EA026732B1

EA026732B1 - Способы культивирования стволовых клеток и клеток-предшественников

Info

Publication number: EA026732B1
Application number: EA201290003A
Authority: EA
Inventors: Синтия Бэмдэд
Original assignee: Минерва Байотекнолоджиз Корпорейшн
Priority date: 2009-06-11
Filing date: 2010-06-11
Publication date: 2017-05-31
Also published as: US8535944B2; EP3633024A1; MY157524A; CN104293732A; US20100316688A1; US20220252604A1; EA201290003A1; KR20210019599A; CN102549146B; EP2440652A1; CA2767164A1; MX2011013385A; AU2010259858A1; WO2010144887A1; US20140044696A1; AU2016204735A1; BRPI1011127A2; IL216902B; KR20170075023A; JP2012529890A

Abstract

Изобретение относится к способам культивирования или обеспечения пролиферации стволовых клеток, или стволовоподобных клеток, или индуцированных плюрипотентных стволовых клеток на поверхности без дифференцировки, к способам сбора клеток после их выращивания в соответствии с указанными способами, а также к способу идентификации состояния дифференцировки клеток и к способу детектирования раковых стволовых клеток. Изобретение также относится к твердой подложке для использования в способе культивирования или обеспечения пролиферации стволовых клеток, или стволовоподобных клеток, или индуцированных плюрипотентных стволовых клеток на поверхности без дифференцировки.

Description

Перекрестная ссылка на родственные заявки на изобретения

В настоящей заявке на изобретение заявлен приоритет предварительных заявок на патент США № 61/186310, поданной 11 июня 2009 года, и № 61/323779, поданной 13 апреля 2010 года, содержание которых включено в данное описание путем ссылки.

Предшествующий уровень техники

Проблема, существующая в области культивирования или пролиферации стволовых клеток, клетокпредшественников, индуцированных плюрипотентных стволовых клеток или других неадгезивных клеток, заключается в том, как культивировать клетки таким путем, который не оказывал бы влияние на более поздние предполагаемые применения, включая трансплантаты или последующую дифференцировку. В отличие от большинства клеток, которые прилипают к пластику, которые могут быть культивированы в пластмассовых колбах для роста, стволовые клетки не являются адгезивными, поэтому не могут быть выращены с использованием традиционных способов. Стволовые клетки, тем не менее, растут на слоях клеток фибробластов. Эти слои питающих клеток предоставляют поверхность для адгезии и питают клетки смесью пока не охарактеризованных факторов роста, которые требуются для роста и выживания стволовых клеток. Недавно исследователям удалось культивировать стволовые клетки путем прикрепления их к компонентам, происходящим из внеклеточного матрикса, таким как Майтде1. Стволовые клетки прилипают к этим поверхностно-подобным субстратам, но должны быть культивированы в ростовых средах, которые содержат как основной фактор роста фибробластов (ЬРСР), так и собранные продукты секреции фибробластных питающих клеток. Не полностью понятно, каким образом или почему эти способы стимулируют пролиферацию стволовых клеток, поскольку в них обоих используется окружение из не охарактеризованных факторов, секретируемых клетками. Сообщалось о том, что стволовые клетки дифференцируются быстрее, когда они культивируются на поверхности МайтдеР

Стволовые клетки, выращиваемые в соответствии с любым из способов, т.е. питающими клетками или Майтде1 вместе с кондиционированными средами от питающих клеток, спонтанно дифференцируются. Дифференцирующиеся стволовые клетки секретируют факторы, заставляющие соседние клетки также начать дифференцировку. Таким образом, каждые приблизительно 7 суток технический персонал должен вручную отсекать и собирать только те колонии стволовых клеток или фрагменты колоний, которые, по-видимому, еще остаются недифференцированными. Собранные клетки затем повторно высевают для продолжения роста. Эту процедуру повторяют до тех пор, пока не соберут достаточное количество недифференцированных клеток для предполагаемой задачи. Эти способы культивирования стволовых клеток представляют собой текущее состояние уровня техники.

По существу, любой тип масштабируемого роста стволовых клеток или индуцированных плюрипотентных стволовых клеток требует разработки новых способов, которые обеспечат возможность высокоэффективного сбора этих клеток.

Настоящая практика заключается в выращивании стволовых клеток на фибробластных питающих клетках, для которых единственный способ сбора заключается в отсечении вручную под микроскопом и выделении хороших клеток с последующим повторным высеванием. Этот способ несовершенен, поскольку является субъективным и требует затрат времени. Существует потребность в способах автоматизируемого сбора и автоматизируемых способах очистки желаемых клеток от смешанного пула, где клетки выбирают на основе молекулярного распознавания, а не субъективных критериев технического специалиста.

Способы культивирования стволовых клеток в соответствии с уровнем техники неудовлетворительны, поскольку они: 1) являются трудоемкими; 2) по существу, несовместимы с крупномасштабным ростом; 3) зависят от не охарактеризованных факторов, таких как кондиционированные среды; 4) требуют от клеток или клеточных продуктов способность адгезии стволовых клеток к колбам для роста; и 5) часто используют клетки, не являющиеся человеческими, и клеточные экстракты, которые могут необратимо изменять человеческие стволовые клетки. Значительное улучшение может быть достигнуто в том случае, если идентифицированы отдельные факторы, дающие возможность роста стволовых клеток. Полагают, что если добавлены только необходимые и достаточные факторы роста, то спонтанная дифференцировка может быть минимизирована. Другое значимое улучшение может быть достигнуто в том случае, если клетки могут быть безопасно собраны таким путем, который совместим с крупномасштабным ростом, а не с используемым в настоящее время способом ручного отсечения под микроскопом. В настоящее время стволовые клетки, растущие на Майтде1, могут быть собраны путем ферментативного расщепления, например с использованием трипсина. Как правило, недифференцированные колонии или фрагменты колоний отсекают вручную, затем расщепляют при помощи фермента, такого как трипсин или коллагеназа. Однако трипсин вызывает значительную клеточную гибель, и сообщается о том, что серийные пассажи стволовых клеток на Майтде1 вызывают аномальный кариотип. Последнее может возникать в результате сбора с трипсином или может возникать в результате того, что Ма1йде1 представляет собой смесь клеток и продуктов секреции клеток мышиной саркомы. Предполагают, что питающие клетки, не являющиеся человеческими, изменяют образующиеся в результате стволовые клетки таким образом, что они не являются полностью человеческими. Например, предполагается, что картины гликозилирования и другие посттрансляционные модификации могут приобрести характеристики видов питающих клеток.

- 1 026732

Таким образом, значительное улучшение по сравнению с настоящим уровнем техники будет иметь место в том случае, если будут разработаны бесклеточные способы, поддерживающие рост стволовых клеток. Еще большее улучшение будет иметь место в том случае, если стволовые клетки могут быть выращены и собраны с использованием полностью охарактеризованных отдельных агентов, где максимально возможную долю составляют синтетические агенты. Для продуцирования клеток, подходящих для лечения людей, значительное улучшение по сравнению с текущим состоянием уровня техники будет иметь место в том случае, если будут разработаны способы культивирования клеток, при которых используются исключительно определяемые факторы. Идеально, определенные компоненты не должны содержать компоненты, не являющиеся человеческими. Предпочтительны рекомбинантные белки или синтетические компоненты. Антитела, включающие поликлональные, моноклональные, гуманизированные, химерные или их производные, особенно предпочтительны, поскольку их продуцирование является высоковоспроизводимым, они надежны и могут быть легко извлечены из собранных клеток, например аффинной элиминацией с использованием Белка А или Белка С.

Краткое изложение сущности изобретения

Изобретение относится к способу культивирования, развития или выращивания стволовых или стволовоподобных клеток или индуцированных плюрипотентных стволовых клеток на поверхности, включающему прикрепление клеток к поверхности при помощи лиганда, который связывается с поверхностью и клетками. Лиганд может связываться с поверхностью непосредственно или опосредованно через промежуточное звено. Промежуточное звено может представлять собой химический линкер или другой белок или их комбинацию. Белок может представлять собой белок А или белок С. В частности, линкер может быть фото- или химически чувствительным. Как лиганд, так и промежуточное звено могут быть неспецифически адсорбированы на поверхности или могут быть ковалентно связаны или присоединены к поверхности посредством взаимодейстивия с партнером связывания аффинной концевой последовательности. Лиганд также может быть связан с полимером. В конкретном воплощении лиганд может специфически связываться с полипептидом, который экспрессируется на стволовых или стволовоподобных клетках или индуцированных плюрипотентных стволовых клетках. Полипептид на поверхности клетки может представлять собой МИС1 (муцин-1) или МИС1*, 88ЕА3 (стадиеспецифический эмбриональный антиген-3), 88ЕА4, Тга 1-81 (кератансульфатный антиген) или Тга 1-60. Лиганд может представлять собой антитело или фактор роста. Предпочтительно, антитело может специфически связываться с Р8МСРК или С-10 Р8МСРК. Предпочтительно, фактор роста может представлять собой ΝΜ23 дикого типа, или мутант ΝΜ23-8120& или БЕСЕ.

В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к способу культивирования стволовых или стволовоподобных клеток или индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, включающему воздействие на клетки средой, содержащей агенты, которые связываются с пептидом, имеющим последовательность Р8МСЕК. В этом аспекте агент может представлять собой антитело, или агент может представлять собой ΝΜ23 дикого типа или мутант ИМ23-8120С.

В еще одном воплощении настоящее изобретение относится к способу культивирования стволовых или стволовоподобных клеток или индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, включающему воздействие на клетки средой, содержащей агенты, секретируемые МиС1*-положительными раковыми клетками. МиС1*-положительные клетки могут представлять собой Τ47Ό, ΖΚ-75-30 или ΖΚ-75-1.

В еще одном аспекте изобретение относится к способу культивирования стволовых или стволовоподобных клеток или индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, включающему воздействие на клетки кондиционированными средами от МИС1*-положительных раковых клеток. МИС1*положительные клетки могут представлять собой, в частности, Τ47Ό, ΖΚ-75-30 или ΖΚ-75-1.

В одном из аспектов используемая поверхность может предпочтительно не представлять собой Ма1пде1. и в присутствии фибробластных питающих клеток не требуется способ отсечения вручную при удалении клеток.

В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к способу сбора клеток после выращивания клеток в соответствии с вышеприведенным способом, включающему добавление конкурентной молекулы, которая связывается с лигандом, так что клетки высвобождаются из связывания с лигандом или поверхностью.

В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к способу сбора клеток после выращивания клеток в соответствии с вышеуказанным способом, включающему отщепление линкера, связанного с поверхностью, который непосредственно или опосредованно прикреплен к клеткам, так что клетки высвобождаются с поверхности.

В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к способу идентификации состояния дифференцировки клеток, включающему использование антитела против МИС1* для связывания с клетками, где положительный сигнал в отношении антитела против МИС1* указывает на плюрипотентное клеточное состояние, а связывание клеток с незахваченным МИС1 указывает на состояние дифференцировки клеток. В этом способе дополнительно могут осуществлять выделение клеток из смешанной популяции стволовых и стволовоподобных клеток или индуцированных плюрипотентных стволовых клеток и вновь дифференцирующихся клеток, включающее использование антитела против МИС1* для связывания с

- 2 026732 клетками, где положительный сигнал в отношении антитела против МиС1* указывает на плюрипотентное клеточное состояние, а связывание клеток с незахваченным МиС1 указывает на состояние дифференцировки клеток. В частности, в этом способе дополнительно могут осуществлять приведение в контакт клеток с антителами к маркерам стволовых или стволовоподобных клеткок или индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, где положительный сигнал в отношении маркера стволовых или стволовоподобных клеток или индуцированных плюрипотентных стволовых клеток указывает на наличие плюрипотентного состояния стволовых клеток. В частности, клетки могут быть приведены в контакт с антителами против МиС1* и против Тга 1-81, против Тга 1-60, 88ЕА3 или 88ЕА4.

В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к способу детектирования раковых стволовых клеток с использованием антитела против МиС1* для связывания с клетками, где положительный сигнал в отношении антитела против МиС1* указывает на раковые стволовые клетки. В этом способе могут дополнительно осуществлять приведение в контакт клеток с антителами к маркерам стволовых клеток, где положительный сигнал в отношении маркера стволовых клеток указывает на присутствие раковых стволовых клеток.

В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к способу модуляции культивирования, развития или роста и ингибирования дифференцировки стволовых или стволовоподобных клеток или индуцированных плюрипотентных стволовых клеток на поверхности, включающему прикрепление клеток к поверхности непосредственно или опосредованно при помощи лиганда, который связывается с клетками, и воздействие на клетки средой, содержащей агенты, которые связываются с пептидом, имеющим последовательность Р8МСРК Агент может димеризовать МиС1*, для того чтобы способствовать росту и ингибированию дифференцировки, или агент может ингибировать димеризацию МиС1*, для того чтобы способствовать дифференцировке.

В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к способу разделения типов клеток, включающему создание пространственного адреса на поверхности для ряда лигандов, обладающих аффинностью в отношении разных типов клеток или в отношении специфических маркеров, которые идентифицируют стадию или тип клетки, и добавление клеток к этой поверхности, где клетки пространственно разделяются в зависимости от того, какой лиганд связывается с клетками. Поверхность может представлять собой частицу или наночастицу.

В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к способу имплантации в организм-хозяин поверхности, несущей прикрепленные лиганды, представляющие собой лиганды стволовых или стволовоподобных клеток или индуцированных плюрипотентных стволовых клеток. Хозяин может представлять собой пациента. В частности, лиганды могут представлять собой факторы роста для стволовых или стволовоподобных клеток или индуцированных плюрипотентных стволовых клеток хозяина.

В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к способу имплантации в организм-хозяин поверхности, несущей клетки, прикрепленные при помощи лигандов, которые связываются с поверхностью и клетками.

В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к способу пролиферации стволовых или стволовоподобных клеток или индуцированных плюрипотентных стволовых клеток ίη νίνο, включающему введение в организм-хозяин поверхности, несущей прикрепленные лиганды, представляющие собой лиганды стволовых или стволовоподобных клеток или индуцированных плюрипотентных стволовых клеток.

В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к композиции, содержащей поверхность, с которой связан белок А или белок С посредством аффинного взаимодействия, где белок А или белок С связан с антителом, специфическим в отношении полипептида, специфически экспрессирующегося в стволовых или стволовоподобных клетках или индуцированных плюрипотентных стволовых клетках, и МиС1* димеризующий агент. Аффинное взаимодействие может осуществляться через взаимодействие комплекса никеля с нитрилотриуксусной кислотой (ΝΤΑ-Νί) с поверхностью. Полипептид может представлять собой МиС1 или МиС1*, 88ЕА3, 88ЕА4, Тга 1-81 или Тга 1-60. МНС1* димеризующий агент может представлять собой NМ23 дикого типа или мутант NМ23-§120С.

В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к способу пролиферации стволовых или стволовоподобных или индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, включающему приведение в контакт поверхности, с которой связан белок А или белок С посредством аффинного взаимодействия, где белок А или белок С связан с антителом, специфическим в отношении полипептида, специфически экспрессирующегося в стволовых или стволовоподобных клетках или индуцированных плюрипотентных стволовых клетках, с образцом, содержащим клетки, и с МНС1* димеризующим агентом.

Краткое описание графических материалов

На фиг. 1 показано, что человеческие эмбриональные стволовые клетки (Η9δ), прикрепленные к Майг§е1, растут, по существу, на 100% плюрипотентными (ОСТ4+) при культивировании с антителом против МиС1* в минимальных средах в сравнении с меньшим количеством клеток и большей дифференцировкой при культивировании со стандартным ЬРСР и в кондиционированных средах от фибробластных питающих клеток. ΌΑΡΙ (4',6-диамидино-2-фенилиндол) окрашивает ядра всех клеток. Пунктирные линии обозначают границу недифференцированного фрагмента колонии. В лунках, обработанных

- 3 026732 антителом против МиС1*, недифференцированные стволовые клетки растут до границ лунок;

на фиг. 2 показано, что после 18 пассажей человеческих эмбриональных стволовых клеток на Ма1пде1 с антителом против МиС1* и только минимальных средах, кариотип ВС01у/ЬОС не изменялся;

на фиг. 3Ά-3Ό показано, что человеческие эмбриональные стволовые клетки, культивированные на

Ма1пдс1 с антителом против МиС1* и только минимальных средах, способны дифференцироваться до 3 генеративных линий: А) ОСТ4-отрицательная указывает на то, что клетки дифференцированы; Б) положительная в отношении альфа-фетопротеина указывает на дифференцировку в сторону развития эндодермальной генеративной линии; В) положительная в отношении нестина указывает на дифференцировку в эктодермальную генеративную линию; и Г) положительная в отношении гладкомышечного актина указывает на дифференцировку в мезодермальную генеративную линию;

на фиг. 4 показано, что поверхности, покрытые антителом против МиС1*, поддерживают рост стволовых клеток при культивировании только в минимальных средах для стволовых клеток или ЬРСР вместе с кондиционированными средами от фибробластных питающих клеток. Нерелевантное антитело, нанесенное на другую поверхность, не вызывало адгезию стволовых клеток, и клетки погибли в течение 24 ч;

на фиг. 5А-5В - изображения человеческих стволовых клеток, прикрепленных к Ма1пде1 после множественных пассажей в культуре, содержащей только антитело против МИС1* и минимальные среды. Изображения слева демонстрируют ΌΑΡΙ окрашивание ядер всех клеток, а панели справа демонстрируют корреляцию 1:1 с окрашиванием ОСТ4. Вместе они демонстрируют, что все клетки остаются ОСТ4+, что указывает на плюрипотентность;

на фиг. 6Α1-Ό2 - изображения клеток Ьи Εδ Η9δ, растущих на поверхностях с антителом против МиС1*: А) культивированных только в минимальных средах на 3 сутки (А1) и 7 сутки (А2); Б) минимальных средах вместе с 80 нг/мл антитела против МИС1* на 3 сутки (В1) и 7 сутки (В2); В) в 4 нг/мл ЬРСР и 50% кондиционированных средах от фибробластов Ηδ27 на 3 сутки (С1) и 7 сутки (С2); Ό1, Ό2) клетки из лунок А и В собирали путем добавления свободного пептида Р8МСРК (МИС1* внеклеточный домен), который высвобождает клетки с поверхности; клетки повторно высевали на поверхностях со свежим антителом против МИС1*, к которым они прикреплялись и пролиферировали;

