ES2744589T3 - Extracción de ácido nucleico de materiales biológicos heterogéneos - Google Patents

Abstract

Un método para extraer ácido nucleico de una muestra biológica, que comprende los pasos de: (a) proporcionar una muestra biológica obtenida de un sujeto, en el que la muestra comprende una colección heterogénea de materiales que contienen ácido nucleico que comprenden células o microvesículas, o ambos; (b) realizar un paso de preprocesamiento de muestra en la muestra biológica para obtener una fracción que comprende la colección heterogénea de materiales que contienen ácido nucleico, en el que el paso de preprocesamiento excluye proteínas, lípidos, restos de células muertas y otros contaminantes potenciales e inhibidores PCR de los materiales que contienen ácido nucleico heterogéneo; (c) realizar una operación de exclusión por afinidad poniendo en contacto la colección heterogénea de materiales que contienen ácido nucleico con un agente de afinidad que se une a un marcador de superficie y eliminando los materiales de ácido nucleico que se unen al agente de afinidad para agotar los materiales que contienen ácido nucleico procedentes de un célula de tipo donante específico o un tipo de célula tumoral específica, seguido de una operación de mejora de extracción, en el que el marcador de superficie es un marcador tumoral seleccionado de los marcadores listados en la Tabla 2, y en el que la operación de mejora de extracción comprende el uso de un agente seleccionado del grupo que consiste en un inhibidor de RNasa, una proteasa, un agente reductor, un sustrato señuelo, un receptor soluble, un ARN de interferencia corta, una molécula de unión a ARN, una sustancia desnaturalizante de RNasa y cualquier combinación de los mismos, en combinación con un paso de procesamiento seleccionada del grupo que consiste en lavar los materiales que contienen ácido nucleico; separación por tamaño de RNasas de la muestra biológica; desnaturalización de proteínas en la muestra biológica; y combinaciones de los mismos; y (d) extraer ácido nucleico de los materiales resultantes.

Description

DESCRIPCIÓN

Extracción de ácido nucleico de materiales biológicos heterogéneos

Campo de la invención

La presente divulgación se refiere al campo general del análisis de ácido nucleico, particularmente a la obtención y análisis de ácidos nucleicos de alta calidad a partir de una muestra de materiales biológicos heterogéneos.

Antecedentes

El conocimiento creciente de los cambios genéticos y epigenéticos que ocurren en las células cancerosas proporciona una oportunidad para detectar, caracterizar y controlar tumores analizando secuencias y perfiles de ácido nucleico relacionados con tumores. Los biomarcadores relacionados con el cáncer incluyen, por ejemplo, mutaciones específicas en secuencias de genes (Cortez y Calin, 2009; Diehl et al., 2008; Network, 2008; Parsons et al., 2008), regulación hacia arriba y hacia abajo de la expresión de ARNm y ARNmi (Cortez y Calin, 2009; Itadani et al., 2008; Novakova et al., 2009), variaciones de empalme de ARNm, cambios en los patrones de metilación del ADN (Cadieux et al., 2006; Kristensen y Hansen, 2009), amplificación y eliminación de regiones genómicas (Cowell y Lo, 2009), y expresión aberrante de secuencias repetidas de ADN (Ting et al., 2011). Diversos ensayos de diagnóstico molecular como el análisis mutacional, el estado de metilación del ADN genómico y el análisis de la expresión génica pueden detectar estos biomarcadores y proporcionar información valiosa para médicos, médicos e investigadores. Hasta ahora, estas pruebas utilizan células cancerosas derivadas de tejido tumoral extirpado quirúrgicamente o de tejido obtenido mediante biopsia.

Sin embargo, la capacidad de realizar estas pruebas usando un fluido corporal es a menudo más deseable que usar una muestra de tejido del paciente. Un enfoque menos invasivo que utiliza una muestra de fluido corporal tiene amplias implicaciones en términos de bienestar del paciente, la capacidad de realizar una monitorización longitudinal de la enfermedad y la capacidad de obtener perfiles de expresión incluso cuando las células de los tejidos no son fácilmente accesibles, por ejemplo, en pacientes con cáncer de ovario o cerebro.

La presente divulgación está dirigida a métodos y sistemas para extraer ácido nucleico de alta calidad de una muestra biológica, preferiblemente una muestra fluida, y las extracciones de ácido nucleico resultantes. Los métodos objeto, sistemas y extracciones en cuestión se pueden utilizar en apoyo del diagnóstico del paciente, pronósticos, teranósticos, monitorización, medicina predictiva, medicina personalizada, medicina integrada, farmacodiagnóstico y diagnóstico/asociación de prescripción (diagnóstico complementario). El documento WO2011/009104A1 (RUSSO eT AL), 20 de enero de 2011, analiza el análisis de ácido nucleico en humanos u otros animales objeto, en particular la obtención y análisis de ácidos nucleicos de alta calidad a partir de una muestra biológica y, en particular, de microvesículas.

