CN102549146A - 用于培养干细胞和祖细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明描述了在表面上培养、扩增或培育干细胞或干细胞样细胞或诱导多能干细胞的方法，包括通过结合于表面和细胞的配体将细胞连接于表面。

Description

用于培养干细胞和祖细胞的方法
相关申请的引用
本发明要求于2009年6月11日提交的美国临时专利申请号61/186,310以及于2010年4月13日提交的61/323,779的优先权的权益，将其内容以整体引用的方式并入本文。
背景技术
在培养或增殖干细胞、祖细胞、诱导多能干细胞(induced pluripotentstem cells)或其它非粘附细胞的领域中存在的问题是如何以一种不干扰之后预期用途的方式培养细胞，包括移植或下游分化。与大多数可粘附于塑料而可在塑料培养烧瓶中培养的细胞不同，干细胞为非粘附性的，因此不能使用传统方法培育。然而干细胞可在成纤维细胞层中生长。这些“饲养细胞”层提供粘附表面并使用迄今未定性的(uncharacterized，未得到特征描述的)干细胞生长和存活所需的生长因子来饲养细胞。最近，研究者能够通过将其连接于衍生自细胞外基质的成分如基质胶(matrigel)来培养干细胞。粘附于这些表面样基质的干细胞必须在含有碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和聚积的成纤维细胞饲养细胞的分泌物的培养基中进行培养。由于均采用了细胞所分泌的未定性的因子的环境，因此尚不完全清楚如何或为何这些方法促进干细胞增殖。已报道当在基质胶表面培养时，干细胞分化更加迅速。根据任一方法(即饲养细胞或基质胶加上来自饲养细胞的条件培养基)所培养的干细胞均自发地进行分化。分化的干细胞分泌的因子可诱导邻近细胞也开始分化。因此，大约每7天，技术人员必须手动剥离并收获仅看上去未分化的干细胞集落或集落部分。然后将所收获的细胞再平皿培养(re-plated)以继续生长。重复该步骤直到可为预期目的收获足够的未分化细胞。这些培养干细胞的方法是该产业的现有技术水平。
实际上任何类型的干细胞或诱导多能干细胞的扩大培育(scaled upgrowth)都需要开发新的方法，以实现高生产量地收获这些细胞。
目前的做法是在成纤维细胞饲养细胞上培育干细胞，从中收获的唯一方法是在显微镜下手动剥离以及分离“好”细胞，接着再平皿培养。该步骤是有缺陷的，因为其具有主观性并且耗费时间。所需的是自动化收获的方法和纯化来自混合池(mixed pool)的所需细胞的自动化方法，其中基于分子识别而并非技术人员的主观标准来选择细胞。
培养干细胞的现有方法水平是不够的，因为它们：1)属于劳动密集型；2)本质上与大规模生长不匹配；3)取决于未定性的因素如条件培养基；4)需要细胞或细胞产物将干细胞附着在培养烧瓶上；和5)频繁使用能够不可逆地改变人类干细胞的非人类细胞和细胞提取物。如果可确定能够使干细胞生长的离散因素，将是一个重大的进步。有人认为如果仅加入必需和足够的生长因子，就可以使自发分化最小化。如果能够以一种与大规模生长相容的方式而并非目前在显微镜下手动剥离的方法安全地收获细胞，将是另一个重大的进步。目前，在基质胶上生长的干细胞可通过酶裂解进行收获，例如使用胰蛋白酶。通常，对未分化的集落或集落部分进行手动剥离然后使用诸如胰蛋白酶或胶原酶的酶进行消化。然而，胰蛋白酶会导致大量细胞死亡，并且已报道干细胞在基质胶上连续传代会导致异常核型(染色体组型，karyotype)。这可能是由于使用胰蛋白酶收获或可能由于基质胶是来自小鼠肉瘤细胞的细胞和分泌物的混合物。怀疑非人类饲养细胞会改变所产生的干细胞以使其不完全为人类细胞。例如，怀疑糖基化模式和其它翻译后修饰会呈现饲养细胞物种(species)的特征。
因此，如果开发出支持干细胞生长的无细胞方法，将使现有技术水平得到显著提高。如果能够使用完全定性的离散试剂(discrete agents)培育并收获干细胞，且其中尽可能多的为合成试剂，那么将是更加显著的进步。对于生产适合人类治疗的细胞，如果开发出仅包括可确定的因素的培养细胞的方法，那么将使现有技术水平得到显著提高。理想地，限定的成分应无非人类成分。优选重组蛋白或合成成分。特别优选抗体，包括多克隆、单克隆、人化抗体，其嵌合体或衍生物，由于其产生是高度重现的，其很稳定并可容易地从所收获的细胞中除去，例如使用蛋白A或蛋白G通过亲和去除(affinity depletion)来除去。
发明内容
本发明涉及在表面上培养、扩增或培育干细胞或干细胞样细胞(stem-like cells)或诱导多能干细胞的方法，其包括通过结合于表面和细胞的配体(ligand)将细胞连接于表面。配体可通过媒介物(intermediary)直接或间接结合于表面。媒介物可为化学连接子(连接物，linker)或另一种蛋白或其组合。蛋白可为蛋白A或蛋白G。特别地，连接子具有光学或化学敏感性。配体或媒介物可非特异性地吸附于表面，或可通过亲和标记-结合配偶体(亲和标签-结合伴侣，affinity tag-binding partner)的相互作用共价偶联或连接(attach，附接)于表面。配体也可与聚合物连接。在一个特定实施方式中，配体可特异性结合于在干细胞或干细胞样细胞或诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells)上表达的多肽。细胞表面的多肽可为MUC1或MUC1*、SSEA3、SSEA4、Tra 1-81或Tra 1-60。配体可为抗体或生长因子。优选地，抗体可特异性结合于PSMGFR或C-10PSMGFR。优选地，生长因子可为野生型NM23、或NM23-S120G突变体、或bFGF。
在另一个方面中，本发明涉及培养干细胞或干细胞样细胞或诱导多能干细胞的方法，其中将细胞暴露于含有可与具有序列PSMGFR的肽结合的试剂(因子，agents)的培养基中。在这方面，该试剂可为抗体，或者该试剂可为野生型NM23或NM23-S120G突变体(mutant)。
在又一个实施方式中，本发明涉及培养干细胞或干细胞样细胞或诱导多能干细胞的方法，其包括将细胞暴露于含有MUC1*阳性癌细胞所分泌的试剂(因子，agents)的培养基中。MUC1*阳性细胞可以是T47D、ZR-75-30、或ZR-75-1。
在又一个方面中，本发明涉及培养干细胞或干细胞样细胞或诱导多能干细胞的方法，其包括将细胞暴露于来自MUC1*阳性癌细胞的条件培养基中。MUC1*阳性细胞特别可以是T47D、ZR-75-30、或ZR-75-1。
在一个方面中，待使用的表面可优选不为基质胶(matrigel)，以及无成纤维细胞饲养细胞存在，当移除细胞时不需手动剥离过程。
在另一个方面中，本发明涉及从根据上述方法培育的细胞中收获细胞的方法，其包括加入可与配体结合的竞争分子(competing molecule)，以使细胞从结合于配体或表面而释放。
在又一个方面中，本发明涉及从根据上述方法培育的细胞中收获细胞的方法，其包括裂解(断裂，cleave)结合于表面并直接或间接连接于细胞的连接子，以使细胞从表面释放。
在又一个方面中，本发明涉及识别细胞分化状态的方法，其包括使用抗MUC1*抗体结合细胞，其中抗MUC1*抗体的阳性信号指示多能细胞状态，显示与未剪切(non-clipped)MUC1结合的细胞指示分化细胞状态。该方法可进一步包括从干细胞和干细胞样细胞或诱导多能干细胞和新分化细胞的混合群体(混合群落，mixed population)中分离细胞，其包括使用抗MUC1*抗体结合细胞，其中抗MUC1*抗体的阳性信号指示多能细胞状态，显示与未剪切MUC1结合的细胞指示分化细胞状态。特别地，该方法可进一步包括将细胞与干细胞或干细胞样细胞或诱导多能干细胞标记物的抗体接触，其中干细胞或干细胞样细胞或诱导多能干细胞标记物的阳性信号指示多能干细胞状态的存在。特别地，可将细胞与抗MUC1*和抗Tra 1-81、抗Tra 1-60、SSEA3或SSEA4抗体接触。
在又一个方面中，本发明涉及使用抗MUC1*抗体结合细胞以检测癌症干细胞的方法，其中抗MUC1*抗体的阳性信号指示癌症干细胞。该方法可进一步包括将细胞与干细胞标记物的抗体接触，其中干细胞标记物的阳性信号指示癌症干细胞的存在。
在又一个方面中，本发明涉及在表面上调节培养、扩增或培育以及抑制干细胞或干细胞样细胞或诱导多能干细胞分化的方法，其包括通过结合于细胞的配体直接或间接将细胞连接于表面，并将细胞暴露于含有可与具有序列PSMGFR的肽结合的试剂的培养基中。该试剂可使MUC1*二聚化以促进生长并抑制分化，或者该试剂可抑制MUC1*的二聚化以促进分化。
在又一个方面中，本发明涉及分离细胞类型的方法，其包括：在表面为对不同细胞类型具有亲和力的多种配体或为能够识别细胞期(cell stage)或类型的特异性标记物建立空间编址(空间寻址、空间地址，spatialaddress)；和将细胞加至表面，其中根据细胞所结合的配体使细胞在空间中分离。表面可为颗粒或纳米粒子。
在又一个方面中，本发明涉及将连接配体的表面植入宿主体内的方法，其中所述配体为干细胞或干细胞样细胞或诱导多能干细胞的配体。宿主可为患者。特别地，配体可为宿主的干细胞或干细胞样细胞或诱导多能干细胞的生长因子。
在又一个方面中，本发明涉及将通过结合于表面和细胞的配体而与细胞连接的表面植入宿主体内的方法。
在又一个方面中，本发明涉及体内增殖干细胞或干细胞样细胞或诱导多能干细胞的方法，其包括将连接配体的表面给予至宿主体内，所述配体为干细胞或干细胞样细胞或诱导多能干细胞的配体。
在又一个方面中，本发明涉及组合物，其包括：通过亲和相互作用与蛋白A或蛋白G结合的表面，其中蛋白A或蛋白G结合于特异性针对在干细胞或干细胞样细胞或诱导多能干细胞上特异表达的多肽的抗体，和MUC1*二聚化试剂。亲和相互作用可通过NTA-Ni与表面的相互作用。多肽可为MUC1或MUC1*、SSEA3、SSEA4、Tra 1-81或Tra 1-60。MUC1*二聚化试剂可为野生型NM23或NM23-S120G突变体。
在又一个方面中，本发明涉及增殖干细胞或干细胞样细胞或诱导多能干细胞的方法，其包括：使通过亲和相互作用与蛋白A或蛋白G结合的表面(其中蛋白A或蛋白G结合于特异性针对在干细胞或干细胞样细胞或诱导多能干细胞上特异表达的多肽的抗体)与含有细胞并具有MUC1*二聚化试剂的样品接触。
附图说明
图1显示当在基本培养基和抗MUC1*中培养时，连接于基质胶的人类胚胎干细胞(H9)基本上100％发育成多能的(OCT4+)，而当在标准bFGF和来自成纤维细胞饲养细胞的条件培养基中培养时具有较少的细胞数和较多的分化。DAPI对所有细胞核进行染色。虚线用于区分集落的未分化部分的边界。在用抗MUC1*处理的孔中，未分化的干细胞生长达到了孔的极限。
图2显示了仅在抗MUC1*和基本培养基中的基质胶上的人类胚胎干细胞进行18次传代后，BG01v/hOG的核型无变化。
图3A-3D显示仅在抗MUC1*和基本培养基(minimal media)中的基质胶上培养的人类胚胎干细胞能够沿3个胚系(germlines)进行分化：A)OCT4阴性表明细胞已分化；B)对α-甲胎蛋白呈阳性表明沿内胚层胚系分化；C)对巢蛋白呈阳性表明沿外胚层胚系分化；和D)对平滑肌肌动蛋白呈阳性表明沿中胚层胚系分化。
图4显示无论仅在基本干细胞培养基中还是在添加bFGF的来自成纤维细胞饲养细胞的条件培养基中培养，包被抗MUC1*抗体的表面均支持干细胞的生长。将不相关的抗体包被在不同的表面上未引起干细胞粘附，并且细胞在24小时内死亡。
图5A-5B显示在仅含有抗MUC1*和基本培养基的培养中多次传代后，连接于基质胶的人类胚胎干细胞的照片。左侧的照片显示DAPI对所有细胞的核进行染色，右侧的画面显示与OCT4染色具有1∶1的相关。其总体显示所有细胞仍然为OCT4+，表明具有多能性。
图6A1-D2显示在抗MUC1*抗体表面生长的hu ES H9细胞的照片：A)仅在基本培养基中培养的第3天(A1)和第7天(A2)；B)在基本培养基加上80ng/ml抗MUC1*中培养的第3天(B1)和第7天(B2)；C)在4ng/ml bFGF和50％来自HS27成纤维细胞的条件培养基中培养的第3天(C1)和第7天(C2)；D1，D2)通过加入游离PSMGFR(MUC1*胞外域)肽收获A孔和B孔的细胞，将细胞从表面释放；在细胞所连接和增殖的新鲜抗MUC1*抗体表面对细胞再次进行再平皿培养。
图7是干细胞在包被有抗MUC1*抗体或与β-环糊精偶联的相同抗体的表面上生长的图表。其显示了当抗体与环糊精偶联时，细胞粘附和生长均提高。
图8显示如果在基本培养基加上80ng/ml抗MUC1*抗体中培养，可通过将细胞与包被有可结合干细胞表面标记物蛋白SSEA4和Tra 1-81的抗体的表面连接来培养hu ES细胞。
图9显示当在基本培养基加上NM23中培养时，基质胶上的hu ES细胞至少与现有技术水平生长得一样好。该图表比较了当在添加标准4ng/ml bFGF的来自成纤维细胞的HS27条件培养基(对照)中培养时基质胶上的hu ES H9细胞的生长与在基本干细胞培养基加上标明浓度的NM23中的生长。通过盲目计数(默数，blinded count)未分化和分化的集落，然后换算为百分比来计算未分化生长的百分比。仅有完全未分化的细胞记为(得分为，score)未分化。
图10显示在包被有与环糊精共价偶联的抗MUC1*的表面生长并且在基本培养基加上标明浓度的NM23中培养至快要分裂(ready to split)的hu ES细胞。一组细胞首先在4ng/ml bFGF加上50％HS27成纤维细胞条件培养基(CM)中培养24小时。该图表显示如果加入足量的NM23，bFGF和CM不利于细胞生长或分化状态。
图11A-11G显示干细胞粘附并生长在NTA-Ni包被的表面上，在NTA-Ni上首先结合了组氨酸标记的配体NM23、RGD肽、蛋白G，其次是抗SSEA4和Tra 1-81。随后Hu ES H9细胞生长并形成集落。绘制在第3天计数的未分化的和已分化的集落数量(B-G)。所绘制的代表性干细胞集落的照片显示在图11A中。
