CN101652469A - 用于鉴定和操作细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本申请披露了一种从包含干细胞的混合种群中分离或选择干细胞的方法，其包括使所述细胞种群与特异于截短型MUC1受体的配体接触，其中，细胞上存在截短型MUC1受体表明它们是干细胞。

Description

用于鉴定和操作细胞的方法

技术领域

本发明涉及一种用于扩增表达MUC1的细胞群的方法。本发明还涉及用于鉴定、分离、扩增和操作表达MUC1的细胞、特别是干细胞和前体细胞的方法和试剂。

背景技术

下列文献通过引用结合于本文中：2004年8月26日提交的PCT申请号PCT/US2004/027954(WO 2005/019269)；2002年7月18日公布的PCT公开号WO 02/056022；2001年11月27日提交的U.S.专利申请序列号09/996,069，于2003年2月20日以公开号2003/0036199公布，其阐述MUC1受体在肿瘤发生中的作用。

干细胞是一类可产生多种不同细胞类型，随后可生成多种不同组织类型的细胞。干细胞的一个重要特征是它们具有无限自我更新以及分化为不同类型成体细胞的能力。祖细胞是一种更后阶段类型的细胞，也具有分化为不同种类细胞的能力，但祖细胞已失去了成为任何类型细胞的能力。

存在着三种主要类型的干细胞。全能细胞例如受精卵，能够产生完整且具有全部功能的生物体。相比全能干细胞，多能干细胞(pluripotent stem cell)更加特化，因为其不能产生完整的生物体或人体但其能够产生机体内每一种类型的细胞。多效干细胞(multipotent stem cells，专能干细胞)可产生其所起源组织类型中存在的细胞类型。例如，血液专能细胞仅可生成特化血细胞，而皮肤专能细胞则仅可生成多种类型的皮肤细胞。

干细胞具有在治疗中应用的巨大潜能。疾患例如阿耳兹海默症、帕金森症、糖尿病、脊髓损伤、中风以及某些类型的出生缺陷均由成年人体无法再生的细胞和组织的破坏而引起。因为干细胞具有形成任何细胞类型的潜能，因此其可用来生成新细胞以治疗这些疾病。

为了实现干细胞疗法的可能性，人们必须能够鉴定并分离干细胞且必须能够理解并具有操作介导干细胞更新和分化的机制的能力。现在，对这些机制的认识还处在其初期阶段。现在，存在着至少三种因素在干细胞分化中发挥作用：1)未分化细胞群被已分化细胞污染；2)粘附于一个表面；以及3)添加生长因子，其中一些生长因子支持干细胞自我更新，还有一些则引导该细胞直向分化途径。目前，鉴定并分离纯的未分化细胞群极其困难。现有方法包括测定细胞对一种抗体的反应性，而所述抗体针对某种已被确定为特定分化状态“标志物”的蛋白。较典型地，可检测细胞中一组标志物的存在情况，这些标志物可共同表示特定分化状态。例如，用于鉴定人类多能干细胞的现有方法包括检测细胞中OCT4、SSEA4、TRA1-60和TRA 1-81的存在情况。然而，该方法还可鉴定并非表现真正多能性而可能处于某些分化途径初始阶段的细胞。这些细胞多数可能分泌可促使周围细胞定向于相同分化途径的因子。因此，相比纯化细胞群，混合或被污染细胞群将分化更迅速且将不能用于治疗性植入，因为未分化细胞将被促使沿一种途径进行分化，而该途径可能得到一种不需要的细胞类型。例如，多能细胞群被已开始分化为血细胞的细胞污染将不能理想植入帕金森症患者的脑内。因此，用于鉴定和分离处于不同分化状态的细胞的方法，将是对现有技术的一个重大改善，且将使治疗性应用干细胞成为可能。

现在已有证据支持下列观点，即干细胞粘附于一个表面可促进分化过程。相比饲养层法(feeder layer method)，在基质胶培养基中培养干细胞的实验产生较高比例的分化克隆，可能是由于基质胶养基中存在大量复杂的未鉴定的生长因子或者可能由于表面效应。因此，可促进锚定非依赖性(anchorage-independent)细胞生长的方法对于未分化干细胞的繁殖将非常有用。

因为目前尚不清楚哪些生长因子支持多能性更新以及哪些生长因子启动分化，但胚胎干细胞现在已可在补充了FGF的最低培养基中生长，已知FGF是似乎可促进自我更新的生长因子。此外，干细胞可在“饲养”细胞(通常是成纤维细胞，其分泌其他必需但尚未鉴定的支持干细胞生长的因子)层上生长。这些饲养细胞的确产生了生长因子的环境，其中多种生长因子还可启动分化，如已通过一个事实即该生长方法可产生未分化和分化克隆混合物所证实的。因此，这对于鉴定促进未分化细胞再生的特殊生长因子以及鉴定那些使细胞定向进入一种分化途径的因子将极具优势。

因此，目前人们对于开发用以鉴定并分离不同分化状态、尤其是多能性状态细胞的方法、开发锚定非依赖性未分化细胞培养的方法以及确定哪些因子支持其自我更新过程以及哪些因子启动分化均具有相当的兴趣。开发用以鉴定新的干细胞来源的方法也将非常有益，无论其为胚胎还是成体、全能、多能或多效干细胞。

近期的研究支持癌症干细胞(CSC)的存在(Prospectiveidentification of tumorigenic stem cells.Al-Hajj M，Wicha MS，Benito-Hernandez A，Morrison SJ and Clarke MF.(2003).Proc.Natl.Acad.Sci.USA，100，3983-3988；Characterization of clonogenic multiple myeloma cells.Matsui W，Huff CA，Wang Q，Malehorn M T，Barber J，Tanhehco Y，Smith BD，Civin CI and Jones RJ.(2004)Blood，103，2332-2336；Identification of a cancer stem cell in human brain tumor.Singh SK，Clarke ID，Terasaki M，Bonn VE，Hawkins C，Squire J and Dirks PB.(2003)Cancer Res.，63，5281-5828)。CSC是那些足以启动肿瘤生长、在另外的无癌宿主接种肿瘤或者在之前已患癌的宿主接种一种新的肿瘤位点的细胞。正常干细胞的特征在于其能够无限自我更新以及分化而形成不同组织类型成体细胞的能力。祖细胞具有进一步分化为不同细胞类型的能力但丧失了分化为任何细胞类型的能力。已证实，并非所有癌细胞均具有自我更新、在新宿主中诱发疾病或者形成新肿瘤的能力(A cellinitiating humanacute myeloid leukaemia after transplantation into SCID mice.Lapidot T，Srirad C，VormoorJ，Murdoch B，Hoang T，Caceres-Cortes J，Minden M，Paterson B，Caligiuri M and Dick J.(1994).Nature，17，645-648；Identification of a cancer stem cell in human brain tumor.SinghSK，Clarke ID，Terasaki M，Bonn VE，Hawkins C，Squire J and Dirks PB.(2003)CancerRes.，63，5281-5828；Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy thatoriginates from a primitive hematopoietic cell.Bonnet D.，and Dick JE.(1997)Nat.Med.3，730-737)。而是癌细胞中仅一小部分具有这种自我更新以及形成新肿瘤即转移的能力。一种重要的理论是癌症干细胞可能以类似于正常干细胞的方式起作用(Self-renewal and solid tumor stem cells Al-Hajj M andClarke MF(2004)Oncogene，23，7274-7282)。实体瘤发生于具有干细胞群的器官中。上皮癌(包括乳腺、前列腺、结肠和肺癌)是成人中最常见的癌症。这些癌症中超过75％的特征为MUC1受体的异常表达(Development and characterization of breastcancer reactive monoclonal antibodies directed to the core protein of the human milk mucinBurchell J，Gendler S，Taylor-Papadimitriou J，Girling A，Lewis A，Millis R，and Lamport D.(1987)Cancer Res.，47，5476-5482；Monoclonal antibodies to epithelial sialomucinsrecognize epitopes at different cellular sites in adenolymphomas of the parotid gland Zotter S，Hageman P C，Lossnitzer A，Mooi W and Hilgers J(1988)Cancer Rev.11-12，55-101；Mucins and mucin binding proteins in colorectal cancer Byrd JC and Bresalier RS(2004)Cancer Metastasis Review Jan-Jun；23(1-2)：77-99)，其中异常表达意味着该受体不再定位于管腔细胞的顶缘，而是不均匀地分布于整个细胞表面上(Differential reacitivity of a novel monoclonal antibody(DF3)with human malignant versus benign breast tumors(1984)Kufe D，Inghirammi G，Abe，M，Hayes D，Justi-wheeler H and Schlom J Hybridoma，3，223-232)。最大MUC1阳性百分比癌存在于乳腺癌中，其中大于96％表现出MUC1的异常表达。有趣的是，在成年女性中，伴随每一次月经周期和妊娠，乳腺组织必须经历周期性的生长和凋亡爆发。因此得出结论，在成年女性的一生中乳腺组织必须维持有功能性干细胞或者至少祖细胞群。

鉴定可驱动癌细胞生长的生长因子及其受体，将成为理解如何培养并操作干细胞和祖细胞用于研究、治疗和其他用途的关键。

MUC1(粘蛋白1)是一种可在多种上皮细胞类型上(Molecularcloning and expression of the human tumorassociated polymorphic epithelial mucin，PEM.Gendler Sj，Lancaster CA，Taylor-Papadimitriou J，Dhuig，T，Peat，N，Burchell，J，Pemberton，L，Lalani，E-N and Wilson D.(1990)J.Biol.Chem.265，15286-15293；Episialin，a carcinoma associated mucin，isgenerated by a polymorphic gene encoding splice variants with alternative amino termini.Ligtenberg MJL，Vos HL，Genissen，AMC and Hilkens J.(1990)J.Biol.Chem.265，15573-15578)或造血细胞上(Evaluation of MUC1 and EGP40 in Bone marrow andPeripheral Blood as a Marker for Occult breast cancer(2001 Zhong XY，Kaul S，Bastert G，Arch Gynecol Obstet 264：177-181)以及祖细胞上(Epithelial Progenitors inthe Normal Human mammary Gland.Stingl J，Raouf A，Emerman J，and Eaves C.(2005).Journal of Mamary Gland Biology and Neoplasia，Vol.10，No.1，49-59)表达的跨膜粘蛋白。细胞表面受体MUC1存在于健康上皮的顶缘，但在多种人类实体瘤中异常表达(分布于整个细胞表面上)。现在已知，MUC1受体可一段时间内从细胞表面上“脱落”，因为乳腺癌患者的血液中可检测到其胞外结构域的一部分。本发明人之前已披露，裂解后MUC1受体中仍粘附于细胞表面的部分(主要由PSMGFR组成)是介导体外MUC1阳性癌细胞生长的主要生长因子受体。转染包含完整跨膜和胞质结构域但其外功能区终止于PSMGFR序列末端的突变MUC1受体，足以赋予这些细胞锚定非依赖性生长的能力。

更详细地，MUC1包括本文如下命名的几个区域，按照从C末端至延伸穿过细胞膜并延伸入细胞外结构域的顺序加以列举。MUC1受体的基本结构示于图1中。如所示出的，该受体包括：1)胞质尾区；2)跨膜部分；3)MGFR；4)IBR，5)独特区(uniqueregion)，6)重复区以及包含信号肽的N末端区。关于MUC1及其在正常和肿瘤细胞内的功能的详述，参见PCT/US2005/032821，其关于细胞表面上已裂解MUC1功能和活性的全部描述均以引用方式结合于本文中。

发明内容

一方面，本发明涉及用于干细胞鉴定、分离和操作的方法和试剂。另一方面，本发明涉及通过激活细胞上MUC1受体而用于刺激或增强细胞群增殖的方法。该激活可通过使细胞与(i)多聚化MUC1的MGFR部分的试剂；(ii)促进将MUC1裂解为生长因子受体形式的试剂；或(iii)激活该MUC1受体的MGFR部分的配体相接触而实现。所述细胞可为非肿瘤性细胞、优选未成熟细胞如干细胞、祖细胞、子宫内膜细胞、中性粒细胞前体或中性粒细胞。此外，在该方法中，MUC1受体可为一种细胞表面连接的裂解产物。该MUC1裂解产物可为MGFR。而且该MGFR可包含PSMGFR。在该方法中，该MUC1受体可通过MUC1受体的多聚化试剂而激活。而且，该多聚化试剂可为二价试剂。所述二价试剂可识别MGFR的一部分。而且，该二价试剂可为一种合成的化合物。该二价试剂可为MUC1的二聚化配体。此外该二价试剂可为一种抗体。在上文所述方法中，促进裂解的试剂可为一种酶。在一个优选方面，该酶可为TACE/ADAM17或MMP14(也称为MT1-MMP)。

另一方面，本发明涉及一种治疗症状表现为白细胞计数降低的患者的方法，包括给予患者一种用于激活细胞内MUC1受体的试剂。该方法可包括给予需要该治疗的患者，其中激活通过使细胞与(i)多聚化MUC1的MGFR部分的试剂；(ii)促进将MUC1裂解为生长因子受体形式的试剂；或(iii)激活该MUC1受体的MGFR部分的配体相接触而实现。

另一方面，本发明涉及一种用于治疗患者的方法，而所述患者所表现出的症状表明：通过采用可激活细胞内MUC1受体的试剂引起未成熟细胞增殖可获得疗效。在该方法中，MUC1可通过使MUC1受体的MGFR部分二聚化而激活。MUC1还可通过刺激MUC1裂解从而使得仍然连接于细胞表面的部分基本上由PSMGFR优选天然-PSMGFR(nat-PSMGFR)组成而激活。此外在该方法中，MUC1还可通过刺激生成MUC1或翻译后修饰的MUC1而激活。已知GCSF和GMCSF可刺激干细胞和祖细胞从活体骨髓中分泌。因此，GCSF和/或GMCSF可用于本发明的方法中，从而使得干细胞和祖细胞更加易于被影响干细胞、祖细胞以及某些分裂迅速的上皮细胞(如那些衬于导管腔缘的细胞以及衬于呼吸道和消化道的细胞)生长的MUC1调节试剂接近。而且在该方法中，所述MUC1可通过加入粒细胞集落刺激因子(G-CSF)刺激MUC1或翻译后修饰的MUC1生成而激活。

另外一方面，本发明涉及一种用于治疗患者的方法，所述患者的症状可通过在需要细胞增殖的部位给予患者编码(i)MUC1、(ii)位于细胞表面上的MUC1片段或者(iii)MUC1的MGFR部分的DNA引起未成熟细胞增殖而得到缓解。

另一方面，本发明涉及一种用于通过导入编码MUC1、位于细胞表面上的MUC1片段或者MUC1中的MGFR部分的DNA而在体外刺激未成熟细胞增殖的方法。在该方法中，该患者可采用用于治疗MUC1阴性癌的化疗药物进行治疗。

本发明还涉及一种组合物，包含：(i)多聚化MUC1的MGFR部分的试剂；(ii)促进MUC1裂解成为生长因子受体形式的试剂；或者(iii)激活该MUC1受体中MGFR部分的配体；以及一种药用载体。

申请人已经发现MUC1^*在人类未分化多能胚胎干细胞表面上表达。因为已知MUC1^*在癌细胞上作为生长因子受体起作用，因此可以推断MUC1^*在干细胞上也作为生长因子受体起作用。细胞粘附可引导干细胞分化。

在本发明的方法中，通过转染入该MUC1^*受体，“正常”细胞可锚定非依赖性地生长。在某些受体密度下(其表现出高密度自我信号)，锚定非依赖性细胞生长可无需刺激而进行；加入二价抗MUC1^*抗体或其他多聚化试剂优选二聚化试剂，可增强这种锚定非依赖性生长的能力。

本申请人已证实，向未分化干细胞中加入二价抗MUC1^*抗体(抗-PSMGFR和抗-PSMGFR-天然)大大促进了干细胞生长而未诱导分化。加入二价抗MGFR抗体还能够使干细胞锚定非依赖性生长，这有助于延迟分化。加入二价抗MGFR抗体增强了干细胞增殖而无需加入FGF或在成纤维饲养细胞上生长。可选择性将FGF或+/-G-CSF或条件培养基(conditioned media)与抗MGFR抗体一起加入，以使刺激干细胞生长更为增强。

干细胞增殖增强还可通过加入一种(或多种)多聚MUC1^*配体而实现，本发明人已证实NM23可刺激MUC1^*阳性癌细胞的生长。因此可以推断，加入NM23特别是二聚体形式的NM23可用来激活该MUC1^*受体并刺激干细胞生长。

本发明人已观察到未分化胚胎干细胞独特表达裂解形式的MUC1，本文中称为MUC1^*或MGFR，且未表现出全长MUC1的表面表达。然而，人们发现干细胞分化的第一步涉及到MUC1裂解的终止。且进一步发现细胞经历一个过渡阶段，在该阶段它们既表达全长MUC1(分化标志物)又表达OCT4(之前鉴定的一种多能性标志物)。本申请人还观察到代数较高的干细胞常常表现出所有已知的多能性标志物，而且既表达全长MUC1又表达裂解的MUC1。这些结果也支持一个结论，即已知的多能性标志物尚不足够，评估多能状态必须包括一些试验来检测裂解和全长形式的MUC1。因此，针对MUC1^*和全长MUC1的抗体可在一种新方法中联合应用，该方法用于鉴定和分离处于独特多能状态的干细胞或者其缺失。

根据本发明的下列说明、参考附图以及所附权利要求，将能够更彻底地理解本发明的这些以及其他目的。

附图说明

从本文以下给出的详细说明以及附图，将能更彻底地理解本发明，给出附图仅是为了举例说明而非限制本发明，其中：

图1是全长MUC1受体和生长因子受体裂解产物MGFR的示意图。

图2是细胞增殖分析的曲线图，其中将三种(3)不同的细胞系用抗PSMGFR加以处理，其中(A)乳腺癌细胞系1504、(B)HeLa细胞，均表现为非常轻微MUC1阳性且对MUC1二聚化表现轻微的生长反应，(C)HEK293细胞为MUC1阴性。将标准化的细胞生长作为抗体浓度的函数绘图。MUC1阳性乳腺癌细胞系1504的生长曲线表现出典型的双相反应(这是I类生长因子受体的特征)；因为每一个抗体二聚化每两个受体，因此当抗体浓度增加时细胞生长得到增强。当抗体浓度过高且每个单一抗体结合单个受体而非二聚化两个受体，则细胞生长开始减慢。如果未发生二聚化，则生长信号消失。因为缺乏MUC1受体，因此HEK293细胞对于抗PMGFR引起的MUC1刺激无反应。这些结果表明，MUC1受体中包含PSMGFR序列的部分作为生长因子受体发挥作用并在二聚化时刺激细胞分裂。抗-Muc1^*指抗MGFR抗体。

图3是细胞增殖分析的曲线图，其中人胚肾(HEK)293细胞(MUC1阴性)已稳定转染了MUC1受体(含一个截短型外功能区，终止于PSMGFR序列的末端)，用抗-PSMGFR对其进行处理。将标准化的细胞生长作为抗体浓度的函数绘图，表明MUC1受体的PSMGFR部分通过受体该部分二聚化而介导细胞生长。

图4是细胞增殖分析的曲线图，其中将三种(3)细胞系用单价抗PSMGFR进行处理，而该单价抗PSMGFR不能二聚化所述受体。该曲线图表明，对照细胞系(A)HeLa和(B)HEK293并未由于加入抗体而受影响，但在MUC1阳性细胞系乳腺癌细胞系1504(C)和(D)中，细胞生长则受到抑制。

图5是蛋白印迹图，表明一旦MUC1受体的PSMGFR区域发生二聚化，则MAP激酶增殖途径的ERK2分支即可激活(ERK2被磷酸化)。

图6是竞争试验的蛋白印迹图，其中结合MUC1的PSMGFR区域的小分子和抗PSMGFR竞争与该位点的结合。如果存在竞争性小分子，则该抗体不发生结合，且ERK2磷酸化被抑制。这些结果表明，MUC1受体的PSMGFR部分介导细胞生长，且受体二聚化可触发该生长信号。图中提到的竞争性化合物MN9的化学式是：

化合物MN21是：

而化合物MN13是：

图7A-7B示出了人乳腺癌样本的四幅(4)放大照片。(A)和(C)是MUC1阳性癌相同部分的相邻切片，(B)和(D)是MUC1阴性癌相同部分的相邻切片。切片(A)和(B)(上图)已用抗PSMGFR进行了处理，其结合MUC1受体中在受体裂解后仍然粘附于细胞表面的部分。切片(C)和(D)(下图)已用抗VU4H5抗体进行了处理，其结合MUC1受体中通常从癌细胞表面脱落的串联重复部分。可注意到，相比VU4H5染色，抗PSMGFR染色亮度较高。该结果表明，癌细胞表面上的主要MUC1受体形式缺乏所述串联重复部分，基本上由PSMGR序列组成。

图8A-8C示出了乳腺癌活检样本相邻切片的三幅(3)照片，用A)H&E；B)抗PSMGFR或C)VU4H5进行染色。比较B)和C)表明，VU4H5在胞质弥散着色，而抗PSMGFR则在细胞表膜清晰着色。这表明，在癌细胞上，MUC1受体已经裂解释放出了所述串联重复部分，而包含PSMGFR序列的部分则仍然粘附于细胞表面上。

图9A-9D示出了人肺癌组织样本的四幅(4)放大照片。(A)和(C)是MUC1阳性肺癌第一个截面的相邻切片，而(B)和(D)是来自MUC1阴性癌的相邻切片。切片(A)和(B)(上图)已用抗PSMGFR进行了处理，其结合MUC1受体中在受体裂解后仍然粘附于细胞表面的部分。切片(C)和(D)(下图)已用抗VU4H5抗体进行了处理，其结合MUC1受体中通常从癌细胞表面脱落的串联重复部分。可注意到，相比VU4H5染色，抗PSMGFR染色亮度较高且抗PSMGFR着色主要限于细胞表面。这些结果再次表明，MUC1阳性肺癌细胞表面上的主要MUC1受体形式大多缺乏所述串联重复部分，基本上由PSMGR序列组成。

图10A-10C以较高放大倍数示出了与图9A-9D中相同的一组MUC1阳性肺癌组织样本。放大倍数提高时，可很容易观察到抗PSMGFR染色限于细胞表面，而VU4H5则是弥散的胞质分布，证实了MUC1阳性肺癌细胞表面上MUC1受体裂解以释放串联重复序列并留下MGFR部分粘附于该细胞表面。

图11A-11B示出了两幅(2)结肠癌组织样本的照片，其已用(A)抗PSMGFR或(B)VU4H5进行了染色。箭头指出了切片中癌性较强的部分，这可由其已丢失全部细胞结构而表明。切片(A)示出了用抗PSMGFR染色的黑色区域，但相邻的切片(B)中用VU4H5(其识别MUC1受体中的串联重复部分)染色的相同区域则根本未表现出染色。这些结果表明，在MUC1阳性结肠癌中，MUC1受体被裂解从而释放出串联重复部分，但受体包含PSMGFR序列的部分保持完整，并粘附于细胞表面。

图12A-12B示出了两幅用抗PSMGFR(A)或VU4H5(B)染色的MUC1阴性组织样本的照片。注意：在(A)中，箭头指出了几个肥大细胞祖细胞(mast progenitor cell)，其表面已经完全被PSMGFR而非VU4H5着色。这些结果表明包含PSMGFR序列而非串联重复区域的裂解形式的MUC1受体存在于肥大细胞祖细胞的表面上。

图13是图12(A)的放大形式，示出了由抗PSMGFR包被的肥大细胞祖细胞。箭头指出了由MUC1裂解产物PSMGFR包被的肥大细胞祖细胞。

图14A-14B示出了健康输卵管组织样本中相邻切片的照片，其用结合裂解MUC1的抗PSMGFR(A)或者结合全长MUC1的VU4H5(B)进行染色。

图15A-15F示出了用MUC1^*和OCT4抗体进行免疫标记的人胚胎H9干细胞(40代)。A)MUC1^*。B)OCT4-区至点线右侧表示未分化克隆。C)MUC1^*与OCT4的合并图。D和E)是不加一抗的对照。F)A-C中所示相同细胞的DAPI染色。所有图像均以40×的放大倍数进行拍照。

图16A-16F示出了用全长MUC1和OCT4抗体进行免疫标记的人胚胎H9干细胞(40代)。A)MUC1全长。B)OCT4-区域至点线右侧表示未分化克隆。C)MUC1全长与OCT4的合并图。D和E)是不加一抗的对照。F)A-C中所示相同细胞的DAPI染色。所有图像均以20×的放大倍数进行拍照。