CHEN C. ET AL, “Microfluidic isolation and transcriptome analysis of serum microvesicles”, LAB ON A CHIP, vol. 10, No. 4, 21 de febrero de 2010, páginas 505-511, discute un método de inmunoafinidad microfluídica para aislar microvesículas, y la extracción de ARN de estas microvesículas que proporciona una fuente de información sobre el estado genético de los tumores para servir como biomarcadores para el diagnóstico y el pronóstico del cáncer. Resumen

En términos generales, la presente divulgación se refiere a métodos para extraer ácido nucleico de una muestra biológica utilizando principios de mejora de extracción y exclusión de afinidad para reducir la heterogeneidad en una muestra que contiene una colección heterogénea de materiales que contienen ácido nucleico. Son posibles una serie de variaciones, cada una de las cuales se describe a continuación.

Como se describe aquí, los materiales que contienen ácido nucleico se refieren a células, microvesículas, complejos de ARN-proteína y otras partículas que contienen ácido nucleico que se encuentran naturalmente en muestras biológicas. Los ejemplos de células que contienen ácidos nucleicos de especial interés incluyen, entre otras, células tumorales circulantes y otras células que han sufrido o están experimentando una transformación relacionada con la enfermedad, u otras células que contienen evidencia genómica del estado físico o la salud de un organismo. Los ejemplos de microvesículas incluyen, entre otros, exosomas, vesículas de membrana, microvesículas desprendibles, micropartículas, nanovesículas, cuerpos apoptóticos, nanopartículas y vesículas de membrana, y se denominarán colectivamente en toda esta especificación como “microvesículas” a menos que se indique expresamente lo contrario. Los materiales que contienen ácido nucleico pueden originarse, por ejemplo, de una célula, órgano o tejido particular del cuerpo, o fluido corporal. Por ejemplo, los materiales que contienen ácido nucleico pueden detectarse o aislarse de la orina. Alternativamente, un material que contiene ácido nucleico puede originarse, por ejemplo, de un tumor, crecimiento hiperplásico, nódulo, neoplasia, quiste o masa. Los materiales que contienen ácido nucleico transportan moléculas de superficie, como antígenos, biomarcadores, receptores, que pueden usarse para identificar, detectar, aislar, enriquecer u ordenar materiales que contienen ácido nucleico de un tipo de célula, tejido u órgano donante específico del cuerpo o fluido corporal. Las especies individuales de materiales que contienen ácido nucleico pueden purificarse conjuntamente durante los métodos de extracción, como se describe aquí. Por ejemplo, las células tumorales circulantes pueden purificarse conjuntamente con microvesículas.

Una “colección heterogénea de materiales que contienen ácido nucleico”, como se usa en el presente documento, es una mezcla de cualquiera de las especies anteriores de materiales que contienen ácido nucleico, por ejemplo, células, cualquier especie de microvesícula, complejos de ARN-proteína y cualquier otra especie de partículas que contienen ácido nucleico, o cualquier combinación de las mismas. Por ejemplo, una colección heterogénea de materiales que contienen ácido nucleico de la presente invención incluye células o microvesículas, o ambas. En un aspecto, una colección heterogénea de materiales que contienen ácido nucleico de la presente invención es células tumorales circulantes y microvesículas. En algunas realizaciones, la mezcla comprenderá una o más células además de cualquiera o todas las otras especies de materiales que contienen ácido nucleico.

En un primer aspecto de la invención, se proporciona un método de acuerdo con la reivindicación 1.

En el presente documento se divulga un método para extraer ácido nucleico de una muestra biológica, que comprende los pasos de: obtener una muestra biológica; realizar un paso de preprocesamiento de muestra en la muestra biológica para obtener una fracción que comprende una colección heterogénea de materiales que contienen ácido nucleico; realizar una operación de mejora de extracción; y extraer ácido nucleico de los materiales resultantes. No hay un orden específico para el desempeño del paso de preprocesamiento de muestra y la operación de mejora de extracción, y de hecho, los dos pueden realizarse simultáneamente. Preferiblemente, este método dará como resultado una extracción de ácido nucleico que cumpla con uno o más de los estándares de calidad descritos a continuación en términos de la relación cuantitativa de 18S ARNr a 28S ARNr, o rendimiento de ácido nucleico. La colección heterogénea de materiales que contienen ácido nucleico incluye, pero no se limita a, una mezcla de materiales que contienen ácido nucleico, que incluyen, pero no se limitan a, células o microvesículas, o ambas.