на фиг. 7 - график роста стволовых клеток на поверхностях, покрытых антителом против МИС1*, или тем же самым антителом, связанным с бета-циклодекстрином. Продемонстрирована усиленная клеточная адгезия и рост, когда антитело связано с декстрином;

на фиг. 8 показано, что клетки Ьи Εδ могут быть культивированы путем прикрепления их к поверхности, покрытой антителами, которые связываются с маркерными белками клеточной поверхности стволовых клеток δδΕΑ4 и Тга 1-81 при культивировании в минимальных средах вместе с 80 нг/мл антитела против МиС1*;

на фиг. 9 показано, что клетки Ьи Εδ на Ма1пде1 растут, по меньшей мере, также, как в уровне техники, когда их культивируют в минимальных средах вместе с ΝΜ23. На графиках приведено сравнение роста клеток Ьи Εδ Η9 на МаЬтде1, когда их культивируют в стандартных кондиционированных средах с 4 нг/мл ЬРСР вместе с Ηδ27 от фибробластов (контроль), и роста в минимальных средах для стволовых клеток вместе с ΝΜ23 в указанных концентрациях. Процентную долю недифференцированного роста рассчитывали при помощи слепого подсчета недифференцированных и дифференцированных колоний, пересчитанных затем в виде процентной доли. Только клетки, которые были полностью недифференцированными, засчитали как недифференцированные;

на фиг. 10 - рост клеток Ьи Εδ на поверхностях, покрытых антителом против МИС1*, ковалентно связанным с циклодекстраном, и культивированных до готовности делиться в минимальных средах вместе с ΝΜ23 в указанных концентрациях. Один набор клеток сначала культивировали в 4 нг/мл ЬРСР вместе с 50% кондиционированными средами (СМ) от фибробластов Ηδ27 в течение первых 24 ч. График демонстрирует, что ЬРСР и СМ не благоприятствуют клеточному росту или состоянию дифференцировки при добавлении соответствующих количеств ΝΜ23;

на фиг. 11А-11С показано, что стволовые клетки прилипают и культивируются на поверхностях, покрытых ΝΤΑ-Νί, с которыми сначала связывали лиганды ΝΜ23, имеющие гистидиновую концевую последовательность, пептид КСИ и белок С, а затем антитело против δδΕΑ4 и Тга 1-81, с последующими ростом клеток Ηιι Εδ Η9 и образованием колоний. На графиках даны количества недифференцированных и дифференцированных колоний, подсчитанные на 3 сутки (В-С). Представлены изображения репрезентативных колоний стволовых клеток, приведенных на графике фиг. 11А;

на фиг. 12 показано, что кондиционированные среды от МиС1*-положительных раковых клеткок (Са СМ) способствуют росту и ингибируют дифференцировку Ьи Εδ клеток в гораздо большей степени по сравнению со стандартными кондиционированными средами от фибробластов (СМ). Дополнительно, ΝΜ23 действовал гораздо лучше по сравнению со стандартным ЬРСР при добавлении к Са СМ;

на фиг. 13А-13С - изображения роста клеток Ьи ВС01у/ЬОС Εδ на адсорбированном супернатанте гибридомных клонов, каждый из которых секретирует разные моноклональные антитела. Таким образом, идентифицированы моноклональные антитела, которые в наилучшей степени обеспечивают возможность адгезии стволовых клеток;

на фиг. 14 представлен график твердофазного иммуноферментного анализа (ΕΜδΑ), в котором су- 4 026732 пернатанты гибридом тестировали в отношении их способности связываться с делеционными мутантами пептида Р8МСРР, в котором отсутствуют 10 аминокислот с любого из Ν- или С-концов. Гибридомы, которые делают возможным прикрепление стволовых клеток к поверхности, покрытой их супернатантом, также демонстрировали связывание с пептидом С-10 Р8МСРР (ΌΤΙΝνΗΌνΕΤΟΡΝΟΥΚΤΕΑΑδΡΥΝΕΤΙδΌνδνδΌν). Авторы изобретения предположили, что антитела, связанные с более отдаленными фрагментами внеклеточного домена МИС1*, в большей степени дают возможность стволовым клеткам прикрепляться к поверхности;

на фиг. 15А-15Ь показаны изображения иммуноцитохимического (1СС) окрашивания человеческих эмбриональных стволовых клеток Н9 до и после начала их дифференцировки. Антитело против МИС1* окрашивало все клетки недифференцированных колоний и локализовалось вместе с ОСТ4, который представляет собой золотой стандарт среди показателей плюрипотентности (фиг. 15А, 15В). Антитело νυ4Η5, которое идентифицирует полноразмерный МИС1, не окрашивало какие-либо из недифференцированных клеток (фиг. 15С). Тем не менее, когда клетки дифференцировались, наблюдалась обратная картина МиС1. Не обнаружено никакого окрашивания МиС1* или окрашивания ОСТ4 (фиг. 15Ό, 15Е). Но каждая клетка была положительно окрашенной в отношении полноразмерного МиС1 (фиг. 15Р). Аналогично, недифференцированные стволовые клетки были положительно окрашенными в отношении NМ23, лиганд МиС1* и NМ23 точно локализовались вместе с МиС1* и ОСТ4 (фиг. 15О-15Ц;

на фиг. 16А-16В показано, что антитело против МиС1*, добавленное в среды для роста стволовых клеток, увеличивает рост человеческих гематопоэтических стволовых клеток (Н8С§) (А). (В) РАС8анализ (сортировка клеток с активацией флуоресценции) демонстрирует, что количество клеток, которые остаются гематопоэтическими стволовыми клетками, СО34+/СЭ38-, повышалось с увеличением концентрации антитела против МиС1*. Наоборот, количество клеток, которые прогрессируют до следующей стадии предшественника 0034+/0038+, повышалось по мере уменьшения концентрации антитела против МиС1*. Эти результаты демонстрируют, что стимуляция рецептора фактора роста МиС1* ингибирует дифференцировку Н8С;

на фиг. 17А-17В - сканированные РАС8 изображения нейрональных стволовых клеток (А) и фетальных клеток печени (В). Клетки получали от поставщика и немедленно подвергали окрашиванию флуоресцентно меченым антителом против МиС1* и меченым антителом (НРМУ), которое распознает дистальный фрагмент полноразмерного МиС1. Сканированные РАС8 изображения демонстрируют, что МиС1 в наибольшей степени связан с МиС1* в обоих типах ранних предшественников. Последующие эксперименты продемонстрировали, что антитело против МиС1* стимулирует рост обоих типов клеток в зависимости от концентрации;

на фиг. 18 - график роста фетальных клеток печени в зависимости от концентрации антитела против МиС1*, демонстрируя, что МиС1* клетки-предшественники могут быть выделены и могут развиваться путем стимуляции рецептора МиС1 *;

на фиг. 19 - диаграмма колоний стволовых клеток после того, как клетки 1ш Е8 Н9 были высеяны на антитела против МиС1* или антитела против 88ЕА4, нанесенные в 12-луночные планшеты, затем культивированы с 8 нМ NМ23 или 4 нг/мл ЬРСР вместе с 50% кондиционированными средами от фибробластов Н827.

Подробное описание изобретения

В настоящей заявке на изобретение использование единственного числа подразумевает также множественное число.

Использованный здесь термин рецептор фактора роста МиС1 (МСРР) представляет собой функциональное определение, обозначающее фрагмент рецептора МиС1, который взаимодействует с активирующим лигандом, таким как фактор роста или модифицирующий фермент, такой как расщепляющий фермент. Область МСРР в МиС1 представляет собой внеклеточный фрагмент, который наиболее близок к клеточной поверхности, и определяется большей или всей частью Р8МСРР, как определено ниже. МСРР включает как немодифицированные пептиды, так и пептиды, которые претерпевают ферментативные модификации, такие как, например, фосфорилирование, гликозилирование и тому подобное.

Использованный здесь термин первичная последовательность рецептора фактора роста МиС1 (Р8МСРР) относится к пептидной последовательности, которая определяет большую или всю часть МСРР в некоторых случаях, и функциональные варианты и фрагменты пептидной последовательности. Р8МСРР определен как 8ЕЦ ГО N0: 1 и все ее функциональные варианты и фрагменты, имеющие любое целое число аминокислотных замен вплоть до 20 (т.е. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20) и/или любое целое число аминокислотных добавок или делеций вплоть до 20 по Ν-концу и/или С-концу. Функциональный вариант или фрагмент в вышеприведенном контексте относится к такому варианту или фрагменту, обладающему способностью специфически связываться с, или иначе специфически взаимодействовать с, лигандами, которые специфически связываются с, или иначе специфически взаимодействуют с, пептидом 8ЕЦ ГО N0: 1, в то же время не связываясь сильно с идентичными областями других пептидных молекул, идентичных им самим, так что пептидные молекулы будут обладать способностью агрегироваться (т.е. подвергаться спонтанной агрегации) с другими идентичными пептидными молекулами. Один из примеров Р8МСРР, который представляет собой функциональный

- 5 026732 вариант пептида ΡδΜΟΡΚ 8ЕО ΙΌ N0: 1, представляет собой 8Е0 ГО N0: 2, который отличается от 8Е0 ГО N0: 1 включением последовательности -8ΡΥ- вместо -8ΚΥ-.

Использованный здесь МиС1* относится к белку МИС1 с усеченным Ν-концом, так что внеклеточный домен, по существу, состоит из Ρ8Μ0ΡΚ (8Е0 ГО N0:1).

Термин поверхность, использованный в контексте клетки, связанной с поверхностью, может представлять собой твердый субстрат, или пористый субстрат, или другие нетвердые субстраты.

Использованный здесь термин минимальные среды может представлять любые среды, которые содержат минимальные питательные вещества, возможные для клеточной культуры, как правило без присутствия смеси неопределенных агентов, такой как кондиционированные среды от клеток или сыворотка крови живого хозяина. Использованный здесь термин минимальные среды для роста стволовых клеток может представлять собой любую из сред, содержащих минимальные питательные вещества, возможные для культуры стволовых клеток или стволовоподобных клеток. Они также обозначаются как минимальные среды или ММ. Как можно видеть, используемые в настоящем изобретении минимальные среды не ограничены минимальными средами, приведенными в примерах, и могут охватывать многочисленные типы растворов с определенными компонентами.

Использованные здесь стволовоподобные клетки обладают некоторыми из свойств стволовых клеток. Например, они обладают некоторой способностью к самообновлению. Они: а) экспрессируют или индуцируются к экспрессии ОСТ4, 80X2 и NΑN00, или КЬР4; или б) они экспрессируют высокие уровни МиС1* на своей поверхности. примеры стволовоподобных клеток включают клеткипредшественники, плюрипотентные стволовые клетки, клетки, подвергающиеся процессу индуцирования плюрипотентности, раковые клетки, раковые стволовые клетки, гематопоэтические стволовые клетки, ίΡ8 (индуцированная плюрипотентная стволовая клетка) и некоторые из продуцирующих антитела клеток гибридомы, но не ограничиваются ими.

Использованный здесь термин индуцированные плюрипотентные стволовые клетки или ΪΡ8 относится к типу плюрипотентных стволовых клеток, искусственно полученных из неплюрипотентных клеток, как правило взрослых соматических клеток, путем индукции вынужденной экспрессии некоторых генов.

Использованный здесь термин стимулятор МиС1* относится к любой молекуле, которая способна вызывать активность МИС1*, такую как димеризация МИС1* или расщепление МИС1 с образованием МИС1*.

Свободный текст перечня последовательностей.

В отношении использования нуклеотидных символов, отличных от а, д, с, (, следуют конвенции, изложенной в νΐΡ0 81апбаг1 8Т.25, приложение 2,

Табл. 1, где к представляет собой ( или д; η представляет собой а, с, ( или д; т представляет собой а или с; г представляет собой а или д; 8 представляет собой с или д; \ν представляет собой а или (; и у представляет собой с или к

ΟТINVΗ^VЕТ^РN^ΥКТЕΑΑ8ΚΥN^ТI8^V8V8^VΡРΡР8Α^8ΟΑ (8ЕО ГО N0: 1) описывает расположенную проксимально к мембране внеклеточную область МИС1 от аминокислоты 1110 до 1155 (ВЗМСРК).

ΟТINVΗ^VЕТ^РN^ΥКТЕΑΑ8ΡΥN^ТI8^V8V8^VΡРΡР8Α^8ΟΑ (8ЕО ГО N0: 2) описывает вариант расположенной проксимально к мембране внеклеточной области МИС1 от аминокислоты 1110 до 1155 (вариант Ρ8Μ0РΚ).

^РN^ΥКТЕΑΑ8ΚΥN^ТI8^V8V8^VΡРΡР8Α^8ΟΑ (8ЕО ГО N0: 3) описывает последовательность Ρ8Μ0РΚ с делецией десяти аминокислот по Оконцу (N-10 Ρ8Μ0РΚ).

ΟТINVΗ^VЕТ^РN^ΥКТЕΑΑ8ΚΥN^ТI8^V8V8^V (8ЕО ГО N0: 4) описывает последовательность Ρ8Μ0РΚ с делецией десяти аминокислот по С-концу (С-10 Ρ8Μ0РΚ).

Стволовые или стволовоподобные клетки или индуцированные плюрипотентные стволовые клетки на поверхности.

В настоящем изобретении раскрыты способы культивирования или развития стволовых или стволовоподобных клеток или индуцированных плюрипотентных стволовых клеток и предшественников, включающие прикрепление лигандов к белкам клеточной поверхности на твердые подложки, которые могут содержать в себе ростовую среду или которые могут быть добавлены к ростовой среде.

В настоящем изобретении раскрыты новые способы и поверхности для культивирования клеток. Эти способы особенно полезны для роста и поддержания клеток, которые не являются адгезивными. Эти способы особенно полезны для культивирования стволовых, стволовоподобных клеток и клетокпредшественников.

Поверхности.

В изобретении раскрыты новые поверхности и способы выращивания клеток. Эти поверхности особенно полезны для культивирования неадгезивных клеток, стволовых клеток и стволовоподобных клеток, включая индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ίΡ8) и некоторые клеткипредшественники. Раскрытые здесь способы решают проблему того, как сохранить ценные клетки при замене культуральных клеточных сред. Множество из существующих способов культивирования клеток

- 6 026732 разработано для адгезивных клеток, поскольку они прикрепляются к поверхности колбы. Старая жидкая среда может быть удалена и заменена на новую среду без взмучивания клеток, которые прикреплены к поверхностям содержащего ее сосуда. Некоторые из способов по изобретению также полезны тем, что они дают возможность для удерживания ценных факторов роста, тогда как менее дорогостоящие факторы, которые необходимо менять чаще, подвергаются замене. Другие способы по изобретению обеспечивают большую площадь поверхности для прикрепления клеток и тем самым увеличивают выход клеток при использовании относительно небольшого пространства и небольшого объема культуральной среды. Эти способы в общем включают прикрепление как непосредственное, так и опосредованное лигандов к поверхности, где лиганды способны связываться с молекулами на клеточной поверхности.

Поверхности, которые подходят для применения в этих способах, могут представлять собой мембраны или быть пористыми по природе. Описанные здесь поверхности могут представлять собой полимеры, поверхности, покрытые полимерами, циклодекстрином или циклодекстраном. Поверхности могут представлять собой поверхности с пространственной адресацией, поверхность гранул, частиц или наночастиц. Гранулы, частицы или наночастицы могут находиться в растворе в свободном состоянии или могут быть соединены промежуточными молекулами. Например, мембрана может состоять из полимерного вещества и может иметь прикрепленные к ней гранулы или частицы, несущие лиганды, которые способствуют связыванию между клетками и поверхностью. Изобретение включает применение этих поверхностей для выращивания ίη νίίτο, ех νίνο и ίη νίνο. Поверхности по изобретению могут быть использованы для культивирования клеток ίη νίίτο. Альтернативно, поверхности по изобретению могут быть имплантированы в организм хозяина. Поверхности могут нести клетки, такие как стволовые клетки, которые имплантированы в качестве терапии. Например, поверхности по изобретению с или без прикрепленных растущих стволовых клеток могут быть трансплантированы таким образом, что поверхность повышает эффективность приживления. В другом случае, трансплантированная поверхность несет лиганды для рекрутинга клеток хозяина или стволовых клеток на площади поверхности или для того, чтобы способствовать росту целевых клеток в данном месте. Например, поверхности, которые привлекают и способствуют росту стволовых клеток, могут быть помещены в сустав для содействия замене хряща. Поверхности по изобретению могут быть формованными или нанесены на каркас, так чтобы клетки, по существу, образовали трехмерную структуру. Например, материал может быть изготовлен в форме уха, затем покрыт одной из описанных здесь поверхностей, которые дают возможность прикрепления и роста стволовых или стволовоподобных клеток, которые в конечном итоге развиваются в более зрелые клетки или ткани в пределах формы данного каркаса. Дополнительно предполагается, что поверхности и композиции по изобретению могут быть использованы для покрытия имплантируемых устройств, которые могут представлять собой структурированные или неструктурированные пористые или твердые поверхности. Указанные устройства могут доставлять или рекрутировать стволовые клетки или клетки-предшественники в какой-либо области для целей восстановления или регенерации тканей или клеток. Стенты, например, могут быть покрыты любой из поверхностей или композиций по изобретению для восстановления или регенерации кровеносных сосудов. Стенты, покрытые поверхностями по изобретению, например ΝΜ23-8120Ο, и к которым прикреплены стволовые клетки или клетки-предшественники, могут быть имплантированы в организм хозяина или другого субъекта для доставки клеток или факторов роста, которые стимулируют клетки хозяина. Эти способы могут быть осуществлены ίη νίίτο, ех νίνο или ίη νίνο.

Лиганды.