图17A-17E示出了用MUC1^*和SSEA4抗体进行免疫标记的未分化H9细胞(40代)。A MUC1^*。B SSEA4。C MUC1^*和SSEA4的合并图。D和E是不加一抗的对照。所有图像均以40×的放大倍数进行拍摄。

图18A-18E示出了用结合MUC1全长的抗体以及结合裂解形式的抗体MUC1^*进行免疫标记的CRL-1500乳腺癌细胞系。A)MUC1。B)SRY。C)MUC1全长和MUC1^*的合并图。D和E)是不加一抗的对照。所有图像均以40×的放大倍数进行拍照。

图19A-F示出双染实验，表明MUC1^*受体与多能标志物SSEA4、TRA1-60和TRA1-81共定位(co-localize)。

图20a(A-I)和20b(A-G)示出了H9细胞的过渡区，其可培养21天而无需加入bFGF来诱导分化开始；过渡区中的细胞表达OCT4且表现出了MUC1^*和全长MUC1的表面染色。

图21a(A-F)和21b(A-F)示出了在成纤维饲养细胞上(a)或基质胶上(b)培养的未分化人胚胎干细胞；图像示出了在两种培养条件下，裂解酶TACE/ADAM17和MT1-MMP/MMP14存在于未分化干细胞上，其还存在于裂解形式的MUC1受体(其为生长因子受体形式)上。

图22示出了乳腺癌细胞裂解物(cell lysate)与结合于金纳米颗粒的MUC1^*之间结合反应的结果。

图23是免疫印迹照片，其示出了用MUC1^*肽从乳腺癌细胞中免疫沉淀的样本，可与针对NM23的抗体发生反应。

图24是免疫印迹照片，示出了NM23响应MUC1^*表达的反馈表达(feedback expression)。

图25示出了用针对MUC1^*的单价抗体进行处理的干细胞，该抗体结合单个MUC1^*受体并防止二聚化，当通过用钙黄绿素(其染色存活细胞)和乙啡啶(其染色死亡细胞)染色来进行可视化时细胞死亡。

图26是活/死细胞检测的照片，表明用单价抗MUC1^*处理干细胞引起干细胞全部死亡。

图27是活/死细胞检测的照片，其中用单价抗MUC1^*以及MUC1^*游离肽处理干细胞，与未加游离肽相比可引起活细胞数增加。

图28表明用二价抗MUC1^*抗体处理干细胞对于细胞生长未产生有害效应，且可刺激细胞生长。

图29示出了无二价抗MUC1^*抗体时的干细胞生长/死亡。

图30是在不加bFGF的情况下用二价抗MUC1^*抗体处理干细胞后的活/死细胞检测的照片。

图31是未加入二价抗MUC1^*或bFGF的干细胞的活/死细胞检测照片。

图32是柱状图，其总结了用二价抗MUC1^*、单价抗MUC1^*处理后或不加抗体时的定量干细胞生长检测的结果。

图33是柱状图，示出了多种抗体条件下干细胞生长的结果。

具体实施方式

在本申请中，“一个”既用来指单个又用来指多个物体。

术语“MUC1生长因子受体”(MGFR)是功能性定义，意指MUC1受体中与活化配体如生长因子或修饰酶如裂解酶相互作用以促进细胞增殖的部分。MUC1的MGFR部分是距离细胞表面最近的细胞外部分且由大部分或全部PSMGFR(如下文所定义的)而确定。所述MGFR既包括未修饰的肽又包括经过酶修饰如磷酸化、糖基化等的肽。本发明的结果与一种机制相符合，在该机制中，在与肿瘤发生相关的位点处进行MUC1裂解引起IBR部分或全部从细胞释放后，这部分易于被配体接近。MGFR也称为MUC1^*。

如本文中所应用的，“抗PSMGFR”是指识别MGFR区域、以及可选地PSMGFR的任意部分的任意抗体。在本申请中例示并优选天然-PSMGFR的抗体，但并不将其限制为针对这个特定序列而形成的抗体，而是MGFR和PSMGER的其他片段也考虑在内。

术语“链间结合区”(IBR)是功能性定义，意指MUC1受体中与其他MUC1分子中相同区域强烈结合的部分，从而赋予MUC1通过各个受体的IBR而与其他MUC1受体聚集(即自我聚集)的能力。该自我聚集可促进MUC1受体成簇，如在健康细胞中观察到的。在一个优选实施方式中，IBR可大致定义为全长人类MUC1受体中一串至少12-18个氨基酸的序列，定义为包含MUC1受体(SEQID NO：1)细胞外序列的氨基酸507-549，其中尤其优选氨基酸525-540以及525-549(序号参见Andrew Spicer et al.，J Biol.ChemVol 266 No.23，1991 pgs.15099-15109；这些氨基酸序号对应于Genbank登录号P1594；PID G547937，SEQ ID NO：1中的序号1067、1109、1085、1100、1085、1109)或者其片段、功能性变异体或保守性取代物，如下文中较详细定义的。

术语“已裂解IBR”表示已从仍然粘附于细胞表面的该受体分子节段释放的IBR(或其中一部分)。所述释放可能是由于IBR的酶促或其他裂解。如本文中使用的，当IBR“位于细胞表面”时，则表示该IBR连接于该细胞表面受体中未脱落或裂解的部分。感兴趣的已裂解IBR是“疾病相关性裂解”，即可引起癌症的裂解类型。

术语“恒定区”(CR)是MUC1中任何与IBR呈1∶1的比例存在的非重复序列，其在健康和肿瘤发生细胞中构成裂解后发生脱落的MUC1部分的一部分。

术语“重复序列”是在本领域中的常规意义。

术语“MUC1生长因子受体的一级序列”(PSMGFR)是一种肽序列，某些情况下其定义了该MGFR的大部分或全部序列，以及如下文所定义的该肽序列的功能性变异体和片段。所述PSMGFR定义为下文表1中列出的SEQ ID NO：10及其全部功能性变异体和片段，所述功能性变异体和片段在其N端和/或C端具有直到20的任意整数个氨基酸取代(即：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)和/或直到20个的任意整数个氨基酸增加或缺失。上文中“功能性变异体或片段”指那些具有特异性结合配体或以其他方式与其特异性相互作用的变异体或片段，所述配体特异性结合肽SEQ ID NO：10或以其他方式与其特异性相互作用。作为PSMGFR肽SEQ ID NO：10(称为天然-PSMGFR-代表“天然的”)的功能性变异体的PSMGFR实例是SEQ ID NO：12(称为变异-PSMGFR)，其与天然-PSMGFR的区别在于包含一个SPY序列而非天然SRY(参见序列表中的黑体部分)。相比天然形式，var-PSMGFR可具有增强的构象稳定性，这对于某些应用如抗体生产可能比较重要。所述PSMGFR既包括未修饰肽，又包括已经过酶修饰如磷酸化、糖基化等的肽。

术语“MUC1生长因子受体延长序列”(ESMGFR)是一种肽序列，如下文所定义的(参见表1-SEQ ID NO：15)，其确定了全部His-变异-PSMGFR以及PSIBR近端的9个氨基酸。

术语“肿瘤特异性MUC1生长因子受体延长序列”(TSESMGFR)是一种肽序列(参见，例如，表1-SEQ ID NO：16)，其定义了肿瘤细胞中存在的仍然粘附于细胞表面的MUC1裂解产物，其能够以类似于PSMGFR的方式与活化配体相互作用。

PSIBR是一种肽序列，如下文所定义的(参见表1-SEQ IDNO：17)，其定义了所述IBR的大部分或全部。

“截短型链间结合区(TPSIBR)”是一种肽序列，如下文定义的(参见表1-SEQ ID NO：18)，其定义了某些肿瘤细胞中受体裂解后从细胞表面释放的较小IBR部分。

PSMGFRTC是一种包含PSMGFR的截短型MUC1受体同种型(isoform)，在其N末端大约直到30个(即在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30内)氨基酸处或其内部截短，且包含全长MUC1受体的跨膜和胞质序列。如本文中使用的，提到所列举序列在较大分子如多肽或受体中的位置时，术语“在其N末端”指那种从该分子N末端氨基酸不多于30个氨基酸的序列。可选地，所述PSMGFRTC以及下文讨论的其他截短型MUC1受体同种型可包括一个MUC1 N末端信号序列(表1-SEQ ID NO：2、3或4)，典型地，长度为20-30个氨基酸，或者其功能性片段或变异体。这种序列通常由编码截短型MUC1受体的核酸构建体进行编码。根据上述定义，这种PSMGFRTC即包含可选信号序列仍将是“在其N末端”“具有PSMGFR”序列的肽或蛋白。一个实例是天然-PSMGFRTC(SEQ ID NO：5，在最远N末端包含或不包含SEQ ID NO：2、3或4信号肽)，其N末端具有天然-PSMGFR(SEQ NO：10)(即，在最远N末端或其30个氨基酸的内部)。

如本文中使用的，受体“多聚化”包括但不限于受体的二聚化。此外，多聚化包括(一个)共受体(co-receptor)或(多个)共受体与MUC1的结合或者多个MUC1受体彼此之间的结合，其可能通过具有多价的一个或多个配体聚集在一起。

细胞表面受体的“配体”指任何可与该受体相互作用从而暂时或永久改变其结构和/或功能的物质。实例包括但不限于该受体的结合伴侣(例如抗体或其抗原结合片段)以及可改变该受体化学结构的试剂(例如修饰酶)。

“活化配体”指能够与受体相互作用而将信号转导至细胞的配体。活化配体可包括但不限于可实现细胞表面受体诱导性多聚化的配体种类，例如具有多于一个能够结合受体的活性位点的单分子配体种类；二聚体、四聚体、更高多聚体、二价抗体或其二价抗原结合片段或者包含多种分子种类的复合物。活化配体还可包括修饰受体使得该受体随后传递信号的种类。当修饰受体使其形成其他活化配体的新识别位点时，酶也可作为活化配体，例如当加入碳水化合物可促进配体对受体的亲和性时，糖基化酶就是活化配体。当裂解产物是受体更具活性的形式时例如通过使识别位点对于配体更加易于接近时，则裂解酶即为活化配体。在MUC1干细胞或祖细胞的情况下，活化配体可以为裂解MUC1、化学修饰该受体的种类或者可与MUC1细胞表面上的MGFR相互作用以将刺激增殖的信号转导至细胞的种类，例如可实现诱导性多聚化的种类。

“生长因子”指可归入之前已鉴定生长因子种类中、或虽不可归入该种类但由于可作为活化配体起作用因而可作为生长因子发挥作用的种类。

“MUC1呈递细胞”指表面上表达MUC1和/或MGFR的细胞。

术语“未成熟细胞”在本文中用来指处于从未分化干细胞至祖细胞和其他细胞如多种前体细胞和中性粒细胞的分化过程中不同阶段的细胞，其可为部分分化的，不包括完全分化的细胞。

术语“干细胞”指能够进行多个细胞系(multi-lineage)分化和自我更新以及组织再生的细胞。干细胞可起源于但不限于脐带血、肝脏干细胞、胰腺干细胞、神经干细胞、骨髓干细胞、外周血干细胞或者其混合物。而且本发明不限于任何获自任何特定来源的特定干细胞的移植，而是可包括来自“多个干细胞来源”的彼此混合的干细胞。因此，扩增的间充质基质细胞可与获自单个或多个干细胞来源的干细胞共移植以增加移植量。

如本文中使用的，术语“癌症”可包括但不限于：胆管癌；膀胱癌；脑癌包括成胶质细胞瘤和成神经管细胞瘤；乳腺癌；宫颈癌；绒毛膜癌；结肠癌；子宫内膜癌；食管癌；胃癌；血液肿瘤包括急性淋巴细胞和骨髓性粒细胞白血病；多发性骨髓瘤；AIDS相关白血病和成人T细胞白血病/淋巴瘤；上皮内肿瘤包括Bowen病和Paget病；肝癌；肺癌；淋巴瘤包括Hodgkin病和淋巴细胞性淋巴瘤；成神经细胞瘤；口腔癌包括鳞状上皮细胞癌；卵巢癌包括那些发生于上皮细胞、基质细胞、生殖细胞和间充质细胞的癌症；胰腺癌；前列腺癌；直肠癌；肉瘤包括平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、脂肉瘤、纤维肉瘤和骨肉瘤；皮肤癌包括黑色素瘤、Kaposi肉瘤、基底细胞癌(basocellular cancer)和鳞状上皮细胞癌；睾丸癌包括胚组织瘤如精原细胞瘤、非精原细胞瘤(畸胎瘤、绒毛膜癌)、间质瘤和生殖细胞瘤；甲状腺癌包括甲状腺腺癌和髓样癌；以及肾癌包括腺癌和Wilms瘤。优选的癌症为：乳腺、前列腺、肺、卵巢、结直肠和脑癌。

本文所述术语“癌症治疗”可包括但不限于：化疗、放疗、辅助治疗或者前述方法的任何组合。治疗中可加以改变的方面包括但不限于：剂量、给予的时间安排或者持续期或者疗法；且可与或不与其他治疗相结合，所述其他治疗的剂量、时间安排或持续期也可加以改变。另一种用于癌症的治疗是手术，可单独采用或者与前述治疗方法中任何一种联用。医学领域中的普通技术人员可确定恰当的治疗。

“用于预防癌症或肿瘤发生的试剂”指任何可阻碍本文所述任何与癌症或肿瘤发生的相关过程的试剂。

如本文中使用的，“促进细胞表面受体链间结合区裂解的试剂”是任何通过用糖基或磷酸盐修饰MUC1而促进特定位点裂解的组合物，所述糖基或磷酸盐可在该位点生成一个识别基序用于裂解。其他酶可通过活化其他裂解酶而促进受体裂解。一种选择促进细胞表面受体IBR裂解的试剂的方式是首先鉴定影响上述裂解的酶并针对其改变那些酶的活性的能力筛选试剂及其类似物。另一种方式是针对改变MUC1裂解位点的能力来检测已知可影响类似酶(例如，来自相同家族)活性的试剂并类似地检测这些试剂的类似物。可替代地，可在包含该酶和MUC1受体的无细胞检测中筛选试剂，并通过抗体检测、聚合酶链式反应(PCR)等测定裂解速度或位置。可替代地，无需首先鉴定影响MUC1的酶，可针对呈递MUC1的细胞筛查试剂改变MUC1裂解位点或裂解速度的能力。例如，可在包含呈递MUC1的全细胞的检测中筛选试剂，并测定其细胞上清的聚集能力，其可指示IBR中仍然粘附于已裂解MUC1部分的IBR的量，即MGFR与IBR之间的裂解程度。在另一种技术中，可在包含呈递MUC1的全细胞但去除了上清的检测中筛选试剂，该细胞还可用于检测MGFR部分的可接近性，例如采用针对MGFR的标记抗体。试剂还可从商业化来源如分子文库进行鉴定，或者基于已知具有相同功能性能力的试剂进行合理设计并利用筛选性分析测定其活性。

“促进MUC1受体裂解的试剂”是在任何位置促进或增强MUC1受体解的任何组合物。这种试剂可用来增加干细胞或祖细胞群，其中如果产生了裂解，则MGFR(一种与细胞增殖相关的功能性受体)的可接近性被增强或促进。这种试剂可通过将细胞暴露于候选试剂而选择，并测定上清中已裂解MUC1受体相对于对照的量。

如本文中使用的，细胞“增殖”表示细胞存活且其生长被刺激。

如本文中使用的，个体指任何哺乳动物(优选人)，且优选所患疾病可通过给予干细胞或祖细胞至该个体内某个部位而进行治疗的哺乳动物。实例包括人、非人灵长类、母牛、马、猪、绵羊、山羊、狗或者猫。通常，本发明涉及与人相关的应用。

本文中使用的样品是任何从个体获得的机体组织或体液样品。优选体液，例如淋巴液、唾液、血液、尿液、乳汁和乳腺分泌物等。血液是最优选的。用于本文所述多种方法中的组织和/或细胞样品可通过标准方法获得，包括但不限于：组织活检，包括钻取活组织检查和细胞刮取术、穿刺活检，以及通过抽吸或其他方法收集血液或其他体液。

MUC1受体

本发明人之前披露，一种MUC1受体形式(其具有较短的胞外区)在癌细胞上高表达，而且正是该截短型MUC1的生长因子受体活性驱动癌细胞生长。该截短型MUC1的胞外结构域主要由PSMGFR序列组成，如表1中，SEQ ID NO：11所示，但还具有MUC1的跨膜和胞质区，本文中称为MUC1^*，也称为MGFR。在之前的申请中，其称为MGFR。该截短形式的MUC1受体常常是裂解事件的结果。然而，含有截短型胞外结构域的MUC1变异体如MUC1/Y还可通过可变剪接等生成。

本申请披露，该截短形式的MUC1受体主要包含PSMGFR，存在于人类胚胎干细胞上和多能干细胞上，是一种多能性标志物，而且较广泛存在于那些还可经历另一分化步骤的细胞上。蛋白酶解形式的MUC1，主要由PSMGFR组成，存在于肠粘膜、多能性骨髓干细胞、中性粒细胞前体、中性粒细胞和祖细胞上。本申请进一步披露，缩略形式的MUC1(MGFR或MUC1^*)是一种原始生长因子受体，其驱动干细胞和祖细胞生长。类似于其在癌细胞上的功能，刺激该受体MUC1^*部分可加速干细胞和祖细胞生长并抑制细胞分化。相反，抑制该MUC1^*部分则抑制生长并导致细胞死亡。此外，加入MUC1^*二聚化试剂抑制细胞分化，而抑制所述二聚化试剂则促进分化。

MUC1在肿瘤细胞中的表达

据估计，全部人类实体瘤中，75％存在MUC1异常表达，且MUC1也可能存在于其他类型的癌症中。本文中，异常表达从历史观点上指观察到健康上皮上该受体在顶缘簇集，而在癌细胞上，该受体则均匀分布于整个细胞表面上。并且已知在晚期乳腺癌患者的血液中一段时间内可检测到该受体的一部分。此外，已有文献报道描述了MUC1胞外区中可能的裂解位点。

为了建立癌症与MUC1裂解之间的可能关联并确定哪种MUC1种类在癌细胞表面上表达，用两种抗体检测了一组人类癌组织样本：一种识别该受体中在受体裂解后从细胞表面释放的部分，另一种则识别仍然粘附于细胞表面的部分。第一抗体是针对所述PSMGFR而激发的兔多克隆抗体，本文中称为抗PSMGFR，也称为抗MUC1^*。第二抗体是一种结合MUC1受体中串联重复序列的商品化抗体(VU4H5)，该序列位于受体N末端，远离细胞表面。应注意，MUC1受体包含数百个串联重复基序，因此，每一个全长受体将被数百个VU4H5抗体结合。明显相反地，抗MUC1^*结合的序列则为每个受体仅出现一次。

图7、9、10和11是人癌组织样本。双抗体染色表明，癌组织上大部分MUC1已被裂解释放出所述串联重复部分而留下MGFR或MUC1^*部分粘附于细胞表面。癌细胞上表达的主要MUC1种类与抗PSMGFR相互作用但不与VU4H5相互作用。图7示出了人乳腺癌样本的四幅(4)放大照片。(A)和(C)是MUC1阳性癌相同部分的相邻切片，(B)和(D)是MUC1阴性癌相同部分的相邻切片。切片(A)和(B)(上图)已用抗PSMGFR进行处理。切片(C)和(D)(下图)已用抗VU4H5抗体进行处理，其结合MUC1受体中通常从癌细胞表面脱落的串联重复部分。可注意到，相比VU4H5染色，抗PSMGFR染色亮度较高。该结果表明，癌细胞表面上的主要MUC1受体形式缺乏所述串联重复部分，基本上由PSMGFR序列组成。图9示出了人肺癌组织样本的四幅(4)放大照片。(A)和(C)是MUC1阳性肺癌第一个截面的相邻切片，而(B)和(D)是来自MUC1阴性癌的相邻切片。切片(A)和(B)(上图)已用抗PSMGFR进行了处理，其结合MUC1受体中在受体裂解后仍然粘附于细胞表面的部分。切片(C)和(D)(下图)已用抗VU4H5抗体进行了处理，其结合MUC1受体中通常从癌细胞表面脱落的串联重复部分。

可注意到，相比VU4H5染色，抗PSMGFR染色亮度较高且抗PSMGFR着色限于细胞表面。还注意到，用VU4H5检测时，MUC1有较重的胞质着色而无表面着色(图7C、8C和10C)。然而，用抗PSMGFR检测相邻组织切片时表明整个细胞表面由已裂解MUC1均匀包被，该裂解MUC1不包含串联重复序列但却包含所述PSMGFR序列(图7A、8B和10B)。这些结果再次表明，MUC1阳性肺癌细胞表面上的主要MUC1受体形式大多缺乏所述串联重复部分，基本上由PSMGR序列组成。图11示出了两幅(2)结肠癌组织样本的照片，其已用(A)抗PSMGFR或(B)VU4H5进行了染色。箭头指出了切片中癌性较强的部分，这可由其已丢失了全部细胞结构而表明。切片(A)示出了用抗PSMGFR染色的黑色区域，但相邻的切片(B)中用VU4H5(其识别MUC1受体中的串联重复部分)染色的相同区域则未表现出染色。这些结果表明，肿瘤中生长最快的部分表现为一种形式的MUC1，其缺乏所述串联重复序列但受体中包含天然-PSMGFR序列的部分保持完整并粘附于细胞表面。这些染色实验的结果表明，人类癌组织表面上的主要MUC1种类是MUC1^*，而细胞表面上的全长MUC1量较少，提示癌症中MUC1受体的裂解程度较高。

为了确定培养的癌细胞系是否表现出与癌组织样本上所观察到比值类似的已裂解MUC1与未裂解MUC1的比值，我们通过SDS-PAGE分析了MUC1阳性肿瘤细胞裂解物。正如我们对癌组织样本所观察到的，培养的肿瘤细胞系上绝大多数MUC1受体已被裂解，留下MUC1^*部分粘附于细胞表面，而较小比例的受体包含所述串联重复部分。将已知MUC1表达水平较高的人源性癌细胞系进行蛋白印迹分析。低百分比的丙烯酰胺凝胶(6％)示出了一条约220kDa与VU4H5抗体发生反应的高分子量蛋白条带。高百分比凝胶(12％)则示出一条与抗PSMGFR抗体发生反应的低分子量条带，其具有20-30kDa的表观分子量。综合上文给出的数据，这些数据表明培养的癌细胞系和人癌组织均表现为高表达一种与抗PSMGFR序列的抗体发生反应的低分子量蛋白种类。

本发明人之前披露了MUC1受体中的MUC1^*部分作为生长因子受体发挥作用。为了进一步支持该披露内容，本文中示出的数据表明将该受体的MUC1^*部分转染入MUC1阴性宿主细胞内足以引起那些细胞以较快速度生长，使得该细胞抵抗由标准化疗药物引起的细胞死亡，并使得较多细胞处于细胞周期的G2/M期。这些数据一起强烈证明该受体的MUC1^*部分作为生长因子受体发挥作用，且可在之前MUC1阴性细胞以及非肿瘤细胞中发挥作用。

多种细胞表面受体是I类细胞因子受体，当胞外部分接近到一起时或二聚化时被激活。为了探索MUC1是否以这种方式发挥作用，二价抗-PMSGFR用来二聚化该受体。图2是细胞增殖分析的曲线图，其中三种(3)不同的细胞系用抗PSMGFR进行处理，其中(A)乳腺癌细胞系1504、(B)HeLa细胞，均表现为轻微MUC1阳性且对MUC1二聚化表现出轻微的生长反应，(C)HEK293细胞为MUC1阴性。将标准化的细胞生长作为抗体浓度的函数绘图。MUC1阳性乳腺癌细胞系1504的生长曲线表现出典型的双相反应(这是I类生长因子受体的特征)；因为每一个抗体可二聚化每两个受体，因此当抗体浓度增加时细胞生长增强。如果抗体浓度过高且每个单一抗体结合单个受体而非二聚化两个受体，则细胞生长开始减慢。如果未发生二聚化，则生长信号消失。因为缺乏MUC1受体，因此HEK293细胞对抗PMGFR引起的MUC1刺激无反应。因此，如果受体作为I类生长因子受体即通过受体二聚化起作用，则作为所加入二聚化试剂浓度函数的细胞生长曲线将得到一条钟形曲线。图2和3示出了这种典型的钟形曲线。这些结果表明，MUC1受体中包含PSMGFR序列的部分作为生长因子受体发挥作用，二聚化时刺激细胞分裂。