图12显示来自MUC1*阳性癌细胞的条件培养基(Ca CM)以远超过标准成纤维细胞条件培养基(CM)的程度促进hu ES细胞的生长并抑制其分化。此外，当加入至Ca CM中，NM23比标准bFGF效果更好。
图13A-13C显示在从分泌不同单克隆抗体的杂交瘤克隆中吸取的上清液中生长的hu BG01v/hOG ES细胞的照片。以这种方式可以确定能够实现最佳干细胞粘附的单克隆抗体。
图14为ELISA测定的图表，其中测试杂交瘤上清液结合N端或C端缺少10个氨基酸的缺失突变的PSMGFR肽的能力。能够使干细胞附着于包被其上清液的表面的杂交瘤也表现为结合于C-10PSMGFR肽(GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDV)。我们认为结合于MUC1*胞外域更远端部分的抗体可更好地使细胞附着于表面。
图15A-15L显示H9人类胚胎干细胞在开始分化前后的ICC染色的照片。抗MUC1*对所有未分化的细胞集落进行染色并用OCT4进行共定位，其中OCT4是多能性的黄金标准指示剂(图15A，15B)。识别出MUC1全长的VU4H5抗体未对任何未分化细胞进行染色。图15C。然而当细胞分化时，检测到反向MUC1模式。未观察到MUC1*染色或OCT4染色(图15D，15E)。但每个细胞对全长MUC1染色呈阳性(图15F)。同样，未分化的干细胞对NM23即MUC1*配体染色呈阳性，并且NM23与MUC1*和OCT4精确地进行了共定位(图15G-15L)。
图16A-16B显示抗MUC1*抗体加入至干细胞培养基可增强人类造血干细胞(HSC)的生长(A)。(B)FACS分析显示仍然为造血干细胞(CD34+/CD38-)的细胞数量随着抗MUC1*浓度的升高而升高。相反，进展至下一个祖细胞期(CD34+/CD38+)的细胞数量随着抗MUC1*浓度的降低而升高。这些结果显示刺激MUC1*生长因子受体可抑制HSC的分化。
图17A-17B显示神经干细胞(A)和胎肝细胞(B)的FACS扫描。从供应商处获得细胞并立即使用荧光标记的抗MUC1*抗体和能够识别全长MUC1远端部分的标记抗体(HPMV)进行染色。FACS扫描显示在两种早期祖细胞中MUC1均通常被剪切(clip)为MUC1*。随后的实验显示抗MUC1*以浓度依赖的方式刺激两种细胞类型的生长。
图18为胎肝细胞根据抗MUC1*浓度的生长曲线图，其显示可通过刺激MUC1*受体分离并扩增MUC1*祖细胞。
图19为在包被于12孔板的抗MUC1*或抗SSEA4抗体上对hu ES H9细胞进行平皿培养，然后在8nM NM23或4ng/ml bFGF加上50％HS27成纤维细胞条件培养基中培养的干细胞集落的曲线图。
具体实施方式
在本发明中，“一个”和“一种”用于指代单数和复数对象。
如此处所使用，“MUC1生长因子受体”(MGFR)为一功能性定义，是指与活化配体如生长因子或修饰酶如裂解酶相互作用的MUC1受体的部分。MUC1的MGFR区域为距细胞表面最近的胞外部分，其由多数或所有PSMGFR定义，定义如下。MGFR包括未修饰的肽和经过酶修饰(如磷酸化、糖基化等)的肽两种。
如此处所使用，“MUC1生长因子受体的一级序列”(PSMGFR)是指在某些情况下定义大部分或所有MGFR的肽序列，以及功能性变体和肽序列片段。将PSMGFR定义为SEQ ID NO：1，其所有功能性变体和片段的氨基酸替换的整数值多达20(即1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20)和/或在其N端和/或C端的氨基酸增加或缺失的整数值多达20。上文中的“功能性变体或片段”是指具有与配体特异性结合或特异性相互作用的能力而不会强烈结合于与其自身相同的其它肽分子的相同区域而致使肽分子具有与其它相同的肽分子聚集(即自聚集)的能力的变体或片段，其中所述配体与SEQ ID NO：1的肽特异性结合或特异性相互作用。一个作为SEQ NO：1的PSMGFR肽的功能性变体的PSMGFR的实例为SEQ ID NO：2，其通过以-SPY-序列代替-SRY-而不同于SEQ ID NO：1。
如此处所使用，“MUC1*”是指N端截短的MUC1蛋白，导致胞外域基本由PSMGFR组成(SEQ ID NO：1)。
如此处所使用，在细胞结合于表面的上下文中所使用的“表面”可为固体基质、或多孔基质或其它非固体基质。
如此处所使用，“基本培养基”可为含有能够培养细胞的最低养分的任意培养基，通常不存在不明确的试剂的混合物，如来自细胞的条件培养基，或来自存活宿主的血清。如此处所使用，“基本干细胞培养基”可为含有能够培养干细胞或干细胞样细胞的最低养分的任意培养基。这也称为基本培养基或MM。可以看出，本发明所使用的基本培养基不限于例示的基本培养基，并可包括具有明确成分的多种类型的溶液。
如此处所使用，“干细胞样”细胞具有干细胞的某些特征。例如，它们具有某些自我更新的能力。它们可以：a)表达，或诱导表达OCT4、SOX2、和NANOG、或KLF4；或b)它们在其表面表达高水平的MUC1*。干细胞样细胞的实例包括但不限于祖细胞、多能干细胞、经历诱导多能性过程的细胞、癌细胞、癌症干细胞、造血干细胞、iPS以及某些产生抗体的杂交瘤细胞。
如此处所使用，“诱导多能干细胞”或“iPS”是指通过诱导某些基因的“强迫性”表达(“受迫”表达，“forced”expression)，人为地来自非多能干细胞的一种多能干细胞，所述非多能干细胞通常为成人体细胞。
如此处所使用，“MUC1*刺激物(刺激子，stimulator)”是指任何能够激活MUC1*活性的分子，如MUC1*的二聚化或MUC1裂解形成MUC1*。
序列表独立文本(Sequence Listing Free Text)
关于核苷酸符号而不是a、g、c、t的使用，遵循WIPO标准ST.25，附录2，表1中提出的公约，其中k代表t或g；n代表a、c、t或g；m代表a或c；r代表a或g；s代表c或g；w代表a或t且y代表c或t。
GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(SEQ ID NO：1)描述了MUC1的近膜端的胞外域(membrane proximalextracellular region)的氨基酸1110至1155(PSMGFR)。
GTINVHDVETQFNQYKTEAASPYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(SEQ ID NO：2)描述了MUC1的近膜端的胞外域的变体的氨基酸1110至1155(PSMGFR的变体)。
QFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(SEQ ID NO：3)描述了N端缺失十个氨基酸的PSMGFR序列(N-10PSMGFR)。
GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDV(SEQ ID NO：4)描述了C端缺失十个氨基酸的PSMGFR序列(C-10PSMGFR)。
表面上的干细胞或干细胞样细胞或诱导多能干细胞
本发明公开了培养或扩增干细胞或干细胞样细胞或诱导多能干细胞和祖细胞的方法，其涉及将细胞表面蛋白配体连接于可以容纳培养基或可以加入培养基中的固体支持物(固体载体，solid support)上。
本发明公开了培养细胞的新方法和表面。该方法特别适用于培育和保存无粘附性的细胞。这些方法尤其适用于培养干细胞、干细胞样细胞和祖细胞。
表面
本发明公开了培育细胞的新型表面和方法。这些表面特别适用于培育非粘附细胞、干细胞和干细胞样细胞，包括诱导多能干细胞(iPS)和某些祖细胞。本文所公开的方法解决了如何在保存有价值的细胞的同时更换细胞培养基的问题。许多现有的细胞培养方法仅对粘附细胞有效，因为他们可附着在烧瓶表面。可除去旧的液体培养基并更换为新培养基而不干扰附着于密封容器表面的细胞。本发明的某些方法的有用之处在于它们允许保留有价值的生长因素(生长因子，growth factors)，而更换需要更频繁替换的不昂贵的因素。本发明的其它方法提供了更大的细胞附着的表面积，因此在使用相对较小的空间和较小体积培养基的同时，增加了细胞的产率。该方法通常涉及将配体直接或间接地连接于表面，其中配体能够结合细胞表面的分子。
适用于这些方法的表面可为膜或具有多孔的性质。此处所述的表面可为聚合物，包被聚合物的表面，环糊精或环葡聚糖(cyclodextran)。表面可为空间可编址的表面，珠粒(bead)、颗粒或纳米粒子的表面。珠粒、颗粒或纳米粒子可在溶液中游离或由中间分子(intervening molecule)连接。例如，膜可由聚合物质组成并可与具有促进细胞和表面间结合的配体的珠粒或颗粒连接。本发明包括使用这些表面进行体外、离体和体内培育。本发明所述表面可用于体外培养细胞。可替换地，本发明所述表面可植入宿主中。表面可容纳细胞如干细胞，并作为疗法植入。例如，可将连接或未连接生长的干细胞的本发明所述表面进行移植，增加了表面的植入效率。在另一种情况中，移植的表面含有配体以便将宿主自身的细胞或干细胞招募至一区域或促进该部位的靶细胞生长。例如，可将吸引并促进干细胞生长的表面插入至关节中以促进软骨的替换。可对本发明所述表面进行成形或包被于骨架上，以使细胞最终形成三维的形式。例如，可将材料制成耳的形状然后包被本文所述的能够连接并培育干细胞或干细胞样细胞的一种表面，所述干细胞或干细胞样细胞最终以骨架的形式发育成更成熟的细胞或组织。进一步设想本发明所述表面和组合物可用于包被可植入设备，该设备可为结构化或非结构化的多孔或固体表面。所述设备可将干细胞或祖细胞传送或招募至一区域用于修复或再生组织或细胞的目的。例如可使用任意本发明所述表面或组合物包被支架以修复或使血管再生。可将包被有本发明所述表面(例如NM23-S120G以及干细胞或祖细胞所连接的表面)的支架植入宿主或人体内以传送能够刺激宿主自身细胞的细胞或生长因子。可在体外、离体或体内实施该方法。
配体
促进细胞结合至表面或刺激细胞增殖的配体可直接连接于表面或间接地例如连接于与表面连接的聚合物。例如，识别细胞表面受体的抗体可共价连接于聚合物，如连接或吸附于表面的环糊精或环葡聚糖，见实施例6、10-12和图7、10。可选地将对细胞表面的分子具有某些亲和力的配体连接于这些表面以促进细胞的粘附与生长。配体可特异性结合于细胞表面，如生长因子受体。配体可为蛋白、肽、小分子、抗体、多克隆或单克隆抗体、双特异性抗体、单价或二价抗体、抗体衍生物如Fab、单链抗体、基因工程衍生物或将一种抗体的可变域插入另一种蛋白中以使其能够与其靶标特异性结合而产生的衍生物。此外，配体无需对细胞表面分子具有特异性亲和力。例如，连接于表面的配体可导致细胞通过非特异性相互作用粘附于表面。非特异性相互作用可为化学或生物性质。衍生有亲水性部分如羟基或疏水性头基(headgroup)如甲基的表面可通过疏水性相互作用非特异性地保留细胞。具有带电(负载，charged)化学或生物实体的表面可通过离子相互作用吸附细胞。携带对细胞有某些特异性的实体的表面也可捕获细胞，包括但不限于含有RGD序列的肽、聚赖氨酸、带正电或负电的表面、胶原、层粘连蛋白、及其它细胞外基质成分，包括基质胶和基质胶样物质。其它类型的化学修饰的表面也可捕获细胞。例如，包被有NTA-Ni和其它金属螯合物的表面可非特异性地结合细胞和干细胞，见实施例15和图12。
在一个优选实施方式中，将对细胞表面的分子具有特异性亲和力的部分连接于表面以促进干细胞的附着。例如，将作为干细胞的特异性标记物与细胞表面蛋白结合的抗体连接于表面，如SSEA3、SSEA4、或Tra 1-81或Tra 1-60。干细胞通过其细胞表面蛋白和培养皿上的同源抗体(cognateantibody)之间的特异性相互作用粘附于这些表面。随后可通过标准方法或本发明所述的刺激MUC1*的新型方法培养细胞，见实施例1-4、8-10、12和图1-10。在另一个实例中，连接于表面的配体为生长因子或生长因子的部分。在另一个实例中，连接于表面的配体为能够识别细胞表面分子的抗体、或抗体的部分，所述细胞表面分子可为生长因子受体。在另一个实例中，将配体复合物连接或固定于表面，其中复合物的至少一个成员对细胞表面分子具有亲和力或向细胞提供可调节细胞生长或分化的试剂(agent)。例如，可通过组氨酸标记NTA-Ni相互作用将蛋白G吸附于，或特异性连接于表面，并通过抗体与蛋白G的相互作用将能够识别干细胞表面标记物的抗体连接于表面，见实施例14、图11。
混合表面
在某些情况下，需要含有配体和成分混合物的表面。这些可为生物或化学性质或可为生物和化学成分的混合物。例如，可使用生长因子的混合物，或等价的活化抗体加上细胞外基质成分如胶原或层粘连蛋白(laminin)的混合物来包被表面。包被有层粘连蛋白和生长因子或抗体的混合物的表面也可促进干细胞的附着和生长。例如，我们已经说明由胶原或层粘连蛋白和特异性针对细胞表面标记物的抗体组成的表面包被层(surfacecoatings)可用于培育干细胞或干细胞样细胞。
在另一个实例中，将层粘连蛋白或胶原与细胞表面标记物的配体混合。实验表明将层粘连蛋白与抗MUC1*混合可降低干细胞附着和细胞生长以及正常干细胞集落成长(develop)所需的抗体量。在本发明的另一个方面中，将混合的种类连接于表面，其中一种或多种成分为可促进细胞附着于表面的配体，其它成分可向细胞提供能够影响细胞功能的试剂。能够连接于表面的功能性试剂的实例包括但不限于促进生长、分化或诱导多能性的试剂。
配体连接的方法
促进细胞粘附或为生长因子的配体可以多种方式连接于表面，包括但不限于共价偶联，例如使用EDC/NHS或马来酰亚胺偶联化学。可替换地，本发明所述配体可通过非共价相互作用或亲和相互作用连接于表面。例如，可用组氨酸标记本发明所述配体，然后通过次氮基三乙酸-镍(nitrilotri-acetic acid-nickel，NTA-Ni)部分连接于表面。可使用亲和标记相互作用来产生适合培养细胞的生长表面。例如，将NTA-Ni部分与细胞培养烧瓶连接，并通过NTA-Ni捕获组氨酸标记的配体。配体可直接或间接连接于细胞表面受体以将细胞固定在表面。如果配体也为生长因子，那么其有助于引起细胞粘附并促进增殖，见实施例14、图11。