Лиганды, которые способствуют связыванию клеток с поверхностями или которые стимулируют клеточную пролиферацию, могут быть прикреплены непосредственно к поверхности или опосредованно, например, к полимерам, прикрепленным к поверхности. Например, антитела, которые распознают рецепторы клеточной поверхности, могут быть ковалентно прикреплены к полимеру, такому как циклодекстрин или циклодекстран, который был прикреплен или адсорбирован на поверхности, см. примеры 6, 1012 и фиг. 7, 10. Лиганды, которые обладают некоторой аффинностью в отношении молекул на клеточной поверхности, возможно прикрепляются к этим поверхностям для того, чтобы способствовать прикреплению и росту клеток. Эти лиганды могут специфически связываться с молекулами клеточной поверхности, такими как рецепторы фактора роста. Лиганды могут представлять собой белки, пептиды, небольшие молекулы, антитела, поликлональные или моноклональные антитела, биспецифические антитела, моновалентные или двухвалентные антитела, производные антитела, такие как РаЬк, одноцепочечные антитела, генетически сконструированные производные или производные, в которых вариабельный домен антитела встроен в другой белок, так что он способен специфически связываться со своей мишенью. Альтернативно, лиганды не обязательно должны обладать специфической аффинностью в отношении молекул клеточной поверхности. Например, лиганды, прикрепленные к поверхности, могут способствовать адгезии клеток на поверхности путем неспецифического взаимодействия. Неспецифическое взаимодействие может быть химическим или биологическим по своей природе. Поверхности, дериватизированные гидрофильными группировками, такими как гидроксилы, или гидрофобными головными группами, такими как метильные группы, могут удерживать клетки неспецифически посредством гидрофобного взаимодействия. Поверхности, несущие заряженные химические или биологические объекты, могут адсорбировать клетки посредством ионного взаимодействия. Клетки дополнительно могут захватываться

- 7 026732 поверхностями, несущими объекты, которые обладают некоторой специфичностью в отношении клеток, включая пептиды, содержащие последовательность КОБ, полилизин, положительно или отрицательно заряженные поверхности, коллаген, ламинин и другие компоненты внеклеточного матрикса, включая Ма1пдс1 и подобные Ма1пдс1 вещества, но не ограниченные ими. Клетки также могут захватываться другими типами химически модифицированных поверхностей. Например, поверхности, покрытые ΝΤΆ-Νί и другими хелатами металлов, неспецифически связываются с клетками и стволовыми клетками, см. пример 15 и фиг. 12.

В предпочтительном воплощении группировки, которые обладают специфической аффинностью в отношении молекул клеточной поверхности, прикреплены к поверхностям для облегчения прикрепления стволовых клеток. Например, к поверхностям прикреплены антитела, которые связываются с белками клеточной поверхности, представляющими собой специфические маркеры стволовых клеток, такие как 88ЕА3, 88ЕЛ4 или Тга 1-81, или Тга 1-60. Стволовые клетки прилипают к этим поверхностям посредством специфического взаимодействия между белками клеточной поверхности и когнатным антителом на планшете для выращивания. Клетки затем могут быть культивированы стандартными способами или новыми способами по изобретению, которые стимулируют МИС1*, см. примеры 1-4, 8-10, 12 и фиг. 110. В другом случае лиганд, прикрепленный к поверхности, представляет собой фактор роста или фрагмент фактора роста. В другом случае лиганд, прикрепленный к поверхности, представляет собой антитело или фрагмент антитела, распознающие молекулу клеточной поверхности, которая может представлять собой рецептор фактора роста. В другом случае комплекс лиганда прикреплен к поверхностям или иммобилизован на них, где по меньшей мере один член комплекса обладает аффинностью в отношении молекулы клеточной поверхности или обеспечивает клетки агентом, который модулирует рост или дифференцировку клетки. Например, белок О может быть адсорбирован на, или специфически прикреплен к, поверхности путем взаимодействия с гистидиновой концевой последовательностью ΝΤΑ-Νί, и антитело, которое распознает поверхностный маркер стволовой клетки, прикреплено к поверхности путем его взаимодействия с белком О, см. пример 14, фиг. 11.

Смешанные поверхности.

В некоторых случаях желательно обеспечить поверхности, которые предоставляют смесь лигандов и компонентов. Они могут быть биологическими или химическими по природе или могут представлять собой смесь биологических и химических компонентов. Например, поверхности могут быть покрыты смесью фактора роста или эквивалентного активирующего антитела вместе с компонентами внеклеточного матрикса, такими как коллаген или ламинин. Поверхности, покрытые смесью ламинина и факторов роста, или антителами также способствуют прикреплению и росту стволовых клеток. Например, авторы изобретения продемонстрировали, что покрытия поверхности, состоящие из коллагена или ламинина и антитела, специфического в отношении маркера клеточной поверхности, полезны для роста стволовых и стволовоподобных клеток.

В другом примере ламинин или коллаген смешивают с лигандом маркера клеточной поверхности. Эксперименты продемонстрировали, что смешивание ламинина с антителом против МИС1* уменьшало количество антитела, которое требуется для прикрепления стволовых клеток и клеточного роста и развития нормальных колоний стволовых клеток. В еще одном аспекте изобретения смешанные частицы прикреплены к поверхности, где один или более чем один компонент представляет собой лиганды, облегчающие прикрепление клеток к поверхности, а другой(ие) представляет(ют) собой компонент(ы), который(е) обеспечивает(ют) клетку агентом, который влияет на функцию клетки. примеры функциональных агентов, которые могут быть прикреплены к поверхности, включают агенты, способствующие росту, дифференцировке или индуцирующие плюрипотентность, но не ограничиваются ими.

Способы прикрепления лиганда.

Лиганды, которые способствуют клеточной адгезии или представляют собой факторы роста, могут быть прикреплены к поверхностям множеством путей, включая ковалентное связывание, например с использованием связывающих химических соединений ΕΟί'.'/ΝΗ8 (1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид/И-гидроксисукцинимид) или малеимида, но не ограничиваясь ими. Альтернативно, лиганды по изобретениию могут быть прикреплены к поверхности путем нековалентного взаимодействия или аффинного взаимодействия. Например, лиганды по изобретению могут быть обеспечены гистидиновыми концевыми последовательностями, затем прикреплены к поверхности через группировку комплекса никеля с нитрилотриуксусной кислотой (ΝΤΑ-Νί). Взаимодействия при участии аффинной концевой последовательности могут быть использованы для создания ростовой поверхности, подходящей для культивирования клеток. Например, группировку ΝΤΑ-Νί прикрепляют к колбе для клеточной культуры, и имеющий гистидиновую концевую последовательность лиганд захватывается при помощи ΝΤΑ-Νί. Лиганд непосредственно или опосредованно связывается с рецептором клеточной поверхности для заякоривания клетки на поверхности. Если лиганд также представляет собой фактор роста, то он служит для того, чтобы вызвать клеточную адгезию и способствовать пролиферации, см. пример 14, фиг. 11.

В одном из воплощений лиганд представляет собой белок О или А, с которым связывается антитело, распознающее рецептор клеточной поверхности, такой как МИС1* или РОРК (рецептор фактора роста фибробластов). Белок О или А может быть неспецифически адсорбирован на поверхности, ковалентно

- 8 026732 связан или прикреплен путем взаимодейстивия с партнером связывания аффинной концевой последовательности. Например, колбы для клеточных культур могут быть покрыты группировкой ΝΤΑ-Νΐ таким образом, что имеющий гистидиновую концевую последовательность белок С или А может захватываться поверхностью. Затем добавляют антитело против рецептора клеточной поверхности, после чего оно связывается с белком С или А, иммобилизованным на поверхности.

В еще одном аспекте лиганды и агенты, которые прикреплены к поверхностям, могут быть прикреплены к поверхности таким образом, что они могут высвобождаться с поверхности с изменением локального окружения, или таким образом, что клетка может поглощать агент. Агенты могут быть прикреплены к поверхности таким образом, что они высвобождаются с поверхности как только они распадаются, или они могут высвобождаться в ответ на стимул. Например, агенты могут быть прикреплены к поверхности с использованием фоточувствительных или химически чувствительных линкеров таким образом, что агент может высвобождаться в ответ на световой или химический сигнал. Некоторые линкеры отщепляются в ответ на изменения рН. Гены или генные продукты, такие как ОСТ4, ΝΑΝ0& 80X2, КЬР4 или ΝΜ23, которые индуцируют плюрипотентность, или гены или их продукты, которые вызывают дифференцировку, такие как ттК-145 (микро-РНК), могут быть добавлены к средам или прикреплены к поверхности. Они могут высвобождаться с поверхностей путем распада с течением времени или в ответ на специфический сигнал, такой как специфическая длина волны света для расщепления прикрепляющих связей.

В предпочтительном воплощении лиганд, прикрепленный к поверхности или иммобилизованный на ней, представляет собой фактор роста, который распознает рецептор фактора роста на клеточной поверхности. Антитела, которые активируют рецепторы фактора роста на клеточной поверхности, могут быть прикреплены к поверхностям с использованием любого из ранее описанных способов или их комбинаций. В одном из случаев фактор роста представляет собой фактор роста фибробластов (РСР) или основной фактор роста фибробластов (ЬРСР), и молекула на клеточной поверхности, в отношении которой лиганд обладает аффинностью, представляет собой рецептор фактора роста фибробластов (РСРК). Альтернативно, лиганд может представлять собой антитело, которое распознает РСРК. В еще одном аспекте изобретения фактор роста представляет собой эпидермальный фактор роста (ЕСР), а молекула на клеточной поверхности, в отношении которой лиганд обладает аффинностью, представляет собой рецептор эпидермального фактора роста (ЕСРК). В еще одном аспекте аффинный лиганд представляет собой фактор стволовых клеток (8СР) или другой агент, включающий антитело, которое активирует с-Кй/8СРК. Лиганды, которые прикреплены к ростовой поверхности, могут также представлять собой лиганд Р11 3, тромбопоэтин (ТРО), интерлейкин-2 (1Ь-2), 1Ь-3, 1Ь-п или антитела, которые имитируют их влияние в отношении их когнатных рецепторов.

Лиганды МИ С1*.

В более предпочтительном воплощении лиганд, прикрепленный к ростовой поверхности, обладает аффинностью в отношении белка клеточной поверхности МИС1. В еще одном более предпочтительном воплощении лиганд обладает аффинностью в отношении Р8МСРК фрагмента (МИС1*) белка. В еще одном более предпочтительном воплощении лиганд вызывает димеризацию МИС1*. В одном из случаев лиганд представляет собой антитело против МИС1* (примеры 1, 4, 7, 10 и фиг. 1, 6Α,Β,Ό, 8). В другом случае лиганд представляет собой ΝΜ23 или вариант, такой как 8120С, или любой другой мутант или производное, которые способствуют образованию димера или действуют как димер, см. примеры 9, 12, 14, 15, 20 и фиг. 9-12 и 19. Поверхность может быть конфигурирована таким образом, что ΝΜ23 презентируется клетке в виде димера. В другом случае лиганд, прикрепленный к поверхности роста, представляет собой антитело, которое связывается с внеклеточным доменом МИС1. Предпочтительны антитела, которые связываются с фрагментом МИС1, который остается прикрепленным к клеточной поверхности после отщепления тандемного повторяющегося домена и выталкивания с клеточной поверхности. Например, двухвалентные антитела, которые связываются с последовательностью Р8МСРК МИС1, активируют функцию рецептора фактора роста отщепляемого МИС1 и стимулируют клеточную пролиферацию. Поликлональные или моноклональные антитела, генерированные путем иммунизации, по меньшей мере, фрагментом пептида Р8МСРК, прикреплены к поверхностям для того, чтобы способствовать прикреплению клеток к поверхности и для стимуляции роста клеток путем активации рецептора фактора роста МИС1*.

Могут быть получены или выбраны как поликлональные, так и моноклональные антитела, а также природные и неприродные производные антитела, таким образом, чтобы они лучше подходили для адгезии стволовых клеток по сравнению с антителами, полученными с использованием, или выбранными в отношении аффинности к, полноразмерной последовательности Р8МСРК. Путем иммунизации кроликов пептидом, соответствующим последовательности внеклеточного домена МИС1* но с делецией 10 аминокислот, расположенных проксимально относительно клеточной поверхности, С-10 Р8МСРК, были получены поликлональные антитела, которые оказались более эффективными для того, чтобы способствовать адгезии стволовых клеток по сравнению с антителами, полученными против полноразмерного пептида Р8МСРК или N-10 Р8МСРК (ΟΙΑΌΥΚΤΙАА8К¥\1.Т181)\А\М)\2Ш1У8АО8С.А) (8ЕО ГО N0: 3), имеющего делецию большей части дистальных 10 аминокислот, см. пример 16 и фиг. 13, 14. Ан- 9 026732 титела, которые обладают усиленной способностью связываться со стволовыми клетками, могут также быть выделены из поликлональных антител, индуцированных против полноразмерного пептида ΡδΜΟΡΚ, путем аффинной очистки их с поверхностей, которые предоставляют пептид С-10 ΡδΜΟΡΚ или другой Ν-концевой фрагмент.

Гибридомные клоны, которые секретируют моноклональное антитело, связывающееся с С-10 ΡδΜΟΡΚ пептидом, но не с Ν-10 ΡδΜΟΡΚ пептидом, представлены для облегчения адгезии стволовых клеток к поверхности, см. фиг. 13 А-С, фиг. 14. В противоположность этому моноклональные антитела, связывающиеся с Ν-10 ΡδΜΟΡΚ пептидами, но не с С-10 ΡδΜΟΡΚ пептидами, почти не способствуют адгезии стволовых клеток. Оба типа моноклональных антител способны стимулировать клеточный рост при их добавлении к культуральным средам.

В предпочтительном воплощении стволовые клетки культивируют на поверхности, предоставляющей ΝΜ23, являющийся лигандом рецептора фактора роста МИС1*. ΝΜ23 может быть непосредственно или опосредованно прикреплен к поверхности. В одном из аспектов изобретения ΝΜ23 или мутант δ120Ο, который способствует димеризации, неспецифически адсорбирован на поверхностях для роста клеток, см. пример 15, фиг. 12. В еще одном аспекте изобретения поверхность сначала дериватизируют партнером связывания аффинной концевой последовательности, таким как ΝΤΑ-Νί, который связывается с белками или пептидами, имеющими гистидиновую концевую последовательность. ΝΜ23 с гистидиновой концевой последовательностью затем нековалентно связывают с этой ΝΤΑ-Νί поверхностью. ΜυС1*-положительные клетки, такие как стволовые клетки и некоторые предшественники, затем добавляют к этим ΝΜ23 поверхностям, вследствие чего клетки прилипают к поверхностям и растут. В более предпочтительном воплощении мутант ΝΜ23 δ120Ο ковалентно связан с циклодекстраном.

Способы сбора.

В еще одном аспекте изобретения описаны новые способы сбора клеток с поверхностей по изобретению. Изобретение включает эти способы сбора, которые полезны для поверхностей по настоящему изобретению, а также для множества других систем выращивания клеток. Изобретение также включает применение стандартных способов сбора, таких как отсечение вручную и ферментативное расщепление, в отношении новых поверхностей по изобретению. Некоторые способы сбора клеток зависят от идентичности компонентов поверхности. Например, клетки, выращенные путем адсорбции на поверхностях антитела, могут высвобождаться при добавлении избытка пептидов, имеющих ту же самую последовательность, как эпитоп антитела. Например, если антитело распознает внеклеточный домен ΜΌΟ1*, то клетки могут высвобождаться при добавлении избытка пептида, имеющего некоторую или всю последовательность внеклеточного домена ΜΌΟ1*. Свободный пептид конкурирует с рецептором ΜΌΟ1* на клетках за связывание с антителом, прикрепленным к поверхности. Связывание пептида с антителом высвобождает клетку, см. пример 4, фиг. 6Ό. Клетки, культивированные на поверхностях, предоставляющих антитела, прикрепленные к поверхности путем связывания с белком Ο или А, высвобождаются с поверхности при добавлении избытка Рс-фрагментов или избытка нерелевантного антитела. Поскольку белок Ο связывается с Рс-доменами, свободный Рс конкурирует с когнатным антителом за связывание с прикрепленным к поверхности белком Ο или А, и высвобождает клетки в комплексе с антителом. Клетки, культивированные на поверхности с лигандами, прикрепленными посредством взаимодействия с партнером связывания аффинной концевой последовательности, высвобождаются при добавлении агента, который препятствует взаимодействию с партнером связывания аффинной концевой последовательности, или при добавлении избытка фрагмента аффинной концевой последовательности, которая взаимодействует с партнером связывания. Например, клетки, растущие на ΝΤΑ-Νί поверхностях, с которыми связаны лиганды, имеющие гистидиновую концевую последовательность, высвобождаются при добавлении имидазола, нерелевантного гистидинового пептида или избытка по меньшей мере фрагмента партнера связывания лиганда, прикрепленного к поверхности. В случае поверхностей ΝΜ23 клетки могут высвобождаться при добавлении избытка пептида, имеющего последовательность, по существу, такую же, как, по меньшей мере, фрагмент внеклеточного домена ΜΌΟ1*, так что добавление избытка пептида конкурирует с рецептором клеточной поверхности ΜΌΟ1* за связывание с прикрепленным к поверхности ΝΜ23, тем самым высвобождая клетки. Альтернативно, ΝΜ23 получают с аффинной концевой последовательностью, которая облегчает прикрепление к поверхности. Стратегии, которые вмешиваются во взаимодействие между аффинной концевой последовательностью и поверхностью, высвобождают ΝΜ23 и прикрепленные клетки с этой поверхности. Аналогично, имеющий Ηίδ-концевую последовательность белок Ο (вместе с антителом) или имеющий Ηίδ-концевую последовательность ΝΜ23, могут высвобождаться с поверхности при добавлении: а) имидазола (в концентрации 0,5М); или б) избытка (ΗΪ8)₆ пептида.

Любая пара партнеров связывания аффинной концевой последовательности, которая может быть использована для прикрепления лигандов к поверхности и прерывания взаимодействия с партнером связывания аффинной концевой последовательности, высвобождает стволовые клетки с поверхности. примеры подходящих пар партнеров связывания аффинной концевой последовательности включают ΝΤΑΝί/гистидиновую концевую последовательность, слияние глутатион/ΟδΤ, мальтозу/белок, связывающий мальтозу, и биотин/стрептавидин, но не ограничиваются ими.