MUC1阳性癌中细胞生长的主要机制可能更多依赖于发生裂解的MUC1量而非所表达MUC1受体的总量。在丙烯酰胺凝胶上迁移的低分子量(具有约20-30kD的表观分子量，部分糖基化)蛋白存在于MUC1阳性肿瘤细胞上但其数量不足以在非肿瘤MUC1细胞内检测到。之前已鉴定了肿瘤细胞内MUC1受体的两个裂解位点。第一个裂解位点存在于IBR中间，第二个裂解位点(我们的证据表明其是更强致瘤形式)存在于该IBR的C末端：第一个裂解位点定位于TPSIBR(SEQ ID NO：17)N末端而第二个裂解位点定位于所述天然-PSMGFR(具有SEQ ID NO：13)的N末端。如果在第一个位点裂解，则受体中仍然粘附于细胞表面的部分类似于TSESMGFR(见表1，SEQ ID NO：16，但具有天然SRY序列)。如果在第二个位点裂解，则残留部分为表1中，SEQ ID NO：11示出的PSMGFR。与细胞表达的总量MUC1受体相比，该肿瘤特异性低分子量蛋白基本上由天然PSMGFR序列(某些情况下，为TSESMGFR序列)组成，且可用于同源配体，即非自我聚集。为了支持该结论，本发明中发现肿瘤细胞的增殖易感性是截短形式MUC1受体量的函数。

为了进一步支持MUC1受体的MUC1^*部分介导细胞生长这一结论，我们对MUC1阴性细胞进行了相同抗体诱导的二聚化试验，该细胞已转染了终止于PSMGFR序列N端的截短型MUC1^*受体。图3是细胞增殖分析的曲线图，其中人胚肾(HEK)293细胞(MUC1阴性)稳定转染有具有终止于PSMGFR序列末端的截短型外功能区的MUC1受体，用抗PSMGFR抗体对其进行处理。绘制作为抗体浓度的函数的标准化细胞生长并表明MUC1受体中的MUC1^*部分通过受体中的这一部分的二聚化来介导细胞生长。

为了进一步证实MUC1裂解产物MUC1^*作为生长因子受体发挥作用，我们生成了一种结合MUC1^*并阻碍其二聚化的试剂。将该抗PSMGFR抗体蛋白水解，随后在MUC1^*亲和柱上纯化得到结合MUC1^*但阻止其二聚化的单价抗体。加入该单价抗MUC1^*后，不会产生钟形曲线，而会阻碍MUC1^*表达细胞的生长。图4是细胞增殖分析的曲线图，其中将三种(3)细胞系用该单价抗PSMGFR进行处理。该曲线图表明，对照细胞系(A)HeLa和(B)HEK293并未由于加入该抗体而受影响，但在MUC1阳性乳腺癌细胞系1504(C)和(D)中，细胞生长则受到抑制。

我们进一步证实，当该受体的MUC1^*部分二聚化时，则激活MAP激酶信号途径，其使细胞定进行分裂。图5是蛋白印迹图，表明一旦MUC1^*发生二聚化，则MAP激酶信号途径的ERK2分支即可激活(ERK2被磷酸化)。图5示出了在加入二价抗PSMGFR 10分钟内，ERK2被磷酸化。该蛋白印迹的检测抗体是磷酸-ERK2。图6是竞争试验的蛋白印迹图，其中结合MUC1中PSMGFR区域的小分子和抗PSMGFR竞争与该位点的结合。如果存在竞争性小分子，则该抗体不发生结合，且ERK2磷酸化被抑制。这些结果表明，MUC1受体的PSMGFR部分介导细胞生长，且受体二聚化可触发该生长信号。

这些结果支持一个结论，即MUC1受体中作为生长因子受体发挥作用的部分是一种裂解产物，其中大部分或全部IBR从细胞表面释放。而且这些结果支持一个结论，即其中相当比例的MUC1受体已被裂解而释放TPSIBR(SEQ ID NO：18)的肿瘤是侵袭性(aggressive)特别强的癌症，而那些经裂解释放出整个IBR而留下PSMGFR(SEQ ID NO：11)粘附于细胞表面的肿瘤则侵袭性更强。因此，抗MUC1受体中TPSIBR(SEQ ID NO：18)部分的抗体可用来评估MUC1阳性癌的侵袭性。

干细胞中的MUC1表达

MUC1 ^* 在hESC上表达

本中请人已发现，截短形式的MUC1受体(我们称为MUC1^*)，基本上由MUC1的胞质尾区和跨膜部分组成，但具有一个终止于PSMGFR序列(SEQ ID NO：10和11)末端之后的外功能区，该受体在未分化、多能性人胚胎干细胞(hESC)的表面上表达。当用抗PSMGFR的抗体检测时，该截短形式的MUC1受体着色为阳性，而用结合MUC1受体远端部分(之前我们证实其常常被裂解而从癌细胞表面释放)的VU4H5抗体检测时，则未表现出着色。当用抗肽SEQ ID NO：10的兔多克隆抗体检测时，低代数(40代)H9人胚胎干细胞(Wicell，Madison，WI)着色呈阳性，该肽相当于人MUC1受体胞外结构域的最开始56个氨基酸(抗PSMGFR)。双染证实相同的细胞与抗PSMGFR和抗OCT4的抗体呈阳性反应，OCT4是一种已知的人类未分化干细胞标志物，参见图15。用抗MUC1受体中串联重复部分的抗体VU4H5孵育相同细胞，未得到表面着色或胞质着色。参见图16。将去垢剂加入该VU4H5混合物中以透化细胞膜，也未能得到着色。图17也是一幅免疫细胞化学图像，其中相同的hESC用抗PSMGFR(与截短形式的MUC1发生反应)和SSEA4进行双染，而SSEA4是另一种已识别的代表干细胞多能性或未分化的标志物。MUC1^*在H9 hESC表面上表达，这可由采用抗PSMGFR的着色清晰且较强而证实，而无需加入去垢剂(其对于可视化胞质和/或核内的蛋白是必需的)。此外，如图19中可以看到的，用抗PSMGFR抗体(本文也称为抗MUC1^*)进行染色，产生了“鸡爪样(chicken wire)”效应，其为细胞表面蛋白的特征。双染实验还证实该MUC1^*受体与多能性标志物SSEA4、TRA1-60及TRA1-81共定位。参见图19。

裂解酶MMP14和ADAM17裂解癌细胞内和干细胞上的MUC1

MMP14和ADAM17存在于表达MUC1^*、OCT4和其他多能性标志物的相同干细胞表面上。这可得到一个结论，即在hESC上MUC1受体经裂解将MUC1^*留在细胞表面上，该裂解通过膜基质金属蛋白酶MMP14(也称MT1-MMP和ADAM17)而实现。这就强调了癌细胞与干细胞之间的另一个相似之处；MMP14和ADAM17均与癌细胞上MUC1受体的裂解有关。

已分化干细胞表达全长受体而非该裂解形式，MUC1^*。

采用RNAi通过抑制MMP的天然抑制剂如TIMPS来刺激干细胞生长，也在本发明的范围内。因为MMP-14和TACE对于将MUC1裂解为刺激干细胞生长的生长因子受体形式是必需的，因此抑制这些裂解酶可抑制MUC1裂解。我们已观察到干细胞上MUC1裂解的终止引导分化的开始。因此，可推断促进MUC1裂解的试剂是用于刺激干细胞生长的有用试剂。

相反，抑制那些裂解MUC1的酶如MMP-14和TACE的RNAi则是有用的试剂，可用来诱导干细胞分化以抑制癌细胞特别是癌症干细胞生长。在某些情况下，将RNAi靶向特定细胞或组织是有益的。例如，为了诱导分化，通过把RNAi和靶向抗体连接于同一物质而将抑制MUC1裂解酶的干扰RNA递送至靶细胞。在一个实施方式中，既呈递靶向抗体又呈递siRNA或shRNA的常用物质是纳米颗粒。在一个优选实施方式中，所述纳米颗粒是金，且涂布有自组装单层(或自组装单分子膜，SAM)。在一个较优选的实施方式中，所述纳米颗粒负载抗SSEA4、抗Tra 1-81或抗Tra 1-60以及抑制MMP-14或TACE表达的干扰RNA。

图20a和20b是未分化以及从而多能性人胚胎干细胞的图像，培养于Hs 27人包皮成纤维饲养细胞(a)或基质胶(b)上。在两种情况中，我们均观察到未分化干细胞染色为MMP-14和TACE强阳性而未检测到全长MUC1。这些结果表明，MMP-14和TACE裂解全长MUC1，且裂解并非必需由成纤维饲养细胞分泌的试剂。通过视觉观察而且由于其OCT4和其他未分化状态标志物如SSEA4、Tra 1-81和Tra 1-60染色呈阳性，因此认为这些干细胞为未分化状态。形成鲜明对比的是，当使细胞分化或通过控制外源性bFGF的加入达14天或更长而强迫其分化时，则实验表明干细胞被全长MUC1蛋白包被，很少或几乎不表达MMP-14或TACE，已裂解MUC1(本文中我们称为MGFR或MUC1^*)表达也很少或不表达。此外，这些细胞不再表达OCT4。

我们观察到已发生分化的细胞，根据其与结合串联重复单位的VU4H5抗体发生反应的事实，可知其表达全长MUC1。针对MUC1^*的存在，染色不再呈阳性。OCT4染色阳性的未分化细胞，全长MUC1染色为阴性。然而，一旦细胞发生分化，则OCT4染色消失且针对其全长受体的存在染色呈阳性。然而，应注意，在未分化与分化的交界，这些细胞的MUC1全长和OCT4染色均为阳性。该结果提出一个问题，即OCT4染色阳性是否是未分化干细胞的一个真实指标。根据这些实验，利用已知的干细胞多能性标志物不足以鉴定真正的多能性未分化干细胞，而是，我们必须包括抗MUC1^*的抗体。因此，多能性干细胞的精确鉴定基于细胞表面上MUC1^*和OCT4染色阳性，但全长MUC 1染色为阴性。SSEA4、Tra 1-60和Tra 1-81可与抗MUC1^*和OCT4的抗体联合应用，以更精确鉴定并选择未分化干细胞。

此外，培养21天而未加入bFGF以诱导分化开始的H9细胞，表现为MUC1^*和全长MUC1的表面染色(图20)。该表面染色模式类似于癌细胞对MUC1^*和全长MUC1进行双染时所观察到的现象。二者均表达于癌细胞表面上，参见图18。

较高代数的干细胞并非真正的未分化，即使按照本领域的情形检测其多能性标志物呈阳性。较高代数干细胞(84代)，仍可认为呈多能性，其MUC1和MUC1^*染色的抗体着色模式有所不同。与低代数细胞染色形成对比的是，这些细胞胞质内的全长MUC1染色呈阳性。MUC1^*、SSEA4、TRA 1-60、TRA 1-81和OCT4的染色水平和模式与低代数干细胞所观察到的相同。

综上，这些结果表明现有技术中用于鉴定多能性干细胞的标志物尚不足够。评估该MUC1受体裂解状态和/或确定其位于表面上还是胞质内的抗体必须加以整合，以准确鉴定真正多能性干细胞。

既然我们已知裂解形式的MUC1受体，MUC1^*在干细胞和癌细胞上表达，而且已知该受体以该形式作为驱动这些细胞生长的生长因子受体发挥作用，因此可以推断MUC1^*受体于祖细胞(指还可经历另一分化步骤的细胞)上并驱动其生长，甚至于快速更新的细胞上。例如，中性粒细胞在其细胞表面上仅独特表达蛋白水解形式的MUC1而非包含串联重复序列的已脱落部分。导管如乳腺导管、前列腺导管和结肠导管的管腔表面，由MUC1^*所衬。

这些快速更新细胞的胞质内具有高水平MUC1。图14示出了示出了健康输卵管的组织样本，表明当用抗PSMGFR检测时内衬于管道的管腔细胞在细胞表面染色呈阳性(A)，而用VU4H5检测时则仅胞质内染色阳性(B)。内衬于输卵管和其他导管的细胞示出的MUC1裂解产物包含PSMGFR区而非串联重复区。这些管腔细胞并非癌性但必须时常补充。这些组织包含干细胞和祖细胞使得该细胞快速更新成为可能。

根据这些研究结果，细胞(其可快速分裂如中性粒细胞、其前体、干细胞包括多能性干细胞等)上主要形式的MUC1受体，是基本由PSMGFR组成的已裂解形式。该裂解MUC1介导部分(如非全部)干细胞、祖细胞、中性粒细胞、前体及其他快速分裂细胞的增殖和扩增。

较密切观察新分化克隆，发现在细胞分化的初始阶段存在极少过渡区，其中细胞同时表现出未分化状态标志物和分化状态标志物。我们明显注意到，在这些过渡区内细胞的全长MUC1和OCT4染色均呈阳性，如图21a和21b中所示。这些结果可得到一个结论，即检测OCT4存在与否不足以确定细胞未分化还是正分化。全长MUC1裂解终止是分化开始的第一个征象。因此，为了鉴定未分化干细胞(其还是多能性干细胞)，我们必须检测MGFR的存在以及全长MUC1的缺失。用于鉴定并选择多能性和/或未分化干细胞的方法还可选择性包括选择表达NM23、MMP-14、TACE和OCT4的细胞。为了精确鉴定和选择多能性干细胞，我们还可希望包括一个阴性选择标准，其应该是全长MUC1的缺失，且可选择性包括胚系标志物分化的其他标志物。

干细胞的鉴定和分离

因此，为了鉴定干细胞和干细胞来源，我们必须整合用于确定哪种形式MUC1位于细胞表面上以及全长MUC1存在于表面上还是胞质内的方法。真正的多能性干细胞特征在于MUC1^*的表面表达，缺乏全长MUC 1染色以及核内存在OCT4；这些多能性克隆中的细胞上还可表达表面标志物TRA 1-60、TRA 1-81，有时还表达SSEA4。

在一个优选实施方式中，通过选择那些表面上表达MUC1^*、SSEA4、TRA1-60和TRA 1-81，核内表达OCT4且无显著性全长MUC1表面表达的细胞而鉴定和/或分离真正的多能性干细胞。在另一个较优选实施方式中，通过选择表现为MUC1^*表面表达、OCT4核内表达且未表现出全长MUC1表面表达的细胞而鉴定和/或分离多能性干细胞。

本发明包括采用这些标志物包括抗MUC1^*和MUC1全长的抗体来鉴定新的干细胞来源。为了鉴定成体干细胞的来源并从中分离干细胞，将要筛选的来源包括但不限于组织、体液、乳汁、脂肪、毛囊、黏液和粘膜内层(被覆粘膜，mucosal lining)、骨、骨髓、血液、脑细胞、眼睛等。为了鉴定胚胎干细胞的来源并从中分离干细胞，将筛选的来源包括但不限于胚胎组织、流体、羊水、胎盘血、胎盘、脐带血和组织、血液、胚泡、胎、受精卵等。

本发明的一个显著特征在于：从全能干细胞到多能性干细胞到多效干细胞到快速分裂的完全分化细胞，特征均为细胞表面上MUC1^*与全长MUC1的比值，其中该比值与分化程度成反比。例如，多能性干细胞可通过表面上已裂解与未裂解MUC1的比值基本上是无限大而鉴定，因为这些细胞表面上几乎不可检测到全长受体。然而，随着细胞分化，MUC1裂解减少，因此MUC1^*与全长MUC1的比值也下降，当细胞完全分化时则接近零。

可能存在一些情况，其中需要鉴定并分离已经历部分分化的细胞群，如经历可使那些细胞定向于沿着三种胚系之一而分化的分化步骤，三种胚系为：内胚层(腺体、器官和消化道)、外胚层(皮肤、指甲、头发、眼睛、耳朵、牙釉质、脑下垂体、乳腺、神经系统)或中胚层(肌肉、骨、淋巴组织、脾脏、血液系统干细胞、心脏、肺、生殖系统)。如果需要使一群干细胞均分化为皮肤细胞，则可能需要从已开始定向于该途径的细胞开始，这可通过选择表面上表达MUC1^*以及某些定向于该胚系的早期标志物的细胞而实现。例如，用于内胚层胚系的标志物包括GATA 4/6、HNF家族、FGF5、Wnt3、EndoA、胶原IV和t-PA；用于外胚层的标志物包括ECTO-V、LpC2肌动蛋白和LpS1 mRANA；用于中胚层胚系的标志物包括NESTIN、MAP-2、GATA4、TWIST和Tbx20和ab20680。针对这些标志物亚型的抗体可与抗PSMGFR联合应用来鉴定已开始定向于某个特化命运的多能干细胞。随着细胞从多能至专能至完全分化，MUC1^*与全长MUC1的比值从高(MUC1^*表达高而全长MUC1不可检测到)变为低(MUC1^*不可检测到)。

癌症干细胞(Cancer Stem Cell)的鉴定和分离

最近已确定存在癌症干细胞，如通过其导入少量(10或100数量级而非通常需要百万数量级细胞)癌细胞即可在宿主内致病的能力而定义的。当然已存在多个需要在多种情况中检测癌症干细胞的治疗性理由。鉴定癌症干细胞的技术还处于初期阶段。现有的研究表明，癌症干细胞的特征在于一组标志物，包括CD 133、CD44和ESA，特别是CD44(高)和CD24(低)。回忆一下：我们已证实MUC1^*在癌症细胞表面上高水平表达，以及MUC1^*的高水平表面表达与全长MUC1的低水平表面表达表示侵袭性癌细胞生长，其还可抵抗化疗药物的治疗。因此，现有用于鉴定癌症干细胞的方法的一个改进就是选择表达已知癌标志物如CD133、CD44和ESA、特别是CD44(高)和CD24(低)，并且还必须表现出高水平的MUC1^*表面染色以及较低或无MUC1受体中重复部分染色的细胞。

本发明用于鉴定并分离癌细胞和癌症干细胞CSC的方法可应用于多种情形中。例如，CSC可鉴定并从患者取出而作为治疗方案的一部分。因为CSC可能处于循环中，因此采用本发明所述方法来清除患者体液和其他物质包括血液、骨和骨髓中的CSC，随后再导入该患者或另一个患者体内是有利的。在几种类型的治疗性干预后可再次导入细胞，以缓解该癌症，所述干预可包括化疗和放射性治疗。在一个实施方式中，本发明所述方法用来鉴定、分离并从患者血液中取出癌症干细胞作为抗癌症疗法，癌症预防法或癌症复发预防法。从患者取出患者的血液，并使其通过一个设备，该设备具有呈递抗MUC1^*抗体以及一组其他CSC标志物如CD144、CD44和/或ESA的的室。当MUC1^*阳性细胞通过所述设备的该部分时，即被捕获并存留于设备内部，同时将已消毒血液再次导入患者体内。本发明所述方法用于癌症干细胞的鉴定和分离以及随后从患者分离干细胞或癌症干细胞，以例如在癌症手术或治疗后消毒(为了确保从患者取出全部癌症干细胞)患者血液或骨髓。

本发明进一步计划采用本文所述方法来鉴定并从多种来源分离癌症干细胞，以清除人、动物或者人/动物源性材料中的癌症干细胞。需要清除生物材料中的癌和CSC的情况包括那些其中材料计划用于移植或输注的情形。这些癌症干细胞可从中鉴定和/或分离的材料和/或来源包括但不限于癌症患者、疑似癌症患者、存活或死亡个体，无论是贡献还是认为可接受移植物包括器官、角膜、组织、皮肤、骨、骨髓等。认为可通过移植、输注、注射或口服给予而导入活组织、器官或个体内的物质，其中可能需要清除该物质中的癌或癌症干细胞，包括但不限于血液、器官、组织、皮肤、脂肪、干细胞、骨髓和软骨。

通过MUC1受体操作进行细胞扩增

本发明人之前披露，人们可通过二聚化该受体而刺激MUC1阳性癌细胞生长。采用针对所述MUC1^*部分的抗体可阐释多种情形，因为受体该部分是癌细胞上的主要MUC1种类。本发明人还证实当阻止MUC1受体二聚化时可诱导细胞死亡。本发明人证明，当MUC1阳性癌细胞或者用MUC1^*转染的细胞与单价抗PSMGFR抗体或FAb一起孵育时引起细胞死亡或生长抑制。

本文中，本发明人首次披露了人胚胎干细胞生长可通过引起MUC1^*二聚化或阻止二聚化而加以操作。概括而言，当细胞表面上MUC1受体中的MUC1^*部分二聚化时，可刺激胚胎干细胞生长。干细胞表面上MUC1^*的二聚化不仅提高其生长速度而且还延迟了分化。相反，加入防止MUC1二聚化的试剂则阻碍干细胞生长，在某些情况下可在极短时间内诱导细胞死亡。

为了证明，我们采用二价抗PSMGFR抗体来二聚化胚胎干细胞表面上的MUC1^*以诱导细胞生长，采用单价FAb抗PSMGFR结合MUC1^*并阻止受体二聚化。具体为：将H9低代数hESC在基质胶上培养7天，向一组孔中加入二价抗PSMGFR，向另一组孔中加入单价抗PSMGFR；向第三组孔中加入缓冲液作为对照。结果表明，加入单价抗PSMGFR引起干细胞在8小时内死亡。细胞立即变圆(round up)并在数小时内漂至培养基顶部。存活/死亡分析表明，这些细胞吸收乙啡啶从而确证其实际上已死亡。相反，加入二价抗PSMGFR的孔则表现为健康的干细胞生长，其量显著高于对照孔。克隆较大且通常具有较少的分化细胞。

在另一项证明实验中，我们采用二价抗体使干细胞增殖。可采用任何可引起MUC1^*的试剂用于该目的。例如，MUC1受体的天然或非天然配体可用来加速干细胞生长。例如，NM23是MUC1^*的天然配体，对于刺激干细胞生长也比较有用。因为NM23以几种多聚化状态存在，因此尤其优选其中该配体处于二聚体的浓度。蛋白14-3-3也是MUC1^*的配体，且可类似地用来刺激干细胞生长。特别优选二聚化配体和/或以特征为二聚化状态的浓度加入配体。来自天然配体的肽可人工二聚化并加入正生长的干细胞中以加速生长并抑制分化。类似地，方法如噬菌体展示可用来再次鉴定可结合该PSMGFR序列(MUC1^*胞外结构域)的肽。这些肽可通过单链合成、化学耦联或借助于二硫键合二聚化，以生成新的MUC1^*配体以及生长因子。单价肽可加入正生长的干细胞以启动分化。并不是要将这些方法局限于在干细胞上应用。本发明人之前描述了MUC1^*的小分子抑制剂，其设计用作癌症疗法。这些小分子可合成为二聚体并用来刺激干细胞生长。

本发明计划采用上述方法用于操作其生长受MUC1^*受体介导的细胞，包括但不限于祖细胞和前体细胞、中性粒细胞等以及癌细胞。

通过MUC1受体操作进行细胞扩增

所述受体可特意激活以体外、离体和/或体内促进这些干细胞或前体细胞生长，用于治疗、研究和其他目的。

MUC1受体的特意激活可通过：1)诱导受体裂解；2)用活化配体处理负载该受体的细胞，该活化配体可为二聚化该受体的试剂，包括结合该受体中可接近部分的抗体；3)用MUC1受体或其MGFR部分转染细胞；和/或递送可使细胞表达该MUC1受体和/或其活化配体的基因或其他结构。

针对该MUC1受体中PSMGFR或天然-PSMGFR序列的二价抗体已证实可刺激呈递MUC1的肿瘤细胞的生长(图2-6)。类似的抗体可用来激活MUC1受体并促进多种非癌细胞包括未成熟细胞或干细胞增殖。抗PSMGFR或抗天然-PSMGFR是这种抗体的实例。然而，针对该MGFR中任何区域的抗体均可用来刺激MUC1阳性细胞生长，其中该受体中的天然-PSMGFR部分是可接近的。MUC1受体或其功能模拟物的天然配体还可用来促进MUC1介导的细胞生长。MUC1受体的配体可包括但不限于NM23、14-3-3和/或组织蛋白酶D。

可替代地，可将酶如TACE/ADAM17或MT1-MMP14给予呈递全长受体的细胞，以增强裂解为生长因子受体形式并因此促进细胞生长(图21)。任何能够裂解MUC1受体从而使该受体的PSMGFR部分暴露的酶均可构成一种用于促进MUC1呈递细胞增殖的可接受方法。

