病或病况。

39.根据权利要求36所述的方法，其中，在给予患者之前将所述细胞分化，并且其中，在分化过程中将NME1、NME6或NME7撤出。

40.一种治疗患者中的癌症的方法，包括将药剂给予至所述患者使得所述药剂增加其多聚化状态是生物学无活性状态的NME家族成员的量或减少其多聚化状态是生物学活性状态的NME家族成员的相对量。

41.根据权利要求40所述的方法，其中，其多聚化状态是生物学活性状态的所述NME家族成员是NME7。

42.根据权利要求40所述的方法，其中，其多聚化状态是生物学无活性状态的NME家族成员是NME1、NME2或NME8。