También se divulga un método para extraer ácido nucleico de una muestra biológica, que comprende los pasos de: obtener una muestra biológica; realizar un paso de preprocesamiento de muestra en la muestra biológica para obtener una fracción que comprende una colección heterogénea de materiales que contienen ácido nucleico; realizar una operación de exclusión por afinidad en la colección heterogénea de materiales que contienen ácido nucleico; y extraer ácido nucleico de los materiales resultantes. Preferiblemente, este método dará como resultado una extracción de ácido nucleico que cumpla con uno o más de los estándares de calidad descritos a continuación en términos de la relación cuantitativa de 18S ARNr a 28S ARNr, o rendimiento de ácido nucleico. La colección heterogénea de materiales que contienen ácido nucleico incluye, pero no se limita a, una mezcla de materiales que contienen ácido nucleico, que incluyen, pero no se limitan a, células o microvesículas o ambas.

También se divulga un método para extraer ácido nucleico de una muestra biológica, que comprende los pasos de: obtener una muestra biológica; realizar un paso de preprocesamiento de muestra en la muestra biológica para obtener una fracción que comprende una colección heterogénea de materiales que contienen ácido nucleico; realizar una operación de mejora de extracción; realizar una operación de exclusión por afinidad en los materiales resultantes; y extracción de ácido nucleico de los materiales restantes. No hay un orden específico para el desempeño del paso de preprocesamiento de muestra y la operación de mejora de extracción, y de hecho, los dos pueden realizarse simultáneamente. La operación de exclusión por afinidad se realiza en cualquier momento después del paso de preprocesamiento. Preferiblemente, este método dará como resultado una extracción de ácido nucleico que cumpla con uno o más de los estándares de calidad descritos a continuación en términos de la relación cuantitativa de 18S ARNr a 28S ARNr, o rendimiento de ácido nucleico. La colección heterogénea de materiales que contienen ácido nucleico incluye, pero no se limita a, una mezcla de materiales que contienen ácido nucleico, que incluyen, pero no se limitan a, células o microvesículas, o ambas.

Se divulga una extracción de ácido nucleico de una colección heterogénea de materiales que contienen ácido nucleico obtenidos de una muestra biológica eucariota, en la que el ARNr 18S y el ARNr 28S son detectables en la extracción. Preferiblemente, la relación cuantitativa de 18S ARNr a 28S ARNr detectable en las extracciones de ácido nucleico está dentro del rango de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 1:2; y es preferiblemente aproximadamente 1:2. Las extracciones de ácido nucleico de esta naturaleza se pueden obtener usando cualquiera de los métodos descritos anteriormente.

Se divulga una extracción de ácido nucleico de una colección heterogénea de materiales que contienen ácido nucleico obtenidos de una muestra de fluido corporal con una concentración de proteína de menos de 10 mg/ml, tal como orina, donde la extracción de ácido nucleico tiene un rendimiento de ácido nucleico de 50 pg/ml a partir de 20 ml de muestra biológica. Las extracciones de ácido nucleico de esta naturaleza se pueden obtener usando cualquiera de los métodos descritos anteriormente.

Se divulga una extracción de ácido nucleico de una colección heterogénea de materiales que contienen ácido nucleico obtenidos de una muestra de fluido corporal con una concentración de proteína de más de 10 mg/ml, tal como suero o plasma, en donde la extracción de ácido nucleico tiene un rendimiento de ácido nucleico mayor o igual a 50 pg/ml a partir de 1 ml de muestra biológica. La colección heterogénea de materiales que contienen ácido nucleico incluye, pero no se limita a, una mezcla de materiales que contienen ácido nucleico, que incluyen, pero no se limitan a, células o microvesículas. Las extracciones de ácido nucleico de esta naturaleza se obtienen utilizando cualquiera de los métodos descritos anteriormente.

En otro aspecto más de la divulgación, los perfiles de ácido nucleico se obtienen analizando las extracciones de ácido nucleico resultantes de cualquiera de los métodos anteriores.

Se divulga un kit para extraer ácidos nucleicos de muestras biológicas o una colección heterogénea que contiene ácido nucleico. Variaciones y ejemplos de los cuales se describen a continuación. La colección heterogénea de materiales que contienen ácido nucleico incluye, pero no se limita a, una mezcla de materiales que contienen ácido nucleico, que incluyen, pero no se limitan a, células o microvesículas, o ambas.

Las realizaciones anteriores incluyen un paso de preprocesamiento de muestra que incluye técnicas para separar materiales que contienen ácido nucleico de una muestra biológica. Por ejemplo, se pueden usar métodos de centrifugación, concentración de filtración y/o intercambio aniónico y/o cromatografía de permeación en gel.