- 10 026732

Ростовые среды.

Описанные здесь поверхности и способы сбора совместимы со стандартными способами культивирования стволовых клеток, а также новыми способами. Для стандартных сред для культивирования стволовых клеток требуется добавление экзогенного основного фактора роста фибробластов (ЬРОР) и рост на фибробластных питающих клетках, поскольку для роста стволовых клеток до настоящего времени требуются неидентифицированные факторы роста, которые секретируются этими клетками. Стволовые клетки также можно выращивать на Ма1гфе1 в соответствии со стандартным протоколом за исключением того, что дополнительно к ЬРОР кондиционированные среды от фибробластных питающих клеток (СМ) могут быть добавлены до приблизительно 30-50% сред. Инактивированные человеческие фибробластные питающие клетки крайней плоти (Н§27) типично используют для роста эмбриональных стволовых клеток.

Авторы изобретения продемонстрировали, что стандартные ростовые среды совместимы с ростом на поверхностях по изобретению, пример 4, фиг. 6С и пример 3, фиг. 4. Аналогично росту на Майт§е1, для ЬРОР-опосредованного роста также требуются кондиционированные среды от фибробластов для поддержки роста стволовых клеток на описанных здесь поверхностях по изобретению. Предпочтительны культуральные среды, содержащие стимуляторы МИС1* или димеризующие агенты. Как антитела, которые распознают пептид Р8МОРК, так и ΝΜ23, дикого типа или мутант §1200, представляют собой предпочтительные факторы роста и могут заменять ЬРОР и кондиционированные среды от фибробластов, см. фиг. 6, 9-12. Рост человеческих эмбриональных стволовых клеток, прикрепленных к МаОтде1, Се11 §1аг1 (1иуйгодеи), ОеИгех (1иуйгодеи) или любым поверхностям по изобретению, значительно превосходит рост, когда антитела против МИС1* или ΝΜ23-§1200 добавлены к минимальным средам для стволовых клеток вместо кондиционированных сред ЬРОР и Н§27; скорость роста, морфология колоний и ингибирование дифференцировки значительно лучше, когда стимуляторами МИС1* заменяют ЬРОР вместе с кондиционированными средами (СМ).

Кондиционированные среды, собранные после выращивания МИС1*-положительных раковых клеток, увеличивают рост стволовых клеток и образование колоний, в то же время ингибируя дифференцировку. Человеческие стволовые клетки, растущие на Ма1пде1, ΝΤΆ-Νί, поверхностях с антителом против МИС1* или поверхностях NΜ23, культивировали в минимальных средах для стволовых клеток вместе с кондиционированными средами, собранными после выращивания МиС1*-положительных раковых клеток. Кондиционированные среды от клеток Τ47Ό, которые представляют собой МиС1*-положительные клетки рака молочной железы, при добавлении к ММ23-§1200 или антителам против МИС1* или ЬРОР значительно улучшали рост стволовых клеток, образование колоний и ингибирование дифференцировки по сравнению с кондиционированными средами от фибробластных питающих клеток Н§27, см. примеры 14, 15 и фиг. 11, 12. Описанные здесь поверхности и способы сбора могут быть использованы для клеток, отличных от стволовых клеток.

Антитела против МИС1* для сортировки клеток.

Очистка. Чистые популяции плюрипотентных стволовых клеток могут быть очищены из смешанных популяций клеток. Массивный рост стволовых клеток может приводить к образованию некоторого количества стволовых клеток, которые спонтанно дифференцированы. Таким образом, могут быть необходимы высокоэффективные способы захвата желаемых плюрипотентных клеток и отбрасывания недифференцированных. МИС1* представляет собой маркер клеточной поверхности в отношении плюрипотентности, который утрачивается перед ОСТ4, когда клетки начинают дифференцироваться. Чистые популяции плюрипотентных (МиС1*-положительных) стволовых клеток могут быть выделены из смешанных популяций путем захвата их на колонке, дериватизированной с антителом против МИС1*. Наоборот, МИС1* аффинную колонку используют для удаления МиС1*-положительных клеток от дифференцированных клеток перед трансплантацией для снижения риска образования тератомы.

Во множестве случаев желательно отделять стволовые клетки и клетки-предшественники в соответствии со стадией их дифференцировки. Авторы изобретения ранее демонстрировали, что плюрипотентные стволовые клетки презентируют усеченную форму МИС1*, а не полноразмерный белок МИС1; после начала дифференцировки отщепление МПС1 прекращается, и клетки в основном являются отрицательными в отношении МИС1* и положительными в отношении полноразмерной формы. Имеется множество антител, которые связываются с тандемными повторяющимися единицами полноразмерного МИС1, например имеющиеся в продаже антитела УИ4Н5 или НМРУ. Расщепление МИС1 до формы рецептора фактора роста МИС1* высвобождает эти фрагменты с клеточной поверхности, так что антитела против тандемных повторов не будут окрашивать МИС1*. Хотя последовательность Р8МОРК представлена как в МИС1, так и в его усеченной форме (МИС1*), антитела против последовательности Р8МОРК не связываются с полноразмерным МИС1, поскольку эпитоп замаскирован. На фиг. 15Л-Ь показаны изображения иммуноцитохимического (1СС) окрашивания человеческих эмбриональных стволовых клеток Н9 до и затем после начала их дифференцировки. Кроличье поликлональные антитело, индуцированное против полноразмерного пептида Р8МОРК, окрашивало, по существу, каждую клетку недифференцированной колонии. ОСТ4, представляющий собой золотой стандарт индикатора плюрипотентности стволовых клеток, точно локализовался в месте окрашивания антителом против МИС1* (также названным как антитело против Р8МОРК), фиг. 15А, В. Антитело УИ4Н5, которое связывается с дистальными тандем- 11 026732 ными повторами полноразмерного МиС1, не окрашивает никакую из недифференцированных клеток, фиг. 15С. Однако, когда эти же клетки оставляли дифференцироваться путем удерживания ЬРОР в течение 14 суток, обнаружили обратную МиС1 картину. Не наблюдалось никакого окрашивания МиС1* или окрашивания ОСТ4, фиг. 15Ό, Е, но каждая клетка окрашивалась положительно в отношении полноразмерного МиС1, фиг. 15Р. Аналогично, недифференцированные стволовые клетки окрашивались положительно в отношении ММ23, представляющего собой лиганд МНС1*, и ММ23 точно локализовался вместе с МНС1*, фиг. 15Ο-Ι и ОСТ4, фиг. 151-Ь. Расщепляющие ферменты ММР14, ММР16 и АОАМ-17 вовлечены в расщепление МиС1. Они также локализованы вместе с МНС1* на недифференцированных стволовых клетках, Шкйа с1 а1., РЬо8 ΟΝΕ, 2008.

Следовательно, антитела против МНС1* возможно в комбинации с другими антителами, включающими антитела против NМ23, ММР14, ММР16, АОАМ-17 и ОСТ4, могут быть использованы для идентификации и выделения плюрипотентных стволовых клеток из смеси. Антитела против 88ЕА3/4 или Тга 1-81/1-60 также могут быть использованы в сочетании с антителами против МНС1* для идентификации плюрипотентных стволовых клеток. Совокупности недифференцированных и дифференцированных стволовых клеток могут окрашиваться антителами, которые связываются с пептидом Р8МОРК, и антителами, которые связываются с фрагментом МНС1, который высвобождается когда он усечен. Стандартные способы разделения клеток, такие как РАС8 (сортировка клеток с активацией флуоресценции), затем могут быть использованы для отделения клеток, презентирующих МНС1*, от клеток, которые презентируют полноразмерную форму белка. В некоторых случаях желательно удалять те стволовые клетки, которые дифференцированы, от клеток, которые остаются плюрипотентными. В других случаях желательно удалять те стволовые клетки, которые остаются плюрипотентными (МиС1*-положительными), поскольку они могут повышать риск образования тератомы при трансплантации хозяину. Комбинации антител против МиС1*, т.е. антител против Р8МОРК и антител NМ23, также могут быть использованы для идентификации плюрипотентных стволовых клеток и также для идентификации тех клетокпредшественников, которые могут развиваться путем стимуляции МНС1*.

Распознавание и выведение раковых стволовых клеток.

Раковые клетки увеличивают экспрессию МНС1*, но не полноразмерного МНС1, когда они приобретают резистентность к химиотерапевтическим лекарственным средствам. Эти клетки, которые резистентны к химиотерапии, также называют раковыми стволовыми клетками. Таким образом, антитела против МиС1*, возможно комбинированные с другими антителами, включающими антитела против NМ23, ММР14, ММР16, АОАМ-17 и ОСТ4, могут быть использованы для идентификации раковых стволовых клеток. В одном из воплощений изобретения антитела против МНС1* и комбинации этих других антител используют для выведения раковых стволовых клеток из организма пациента, например из крови пациента.

РАС8 и рост человеческих стволовых клеток.

В настоящем изобретении дополнительно раскрыто применение антител против МИС1*, или NМ23 либо NМ23 8120О или других мутантов, которые способствуют димеризации для стимулирования роста и ингибирования дифференцировки клеток-предшественников, которые экспрессируют усеченную форму МиС1 (МиС1*). Хотя расщепление МНС1 прекращается, когда стволовые клетки начинают дифференцироваться, расщепление возобновляется на более поздних стадиях. Например, гематопоэтические стволовые клетки (Н8С) экспрессируют усеченную форму МНС1* и могут пролиферировать при воздействии на клетки МНС1* димеризующих агентов. Гематопоэтические стволовые клетки являются 0034положительными и СО38-отрицательными, когда они рассматриваются как стволовые клетки. Когда они развиваются в следующую стадию дифференцировки, они становятся СО34-положительными и С.О38положительными. Авторы изобретения получили человеческие Н8С из пуповинной крови и культивировали их в минимальных средах для стволовых клеток вместе с антителами против МНС1* в различных концентрациях. Клетки выращивали в течение 11 суток со свежими антителами, добавленными на 5 сутки после высевания. Клетки анализировали и сортировали при помощи РАС8. Фиг. 16А и В, пример 18 демонстрируют, что количество клеток, которые остаются гематопоэтическими стволовыми клетками, СЭ34+/СО38-, увеличивается с увеличением концентрации антитела против МНС1*. Наоборот, количество клеток, которые развиваются в следующую стадию предшественника, СО34+/СО38+, увеличивается с уменьшением концентрации антитела против МИС1*. Эти результаты демонстрируют, что стимуляция рецептора фактора роста МНС1* ингибирует дифференцировку Н8С.

Гематопоэз осуществляется в печени плода и на ранней стадии жизни. Человеческие фетальные клетки печени подвергали сортировке при помощи РАС8 с использованием антитела, которое связывается с последовательностью Р8МОРК внеклеточного домена МНС1*, и νυ4Η5, которое представляет собой антитело, имеющееся в продаже, которое связывается с тандемными повторяющимися единицами полноразмерного МиС1. Сканированное изображение РАС8 на фиг. 17В демонстрирует, что фетальные клетки печени являются в основном МиС1*-положительными и отрицательными в отношении полноразмерной молекулы. МиС1*-положительные фетальные клетки печени выделяли и размножали путем их выращивания в минимальных средах вместе с антителами против МиС1*. График на фиг. 18 демонстрирует, что рост фетальных клеток печени значительно увеличивается в оптимальной концентрации

- 12 026732 антитела против МИС1*. Рост уменьшается, когда антитело вводят в избытке и имеется одно антитело, прикрепленное к каждому рецептору, нежели одно антитело, связывающееся с каждым из двух рецепторов. Аналогично, недифференцированные стволовые клетки могут быть отделены от клеток, которые дифференцированы, путем осуществления РЛС8 или других способов разделения с использованием связывающих агентов, таких как антитела, которые связываются с областью Р8МСРК или дистальным фрагментом полноразмерного белка МИС1.

Другие типы клеток могут презентировать усеченную форму МиС1 и могут быть выделены или удалены из клеточных популяций на основе того, распознают ли антитела фрагмент Р8МСРК белка МИС1, связанного с клетками.

Объединение захвата, выращивания, высвобождения и сортировки.

В некоторых случаях может быть желательно отделять один тип клеток от другого до, во время или после периода роста. В одном из способов каждый пространственный адрес на поверхности предоставляет отличающийся лиганд, каждый из которых обладает аффинностью в отношении другого типа клеток или специфических маркеров, которые идентифицируют стадию или тип клеток. Клетки добавляют к поверхности, и посредством аффинного взаимодействия клетки начинают пространственно разделяться в соответствии с маркерами на поверхности каждого типа клеток. Разделенные клетки могут быть индивидуально собраны для культивирования в разных местах или могут быть культивированы в виде смеси, затем собраны позже на месте. В одном из способов разные пути прикрепления используют для прикрепления разных маркер-специфических лигандов. Например, в одной из областей лиганды к МИС1*, представляющему собой маркер плюрипотентных клеток, прикрепляют к поверхности посредством взаимодействия гистидиновой концевой последовательности/ΝΤΑ-Νί, тогда как в другой области антитела к маркеру клеток, дифференцирующихся в эктодермальную линию, прикрепляют к поверхности при помощи белка С. Таким образом, недифференцированные клетки высвобождаются при добавлении имидазола, и эктодермальные клетки высвобождаются при добавлении избытка Рс. В другом способе две или более чем две поверхности, каждая из которых предоставляет лиганд с отличающейся аффинностью, располагаются в отдельных областях. Две или более чем две поверхности могут быть соединены при помощи проточных каналов. В одном из воплощений смесь клеток вводят на первую поверхность, которая захватывает клетки, которые экспрессируют когнатную молекулу для лиганда, который данная поверхность предоставляет. Супернатант или элюат затем вводят на вторую поверхность, которая захватывает клетки, которые предоставляют когнатную молекулу клеточной поверхности, которая облегчает связывание с их поверхностью. Супернатант или элюат затем вводят на третью поверхность и так далее, так что желаемые типы клеток захватываются поверхностями с пространственным адресом. Этот способ используют для разделения клеток по типу или для отделения и затем роста клеток. Могут быть использованы каналы и клапаны, так чтобы поток обеспечивался во время клеточного разделения, но затем ограничивался таким образом, чтобы клетки специфического типа могли быть культивированы в условиях, оптимальных для этого конкретного типа клеток.

Способы по изобретению подходят для разделения клеток, которые могут претерпевать дифференцировку во время способа выращивания. Системы, состоящие из смешанных поверхностей, каждая из которых предоставляет аффинный лиганд для конкретного маркера состояния дифференцировки или типа клеток, используют в динамической системе для сортировки потомства в зависимости от состояния дифференцировки. Клетки исходно прикрепляются к первой поверхности путем взаимодействия с одним из белков их клеточной поверхности, представляющим собой маркер исходного состояния дифференцировки, который больше не экспрессируется клетками или их потомством на другой стадии дифференцировки. Таким образом, клетка может быть высвобождена, после чего она может перемещаться в новую область, предоставляющую лиганд, обладающий аффинностью к маркеру клеточной поверхности, который определяет новое состояние их дифференцировки. Эта сортировка может осуществляться пространственно, например, расположение в проточном канале, введение супернатанта на новую поверхность, или самосортировка, при которой клетки высвобождаются из одной области (может представлять собой частицу) и перемещаются во вторую область (может представлять собой соседнюю частицу), на которой иммобилизован аффинный лиганд в отношении другого клеточного маркера. В одном из воплощений гранулы или частицы, которые предоставляют лиганды с отличающейся аффинностью, смешивают вместе, и клетки прикрепляются к грануле/частице, для которых они презентируют на своей поверхности когнатные молекулы. В этом случае гранулы или частицы также обладают свойством, которое дает возможность их сортировки после прикрепления клеток. Например, магнитные гранулы, которые предоставляют лиганд(ы), обладающий(ие) аффинностью в отношении СО34+/38-гематопоэтических стволовых клеток, смешивают с немагнитными гранулами, которые предоставляют лиганд(ы), обладающие аффинностью в отношении ί'.Ό34+/ί'.Ό38+ клеток-предшественников. После культивирования клеток гранулы, несущие клетки СЭ34+/38-. выделяют и собирают магнитным способом, тогда как оставшиеся гранулы содержат популяцию клеток СЭ34+/38+. Альтернативно, пространственные расположения, гранулы или частицы могут нести прикрепленные к ним группировки, которые могут захватываться другими поверхностями для очистки. В качестве примера гранулы, которые предоставляют аффинный лиганд и лиганд для очистки, захватывают все желаемые типы клеток путем взаимодействия между аффинным

- 13 026732 лигандом и когнатными рецепторами клеточной поверхности; лиганд для очистки прикрепляет гранулы к специфическому пространственному адресу посредством связывания между лигандом для очистки и группировкой на второй поверхности. Изобретение включает применение этого способа для сортировки клеток из смешанной совокупности, где клетки находятся на разных стадиях дифференцировки. Изобретение также включает применение этого способа для сортировки клеток в ситуациях с культурой клеток, когда индуцируется плюрипотентность клеток, и желательно выбирать и амплифицировать те клетки, которые обладают свойствами, подобными свойствам стволовых клеток, в разные моменты времени во время процесса индукции плюрипотентности.

В альтернативном способе клетки разделяют путем иммобилизации на частицах, которые предоставляют лиганды, специфические в отношении различных типов клеток. Смесь клеток вводят в смесь частиц. Клетки разделяют на частицах, которые предоставляют лиганд, обладающий аффинностью в отношении молекулы клеточной поверхности. Клетки, несущие частицы, затем могут быть разделены перед культивированием или культивированы все вместе и затем разделены после периода выращивания. Частицы, несущие клетки, разделяют при помощи множества средств, основанных на свойствах самих частиц или свойствах лигандов, прикрепленных к частицам. Например, частицы могут быть разделены на основе размера, заряда, плотности, оптических свойств, электромагнитных свойств и тому подобное. Эти свойства могут представлять собой свойства, присущие самим частицам, или свойства прикрепленного лиганда. Например, сами частицы могут быть флуоресцентными, или лиганды, прикрепленные к частицам, могут быть флуоресцентными. Частицы легко разделять по свойствам, включая магнитные, заряженные, флуоресцентные или электронные характеристики, но не ограничиваясь ими. Альтернативно, могут быть использованы частицы, которые предоставляют лиганды, несущие лиганд, обладающий второй аффинностью. В этом случае в дополнение к тому, что частица несет лиганд, облегчающий прикрепление к клетке, она также может нести группировку, которая облегчает прикрепление частицы, несущей клетку, к отдельным поверхностям или областям.