在一个实施方式中，配体为蛋白G或A，其连接能够识别细胞表面受体如MUC1*或FGFR(成纤维细胞生长因子受体)的抗体。蛋白G或A可非特异性吸附于表面，通过亲和标记-结合配偶体相互作用共价偶联或连接。例如，可使用NTA-Ni部分包被细胞培养烧瓶，以使表面能够捕获组氨酸标记的蛋白G或A。然后加入针对细胞表面受体的抗体，于是其结合于固定在表面的蛋白G或A。
在另一个方面中，可以将连接于表面的配体和试剂以这样的方式连接于表面，所述方式便于其从表面释放并改变局部环境或便于细胞消耗该试剂。可将试剂连接于表面以便当其降解时从表面释放或在应答刺激时释放。例如，可使用光敏感性或化学敏感性连接子将试剂连接于表面，以便于在应答光照时或通过化学信号释放试剂。某些连接子在应答pH值的变化时裂解。诱导多能性的基因或基因产物，如OCT4、NANOG、SOX2、KLF4或NM23，或诱导分化的基因或其产物，如miR-145(微小RNA)可加入至培养基或连接于表面。它们可随着时间的推移，通过降解或应答特异性信号(如断裂连接键的特定波长的光)而从表面释放。
在一个优选的实施方式中，连接或固定于表面的配体为能够识别细胞表面生长因子受体的生长因子。可使用如前所述的任意方法或其组合将能够活化细胞表面生长因子受体的抗体连接于表面。在一个实例中，生长因子为成纤维细胞生长因子(FGF)或碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，并且配体所亲和的细胞表面的分子为成纤维细胞生长因子受体(FGFR)。可替换地，配体可为识别FGFR的抗体。在本发明的另一个方面中，生长因子为表皮生长因子(EGF)，并且配体所亲和的细胞表面的分子为表皮生长因子受体(EGFR)。在另一个方面中，亲和配体为干细胞因子(SCF)或另一种因子，包括活化c-Kit/SCF-R的抗体。与生长表面连接的配体也可为Flt 3配体、促血小板生成素(thrombopoetin，TPO)、IL-2、IL-3、IL-n或模拟其对其同源受体的作用的抗体。
MUC1*配体
在一个更优选的实施方式中，连接于生长表面的配体对MUC1细胞表面蛋白具有亲和力。在另一个更优选的实施方式中，配体对蛋白的PSMGFR部分(MUC1*)具有亲和力。在又一个更优选的实施方式中，配体诱导MUC1*的二聚化。在一个实例中，配体为抗MUC1*抗体(实施例1、4、7、10和图1、6A、6B、6D、8)。在另一个实例中，配体为NM23或变体如S120G，或任何其它倾向于形成二聚体或充当二聚体的突变体或衍生物，见实施例9、12、14、15、20和图9、10、11、12和19。可对表面进行如此设定，以使NM23作为二聚体呈递至细胞。在另一个实例中，连接于生长表面的配体为结合于MUC1胞外域的抗体。优选结合于当串联重复区域断裂并从细胞表面脱落后仍然连接在细胞表面的MUC1部分的抗体。例如，结合于MUC1的PSMGFR序列的二价抗体可活化断裂MUC1的生长因子受体功能并刺激细胞增殖。将通过用至少一部分PSMGFR肽免疫而产生的多克隆或单克隆抗体连接于表面以促进细胞附着在表面并通过活化MUC1*生长因子受体刺激细胞生长。
如此生成或选择的多克隆或单克隆抗体，以及天然和非天然抗体衍生物，与使用完整PSMGFR序列生成或针对其亲和力选择的抗体相比，更加适合干细胞粘附。通过使用与MUC1*胞外域序列相对应但细胞表面近端有10个氨基酸缺失的肽对兔进行免疫而产生多克隆抗体，“C-10PSMGFR”生成的抗体在促进干细胞粘附时比通过全PSMGFR肽或最远端的10个氨基酸缺失的“N-10PSMGFR”(QFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA)(SEQ ID NO：3)生成的抗体更有效，见实施例6和图13、14。通过在含有C-10PSMGFR肽或其它N端片段的表面上进行亲和纯化，也可从通过全PSMGFR肽培育的多克隆(抗体)中分离出与干细胞结合的能力提高的抗体。
已显示分泌与C-10PSMGFR肽而不与N-10PSMGFR肽结合的单克隆抗体的杂交瘤细胞克隆可促进干细胞粘附至表面，见图13A-C，图14。相反，与N-10PSMGFR肽而不与C-10PSMGFR肽结合的单克隆抗体几乎不能使干细胞粘附。当加入至培养基时，两种单克隆抗体类型均能够刺激细胞生长。
在一个优选的实施方式中，在含有NM23的表面培养干细胞，其中NM23为MUC1*生长因子受体的配体。NM23可直接或间接连接于表面。在本发明的一个方面中，将倾向于二聚化的NM23或S120G突变体非特异性吸附在细胞生长的表面，见实施例15、图12。在本发明的另一个方面中，首先使用亲和标记-结合配偶体对表面进行衍生化，如与组氨酸标记蛋白或肽结合的NTA-Ni。随后将组氨酸标记的NM23非共价偶联至NTA-Ni表面。然后将MUC1*阳性细胞如干细胞和某些祖细胞加至NM23表面，从而使细胞粘附于表面并生长。在又一个更优选的实施方式中，NM23S120G突变体共价偶联于环葡聚糖。
收获方法
在本发明的另一个方面中，描述了从本发明所述表面收获细胞的新方法。本发明包括用于本发明所述表面以及许多其它细胞生长系统的收获方法。本发明也包括对本发明所述新型表面使用标准收获方法，如手动剥离和酶裂解。某些细胞收获方法取决于表面成分的特性。例如，可通过加入过量的与抗体表位序列相同的肽将通过吸附在抗体表面生长的细胞释放。例如，如果抗体识别MUC1*的胞外域，那么可通过加入过量的具有MUC1*胞外域的某些或全部序列的肽将细胞释放。游离肽与细胞上的MUC1*受体竞争与连接于表面的抗体结合。肽与抗体的结合使细胞释放，见实施例4，图6D。在表面培养的呈递抗体的细胞通过结合于蛋白G或A而连接于表面，通过加入过量Fc部分或过量的不相关抗体将其从表面释放。由于蛋白G结合于Fc域，因此游离Fc与同源抗体竞争与连接表面的蛋白G或A结合并释放抗体复合的细胞(antibody-complexed cells)。在表面培养的细胞通过亲和标记-结合配偶体的相互作用与配体连接，通过加入干扰亲和标记-结合配偶体相互作用的试剂或通过加入过量的与结合配偶体相互作用的亲和标记部分将其释放。例如，通过加入咪唑，一种不相关的组氨酸肽，或过量的至少部分与配体连接的表面的结合配偶体使生长在组氨酸标记的配体中并结合于NTA-Ni表面的细胞释放。对NM23表面而言，可通过加入过量的与至少一部分MUC1*胞外域的序列基本相同的肽使细胞释放，其中过量的肽的加入与MUC1*细胞表面受体竞争结合连接NM23的表面，从而释放细胞。可替换地，NM23由促进附着于表面的亲和标记(亲和标签，affinity tag)组成。干扰亲和标记和表面间相互作用的策略可使NM23和所连接的细胞从表面释放。同样，通过加入：a)咪唑(0.5M)；或b)过量(His)6肽可使His标记的蛋白G(加上一种抗体)或His标记的NM23从表面释放。
任何亲和标记、结合配偶体对可用于将配体与表面连接，中断亲和标记-结合配偶体的相互作用可使干细胞从表面释放。合适的亲和标记、结合配偶体对的实例包括但不限于NTA-Ni/组氨酸标记、谷胱甘肽/GST融合；麦芽糖/麦芽糖结合蛋白以及生物素/链霉亲和素。
培养基
此处所述的表面和收获方法是与标准干细胞培养方法以及新型方法兼容的。标准干细胞培养基需要加入外源性碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)并且在成纤维细胞饲养细胞中生长，这是由于目前为止干细胞的生长仍需要尚未鉴别的由这些细胞所分泌的生长因子。根据标准协议，也可在基质胶上培育干细胞，但除bFGF之外，还必须加入约为培养基30-50％的来自成纤维细胞饲养细胞(CM)的条件培养基。灭活的人包皮(HS27)成纤维细胞饲养细胞通常用于培育胚胎干细胞。
我们已经证明标准培养基与在本发明所述表面上生长是兼容的，实施例4、图6C和实施例3、图4。与在基质胶上生长相同，bFGF介导的生长也需要成纤维细胞条件培养基以支持干细胞在此处所述的所发明的表面上生长。优选含有MUC1*刺激物或二聚化试剂的培养基。识别PSMGFR肽的抗体，或NM23，野生型或突变体S120G为优选的生长因子，并可代替bFGF和成纤维细胞条件培养基，见图6、9、10、11和12。当抗MUC1*抗体或NM23-S120G代替bFGF和HS27条件培养基加入至基本干细胞培养基中时，与基质胶、Cell Start(Invitrogen)、Geltrex(Invitrogen)或任何本发明所述表面连接的人类胚胎干细胞的生长始终更好；当MUC1*刺激物代替添加bFGF的条件培养基(CM)时，生长速率、集落形态和抑制分化始终更好。
收集自MUC1*阳性癌细胞的条件培养基增加干细胞生长和集落形成，同时抑制分化。将在基质胶、NTA-Ni、抗MUC1*抗体或NM23表面生长的人类干细胞在基本干细胞培养基加上收集自生长的MUC1*阳性癌细胞的条件培养基中进行培养。当来自T47D细胞的条件培养基加入NM23-S120G或抗MUC1*抗体或bFGF中时，与来自HS27成纤维细胞饲养细胞的条件培养基相比，可显著提高干细胞生长、集落形成及抑制分化，其中所述T47D细胞为MUC1*阳性乳腺癌细胞，见实施例14、15和图11、12。此处所述表面和收获方法可用于除干细胞以外的细胞。
用于细胞分选(cell sorting)的抗MUC1*抗体
纯化：可从细胞的混合群体中纯化出纯的多能干细胞群体。大量的干细胞生长会产生某些自发分化的干细胞。因此，捕获所需多能干细胞并弃除分化细胞的高通量方法是必要的。MUC1*为多能性的细胞表面标记物，当细胞开始分化时，在OCT4前失去所述多能性。可通过在衍生有抗MUC1*抗体的柱上对其进行捕获而从混合群体中分离出纯的多能干细胞群体(MUC1*阳性)。相反，可在移植前使用MUC1*亲和柱从分化的细胞中移除MUC1*阳性细胞，以降低畸形瘤形成的风险。
在许多情况下，需要根据分化阶段来分离干细胞和祖细胞。我们曾经发现多能干细胞含有剪切的MUC1*形式而不是全长MUC1蛋白；分化开始后，MUC1裂解停止，因此大多数细胞为MUC1*阴性，而对全长形式为阳性。可得到许多与全长MUC1串联重复单元结合的抗体，例如市售的VU4H5或HMPV抗体。MUC1裂解为生长因子受体形式MUC1*时从细胞表面释放这些部分，因此针对串联重复序列的抗体不会使MUC1*染色。虽然在MUC1及其剪切形式(MUC1*)中均存在PSMGFR序列，但由于表位被掩蔽，因此针对PSMGFR序列的抗体不与全长MUC1结合。图15A-L显示H9人类胚胎干细胞在其开始分化前后的免疫细胞化学(ICC)染色的照片。所培育的针对全PSMGFR肽的兔多克隆抗体几乎使未分化集落的每个细胞染色。干细胞多能性的黄金标准指示剂OCT4与抗MUC1*(也称为抗PSMGFR)抗体染色精确共定位，图15A、15B。与MUC1全长的远端串联重复(序列)结合的VU4H5抗体未使任何未分化的细胞染色，图15C。然而，当保留bFGF14天以使这些相同的细胞进行分化时，观察到反向MUC1模式。未观察到MUC1*染色或OCT4染色，图15D、15E，但每个细胞均对全长MUC1染色呈阳性，图15F。同样，未分化的干细胞对NM23即MUC1*配体染色呈阳性，NM23与MUC1*(图15G-I)和OCT4(图15J-L)进行了精确的共定位。裂解酶MMP14、MMP16和ADAM-17涉及MUC1的裂解。它们也与MUC1*共定位在未分化的干细胞上，Hikita等，PLoS ONE，2008。
因此，可选地与其它包括针对NM23、MMP14、MMP16、ADAM-17和OCT4的抗体组合的抗MUC1*抗体可用于从混合池中识别并分离多能干细胞。针对SSEA3/4或Tra 1-81/1-60的抗体也可与抗MUC1*抗体共同使用以识别多能干细胞。可使用与PSMGFR肽结合的抗体以及与当剪切时释放的MUC1部分结合的抗体对未分化的和分化的干细胞池进行染色。然后使用标准细胞分离方法如FACS(荧光激活细胞分选)将呈递MUC1*的细胞与呈递全长形式蛋白的细胞分离开来。在某些情况下，期望将已分化的干细胞从保持多能性的干细胞中除去。在其它情况下，期望将保持多能性的干细胞(MUC1*阳性)除去，因为其在移植入宿主时会增加形成畸形瘤的风险。抗MUC1*抗体即抗PSMGFR抗体和NM23抗体的组合也可用于识别多能干细胞以及识别能够通过MUC1*刺激而扩增的祖细胞。
癌症干细胞分选排除(sorting depleting)
当癌症细胞获得对化疗药的耐药性时，MUC1*表达增加，而MUC1全长的表达未增加。这些对化疗具有耐药性的细胞也称为癌症干细胞。因此，可选地与其它抗体包括针对NM23、MMP14、MMP16、ADAM-17和OCT4的抗体结合的抗MUC1*抗体可用于识别癌症干细胞。在本发明的一个实施方式中，抗MUC1*抗体及这些其它抗体的组合用于从患者体内例如从患者的血液中排除(deplete)癌症干细胞。
FACS及人类干细胞的生长
本发明进一步公开了使用抗MUC1*抗体，或倾向于二聚化的NM23或NM23S120G或其它突变体以刺激表达MUC1剪切形式(MUC1*)的祖细胞的生长并抑制其分化。虽然MUC1裂解在干细胞开始分化时停止，但在稍后阶段裂解会继续。例如造血干细胞(HSC)表达剪切形式，MUC1*，并可通过将细胞暴露于MUC1*二聚化试剂中而使其增殖。当将造血干细胞认为是干细胞时，其为CD34阳性及CD38阴性。当其进展到分化的下一个阶段，会变成CD34阳性及CD38阳性。我们从脐带血中获得人HSC并在基本干细胞培养基加上不同浓度的抗MUC1*抗体中培养。培养细胞11天，并在平皿培养第5天后加入新鲜抗体。对细胞进行分析并通过FACS分选。图16A和16B，实施例18显示仍为造血干细胞(CD34+/CD38-)的细胞数量随着抗MUC1*浓度的升高而增加。相反，已进展至下一祖细胞期(CD34+/CD38+)的细胞数量随着抗MUC1*浓度的降低而增加。这些结果表明刺激MUC1*生长因子受体可抑制HSC的分化。