本发明所述方法包括二聚化该MUC1受体中MGFR部分的抗体可体外或离体给予中性粒细胞或其前体，然后去除该抗体并重新导入患者体内。类似地，增加MUC1裂解为生长因子受体形式的试剂可用来刺激未成熟细胞生长，例如但不限于干细胞、祖细胞、前体细胞、中性粒细胞和中性粒细胞前体。激活MUC1受体中MGFR部分的配体如生长因子也可用来刺激这些细胞类型的生长。这些方法可用来刺激干细胞、中性粒细胞或任何呈递所述细胞表面受体MUC1的其他细胞增殖，其中，细胞增殖是需要的。

一种设计用来刺激未成熟细胞如干细胞、祖细胞、中性粒细胞或中性粒细胞前体生长的基因治疗形式包括将编码MUC1或优选截短型MUC1(基本上由PSMGFR组成)的DNA导入未成熟细胞如干细胞、祖细胞、中性粒细胞或类似细胞，其中增殖是所需要的。可导入编码MUC1配体或抗体(其结合该受体中裂解后仍然粘附于细胞表面的部分)的DNA刺激新细胞生长。可同时导入编码G-CSF受体的DNA，因为G-CSF刺激MUC1受体的表达或裂解。

在另一个实施方式中，本发明涉及与激活MUC1的试剂和/或二聚化该MUC1受体和/或辅助裂解MUC1的试剂一起给予或者添加G-CSF，以引起干细胞、中性粒细胞以及其他细胞类型(其呈递MUC1受体和/或G-CSF受体)增殖。

与这些研究结果一致的是，细胞(组织)上可接近的MGFR量可与肿瘤侵袭性以及侵袭性细胞生长相关。因此，可识别该受体中MGFR部分且已证实可触发MUC1介导的细胞生长的抗体，可用来促进表达MUC1的非癌性细胞中的细胞生长，其中该受体的PSMGFR部分是可接近的。这种细胞的实例包括但不限于干细胞、中性粒细胞、肥大细胞组细胞以及其他未成熟细胞。

一篇最近发表的文献表明，当用G-CSF(粒细胞集落刺激因子)治疗乳腺癌患者时，其血清中的脱落MUC1水平大大增加(G-CSFinduces elevation of circulating CA 15-3 in breast carcinoma patientstreated in an adjuvant setting.Briasoulis E，Andreopolou E，Tolis CF，Bairaktari E，KatsarakiA，Dimopoulos MA，Fountzilas G，Seferiadis C ans Pavlidis N.(2001)Cancer，91，909-917).他们的研究表明脱落MUC1水平的增加与中性粒细胞数量的增加相关。这些研究者报道，这些中性粒细胞的胞质中而非中性粒细胞表面上MUC1受体数量增加。申请人证实，该文献中得到的结论即中性粒细胞在其表面上不表达MUC1，是一个错误的结论，因为所引用的研究采用的抗体(CA 15.3)识别MUC1受体中的串联重复部分(参见图8、10和14)。图8和10示出，当用VU4H5，结合受体中串联重复部分的抗体进行检测时，乳腺癌和肺癌细胞在胞质中而非细胞表面上MUCI染色为阳性。然而，当用抗PSMGFR(其结合受体中的PSMGFR部分)检测相邻切片时，则可发现该受体的裂解产物完全包被细胞表面。申请人之前证实，MUC1受体的裂解产物(其基本上由PSMGFR序列构成)作为生长因子受体发挥作用。

这些数据与一种观念一致，即G-CSF刺激中性粒细胞增殖而且增殖增强是由于中性粒细胞表面上存在的裂解形式MUC1受体(其已脱离串联重复部分)数量增加，而且该蛋白水解形式的MUC1正是驱动了增殖的生长因子受体。此外，MUC1中MGFR部分的二聚化触发了该细胞增殖，可选的通过用于二聚化的试剂而实现。因此，二聚化MUC1的试剂可用来例如体外、离体、体内或原位刺激某些细胞类型的生长。特别地，可通过加入二聚化或多聚化MUC1中MGFR部分的试剂而刺激干细胞、祖细胞、前体细胞、中性粒细胞等增殖。

如文献中报道的，G-CSF增强了MUC1特别是作为生长因子受体起作用的裂解形式MUC1的生成。因此，刺激干细胞、中性粒细胞以及其他呈递MUC1受体和/或G-CSF受体的细胞类型生长的策略可包括对G-CSF受体和MUC1受体特别是受体裂解后仍粘附于细胞表面的部分均作用的试剂。也就是说，干细胞增殖以及中性粒细胞群增加均可通过同时或者交错治疗方案共刺激两种受体而实现。

非肿瘤细胞的增殖

在其他实施方式中，本发明提供的方法用于治疗那些干细胞或任何祖细胞对其将具有治疗价值的患者或者其他需要用一种或多种本发明所述抗体或者其抗原结合片段进行治疗的病症。该方法涉及以可有效扩增患者体内干细胞或祖细胞的量给予患者一种抗体或其抗原结合片段。在某些实施方式中，上述抗体或其抗原结合片段中任何一种，特别是那些特异性结合MGFR、PSMGFR、天然-PSMGFR等的抗体均可应用。在某些优选实施方式中，抗体或其抗原结合片段以可有效增强该MUC1受体例如MGFR(其在MUC1受体的链内结合区脱落后仍然粘附于细胞)之间相互作用的量而给予。在该方法的一个实施方式中，特别是其中该抗体或其抗原结合片段特异性结合MGFR，这种治疗方法可涉及到以可有效引起生长因子受体如已裂解MUC1诱导性二聚化的量给予患者该抗体或其抗原结合片段。

刺激干细胞、祖细胞、中性粒细胞、肥大细胞祖细胞及其前体生长的技术有多种用途。单个干细胞可增殖并分化成为一个完整的器官。操作干细胞和祖细胞生长和/或分化的方法将应用于组织再生、器官生成、扩增衰竭的细胞群来治疗诸如脊柱损伤及阿兹海默症等病症。这些细胞的生长可在体外或离体而实现。例如，患者自身细胞可被扩增然后导入患者体内。可替代地，可单独或与干细胞或干细胞样细胞一起体内导入刺激性试剂，例如在组织或神经损伤部位。在其他实施方式中，同种异体细胞可用于干细胞中。

在一个优选实施方式中，针对MUC1受体中MGFR部分的试剂如二聚化抗体，可用来增加那些接受可诱发中性粒细胞减少症的疗法的患者体内白细胞的数量。这些试剂可直接给予正接受非癌病症或者MUC1阴性癌治疗的患者以及其他免疫缺陷患者。可替代地，患者自身的中性粒细胞或其前体可利用本发明所述方法从患者体内取出并进行扩增，然后再导入患者体内。例如，这将消除患者对骨髓移植的需要，其中患者已经历了广泛放射或其他可破坏骨髓的方法。诸如白血病的病症也可用该方法进行治疗以恢复患者的免疫系统和血象(或全血细胞测定，blood profile)。

在一个优选实施方式中，经操作用于治疗性应用的MUC1^*受体涉及到选择并扩增干细胞以恢复疾病和损伤时的神经功能、取代器官组织，其中器官组织由于萎缩、疾病、手术和损伤而丧失。本发明所述方法的治疗性应用还包括扩增并引导外胚层干细胞分化，用于在伤口修复、疤痕修复、烧伤时以及为了美容目的而生成皮肤。来自骨髓提取物的干细胞可扩增用于治疗性目的。

本发明进一步计划采用用于干细胞鉴定、分离和操作的方法用于美容目的。例如，鉴定、收集并扩增毛囊的方法用于毛发移植、用于头发、眼睫毛、眼眉等。收集可分化为脂肪细胞或乳腺组织的干细胞并移植用于丰乳、唇、颊以及身体整形或增强。用来再生并恢复牙齿、釉质、牙本质等的应用也包括在本发明的范围内。内分泌细胞置换是本发明的一部分，例如对于细胞包括但不限于胰岛(或郎格罕氏岛，islet of langerhorn)中的β细胞，用于治疗糖尿病。

本发明所述方法也适用于治疗某些病症，包括但不限于骨损伤、骨质疏松、神经退化性疾病、关节炎、多发性硬化、由自身免疫疾病引起的退化性疾病、中风、创伤性脑损伤、脊髓损伤(由于创伤性损伤或者退化性疾病如多发性硬化)、动脉和静脉疾病、动脉瘤、黄斑变性、失明、偏瘫；用于治疗退化性疾病，包括肌肉退化疾病、MS、AD、PD、CJD、Lou Geurrig病、中风、Plaget综合征、脑瘫(cerebro palsy)、镰状细胞贫血、灼伤患者、新皮肤、新组织、肢体再生、器官再生、神经和脑细胞再生。本发明所述方法还可用来再生类毛细胞(hair-like cell)、耳蜗细胞以能够实现或恢复听力。

类似于血库，可收集全能、多能以及多效干细胞以及其他前体细胞供应并分选为分化群用于随后的扩增并导入或者再次导入受体。

未成熟细胞的扩增

未成熟细胞包括体细胞干细胞、胚胎干细胞、脐带血干细胞以及其他未彻底分化的细胞。成体干细胞也称为体细胞干细胞，是特定组织的分化细胞中存在的未分化细胞且大多数为专能细胞。它们已经用于100种以上疾患和病症的治疗中。所有组织中均存在某些成体干细胞，其命名为“孢子样细胞(spore-like cells)”(Vacanti，M.P.，A.Roy，J.Cortiella，L.Bonassar，and C.A.Vacanti.2001，J CellBiochem 80：455-60.)。胚胎干细胞是从早期人胚胎的未分化的内部细胞团(mass cell)获得的培养细胞，其为全能性的。脐带血干细胞来自于出生后胎盘和脐带的血液，脐带血干细胞用来治疗但不限于格雷夫斯氏病(Gunther病)、粘多糖贮积症II型(Hunter综合征)、粘多糖贮积症IH型(Hurler综合征)、急性淋巴细胞性白血病。

同种异体治疗在本发明的考虑之内。

此外，特别地，骨髓包含两种类型的干细胞：造血(其可产生血细胞)和基质干细胞(其可产生脂肪、软骨和骨)。基质干细胞具有分化成为多种组织如神经组织的能力。造血干细胞产生循环中存在的三种类型血细胞：白细胞、红色血细胞(红血球)和血小板(凝血细胞)。多能造血干细胞(PHSC)是骨髓中存在的干细胞。PHSC是能产生骨髓和淋巴胚系中所有血细胞类型的前体细胞。这包括单核细胞和巨噬细胞、中性粒细胞、嗜碱细胞、T细胞、B细胞、NK细胞、小胶质细胞、红血球(红色血细胞)、巨核细胞(如血小板)和树突细胞。

如本文中讨论的，蛋白水解形式的MUC1受体作为原始生长因子受体起作用，驱动多种细胞类型增殖，包括但不限于未成熟细胞类型如干细胞和祖细胞。表3列出了已知表达MUC1的细胞类型以及本发明所述方法所适合的治疗。此外，可通过遗传操作细胞使其表达MUC1或MUC1截短突变体随后应用本发明所述方法刺激MUC1受体并诱导或增强细胞增殖，可刺激不表达MUC1的细胞类型增殖。

NM23

MUC1^*生长因子受体的激活是一个自分泌过程。表达MUC1受体的生长因子受体形式即MUC1^*的细胞还可产生激活该受体的配体。抗体刺激实验证实，MUC1^*受体二聚化通过触发MAP激酶细胞增殖级联反应而刺激细胞生长。为了确定MUC1癌细胞是否也产生该二聚化配体，设计了纳米颗粒实验，其检测可二聚化MUC1^*肽的配体存在情况。将组氨酸标签化的PSMGFR(MUC1^*)肽固定于NTA-镍SAM涂布的金纳米颗粒上。将来自一组MUC1阳性乳腺癌细胞系的提取物和上清加入该负载MUC1^*的纳米颗粒中。可从粉红变为蓝色的溶液包含二聚化该颗粒固定的MUC1^*肽的配体。(由于金纳米颗粒内在的光学特性，其在均相悬浮液中表现为粉红色，当彼此靠近在一起，例如当颗粒固定的配体结合共同靶标时变为蓝色。)图22示出了纳米颗粒实验的结果。来自乳腺癌细胞系CRL-1504、T47D、CRL-1500及CRL-1902的癌细胞提取物分别加入柱A中的MUC 1^*肽呈递纳米颗粒中。在柱B中，将相同的癌细胞提取物加入呈递无关肽的纳米颗粒中；这些细胞未变蓝，因为其细胞提取物中的配体未被该无关肽识别。柱A中的孔变蓝的速度大致可反映每一种细胞系所产生的MUC1量。例如，CRL-1902细胞呈递低水平的MUC1受体。加入CRL-1902提取物的纳米颗粒孔则需要比T47D孔多得多的时间来变蓝。T47D细胞则呈递高水平的MUC1受体。

NM23是可二聚化并激活所述MUC1^*生长因子受体的配体。将T47D癌细胞提取物用磁珠进行免疫沉淀，而磁珠预先已经结合了组氨酸标签化的PSMGFR(MUC1^*)肽。所捕获的MUC1^*结合蛋白随后利用SDS-PAGE进行分离。然后通过采用识别NM23H1的抗体检测凝胶而实施蛋白印迹。图23是一个蛋白印迹图，其证实，用抗MUC1^*从T47D上清中免疫沉淀出的蛋白种类与抗NM23发生反应且为预期分子量的NM23。因此，MUC1的配体是NM23。注意泳道2，其中加载来自3Y1上清的样品，未表现出可检测水平的NM23。

MUC1受体的表达刺激NM23的表达(图24)。图24示出了之前实验的一个延伸结果。这里，细胞上清(上面的凝胶)或者裂解物(下面的凝胶)可通过结合于磁珠的MUC1^*而免疫沉淀。随后释放被捕获的MUC1^*结合蛋白并在凝胶上进行电泳，随后用识别NM23的抗体进行印迹分析。图24的IP/蛋白印迹示出，MUC1阴性细胞系3Y1的裂解物或上清中均不产生NM23(泳道1)。然而，转染全长MUC1(泳道2)(实验证实其可高效裂解生成MUC1^*)或MUC1^*(泳道3)后，随后可在裂解物中检测到NM23。泳道4示出的是已用MUC1^*转染的HEK 293细胞，其裂解物和上清中具有可检测水平的NM23。泳道5、6和9是乳腺癌细胞系，裂解物和上清中均示出可检测水平的NM23。泳道8是BT474，其为一种其表面上产生相对较低水平MUC1受体的MUC1阳性乳腺癌细胞系。泳道7中加载的是HeLa细胞提取物，其表达低水平MUC1受体。综上，这些结果尤其是不表达NM23的MUC1阴性细胞在转染MUC1后开始表达NM23，强烈证明刺激MUC1受体触发了其配体NM23的表达。

MUC1^*刺激NM23通过自分泌反馈环而自我调节。NM23可作为单体、二聚体、四聚体或六聚体而存在(综述参见Lascu，et al.J.Bioenerg.Biomemb 2000 32(3)：227-36)。该NM23二聚体通过二聚化MUC1^*受体而激活细胞生长。NM23的较高级多聚体如六聚体通过诱导MUC1受体的簇集而抑制MUC1依赖性细胞生长。该MUC1受体自我调节方面的缺陷可引起癌或未加抑制的细胞生长。NM23中抑制保护性六聚体形成的突变可引起癌症。这些抑制六聚体形成的突变表现为NM23二聚体水平增加，其通过二聚化该MUC1^*受体而激活了MUC1依赖性细胞生长。NM23-H1的突变体S120G在成神经细胞瘤中比较常见，而且已证实与野生型蛋白相比，S120G突变引起溶液中六聚体减少、二聚体增加(Kim，et al.BiochemBiophys Res Comm 2003 307：281-9)。转染野生型NM23-H1或者不影响六聚体形成的突变体，在体外侵袭性检测中可抑制前列腺癌细胞(Kim，et al.Biochem Biophys Res Comm 2003 307：281-9)和乳腺癌细胞(MacDonald，et al.，J Biol Chem 1996 271(41)：25107-16)的迁移，而转染突变体NM23-H1的构建体(其携带S120G突变)则未抑制侵袭性，在某些实验中还能增强侵袭性(MacDonald，et al.，JBiol Chem 1996 271(41)：25107-16)。

NM23疗法：通过提供细胞NM23可刺激干细胞和祖细胞的生长。在一个优选实施方式中，NM23以有利于配体二聚化的浓度而提供，如S120G。在另一个实施方式中，提供优先形成二聚体的突变形式NM23用于刺激干细胞和祖细胞生长以及延缓分化。

NM23是MUC1受体的一种活化配体。其通过二聚化MUC1受体中的MUC1^*结构域而触发细胞生长。用二聚体形式的NM23处理干细胞和祖细胞，可刺激细胞生长并延迟分化。干细胞上存在的另一种生长因子受体是FGF受体。用bFGF刺激该FGF受体已证实可延迟干细胞分化。从干细胞中抑制bFGF达14-21天，则引起细胞分化。通过类比，刺激位于干细胞和某些祖细胞上的MUC1^*生长因子受体，特别是具有二聚体形式NM23的造血干细胞和祖细胞将延缓分化。

对该领域中的现有知识水平的综述示出了关于NM23在分化 中的作用所存在的混乱的程度。

Okabe-Kado，et al(Cancer Research 1985 45：4848-52)首次鉴定了鼠髓细胞性白血病M1细胞的一种分化抑制因子(如通过用地塞米松处理细胞后诱导吞噬细胞活性所确定的)，包含在那些细胞的培养基中。在接下来的一篇文献(Okabe-Kado，et al，BBRC 1992182(3)：987-94)中，该抑制性因子鉴定为鼠NM23-H2。进一步的工作证实，红细胞白血病细胞系K562、HEL和KU812F细胞的红细胞分化抑制(Okabe-Kado，et al.Biochimica Biophysica Acta 1995 1267：101-106)。在这些实验中，红细胞分化定义为联苯胺染色阳性，分化则通过TGF-β1、血晶素和维甲酸所诱导。

这些实验还证实，以GST融合形式来重组人类NM23-H1和-H2阻断了TGF-β1所诱导HEL细胞中的红细胞分化，且激酶缺陷性人类NM23-H2和截短型NM23-H2(aa1-60)也能够抑制TGF-β1引起的HEL细胞分化。该研究小组几乎同时做的类似工作(Okabe-Kado，et al FEBS Letters 1995 363：311-315)证实小鼠、人和大鼠NM231和2蛋白的重组GST融合抑制了鼠髓细胞性白血病M1细胞的分化抑制，如通过在地塞米松处理细胞后诱导吞噬细胞活性所确定的，且证实NM23-H2的激酶活性并非该活性所需，且NM23-H2的N末端区域(aa1-60和aa1-108)包含野生型抑制活性。

迄今为止，这些文献讨论了其声称可能是由于NM23作用的分化抑制。没有鉴定出NM23的靶受体。NM23作为整体进行讨论而未特别提及NM23的多聚化状态。NM23可以单体、二聚体、四聚体或六聚体而存在(综述参见Lascu，et al.J.Bioenerg.Biomemb 200032(3)：227-36)。本申请披露，作为二聚体，NM23二聚化MUC1^*受体并触发细胞生长。在较高聚合状态例如六聚体，其不再二聚化受体而触发细胞生长或延迟分化。相反，其通过重新簇集MUC1受体并抑制其生长因子受体活性而抑制这两种活性。关于该研究需要注意的第二点是，作者正在研究NM23在白血病和/或癌细胞系中的作用，其中NM23可能是一种突变形式，其优先形成二聚体而非六聚体(Kim，et al.Biochem Biophys Res Comm 2003 307：281-9)。此外，所例证对分化具有这些相同抑制效应的重组NM23作为GST融合蛋白而表达；GST是二聚体并使GST融合蛋白成为二聚体。

Willems，et al近期开展的工作(Experimental Hematology 200230：640-8)证实，加入重组NM23-H1、-H2或-H3未诱导造血干细胞(CD34++CD38-)的生长或扩大其形成克隆的能力，尽管NM23-H3可在轻微程度上诱导克隆形成效率。然而，用这些蛋白处理造血祖细胞(CD34+CD38-)减少了这些细胞分化为粒细胞、巨噬细胞或粒细胞-巨噬细胞克隆(CFU-G、CFU-M或CFU-GM)，并增加了红细胞克隆、红细胞爆发或混合克隆(CFU-E、BFU或CFU-GEMM)的形成。克隆形态通过显微镜进行评分。

该工作的最后一部分采用可为4种多聚化状态中任何之一的重组NM23，其中单体、二聚体(激活生长并延缓分化)和六聚体(抑制生长并诱导分化)得到差异巨大的结果。

类似地，一种用于患MUC 1阳性癌的患者的恰当治疗包括提供能够形成六聚体的NM23，通过直接给予或者借助于基因治疗的方式。

MUC1^*激活

根据研究结果即MUC1^*介导癌细胞中的生长，我们设计实验来证实干细胞生长是否可通过改变MUC1^*的二聚化状态而进行操作。将设定数量的人胚胎干细胞H9p55铺种于基质胶上。细胞通过以下进行处理：1)二价抗MUC1^*抗体(抗PSMGFR序列的兔多克隆抗体)，其二聚化该受体的MUC1^*部分；2)该相同抗体的单价形式，其结合单个MUC1^*受体并阻止二聚化；或3)不加任何抗体作为对照。最惊人的结果是，几乎所有加入了单价抗-MUC1^*抗体的细胞均在处理8小时内死亡，参见图25和26。请注意，当加入游离MUC1^*肽时，参见图27，存在较多活细胞，可能是由于游离MUC1^*肽与细胞表面结合的MUC1^*竞争对该抑制性单价抗体的结合。由于该游离肽还可与细胞表面的MUC1^*受体竞争与活化配体的结合，因此，未预料到出现了单价抗体所诱导细胞死亡的完全逆转。比较图28和29与图30和31，仅根据肉眼观察，不可能区分对照细胞与加入二价抗MUC1^*的细胞之间的差异。因此，虽然该实验进行了重复，但未以所得细胞数量可加以量化的方式进行分析。

将特定数量的细胞H9p55加入每一个孔中。同样，细胞用二价抗MUC1^*、单价抗MUC1^*加以处理或者不加抗体作为对照，随后在细胞计数仪上进行计数。图32的曲线图总结了该结果。同样，用单价抗MUC1^*抗体进行处理引起细胞在8小时内死亡。与对照细胞相比，加入二价抗MUC1^*抗体则增加了细胞死亡(虽然是中度)。图33的曲线图给出了该实验的细节。注意第一和第三组柱状图(分别对应于加入二价抗体以及不加抗体)，可注意到加入二价抗MUC1^*增加了细胞数量。比较每一组中的第一个柱形：B-bFGF-NO肽(加入二价抗MUC1^*-加入bFGF-不加入MUC1^*肽)与bFGF-NO肽相比(未加入二价抗体-加入bFGF-未加入MUC1^*肽)相比，可注意到加入二价抗MUC1^*增加了细胞生长。比较第一和第三组的第二个柱形，注意到将MUC1^*肽加入之前相同的两个环境中，引起细胞数降低，可能是由于该肽与两种环境中细胞表面结合的MUC1^*竞争对活化配体的刺激性结合，且在第一种环境中竞争与抗体的结合。

因此，可将二价抗MUC1^*加入干细胞中，以增强其生长。此外，该干细胞可在无成纤维饲养细胞(其为细胞提供未知生长因子)的情况下进行培养。这些未表征的生长因子可能还包括触发未分化干细胞开始分化的因子。将所述细胞在二价抗MUC1^*存在的情况下进行培养，添加最低量补充因子(其将延迟分化)即可使细胞生长。这些方法不应局限于增强干细胞生长。多种祖细胞在其表面上表达MUC1^*，且其增殖可利用二聚化MUC1受体中MUC1^*部分的抗体和试剂而增强。

例如，本发明中已披露，作为一种二聚体，NM23激活了MUC1^*受体并驱动癌细胞和干细胞的生长。因此，可将NM23加入干细胞和祖细胞中以刺激细胞生长并延迟这些细胞的分化，用于研究和治疗目的。可加入那些阻止或抑制较高级多聚体如六聚体形成的NM23突变体(Kim，et al.Biochem Biophys Res Comm 2003 307：281-9)来刺激干细胞生长而无需六聚体的形成，其重新簇集MUC1受体并抑制细胞生长。