В еще одном аспекте изобретения одна поверхность предоставляет два или более чем два разных лиганда, которые имеют разные функциональные группы. В некоторых случаях два или более чем два лиганда более избирательны по сравнению с единичным лигандом в отношении прикрепления специфических клеток. В другом случае первый лиганд опосредует прикрепление клеток, тогда как второй лиганд нацеливает комплекс клетка/поверхность на специфическую область, которая может представлять собой другую поверхность или другую область. Таким образом, поверхности, которые представляют собой изделия или частицы, несущие лиганды, которые захватывают специфический тип клеток, могут быть очищены от нецелевых клеток посредством прикрепления ко второй поверхности или области. В других случаях может быть желательно захватывать два или более чем два разных типа клеток, обладающих способностью разделять клетки в зависимости от типа до, после или во время периода роста. Последнее осуществляют путем использования поверхностей или частиц, которые предоставляют первый лиганд, облегчающий прикрепление специфического типа клеток, и второй лиганд, который нацеливает поверхность на специфическую область. Нацеливающий лиганд может представлять собой химическую или биологическую группировку, которая нацеливает частицу путем связывания с объектом в другой области. Альтернативно, нацеливающий лиганд может представлять собой объект, который придает некоторые свойства частицам, которые позволяют отделять их от других частиц. Например, лиганд может представлять собой флуоресцентную группировку, краситель, заряженную группировку или группировку, обладающую оптическими или электромагнитными свойствами. В еще одном аспекте изобретения нацеливающий лиганд не представляет собой лиганд сам по себе, а скорее представляет собой специфическое свойство частицы.

Поверхности и новые факторы роста по изобретению предусматривают использовать для роста стволовых клеток, клеток-предшественников и других МиС1*-положительных клеток в различных форматах, включающих колебательные контейнеры, роллерные флаконы, рост в суспензии и применение в любом типе герметизирующего сосуда, включающих живого хозяина, но не ограничивающихся ими. Герметизирующий сосуд может поддерживаться в движении для предотвращения адгезии клеток на сосуде. Взаимодействие между иммобилизованными на поверхности лигандами и их когнатными мишенями на клетках дает возможность замены сред без потери клеток. Когда желательно собирать или выводить клетки, тогда поверхности, которые могут представлять собой частицы, могут быть выделены путем центрифугирования, осаждения, при помощи электромагнитного или электрического поля. Агенты могут быть добавлены для высвобождения клеток с поверхностей. Избыток аффинных лигандов может быть добавлен в свободной форме в растворе таким образом, чтобы они конкурировали за связывание с рецепторами на клеточной поверхности и тем самым высвобождали клетки с частиц. В одном из воплощений, если аффинный лиганд представляет собой антитело, то добавляют избыток Ес-фрагментов антител, которые служат для высвобождения антитела с частиц, и клетка вместе с активирующим лигандом становятся свободными в растворе. В еще одном воплощении лиганд представляет собой ЫМ23 или его мутант.

В настоящем изобретении дополнительно раскрыто использование ИМ23 дикого типа или мутантов, способствующих образованию тетрамеров и гексамеров для индукции дифференцировки стволовых клеток, клеток-предшественников или клеток, которые были индуцированы к тому, чтобы стать стволо- 14 026732 воподобными клетками, путем введения нуклеиновых кислот, κίΡΗΚ, микро-РНК или белков.

Изобретение также включает способы индукции дифференцировки стволовых клеток и стволовоподобных клеток. Лиганды, которые блокируют взаимодействие МИС1* и его димеризующих лигандов, индуцируют дифференцировку. Например, добавление пептида, содержащего достаточное количество последовательности внеклеточного домена МИС1* для блокирования взаимодействия ΝΜ23 и внеклеточного домена МИС1*, индуцирует дифференцировку. Аналогично, добавление низких концентраций РаЬ (моновалентного) антитела против МИС1* предотвращает димеризацию рецептора, что способствует плюрипотентности, и приводит в результате к инициации дифференцировки. Пептид внеклеточного домена МИС1* или РаЬ антител, которые связываются с МИС1*, могут быть добавлены в культуральные среды или прикреплены к поверхностям. Стволовые клетки могут быть собраны, затем повторно высеяны на поверхности, предоставляющей лиганды, такие как пептид внеклеточного домена МИС1* антитела против МИС1* РаЬ, для индукции дифференцировки. Микро-РНК 145 (т1К-145) подавляет МИС1 и таким образом вызывает дифференцировку. тгК-145 могут быть добавлены к стволовым клеткам и предшественникам в культуре для того, чтобы способствовать дифференцировке. Наоборот, ингибиторы тгК145, такие как κίΡΗΚ, специфические в отношении ιηίΡ-145. могут быть добавлены к растущим стволовым и стволовоподобным клеткам для ингибирования их дифференцировки.

Поверхности роста лиганд-полимер. Прикрепление лигандов по изобретению к полимерам или макромолекулам, таким как декстрин или циклодекстран, значительно улучшает их способность к захвату и росту целевых стволовых клеток и клеток-предшественников. Образующиеся в результате поверхности имитируют лиганды в растворе. Ковалентное прикрепление белков и антител к циклодекстрану, увеличившего клеточную адгезию, значительно уменьшило требуемое количество лиганда по сравнению с количеством, когда лиганд непосредственно адсорбирован на поверхности. Лиганды, такие как NМ23 или антитело против МИС1*, связанные с циклодекстраном, поддерживали рост эмбриональных стволовых клеток в минимальных средах без необходимости наличия в средах дополнительных факторов роста. Антитела и когнатные белки типа антитела против МИС1* и NМ23 также могут быть прикреплены к другим полимерам и другим поверхностям, включающим пористые мембраны и каркасы. Изобретение включает структурированные и неструктурированные поверхности. Например, стенты, искусственные структуры, такие как уши, могут быть покрыты биологическими и/или химическими агентами, которые облегчают прикрепление стволовых клеток и клеток-предшественников. Эти лиганды могут возможно обеспечивать стволовые клетки или клетки-предшественники питательными веществами или сигналами, которые влияют на их рост и/или дифференцировку.

Поверхности роста с синтетическим антителом. Изобретение также охватывает применение синтетических лигандов в качестве факторов роста для сред для роста клеток и также для поверхностных покрытий, облегчающих прикрепление клеток. Например, небольшие молекулы, которые связываются с белками клеточной поверхности, легко идентифицируют с использованием стандартных способов скрининга. Авторы изобретения ранее раскрыли небольшие молекулы, которые связываются с внеклеточным доменом МИС1* и, в частности, с пептидом Р8МСРК. Эти синтетические молекулы можно затем нековалентно или ковалентно прикреплять к поверхностям для адсорбции и роста неадгезивных клеток, таких как стволовые клетки, клеток ίΡδ и ранних предшественников, таких как гематопоэтические стволовые клетки, которые экспрессируют МИС1*. Если синтетические лиганды связываются с рецепторами фактора роста, которые активируются посредством димеризации, то активирующие димеры небольших молекул могут быть получены путем ковалентного связывания двух небольших молекул с получением димеров. В предпочтительном воплощении небольшие молекулы, связанные с пептидом Р8МСРК и небольшими молекулами, связаны таким образом, что они образуют димеры и действуют в качестве искусственных факторов роста. В еще одном аспекте изобретения низкомолекулярные мономеры могут быть прикреплены к поверхности таким образом, что они достаточно близки для того, чтобы вместе вести себя как димер. Т.е. поверхность действует как линкер, так что небольшие молекулы презентируются рецептору клеточной поверхности в определенной геометрии, которая активирует рецептор. Эти низкомолекулярные димеры могут быть использованы тем же самым путем, как природные факторы роста, включая то, что они могут быть добавлены к ростовым средам, а также адсорбированы или ковалентно присоединены к поверхностям. Синтетические поверхности могут быть: а) более дешевыми для изготовления; б) способны к длительному хранению; и в) устойчивыми к распаду. Авторы изобретения ранее описали небольшие молекулы, которые связываются с внеклеточным доменом МИС1* с высокой аффинностью. Низкомолекулярные димеры (двухвалентные), которые имитируют антитела против МИС1*, синтезируют путем связывания небольших молекул с линкером. Синтетические антитела могут быть иммобилизованы непосредственно на поверхностях планшета или при помощи полимерного покрытия.

Объем настоящего изобретения не ограничен конкретными описанными здесь воплощениями. Действительно, различные модификации изобретения дополнительно к описанным здесь понятны специалистам в данной области техники из предшествующего описания и прилагаемых графических материалов. Предполагается, что такие модификации находятся в объеме прилагаемой формулы изобретения. Следующие примеры предложены в качестве иллюстрации настоящего изобретения, но не в качестве ограничения.

- 15 026732

Примеры

Пример 1. Плюрипотентные стволовые клетки, прикрепленные к Ма1гще1 и культивированные в минимальных средах вместе с антителами против МИС1*, пролиферируют быстрее и с меньшей дифференцировкой по сравнению с ростом в дополненных ЬРСР и кондиционированных средах от фибробластных питающих клеток.

Н9 НЕЗСз (^1Се11) или ВС0И/НОС (ЧпуПгодеп) культивировали при 37°С и 5% СО₂ в инактивированных митомицином-С человеческих фибробластах крайней плоти Ηδ27 (АТСС) в 6-луночных планшетах (ΒΌ Ра1соп). Культуральные среды НЕЗС состояли из ОМЕМ/Р12/С1и1аМАХ I с 20% нокаутированным заменителем сыворотки, 1% концентрированным раствором заменимых аминокислот, 0,1 мМ 3меркаптоэтанола (все от НпЧгодеп) и 4 нг/мл человеческого основного фактора роста фибробластов (ЬРСР, Рерго(есН). Клетки высевали с отсечением вручную каждые 5-7 суток в соотношении 1:3 и среду меняли каждые 48 ч. В некоторых экспериментах НЕЗСз выращивали на Ма1гще1 (ΒΌ Вюзаепсез) с культуральными средами НЕЗС, дополненными 30% Нз27-кондиционированной средой и 4 нг/мл ЬРСР. В других экспериментах, в которых добавляли антитело против МИС1*, кондиционированные среды и ЬРСР не использовали; авторы изобретения называют их как минимальные среды (сокращение ММ).

На фиг. 1 показана ОСТ4 иммунофлуоресценция колоний человеческих стволовых клеток, обработанных антителом против МИС1*. Клетки Н9 диссоциировали путем трипсиновой обработки и высевали в 8-луночных слайдах, предварительно покрытых Ма1гще1 в концентрации 4 х 10⁴ клеток/лунку. Среды меняли и антитела добавляли через сутки в конечной концентрации 1 мкг/мл для двухвалентного антитела против МиС1* в течение пяти недель. Клетки окрашивали при помощи ОСТ4 специфического антитела (Зап!а Οήζ, клоны Н-134 и С-10) и ИАР1.

На фиг. 1 показано, что после пяти (5) недель роста человеческие эмбриональные стволовые клетки Н9 выросли на 100% плюрипотентными при культивировании в минимальных средах вместе с антителами против МиС1*. Клетки росли идентично, за исключением того, что они потребляли минимальные среды вместе с ЬРСР и 30% кондиционированные среды от питающих клеток, пролиферировали в меньшей степени и были более дифференцированными. Сравните окрашивание ядер ЭАР1 с окрашиванием ОСТ4, которое идентифицирует плюрипотентные клетки. Пунктирные линии обозначают границу недифференцированных фрагментов.

Пример 2. Плюрипотентные стволовые клетки, культивированные с антителом против МИС1* на Ма1гще1. поддерживают стабильный кариотип и нормально дифференцируются.

Клетки ВС01у/НОС Ни ЕЗ (1пх11годеп) высевали на Ма1гще1 и культивировали в минимальных средах (см. пример 1) вместе с кроличьим поликлональным антителом против МИС1* (3ΚΥ 2а) в концентрации 80 нг/мл за 18 пассажей в течение шести (6) месяцев. Клетки осаждали, ДНК экстрагировали и передавали стороннему исполнителю для кариотипирования. На фиг. 2 показано, что кариотип по завершении 18 пассажей не менялся. Необходимо отметить, что эта линия стволовых клеток имеет трисомальные аномалии; тем не менее подходит, что кариотип является стабильным и не изменяется при культивировании с антителом против МИС1* в отсутствие других факторов роста.

Из той же самой партии клеток ВС01у/НОС после множества пассажей недифференцированные стволовые клетки собирали путем обработки коллагеназой, затем суспендировали в минимальных средах в течение 14 суток. Необходимо иметь в виду, что в течение этого периода антитело против МИС1* удаляют для того, чтобы способствовать дифференцировке. Последнее дает клеткам возможность образовывать эмброидные тела, которые высевали на желатине в течение 7 суток, затем окрашивали с антителами, которые распознают маркеры трех генеративных линий: фиг. 3 А) Клетки были ОСТ4-отрицательными, указывая на то, что они дифференцированы; В) положительными в отношении альфа-фетопротеина, который представляет собой эндодермальный маркер; С) нестин-положительными, представляющим собой эктодермальный маркер; и Ό) положительными в отношении гладкомышечного актина, представляющего собой маркер для мезодермальной генеративной линии.

Пример 3. Поверхности, которые способствуют росту плюрипотентных стволовых клеток.

Поверхности, которые предоставляют лиганд, который связывается и димеризуется с внеклеточным доменом МИС1*, дают возможность использования в отношении плюрипотентных стволовых клеток способа прикрепления к поверхности планшета и также активирования функции рецептора фактора роста МИС1*. Колбы для клеточных культур, чашки Петри или многолуночные планшеты покрывали кроличьим поликлональным антителом, индуцированным против пептида, имеющего последовательность внеклеточного домена МИС1*: С.Т1\\4 ГО\1ПП1%(4кТЕААЗ10Л'ЕТ1З1)УЗУЗ1)УРЕРЕЗАОЗС.А (ЗРГ) ΙΌ ΝΟ: 1). Антитела, которые связываются с последовательностью, приведенной непосредственно выше, названы здесь как антитела против МИС1* или антитела против РЗМСРК Использовали обработанную культуру ткани, а также открытые пластиковые и полистирольные планшеты.

В одном из примеров антитело против МИС1* (2ушеб: сиз1от апНЬобу зеМсе) добавляли в концентрации 30, 100 или 300 мкг/мл в лунки 96-луночных обработанных планшетов для культуры клеток (Т188ие СиНиге Тез! Р1а1е 96Р ТРР #92096) и оставляли адсорбироваться в течение ночи при 4°С. Недифференцированные стволовые клетки ВС01у/НОС (Рпуйгодеп) суспендировали в минимальных средах.

- 16 026732

Минимальные среды представляют собой 400 мл БМЕ/Р12/О1и1аМАХ I (1пуЦгодеп# 10565-018; 100 мл нокаутированного заменителя сыворотки крови (КО-8К, 1пуЦгодеп# 10828-028); и 5 мл 100х МЕМ раствора заменимых аминокислот (1пуЦгодеп# 11140-050); и 0,9 мл (0,1 мМ) β-меркаптоэтанола (55 мМ концентрированный раствор, 1пуЦгодеп# 21985-023). Стволовые клетки ВО01у/ЮО высевали на поверхностях, покрытых антителом против МИС1*, с плотностью 10000 клеток на лунку. Клетки оставляли для адгезии в течение 24 ч. Клетки затем культивировали только в минимальных средах в течение 5 суток со сменой сред каждые 48 ч.

Для сравнения, клетки в контрольных лунках культивировали в средах, дополненных 4 нг/мл ЬРОР и 30% кондиционированных средах от фибробластов Н827. На фиг. 4 приведен график после окрашивания Кальцеин-АМ (Мо1еси1аг РгоЬек), после которого флуоресценцию живых клеток измеряли в зависимости от плотности антитела против МИС1* на поверхности, на которой выращивали эти клетки. График на фиг. 4 демонстрирует, что клетки, растущие на поверхностях с антителом против МИС1*, пролиферируют в отсутствие любого другого фактора роста. Рост только умеренно усиливается после добавления ЬРОР и не охарактеризованных факторов, секретируемых питающими клетками. В качестве отрицательного контроля нерелевантное антитело наносили на поверхности. Стволовые клетки, которые высевали на этих поверхностях, не прилипали и всплывали или погибали к концу 24-часового периода прикрепления.

Параллельно, образующиеся в результате стволовые клетки дважды окрашивали ΌΑΡΙ (краситель для ядер клеток) и антителами против ОСТ4. Корреляция 1: 1 положительной реакции в отношении ОСТ4 и окрашивания ΌΑΡΙ подтверждает, что образующиеся в результате клетки были плюрипотентными, см. фиг. 5.

Пример 4. Человеческие плюрипотентные стволовые клетки пролиферируют на поверхностях с антителом против МИС1* с добавлением стимуляторов МИС1* в раствор или без такого добавления.