造血发生在胎儿的肝脏中及早期生命中。使用与MUC1*胞外域的PSMGFR序列结合的抗体和VU4H5对人类胎肝细胞进行FACS分选，其中VU4H5为市售的与全长MUC1串联重复单元结合的抗体。图17B的FACS扫描显示胎肝细胞大多数为MUC1*阳性和全长阴性。将MUC1*阳性胎肝细胞分离并通过在基本培养基加上抗MUC1*抗体中培育而使其扩增。图18的图表显示在最佳抗MUC1*抗体浓度下，胎肝细胞的生长显著增加。当抗体过量时，生长下降，每个受体连接一个抗体而不是每两个受体结合一个抗体。同样，可通过进行FACS或其它分离技术，使用结合试剂如结合于PSMGFR区域或全长MUC1蛋白远端部分的抗体将未分化的干细胞与已分化的干细胞分离。
其它类型的细胞可呈递剪切形式的MUC1，并可根据识别MUC1蛋白PSMGF部分的抗体是否与细胞结合从细胞群体中分离或排除。
捕获、生长、释放、分选组合
在某些情况下，期望在生长期之前、之间或之后将一种细胞类型与另一种分离。在一种方法中，表面的每个空间编址具有不同的配体，每个配体对不同细胞类型或可识别细胞期或类型的特定标记物具有亲和力。将细胞加至表面，细胞根据表面上每种细胞类型的标记物，通过亲和相互作用而在空间中分离。可单独收获已分离的细胞以在不同位置进行培养或作为混合物进行培养，随后根据位置进行收获。在一种方法中，使用不同的连接模式来连接不同的标记物特异性配体。例如在一个位置，通过组氨酸标记/NTA-Ni相互作用将MUC1*的配体，一种多能细胞的标记物连接于表面，而在另一个位置，通过蛋白G将沿外胚层线分化的细胞的标记物的抗体连接于表面。这样，通过加入咪唑可使未分化的细胞释放，加入过量Fc可使外胚层细胞释放。在另一个方法中，将各自呈递不同亲和配体的两个或多个表面安放在不同位置。通过液流通道(flow channel)将两个或多个表面相连。在一个实施方式中，将细胞混合物引入第一表面，其捕获表达该表面呈递的配体的同源分子的细胞。将上清或液流引入第二表面，其捕获呈递可促进与其表面结合的同源细胞表面分子的细胞。然后将上清或液流引入第三表面等，以便通过空间可编址的表面将所需细胞类型捕获。该方法用于根据类型分离细胞，或分离并培育细胞。可使用液流通道和阀门，以便于允许在细胞分离期间流动，而随后限制流动以便在对于特定细胞类型最佳的条件下培养该特定类型的细胞。
本发明所述方法适合分离在生长过程中发生分化的细胞。将分别呈递对特定分化状态的标记物或细胞类型的亲和配体的混合表面组成的系统用于动态系统中，以根据分化状态分选后代。细胞最初通过其一种细胞表面蛋白的相互作用连接于第一表面，所述细胞表面蛋白为初期分化状态的标记物，在另一分化状态中细胞或其后代不再表达(该蛋白)。因此细胞可被释放并且会迁移至一个新的位置，该位置具有对定义其新分化状态的细胞表面标记物具有亲和力的配体。该分选可地理性地发生，例如在液流通道中的部位，将上清液引入新的表面，或自分选，其中细胞从一个部位(可为颗粒)释放并迁移至固定不同细胞标记物亲和配体的第二个部位(可为邻近颗粒)。在一个实施方式中，展示不同亲和配体的珠粒或颗粒混合在一起，细胞与表面具有同源分子的珠粒/颗粒连接。在这种情况下，珠粒或颗粒也具有在细胞连接后允许对其进行分选的性质。例如，将具有可亲和CD34+/38-造血干细胞的配体的磁性珠粒与具有可亲和CD34+/CD38+祖细胞的配体的非磁性珠粒混合。细胞培养后，将携带CD34+/38-细胞的珠粒通过磁性分离并收集，而其余的珠粒包括CD34+/38+细胞群体。另外，空间部位，珠粒或颗粒可连接于能够被其它表面所捕获的部分以进行纯化。例如，呈递亲和配体和纯化配体的珠粒会通过亲和配体和同源细胞表面受体间的相互作用来捕获所有所需的细胞类型；纯化配体会通过纯化配体和第二表面上的部分的结合将珠粒连接于特异性的空间编址。本发明包括使用该方法从混合池中分选细胞，其中该细胞在不同的分化阶段。本发明也包括使用该方法在将细胞诱导为多能性的细胞培养环境中分选细胞，并且期望在诱导多能性过程中的不同时间选择并放大那些具有特定干细胞样特征的细胞。
在一种替代方法中，通过固定于呈递配体的颗粒来分离细胞，所述配体对不同细胞类型具有特异性。将细胞的混合物引入颗粒的混合物中。细胞在呈递可亲和其细胞表面分子的配体的颗粒上得到分离。可在培养前分离携带细胞的颗粒，或将其一起培养，然后在生长期之后分离。根据颗粒自身的性质或连接于颗粒的配体的性质，通过各种手段分离携带细胞的颗粒。例如，可根据大小、电荷、密度、光学性质、电磁性质等分离颗粒。这些性质可为颗粒自身的固有性质或所连接配体的性质。例如，颗粒自身可具有荧光性或连接于颗粒的配体可具有荧光性。根据性质可容易地分离颗粒，包括但不限于磁性、电荷、荧光或电子特性。可替换地，可使用呈递携带第二亲和配体的配体的颗粒。在该情况下，除了携带可促进细胞附着的配体外，颗粒也可携带这样的部分，该部分可促进携带细胞的颗粒附着于分开的表面或位置。
在本发明的另一个方面，一个表面具有两种或多种功能不同的不同配体。在某些情况下，两种或多种配体在与特定细胞连接时比单一配体选择性更高。在另一种情况下，第一配体介导细胞的附着，而第二配体使细胞/表面复合物靶向特定部位，所述部位可为另一个表面或另一个部位。因此，通过连接于第二表面或部位可从非靶细胞中将表面纯化，所述表面为携带能够捕获特定细胞类型的配体的物体或颗粒。在其它情况下，期望捕获两种或多种不同的细胞类型，并能够在生长期之前、之后或之间根据类型分离细胞。通过使用呈递促进特定细胞类型附着的第一配体和使表面靶向特定部位的第二配体的表面或颗粒来实施。靶向配体可为化学或生物部分，其通过结合于不同部位的实体来靶向颗粒。可替换地，靶向配体可为将特定性质赋予颗粒从而使其与其它颗粒区别开来的实体。例如，配体可为荧光性部分、染料、带电荷部分、或具有光学或电磁性质的部分。在本发明的另一个方面，靶向配体自身不为配体，而是颗粒的特定性质。
本发明所述的表面和新型生长因子可预想以多种样式用于培育干细胞、祖细胞和其它MUC1*阳性细胞，包括但不限于摇袋(wave bag)、转瓶(roller bottle)、在悬浮液中生长，以及用于任何类型的密封容器，包括存活的宿主。可保持密封容器运动以防止细胞粘附在容器上。表面固定的配体及其在细胞上的同源靶标间的相互作用允许更换培养基而不损失细胞。当需要收获或排除细胞时，可为颗粒的表面能够通过离心、重力、电磁或电场将其分离。可加入试剂使细胞从表面释放。可在溶液中加入过量的游离的亲和配体以使其竞争与细胞表面的受体结合，从而使细胞从颗粒上释放。在一个实施方式中，如果亲和配体为抗体，则加入过量的抗体的Fc部分使抗体从颗粒上释放，并且细胞与活化配体游离在溶液中。在另一个实施方式中，配体为NM23或其突变体。
本发明进一步公开了使用倾向于形成四聚体和六聚体的NM23野生型或突变体来诱导干细胞、祖细胞或通过核酸、siRNA、微小RNA或蛋白的诱导而诱导为干细胞样的细胞的分化。
本发明还包括诱导干细胞及干细胞样细胞分化的方法。阻断MUC1*及其二聚化配体相互作用的配体可诱导分化。例如，加入可阻断NM23和MUC1*胞外域相互作用的含有足够MUC1*胞外域的序列的肽可以诱导分化。同样，加入低浓度抗MUC1*抗体的Fab(单价)可防止受体二聚化，促进多能性并导致分化的开始。MUC1*胞外域肽或结合于MUC1*的抗体的Fab可加入培养基中或连接于表面。可收获干细胞并随后在呈递配体如抗MUC1*Fab的MUC1*胞外域肽的表面进行平皿培养以诱导分化。微小RNA 145(miR-145)抑制MUC1并由此诱导分化。可将miR-145加入培养中的干细胞和祖细胞中以促进分化。相反，可将miR-145的抑制剂，如对miR-145具有特异性的siRNA加入至生长的干细胞和干细胞样细胞中以抑制其分化。
配体-聚合物生长表面：本发明所述配体与聚合物或大分子如糊精或环葡聚糖连接可显著提高其捕获及培育靶标干细胞和祖细胞的能力。所产生的表面在溶液中可模拟配体。与将配体直接吸附于表面相比，将蛋白和抗体与增加细胞粘附的环葡聚糖共价连接可显著降低所需配体的量。与环葡聚糖偶联的配体如NM23或抗MUC1*可支持胚胎干细胞在基本培养基中的生长，培养基中无需其它生长因子。抗体和同源蛋白如抗MUC1*和NM23也可连接于其它聚合物和其它表面，包括多孔膜和支架(scaffold)。本发明包括结构化和非结构化的表面。例如，可使用促进干细胞和祖细胞附着的生物和/或化学因子涂覆(coat)支架、人造结构如耳。这些配体可选地向干细胞和祖细胞提供影响其生长和/或分化的养分或信号。
合成抗体生长表面：本发明还考虑使用合成配体作为细胞培养基以及促进细胞附着的表面包被层的生长因子。例如，使用标准筛选方法很容易确定与细胞表面蛋白结合的小分子。发明人曾公开过与MUC1*胞外域，特别是与PSMGFR肽结合的小分子。这些合成的分子可非共价或共价结合于表面以吸附及培育非粘附细胞，如干细胞、iPS细胞和早期祖细胞如表达MUC1*的造血干细胞。如果通过二聚化活化的合成配体与生长因子受体结合，那么可通过共价连接两个小分子以形成二聚体来构成小分子的活化二聚体。在一个优选的实施方式中，连接于PSMGFR肽的小分子与小分子相连，以使其成为二聚体并充当人造生长因子。在本发明的另一个方面，可将小分子单体连接于表面使其足够接近以充当二聚体。也就是说，表面充当连接子，以使小分子以可活化受体的确定的几何结构呈递至细胞表面受体。可以与天然生长因子相同的方式使用这些小分子二聚体，包括将其加入培养基中以及吸附或共价连接于表面。合成表面：a)生产更便宜；b)可长期储存；以及c)免受降解的影响。发明人曾描述小分子以高亲和力结合于MUC1*的胞外域。通过将小分子与连接子偶联来合成模拟抗MUC1*抗体的小分子二聚体(二价)。可直接或通过聚合物包被层(涂层，coating)将合成抗体固定于板表面。
本发明不限定于此处所述特定实施方式的范围。事实上，通过先前的描述和附图，除了此处已描述的内容，本发明的各种改变对于本领域技术人员是显而易见的。因此这种改变将落入所附权利要求的范围内。以说明本发明的方式而并非限制的方式提供以下实施例。
实施例
实施例1.连接于基质胶并在基本培养基加上抗MUC1*抗体中培养的多能干细胞比在补充有bFGF和来自成纤维细胞饲养细胞的条件培养基的培养基中增殖更快，分化更少
在37℃和5％CO2下，分别在6孔板(BD Falcon)中的丝裂霉素C灭活的Hs27人包皮成纤维细胞(ATCC)上培养H9hESC(WiCell)或BG01v/hOG(Invitrogen)。hESC培养基由含20％Knockout(敲除)血清替代品的DMEM/F12/GlutaMAX I，1％非必需氨基酸储备液(stock)，0.1mMβ-巯基乙醇(均购自Invitrogen)以及4ng/ml人类碱性成纤维细胞生长因子(bFGF，Peprotech)构成。通过每5-7天以1∶3的比例手动剥离使细胞传代，并且每48小时更换培养基。在某些实验中，使用补充30％Hs27条件培养基和4ng/ml bFGF的hESC培养基在基质胶(BDBiosciences)上培育hESC。在加入MUC1*的其它实验中，省略了条件培养基和bFGF；我们将其称为“基本培养基”(简称MM)。
图1显示了使用抗MUC1*处理的人类干细胞集落的OCT4免疫荧光。用胰蛋白酶分离H9细胞并以4x 104细胞/孔接种于预包被有基质胶的8孔腔室玻片(8-well chamber slide)。连续五周隔日更换培养基并加入抗体，使二价抗MUC1*的终浓度为1μg/ml。使用OCT4特异性抗体(Santa Cruz，克隆H-134和C-10)及DAPI对细胞染色。
图1显示了当在基本培养基加上抗MUC1*抗体中培养时，生长五(5)周后，人类胚胎H9干细胞100％成为多能性。在相同条件下培育的细胞，除了饲以基本培养基加上bFGF和30％来自饲养细胞的条件培养基，增殖较少并且分化较多。对细胞核的DAPI染色与识别多能干细胞的OCT4染色进行比较。虚线标记未分化部分的边界。
实施例2.在基质胶上的抗MUC1*中培养的多能干细胞保持稳定的核型并正常分化
将BG01v/hOG hu ES细胞(Invitrogen)涂布于基质胶上并在基本培养基(见实施例1)加上80ng/ml兔多克隆抗MUC1*抗体(SRY 2a)中培养，在六(6)个月的过程中传代18次。将细胞沉淀，提取DNA并通过外包界途径测定核型。图2显示在18代末期核型未改变。注意到该干细胞系具有三染色体异常；然而与此相关的是，通过在无其它生长因子的抗MUC1*中培养，核型稳定并不改变。
通过使用胶原酶处理从该同批多次传代的BG01v/hOG细胞中收获未分化的细胞，并在基本培养基中悬浮14天。注意在此期间，停止提供抗MUC1*抗体以促进分化。这使得细胞形成拟胚体(embroid bodies)，将其在明胶中平皿培养7天，然后使用识别以下三个胚系的标记物的抗体染色：图3A)细胞为OCT4阴性，表明其已分化；B)α甲胎蛋白阳性，为内胚层的标志；C)巢蛋白阳性，为外胚层的标志；和D)平滑肌肌动蛋白阳性，为中胚层胚系的标志。
实施例3.促进多能干细胞生长的表面
呈递连接于MUC1*胞外域并使其二聚化的配体的表面向多能干细胞提供粘附至板表面的方法，并活化MUC1*的生长因子受体的功能。使用兔多克隆抗体包被细胞培养烧瓶、陪替式培养皿(petri dishes)或多孔板，其中所述兔多克隆抗体是针对具有以下MUC1*胞外域序列的肽所培育的：GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(SEQ ID NO：1)。与以上直接给出的序列结合的抗体在此处称为抗MUC1*抗体或抗PSMGFR抗体。使用组织培养物处理的板、以及裸塑料板和聚苯乙烯板。