抗体

免疫动物前，可或不将用于抗体生成的肽进行糖基化。这些肽的序列不需要精确反映MUC1受体的序列，如其在一般细胞群中所存在的。例如，本发明人观察到：相比针对实际天然序列(即，天然-PSMGFR，SEQ ID NO：10)的抗体(含有一个“-SRY-”基序)，针对PSMGFR肽变异体var-PSMGFR(SEQ ID NO：12)的抗体(含有一个“-SPY-”基序)对MUC1蛋白具有较高的亲和性和较强的特异性。在某些实施方式中，人们还可将突变引入该PSMGFR肽序列中以产生一个可增加抗体生成的刚性较强肽。例如，在SEQ ID NO：12的变异-PSMGFR序列中，R至P突变实际上可提供一个刚性较强的肽，从而免疫原性更强。另一种用于生成抗体的方法，所述抗体针对肽中并非特别具有免疫原性的区域如IBR或TPSIBR，是用无关序列标记特异性肽序列，其中氨基酸是D-构象因此可发挥作用来刺激宿主动物的免疫应答。用来免疫动物用于抗体生成的肽序列还可进行糖基化。本文中用于药物筛选及用来生成同源性抗体的MUC1肽来自于人类MUC1。因为不同物种之间的PSMGFR和IBR以及UR的某些部分具有相当的保守性，所以预期序列来自其他物种的MUC1肽也可用于药物筛选并生成抗体用于这些相同目的。

在某些方面，本发明提供了抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，本发明提供特异性结合MGFR的抗体或抗原结合片段。在某些实施方式中，上述抗体或其抗原结合片段特异性结合PSMGFR。在某些这种实施方式中，抗体或其抗原结合片段可特异性结合SEQ ID NO：10中列出的氨基酸序列或者其功能性变异体或片段，其在N末端包含至多15个氨基酸增加或缺失或者包含至多20个氨基酸取代；在其他实施方式中，其特异性结合SEQ ID NO：10中列出的氨基酸序列或者其功能性变异体或片段，其包含至多10个氨基酸取代；在其他实施方式中，抗体或者其抗原结合片段特异性结合SEQ ID NO：10中列出的氨基酸序列或者其功能性变异体或片段，其包含至多5个氨基酸取代；而在另外一个实施方式中，抗体或者其抗原结合片段特异性结合SEQ ID NO：10中列出的氨基酸序列。在某些实施方式中，本发明所述抗体或抗原结合片段是人、人源化、异种或者嵌合的人-非人抗体或其抗原结合片段。在某些实施方式中，本发明所述抗体或其抗原结合片段包括一个完整抗体或完整单链抗体。在某些实施方式中，对于单价抗体或抗原结合片段，其可能包含单链Fv片段、Fab’片段、Fab片段或Fd片段。对于本发明所述二价抗体或抗原结合片段，某些实施方式包含的抗原结合片段是F(ab’)₂。在某些这种组合物中，抗体或其抗原结合片段可为多克隆，而在其他实施方式中，其可为单克隆。

如本领域中为人熟知的，在抗体的抗原结合部分内存在互补决定区(CDR)，其直接与抗原表位相互作用，还存在框架区(FR)，其保持互补位的三体结构(一般参见Clark，1986；Roitt，1991)。在IgG免疫球蛋白的重链Fd片段和轻链中，存在四个框架区(FR1-FR4)，分别由三个互补决定区(CDR1-CDR3)隔开。所述CDR特别是CDR3区，更特别是重链CDR3区，主要负责抗体特异性。

如现在已为本领域所熟知的，哺乳动物抗体的非CDR区可由同种或异种抗体的类似区域而取代，同时保持原始抗体的表位特异性。这一点在“人源化”抗体的开发和应用中得到了最清楚的体现，其中将非人类CDR共价连接于人类FR和/或Fc/pFc’区而得到功能性抗体。参见例如U.S.专利4,816,567、5,225,539、5,585,089、5,693,762和5,859,205，其全部内容均结合于此供参考。这些抗体或其片段在本发明的范围内。

在某些实施方式中，完全人类单克隆抗体还可通过免疫小鼠使其成为人类免疫球蛋白重链和轻链基因座较大部分的转基因小鼠而制备。这些小鼠(例如XenoMouse(Abgenix)、HuMab小鼠(Medarex/GenPharm))免疫接种后，可按照标准杂交瘤技术制备单克隆抗体。这些单克隆抗体将具有人类免疫球蛋白氨基酸序列，因此当给予人类时将激发人抗小鼠的抗体(HAMA)应答。

在某些实施方式中，本发明包括用于生成本发明抗体或其抗原结合片段的方法，包括生成嵌合抗体、人源化抗体、单链抗体、Fab片段、F(ab’)₂片段、双特异性抗体、融合抗体、标记抗体或者这些中任何一种的类似物的步骤中的任何一种。相应方法为本领域中的熟练技术人员所已知，且在例如in Harlow and Lane“Antibodies，ALaboratory Manual”，CSH Press，Cold Spring Harbor，1988中加以阐述。嵌合抗体的生成在例如WO89/09622中加以阐述。用于人源化抗体生成的方法在例如EA-A10 239 400和WO90/07861中加以阐述。可按照本发明而利用的另一个抗体来源是所谓的异基因(或异种)抗体。用于异基因抗体生成如在小鼠体内生成人类抗体的一般原则在例如WO 91/10741、WO 94/02602、WO 96/34096和WO96/33735中加以阐述。如下文所述，本发明所述抗体可以多种形式存在(除了完整抗体；包括例如其抗原结合片段如Fv、Fab和F(ab’)2以及单链形式(即作为单链抗体)；见例如WO/09344)。

因此，如对于本领域中的普通技术人员来说将是很明显的，在某些实施方式中，本发明还提供F(ab’)₂、Fab、Fv和Fd片段；嵌合抗体，其中Fc和/或FR和/或CDR1和/或CDR2和/或轻链CDR3区已为同源性人或非人序列所取代；嵌合F(ab’)₂片段抗体，其中FR和/或CDR1和/或CDR2和/或轻链CDR3区已为同源性人或非人序列所取代；嵌合Fab片段抗体，其中FR和/或CDR1和/或CDR2和/或轻链CDR3区已为同源性人或非人序列所取代；以及嵌合Fd片段抗体，其中FR和/或CDR1和/或CDR2区已为同源性人或非人序列所取代。本发明还包括所谓的单链抗体。

抗体的化学衍生物和制剂

在某些实施方式中，本发明涉及包含上述本发明抗体或抗原结合片段或者其化学衍生物的组合物。本发明所述组合物可进一步包括药用载体。术语“化学衍生物”描述了一种分子，其包含一些通常并非该基础分子一部分的其他化学基团。这些基团可改善该基础分子的可溶性、半衰期、吸收等。可替代地，所述基团可减弱该基础分子中不需要的副作用或者降低该基础分子的毒性。这些基团的实例在多个教材例如Remington′s Pharmaceutical Sciences中有所阐述。

恰当药用载体的实例在本领域中为人熟知，包括磷酸缓冲盐溶液、水、乳液如油/水乳液、多种润湿剂、无菌溶液等。包含这些载体的组合物可采用熟知的常规方法配制。这些药学组合物可以恰当的剂量给予患者。恰当组合物的给予可通过不同方式实现，例如静脉内、腹膜内、皮下、肌内、局部或皮内给予。气溶胶制剂如鼻喷雾制剂包括活性试剂的纯化水性或其他溶液，含有防腐剂和等张剂。这些制剂优选调为与鼻粘膜表面相兼容的pH和等张状态，例如用于鼻内给药。用于直肠或阴道给予的制剂可利用恰当载体呈现为栓剂。

药学有效剂量指可减缓待治疗疾病症状或病症的抗体和/或抗原结合片段的量。这些组合物的疗效和毒性可通过标准的药学步骤在细胞培养物或实验动物中确定，例如ED50(在该群50％中治疗有效的剂量)和LD50(可使该群50％致死的剂量)。治疗性和毒性效应之间的剂量比即治疗指数，可表示为LD50/ED50的比。

本发明所述抗体和/或抗原结合片段的生物学活性表示其具有足够的亲和性使其成为候选物，用来将药物定位于可表达恰当表面结构如MGFR的细胞。因此，本发明所述抗体和/或抗原结合片段靶向并结合细胞对于递送治疗或诊断活性试剂(包括靶向药物、核酸和核酸类似物、DNA序列、RNA序列、脂质、蛋白以及基因治疗/基因递送)可非常有用。因此，本发明所述抗体和/或抗原结合片段可进行标记(例如，荧光、放射性、酶、核磁、胶体、其他信号体等)并用来体内或体外检测特异性靶标，包括体外“免疫化学”类似分析。在体内，其可以与核医学成像技术类似方式应用来检测组织、细胞或其他表达MGFR的材料。本发明的另一种方法涉及到采用结合于MUC1受体中MGFR部分的抗体作为一种用于分选和/或分离需扩增细胞的方法。分选后，这些细胞可进行体外扩增。新的遗传物质例如编码共受体和/或活化配体的物质可在扩增前或后加入这些选择的细胞中。活化抗体可在导入患者体内之前从该细胞群中去除。另一种方法涉及向患者递送治疗活性试剂。所述方法包括给予患者至少一种抗体或者其抗原结合片段以及治疗活性试剂。优选地，该治疗活性试剂选自药物、核酸和核酸类似物、序列、RNA序列、蛋白、脂质及其组合物。

MUC1调节的细胞生长

本发明涵盖用来调节受MUC1介导的细胞生长的方法和试剂。

用于调节MUC1所介导增殖的试剂针对于MUC1区，本文中我们称其为MUC1^*或MGFR。较宽泛地，这些治疗剂针对MUC1中仍粘附于细胞表面而未释放以及从细胞表面脱落的部分。在一个优选的实施方式中，治疗剂针对MUC1中主要由PSMGFR序列组成的区域。其可针对PSMGFR序列的部分或片段。此外，该PSMGFR序列可为N末端延伸的，该延伸的PSMGFR序列可为靶标治疗区域。在另一个实施方式中，该MUC1靶标区域可为PSMGFR的一种移码体使得该靶标序列在N末端一侧延伸6-12个氨基酸，并由C末端一侧类似数目的氨基酸所截短。靶向MUC1该区域的治疗剂包括抗体、抗体片段、单价抗体、双特异性或双结构域抗体、小分子、蛋白、肽等。抗体和抗体片段可选择性聚乙二醇化(pegylated)、轭合于其他物质、蛋白如白蛋白、肽和/或聚合物，只要该轭合或杂合抗体种类保留结合MUC1蛋白中定义为MGFR的部分或者包含该PSMGFR或PSMGFR-天然或PSMGFR-变异序列中至少6-9个相邻氨基酸的部分的能力。

用于调节MUC1所介导生长的试剂可针对MUC1的胞外或胞内部分。MUC1与其配体之间相互作用的拮抗剂是MUC1所介导细胞生长的抑制剂，可用作治疗剂来抑制癌细胞和癌症干细胞生长或杀死癌细胞及癌症干细胞。MUC1胞质尾区及其配体之间相互作用的激动剂或拮抗剂可分别用来促进或抑制细胞生长。抑制ERK2磷酸化的试剂例如将抑制MUC1所介导的生长。预期抑制MUC1和其他生长因子受体包括Her2或EGF受体或VEGF受体之间细胞外或细胞内相互作用的试剂为生长抑制剂，同样对于抑制癌细胞和癌症干细胞的生长特别有用。在一个优选的实施方式中，针对PSMGFR肽序列中至少6个相邻氨基酸的抗体是用于杀死或抑制癌细胞和癌症干细胞生长的试剂。在一个特别优选的实施方式中，该抗体是单价的，可结合于该PSMGFR肽中至少6个相邻氨基酸。用于抑制癌细胞和癌症干细胞生长的抗体和抗体片段可轭合于毒素或细胞毒性试剂和药物。结合MUC1中MGFR部分的抗体或抗体片段可选地设计用来诱发宿主体内的免疫应答，用于杀死或抑制癌和癌症干细胞生长。抗体及其片段可用作药物载体和药物递送剂。如本文中使用的，术语药物可表示任何治疗剂包括核酸治疗剂，其包括RNAi、siRNA和shRNA。其他用于抑制癌细胞生长和癌症干细胞生长的试剂为可中和NM23的试剂。优选的是中和NM23结合MUC1能力的试剂。特别优选的是阻止NM23二聚化的试剂。这些试剂包括抗体、抗体片段、小分子、蛋白、肽、核酸和核酸类似物包括DNA、RNA、RNAi、siRNA和shRNA。

MUC1部分和/或MUC1配体(单独或者与载体或其他药学试剂轭合)可用来诱导宿主产生针对携带MUC1细胞、特别是癌细胞和癌症干细胞的免疫应答。通过该方式，可将MUC1部分或其配体连接于佐剂、细胞、树突状细胞等而生产疫苗。在一个优选实施方式中，采用源自MUC1中仍然粘附于细胞表面的部分的肽。较优选的是包含PSMGFR或PSMGFR-天然或PSMGFR-变异序列中至少6个相邻氨基酸的肽，用于刺激免疫应答或疫苗。类似地，NM23的部分或片段可单独或者轭合于载体或佐剂而应用，其中该载体或佐剂作为免疫剂诱导免疫应答或疫苗。这种疫苗可用作包括实体瘤和非实体瘤的癌症的治疗或预防。

在细胞外或细胞内起作用的MUC1激活剂是用于刺激干细胞生长和/或延缓分化的试剂。在一个实施方式中，结合MUC1中未脱落并从细胞表面释放的部分的抗体刺激干细胞和祖细胞生长。在一个优选实施方式中，抗体结合PSMGFR或PSMGFR-天然或PSMGFR-变异(PSMGFR-var)序列中至少6个相邻氨基酸。

蛋白

根据本发明另一方面，提供一系列已分离的蛋白或肽。本发明的肽可包括但不限于上文那些定义为PSMGFR或PSMGFRTC的肽以及SEQ ID NOS：2-19中列出的那些。此外，本发明涵盖任何上文未特别提及的蛋白、或肽，可由下文所述的本发明已分离核酸分子中的任何一种来编码。本发明还涵盖上文所提及蛋白或肽的独特片段、以及针对其形成的抗体，包括单克隆抗体或多克隆抗体。

蛋白可从生物学样品包括组织或细胞匀浆中分离，且可通过构建适于该表达系统的表达载体、将该表达载体导入表达系统中以及分离重组性表达的蛋白在多种原核和真核表达系统中重组性表达。短多肽包括抗原性肽(如细胞表面上MHC分子所呈递用于免疫识别的肽)还可利用已建立的肽合成方法化学合成。

本发明还涵盖本发明蛋白或肽的独特片段，一方面其可用来产生抗体。本发明蛋白或肽中任何一种的片段例如通常具有片段包括独特片段的特征和特性，如本文中关于核酸分子所讨论的。如将由本领域中熟练技术人员所认识到的，独特片段的大小将依赖于一些因素如该片段是否构成保守性蛋白结构域的一部分。因此，本发明蛋白或肽中的某些区域将需要较长节段而成为独特片段，而其他区域则仅需要短节段，通常为5-12个氨基酸(例如长5、6、7、8、9、10、11和12个氨基酸)。

蛋白的独特片段优选是那些保留该蛋白独特功能能力的片段。蛋白片段中可保留的功能能力包括与抗体的相互作用、与其他蛋白或其片段的相互作用、选择性结合核酸分子以及酶活性。一个重要活性是作为鉴定该多肽的识别标志的能力。

本领域中的熟练技术人员非常精通于选择独特氨基酸序列的方法，特别是根据该片段从非家族成员选择性区分感兴趣序列的能力。将该片段的序列与已知数据库进行比较通常是所必需的。

本发明包括本文所述的本发明蛋白或肽的变异体。如本文中使用的，蛋白“变异体”是包含对这种蛋白一级氨基酸序列的一种或多种修饰的蛋白。可对这种蛋白进行可形成蛋白变异体的修饰1)以产生、增加、减少或消除蛋白活性；2)促进蛋白特性如蛋白在表达系统中的稳定性或者蛋白-蛋白结合的稳定性；3)为蛋白提供一种新活性或特性，例如加入抗原表位或者加入可检测性基团；和/或4)以提供与配体分子相当或更好的结合。对该蛋白进行的修饰可通过对编码该蛋白的核酸分子进行修饰而实现，可包括缺失、点突变、截短、氨基酸取代以及加入氨基酸或非氨基酸基团。可替代地，可直接对该蛋白进行修饰，例如通过裂解、在化学合成过程中取代一种或多种氨基酸、加入连接分子、加入可检测性基团如生物素、加入脂肪酸等。修饰还包括包含本发明所述氨基酸序列全部或部分的融合蛋白。本领域中的熟练技术人员将熟悉用于预测氨基酸序列变化对蛋白构象影响的方法，因此可按照已知方法“设计”变异多肽。这种方法的一个实例由Dahiyat和Mayo在Science 278：82-87，1997中加以阐述，借助该方法可重新设计蛋白。该方法可应用于已知蛋白，以仅改变该蛋白序列中的一部分。通过采用Dahiyat和Mayo的计算方法，可提出DOS蛋白的特殊变异体并加以检测以确定该变异体是否保留所需构象。

熟练技术人员还将认识到，可在本发明蛋白或肽中进行某些氨基酸取代如保守氨基酸取代以提供前述蛋白或肽的“功能性变异体”，即拥有对应的本发明蛋白或肽的功能能力。如本文中使用的，“保守性氨基酸取代”指一种氨基酸取代，其不改变其中进行氨基酸取代的蛋白的相对电荷或尺寸特征。保守性氨基酸取代包括在下列分组内氨基酸中进行的取代：(a)M、I、L、V；(b)F、Y、W；(c)K、R、H；(d)A、G；(e)S、T；(f)Q、N；以及(g)E、D。

可制备具有达1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多氨基酸取代的功能性变异体。类似地，上述或者其他功能性变异体可制备成在其C和/或N末端具有(或者还具有)达1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多氨基酸增加(amino acid addition)或缺失。如果需要，可将通过前述方法制备的该蛋白或肽的变异体进行测序，以确定氨基酸序列，从而推测编码这些变异体的核苷酸序列。

核酸

另一方面，本发明提供编码多种截短型MUC1受体蛋白的核酸序列或者其功能性变异体或片段，以及其他在高严谨性条件下杂交于上述核酸序列的核酸序列。表2中示出了本发明所述核酸分子中某些分子的序列，SEQ ID NOS：21-25，表1中给出了这些基因蛋白产物的预测氨基酸序列，每一种均包含截短型MUC1受体蛋白的同种型。因此，一方面本发明涉及表现为截短型MUC1受体同种型的肽序列、编码那些肽序列的基因以及前述功能性修饰和变异体、前述肽序列的有用片段以及与其相关的治疗产物和方法。本文中提到的肽如截短型MUC1受体蛋白包括全长MUC1受体的片段，但不包括全长MUC1受体蛋白(即SEQ ID NO：1)。同样，编码本文所述MUC1受体不同截短型同种型的核酸分子可包括MUC1基因编码区的片段，但不包括全长MUC1编码区。

根据本发明的一个实施方式，提供分离的核酸分子。该分离的核酸分子选自由以下分子组成的组：

(a)编码MUC1截短型受体同种型的核酸分子，在表1中以SEQ ID NOS：5、6、7、8和9列出，或者其功能性变异体或片段，分别包括例如核苷酸序列：SEQ ID NOS：21、22、23、24和25，以及

(b)在高严谨性条件下与(a)中核酸分子杂交的核酸分子，

(c)(a)或(b)中核酸分子的缺失、增加和取代，

(d)根据遗传密码的简并性，密码序列与(a)、(b)或(c)中核酸分子不同的核酸分子，以及

(e)(a)、(b)、(c)或(d)的互补物。

本发明所述的某些已分离核酸是编码MUC1受体的截短型同种型的核酸分子、或者其功能片段或变异体、或其功能等价物(例如，编码与通过表2中列出的核酸序列中其中一种如SEQ ID NO：21编码的相同蛋白的核酸序列)，只要该功能片段或等价物编码的蛋白表现出由该列出序列所编码MUC1受体的截短型同种型功能活性。如本文中使用的，该MUC1受体截短型同种型的功能活性指该MUC1受体肽序列的截短型同种型特异性与MGFR的配体相互作用并调节响应于这种相互作用的细胞生长或细胞增殖的能力。在某些实施方式中，所分离核酸分子为SEQ ID NO：21。

本发明提供可在高严谨性条件下与核酸或核酸类似物分子(由SEQ ID NO：21-25中列出的核苷酸序列组成)杂交的核酸和核酸类似物分子。这些核酸分子可为DNA、RNA，由混合的脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸组成，或者还可包括合成的非天然核苷酸。多种用于确定正常和肿瘤细胞中核酸和/或多肽表达的方法，为本领域中的熟练技术人员所知。

如本文中使用的，术语“高严谨性条件”指本领域中的熟练技术人员所熟练掌握的参数。核酸杂交参数可在编纂这些方法的参考文献中查到，例如Molecular Cloning：A Laboratory Manual，J.Sambrook，et al.，eds.，Second Edition，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York，1989，or Current Protocolsin Molecular Biology，F.M.Ausubel，et al.，eds.，John Wiley & Sons，Inc.，New York。较特别地，如本文中使用的，严谨性条件指例如于65℃在杂交缓冲液(3.5×SSC、0.02％Ficoll、0.02％聚乙烯吡咯烷酮、0.02％牛血清白蛋白、2.5Mm NaH2PO4(pH 7)、0.5％SDS、2mM EDTA)中进行杂交。SSC是0.15M氯化钠/0.15M柠檬酸钠，pH7；SDS是十二烷基硫酸钠；EDTA是乙二胺四乙酸。杂交后，DNA已转移其上的膜在2×SSC中室温洗涤，随后在0.1×SSC/0.1×SDS中在达68℃温度下洗涤。

一般来说，本文中列举的特定SEQ ID NO的同系物和等位基因(参见表2)通常将与该核苷酸序列或氨基酸序列分别共有至少40％的核苷酸一致性和/或至少50％的氨基酸一致性，在某些情况下将共有至少50％的核苷酸一致性和/或至少65％的氨基酸一致性，甚至在其他情况下将共有至少60％的核苷酸一致性和/或至少75％的氨基酸一致性。优选的同系物和等位基因分别与SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：5；或分别与SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：6；或分别与SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：7；或分别与SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：8；或分别与SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：9共有核苷酸和氨基酸序列一致性；且编码大于80％、较优选大于90％、更优选大于95％、最优选大于99％一致性的多肽。该一致性百分比可利用NCBI开发的多种公用软件工具进行计算(Bethesda，Maryland)，其可通过互联网获得(ftp:/ncbi.nlm.nih.gov/pub/)。示例性工具包括http://www.ncbi.nlm.nih.gov中可用的BLAST系统，其利用Altschul et al.(Nucleic Acids Res.25：3389-3402，1997)开发的运算法则。Pairwise和ClustalW比对(BLOSUM30矩阵设置)以及kyte-Doolittle亲水性分析利用MacVector序列分析软件(Oxford Molecular Group)而获得。前述核酸分子的Watson-Crick互补物也包括在本发明内。

本发明还提供分离的独特片段SEQ ID NOS：21-25和/或SEQ IDNOS：21-25的互补物。独特片段是较大核酸的“识别标志”。例如，其应足够长以确保其精确序列不存在于本发明的上述核酸分子之外的分子中。本领域的普通技术人员可仅应用常规步骤来确定一个片段在人或小鼠基因组内是否是独特的。

如将被本领域中熟练技术人员所认识到的，上述独特片段的大小将依赖于其遗传密码的保守性。因此，SEQ ID NOS：21-25中的某些区域及其互补物将需要较长节段而成为独特片段而其他区域则仅需要较短节段，通常长度为12-32个核苷酸或更长(例如，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，3031，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71，72，73，74，75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，100，101，102，103，104，105，106，107，108，109，110，111，112，113，114，115或更多)，直至所披露序列的全长。多核苷酸编码区或其互补物中多个长度为18或更多核苷酸的节段将是独特的。本领域中的熟练技术人员对于选择这些序列的方法非常精通，通常基于该独特片段选择性区分感兴趣序列与其他不相关核酸分子的能力。将该片段的序列与已知数据库中的序列进行比较是必需的，尽管可开展体外确认性杂交及测序分析。

如本文中使用的，“载体”可为多种核酸分子中的任何一种，可将所需序列通过限制性酶切和连接而插入其中用于不同遗传环境之间的转运或用于宿主细胞内的表达。尽管也可采用RNA载体，但载体通常由DNA组成。载体包括但不限于质粒、噬菌粒和病毒基因组。克隆载体是能够在宿主细胞内复制的载体，且其可进一步表征为具有一个或多个内切核酸酶限制位点，在该位点，载体以可确定性方式被切开且所需DNA序列可连接入内，使得新的重组载体保留在宿主细胞内复制的能力。在质粒中，随着宿主菌内质粒拷贝数的增加所需序列的复制可发生多次，或者在宿主通过有丝分裂繁殖前仅复制一次。在噬菌体中，复制在溶菌阶段可活跃发生，而在溶原阶段则比较被动。