Линии человеческих эмбриональных стволовых клеток тестировали в отношении их способности расти на антителе против МИС1*, адсорбированном на любом из обработанных планшетов для культуры ткани, полистирольных планшетах или предметных стеклах. Антитело против МИС1* в концентрации 100 мкг/мл адсорбировали на планшетах и оставляли адсорбироваться при 4°С в течение ночи. Недифференцированные человеческие эмбриональные стволовые клетки Н9 высевали в количестве 10000 клеток или 40000 клеток на лунку 96-луночного планшета или в количестве 25000 клеток на лунку 8луночных планшетов. Во всех случаях недифференцированные стволовые клетки, прикрепленные и пролиферирующие на поверхностях с антителом против МИС1*, культивировали в минимальных средах в отдельности или с антителом против МИС1*, добавленным в минимальные среды для роста стволовых клеток. Недифференцированные стволовые клетки Н9 затем культивировали в: А) минимальных средах; Б) минимальных средах вместе с антителом против МИС1* в концентрации 80 нг/мл; или В) минимальных средах вместе с ЬРОР в концентрации 4 нг/мл и 50% кондиционированных средах от инактивированных фибробластных питающих клеток Н827. Эксперименты осуществляли в трех параллелях. Недифференцированные стволовые клетки прикреплялись к поверхностям с антителом против МИС1*. Недифференцированные колонии росли быстрее всего, когда в минимальные среды также было добавлено антитело против МИС1*. Тем не менее колонии недифференцированных стволовых клеток подобной морфологии и качества развивались через сутки или двое в лунках, которые культивировали в минимальных средах в отдельности. Количество пролифераций и качество колоний недифференцированных стволовых клеток были сравнимы независимо от того, культивировали ли клетки в минимальных средах, минимальных средах вместе с антителом против МИС1* или вместе с ЬРОР и кондиционированными средами от фибробластов. В результате получали плюрипотентные стволовые клетки, которые могут быть разделены между сутками 5 и 7, что является типичным для стволовых клеток, выращенных в соответствии со стандартными ЬРОР протоколами для питающих клеток. На фиг. 6 показаны изображения роста в лунках при культивировании в различных средах: 6А) минимальных средах; 6В) минимальных средах вместе с антителом против МИС1* в концентрации 80 нг/мл; или 6С) минимальных средах вместе с ЬРОР в концентрации 4 нг/мл и 50% кондиционированных средах от фибробластных питающих клеток. Панели, обозначенные 1 (например А1, В1, С1), представляют собой изображения, полученные после 3 суток роста; А2, В2, и В3 представляют собой изображения тех же самых лунок, полученные на 7 сутки.

Пример 5. Способ сбора стволовых клеток.

Стволовые клетки, выращенные в примере 4 выше, готовы для сбора и разделения на 7 сутки. Поскольку клетки были иммобилизованы на поверхностях с антителом против МИС1*, авторы изобретения предположили, что они могут быть высвобождены при добавлении пептида, который может конкурировать с рецептором клеточной поверхности за связывание с антителом против МИС1* на поверхности планшета. Пептид, имеющий последовательность ОΤINVН^VЕΤ^РN^ΥКΤЕΑΑ8КΥN^ΤI8^V8V8^VΡРΡР8Α^8ОΑ (8Еф ΙΌ ΝΟ: 1), соответствует внеклеточному домену рецептора МИС1* и также представляет собой пептид, против которого индуцируется антитело против МИС1*, и назван здесь как пептид МИС1*_ес4 или пептид Р8МОРК. Пептид МИС1*_ес4 добавляли к растущим стволовым клеткам в концентрации 10 мкМ и инкубировали в течение 30 мин. В этот момент обнаружили, что стволовые клетки высвобождались с поверхности. Стволовые клетки собирали в супернатанте, промывали и по- 17 026732 вторно высевали на поверхностях со свежим антителом против МИС1*, к которым клетки прикреплялись и продолжали пролиферировать. Этот способ также успешно осуществляли с использованием линии человеческих эмбриональных стволовых (ЬиЕ§) клеток ВО01у/НОО (Ιηνίίτο^η), затем 1шЕ5> Н98. На фиг. 6Ό показаны стволовые клетки Н9, выращенные на поверхностях с антителом против МИС1*, культивированные из единичных клеток, затем собранные при помощи высвобождения конкурентным пептидом и повторно высеянные на поверхностях со свежим антителом против МИС1*, где они продолжали пролиферировать.

Пример 6. Антитело против МИС1*, связанное с бета-циклодекстрином, стимулирует взаимодействие в растворе фактора роста МИС1* с рецепторами клеточной поверхности.

Антитела против МИС1* ковалентно связывали карбокси-в-циклодекстрином (ί','β-ί'Ό) в соответствии со стандартным протоколом связывания (РгаксЫт С.; Υίβηοη Μ.Κ. 5е1есЦуе οχίάαΐίοη ο£ рптагу αίοο1ο1 дгоир8 ο£ β-сес1οάеxί^^η теФа1ей Ьу 2,2,6,6-ίеί^атеίЬу1ρ^ρе^^ά^ηе-1-οxу1 таФса1 (ТЕМРО). Са^ЬοЬуά^аίе КекеагсЬ 2000. 328(4):585-589). 96-луночные обработанные планшеты для культуры клеток (Т188ие Си11иге Теδί Р1а1е 96Р ТРР #92096) покрывали антителом против МИС1*, связанным с бета-циклодекстрином с концентрацией конечного антитела 0, 10, 30, 100, 300 или 1000 мкг/мл; концентрация бетациклодекстрина в каждой лунке поддерживалась постоянной, тогда как варьировали только концентрацию антитела. В качестве контроля антитела против МИС1* непосредственно адсорбировали на планшетах без циклодекстрина. Готовили суспензии единичных стволовых клеток ВО01у/НОО и клетки высевали с плотностью 10000 клеток/лунку в минимальных средах. Стволовые клетки прикреплялись и пролиферировали на поверхностях с антителом и поверхностях с антителом, связанным с циклодекстрином. Никакие другие факторы роста не добавляли. Через двое суток после высевания живые клетки измеряли с использованием реагента кальцеин-АМ. График на фиг. 7 демонстрирует, что рост стволовых клеток в минимальных средах поддерживается антителами против МИС1*, презентированными на бетациклодекстрине, и что требуемое количество антитела меньше, чем для голого антитела, адсорбированного на планшете для роста, вероятно в виду 3-мерной презентации антитела растущим клеткам.

Пример 7. Антитела против любого антигена клеточной поверхности дают возможность стволовым клеткам прикрепляться к поверхности и пролиферировать в случае культивирования при помощи обычных средств или при добавлении антитела против МИС1* к минимальным средам.

Антитела против §§ЕЛ4, Тга 1-60 и Тга 1-81 способствуют росту плюрипотентных стволовых клеток при культивировании в минимальных средах вместе с антителом против МИС1*. 96-луночные обработанные планшеты для культуры клеток (Т188ие СиНите Те8ί Р1а1е 96Р ТРР #92096) отдельно покрывали в трех параллелях при 4°С антителом против §§ЕЛ4 (§айа Сти/), антителом против Тга 1-60 (§айа Сти/) или антителом против Тга 1-81 (§айа Сти/) в конечных концентрациях 0, 3, 10, 30 и 100 мкг/мл в стерильном РВ§. На следующие сутки клетки промывали РВ§. Человеческие эмбриональные стволовые клетки ВО01у/ЮО (Ιηνίίτο^η), которые выращивали на Ма1пде1 и культивировали в минимальных средах для выращивания стволовых клеток вместе с 30% кондиционированными средами от фибробластов вместе с 4 нг/мл ЬРОР, использовали для приготовления одноклеточных суспензий. Клетки высевали в каждой лунке с плотностью 10000 клеток на лунку в минимальных средах. На следующие сутки среду удаляли из лунок и заменяли на минимальные среды вместе с 80 нг/мл антитела против МИС1*. Среды меняли через сутки и клетки анализировали с использованием реагента кальцеин-АМ. На фиг. 8 показано, что стволовые клетки могут прикрепляться к поверхности посредством взаимодействия с белком клеточной поверхности и его когнатным антителом, затем могут быть культивированы в минимальных средах вместе с антителом против МИС1* или с любыми стандартными средами для роста стволовых клеток.

Аналогично, недифференцированные стволовые клетки Н9 высевали с плотностью 10000 клеток на лунку 96-луночного планшета, на котором ранее адсорбировали антитела против §§ЕЛ4 (100 мкг/мл). Стволовые клетки культивировали в течение восьми (8) суток в минимальных средах для роста стволовых клеток вместе с антителом против МИС1* в концентрации 80 нг/мл. Колонии недифференцированных стволовых клеток развивались и пролиферировали.

Проводили параллельные эксперименты, которые показали, что человеческие эмбриональные стволовые клетки Н9 связаны с антителом против §§ЕЛ4 и антителом против Тга 1-81, которые были адсорбированы на поверхности 96-луночных и 12-луночных планшетов. Клетки затем культивировали в стандартных средах для роста стволовых клеток, содержащих ЬРОР в концентрации 4 нг/мл и 50% кондиционированных средах от фибробластных питающих клеток Н§27, или в минимальных средах вместе с антителами против МИС1* в концентрации 80 нг/мл, или в минимальных средах вместе с рекомбинантными ΝΜ23-8120Ο в концентрации 8 нМ. Во всех случаях образовывались колонии недифференцированных стволовых клеток, которые морфологически идентичны колониям стволовых клеток, выращенным стандартными способами. Когда антитела против МИС1* заменяли нерелевантным антителом или когда клетки культивировали только в минимальных средах, тогда стволовые клетки погибали в течение приблизительно суток.

Пример 8. Добавление пептида МиС1*_еса индуцирует дифференцировку.

Недифференцированные человеческие стволовые клетки, растущие на питающих клетках, Ма1пде1

- 18 026732 или поверхностях для роста, могут быть быстро индуцированы к дифференцировке при добавлении пептида МиС1*еса. Пептид конкурирует с природным лигандом за связывание с рецептором фактора роста МиС1*; взаимодействие природного лиганда с МиС1* способствует росту плюрипотентных клеток. Блокирование этого взаимодействия ингибирует рост плюрипотентных стволовых клеток и вызывает дифференцировку клеток. Стволовые клетки Н9, растущие на Ма1пде1, дифференцировались приблизительно в три раза быстрее после обработки пептидом МиС1*_ес<Р Пептид, представляющий собой внеклеточный домен МиС1*, может быть использован для сбора стволовых клеток с поверхностей, покрытых лигандами МиС1*. Увеличение скорости дифференцировки предотвращали путем инкубирования собранных клеток с антителом против МиС1* для полного удаления пептида, а затем промывания и повторного нанесения.

Пример 9. NМ23 в минимальных средах эквивалентен используемым в уровне техники ЬРСР вместе с кондиционированными средами от фибробластных питающих клеток Н827 для культивирования человеческих стволовых клеток.

Недифференцированные человеческие эмбриональные стволовые клетки Н9 собирали путем отсечения вручную. Частички колоний приблизительно по 0,1 см в ширину смешивали в минимальных средах и однородно распределяли по 24-луночным планшетам, которые покрывали Ма1пде1 для стволовых клеток в соответствии с указаниями производителя. Недифференцированные единицы колоний из (3) лунок 6-луночного планшета переносили в 24-луночный планшет. Рекомбинантные NМ23-8120С (мутант, который предпочтительно образует димеры) в концентрации 4 или 8 нМ в минимальных средах (ММ) сравнивали с уровнем техники, который в настоящее время представляет собой 4 нг/мл ЬРСР (основной фактор роста фибробластов) вместе с 50% кондиционированными средами (СМ) от инактивированных фибробластных питающих клеток Н827. Авторы изобретения также тестировали эффект обработки свежевысеянных клеток ЬРСР/СМ в течение первых 24 ч с последующей заменой на NМ23 в ММ. После 4 суток в культуре подсчитывали количества недифференцированных колоний по сравнению с дифференцированными. Результаты представлены графически на фиг. 9. Столбцы, обозначенные как КОНТРОЛЬ, относятся к стандартному способу культивирования на Ма1гще1 в 4 нг/мл ЬРСР и 50% СМ от инактивированных фибробластных питающих клеток Н827. График демонстрирует, что: 1) клетки, растущие в NМ23+ММ, растут быстрее, чем в ЬРСР+СМ; 2) в NМ23+ММ они менее дифференцированы по сравнению с уровнем техники; 3) добавление ЬРСР+СМ в течение первых 24 ч было несколько хуже, чем непосредственное выращивание в NМ23+ММ; и 4) имеется тенденция, свидетельствующая о том, что наивысшая концентрация NМ23 (8 нМ) является наилучшей.

Клетки разделяли на 5 сутки и повторно высевали на МаРтдеЬ В течение следующих 5 суток клетки культивировали при 4, 8, 16, 32 или 64 нМ. Результаты демонстрируют, что увеличение концентрации NМ23-8120С приводило к лучшему результату. Концентрации 16 и 32 нМ NМ23-8120С приводили приблизительно к такому же количеству и качеству недифференцированных колоний, как контроль ЬРСР+СМ. При 16 нМ каждая лунка давала 4-5 колоний, где только 1 была дифференцирована; каждая из лунок с 32 нМ давала в общем 3 колонии, из которых только 1 была частично дифференцированной; контроли ЬРСР+СМ продуцировали 2 недифференцированные колонии и 1 частично дифференцированную в одной лунке и 1 недифференцированную, 2 полностью дифференцированные в другой лунке. NМ23-8120С продуцировали гораздо больше колоний по сравнению с ЬРСР/СМ.

Пример 10. Антитело против МиС1*, связанное с циклодекстраном, и антитела против МиС1* или ЬРСР, связанные с циклодекстраном, способствуют прикреплению и росту стволовых клеток в традиционных средах или минимальных средах вместе со стимуляторами МиС1*.

Человеческие эмбриональные стволовые клетки Н9, которые выращивали стандартными способами на фибробластах Н827, затем на Ма1гще1 за 2 пассажа, отсекали вручную и собирали, как описано в примере 9. Частички недифференцированных колоний из 2 лунок 6-луночного планшета высевали в лунки 24-луночного планшета, покрытые антителом против МиС1*, ковалентно связанным с циклодекстраном. Клетки затем культивировали с антителом против МиС1* в минимальных средах в конечной концентрации 160 или 4 нг/мл ЬРСР и 50% Н827 кондиционированных средах (СМ). Клетки, прикрепившиеся в течение часов, растут так же, как можно ожидать для роста на питающих клетках или Ма1й§е1, за исключением увеличенной скорости роста. Клетки было легко разделять между 5 и 6 сутками после высевания. Частички недифференцированных колоний собирали вручную и повторно высевали на новых планшетах, покрытых циклодекстраном-антителом против МиС1*, где они продолжали пролиферировать и образовывать недифференцированные колонии. Количество клеток, морфологию колоний и ингибирование дифференцировки были сравнимы между лунками, в которых культивирование производилось с антителом против МиС1* и ЬРСР вместе с Н827 СМ.

Пример 11. Способ связывания лигандов с циклодекстраном.

Карбоксилирование декстрана. Материалы: декстран 500 (ср. ММ составляет 500 кДа, А1ййсЬ кат. # 31392, выделены из ЬеисопокЮс крр., 8щта-А1йпс11, 8ΐ. Ьошк, Мщкошт); бромуксусная кислота и №ГОН (8щта-А1йпсН); Н₂0 I типа (Рюса СНет1са1 Сотрапу, АгЬидЮп, Τеxак); трубка для диализа 20000 М\УС0 (номинально отсекаемая молекулярная масса) или слайды (Р1кЬег 8с1епРйс, ХУаННат, МаккасЬикейк).

Методика: 2н. раствор №0Н готовили с Н₂О I типа. В чистый сухой сцинтилляционный флакон

- 19 026732 объемом 20 мл добавляли 6 мл указанного выше раствора. В него добавляли 834 мг бромуксусной кислоты, раствор становился мутным после растворения. Затем в этот флакон добавляли 1,00 г декстрана 500 и раствор подвергали интенсивному перемешиванию и легкой ультразвуковой обработке для полного растворения в течение 5 мин. Этот раствор затем перемешивали при комнатной температуре в течение 24 ч. Раствор затем диализировали против потока воды в течение 8 ч, затем диализировали против 0,1н. НС1 в течение 18 ч, затем диализировали против дистиллированной воды в течение 12 ч. Раствор затем лиофилизировали и хранили в атмосфере аргона при -20°С.

Связывание декстран-белок/антитело. Материалы: карбоксилированный декстран 500 собственного изготовления; 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид (ЕЭС) (Ыдша-ЛИпсН); ^гидроксисукцинимид (NН8) (Ыдша-ЛИпсН); белок или антитело для связывания; Н₂О I типа (Юсси Сйетка1 Сотрапу); этаноламин (Ыдта-ЛИпсН).

Методика: готовили раствор 0,5 мг/мл карбоксилированного декстрана 500 в Н₂0 I типа. Готовили раствор 100 мМ ЕЭС/100 мМ NН8 в Н₂0 I типа. В пробирке Эппендорфа объемом 1,5 мл аликвоту 1 мл раствора декстрана добавляли к 12 мкл раствора ЕЭС^Н8. Смесь подвергали интенсивному смешиванию и оставляли встряхиваться при комнатной температуре в течение 15 мин для активирования остатков карбоновой кислоты. В то же время 6,67 нмоль белка или антитела (растворенного в подходящем буфере) добавляли в виде аликвот в отдельную пробирку. После 15-минутной активации 110 мкл активированного раствора декстрана пипетировали в пробирку, содержащую белок или антитело для связывания. Раствор осторожно перемешивали на вортексе, затем слегка встряхивали пробирку при комнатной температуре в течение 2 ч. 5 мкл этаноламина добавляли в пробирку и оставляли встряхиваться в течение еще 15 мин при комнатной температуре. Содержимое пробирки подвергали диализу против физиологического раствора, забуференного фосфатом (рН 7,4), при 4°С в течение по меньшей мере 18 ч. Раствор может быть использован свежим, или его можно лиофилизировать, хранить при -20°С и затем разводить перед применением.

Следует иметь в виду, что авторы изобретения эмпирически определяли оптимальные количества карбоксилирования и концентрации связываемого белка путем тестирования роста стволовых клеток на 24 поверхностях, на которых систематически варьировали карбоксилирование и концентрацию белка.

Пример 12. Стволовые клетки Н9 прикрепляли к антителу против МИС1*, связанному с циклодекстраном, и культивировали с NΜ23-8120Ο в минимальных средах или ЬРОР в кондиционированных средах Н827.