在一个实例中，将抗MUC1*抗体(Zymed：定制抗体服务)以30、100、或300μg/ml加入96孔细胞培养物处理板(组织培养测试板96F TPP#92096)的孔中，并使其在4摄氏度下吸附过夜。将未分化的BG01v/hOG(Invitrogen)干细胞悬浮在基本培养基中。基本培养基为400ml DME/F12/GlutaMAX I(Invitrogen#10565-018)；100ml Knockout血清替代品(KO-SR，Invitrogen#10828-028)；和5ml 100x MEM非必需氨基酸溶液(Invitrogen#11140-050)；及0.9ml(0.1mM)巯基乙醇(55mM储备液，Invitrogen#21985-023)。将BG01v/hOG干细胞以每孔10,000个细胞的密度在抗MUC1*抗体包被的表面进行平皿培养。使细胞粘附24小时。随后将细胞单独在基本培养基中培养5天，每48小时更换培养基。
为了进行比较，在补充有4ng/ml bFGF和30％来自HS27成纤维细胞的条件培养基的培养基中培养对照孔中的细胞。图4显示钙黄绿素-AM(分子探针)染色的图表，其中根据细胞所生长的表面的抗MUC1*抗体密度，对活细胞中的荧光进行测量。图4的图表显示生长在抗MUC1*表面的细胞可在缺乏任何其它生长因子的情况下增殖。加入bFGF及饲养细胞所分泌的已定性的因子仅适度地提高生长。将不相关的抗体在表面上平皿培养以作为阴性对照。在这些表面上平皿培养的干细胞未粘附并漂浮或在24小时的附着期末死亡。
同时，使用DAPI(核染色)和抗OCT4对产生的干细胞进行双染色。OCT4阳性和DAPI染色的1∶1相关(1∶1 correlation)证实了所产生的细胞为多能性，见图5。
实施例4.人类多能干细胞在溶液中加入或不加入MUC1*刺激物的抗MUC1*抗体表面增殖
测试人类胚胎干细胞系在吸附于组织培养物处理的板、聚苯乙烯板或腔室玻片板的抗MUC1*抗体上的生长能力。将100μg/ml的抗MUC1*吸附于板上并使其在4摄氏度下吸附过夜。将未分化的人类H9胚胎干细胞以每孔10,000个细胞或40,000个细胞在96孔板中平皿培养或以每孔25,000个细胞在8孔板中平皿培养。在所有情况中，仅在基本培养基中或加入抗MUC1*的基本干细胞培养基中培养的未分化的干细胞在抗MUC1*表面附着并增殖。随后将未分化的H9干细胞在以下培养基中培养：A)基本培养基；B)基本培养基加上80ng/ml抗MUC1*抗体；或C)基本培养基加上4ng/ml bFGF和50％来自灭活HS27成纤维细胞饲养细胞的条件培养基。一式三份进行实验。未分化的干细胞粘附于抗MUC1*表面。当在基本培养基中也加入抗MUC1*抗体时，未分化的集落生长最快。然而，仅在基本培养基中培养的孔中的形态和质量相似的未分化的干细胞集落在一天或两天后发生变化。不论在基本培养基、基本培养基加上抗MUC1*还是加上bFGF和来自成纤维细胞的条件培养基中培养细胞，未分化干细胞集落的增殖量和质量均类似。通常根据培育干细胞的标准饲养细胞，bFGF协议，产生多能干细胞并在第5天至第7天分离。图6显示在不同培养基中培养时孔中的生长照片。6A)基本培养基；6B)基本培养基加上80ng/ml抗MUC1*；或6C)基本培养基加上4ng/ml bFGF和50％来自成纤维细胞饲养细胞的条件培养基。标记为1(例如A1、B1、C1)的画面为培育3天后拍摄的照片；A2、B2、和B3为第7天所拍摄的相同孔的照片。
实施例5.收获干细胞的方法
在第7天可收获并分离上述实施例4中所培育的干细胞。由于细胞固定在抗MUC1*表面，我们认为通过加入能够与细胞表面受体竞争结合板表面的抗MUC1*抗体的肽可使其释放。所述肽具有序列GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(SEQID NO：1)，其相当于MUC1*受体的胞外域并且也是所培育的抗MUC1*抗体针对的肽，此处将其称为MUC1* ecd肽或PSMGFR肽。将MUC1* ecd肽以10μM的浓度加入生长的干细胞中并孵化30分钟。当时可观察到干细胞已从表面释放。在上清液中收集干细胞，漂洗并在新鲜抗MUC1*表面再进行平皿培养，细胞吸附在所述表面上并增殖。使用人类胚胎干细胞(huES)系BG01v/hOG(Invitrogen)随后使用huES H9也可成功实施该过程。图6D显示由单个细胞培养而成的H9干细胞，其在抗MUC1*抗体表面生长，然后通过竞争性肽释放将其收获，并在其可继续增殖的新鲜抗MUC1*表面再次进行平皿培养。
实施例6.与β-环糊精偶联的抗MUC1*抗体刺激MUC1*生长因子与细胞表面受体间的溶液相互作用
根据标准偶联协议，将抗MUC1*抗体共价偶联于羧基-β-环糊精(Cβ-CD)(Fraschini，C.；Vignon，M.R.Selective oxidation of primaryalcohol groups of β-cyclodextrin mediated by 2，2，6，6-tetramethylpiperidine-1-oxyl radical(TEMPO).Carbohydrate Research 2000.328(4)：585-589)。使用偶联于β-环糊精的抗MUC1*以抗体终浓度0、10、30、100、300或1000μg/ml包被96孔细胞培养物处理板(组织培养板96F TPP#92096)；每孔中β-环糊精的浓度保持恒定，仅改变抗体的浓度。作为对照，在无环糊精的条件下将抗MUC1*抗体直接吸附于板上。制备BG01v/hOG干细胞的单一细胞悬浮液，并在基本培养基中以10,000个细胞/孔的密度进行平皿培养。干细胞可连接于抗体表面和偶联环糊精的抗体表面并增殖。未加入其它生长因子。平皿培养两天后，使用钙黄绿素-AM试剂检测存活细胞。图7的图表显示存在于β-环糊精上的抗MUC1*抗体支持基本培养基中干细胞的生长，并且与吸附在生长板上的裸抗体相比，需要抗体的量较少，可能是由于抗体对生长细胞的3维呈递。
实施例7.如果通过常规方式或通过在基本培养基中加入抗MUC1*抗体培养，针对任何细胞表面抗原的抗体可使干细胞连接于表面并增殖
当在基本培养基加上抗MUC1*抗体中培养时，SSEA4、Tra 1-60和Tra 1-81抗体可促进多能干细胞生长。使用抗SSEA4(Santa Cruz)、抗Tra1-60(Santa Cruz)或抗Tra 1-81(Santa Cruz)抗体在4℃下以终浓度为0、3、10、30和100μg/ml一式三份地在无菌PBS中包被96孔细胞培养物处理板(组织培养板96F TPP#92096)。次日，使用PBS漂洗细胞。在基质胶上生长并在基本干细胞培养基加上30％来自成纤维细胞的条件培养基加上4ng/ml bFGF中培养的BG01v/hOG人类胚胎干细胞(Invitrogen)用于制备单一细胞悬浮液。以密度为每孔10,000个细胞在每个孔的基本培养基中进行平皿培养。次日，将培养基从孔中除去，并更换为基本培养基加上80ng/ml抗MUC1*抗体。隔日更换培养基，并使用钙黄绿素-AM试剂对细胞进行检测。图8显示干细胞能够通过细胞表面蛋白及其同源抗体的相互作用连接于表面，随后可在基本培养基加上抗MUC1*抗体中或使用任何标准干细胞培养基进行培养。
同样，以每孔10,000个细胞的密度将H9未分化干细胞平皿培养于先前已吸附抗SSEA4抗体(100μg/ml)的96孔板中。在基本干细胞培养基加上80ng/ml抗MUC1*抗体中培养干细胞八(8)小时。未分化的干细胞集落发育并增殖。
平行进行实验，其显示H9人类胚胎干细胞与吸附于96孔和12孔板表面的抗SSEA4和抗Tra 1-81结合。然后在含有4ng/ml bFGF和50％来自HS27成纤维细胞饲养细胞的条件培养基的标准干细胞培养基中或在基本培养基加上80ng/ml抗MUC1*抗体中，或在基本培养基加上8nM重组NM23-S120G中培养细胞。在所有情况下，均形成未分化的干细胞集落，其与由标准方法培育的干细胞集落形态相同。当以不相关的抗体替换抗MUC1*抗体，或仅在基本培养基中培养细胞，干细胞在约一天内死亡。
实施例8.加入MUC1*ecd肽诱导分化
可通过加入MUC1*ecd肽迅速诱导在饲养细胞、基质胶或生长表面生长的未分化的人类干细胞进行分化。该肽与天然配体竞争结合于MUC1*生长因子受体；天然配体与MUC1*的相互作用可促进多能干细胞生长。阻断该相互作用可抑制多能干细胞生长并诱导细胞分化。使用MUC1*ecd肽处理后，在基质胶上生长的H9干细胞分化加快约三倍。MUC1*胞外域肽可用于从包被有MUC1*配体的表面收获干细胞。通过使用抗MUC1*孵化所收获的细胞以抵消该肽，随后进行漂洗并再次平皿培养来防止分化的速率增加。
实施例9.培养人类干细胞时，基本培养基中的NM23相当于现有技术水平的bFGF加上来自HS27成纤维细胞饲养细胞的条件培养基
通过手动剥离收获未分化的H9人类胚胎干细胞。将边缘约为0.1cm的集落碎片与基本培养基混合，并遵照生产商的指示使其均匀分布在使用干细胞质量基质胶包被的24孔板上。将来自6孔板的(3)孔的未分化的集落碎片转移至24孔板中。基本培养基(MM)中浓度为4nM或8nM的重组NM23-S120G(优选形成二聚体的突变体)相当于现有技术水平，即目前为4ng/ml bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)加上50％来自灭活HS27成纤维细胞饲养细胞的条件培养基(CM)。我们也测试了前24小时使用bFGF/CM，之后转换为用MM中的NM23处理新鲜平皿培养的细胞的影响。培养4天后，计算未分化与已分化的集落数。结果绘制在图9中。标记为“对照”的条块是指在4ng/ml bFGF和50％来自灭活HS27成纤维细胞饲养细胞的CM中的基质胶上培养的标准方法。图表显示：1)在NM23+MM中培育的细胞比在bFGF+CM中生长更快；2)与现有技术水平相比，NM23+MM分化更少；3)在前24小时加入bFGF+CM比直接在NM23+MM中培养稍差；和4)趋势似乎表明最高浓度的NM23(8nM)最好。
第5天分离细胞并在基质胶上再次平皿培养。接下来的5天，将细胞在4、8、16、32或64nM中培养。结果显示增加NM23-S120G的浓度效果更好。16nM和32nM的NM23-S120G产生未分化集落的数量与bFGF+CM对照大致相同。16nM时，每孔产生4-5个集落，而仅有1个发生分化；32nM时每孔产生3个集落，共有1个发生部分分化；bFGF+CM对照在一个孔中产生2个未分化集落和1个部分分化集落，在另一个孔中产生1个未分化和2个完全分化的集落。NM23-S120G产生的集落比bFGF/CM大得多。
实施例10.与环葡聚糖偶联的抗MUC1*加上抗MUC1*或与环葡聚糖偶联的bFGF-抗MUC1*抗体可促进干细胞在传统培养基或基本培养基加上MUC1*刺激物中附着及生长
如实施例9所述，手动剥离并收获通过标准方法在HS27成纤维细胞上培育，然后在基质胶上传2代的人类胚胎H9干细胞。将6孔板中2个孔的未分化的集落碎片在包被有与环葡聚糖共价偶联的抗MUC1*抗体的24孔板上传代。然后将细胞在抗MUC1*抗体终浓度为160ng/ml的基本培养基中或4ng/ml bFGF和50％HS27条件培养基(CM)中进行培养。如人们所预料，在数小时内附着的细胞在饲养细胞或基质胶上生长，但生长速率加快。在平皿培养的第5天和第6天之间对细胞进行分离。手动收获未分化的集落碎片并在新的环葡聚糖-抗MUC1*包被的板上再次进行平皿培养，其在所述板上继续增殖并形成未分化的集落。在抗MUC1*和bFGF加上HS27CM中培养的孔之间的细胞数量，集落形态和对分化的抑制类似。
实施例11.将配体与环葡聚糖偶联的方法
葡聚糖羧基化：材料：葡聚糖500(平均分子量为500kD，Aldrich cat.#31392，分离自明串珠菌(Leuconostoc spp.)，Sigma-Aldrich，圣路易斯，密苏里州)；溴乙酸和NaOH(Sigma-Aldrich)；I型H2O(Ricca ChemicalCompany，阿灵顿，德克萨斯州)；20,000MWCO透析管，或载玻片(FisherScientific，沃尔瑟姆，马萨诸塞州)。
步骤：使用I型水制备2N的NaOH溶液。在洁净干燥的20mL闪烁管中加入6mL上述溶液。向其中加入834mg溴乙酸，溶解后溶液变浑浊。然后向管中加入1.00g葡聚糖500并对溶液进行涡旋混合和轻微超声，以在五分钟内完全溶解。将该溶液在室温下搅拌24小时。然后使用流动的自来水对溶液透析8h，然后使用0.1N HCl透析18h，然后使用蒸馏水透析12小时。然后将溶液冻干并于-20℃在氩气中储存。
葡聚糖-蛋白/抗体偶联：材料：羧化葡聚糖500，内部制备(preparedin house)；1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)(Sigma-Aldrich)；N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)(Sigma-Aldrich)；待偶联的蛋白或抗体；I型H2O(Ricca Chemical Company)；乙醇胺(Sigma-Aldrich)。
步骤：制备0.5mg/mL羧化葡聚糖500的I型H2O的溶液。制备100mM EDC/100mM NHS的I型H2O的溶液。在1.5mL离心管(eppendorftube)中，将等分试样1mL葡聚糖溶液加入12μL EDC/NHS溶液中。对混合物进行涡旋混合并在室温下振摇15分钟以活化羧酸残基。同时，将6.67nmol蛋白或抗体(在合适的缓冲液中溶解)分装至单独的管中。活化15分钟后，将110μL活化的葡聚糖溶液滴加至含有待偶联的蛋白或抗体的管中。将溶液轻轻涡旋混合，然后在室温下轻轻振摇试管2小时。将5μL乙醇胺加入管中并在室温下再振摇15分钟。4℃下使用磷酸盐缓冲液(pH 7.4)对管中的内容物进行至少18小时的透析。可使用新鲜溶液或冻干并在-20℃下储存，随后在使用前重新配制(复溶、重构，reconstitute)。