“表达载体”是所需DNA序列可通过酶切和连接插入其中使得其可操作性连接于调节序列，且可表达为RNA转录体的载体。载体还可包含一个或多个适用于鉴定细胞的标志物序列，该细胞已经或没有转化或转染有该载体。标志物包括例如编码可增加或降低对抗生素或其他化合物的抗性或敏感性的基因、编码其活性可通过本领域中已知的标准分析加以检测的酶(如β-半乳糖苷酶或碱性磷酸酶)的基因以及可明显影响已转化或转染细胞、宿主、克隆或噬斑表型的基因(如绿色荧光蛋白)。优选的载体是那些能够自主复制并表达该DNA节段中存在的结构基因(它们可操作性连接于此)产物。

如本文中使用的，当编码序列和调节序列通过可使编码序列的表达或转录处于调节序列影响或控制之下的方式进行共价连接时，则称编码序列和调节序列“可操作性”连接。如果需要将该编码序列翻译为功能蛋白，则如果5’调节序列中导入启动子可引起编码序列转录，且如果两个DNA序列之间连接的性质不会(1)导致引入移码突变、(2)干扰该启动子区指导编码序列转录的能力或者(3)干扰相应RNA转录体翻译为蛋白质的能力，则称两个DNA序列可操作性连接。因此，如果启动子区能够实现DNA序列的转录使得所得转录本可翻译为所需蛋白或多肽则启动子区将可操作性连接于编码序列。基因表达所需调节序列的精确性质在不同种属或细胞类型之间可有所不同，且为本领域中的熟练技术人员所熟知。

基因治疗

在一个特殊实施方式中，可通过基因治疗的方式给予包含编码MUC1、MUC1中位于细胞表面上的片段或者MUC1多肽中的MGFR部分的序列的核酸，以治疗、抑制或预防疾患或病症，其中未成熟细胞治疗将有利于患者。基因治疗指通过给予患者已表达或可表达核酸而开展的治疗。在本发明的该实施方式中，所述核酸生成其编码的蛋白，其通过刺激表达MUC1的未成熟细胞增殖而介导治疗效应。

此外，在一个可替代性实施方式中，可共表达基因G-CSF受体用于治疗目的而刺激未成熟细胞的增殖。

本领域中可用于基因治疗的方法中任何一种均可按照本发明而应用，下文描述了示例性方法。

基因治疗方法的综述，参见Goldspiel et al.，ClinicalPharmacy 12：488-505(1993)；Wu and Wu，Biotherapy 3：87-95(1991)；Tolstoshev，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32：573-596(1993)；Mulligan，Science 260：926-932(1993)；以及Morgan and Anderson，Ann.Rev.Biochem.62：191-217(1993)；May，TIBTECH 11(5)：155-215(1993)。本领域中通常已知的可应用的重组DNA技术方法在Ausubel et al.(eds.)，Current Protocols in Molecular Biology，JohnWiley & Sons，NY(1993)；and Kriegler，Gene Transfer and Expression，A LaboratoryManual，Stockton Press，NY(1990)有所描述。

在一个优选方面，核酸序列可编码MUC1、MUC1中位于细胞表面上的片段或者MUC1多肽中的MGFR部分，其中该核酸序列是表达载体的一部分，该载体在恰当宿主中表达多肽。特别地，这些核酸序列具有可操作性连接于多肽编码区的启动子，所述启动子为可诱导性或组成性，且可选地为组织特异性。在另一个特殊实施方式中，采用的核酸分子其中多肽编码序列及任何其他所需序列侧翼为基因组内在所需位点促进同源重组的区域，从而适于染色体内表达抗体编码核酸(Kollerand Smithies，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：8932-8935(1989)；Zijlstra et al.，Nature342：435-438(1989)。

将核酸递送入患者体内可为直接(其中，患者直接暴露于该核酸或携带该核酸的载体)或间接的(其中，细胞首先用核酸进行体外转化随后移植入患者体内)。这两种途径分别称为体内和离体基因治疗。

在一个特殊实施方式中，直接体内给予该核酸序列，其中其表达生成所编码产物。可通过本领域中已知的多种方法中任何一种而实现，例如通过将其构建为恰当核酸表达载体的一部分并给予使其成为细胞内的，例如，可通过利用缺陷或减毒逆转录病毒或其他病毒载体感染或通过直接注射裸DNA或用脂质或细胞表面受体或转染试剂涂布、包裹在脂质体、微颗粒或微胶囊中或者通过连接于已知可进入核中的肽而给予、通过连接于可被受体介导性内吞的配体而给予(见例如Wu and Wu，J.Biol.Chem.262：4429-4432(1987))其可用来靶向特异性表达该受体的细胞类型)等。在另一个实施方式中，可形成核酸-配体复合物，其中该配体包含融合性病毒肽以破坏内涵体，使得核酸避免溶酶体降解。在另一个实施方式中，通过靶向特异性受体，该核酸可靶向于体内进行细胞特异性吸收和表达。可替代地，核酸可通过同源重组导入细胞内以及并入宿主细胞DNA中用于表达(Koller and Smithies，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：8932-8935(1989)；Zijlstra et al.，Nature 342：435-438(1989))。

在一个特殊实施方式中，采用包含编码该多肽的核酸序列的病毒载体。编码可用于基因治疗中的多肽的核酸序列可克隆入一种或多种载体中，其有利于将基因递送至患者体内。逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒是可采用的病毒载体的实例。逆转录病毒包含病毒基因组的正确包装并整合入宿主细胞DNA中所必需的组分。

腺病毒是尤其有吸引力的用于将基因递送至呼吸道上皮的媒介物(vehicle)，因为其自然感染呼吸道上皮，并在该上皮引起轻微疾病。基于腺病毒的递送系统的其他靶标是肝、中枢神经系统、内皮细胞和肌肉。腺病毒具有能够感染非分裂细胞的优势。此外，还提出将腺相关病毒(AAV)用于基因治疗中。

另一种基因治疗途径涉及到将基因转移至组织培养中的细胞，通过诸如电穿孔、脂质体转染、磷酸钙介导的转染或病毒感染的方法。通常，转移方法包括将可选择性标志物转移至细胞。随后选择细胞并分离那些已吸收并正在表达被转移基因的细胞。然后将那些细胞递送至患者。

在该实施方式中，将核酸导入细胞内，然后体内给予所得重组细胞。这种导入可通过本领域中已知的任何方法而实施，包括但不限于转染、电穿孔、微注射、用包含该核酸序列的病毒或噬菌体载体感染、细胞融合、染色体介导的基因转移、微细胞介导的基因转移、原生质体融合等。已知本领域中有多种技术用于将外源基因导入细胞内且可按照本发明应用，只要受体细胞的必要发育和生理功能未被破坏。该技术应该适于将核酸稳定转移至细胞，使得该核酸可被细胞表达、优选是可遗传的且可被其子代细胞表达。

核酸可导入其中用于基因治疗目的的细胞涵盖任何所需的可用细胞类型，包括但不限于上皮细胞、内皮细胞、角质形成细胞、成纤维细胞、肌细胞、肝细胞；血液细胞如T-淋巴细胞、B-淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、嗜曙红细胞、巨核细胞、粒细胞；多种干细胞或祖细胞，特别是造血干细胞或祖细胞，例如从骨髓、脐带血、外周血、胎肝等所获得的。

用于基因治疗的细胞可为自体或同种异体的。在一个优选实施方式中，用于基因治疗的细胞是患者自体细胞。

在基因治疗中采用重组细胞的实施方式中，将编码多肽的核酸序列导入细胞内，使得其可被细胞或其子代表达，随后体内给予重组细胞用于治疗效应。在一个特殊实施方式中，采用干细胞或祖细胞。任何可体外分离并保存的干细胞和/或祖细胞均可能按照本发明该实施方式而应用。

在一个特殊实施方式中，导入而用于基因治疗目的的核酸包含可操作性连接于编码区的可诱导性启动子，从而使得该核酸的表达可通过控制转录的恰当诱导物的存在与否而加以控制。

在某些实施方式中，用于递送编码本发明所述肽序列的核酸分子的病毒载体选自由腺病毒、腺相关病毒、痘病毒包括牛痘苗病毒和减毒痘病毒、Semliki Forest病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、逆转录病毒、Sindbis病毒以及类Ty病毒颗粒组成的组。已用来递送外源核酸的病毒和类病毒颗粒的实例包括：复制缺陷性腺病毒(e.g.，Xiang et al.，Virology 219：220-227，1996；Eloit et al.，J.Virol.7：5375-538l，1997；Chengalvala et al.，Vaccine 15：335-339，1997)，改良逆转录病毒(Townsend et al.，J.Virol.71：3365-3374，1997)，非复制逆转录病毒(Trwin et al.，J.Virol.68：5036-5044，1994)，复制缺陷性Semliki Forest病毒(Zhao etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：3009-3013，1995)，金丝雀痘病毒和高度减毒的牛痘苗病毒衍生物(Paoletti，Proc.Natl.Acad.Sci USA 93：11349-11353，1996)，非复制牛痘苗病毒(Moss，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：11341-11348，1996)，复制牛痘苗病毒(Moss，Dev.Biol.Stand.82：55-63，1994)，委内瑞拉马脑炎病毒(Davis et al.，J.Virol.70：3781-3787，1996)，Sindbis病毒(Pugachev et al.，Virology 212：587-594，1995)，和类Ty病毒颗粒(Allsopp et al.，Eur.J.Immunol 26：1951-1959，1996)。在某些实施方式中，病毒载体是腺病毒。

另一种有望用于某些应用的病毒是腺相关病毒(adeno-associated virus)，一种双链DNA病毒。该腺相关病毒能够感染多种细胞类型和种类，且可加工成复制缺陷型。其进一步具有优势如热稳定性和脂质溶解稳定性、多种系细胞包括造血细胞中的高转导频率以及无重复感染抑制从而可实现多系列的转导。该腺相关病毒可以以位点特异性方式整合入人细胞DNA内，从而将插入性突变的可能性和插入基因表达的变异降到最低。此外，在无选择压力时，野生型腺相关病毒感染已在组织培养中传代多于100代，表明腺相关病毒的基因组整合是一个相对稳定的事件。腺相关病毒还可以染色体外方式起作用。

其他病毒载体基于非细胞病变的真核病毒，其中非必要基因已用感兴趣的基因取代。非细胞病变病毒包括逆转录病毒，其生活周期涉及基因组病毒RNA逆转录为DNA，随后原病毒整合入宿主细胞DNA中。腺病毒和逆转录病毒已批准用于人基因治疗试验。通常，逆转录病毒是复制缺陷型的(即能够指引合成所需蛋白但不能够操作感染性颗粒)。这种遗传改变的逆转录病毒表达载体可具有用于体内高效基因转导的一般性用途。用于产生复制缺陷性逆转录病毒的标准步骤(包括将外源性遗传物质并入质粒内、用质粒转染包装细胞系、利用该包装细胞系生成重组逆转录病毒、从组织培养基中收集病毒颗粒以及用病毒颗粒感染靶细胞的步骤)在(Kriegler，M.，Gene Transfer and Expression，A LaboratoryManual，W.H.Freeman Co.，New York(1990)and Murry，E.J.Ed.“Methods in MolecularBiology，”vol.7，Humana Press，Inc.，Cliffton，New Jersey(1991)中提供。

根据该核酸分子是体外还是体内导入宿主，可采用多种技术将本发明所述核酸分子导入细胞内。这些技术包括转染核酸分子-磷酸钙沉淀、转染结合DEAE的核酸分子、转染或感染前述包含感兴趣核酸分子的病毒、脂质体介导的转染等。

对于某些应用，优选使核酸分子靶向特殊细胞。在这些情况下，用于将本发明所述核酸分子递送入细胞内的载体(例如逆转录病毒或其他病毒；脂质体)可具有一个与其连接的靶向分子。例如，分子如特异于靶细胞表明膜蛋白的抗体或者用于该靶细胞上受体的配体可结合于或并入核酸分子递送载体中。特别优选的是单克隆抗体。如果采用脂质体递送本发明所述核酸分子，则结合于内吞相关表面膜蛋白的蛋白可并入脂质体制剂中用于靶向和/或促进吸收。这些蛋白包括定向于特定细胞类型的衣壳蛋白或其片段、针对循环中发生内化的蛋白的抗体、靶向细胞内定位并增加细胞内半衰期的蛋白等。多聚体递送系统也已成功用来将核酸分子递送入细胞内，如本领域中熟练技术人员已知的。这些系统甚至允许口服递送核酸分子。

除了通过采用载体进行递送，本发明所述核酸可无需载体而递送至细胞，例如采用本领域中熟练技术人员已知的方法进行“裸”核酸递送。

转基因动物

按照本发明的另一个方面，提供包含本发明所述表达载体的非人转基因动物。如本文中使用的，“非人转基因动物”包括具有一个或多个外源核酸分子并入胚系细胞和/或体细胞内的非人动物。因此，转基因动物包括具有游离基因或染色体整合的表达载体的动物等。通常，这些表达载体可利用多种可赋予所需基因表达模式(例如时序或空间)的启动子。条件性启动子也可操作性连接于本发明所述核酸分子，以受调节或条件性方式增加或减少所编码多肽分子的表达。多肽活性或表达的反式作用负或正调节子也可操作性连接于上文所述条件性启动子。

给予和剂量

在一个特殊实施方式中，将本发明所述试剂，其包括抗体、抗体片段、蛋白、肽、核酸和核酸类似物包括DNA、RNA、RNAi、siRNA、shRNA等利用纳米颗粒递送至所需位点。在一个实施方式中，纳米颗粒携带用于将该纳米颗粒靶向于所需位点的抗体，还携带或递送治疗剂。纳米颗粒递送本发明所述物质可在体外或体内应用。优选用于递送的载体是金纳米颗粒，可选地通过聚合物涂层、环状糊精或SAM进行衍生。

当治疗性应用时，将本发明所述试剂以治疗有效量给予。通常，治疗有效量表示延缓待治疗特定病症发病、抑制其进展或将其完全终止所必需的量。通常，治疗有效量将随着患者年龄、病症和性别以及患者疾病的性质和程度而变化，所有这些均可由本领域中的普通技术人员而确定。剂量可由具体医生或兽医而调整，特别是在出现任何并发症的情况下。治疗有效量通常从0.01mg/kg至约1000mg/kg不等。预期剂量1-500mg/kg、优选剂量从1-50mg/kg将比较合适。在其他实施方式中，所述试剂以1μg/kg/天-10μg/kg/天的剂量给予，较优选的剂量为1-200μg/kg/天、1-100μg/kg/天、1-50μg/kg/天或1-25μg/kg/天。在其他实施方式中，剂量可为约0.1mg/kg至约200mg/kg，最优选为0.2mg/kg至约20mg/kg。这些剂量可每天以单次或多次剂量给予，达一天或多天。

本发明所述试剂给予时间应足够长，以为患者提供治疗或预防益处或其二者。通常，该试剂至少给予一天。在某些情况中，该试剂可在患者余生持续给予。试剂给予的速度可根据患者的需要以及给予的模式而不同。例如，在某些情况下，例如在肿瘤或癌症相关事件的过程中或紧随其后，需要给予患者较高且较频繁剂量的试剂，只要这种剂量可获得医学所需结果。另一方面，可能需要给予较低剂量以在获得医学所需结果后加以维持。在其他实施方式中，可在整个治疗期中给予相同剂量的试剂，如本文所述，其可延伸至患者整个生存期。给予频率可根据患者特征而变化。试剂可每天、每2天、每3天、每4天、每5天、每周、每10天、每2周、每月或更长时间或者处于本文所举例列出时间之间的任何时间给予一次。

在一个实施方式中，活性试剂的每日剂量将从0.01毫克/kg/天至1000毫克/kg/天不等。预期在50-500毫克/kg范围内的口服剂量，以每天一次或多次给予，将得到所需结果。根据给予模式，剂量可进行恰当调整以达到所需局部或全身水平。如果患者在该剂量应答不足，则可应用较高剂量(或者通过不同、更局部化的递送途径而给予有效的更高剂量)至患者耐受所允许的程度。可考虑每天多剂量以达到恰当的该试剂全身水平。

优选地，这些试剂可以有利于该试剂活性且如果存在也不显著影响正常细胞功能的剂量、制剂和给予方案而应用。

在一个实施方式中，该试剂的活性程度为至少10％。在其他实施方式中，该药物的活性程度为至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％。

当给予患者用于治疗性目的时，本发明所述制剂可以药学可接受量以及以药学可接受组合物而应用。这种药物组合物可包括本发明所述试剂以及本领域中已知的任何标准生理和/或药学可接受性载体。该组合物应该无菌，且以适于给予患者的重量或体积单位包含治疗有效量的该试剂。如本文中使用的，术语“药学可接受性载体”表示一种或多种相容性固体或液体填充剂、稀释剂或包裹性物质，其适于给予人或其他动物。术语“载体”指一种有机或无机成分，天然的或合成的，活性成分与其结合可有利于应用。该药学组合物的成分还能够以一种使得不存在将大大阻碍所需药学效果的相互作用的方式与本发明所述分子、以及彼此进行混合。此外，药学可接受表示与生物系统如细胞、细胞培养物、组织或有机体相兼容的无毒物质。载体的特性依赖于给予途径。生理和药学可接受性载体包括稀释剂、填充剂、盐、缓冲剂、稳定剂、增溶剂以及其他本领域中熟知的物质。

这些制备物可常规包含盐、缓冲剂、防腐剂、兼容性载体以及可选地其他治疗性成分。当用于药物中时，所述盐类应为药学可接受的，但非药学可接受性盐类可方便地用来制备其药学可接受性盐，因此未排除于本发明范围之外。这种药理和药学可接受性盐类包括但不限于那些从下列酸制备的盐：盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、马来酸、乙酸、水杨酸、p-甲苯磺酸、酒石酸、柠檬酸、甲磺酸、甲酸、丙二酸、琥珀酸、萘-2-磺酸和苯磺酸。此外，药学可接受性盐类可制备成碱性金属或碱土金属的盐类，例如羧酸基团的钠、钾或钙盐。

恰当的缓冲剂包括：乙酸及盐(1-2％W/V)；柠檬酸及盐(1-3％W/V)；硼酸及盐(0.5-2.5％W/V)；以及磷酸及盐(0.8-2％W/V)。

恰当的防腐剂包括苯扎氯铵(0.003-0.03％W/V)；三氯叔丁醇(0.3-0.9％W/V)；对羟苯甲酸酯(0.01-0.25％W/V)和硫柳汞(0.004-0.02％W/V)。

现在已存在多种给予途径。当然，所选定的特殊模式将依赖于所选择药物的特定组合、待治疗疾病病症的严重程度、患者的条件以及治疗有效性所需的剂量。一般来说，本发明的方法可利用医学可接受的任何给予模式而实施，即任何可产生活性化合物有效水平而不引起临床不可接受性不良反应的模式。这些给予模式包括口服、直肠、局部、鼻、其他粘膜形式、直接注射、经皮、舌下或其他途径。“胃肠外”途径包括皮下、静脉内、肌内或灌注。对于局部递送至癌症部位则可优选直接注射。对于高患癌风险个体的预防性治疗，由于患者的方便性以及给药方案可优选口服给予。

化学/物理载体可用来将本发明所述试剂递送至靶标(如细胞)并因此有利于吸收。如本文中使用的，“化学/物理载体”指天然或合成的能够将本发明所述试剂递送至靶标(如细胞)的分子，除了那些来自细菌或病毒来源的分子之外。

本发明优选的化学/物理载体是胶体分散系统。胶体分散系统包括脂质基系统包括水包油乳液、胶束、混合胶束和脂质体。本发明优选的胶体系统是脂质体。脂质体是人工膜介质，其作为体内或体外递送载体非常有用。已证实单层大泡(LUV)大小从0.2-4.0μm不等，可包裹较大的大分子。核酸和核酸类似物、RNA、DNA以及完整病毒体可包裹在水性内部，并可以生物活性形式递送至细胞(Fraley，et al.，Trends Biochem Sci.，v.6，p.77(1981))。为了使脂质体成为高效的基因转移载体，应存在以下特征中的一种或多种：(1)高效包裹感兴趣基因并保留生物学活性；(2)与非靶细胞相比，优先且基本结合于靶细胞；(3)将泡囊中的水性内容物高效递送至靶细胞胞质；以及(4)遗传信息的准确有效表达。

脂质体可通过将脂质体偶联于特殊配体如单克隆抗体、糖、糖脂或蛋白而靶向于特殊(如组织)，如(例如血管细胞壁)。

脂质体可从Gibco BRL购得，例如LIPOFECTIN^TM和LIPOFECTACE^TM，其可由阳离子脂质如N-[1-(2，3-二油酰氧基)丙基]-N，N，N-三甲基氯化铵(DOTMA)和双十烷基二甲基溴化铵(DDAB)形成。用于制备脂质体的方法在本领域中为人熟知，在多个出版物中已有描述。脂质体还在Gregoriadis，G.in Trends in Biotechnology，V.3，p.235-241(1985)中进行了综述。

在一个特殊实施方式中，优选的媒介是生物兼容性小颗粒或植入物，其适于植入哺乳动物受体中。按照该方法非常有用的示例性生物可蚀解植入物在PCT国际申请no.PCT/US/03307(公开No.WO 95/24929，命名为“聚合体基因递送系统”，要求1994年3月15日提交的U.S.专利申请Ser.No.213,668的优先权)中有所阐述。PCT/US/0307描述了一种生物兼容性优选生物可降解性聚合体基质用于在恰当启动子的控制下容纳外源性基因。该聚合体基质用来实现患者体内外源性基因的缓释。按照本发明，本发明所述试剂包裹或分散在生物兼容优选PCT/US/03307中披露的生物可降解性聚合体基质中。该聚合体基质优选以微粒如微球(其中该试剂分散于整个固体聚合体基质中)或微胶囊(其中该试剂储存于聚合体外壳的中心)的形式存在。其他形式用于容纳本发明所述试剂的聚合体基质包括膜、涂层、凝胶、植入物和支架。可选择该聚合体基质装置的大小和组成以在组织内引起有利的释放动力学，而所述基质装置植入组织内。该聚合体基质装置的大小可进一步按照将采用的递送方法(通常是注射入组织或利用气溶胶将悬浮液给予鼻内和/或肺区)而选择。当将装置给予血管表面时，可选择该聚合体基质组合物，使其既具有有利的降解速度又可由生物粘附性材料构成，以进一步提高转移效率。还可选择该基质组合物使其不降解而是通过随时间延长弥散而释放。

非生物降解性和可生物降解性聚合体基质可用来将本发明所述试剂递送至患者。优选可生物降解性基质。这种聚合体可为天然的或合成的聚合体。优选合成的聚合体。该聚合体根据释放所需要的时间期而选择，通常为几小时至一年或更长的数量级。通常，在几小时至3-12个月的时间内释放是最理想的。可选地，该聚合体可为水凝胶的形式，其可吸收达其重量约90％的水，而且可选地，与多价离子或其他聚合体交联。

通常，本发明所述试剂利用生物蚀解性植入物通过弥散、或者较优选地通过聚合体基质的降解而递送。可用来形成可生物降解性递送系统的示例性合成聚合体包括：聚酰胺、聚碳酸酯、聚烷撑(或聚亚烃，polyalkylenes)、聚亚烷基二醇、聚氧化乙烯、聚对苯二甲酸亚烷基酯、聚乙烯醇、聚乙烯醚、聚乙烯酯、卤化聚乙烯、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙交酯、聚硅氧烷、聚氨基甲酸酯及其共聚物、烷基纤维素、羟烷基纤维素、纤维素醚、纤维素酯、硝基纤维素、丙烯酸和甲基丙烯酸酯的聚合物、甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟丁基甲基纤维素、乙酸纤维素、丙酸纤维素、醋酸丁酸纤维素、醋酞纤维素、羧乙基纤维素、三醋酸纤维素、纤维素硫酸钠盐、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸乙酯)、聚(甲基丙烯酸丁酯)、聚(甲基丙烯酸异丁酯)、聚(甲基丙烯酸己酯)、聚(甲基丙烯酸丁酯)、聚(异乙基异丁烯酸)、聚(己基异丁烯酸)、聚(甲基丙烯酸异癸酯)、聚(甲基丙烯酸十二烷基酯)、聚(甲基丙烯酸苯基酯)、聚(丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸异丙酯)、聚(丙烯酸异丁酯)、聚(丙烯酸十八烷基酯)、聚乙烯、聚丙烯、聚乙二醇、聚环氧乙烷、聚对苯二甲酸乙二酯、聚乙烯醇、聚乙酸乙烯酯、聚氯乙烯、聚苯乙烯和聚乙烯吡咯酮。