24-Луночные планшеты покрывали антителом против МИС1*, связанным с циклодекстраном, как описано в примере 11. Клетки Н9 высевали на этих поверхностях, как описано в примере 9, и культивировали с рекомбинантными NΜ23-8120Ο в минимальных средах в конечной концентрации 1, 2, 4 или 8 нМ. В других условиях клетки обрабатывали 4 нг/мл ЬРОР и 50% Н827 кондиционированными средами (СМ) в течение 24 ч перед заменой на №п23-8120О в минимальных средах. Эксперименты осуществляли в двух параллелях. После выращивания в течение 4 суток подсчитывали количество недифференцированных колоний по сравнению с дифференцированными и откладывали на графике в виде процентной доли недифференцированных колоний относительно общего количества колоний. Только колонии, которые были на 100% недифференцированными, считали как недифференцированные. На фиг. 10 продемонстрировано, что ЬРОР вместе с СМ полезен только тогда, когда концентрация NΜ23-8120О недостаточна. Дополнительно, результаты демонстрируют, что NΜ23-8120О в минимальных средах столь же эффективен или даже лучше, чем ЬРОР вместе с кондиционированными средами от фибробластных питающих клеток, с точки зрения морфологии колоний, количества и ингибирования дифференцировки.

Пример 13. Способ покрывания культуральных колб КТЛ-№ Материалы: 24-луночные планшеты для культур клеток с поверхностью, предоставляющей карбоновую кислоту (ВЭ Вюкаепсек Гнгесоа!: #356775); 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид (ЕЭС); Мгидроксисукцинимид (N48); Н,,Н,бис-(карбоксиметил)-Ь-лизина гидрат; Н₂О I типа; стерильный шприц (20 мл); фильтры для шприца с 0,45 мкм ГУЭР-мембраной.

Методика. Готовили 75 мл 10 мМ раствора ЕЭС/10 мМ NН8 на дериватизируемый планшет. Использовали стерильный шприц и фильтр для шприца, раствор ЕЭС^Н8 фильтровали в каждую лунку, заполняя лунки приблизительно на 80%. Планшеты накрывали и осторожно встряхивали в шейкере при комнатной температуре в течение 15 мин. Пока планшеты встряхивались, готовили 40 мл 10 мМ бис-(карбоксиметил)-Ь-лизина гидрата на планшет. После активации планшетов в течение 15 мин их опустошали и трижды промывали водой I типа. Использовали свежий стерильный шприц и фильтр для шприца, раствор Н_а.Н,-бис-(карбоксиметил)-Р-лизина гидрата фильтровали в каждую лунку, заполняя лунки приблизительно наполовину. Планшеты покрывали и осторожно встряхивали при комнатной температуре в течение 3 ч. После 3 ч планшеты опустошали и промывали пять раз водой I типа. Оставшиеся активированные NН8-эфиры гасили в этот момент путем добавления стерильного раствора 1% этаноламина и инкубировали при комнатной температуре в течение 15 мин, затем добавляли стерильный раствор 10% карбоната натрия и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин. Последнее также может быть осуществлено путем хранения планшетов в стерильной воде I типа в течение по

- 20 026732 меньшей мере 48-72 ч при 4°С. После гашения остаточных сложных эфиров ΝΗδ или гидролиза до карбоновых кислот лунки заполняли стерильной Н₂О I типа, затем заворачивали в парафильм, накрывали, заворачивали в тонкую фольгу и хранили при 4°С. Планшеты вновь промывали стерильной Н₂О I типа непосредственно перед применением. 1% раствор сульфата никеля добавляли к планшетам, затем промывали ΡΒδ перед применением.

Следует иметь в виду, что использование раствора этаноламина превращает остаточные сложные эфиры ΝΗδ в амиды, предоставляющие гидроксильную головную группу. Последнее меняет химическую структуру поверхности. Если это не является желательным, то использование замачивания в карбонатном растворе или длительное водное замачивание способствует гидролизу всех оставшихся сложных эфиров ΝΗδ обратно до исходных карбоновых кислот.

Пример 14. Стволовые клетки Н9 прикреплялись к ΝΤΑ-Νί планшетам, которые были покрыты лигандами, несущими гистидиновые концевые последовательности.

12-луночные планшеты дериватизировали ΝΤΑ-Νί, как описано в примере 13. Имеющий гистидиновую концевую последовательность ΝΜ23-δ120Ο. синтетический пептид с последовательностью IIIIIIIIIII ΙδδδδΟδδδδαδδδδαακαυδακαυδ (δΗΟ ΙΟ ΝΟ: 5) (пептид КСЮ) и рекомбинантный белок С с гистидиновой концевой последовательностью (Мшегуа) раздельно добавляли в лунки, покрытые ΝΤΑΝί, в конечной концентрации 200 нМ и инкубировали в течение 15 мин. Планшеты промывали ΡΒδ. В лунки с белком С добавляли антитело против δδΕΑ4 и антитело против Тга 1-81 в концентрации 200 нМ и инкубировали в течение 15 мин, затем промывали ΡΒδ. Частички колоний собирали как описано в примере 9 из 3 лунок 6-луночного планшета с клетками Н9, растущими на Ма1пде1, за 2 пассажа после высевания в лунки. Стволовые клетки культивировали в 8 нМ ΝΜ23-δ120Ο в минимальных средах, 4 нг/мл ЬРСР вместе с Ηδ27 СМ, 8 нМ ΝΜ23-δ120Ο вместе с 50% кондиционированными средами, собранными от Τ47Ό МНС1*-положительных раковых клеток (Са СМ), или 4 нг/мл ЬРСР вместе с 50% Са СМ. Наблюдали клетки, прикрепляющиеся к планшетам в течение 24 ч, и пролиферацию недифференцированных стволовых клеток. На 3 сутки после высевания недифференцированные и дифференцирующиеся колонии подсчитывали и откладывали на графике, см. фиг. 11А. Получали типичные изображения (40х): В) поверхности ИМ23^120С и культивированных в 8 нМ ИМ23^120С вместе с 50% Са СМ; С) поверхности с пептидом КСЭ и культивированных в 8 нМ ΝΜ23-δ12(^ вместе с 50% Са СМ; Ό) поверхности с пептидом КСЭ и культивированных в 4 нг/мл ЬРСР вместе с 50% Ηδ27 СМ; Е) поверхности с белком С, антитела против δδΕΑ4, затем культивированные в 8 нМ ИМ23^120С вместе с 50% Са СМ; Р) поверхности с белком С, антитело против Τκι 1-81, затем культивированные в 8 нМ ММ23^120С вместе с 50% Са СМ; С) поверхности с пептидом КСЭ и культивированные в 4 нг/мл ЬРСР вместе с 50% Са СМ. Наилучшие условия для этого эксперимента получены для имеющего Ηίδ концевую последовательность белка С, прикрепленного к ΝΤΑ-Νί поверхности, затем аффинно прикрепленного к антителу δδΕΑ4 или Τκι 1-81, затем культивированного в NМ23-δ120С в ММ или СаСМ.

В подобных экспериментах использовали кондиционированные среды от других МИС1*положительных раковых клеток (ΖΚ-75-1 и ΖΚ-75-30) и получили такие же результаты.

Пример 15. Кондиционированные среды, собранные от МиС1*-положительных раковых клеток, способствуют росту стволовых клеток и ингибируют дифференцировку лучше, чем кондиционированные среды от фибробластов.

Человеческие эмбриональные стволовые клетки (Η9δ) выращивали в соответствии со стандартными способами на Ма1пде1 в 6-луночных планшетах, затем собирали путем отсечения вручную. Частички колоний с (3) лунок 6-луночного планшета распределяли по лункам 24-луночного покрытого ΝΤΑ-Νί планшета. Авторы изобретения были заинтересованы узнать, могут ли белки на клеточной поверхности или белки в средах сцепляться с хелатом металла, прикрепленным к поверхности планшета. Среды, добавленные к кусочкам колоний в планшетах, представляли собой: а) 4 нг/мл ЬРСР вместе с Ηδ27 (фибробласт) кондиционированными средами (СМ); б) 4 нг/мл ЬРСР вместе с кондиционированными средами от Τ47Ό (МиС1*-положительная линия раковых клеток молочной железы, СМ от этих клеток названы здесь как Са СМ); в) 4 нМ NМ23 в минимальных средах (ММ); г) 8 нМ NМ23 в ММ; д) 4 нМ NМ23 в Са СМ; или е) 8 нМ NМ23 в Са СМ. Через 24 ч обнаружили, что клетки в минимальных средах или СМ или Са СМ прикреплялись к поверхности, даже несмотря на то, что не было видимых оснований для того, почему клетки в ЬРСР/СМ или ЬРСР Са СМ должны прикрепляться; напоминаем, что NМ23, который использовали авторы изобретения, представлял собой имеющий гистидиновую концевую последовательность рекомбинантный белок, который может легко захватываться планшетом ΝΤΑ-Νί. Обнаружили, что рост клеток в кондиционированных средах от раковых клеток, Са СМ, был гораздо лучше, чем в других условиях. Через 6 суток в культуре со сменой сред каждые 48 ч планшеты анализировали в отношении морфологии колоний стволовых клеток, количества колоний и степени дифференцировки. Стволовые клетки, культивированные в 4 нг/мл ЬРСР вместе с кондиционированными средами от раковых клеток, образовывали гораздо больше колоний и обладали гораздо меньшей дифференцировкой (отсутствием) по сравнению с контролем ЬРСР вместе с Ηδ27. Клетки, культивированные только в NМ23, росли и образовывали колонии, но клетки, культивированные в NМ23 вместе с кондиционированными средами от раковых клеток, образовывали больше колоний по сравнению с любым другим состоянием, и

- 21 026732 колонии были приблизительно на 80-85% недифференцированными и полностью сформированными и готовыми для разделения, тогда как для способов в соответствии с уровнем техники на питающих клетках или Ма1пде1 может потребоваться 9 суток для достижения той же самой стадии, хотя и с 30-40% дифференцировкой в среднем. На фиг. 12 представлен график количества колоний на 9 сутки; ΝΜ23 вместе с кондиционированными средами от раковых клеток (Са СМ) авторы изобретения откладывали на графике для 20 колоний, но клетки полностью покрывали всю лунку и не могли быть фактически подсчитаны. На сутки 9 все еще имелись недифференцированные фрагменты, приблизительно равные процентной доле контроля ЬРСР вместе с кондиционированными средами от фибробластов Н827 (Н827СМ), хотя в лунках, стимулированных ΝΜ23, клетки пролиферировали гораздо быстрее.

Пример 16. Антитела, которые связываются с областями пептида, расположенными дистально относительно клеточной поверхности, предпочтительны для клеточной адгезии.

Антитела, которые связываются с фрагментами МИС1* внеклеточного домена, расположенными дистально относительно клеточной поверхности, лучше облегчают адгезию стволовых клеток по сравнению с антителами, которые связываются с областями, расположенными близко к клеточной поверхности. Внеклеточный домен МИС1* имеет длину приблизительно 45 аминокислот. Поликлональные антитела, которые индуцируются против пептида длиной 45 аминокислот, названные в данном описании и в предшествующих заявках на изобретение как ΡδΜΟΡΚ, имеющие последовательность ΟΤΙΝΥΗΌνΕΤρΡΝρΥΚΊΈΛΆδΚΥΝΕΊΊδΌνδνδΌνΡΡΡΡδΆρδΟΆ (8ΕΟ ΙΌ ΝΟ: 1), облегчали адгезию стволовых клеток к поверхности, к которым они прикрепляются. Скрининг моноклональных антител продемонстрировал, что антитела, которые распознают фрагменты внеклеточного домена МИС1*, расположенного рядом с клеточной поверхностью, не способствовали адгезии стволовых клеток к поверхностям, даже хотя эти же моноклональные антитела стимулировали рост стволовых клеток при добавлении в среды. Для идентификации гибридом, которые продуцируют антитела, связанные с дистальными фрагментами рецептора МИС1*, авторы изобретения адсорбировали супернатанты гибридом в лунках 96-луночного планшета, затем высевали частички недифференцированных колоний, собранные после выращивания клеток ВС01у/НОС на МайтдеЕ Супернатанты трех (3) клонов обеспечивали возможность адгезии стволовых клеток. Минимальные среды меняли каждые 48 ч и пролиферацию колоний недифференцированных стволовых клеток фотографировали на 9 сутки после высевания, см. фиг. 13.

В следующем эксперименте анализ ЕЫ8Л осуществляли для определения того, действительно ли антитела, секретируемые этими гибридомами, связываются с дистальным фрагментом МИС1* внеклеточного домена, см. фиг. 14. Синтезировали пептиды с двумя делециями: один с отсутствием 10 Νконцевых аминокислот, Ν-10 Ρ8ΜΟΡΚ, имеющий последовательность ΟΡΝΟΥΚΤΕΛΛ8ΡΥΝΕΤΙ8θν8ν8θνΡΡΡΡ8Λ08ΟΛ (8ΕΟ ΙΌ ΝΟ: 3); а другой с отсутствием 10 аминокислот с С-конца, С-10 Ρ8ΜΟΡΚ, имеющий последовательность ΥιΤΙΝΛΊ 1Ι)νΚΤΟΡ\ΟΥΚΤΚΑΑ8ΗΥ\ΕΤΙ8Ι)ν8ν8Ι)\ (8ΕΟ ΙΌ ΝΟ: 4). Супернатанты гибридом, которые вызывают адгезию стволовых клеток на лунках 96-луночного планшета, представляли собой супернатанты, которые в соответствии с ЕЫ8Л-анализом, как показано, связывались с пептидом, у которого отсутствуют 10 аминокислот, расположенных проксимально относительно клеточной поверхности, но не с пептидом, у которого отсутствуют 10 дистальных аминокислот. Стволовые клетки, высеянные на супернатантах гибридом, вырастали в полностью сформированные колонии, которые были недифференцированными после суток культивирования только в минимальных средах.

Пример 17. МИС1* антитела используют для идентификации плюрипотентных стволовых клеток среди дифференцирующихся.

МиС1*-лиганд ΝΜ23 локализуется вместе с МИС1* и ОСТ4 на недифференцированных ЬЕ8С, но иммунореактивность всех трех белков утрачивается в части колоний, которая начинает дифференцироваться. Недифференцированные колонии Н9 ЬЕ8С окрашиваются положительно в отношении ΝΜ23, МиС1* и ОСТ4. Вновь дифференцирующиеся колонии не взаимодействуют с антителами против любого из трех белков. Коэкспрессия ΝΜ23 с ОСТ4 и МИС1* наилучшим образом наблюдается в колониях, которые начали дифференцироваться. Пунктирная линия обозначает границу между недифференцированными и дифференцированными частями колоний. Эксперименты по тройному окрашиванию осуществляли с использованием: фиг. 15 С) антитела против ΝΜ23 (зеленое), Н) антитела против МИС1* (красное), I) антитела против ΝΜ23 (зеленое), антитела против МИС1* (красное) и ΌΛΡΙ (синее). Похожие колонии окрашивали: 1) антителами против ΝΜ23 (зеленое), К) антителами против ОСТ4 (красное), Ь) антителами против ΝΜ23 (зеленое), антителами против ОСТ4 (красное) и ΌΛΡΙ (синее). Масштабная метка равна 100 мкм. Антитела против ΝΜ23 приобретены в 8аи1а Сти/, С1опе ΝΜ301 и ΒΌ Вюзаеисез, С1опе 56. Антитело против МИС1* получено для пептида Мшетуа Ρ8ΜСΡΚ от Ζνιικύ.

Плюрипотентные стволовые клетки могут быть выделены из смесей недифференцированных и дифференцированных стволовых клеток путем мечения живых клеток антителом против МИС1* и антителом, таким как νυ4Η5, которое связывается с полноразмерным МИС1, затем путем сортировки при помощи РАС8, магнитного разделения клеток или подобными методиками. Положительная реакция в отношении МиС1* обозначала плюрипотентные стволовые клетки. Двухвалентное антитело против МиС1*, связанное с живыми клетками, не влияет на последующий рост, поскольку действует как фактор роста, таким образом, оно идеально для разделений клеток.

- 22 026732

Пример 18. Антитела МиС1* используют для отделения ранних предшественников МиС1* от предшественников на более поздней стадии - гематопоэтических стволовых клеток.

Получали СП34-положительные гематопоэтические стволовые клетки (НЗС), полученные из человеческой пуповинной крови (АЬЬСЕЬЬ§). Клетки, содержавшие смесь СП34+/СП38-, представлены как истинные НЗС, но также содержали СЭ34+/СЭ38+ (следующая стадия предшественника). Клетки размораживали, осаждали, промывали в ЗРЕМ (бессывороточная среда для роста) от З1ешЗрап и ресуспендировали с ЗРЕМ без добавления факторов роста. Приблизительно 4000 клеток высевали в лунки 96луночного планшета, покрытого поли-НЕМА для предотвращения адгезии. Кроличье поликлональные антитело против МИС1*, полученное путем иммунизации пептидом РЗМСРК, добавляли в каждую из 5 лунок до конечной концентрации 0, 80, 250 и 2000 нг/мл. Клетки фотографировали на 3 сутки, фиг. 16 А. На 5 сутки после высевания антитело повторно добавляли к клеткам.

На 11 сутки после высевания клетки визуально проверяли, и большая часть имела все еще тот же самый диаметр, как на момент высевания, что является показателем того, что они все еще представляют собой гематопоэтические стволовые клетки и не перешли на следующую стадию предшественников. Клетки из идентичных лунок объединяли и окрашивали антителом против СП34-Р1ТС и антителом против СИ38-РЕ-Су5. Клетки анализировали и сортировали при помощи РАСЗ (сортировка клеток с активацией флуоресценции). На фиг. 16 В показано, что по мере увеличения концентрации антитела МИС1*, процентная доля клеток, которые остаются истинно гематопоэтическими стволовыми клетками (ί'.Ό34+/ί'.Ό38-). увеличивается. Превращение также действительно происходило. Процентная доля клеток, которые переходили на следующую стадию предшественника (СП34+/СП38+), была наибольшей, когда концентрация антитела МИС1* была наименьшей. Статистическая обработка результатов для репрезентативных лунок показывает, что стимуляция антителом МИС1* приводит в результате к большей доле клеток СЭ34+/38- (НЗС) и меньшей доле клеток СЭ34+/38+ (предшественники) по сравнению с нестимулированными клетками.

Пример 19. РАСЗ-сортировка фетальных клеток печени и последующий рост путем стимуляции МИС1*.