应注意我们通过在羧化和蛋白浓度系统变化的24个表面上测定干细胞的生长而凭经验确定羧化的最佳量以及待偶联的蛋白浓度。
实施例12.连接于与环葡聚糖偶联的抗MUC1*，并在基本培养基中的NM23-S120G或HS27条件培养基中的bFGF中培养的H9干细胞
如实施例11所述，使用与环葡聚糖偶联的抗MUC1*包被24孔板。如实施例9所述，将H9细胞在这些表面进行传代并在重组NM23-S120G终浓度为1nM、2nM、4nM或8nM的基本培养基中培养。在另一个条件下，使用4ng/ml bFGF和50％HS27条件培养基(CM)处理细胞24小时，然后转变为基本培养基中的Nm23-S120G。一式两份进行实验。生长4天后，计算未分化和已分化的集落数量，并绘制为未分化集落与集落总数的百分比。仅100％未分化的集落算作未分化。图10显示bFGF加上CM仅当NM23-S120G浓度不足时起作用。此外，结果显示基本培养基中的NM23-S120G在集落形态、数量和对分化的抑制方面与bFGF加上成纤维细胞饲养细胞条件培养基一样或更好。
实施例13.使用NTA-Ni包被培养烧瓶的步骤
材料：24孔具有羧酸表面的细胞培养板(BD Biosciences Purecoat：#356775)；1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)；N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)；Nα，Nα-二(羧甲基)-L-赖氨酸水合物；I型H2O；无菌注射器(20mL)；0.45μm PVDF膜式针头滤器(PVDF-membrane syringe filters)。
步骤：为每块板制备75mL的10mM EDC/10mM NHS溶液以对其进行衍生化。使用无菌注射器和针头滤器将EDC/NHS溶液过滤至每个孔中，约填充孔的80％。室温下将板覆盖并在板振动器上轻轻振摇15分钟。当振摇板时，为每板制备～40mL的10mM Nα，Nα-二(羧甲基)-L-赖氨酸水合物。活化板15分钟后，将板倒空并使用I型水漂洗3次。使用新的无菌注射器和针头滤器将Nα，Nα-二(羧甲基)-L-赖氨酸水合物的溶液过滤至每个孔中，约填充孔的一半。室温下将板覆盖并在板振动器上轻轻振摇3小时。3小时后，将板倒空并使用I型H2O漂洗5次。此时通过加入1％乙醇胺的无菌溶液将剩余的活化NHS酯淬灭并在室温下孵化15分钟，然后加入10％碳酸钠的无菌溶液并在室温下孵化30分钟。也可通过在4℃下将板储存在无菌的I型H2O中至少48-72小时来实现。一旦将残留的NHS酯淬灭或水解为羧酸，必须使用无菌的I型H2O填充孔，然后用封口膜包裹，用锡箔覆盖并包裹，并储存于4℃。使用前应使用无菌I型H2O再次漂洗板。将1％硫酸镍溶液加入板中，并在使用前用PBS漂洗。
应注意使用乙醇胺溶液会将残留的NHS酯转化为具有羟基首基的酰胺。这将改变表面的化学性质。如果这是不可取的，使用碳酸盐溶液浸泡或长期水浸泡可将所有剩余的NHS酯水解为原始的羧酸。
实施例14.H9干细胞连接于使用携带组氨酸标记的配体包被的NTA-NiH9板
如实施例13所述，使用NTA-Ni对12孔板衍生化。将组氨酸标记的NM23-S120G，具有序列HHHHHHSSSSGSSSSGSSSSGGRGDSGRGDS(SEQ ID NO：5)的合成肽(RGD肽)，和重组的组氨酸标记的蛋白G(Minerva)以终浓度为200nM分别加入NTA-Ni包被的孔中，并孵化15分钟。在PBS中漂洗板。将抗SSEA4和抗Tra 1-81以200nM加入蛋白G孔中并孵化15分钟，然后使用PBS洗涤。如实施例9所述，从在基质胶上生长2代的H9细胞的6孔板的3个孔中收获集落碎片，并在孔中对其进行平皿培养。在NM23-S120G为8nM的基本培养基中，4ng/ml bFGF加上HS27CM中，8nM NM23-S120G加上50％收集自T47D MUC1*阳性癌细胞的条件培养基(“Ca CM”)中或4ng/ml bFGF加上50％Ca CM中培养干细胞。细胞在24小时内附着于板上并观察到未分化干细胞增殖。平皿培养后的第3天，计算并绘制未分化和已分化的集落，见图11A。拍摄了以下代表性照片(40X)：B)在NM23-S120G表面并在8nMNM23-S120G加上50％Ca CM中培养；C)在RGD肽表面并在8nMNM23-S120G加上50％Ca CM中培养；D)在RGD肽表面并在4ng/mlbFGF加上50％HS27CM中培养；E)在抗SSEA4的蛋白G表面，然后在8nM NM23-S120G加上50％Ca CM中培养；F)在抗Tra 1-81的蛋白G表面，然后在8nM NM23-S120G加上50％Ca CM中培养；G)在RGD肽表面并在4ng/ml bFGF加上50％Ca CM中培养。所获得的该实验的最佳条件为His标记的蛋白G连接于NTA-Ni表面，然后亲和连接于抗SSEA4或Tra 1-81，然后在MM或CaCM中的NM23-S120G中培养。
在类似的实验中，使用来自其它MUC1*阳性癌细胞(ZR-75-1和ZR-75-30)的条件培养基并产生相同的结果。
实施例15.与来自成纤维细胞的条件培养基相比，收集自MUC1*阳性癌细胞的条件培养基可更好地促进干细胞生长并抑制分化
根据标准方法，在6孔板上培育人类胚胎干细胞(H9)并通过手动离进行收获。将来自6孔板的(3)孔的未分化的集落碎片分布在NTA-Ni包被的24孔板的孔中。我们好奇是否在细胞表面或培养基中的蛋白会粘附于连接于板表面的金属螯合物。加入平皿培养的集落碎片中的培养基为：a)4ng/ml bFGF加上HS27(成纤维细胞)条件培养基(CM)；b)4ng/ml bFGF加上来自T47D的条件培养基(MUC1*阳性乳腺癌细胞系，来自该细胞的CM在此处称为“Ca CM”)；c)含4nMNM23的基本培养基(“MM”)；d)含8nM NM23的MM；e)含4nM NM23的Ca CM；或f)含8nM NM23的Ca CM。24小时后，观察到在基本培养基或CM或Ca CM中的细胞已连接于表面，虽然没有明显的原因说明为何bFGF/CM或bFGFCa CM会连接；但想起我们所使用的NM23为组氨酸标记的重组蛋白，其可被NTA-Ni容易地捕获。观察到在癌细胞条件培养基即Ca CM中培育的细胞比在其它条件下生长得更好。每48小时更换培养基培养6天后，分析板的干细胞集落形态，集落数量和分化程度。与bFGF加上HS27对照相比，在4ng/ml bFGF加上癌细胞条件培养基中培养的干细胞形成更多的集落并且分化较少(无)。仅在NM23中培养的细胞生长并形成集落，但在NM23加上癌细胞条件培养基中培养的细胞比在任何其它条件下培养的细胞形成的集落更多，集落约有80-85％未分化且完全成形并可容易地分离，而现有技术水平的在饲养细胞或基质胶上的方法需要9天才能达到相同阶段，且平均有30-40％的分化。图12显示第9天的集落数量的图表；我们绘制的NM23加上癌细胞条件培养基(Ca CM)为20个集落，但细胞完全覆盖了整个孔因此实际上无法计算。虽然在NM23刺激的孔中细胞增殖更快，但在第9天，仍然有未分化的部分，大约等于对照bFGF加上HS27成纤维细胞条件培养基(HS27CM)中的百分比。
实施例16.优选结合于细胞表面远端肽区域的抗体用于细胞粘附
与结合于邻近细胞表面区域的抗体相比，结合于细胞表面远端的MUC1*胞外域部分的抗体可更好地促进干细胞粘附。MUC1*的胞外域长度约为45个氨基酸。针对这45个氨基酸培育的多克隆抗体在此处及之前的申请中称为PSMGFR，其具有序列GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(SEQID NO：1)，可促进干细胞粘附于其所连接的表面。单克隆抗体的筛选显示当加入培养基时，虽然识别邻近细胞表面的MUC1*胞外域部分的单克隆抗体可刺激干细胞生长，但是该相同的单克隆抗体不能促进干细胞粘附于表面。为了确定产生结合于MUC1*受体远端部分的抗体的杂交瘤细胞，我们将杂交瘤细胞上清液吸附于96孔板的孔中，然后将在基质胶上培育的BG01v/hOG细胞中收获的未分化的集落碎片进行平皿培养。来自三种(3)克隆的上清液可使干细胞粘附。每48小时更换基本培养基，并在平皿培养后第9天对增殖的未分化细胞集落拍照，见图13。
在后续实验中，进行ELISA试验以确定由这些杂交瘤分泌的抗体是否确实结合于MUC1*胞外域的远端，见图14。合成两种缺失肽：一种缺失10个N端氨基酸，即N-10PSMGFR，序列为QFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPF SAQSGA(SEQ ID NO：3)；一种缺失10个C端氨基酸，即C-10PSMGFR，序列为GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDV(SEQ ID NO：4)。导致干细胞粘附至96孔板的孔中的杂交瘤上清液，通过ELISA试验显示其与缺失了10个细胞表面近端氨基酸的肽结合，而不与缺失远端10个氨基酸的肽结合。在杂交瘤上清液中平皿培养的干细胞可发育为完全成形的集落，仅在基本培养基中对其培养数日后未分化。
实施例17.MUC1*抗体用于识别多能干细胞与分化的干细胞
MUC1*配体即NM23与MUC1*和OCT4共同定位未分化的hESC，但在开始分化的集落部分中，所有三种蛋白均失去免疫反应性。未分化的H9hESC集落对NM23，MUC1*和OCT4染色呈阳性。新分化的集落不与针对任何三种蛋白的抗体反应。在开始分化的集落中可最好地看出NM23与OCT4和MUC1*的共表达。虚线标记集落的分化部分与未分化部分之间的边界。使用以下抗体进行三重染色实验：图15G)抗NM23(绿色)。H)抗MUC1*(红色)。I)抗NM23(绿色)，抗MUC1*(红色)和DAPI(蓝色)。使用以下抗体对类似集落染色：J)抗NM23(绿色)。K)抗OCT4(红色)。L)抗NM23(绿色)，抗OCT4(红色)和DAPI(蓝色)。比例尺＝100μm。抗NM23购自Santa Cruz，克隆NM301和BD Biosciences，克隆56。抗MUC1*由Zymed用Minerva PSMGFR肽定制产生。
可通过使用抗MUC1*和与全长MUC1结合的抗体如VU4H5标记活细胞并通过FACS、磁性细胞分离或类似技术分选，以从未分化和分化干细胞的混合池中分离多能干细胞。MUC1*阳性表示多能干细胞。由于充当生长因子，所以与活细胞结合的二价抗MUC1*不会干扰随后的生长，因此对于细胞分离是理想的。
实施例18.使用MUC1*抗体将MUC1*早期祖细胞与后期祖细胞—造血干细胞分离
获得了来自人类脐带血(ALLCELLS)的CD34阳性造血干细胞(HSC)。细胞含有CD34+/CD38-的混合物，报道为真正的HSC，但也含有CD34+/CD38+(下一个祖细胞阶段)。将细胞解冻，沉淀，在购自StemSpan的SFEM(无血清扩增培养基)中洗涤，并在不加入生长因子的SFEM中重悬。将大约4000个细胞在96孔板中的孔中进行平皿培养，并使用聚HEMA覆盖以防止粘附。将通过使用PSMGFR肽免疫而生成的兔多克隆抗MUC1*抗体分别以0、80、250和2000ng/ml的终浓度加入至5个孔中。在第3天对细胞拍照，图16A。平皿培养后第5天，将抗体重新加入细胞中。
平皿培养后第11天，目视检查细胞，大多数仍然与开始平皿培养时的直径相同，表明其仍为造血干细胞并且未进展至下一个祖细胞期。将来自相同孔中的细胞混合并使用抗CD34-FITC和抗CD38-PE-Cy5进行染色。通过FACS(荧光激活细胞分选)分析并分选细胞。图16B显示当MUC1*抗体的浓度升高，仍保持真造血干细胞(CD34+/CD38-)的百分比就升高。反过来也是如此。当MUC1*抗体的浓度最低时，已进展至下一个祖细胞期(CD34+/CD38+)的细胞的百分比最高。代表性孔的统计数据显示使用MUC1*抗体刺激产生比未刺激的细胞更多的CD34+/38-细胞(HSC)及更少的CD34+/38+(祖)细胞。
实施例19.胎肝细胞的FACS分选及随后通过MUC1*刺激的生长
使用可识别全长MUC1的抗体(VU4H5，Santa Cruz Biotechnology；或HMPV，BD Biosciences)或抗MUC1*(由PSMGFR免疫产生的兔多克隆抗体，Minerva)对许多不同的祖细胞进行FACS分析以确定哪些表达MUC1*，以便于将那些细胞分离并通过刺激MUC1*受体而扩增。图17显示神经干细胞(RenCell CX Millipore)可表达MUC1*。少数细胞可表达剪切和未剪切的MUC1。通过使用抗MUC1*或其它因子如使MUC1*二聚化的NM23进行培养以刺激生长。胎肝细胞(ALLCELLS)几乎专门表达MUC1*，图17B。
在基本培养基加上图18所示浓度的抗MUC1*抗体中培养胎肝细胞。生长曲线显示MUC1*生长因子受体二聚化刺激这些MUC1*祖细胞的生长。在最佳的抗体浓度，一个抗体使两个MUC1*受体二聚化，当抗体过量时每个受体与一个抗体作用，生长受到抑制。这些结果显示可通过加入使MUC1*受体二聚化的因子扩增造血干细胞和其它表达MUC1*的祖细胞。
实施例20.Hu ES细胞粘附于包被有针对任何细胞表面标记蛋白的抗体的表面，并且可在标准干细胞培养基或含有MUC1*刺激物的培养基中被捕获
使用0.5ml抗MUC1*或抗SSEA4抗体以浓度为100μg/ml包被12孔板。板在4摄氏度下孵化过夜，并在无菌PBS中漂洗。手动剥离在基质胶上生长的hu ES H9细胞的未分化集落碎片，重悬，然后在表面进行平皿培养。加入含有终浓度为8nM的重组NM23-S120G(Minerva)或4ng/mlbFGF加上50％HS27成纤维细胞条件培养基的培养基。在平皿培养第5天时手动收获未分化的集落，分离并在同样包被的表面上再次平皿培养。图19的图表显示如果在含有NM23的基本培养基(MM)或bFGF加上HS27条件培养基中培养，干细胞可在两种抗体表面生长。注意到与bFGF处理的孔中的细胞相比，NM23处理的孔中的细胞生长速度大大加快。