非生物降解性聚合体的实例包括乙烯-乙酸乙烯酯(ethylenevinyl acetate)、聚(甲基)丙烯酸、聚酰胺、其共聚物及混合物。

可生物降解性聚合体的实例包括合成聚合体如乳酸和羟乙酸的聚合体、聚酐、聚(正)酯、聚氨酯、聚(丁酸)(poly(butic acid))、聚(戊酸)及聚(丙交酯-共-己内酯)和天然聚合体如藻酸盐及其他多糖类包括葡聚糖和纤维素、胶原、其化学衍生物(化学基团的取代、增加，例如烷基、烯基、羟化、氧化和其他由本领域中熟练技术人员通常进行的修饰)、白蛋白以及其他亲水蛋白、玉米醇溶蛋白以及其他谷醇溶蛋白和疏水蛋白、共聚体及其混合物。通常，这些物质在体内通过酶水解或暴露于水通过表面或骨架溶蚀而降解。

特别感兴趣的生物粘附性聚合体包括生物蚀解性水凝胶，如H.S.Sawhney，C.P.Pathak and J.A.Hubell in Macromolecules，1993，26，581-587所述，其教导内容结合于此供参考，聚玻璃酸、酪蛋白、明胶、明胶蛋白、聚酐、聚丙烯酸、藻酸盐、壳聚糖、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸乙酯)、聚(甲基丙烯酸丁酯)、聚(甲基丙烯酸异丁酯)、聚(甲基丙烯酸己酯)、聚(甲基丙烯酸异癸酯)、聚(甲基丙烯酸十二烷基酯)、聚(甲基丙烯酸苯酯)、聚(丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸异丙酯)、聚(丙烯酸异丁酯)以及聚(丙烯酸十八烷基酯)。因此，本发明提供一种上述试剂的组合物用作药剂、制备该药剂的方法以及用于该药剂体内缓释的方法。

该组合物可方便地制成单位剂型，且可利用药学领域中熟知的任何方法进行制备。所有方法均包括一个步骤即使治疗剂结合载体，其包含一种或多种附加成分。通常，该组合物通过使治疗剂均匀而密切地与液态载体、精细分割的固态载体或二者相结合，如有必要，随后使产品成型而制备。

适于胃肠外给予的组合物常常包含所述治疗剂的无菌水性制剂，优选其与受体的血液是等张的。该水性制剂可按照已知方法利用那些恰当的分散和润湿剂以及悬浮剂而配制。该无菌可注射制剂还可为溶于非毒性胃肠外可接受性稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或悬浮液，例如作为1，3-丁二醇中的溶液。可采用的可接受性媒介和溶剂包括水、林格溶液以及等张氯化钠溶液。此外，可常规采用无菌固定油作为溶剂或悬浮介质。为此目的，可采用的温和性固定油包括合成的甘油一酸酯或甘油二酯。此外，脂肪酸如油酸可应用于注射剂的制备中。适于口服、皮下、静脉内、肌内等的载体制剂可在Remington’s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Company，Easton，PA中查到。

适于口服给予的组合物可表现为分散的单位如胶囊、扁囊剂、片剂或锭剂，每一种均包含预定量的治疗剂。其他组合物包括水性液体或非水性液体中的悬浮物如糖浆、酏剂或乳液。

其他递送系统可包括定时释放、缓释或控释递送系统。这些系统可避免本发明所述治疗剂的重复给予、增加患者和医生的方便性。现在已存在多种类型的释放递送系统，且为本领域中的熟练技术人员所知。它们包括聚合体基系统如聚乳酸和聚乙醇酸、聚(丙交酯-乙交酯)、共聚乙二酸盐、聚酐、聚酯酰胺、聚正酯类、聚羟丁酸和聚己内酯。前述包含药物的多聚体的微胶囊在例如U.S.Pat.No.5,075,109中描述。类脂类非聚合体系统包括固醇类如胆固醇、胆固醇酯和脂肪酸或中性脂肪如一、二和三甘油酯；脂质体；磷脂；水凝胶释放系统；硅橡胶系统；肽基系统；蜡涂层，利用常规粘合剂和赋形剂的压缩片剂，特别是融合植入物等。特殊实例包括但不限于：(a)蚀溶系统，其中多糖以一种形式容纳于基质内，参见美国专利第4,452,775、4,675,189、和5,736,152号以及(b)弥散系统，其中活性成分以可控速度从聚合体渗透，如美国专利第3,854,480、5,133,974和5,407,686所述。此外，可采用泵基硬件递送系统，其中部分适于进行植入。

采用长期控释植入物可特别适用于治疗已确诊的疾病病症以及处于患该疾病风险的患者。如本文中使用的，“长期”释放表示该植入物构建并计划用来递送治疗水平的活性成分达至少7天，优选30-60天。该植入物可定位于损伤部位或者其中需要组织或细胞再生的部位。长期控释植入物为本领域中的熟练技术人员所熟知，包括上述缓释系统中的一部分。

该治疗剂可单独或与其他试剂包括蛋白、受体、共受体和/或遗传物质联合给药，所述遗传物质设计用来导入该区域或细胞内或者上调或下调这些基因。如果该治疗剂联合给药，则其他试剂可利用相同的方法如静脉内、口服等给予或者单独利用不同的模式给予，如治疗剂口服给予，静脉内给予等。在本发明的一个实施方式中，所述治疗剂和其他试剂通过静脉内共同给予。在另一个实施方式中，所述治疗剂和其他试剂分别给予。

可与本发明所述化合物共同给予的其他试剂包括但不限于阿西维辛；阿克拉霉素；盐酸阿可达唑；阿克罗宁；阿霉素；阿多来新；阿地流津；六甲密胺；丙氨肽霉素；阿美坦醌；氨鲁米特；胺苯吖啶；阿那曲唑；蒽霉素；天冬酰胺酶；曲林霉素；氮胞苷；氮替哌；阿佐霉素；巴马司他；苄替哌；比卡鲁胺；盐酸必桑郡；甲碘酸双奈法德；比折来新；硫酸博来霉素；布喹那钠；溴匹立明；白消安；放线菌素；卡鲁睾酮；卡醋胺；卡贝替姆；卡铂；卡莫司汀；盐酸卡米诺霉素；卡折来新；西地芬戈；苯丁酸氮芥；西罗里霉素；氯氨铂；克拉屈滨；甲磺酸克立那托；环磷酰胺；阿糖胞苷；氮烯咪胺；更生霉素；盐酸柔红霉素；脱氧氮杂胞苷；右奥马铂；地扎呱宁；甲磺酸地扎呱宁；地吖醌；多西他赛；阿霉素；盐酸阿霉素；着洛西芬；柠檬酸着洛西芬；羟甲雄酮丙酸酯；偶氮霉素；依达曲沙；盐酸依洛尼塞；依沙芦星；恩洛铂；苯环丙炔酯；依匹哌啶；盐酸表阿霉素；厄布洛唑；盐酸依索比星；磷雌氮芥；雌氮芥磷酸钠；依他硝唑；依托泊苷；磷酸依托泊苷；艾托卜宁；盐酸法罗唑啉；发杂拉平；维甲酰酚胺；氟尿苷；磷酸氟达拉滨；氟尿嘧啶；氟西他宾；磷喹酮；福司曲星钠；吉西他滨；盐酸吉西他滨；羟基脲；盐酸伊达比星；异环磷酰胺；依莫佛新；干扰素α-2a；干扰素α-2b；干扰素α-n1；干扰素α-n3；干扰素β-Ia；干扰素γ-Ib；异丙铂；盐酸依立替康；醋酸兰瑞肽；来曲唑；醋酸亮丙瑞林；盐酸利阿唑；洛美曲索钠；罗氮芥；盐酸洛索蒽醌；马丙考；美登素；盐酸氮芥；醋酸甲地孕酮；醋酸美仑孕酮；美法兰；美诺立尔；巯基嘌呤；氨甲蝶呤；氨甲蝶呤钠；氯苯氨啶；美妥替哌；米丁度胺；丝裂卡菌素(mitocarcin)；丝裂红素；丝裂吉菌素；丝裂马菌素；丝裂霉素；丝裂帕菌素；曼托坦；盐酸米托蒽醌；霉酚酸；洛可达唑；诺加拉霉素；奥马铂；亚磺酰吡啶；紫杉醇；天门冬酰胺酶；佩利霉素；溴新斯的明；硫酸培来霉素；过磷酰胺；哌泊溴烷；哌泊舒凡；盐酸必散特隆；普卡霉素；普洛美坦；扑菲尔钠；普福霉素；松龙苯芥；盐酸甲基苄肼；嘌呤霉素；盐酸嘌呤霉素；吡唑霉素；利波腺苷；吡鲁米特；沙芬戈；盐酸沙芬戈；甲环亚硝脲；辛曲秦；磷乙酰天冬氨酸钠；稀巯霉素；盐酸锗螺胺；螺旋氮芥；链黑霉素；链脲酶素；磺氯苯脲；他利霉索；紫杉酚；替可加兰钠；喃氟啶；盐酸替洛蒽醌；替莫泊芬；鬼臼噻吩甙；替罗昔隆；睾内酯；硫唑鸟嘌呤；硫鸟嘌呤；噻替派；噻唑呋林；替拉扎明；盐酸拓扑替康；枸橼酸托瑞米芬；曲托龙；磷酸曲西立滨；曲麦克特；三甲曲沙葡萄醛酯；曲普瑞林；盐酸妥布氯唑；尿嘧啶氮芥；乌瑞替哌；伐普肽；维替泊芬；硫酸长春花碱；硫酸长春新碱；长春地辛；硫酸长春地辛；硫酸长春匹定；硫酸长春甘酯；硫酸环氧长春碱；酒石酸长春瑞滨；硫酸异长春碱；硫酸长春利定；伏氯唑；折尼拉汀；新制癌菌素；盐酸正定苯酰肼。其他抗肿瘤剂包括那些在Goodman and Gilman’s“The Pharmacological Basis of Therapeutics”，第八版，1990，McGraw-Hill，Inc(健康专业部门(Health ProfessionsDivision))的第52章，抗肿瘤剂(Paul Calabresi and Bruce A.Chabner)，以及其导言，1202-1263中所描述的。

本发明不限于本文所述特殊实施方式的范围。实际上，根据前述说明和附图，除了本文所述范围，本发明的多种变更形式对于本领域中的熟练技术人员将变得非常明显。这种变更也落在所附权利要求的范围内。提供下列实施例仅是为了阐释本发明而非进行限制。

实施例

实施例1-抗体生成

结合MUC1受体中MGFR部分的抗体，本文中称为抗PSMGFR，在PCT申请No.PCT/US2004/027954(WO 2005/019269)、特别是在该PCT申请的实施例8中有详细描述。抗体生成还在PCT申请No.PCT/US2005/032821、特别是该PCT申请的实施例2中有所阐述。本发明的抗体利用标准抗体生成方法针对MUC1受体中的PSMGFR部分、特别是表1中示出的天然-PSMGFR或变异-PSMGFR而激发。兔多克隆抗体利用柱层析进行生产和纯化，其中该免疫肽连接于层析柱的珠子上。抗体，抗天然-PSMGFR和抗变异-PSMGFR已证实可特异且敏感地结合MUC1受体中的MGFR部分。

实施例2-组织样本的制备

图7-14中描绘的组织样本利用之前在PCT申请No.PCT/US2005/032821、特别是该PCT申请的实施例3中所描述的方法进行制备。检测福尔马林固定、石蜡包埋的组织样本对两种抗体的反应性，所述抗体识别MUC1受体上的不同表位，两种抗体为：1)兔多克隆抗体，抗PSMGFR，结合MUC1受体中在受体脱落后仍然粘附于细胞表面的PSMGFR部分；以及2)市售的小鼠单克隆VU4H5(Santa Cruz，CA)，结合该受体中串联重复部分的序列。来自每一个蜡块的切片均用血毒素和伊红(H&E)进行染色以辅助评价肿瘤分级。

实施例3-MUC1呈递细胞的诱导增殖

图2-4中应用的方法在PCT申请No.PCT/US2004/027954(WO 2005/019269)、特别是该PCT申请的实施例1中加以阐述。MUC1阳性细胞暴露于本发明的抗MUC1受体中MGFR部分的二价抗体。标准化细胞生长作为抗体浓度的函数而绘图。二价抗体针对表1中示出的天然-PSMGFR或变异-PSMGFR序列而激发(即，生成的单个抗体具有同时结合两个MGFR的能力)。将MUC1阳性乳腺肿瘤细胞(T47D和1504)以及天然-PSMGFR转染的MUC1阴性细胞系HEK293暴露于抗体，细胞增殖作为抗体浓度的函数而加以研究。观察到了代表生长因子/受体-抗体反应的典型生长/反应曲线。特别地，在足够低的浓度，仅一小部分细胞暴露于抗体，细胞增殖较低。在抗体足够高的浓度，抗体可结合相邻MGFR，细胞增值达到最大化。在抗体高度过量时，每一个抗体仅结合单个MGFR，而非二聚化相邻MGFR，增殖减弱。

本文所引用的全部参考文献的全部内容均结合于此供参考。

本领域中的熟练技术人员将认识到或能够仅采用常规实验而确认本文中特别阐述的本发明具体实施方式的多种等同替代。这些等同替代也涵盖于权利要求的范围内。

表1：肽序列(从N末端至C末端列出)：

全长MUC1受体(粘蛋白前体，Genbank登录号：P15941)

MTPGTQSPFF LLLLLTVLTV VTGSGHASST PGGEKETSAT QRSSVPSSTE

KNAVSMTSSV LSSHSPGSGS STTQGQDVTL APATEPASGS AATWGQDVTS

VPVTRPALGS TTPPAHDVTS APDNKPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS

TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS

APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS

TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS

APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS

TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS

APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS

TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS

APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS

TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS

APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS

TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS

APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS

TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS

APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS

TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS

APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDNRPALGS

TAPPVHNVTS ASGSASGSAS TLVHNGTSAR ATTTPASKST PFSIPSHHSD

TPTTLASHST KTDASSTHHS SVPPLTSSNH STSPQLSTGV SFFFLSFHIS

NLQFNSSLED PSTDYYQELQ RDISEMFLQI YKQGGFLGLS NIKFRPGSVV

VQLTLAFREG TINVHDVETQ FNQYKTEAAS RYNLTISDVS VSDVPFPFSA

QSGAGVPGWG IALLVLVCVL VALAIVYLIA LAVCQCRRKN YGQLDIFPAR

DTYHPMSEYP TYHTHGRYVP PSSTDRSPYE KVSAGNGGSS LSYTNPAVAA ASANL

(SEQ ID NO：1)

N末端MUC-1信号序列，用于引导MUC1受体和截短型同种型至细胞膜表面。C末端可缺失多达3个氨基酸残基，如由SEQ IDNO：2、3和4中变异体所表示的。

MTPGTQSPFFLLLLLTVLT         (SEQ ID NO：2).

MTPGTQSPFFLLLLLTVLT VVTA    (SEQ ID NO：3)

MTPGTQSPFFLLLLLTVLT VVTG    (SEQ ID NO：4)

一种截短型MUC1受体同种型，在其N末端具有天然-PSMGFR且包含全长MUC1受体的跨膜和胞质序列(“天然-PSMGFRTC同种型”-“PSMGFRTC的一个实例”-已证实不包含可选的N末端信号序列，其可能在该受体翻译后、在细胞表面上表达前被裂解)：

GTINVHDVETQ FNQYKTEAAS RYNLTISDVS VSDVPFPFSA QSGAGVPGWG

IALLVLVCVL VALAIVYLIA LAVCQCRRKN YGQLDIFPAR DTYHPMSEYP

TYHTHGRYVP PSSTDRS PYE KVSAGNGGSS LSYTNPAVAA ASANL

(SEQ ID NO：5)

一种截短型MUC1受体同种型，在其N末端具有天然-PSMGFR和PSIBR且包含全长MUC1受体的跨膜和胞质序列(“CM同种型”-已证实不包含可选的N末端信号序列，其可能在该受体翻译后、在细胞表面上表达前被裂解)：

GFLGLS NIKFRPGSVV VQLTLAFREG TINVHDVETQ FNQYKTEAAS RYNLTISDVS

VSDVPFPFSA QSGAGVPGWG IALLVLVCVL VALAIVYLIA LAVCQCRRKN

YGQLDIFPAR DTYHPMSEYP TYHTHGRYVP PSSTDRSPYE KVSAGNGGSS

LSYTNPAVAA ASANL

(SEQ ID NO：6)

一种截短型MUC1受体同种型，在其N末端具有天然-PSMGFR+PSIBR+独特区，且包含全长MUC1受体的跨膜和胞质序列(“UR同种型”-已证实不包含可选的N末端信号序列)：

ATTTPASKST PFSIPSHHSD TPTTLASHST KTDASSTHHS TVPPLTSSNH

STSPQLSTGV SFFFLSFHIS NLQFNSSLED PSTDYYQELQ RDISEMFLQI

YKQGGFLGLS NIKFRPGSVV VQLTLAFREG TINVHDVETQ FNQYKTEAAS

RYNLTISDVS VSDVPFPFSA QSGAGVPGWG IALLVLVCVL VALAIVYLIA

LAVCQCRRKN YGQLDIFPAR DTYHPMSEYP TYHTHGRYVP PSSTDRSPYE

KVSAGNGGSS LSYTNPAVAA ASANL(SEQ ID NO：7)

一种截短型MUC1受体同种型，包含全长MUC1受体的跨膜和胞质序列(“Y同种型”-已证实不包含可选的N末端信号序列，其可能在该受体翻译后、在细胞表面上表达前被裂解)：

GSGHASSTPG GEKETSATQR SSVPSSTEKN AFNSSLEDPS TDYYQELQRD

ISEMFLQIYK QGGFLGLSNI KFRPGSVVVQ LTLAFREGTI NVHDMETQFN

QYKTEAASRY NLTISDVSVS DVPFPFSAQS GAGVPGWGIA LLVLVCVLVA

LAIVYLIALA VCQCRRKNYG QLDI FPARDT YHPMSEYPTY HTHGRYVPPS

STDRSPYEKV SAGNGGSSLS YTNPAVAATS ANL

(SEQ ID NO：8)

一种截短型MUC1受体同种型，在其N末端具有天然-PSMGFR+PSIBR+独特区，且包含全长MUC1受体的跨膜和胞质序列(“Rep同种型”-已证实不包含可选的N末端信号序列，其可能在该受体翻译后、在细胞表面上表达前被裂解)：

LDPRVRTSAP DTRPAPGSTA PQAHGVTSAP DTRPAPGSTA PPAHGVTSAP

DTRPAPGSTA PPAHGVTSAP DTRPAPGSTA PPAHGVTSAP DTRPAPGSTA

PPAHGVTSAP DTRPAPGSTA PPAHGVTSAP DTRPAPGSTA PPAHGVTSAP

DTRPAPGSTA PPAHGVTSAP DTRPAPGSTA PPAHGVTSAP DTRPAPGSTA

PPAHGVTSAP DTRPAPGSTA PPAHGVTSAP DTRPAPGSTA PPAHGVTSAP

DTRPAPGSTA PPAHGVTSAP DTRPAPGSTA PPAHGVTSAP DTRPAPGSTA

PPAHGVTSAP DTRPAPGSTA PPAHGVTSAP DTRPAPGSTA PPAHGVTSAP

DTRPAPGSTA PPAHGVTSAP DTRPAPGSTA PPAHGVTSAP DTRPAPGSTA

PPAHGVTSAP DTRPAPGSTA PPAHGVTSAP DTRPAPGSTA PPAHGVTSAP

DTRPAPGSTA PPAHGVTSAP DTRPAPGSTA PPAHGVTSAP DTRPAPGSTA

PPAHGVTSAP DTRPAPGSTA PPAHGVTSAP DTRPAPGSTA PPAHGVTSAP

DNRPALGSTA PPVHNVTSAS GSASGSASTL VHNGTSARAT TTPASKSTPF

SIPSHHSDTP TTLASHSTKT DASSTHHSSV PPLTSSNHST SPQLSTGVSF

FFLSFHISNL QFNSSLEDPS TDYYQELQRD ISEMFLQIYK QGGFLGLSNI

KFRPGSVVVQ LTLAFREGTI NVHDVETQFN QYKTEAASRY NLTISDVSVS

DVPFPFSAQS GAGVPGWGIA LLVLVCVLVA LAIVYLIALA VCQCRRKNYG

QLDIFPARDT YHPMSEYPTY HTHGRYVPPS STDRSPYEKV SAGNGGSSLS

YTNPAVAAAS ANL

(SEQ ID NO：9)

MUC1生长因子受体的天然一级序列(天然-PSMGFR-“PSMGFR”的一个实例)：

GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(SEQ ID NO：10)

MUC1生长因子受体的天然一级序列(天然-PSMGFR-“PSMGFR”的一个实例)，在SEQ ID NO：10的N末端具有一个单氨基酸缺失：

TINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(SEQ ID NO：11)

MUC1生长因子受体的天然一级序列的“SPY”功能性变异体，其稳定性增强(变异-PSMGFR-“PSMGFR”的一个实例)：

GTINVHDVETQFNQYKTEAASPYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(SEQ ID NO：12)

MUC1生长因子受体的天然一级序列的“SPY”功能性变异体，其稳定性增强(变异-PSMGFR-“PSMGFR”的一个实例)，SEQ IDNO：12的C末端具有单氨基酸缺失：

TINVHDVETQFNQYKTEAASPYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(SEQ ID NO：13)

截短型PSMGFR受体(TR)(具有变异-PSMGFR的“SPY”序列)：

GTINVHDVETQFNQYKTEAASPYNLTISDVSVS(SEQ ID NO：14)

MUC1生长因子受体的延伸序列(ESMGFR)(具有变异-PSMGFR的“SPY”序列)：

VQLTLAFREGTINVHDVETQFNQYKTEAASPYNLTISDVSVSDVPFPF(SEQ ID NO：15)

MUC1生长因子受体的肿瘤特异性延伸序列(TSESMGFR)(具有变异-PSMGFR的“SPY”序列)：

SVVVQLTLAFREGTINVHDVETQFNQYKTEAASPYNLTISDVSVS

DVPFPFSAQSGA(SEQ ID NO：16)

链间结合区的一级序列(PSIBR)：

GFLGLSNIKFRPGSVVVQLTLAFRE(SEQ ID NO：17)

截短型链间结合区(TPSIBR)：

SVVVQLTLAFREG(SEQ ID NO：18)

重复基序2(RM2)：

PDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSA(SEQ ID NO：19)