Анализ РАСЗ с использованием антител, которые распознают полноразмерный МПС1 (УИ4Н5, Зайа Сги/ Вю1есЬпо1оду; или НМРУ, ΒΌ Вюкшепсек) или антитело против МИС1* (кроличье поликлональное антитело после иммунизации РЗМСРК, Мшегуа), осуществляли на ряде различных клетокпредшественников для определения того, в каких клетках экспрессируется МИС1*, так чтобы эти клетки можно было выделять и размножать путем стимуляции рецептора МИС1*. На фиг. 17 А показано, что нейрональные стволовые клетки (КепСе11 СХ Мййроге) экспрессируют МИС1*. Небольшое количество клеток экспрессируют как расщепленный, так и нерасщепленный МПС1. Их рост стимулировали путем культивирования с антителом против МИС1* или другими агентами, такими как ИМ23, которые димеризовали МИС1*. Фетальные клетки печени (АкРСЕЬРЗ) почти исключительно экспрессируют МИС1*, фиг. 17 В.

Фетальные клетки печени культивировали в минимальных средах вместе с антителом против МИС1* в концентрациях, указанных на фиг. 18. Кривая роста демонстрирует, что рост этих предшественников МИС1* стимулируется путем димеризации рецептора фактора роста МИС1*. В оптимальной концентрации антитела одно антитело димеризует два рецептора МИС1*, и когда антитело добавляют в избытке, тогда имеется одно антитело на рецептор, и рост ингибируется. Эти результаты демонстрируют, что гематопоэтические стволовые клетки, а также другие клетки-предшественники, которые экспрессируют МИС1*, могут развиваться при добавлении агентов, которые димеризуют рецептор МИС1*.

Пример 20. Клетки Ни ЕЗ прилипают к поверхности, покрытой антителом против любого маркерного белка клеточной поверхности, и могут быть культивированы в стандартных средах для стволовых клеток или в средах, содержащих стимуляторы МИС1*.

12-луночные планшеты покрывали 0,5 мл антитела против МИС1* или антитела против ЗЗЕА4 в концентрации 100 мкг/мл. Планшеты инкубировали в течение ночи при 4°С, затем промывали в стерильном РВЗ. Недифференцированные частички колоний от клеток 1ш ЕЗ Н9, растущих на Майтде1, отсекали вручную, ресуспендировали, затем высевали на поверхности. Добавляли среды, содержащие рекомбинантные ИМ23-З120С (Мшегуа) в конечной концентрации 8 нМ или 4 нг/мл ЬРСР вместе с 50% кондиционированными фибробластами средами НЗ27.

Недифференцированные колонии собирали вручную на сутки 5 после высевания, разделяли и повторно высевали на идентично покрытые поверхности. График на фиг. 19 демонстрирует, что стволовые клетки растут на любых поверхностях, покрытых антителом, при культивировании в ИМ23 в минимальных средах (ММ) или ЬРСР вместе с кондиционированными средами НЗ27. Отмечено, что клетки в лунках, обработанных ИМ23, растут сравнительно быстрее, чем в лунках, обработанных ЬРСР.

Пример 21. Идентификация агентов в кондиционированных средах от раковых клеток, которые способствуют росту стволовых клеток и ингибированию дифференцировки.

Кондиционированные среды от МИС1*-положительных раковых клеток способствуют росту человеческих стволовых клеток, в то же время ингибируя их дифференцировку. Может быть желательно идентифицировать отдельные агенты в раковых кондиционированных средах, которые влияют на рост

- 23 026732 стволовых клеток, по двум причинам. Во-первых, эти агенты могут быть получены синтетически или рекомбинантно и добавлены в виде отдельных агентов в ростовые среды или покрытия поверхностей, для того чтобы способствовать росту стволовых клеток и некоторых ранних предшественников. Вовторых, идентификация этих агентов может обеспечить стратегии для их подавления для лечения рака.

Для идентификации белков в кондиционированных средах от раковых клеток Са СМ можно собрать Са СМ от ΜυС1*-положительных раковых клеток и отделить их индивидуальные компоненты при помощи, например, разделения на колонке, такой как ионообменная, гель-фильтрационная и тому подобное. Различные фракции могут быть тестированы по отдельности или в комбинациях в отношении их способности стимулировать рост недифференцированных стволовых клеток. Фракция(и), которая(ые) обеспечивала(и) эффект, затем может(гут) быть проанализирована(ы) путем микросеквенирования или масс-спектрометрии для определения идентичности компонентов.

Более направленный подход заключается в сравнении Са СМ от необработанных ΜΙΪ1*положительных раковых клеток с собранными от клеток, обработанных Ш1К-145. Ш1К-145 представляет собой регуляторную микро-РНК, экспрессия которой подвергается позитивной регуляции, когда стволовые клетки переходят из недифференцированных в дифференцированные. Напоминаем, что во время этого перехода прекращается расщепление Μυί',Ί. и экспрессия ΜυΟ подвергается негативной регуляции. В настоящее время продемонстрировано, что тгК-145 подавляет Μυί',Ί. Обработка раковых клеток Щ1К-145 вызывает сдвиг в сторону регулируемого роста, характерного для дифференцировки, нежели чем роста, подобного росту стволовых клеток, характерному как для роста раковых клеток, так и недифференцированных стволовых клеток. Сравнение факторов, секретируемых наивными раковыми клетками, и клетками, обработанными т!К-145, позволяет идентифицировать агенты, ответственные за то, чтобы способствовать росту стволовых клеток и раковых клеток. Они присутствуют в необработанных Са СМ и отсутствуют в обработанных Са СМ. Идентификация может быть осуществлена путем разделения белка того же самого типа, затем секвенирования или масс-спектрометрического анализа. Компоненты могут быть разделены на геле, белковые полосы, уникальные для необработанных Са СМ, могут быть вырезаны из геля, затем проанализированы путем микросеквенирования или масс-спектрометрии.

Параллельно, кондиционированные среды от недифференцированных стволовых клеток можно сравнить с кондиционированными средами, собранными от стволовых клеток, обработанных агентом, который инициирует дифференцировку, таким как пептид внеклеточного домена ΜυΟ*. В этом случае компоненты, исключительно или предпочтительно секретируемые необработанными стволовыми клетками, могут быть желательны в качестве агентов, способствующих росту стволовых клеток или индуцирующих плюрипотентность. Молекулы, которые подавляют эти агенты, могут быть использованы в качестве противораковых терапевтических средств. Наоборот, эти компоненты, исключительно или предпочтительно секретируемые дифференцирующимися стволовыми клетками, могут быть желательны в качестве агентов для лечения рака. Аналогично, молекулы, которые подавляют эти агенты, могут быть использованы для того, чтобы способствовать росту стволовых клеток или индуцировать плюрипотентность.

Регуляторные нуклеиновые кислоты, такие как микро-РНК, которые способствуют или подавляют стволовоподобный рост, т.е. рост стволовых или раковых клеток, могут быть идентифицированы, как описано выше, за исключением того, что нежели чем анализировать продукты секреции клеток, нуклеиновые кислоты могут быть экстрагированы и проанализированы. Например, способ, известный как глубокое секвенирование и общий транскриптомный анализ, может быть осуществлен для идентификации этих регуляторных РНК, которые подвергаются позитивному или негативному регулированию, когда стволовоподобный рост подавляется. Регуляторные РНК, которые подвергаются позитивной регуляции, когда стволовые клетки дифференцируются, такие как тгК-145, могут быть использованы в качестве противоракового лечения. Аналогично, молекулы, включающие δίΡΗΚ, которые подавляют эти микроРНК, могут быть использованы для стимулирования или индуцирования плюрипотентности. Регуляторные нуклеиновые кислоты, которые подвергаются позитивной регуляции при росте недифференцированных стволовых клеток и росте раковых клеток, могут быть нацелены для выключения или подавления при лечении рака или для синхронизации инициации дифференцировки стволовых клеток.

Специалистам в данной области техники известны, или они способны использовать не более чем путем стандартных экспериментальных процедур, множество эквивалентов специфических воплощений изобретения, конкретно описанных здесь. Предполагается, что такие эквиваленты охватываются объемом формулы изобретения.

- 24 026732

Перечень последовательностей <110> МИНЕРВА БИОТЕКНОЛОДЖИЗ КОРПОРЕЙШН БЭМДЭД, СИНТИЯ <120> СПОСОБЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК И КЛЕТОК-ПРЕДШЕСТВЕННИКОВ <130> 13150-70100изА <150> из 61/186,310 <151> 2009-06-11 <150> из 61/323,779 <151> 2010-04-13 <160> 5 <170> РаТепип версия 3.5 <210> 1 <211> 45 <212> ΠΡΤ <213> Искусственная последовательность <22О>

<223> Первичная последовательность рецептора фактора роста мис1 <400> 1

<51 у

тНг

Пе

Аап

Уа1

Нт а

Аар

Уа1

<51 и

тНг

<51 η

РНе

Аап

<51 п

Туг

1_уа

1

5

10

15

ТНг

С1и

А1а

Зег

Агд

Туг

АЗП

ьеи

ТНг

Пе

Зег

Аар

Уа1

зег

Уа!

20

25

30

Зег

Аар

Уа!

Рго

рНе

Рго

РНе

Зег

А1а

С1л

5ег

с! у

А! а

40 45 <210> 2 <211> 45 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> вариант пептида рзмсрк <400> 2

С1у

ТНг

Пе

А5Л

Уа!

Нт а

Аар

Уа!

С1и

ТНг

б1п

РНе

А5П

С1п

Туг

Ьуа

1

5

10

15

тНг

с! и

а! а

А1а

5ег

Рго

туг

Аап

ьеи

ТНг

Не

Зег

А5р

Уа!

5ег

Уа!

25 30

5ег Аар уа! рго рНе рго рНе 5ег д1а е1п зег о!у д!а 35 40 45 <210> 3 <211> 35 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность

- 25 026732 <220>

<223> Ν-10 РБМСРК <400> 3

01п РНе Азп СЧп туг 1_у5 тНг б!и

А1а А1а 10

Бег Агд

туг

АЗП

ьеи тНг 15

1

5

Пе

Бег

АЗр

Уа1

Бег

уа!

Бег

АЗр

Уа1 Рго

рНе

РГО

рНе

Бег

А1а

С1п

20

25

30

Бег С1у А1а 35 <210> 4 <211> 35 <212> прт <213> искусственная последовательность <220>

<223> С-10 Р5МСРК <400> 4

е1у

ТНг

Пе

АЗП

Уа1

НТ 5

Азр

Уа1

с!и

ТНг

С1п

РНе

А5П

С1п

туг

ьуз

1

5

10

15

ТНг

С1и

А1а

Бег

Агд

туг

АЗП

Ьеи

ТНг

Не

Бег

АЗр

Уа1

Бег

УаТ

20

25

30

Бег Азр Уа1 35 <210> 5 <211> 31 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид Κ6ϋ <400> 5

НТ 5

Зег

Бег

б1у

Зег

Бег

1

5

10

15

Зег

5ег

Зег

С1у

01у

Агд

01 у

Азр

Бег

С1у

Агд

01 у

Азр

Бег

20

25

30

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Способ культивирования или обеспечения пролиферации стволовых клеток или стволовоподобных клеток или индуцированных плюрипотентных стволовых клеток на поверхности без дифференцировки, включающий:

а) приведение эмбриональных стволовых клеток, эмбриональных стволовоподобных клеток или индуцированных плюрипотентных стволовых клеток в контакт с поверхностью, покрытой лигандом МИС1 (муцин-1) или МИС1*, где МИС1* представляет собой белок МИС1 с усеченным Ν-концом, так что внеклеточный домен, по существу, состоит из Р8МСРК (первичная последовательность рецептора фактора роста МИС1);

б) добавление среды и

в) культивирование указанных в (а) клеток.
2. Способ по п.1, где поверхность представляет собой мембрану или пористую поверхность.
3. Способ по п.1, где поверхность дополнительно покрыта внеклеточным матриксом или компонентом внеклеточного матрикса.
4. Способ по п.3, где компонент внеклеточного матрикса представляет собой пептид, содержащий последовательность КСИ, полилизин, коллаген или ламинин.
5. Способ по п.3, где внеклеточный матрикс представляет собой Ма1пде1™.
6. Способ по п.1, где лиганд связан с поверхностью непосредственно или через линкер.
7. Способ по п.6, где линкер представляет собой химический линкер или белок или их комбинацию.
8. Способ по п.7, где белок представляет собой белок А или белок С.
9. Способ по п.7, где линкер является фото- или химически чувствительным.
10. Способ по п.6, где лиганд или линкер неспецифически адсорбированы на поверхности или ковалентно связаны или прикреплены к поверхности посредством взаимодействия партнер связыванияаффинная концевая последовательность.

- 26 026732
11. Способ по п.6, где линкер представляет собой полимер.
12. Способ по п.1, где лиганд представляет собой антитело или фактор роста.
13. Способ по п.12, где антитело специфически связывается с Р8МСРК или С-10 РЗМСРК
14. Способ по п.12, где фактор роста представляет собой NМ23 дикого типа, или мутант NМ238120С, или основной фактор роста фибробластов (ЬРСР).
15. Способ по п.3, где внеклеточный матрикс не представляет собой Майтде1™.
16. Способ по п.1, где клетки культивируют в отсутствие фибробластных питающих клеток.
17. Способ по п.1, где клетки удаляют с поверхности не вручную.
18. Способ культивирования или обеспечения пролиферации стволовых клеток, или стволовоподобных клеток, или индуцированных плюрипотентных стволовых клеток на поверхности без дифференцировки, включающий:

а) приведение эмбриональных стволовых клеток, эмбриональных стволовоподобных клеток или индуцированных плюрипотентных стволовых клеток в контакт с поверхностью, покрытой внеклеточным матриксом или компонентом внеклеточного матрикса;

б) добавление среды, содержащей лиганд МИС1 или МИС1*; и

в) культивирование указанных в (а) клеток.
19. Способ по п.18, где лиганд представляет собой антитело.
20. Способ по п.18, где лиганд представляет собой N1^23 дикого типа или мутант NМ23-δ120С.
21. Способ по п.18, где внеклеточный матрикс не представляет собой Майтде1™.
22. Способ по п.18, где клетки культивируют в отсутствие фибробластных питающих клеток.
23. Способ по п.18, где клетки удаляют с поверхности не вручную.
24. Способ по п.18, где поверхность представляет собой мембрану или пористую поверхность.
25. Способ по п.18, где компонент внеклеточного матрикса представляет собой пептид, содержащий последовательность РСЭ, полилизин, коллаген или ламинин.
26. Способ по п.18, где внеклеточный матрикс представляет собой Ма1пде1™.
27. Способ культивирования или обеспечения пролиферации стволовых клеток, или стволовоподобных клеток, или индуцированных плюрипотентных стволовых клеток на поверхности без дифференцировки, включающий культивирование эмбриональных стволовых клеток, эмбриональных стволовоподобных клеток или индуцированных плюрипотентных стволовых клеток в кондиционированных средах от МиС1*-положительных клеток.
28. Способ по п.27, где МиС1*-положительные клетки представляют собой раковые клетки.
29. Способ по п.28, где МиС1*-лоложительные клетки выбраны из Τ47Ό, ΖΚ-75-30 или ΖΚ-75-1.
30. Способ по п.27, где поверхность представляет собой мембрану или пористую поверхность.
31. Способ по п.27, где поверхность покрыта внеклеточным матриксом или компонентом внеклеточного матрикса.
32. Способ по п.31, где компонент внеклеточного матрикса представляет собой пептид, содержащий последовательность РСЭ, полилизин, коллаген или ламинин.
33. Способ по п.31, где внеклеточный матрикс представляет собой Ма1пде1™.
34. Способ по п.31, где внеклеточный матрикс не представляет собой Ма1пде1™.
35. Способ по п.27, где клетки культивируют в отсутствие фибробластных питающих клеток.
36. Способ по п.27, где клетки удаляют с поверхности не вручную.
37. Способ сбора клеток после их выращивания в соответствии со способом по п.1 на поверхности, включающий добавление конкурентной молекулы, которая связывается с лигандом на поверхности, так что высвобождаются клетки, которые были связаны с лигандом или с поверхностью.
38. Способ сбора клеток после выращивания клеток в соответствии со способом по п.6, включающий отщепление линкера, связанного с поверхностью, который опосредованно прикреплен к клеткам, так что высвобождаются клетки, которые были связаны с поверхностью.
39. Способ идентификации состояния дифференцировки клеток, включающий использование антитела против МИС1* для связывания с клетками на поверхности, где положительный сигнал в отношении антитела против МИС1* указывает на плюрипотентное состояние клеток.
40. Способ по п.39, где указанные клетки образуют смешанную популяцию, состоящую из стволовых и стволовоподобных клеток или индуцированных плюрипотентных стволовых клеток и вновь дифференцирующихся клеток, где положительный сигнал в отношении антитела против МИС1* указывает на плюрипотентное состояние стволовых клеток.
41. Способ по п.40, дополнительно включающий приведение в контакт клеток с антителами к маркерам стволовых или стволовоподобных клеток или индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, где положительный сигнал в отношении маркера стволовых или стволовоподобных клеток или индуцированных плюрипотентных стволовых клеток указывает на плюрипотентное состояние стволовых клеток.
42. Способ детектирования раковых стволовых клеток, включающий использование антитела против МИС1* для связывания с клетками на поверхности, где положительный сигнал в отношении антите- 27 026732 ла против МиС1* указывает на раковые стволовые клетки.
43. Способ по п.42, дополнительно включающий обеспечение взаимодействия клеток с антителами к маркерам стволовых клеток, где положительный сигнал в отношении маркера стволовых клеток указывает на присутствие раковых стволовых клеток.
44. Твердая подложка для использования в способе по п.1, поверхность которой связана с белком А или белком О посредством аффинного взаимодействия, где белок А или белок О связан с антителом, специфичным в отношении лиганда МЦС1 или МИС1*, избирательно экспрессирующегося в стволовых или стволовоподобных клетках или индуцированных плюрипотентных стволовых клетках.
45. Твердая подложка по п.44, где аффинное взаимодействие осуществляется через взаимодействие комплекса никеля с нитрилотриуксусной кислотой (ΝΤΆ-Νΐ) с указанной поверхностью.