实施例21.促进干细胞生长并抑制分化的癌细胞条件培养基中的试剂的确定
来自MUC1*阳性癌细胞的条件培养基可促进人类干细胞的生长并同时抑制其分化。两个原因使得确定癌细胞条件培养基中影响干细胞生长的离散因子是可取的。首先，这些因子可通过合成或重组制备并作为离散因子加入至培养基或表面包被物中，以促进干细胞和某些早期祖细胞的生长。其次，确定那些因子可制定抑制其的策略以治疗癌症。
为了确定癌细胞条件培养基Ca CM中的蛋白，我们从MUC1*阳性癌细胞中收集Ca CM并通过例如在柱子上分离将其各个成分分离，如离子交换柱，分子排阻柱等。单独或组合测定各种馏分刺激未分化干细胞生长的能力。然后通过微测序或质谱来分析具有影响的馏分，以确定成分的性质。
一种更直接的方式是将来自未处理MUC1*阳性癌细胞的Ca CM与从miR-145处理的细胞中收集的条件培养基进行比较。miR-145是一种调控微RNA，当干细胞由未分化转变为分化时，其表达上调。可记起在该转变过程中，MUC1剪切停止并且MUC1的表达下调。最近显示miR-145可使MUC1静默。使用miR-145处理癌细胞可转变为分化的调节生长特征而不是癌症细胞生长和未分化干细胞生长均具有的干细胞样生长特征。将初始癌细胞所分泌的因子和miR-145所处理的因子进行比较可确定与促进干细胞和癌症细胞生长有关的因子。它们存在于未处理的Ca CM中而不在已处理的Ca CM中。可通过相同类型的蛋白分离然后测序或质谱分析进行确定。可在凝胶上分离成分，将未处理的Ca CM所具有的独特的蛋白条带从凝胶上切除，然后通过微测序或质谱进行分析。
同时，可将来自未分化干细胞的条件培养基与收集自启动分化的因子如MUC1*胞外域肽处理的干细胞的条件培养基进行比较。在这种情况下，由未分化的干细胞独特或优先分泌的成分是可作为因子促进干细胞生长或诱导多能性的成分。抑制这些因子的分子可用作癌症疗法。反过来，由分化的干细胞独特或优先分泌的成分可作为因子治疗癌症。同样，抑制这些因子的分子可用于促进干细胞的生长或诱导多能性。
可如上所述确定促进或抑制干细胞样生长，即干细胞或癌细胞生长的调节核酸如微RNA，除了提取并分析核酸而不是分析细胞的分泌物。例如，可实施称为深度测序及总转录组分析的技术以确定当干细胞样生长受到抑制时那些上调或下调的调节RNA。当干细胞分化时上调的调节RNA如miR-145可用作抗癌疗法。同样，包括抑制这些微RNA的siRNA的分子可用于促进或诱导多能性。可靶向在未分化干细胞生长及癌症细胞生长中上调的调节核酸以在治疗癌症中使其静默或抑制或同时启动干细胞的分化。
本领域技术人员仅使用常规实验方法即可认识到或能够确定本文特别描述的本发明的特定实施方式的等同物。该等同物将包括在权利要求的范围内。
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Figure IDA0000135154070000021

Claims (48)

1.一种在表面上培养、扩增或培育干细胞或干细胞样细胞或诱导多能干细胞的方法，包括通过结合于所述表面和所述细胞的配体将所述细胞连接于所述表面。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述配体直接地或通过媒介物间接地结合于所述表面。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述媒介物为化学连接子或另一种蛋白或者它们的组合。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述蛋白为蛋白A或蛋白G。
5.根据权利要求3所述的方法，其中，所述连接子为光敏感的或化学敏感的。
6.根据权利要求2所述的方法，其中，所述配体或所述媒介物非特异性地吸附于所述表面，或通过亲和标记-结合配偶体相互作用共价偶联或连接于所述表面。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述配体与聚合物连接。
8.根据权利要求1所述的方法，其中，所述配体特异性地结合于多肽，所述多肽在所述干细胞或干细胞样细胞或诱导多能干细胞上表达。
9.根据权利要求1所述的方法，其中，所述配体为抗体或生长因子。
10.根据权利要求8所述的方法，其中，所述细胞的表面上的所述多肽为MUC1或MUC1*、SSEA3、SSEA4、Tra 1-81或Tra 1-60。
11.根据权利要求10所述的方法，其中，所述细胞的表面上的所述多肽为MUC1*。
12.根据权利要求9所述的方法，其中，所述抗体特异性地结合于PSMGFR或C-10PSMGFR。
13.根据权利要求9所述的方法，其中，所述生长因子为野生型NM23、或NM23-S120G突变体、或bFGF。
14.一种用于培养干细胞或干细胞样细胞或诱导多能干细胞的方法，其中，将所述细胞暴露于含有与具有PSMGFR序列的肽结合的试剂的培养基中。
15.根据权利要求14所述的方法，其中，所述试剂为抗体。
16.根据权利要求14所述的方法，其中，所述试剂为野生型NM23或NM23-S120G突变体。
17.一种培养干细胞或干细胞样细胞或诱导多能干细胞的方法，包括将所述细胞暴露于含有从MUC1*阳性癌细胞分泌的试剂的培养基中。
18.根据权利要求17所述的方法，其中，所述MUC1*阳性细胞选自T47D、ZR-75-30、或ZR-75-1。
19.一种培养干细胞或干细胞样细胞或诱导多能干细胞的方法，包括将所述细胞暴露于来自MUC1*阳性癌细胞的条件培养基中。
20.根据权利要求19所述的方法，其中，所述MUC1*阳性细胞选自T47D、ZR-75-30、或ZR-75-1。
21.根据权利要求1所述的方法，其中，所述表面不是基质胶。
22.根据权利要求1所述的方法，其中，在无成纤维细胞饲养细胞的条件下培养所述细胞。
23.根据权利要求1所述的方法，其中，不进行手动剥离而移除所述细胞。
24.一种从根据权利要求1所述的方法而培育的细胞中收获细胞的方法，包括加入与所述配体结合的竞争分子，以使所述细胞从结合于所述配体或所述表面释放。
25.一种从根据权利要求1所述的方法而培育的细胞中收获细胞的方法，包括裂解结合于所述表面且直接或间接连接于所述细胞的连接子，以使所述细胞从所述表面释放。
26.一种识别细胞分化状态的方法，包括使用抗MUC1*抗体结合于所述细胞，其中，抗MUC1*抗体的阳性信号指示多能细胞状态，而显示为与未剪切MUC1结合的细胞指示分化细胞状态。
27.根据权利要求26所述的方法，包括从干细胞和干细胞样细胞或诱导多能干细胞和新分化细胞的混合群体中分离细胞，其包括使用抗MUC1*抗体结合于所述细胞，其中，抗MUC1*抗体的阳性信号指示多能细胞状态，而显示为与未剪切MUC1结合的细胞指示分化细胞状态。
28.根据权利要求27所述的方法，进一步包括，使所述细胞与干细胞或干细胞样细胞或诱导多能干细胞标记物的抗体接触，其中，干细胞或干细胞样细胞或诱导多能干细胞标记物的阳性信号指示多能干细胞状态的存在。
29.根据权利要求28所述的方法，其中，使所述细胞与抗MUC1*和抗Tra 1-81、抗Tra 1-60、SSEA3或SSEA4抗体接触。
30.一种利用抗MUC1*抗体结合于细胞以检测癌症干细胞的方法，其中，抗MUC1*抗体的阳性信号指示癌症干细胞。
31.根据权利要求30所述的方法，包括使所述细胞与干细胞标记物的抗体反应，其中，干细胞标记物的阳性信号指示癌症干细胞的存在。
32.一种在表面上调节干细胞或干细胞样细胞或诱导多能干细胞的培养、扩增或培育以及抑制干细胞或干细胞样细胞或诱导多能干细胞分化的方法，包括将所述细胞直接地或通过结合于所述细胞的配体间接地连接于所述表面，并将所述细胞暴露于含有与具有PSMGFR序列的肽结合的试剂的培养基中。
33.根据权利要求32所述的方法，其中，所述试剂使MUC1*二聚化以促进生长并抑制分化。
34.根据权利要求32所述的方法，其中，所述试剂抑制MUC1*的二聚化以促进分化。
35.一种分离细胞类型的方法，包括：
在表面上为对不同细胞类型具有亲和力的多种配体或为识别细胞期或类型的特异性标记物建立空间编址；以及
将所述细胞加至所述表面，其中，根据所述细胞所结合的配体而在空间上分离所述细胞。
36.根据权利要求35所述的方法，其中，所述表面为颗粒。
37.根据权利要求36所述的方法，其中，所述颗粒为纳米粒子。
38.一种将表面植入宿主体内的方法，其中，所述表面连接有配体，所述配体为干细胞或干细胞样细胞或诱导多能干细胞的配体。
39.根据权利要求38所述的方法，其中，所述宿主为患者。
40.根据权利要求38所述的方法，其中，所述配体为宿主干细胞或干细胞样细胞或诱导多能干细胞的生长因子。
41.一种将表面植入宿主体内的方法，所述表面通过配体而连接有细胞，所述配体结合于所述表面和所述细胞。
42.一种体内增殖干细胞或干细胞样细胞或诱导多能干细胞的方法，包括将连接有配体的表面给予至宿主体，所述配体为干细胞或干细胞样细胞或诱导多能干细胞的配体。
43.一种组合物，包括：
通过亲和相互作用与蛋白A或蛋白G结合的表面，其中，所述蛋白A或蛋白G结合于对多肽具有特异性的抗体，所述多肽在干细胞或干细胞样细胞或诱导多能干细胞上特异性表达，以及
MUC1*二聚化试剂。
44.根据权利要求43所述的组合物，其中，所述亲和相互作用是通过NTA-Ni与所述表面的相互作用。
45.根据权利要求43所述的组合物，其中，所述多肽为MUC1或MUC1*、SSEA3、SSEA4、Tra 1-81或Tra 1-60。
46.根据权利要求43所述的组合物，其中，所述MUC1*二聚化试剂为野生型NM23或NM23-S120G突变体。
47.一种增殖干细胞或干细胞样细胞或诱导多能干细胞的方法，包括：
使表面与含有所述细胞并具有MUC1*二聚化试剂的样品相互作用，所述表面通过亲和相互作用与蛋白A或蛋白G结合，其中，所述蛋白A或蛋白G结合于对多肽具有特异性的抗体，所述多肽在干细胞或干细胞样细胞或诱导多能干细胞上特异性表达。
48.根据权利要求14所述的方法，其中，所述培养基为基本培养基。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104630144A (zh) * 2015-02-13 2015-05-20 中国医科大学 一种脐血间充质干细胞的分离及培养方法
CN104717980A (zh) * 2012-08-14 2015-06-17 米纳瓦生物技术公司 干细胞增强疗法
CN105164249A (zh) * 2012-07-13 2015-12-16 米纳瓦生物技术公司 用于诱导细胞至较不成熟状态的方法

Families Citing this family (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004022580A2 (en) 2002-09-09 2004-03-18 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Bh3 peptides and method of use thereof
CA2645853A1 (en) 2006-03-31 2007-11-01 Dana-Farber Cancer Institute Methods of determining cellular chemosensitivity
WO2008070171A2 (en) * 2006-12-06 2008-06-12 Minerva Biotechnologies Corp. Method for identifying and manipulating cells
KR20140101876A (ko) 2008-10-09 2014-08-20 미네르바 바이오테크놀로지 코포레이션 세포내에서 다능성을 유도하기 위한 방법
EP4166652A1 (en) 2009-11-12 2023-04-19 Technion Research & Development Foundation Ltd. Culture media, cell cultures and methods of culturing pluripotent stem cells in an undifferentiated state
US10485829B2 (en) 2009-11-17 2019-11-26 Astellas Institute For Regenerative Medicine Methods of producing human RPE cells and pharmaceutical preparations of human RPE cells
KR101853418B1 (ko) * 2010-06-16 2018-05-02 미네르바 바이오테크놀로지 코포레이션 암 세포의 역분화
WO2012126013A2 (en) * 2011-03-17 2012-09-20 Minerva Biotechnologies Corporation Method for making pluripotent stem cells
JP2014517690A (ja) * 2011-05-09 2014-07-24 ミネルバ バイオテクノロジーズ コーポレーション 遺伝子操作した成長因子変異体
AU2012253366A1 (en) * 2011-05-11 2014-01-09 Exosome Diagnostics, Inc. Nucleic acid extraction from heterogeneous biological materials