表2：编码MUC1受体的截短型同种型的核酸序列(从5’末 端至3’末端列出)：

编码全长MUC1受体SEQ ID NO：1的核酸分子的一个实例：

acaggttctggtcatgcaagctctaccccaggtggagaaaaggagacttcggctacccagag

aagttcagtgcccagctctactgagaagaatgctgtgagtatgaccagcagcgtactctcca

gccacagccccggttcaggctcctccaccactcagggacaggatgtcactctggccccggcc

acggaaccagcttcaggttcagctgccacctggggacaggatgtcacctcggtcccagtcac

caggccagccctgggctccaccaccccgccagcccacgatgtcacctcagccccggacaaca

agccagccccgggctccaccgcccccccagcccacggtgtcacctcggccccggacaccagg

ccggccccgggctccaccgcccccccagcccacggtgtcacctcggccccggacaccaggcc

ggccccgggctccaccgcccccccagcccacggtgtcacctcggccccggacaccaggccgg

ccccgggctccaccgcccccccagcccacggtgtcacctcggccccggacaccaggccggcc

ccgggctccaccgcccccccagcccacggtgtcacctcggccccggacaccaggccggcccc

gggctccaccgcccccccagcccacggtgtcacctcggccccggacaccaggccggccccgg

gctccaccgcccccccagcccacggtgtcacctcggccccggacaccaggccggccccgggc

tccaccgcccccccagcccacggtgtcacctcggccccggacaccaggccggccccgggctc

caccgcccccccagcccacggtgtcacctcggccccggacaccaggccggccccgggctcca

ccgcccccccagcccacggtgtcacctcggccccggacaccaggccggccccgggctccacc

gcccccccagcccacggtgtcacctcggccccggacaccaggccggccccgggctccaccgc

ccccccagcccacggtgtcacctcggccccggacaccaggccggccccgggctccaccgccc

ccccagcccacggtgtcacctcggccccggacaccaggccggccccgggctccaccgccccc

ccagcccacggtgtcacctcggccccggacaccaggccggccccgggctccaccgccccccc

agcccacggtgtcacctcggccccggacaccaggccggccccgggctccaccgcccccccag

cccacggtgtcacctcggccccggacaccaggccggccccgggctccaccgcccccccagcc

cacggtgtcacctcggccccggacaccaggccggccccgggctccaccgcccccccagccca

cggtgtcacctcggccccggacaccaggccggccccgggctccaccgcccccccagcccacg

gtgtcacctcggccccggacaccaggccggccccgggctccaccgcccccccagcccacggt

gtcacctcggccccggacaccaggccggccccgggctccaccgcccccccagcccacggtgt

cacctcggccccggacaccaggccggccccgggctccaccgcccccccagcccacggtgtca

cctcggccccggacaccaggccggccccgggctccaccgcccccccagcccacggtgtcacc

tcggccccggacaccaggccggccccgggctccaccgcccccccagcccacggtgtcacctc

ggccccggacaccaggccggccccgggctccaccgcccccccagcccacggtgtcacctcgg

ccccggacaccaggccggccccgggctccaccgcccccccagcccacggtgtcacctcggcc

ccggacaccaggccggccccgggctccaccgcccccccagcccacggtgtcacctcggcccc

ggacaccaggccggccccgggctccaccgcccccccagcccacggtgtcacctcggccccgg

acaccaggccggccccgggctccaccgcccccccagcccacggtgtcacctcggccccggac

accaggccggccccgggctccaccgcccccccagcccacggtgtcacctcggccccggacac

caggccggccccgggctccaccgcccccccagcccacggtgtcacctcggccccggacacca

ggccggccccgggctccaccgcccccccagcccacggtgtcacctcggccccggacaccagg

ccggccccgggctccaccgcccccccagcccacggtgtcacctcggccccggacaccaggcc

ggccccgggctccaccgcccccccagcccacggtgtcacctcggccccggacaccaggccgg

ccccgggctccaccgcccccccagcccacggtgtcacctcggccccggacaccaggccggcc

ccgggctccaccgcccccccagcccacggtgtcacctcggccccggacaccaggccggcccc

gggctccaccgcccccccagcccacggtgtcacctcggccccggacaccaggccggccccgg

gctccaccgcccccccagcccacggtgtcacctcggccccggacaccaggccggccccgggc

tccaccgcccccccagcccacggtgtcacctcggccccggacaccaggccggccccgggctc

caccgcccccccagcccacggtgtcacctcggccccggacaccaggccggccccgggctcca

ccgcccccccagcccatggtgtcacctcggccccggacaacaggcccgccttgggctccacc

gcccctccagtccacaatgtcacctcggcctcaggctctgcatcaggctcagcttctactct

ggtgcacaacggcacctctgccagggctaccacaaccccagccagcaagagcactccattct

caattcccagccaccactctgatactcctaccacccttgccagccatagcaccaagactgat

gccagtagcactcaccatagctcggtacctcctctcacctcctccaatcacagcacttctcc

ccagttgtctactggggtctctttctttttcctgtcttttcacatttcaaacctccagttta

attcctctctggaagatcccagcaccgactactaccaagagctgcagagagacatttctgaa

atgtttttgcagatttataaacaagggggttttctgggcctctccaatattaagttcaggcc

aggatctgtggtggtacaattgactctggccttccgagaaggtaccatcaatgtccacgacg

tggagacacagttcaatcagtataaaacggaagcagcctctcgatataacctgacgatctca

gacgtcagcgtgagtgatgtgccatttcctttctctgcccagtctggggctggggtgccagg

ctggggcatcgcgctgctggtgctggtctgtgttctggttgcgctggccattgtctatctca

ttgccttggctgtctgtcagtgccgccgaaagaactacgggcagctggacatctttccagcc

cgggatacctaccatcctatgagcgagtaccccacctaccacacccatgggcgctatgtgcc

ccctagcagtaccgatcgtagcccctatgagaaggtttctgcaggtaacggtggcagcagcc

tctcttacacaaacccagcagtggcagccgcttctgccaacttgtagggcacgtcgccgctg

agctgagtggccagccagtgccattccactccactcaggttcttcaggccagagcccctgca

ccctgtttgggctggtgagctgggagttcaggtgggctgctcacagcctccttcagaggccc

caccaatttctcggacacttctcagtgtgtggaagctcatgtgggcccctgaggctcatgcc

tgggaagtgttgtgggggctcccaggaggactggcccagagagccctgagatagcggggatc

ctgaactggactgaataaaacgtggtctcccactg(SEQ ID NO：20)

编码天然-PSMGFR SEQ ID NO：5的核酸分子一个实例：

Acgggcacggccggtaccatcaatgtccacgacgtggagacacagttcaatcagtataaaac

ggaagcagcctctcgatataacctgacgatctcagacgtcagcgtgagtgatgtgccatttc

ctttctctgcccagtctggggctggggtgccaggctggggcatcgcgctgctggtgctggtc

tgtgttctggttgcgctggccattgtctatctcattgccttggctgtctgtcagtgccgccg

aaagaactacgggcagctggacatctttccagcccgggatacctaccatcctatgagcgagt

accccacctaccacacccatgggcgctatgtgccccctagcagtaccgatcgtagcccctat

gagaaggtttctgcaggtaacggtggcagcagcctctcttacacaaacccagcagtggcagc

cgcttctgccaacttgtagggcacgtcgccgctgagctgagtggccagccagtgccattcca

ctccactcaggttcttcaggccagagcccctgcaccctgtttgggctggtgagctgggagtt

caggtgggctgctcacagcctccttcagaggccccaccaatttctcggacacttctcagtgt

gtggaagctcatgtgggcccctgaggctcatgcctgggaagtgttgtgggggctcccaggag

gactggcccagagagccctgagatagcggggatcctgaactggactgaataaaacgtggtct

cccactg(SEQ ID NO：21)

编码CM同种型SEQ ID NO：6的核酸分子的一个实例：

Acggccggttttctgggcctctccaatattaagttcaggccaggatctgtggtggtacaatt

gactctggccttccgagaaggtaccatcaatgtccacgacgtggagacacagttcaatcagt

ataaaacggaagcagcctctcgatataacctgacgatctcagacgtcagcgtgagtgatgtg

ccatttcctttctctgcccagtctggggctggggtgccaggctggggcatcgcgctgctggt

gctggtctgtgttctggttgcgctggccattgtctatctcattgccttggctgtctgtcagt

gccgccgaaagaactacgggcagctggacatctttccagcccgggatacctaccatcctatg

agcgagtaccccacctaccacacccatgggcgctatgtgccccctagcagtaccgatcgtag

cccctatgagaaggtttctgcaggtaacggtggcagcagcctctcttacacaaacccagcag

tggcagccgcttctgccaacttgtagggcacgtcgccgctgagctgagtggccagccagtgc

cattccactccactcaggttcttcaggccagagcccctgcaccctgtttgggctggtgagct

gggagttcaggtgggctgctcacagcctccttcagaggccccaccaatttctcggacacttc

tcagtgtgtggaagctcatgtgggcccctgaggctcatgcctgggaagtgttgtgggggctc

ccaggaggactggcccagagagccctgagatagcggggatcctgaactggactgaataaaac

gtggtctcccactg(SEQ ID NO：22)

编码UR同种型SEQ ID NO：7的核酸分子的一个实例：

Acggccgctaccacaaccccagccagcaagagcactccattctcaattcccagccaccactc

tgatactcctaccacccttgccagccatagcaccaagactgatgccagtagcactcaccata

gctcggtacctcctctcacctcctccaatcacagcacttctccccagttgtctactggggtc

tctttctttttcctgtcttttcacatttcaaacctccagtttaattcctctctggaagatcc

cagcaccgactactaccaagagctgcagagagacatttctgaaatgtttttgcagatttata

aacaagggggttttctgggcctctccaatattaagttcaggccaggatctgtggtggtacaa

ttgactctggccttccgagaaggtaccatcaatgtccacgacgtggagacacagttcaatca

gtataaaacggaagcagcctctcgatataacctgacgatctcagacgtcagcgtgagtgatg

tgccatttcctttctctgcccagtctggggctggggtgccaggctggggcatcgcgctgctg

gtgctggtctgtgttctggttgcgctggccattgtctatctcattgccttggctgtctgtca

gtgccgccgaaagaactacgggcagctggacatctttccagcccgggatacctaccatccta

tgagcgagtaccccacctaccacacccatgggcgctatgtgccccctagcagtaccgatcgt

agcccctatgagaaggtttctgcaggtaacggtggcagcagcctctcttacacaaacccagc

agtggcagccgcttctgccaacttgtagggcacgtcgccgctgagctgagtggccagccagt

gccattccactccactcaggttcttcaggccagagcccctgcaccctgtttgggctggtgag

ctgggagttcaggtgggctgctcacagcctccttcagaggccccaccaatttctcggacact

tctcagtgtgtggaagctcatgtgggcccctgaggctcatgcctgggaagtgttgtgggggc

tcccaggaggactggcccagagagccctgagatagcggggatcctgaactggactgaataaa

acgtggtctcccactg(SEQ ID NO：23)

编码Y同种型SEQ ID NO：8的核酸分子的一个实例：

Acaggttctggtcatgcaagctctaccccaggtggagaaaaggagacttcggctacccagag

aagttcagtgcccagctctactgagaagaatgcttttaattcctctctggaagatcccagca

ccgactactaccaagagctgcagagagacatttctgaaatgtttttgcagatttataaacaa

gggggttttctgggcctctccaatattaagttcaggccaggatctgtggtggtacaattgac

tctggccttccgagaaggtaccatcaatgtccacgacgtggagacacagttcaatcagtata

aaacggaagcagcctctcgatataacctgacgatctcagacgtcagcgtgagtgatgtgcca

tttcctttctctgcccagtctggggctggggtgccaggctggggcatcgcgctgctggtgct

ggtctgtgttctggttgcgctggccattgtctatctcattgccttggctgtctgtcagtgcc

gccgaaagaactacgggcagctggacatctttccagcccgggatacctaccatcctatgagc

gagtaccccacctaccacacccatgggcgctatgtgccccctagcagtaccgatcgtagccc

ctatgagaaggtttctgcaggtaatggtggcagcagcctctcttacacaaacccagcagtgg

cagccacttctgccaacttgtaggggcacgtcgcc(SEQ ID NO：24)

编码Rep同种型SEQ ID NO：9的核酸分子的一个实例：

ctcgacccacgcgtccgctcgacccacgcgtccgcacctcggccccggacaccaggccggcc

ccgggctccaccgcccccccagcccacggtgtcacctcggccccggacaccaggccggcccc

gggctccaccgcccccccagcccacggtgtcacctcggccccggacaccaggccggccccgg

gctccaccgcccccccagcccacggtgtcacctcggccccggacaccaggccggccccgggc

tccaccgcccccccagcccacggtgtcacctcggccccggacaccaggccggccccgggctc

caccgcccccccagcccacggtgtcacctcggccccggacaccaggccggccccgggctcca

ccgcccccccagcccacggtgtcacctcggccccggacaccaggccggccccgggctccacc

gcccccccagcccacggtgtcacctcggccccggacaccaggccggccccgggctccaccgc

ccccccagcccacggtgtcacctcggccccggacaccaggccggccccgggctccaccgccc

ccccagcccacggtgtcacctcggccccggacaccaggccggccccgggctccaccgccccc

ccagcccacggtgtcacctcggccccggacaccaggccggccccgggctccaccgccccccc

agcccacggtgtcacctcggccccggacaccaggccggccccgggctccaccgcccccccag

cccacggtgtcacctcggccccggacaccaggccggccccgggctccaccgcccccccagcc

cacggtgtcacctcggccccggacaccaggccggccccgggctccaccgcccccccagccca

cggtgtcacctcggccccggacaccaggccggccccgggctccaccgcccccccagcccacg

gtgtcacctcggccccggacaccaggccggccccgggctccaccgcccccccagcccacggt

gtcacctcggccccggacaccaggccggccccgggctccaccgcccccccagcccacggtgt

cacctcggccccggacaccaggccggccccgggctccaccgcccccccagcccacggtgtca

cctcggccccggacaccaggccggccccgggctccaccgcccccccagcccacggtgtcacc

tcggccccggacaccaggccggccccgggctccaccgcccccccagcccatggtgtcacctc

ggccccggacaacaggcccgccttgggctccaccgcccctccagtccacaatgtcacctcgg

cctcaggctctgcatcaggctcagcttctactctggtgcacaacggcacctctgccagggct

accacaaccccagccagcaagagcactccattctcaattcccagccaccactctgatactcc

taccacccttgccagccatagcaccaagactgatgccagtagcactcaccatagctcggtac

ctcctctcacctcctccaatcacagcacttctccccagttgtctactggggtctctttcttt

ttcctgtcttttcacatttcaaacctccagtttaattcctctctggaagatcccagcaccga

ctactaccaagagctgcagagagacatttctgaaatgtttttgcagatttataaacaagggg

gttttctgggcctctccaatattaagttcaggccaggatctgtggtggtacaattgactctg

gccttccgagaaggtaccatcaatgtccacgacgtggagacacagttcaatcagtataaaac

ggaagcagcctctcgatataacctgacgatctcagacgtcagcgtgagtgatgtgccatttc

ctttctctgcccagtctggggctggggtgccaggctggggcatcgcgctgctggtgctggtc

tgtgttctggttgcgctggccattgtctatctcattgccttggctgtctgtcagtgccgccg

aaagaactacgggcagctggacatctttccagcccgggatacctaccatcctatgagcgagt

accccacctaccacacccatgggcgctatgtgccccctagcagtaccgatcgtagcccctat

gagaaggtttctgcaggtaacggtggcagcagcctctcttacacaaacccagcagtggcagc

cgcttctgccaacttgtagggcacgtcgccgctgagctgagtggccagccagtgccattcca

ctccactcaggttcttcaggccagagcccctgcaccctgtttgggctggtgagctgggagtt

caggtgggctgctcacagcctccttcagaggccccaccaatttctcggacacttctcagtgt

gtggaagctcatgtgggcccctgaggctcatgcctgggaagtgttgtgggggctcccaggag

gactggcccagagagccctgagatagcggggatcctgaactggactgaataaaacgtggtct

cccactg(SEQ ID NO：25)

表3

细胞类型	参考文献	适应证
			未成熟红细胞	Regulated expression ofMUC1 epithelial antigen inerythropoiesis.Rughetti A，Biffoni M，Pierelli L，Rahimi H，Bonanno G，Barachini S，Pellicciotta I，Napoletano C，PescarmonaE，Del Nero A，Pignoloni P，Frati L and Nuti M.(2003)Br.J.Haematol，120(2)：344-352	血液病、贫血的治疗
树突状细胞	Mucin-1is expressed ondendritic cells，both in vitroand in vivo.Cloosen S，Thio M，Vanclee A，vanLeeuwen EB，Senden-Gijsbers BL，Oving EB，Germeraad WT，Bos GM.(2004)Int.Immunol.11，1561-71	免疫疾病、尤其是免疫缺陷性疾病的治疗
			上皮祖细胞	Epithelial progenitors in thenormal human mammarygland.Stingl J，Raouf A，Emerman JT，Eaves CJ.JMammary Gland BiolNeoplasia.(2005)Jan；10(1)：49-59.	组织再生组织增加
成单核细胞和单核细胞	Epithelial membraneantigen(EMA)or MUC1expression in monocytesand monoblasts.Leong CF，Raudhawati O，Cheong SK，Sivagengi K and NoorHamdiah H.2003Pathology，35.422-427	化疗和/或放疗后患者的治疗其他需要增加巨噬细胞种系的病症

子宫内膜细胞	Human endomatrialr mucinMUC1 is up-regulated byprogesterone and down-regulated in vitro by thehuman blastocyst.Meseguer M，Aplin JD，Caballero-Campo P，O′Connor JE，Martin JC，Remohi J，Pellicer A，Simon C.(2001)Biol.Reprod.64(2)590-601	用于子宫内膜异位或其他生育力相关病症的治疗
			肺细胞	MUC1 is a novel marker forthe type II pneumocytelineage during lungcarcinogenesis.JA Jarrard，RI Linnoila，H Lee，SMSteinberg，H Witschi and ESzabo.(1998)CancerResearch，58，(23)5582-5589	用于治疗呼吸性疾病
中性粒细胞及前体	G-CSF induces elevation ofcirculating CA 15-3inbreast carcinoma patientstreated in an adjuvantsetting.Briasoulis E，Andreopolou E，Tolis CF，Bairaktari E，Katsaraki A，Dimopoulos MA，Fountzilas G，Seferiadis Cans Pavlidis N.(2001)Cancer.91.909-917	用于血液病和中性粒细胞减少症的治疗用于接受烧蚀辐射(ablative radiation)以取代骨髓移植的患者的治疗
			肥大细胞祖细胞	申请人	用于免疫缺陷患者的治疗

Claims (58)

1.一种从包含干细胞的混合种群中分离或选择干细胞的方法，包括使所述细胞群与特异于截短型MUC1受体的配体接触，其中，所述细胞上存在所述截短型MUC1受体表明它们是干细胞。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述截短型MUC1受体区域是MGFR。

3.根据权利要求2所述的方法，其中MGFR是基本由PSMGFR的氨基酸序列组成的区域。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述干细胞为多能细胞或胚胎细胞。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述干细胞为成体干细胞。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述干细胞是造血细胞或基质细胞。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述干细胞可分化为红细胞或中性粒细胞。

8.根据权利要求1所述的方法，进一步包括使所述细胞种群与已知干细胞标志物接触。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述已知干细胞标志物是分化谱系特异的。

10.一种从包含祖细胞的混合种群中分离或选择所述祖细胞的方法，包括使所述细胞种群与特异于截短型MUC1受体的配体接触，其中所述细胞上存在所述截短型MUC1受体表明它们可增殖或可进行另一个分化步骤。

11.根据权利要求1所述的方法，其中所述截短型MUC1受体区域是MGFR，所述MGFR由PSMGFR区域内的至少15个连续氨基酸组成。

12.根据权利要求1所述的方法，其中所述祖细胞是“血细胞”的前体。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述祖细胞分化为红细胞、中性粒细胞、肥大细胞、单核细胞、NK细胞、T细胞或B细胞。

14.根据权利要求1所述的方法，进一步包括使所述细胞种群与已知祖细胞标志物接触。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述已知干细胞标志物是分化谱系特异的。

16.一种扩增干细胞或祖细胞种群的方法，包括使所述细胞与结合截短型MUC1受体的二价配体接触。

17.一种诱导肿瘤细胞死亡的方法，包括使肿瘤细胞与特异于截短型MUC1受体的单价配体接触。

18.根据权利要求17所述的方法，其中所述截短型MUC1受体是MGFR，所述MGFR由PSMGFR区域内的至少15个连续氨基酸组成。

19.根据权利要求18所述的方法，其中所述配体是单价或双特异性抗体。

20.一种用于诱导肿瘤细胞死亡的方法，其中使属于NM23蛋白家族的蛋白的非二聚体形式与肿瘤细胞中的截短型MUC1受体接触。

21.根据权利要求20所述的方法，其中所述截短型受体是MGFR，所述MGFR由PSMGFR区域内的至少15个连续氨基酸组成。

22.根据权利要求20所述的方法，其中所述蛋白是NM23。

23.根据权利要求20所述的方法，包括使所述细胞与NM23突变体接触，这导致NM23的多聚化而非二聚化。

24.根据权利要求22所述的用于诱导肿瘤细胞死亡的方法，其中所述NM23是H1同种型。

25.一种扩增干细胞或祖细胞种群的方法，包括使所述细胞与属于NM23家族的蛋白家族二聚体接触。

26.根据权利要求25所述的方法，其中所述干细胞是造血干细胞。

27.根据权利要求26所述的方法，其中所述蛋白是突变体NM23，其优先形成二聚体而非更高级的多聚体。

28.根据权利要求27所述的方法，其中所述突变体NM23是S120G(Kim et al.，Biochem.Biophys Res.Comm.2003，307；281-289.)。

29.根据权利要求25所述的方法，其中所述截短型MUC1受体形式是MGFR，所述MGFR由PSMGFR区域内的至少15个连续氨基酸组成。

30.根据权利要求25所述的方法，其中所述NM23是H1同种型。

31.一种治疗对象体内癌症症状的方法，包括给予患癌症的对象编码NM23的基因。

32.一种优先形成六聚体的突变NM23蛋白。

33.一种用于检测具有患癌症易感性的对象的方法，包括筛查所述对象中的NM23突变，其中，存在形成NM23二聚体的突变表明所述对象易于患癌症。

34.根据权利要求33所述的方法，其中，对血液或其他体液进行所述筛查。

35.一种用于检测具有癌症易感性的对象的方法，包括筛查所述对象中MMP14或ADAM17的存在情况，其中，所述MMP14或ADAM17的存在表明所述对象易患癌症。

36.根据权利要求10所述的方法，其中所述祖细胞是多能性造血干细胞、共同淋巴祖细胞、共同髓系祖细胞、粒细胞/巨噬细胞祖细胞、肥大细胞祖细胞或红细胞/血小板祖细胞。

37.一种调节干细胞生长的方法，通过使细胞接触一种试剂而操控MUC1蛋白。

38.根据权利要求37所述的方法，其中通过使细胞与结合所述MUC1蛋白的MGFR部分的试剂接触而调节干细胞的生长。

39.根据权利要求38所述的方法，其中，通过使细胞与二聚化所述MUC1的MGFR部分的试剂接触而刺激生长。

40.根据权利要求39所述的方法，其中所述试剂是二价抗体或NM23。

41.根据权利要求37所述的方法，其中所述干细胞是胚胎干细胞。

42.根据权利要求37所述的方法，其中通过使细胞与结合所述MUC1的MGFR部分并阻断其二聚化的试剂接触而抑制干细胞生长。

43.根据权利要求42所述的方法，其中所述干细胞是癌症干细胞。

44.根据权利要求42所述的方法，其中所述试剂是结合所述MUC1的MGFR部分的单价抗体。

45.根据权利要求44所述的方法，其中所述抗体结合PSMGFR或PFMGFR-nat肽。

46.根据权利要求37所述的方法，其中所述调节是分化，其通过使所述细胞与抑制MUC1裂解、阻碍MMP-14或TACE表达、阻碍NM23表达或阻碍bFGF表达的试剂接触而被诱导。

47.根据权利要求37所述的方法，其中所述试剂通过纳米颗粒进行递送。

48.根据权利要求37所述的方法，其中所述试剂被共同固定在纳米颗粒上，所述纳米颗粒还呈现结合MUC1的试剂。

49.根据权利要求48所述的方法，其中所述纳米颗粒是金。

50.根据权利要求49所述的方法，其中所述纳米颗粒被自组装单层(SAM)包被。

51.一种通过使细胞群与结合MUC1的抗体接触而鉴定和选择干细胞的方法。

52.根据权利要求51所述的方法，其中所述抗体结合MUC1的MGFR部分。

53.根据权利要求52所述的方法，其中，将结合MUC1的MGFR部分的第一抗体水平和结合全长MUC1蛋白的第二抗体水平进行比较，来鉴定和选择干细胞，其中通过分离那些具有较高MGFR水平和较低全长MUC1水平的细胞来鉴定和选择未分化的干细胞。

54.根据权利要求51所述的方法，其中所述干细胞是全能细胞、多能细胞或癌症干细胞。

55.一种包含刺激干细胞生长试剂的试剂盒，包括：结合MUCI的MGFR部分的抗体；和/或NM23；和/或抑制阻碍MMP-14或TACE表达的试剂的RNAi。

56.根据权利要求55所述的试剂盒，其中试剂存在于纳米颗粒内部或纳米颗粒表面。

57.一种包含用于启动细胞分化的试剂的试剂盒，包括：结合分化的表面标志物的抗体，所述标志物包括SSEA4、Tra 1-81或Tra 1-60；和/或阻碍MMP-14和/或TACE表达的RNAi。

58.根据权利要求55所述的试剂盒，其中试剂存在于纳米颗粒内部或纳米颗粒表面。

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