JP6466170B2 (ja) * 2011-10-17 2019-02-06 ミネルバ バイオテクノロジーズ コーポレーション 幹細胞の増殖及び誘導用の培地
JP6546087B2 (ja) * 2012-07-24 2019-07-17 ミネルバ バイオテクノロジーズ コーポレーション Ｎｍｅバリアント種の発現および抑制
WO2014047342A1 (en) 2012-09-19 2014-03-27 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Dynamic bh3 profiling
KR20140073215A (ko) * 2012-12-06 2014-06-16 삼성전자주식회사 세포 분리용 조성물, 키트 및 이를 이용한 세포 분리 방법
EP2958940A4 (en) * 2013-02-20 2016-07-20 Minerva Biotechnologies Corp NME INHIBITORS AND METHODS OF USING NME INHIBITORS
WO2015035996A1 (en) * 2013-09-11 2015-03-19 Amphidex A/S Cell culture products for adherent cell cultures and manufacture thereof
CA2922503C (en) 2013-09-19 2021-10-26 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Methods of bh3 profiling
TWI746420B (zh) * 2014-04-07 2021-11-21 美商密內瓦生物技術公司 抗ｎｍｅ抗體
US10596492B2 (en) 2014-07-09 2020-03-24 Sudhin Biopharma Particle settling devices
CN107660213B (zh) 2015-02-10 2023-01-13 米纳瓦生物技术公司 人源化抗MUCl＊抗体
EP3288964B1 (en) * 2015-04-27 2024-02-21 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. High throughput bh3 profiling: a rapid and scalable technology to bh3 profile on low numbers of cells
CA3035168A1 (en) * 2015-08-28 2017-03-09 Keith D. Crawford Adult stem cell compositions and methods of identification and isolation
CN108431043A (zh) * 2015-12-22 2018-08-21 艾伯维施特姆森特克斯有限责任公司 新颖的抗mmp16抗体及使用方法交叉引用的申请
EP3652315A4 (en) 2017-07-12 2021-09-01 Exosome Diagnostics, Inc. METHOD OF ISOLATION AND ENRICHMENT OF POPULATIONS OF EXTRACELLULAR VESICULES FROM A BIOFLUID AND METHOD OF USING THEREOF
BR112020021267A2 (pt) 2018-04-18 2021-01-26 Sudhin Biopharma dispositivos de sedimentação de partículas
CA3172276A1 (en) 2020-03-19 2021-09-23 Dhinakar S. Kompala Particle settling devices

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1419597A (zh) * 2000-02-24 2003-05-21 埃克斯西特治疗公司 细胞的同步刺激和富集
US20040067585A1 (en) * 2002-10-07 2004-04-08 Yu-Chi Wang Cell cultivation surface and method of making the same
US20060252087A1 (en) * 2005-01-18 2006-11-09 Biocept, Inc. Recovery of rare cells using a microchannel apparatus with patterned posts
US20070134713A1 (en) * 2002-04-25 2007-06-14 Bo Cao Methods and kits for detecting a target cell
US20090075926A1 (en) * 2006-12-06 2009-03-19 Bamdad Cynthia C Method for identifying and manipulating cells

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5342790A (en) * 1992-10-30 1994-08-30 Becton Dickinson And Company Apparatus for indirect fluorescent assay of blood samples
GB9413029D0 (en) 1994-06-29 1994-08-17 Common Services Agency Stem cell immobilisation
CN1299414A (zh) * 1998-03-18 2001-06-13 科里克萨有限公司 用于治疗和诊断肺癌的化合物和方法
US6797514B2 (en) * 2000-02-24 2004-09-28 Xcyte Therapies, Inc. Simultaneous stimulation and concentration of cells
WO2002022685A2 (en) * 2000-09-11 2002-03-21 Kufe Donald W Muc1 extracellular domain and cancer treatment compositions and methods derived therefrom
US7700715B2 (en) * 2000-11-27 2010-04-20 Minerva Biotechnologies Corporation Diagnostic tumor markers, drug screening for tumorigenesis inhibition, and compositions and methods for treatment of cancer
WO2005019269A2 (en) 2002-11-27 2005-03-03 Minerva Biotechnologies Corporation Techniques and compositions for the diagnosis and treatment of cancer (muc1)
EP1578345A2 (en) * 2001-03-29 2005-09-28 RAMOT UNIVERSITY AUTHORITY FOR APPLIED RESEARCH & INDUSTRIAL DEVELOPMENT LTD. Peptides and antibodies to muc 1 proteins
KR100450578B1 (ko) 2002-03-05 2004-09-30 주식회사 안지오랩 엔엠23 단백질을 유효성분으로 하는, 매트릭스메탈로프로테아제 활성 억제 및 혈관신생 억제용 조성물
WO2003099708A1 (fr) * 2002-05-28 2003-12-04 Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. Procede de production de nanoparticules et nanoparticules produites selon ce procede
US20060142546A1 (en) 2002-09-05 2006-06-29 Franz-Georg Hanisch Immunogenic muc1 glycopeptides
US20060173171A1 (en) * 2003-08-26 2006-08-03 Bamdad Cynthia C Techniques and compositions for diagnosis and treatment of cancer (muci)
CA2584412C (en) 2004-09-14 2017-05-09 Minerva Biotechnologies Corporation Methods for diagnosis and treatment of cancer
GB0424560D0 (en) * 2004-11-08 2004-12-08 Leuven K U Res & Dev Heart valve tissue engineering
WO2006105448A2 (en) 2005-03-30 2006-10-05 Minerva Biotechnologies Corporation Proliferation of muc1 expressing cells
US8076090B2 (en) * 2005-04-05 2011-12-13 Corning Incorporated Label free biosensors and cells
WO2008100805A2 (en) * 2007-02-09 2008-08-21 Genentech, Inc. Anti-robo4 antibodies and uses therefor
US20090092603A1 (en) * 2007-09-25 2009-04-09 Bamdad Cynthia C Early diagnosis and treatment of drug resistance in muc1-positive cancer

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1419597A (zh) * 2000-02-24 2003-05-21 埃克斯西特治疗公司 细胞的同步刺激和富集
US20070134713A1 (en) * 2002-04-25 2007-06-14 Bo Cao Methods and kits for detecting a target cell
US20040067585A1 (en) * 2002-10-07 2004-04-08 Yu-Chi Wang Cell cultivation surface and method of making the same
US20060252087A1 (en) * 2005-01-18 2006-11-09 Biocept, Inc. Recovery of rare cells using a microchannel apparatus with patterned posts
CN101535466A (zh) * 2006-07-19 2009-09-16 生物概念股份有限公司 用微通道设备检测或分离靶分子
US20090075926A1 (en) * 2006-12-06 2009-03-19 Bamdad Cynthia C Method for identifying and manipulating cells
CN101652469A (zh) * 2006-12-06 2010-02-17 米纳瓦生物技术公司 用于鉴定和操作细胞的方法

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105164249A (zh) * 2012-07-13 2015-12-16 米纳瓦生物技术公司 用于诱导细胞至较不成熟状态的方法
CN104717980A (zh) * 2012-08-14 2015-06-17 米纳瓦生物技术公司 干细胞增强疗法
US9932407B2 (en) 2012-08-14 2018-04-03 Minerva Biotechnologies Corporation Stem cell enhancing therapeutics
CN108175856A (zh) * 2012-08-14 2018-06-19 米纳瓦生物技术公司 干细胞增强疗法
CN111388664A (zh) * 2012-08-14 2020-07-10 米纳瓦生物技术公司 干细胞增强疗法
CN108175856B (zh) * 2012-08-14 2024-01-26 米纳瓦生物技术公司 干细胞增强疗法
CN104630144A (zh) * 2015-02-13 2015-05-20 中国医科大学 一种脐血间充质干细胞的分离及培养方法
CN104630144B (zh) * 2015-02-13 2018-02-13 中国医科大学 一种脐血间充质干细胞的分离及培养方法

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US20100316688A1 (en) 2010-12-16
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