Las realizaciones anteriores incluyen un paso de operación de mejora de extracción para eliminar o mitigar factores adversos que evitan la extracción de ácido nucleico de alta calidad de una muestra biológica. Los agentes potenciadores de la extracción incluyen: inhibidor de RNasa, proteasa, agente reductor, sustrato señuelo (por ejemplo, ARN sintético), receptor soluble, ARN interferente pequeño, molécula de unión a ARN (por ejemplo, Anticuerpo anti-ARN, proteína chaperona, proteína inhibidora de RNasa) o RNasa sustancia desnaturalizante (por ejemplo, detergente en solución de alta osmolaridad) o cualquier combinación de los agentes anteriores.

Las realizaciones anteriores incluyen una operación de exclusión por afinidad, como se describe a continuación, para reducir la heterogeneidad de la fracción de materiales que contienen ácido nucleico obtenida de la etapa de preprocesamiento. Por ejemplo, la operación de exclusión por afinidad puede eliminar materiales que contienen ácido nucleico que no son de interés. El agotamiento puede ser completo o parcial. Por ejemplo, en algunos casos, un agotamiento del 50% de los materiales indeseables sería suficiente para lograr una extracción de ácido nucleico de alta calidad.

Todas las realizaciones anteriores pueden incluir una operación de enriquecimiento de afinidad, como se describe a continuación, en la que los métodos de selección de afinidad se usan para enriquecer materiales que contienen ácido nucleico de cierto tipo o que se originan a partir de una célula, tejido u órgano particular del cuerpo. Por ejemplo, los materiales que contienen ácido nucleico de células donantes específicas pueden ser detectados, seleccionados o enriquecidos por las moléculas de superficie específicas que se sabe que están presentes.

Se divulgan usos para cualquiera de los métodos de extracción de ácido nucleico divulgados aquí en cualquiera de una variedad de métodos y técnicas conocidos para analizar ácidos nucleicos en apoyo del diagnóstico del paciente, pronósticos, teranósticos, monitorización, medicina predictiva, medicina personalizada, medicina integrada, farmacodiagnóstico y asociación de diagnóstico/prescripción (diagnóstico complementario). Por ejemplo, el ácido nucleico obtenido de la práctica del método de extracción se analiza para detectar la presencia o ausencia de una aberración genética asociada con una enfermedad o afección médica.

En cualquiera de los aspectos de la presente invención, un ácido nucleico es, por ejemplo, ADN o ARN. El ARN puede ser, por ejemplo, ARN codificante, por ejemplo, ARN mensajero que puede codificar proteínas, o ARN no codificante (ARNnc), por ejemplo, ARN ribosómico, ARN de transferencia, microARN y otras transcripciones no codificantes que pueden originarse a partir de ADN genómico. Las transcripciones de ARN no codificantes pueden incluir, pero no se limitan a, transcripciones que se transcriben de repeticiones de satélite y transposones, que pueden ser transposones de ADN o retrotransposones. El ADN puede ser, por ejemplo, ADN de cadena sencilla, por ejemplo, ADNc que se transcribe inversamente a partir de ARN o se genera a partir de la replicación de ADN; ADN de cadena doble; ADN genómico; ADN no codificante (ADNnc), por ejemplo, repeticiones de satélite, transposones o retrotransposones; o cualquier fragmento o combinación de los mismos.

En cualquiera de los aspectos de la presente invención, la muestra biológica puede ser cualquier muestra de un organismo, por ejemplo, un mamífero y, en particular, un ser humano. Preferiblemente, la muestra biológica es un fluido corporal tal como orina, sangre, suero o plasma, y también puede incluir esputo, líquido cefalorraquídeo, líquido pleural, aspirados de pezón, líquido linfático, líquido de las vías respiratorias, intestinales y genitourinarias, líquido lagrimal, saliva, leche materna, líquido del sistema linfático, semen, líquido cefalorraquídeo, líquido del sistema intraorgánico, líquido ascítico, líquido de quistes tumorales, líquido amniótico y combinaciones de los mismos.

En cualquiera de los aspectos de la presente invención, la muestra biológica se obtiene de un sujeto. Los ejemplos de sujetos incluyen, pero no se limitan a, todos los animales que se muestra o se espera que tengan materiales que contienen ácido nucleico. En realizaciones particulares, el sujeto es un mamífero, un primate humano o no humano, un perro, un gato, un caballo, una vaca, otros animales de granja o un roedor (por ejemplo, ratón, rata, conejillo de indias, etc.).

Las realizaciones preferidas de la invención en cualquiera de sus diversos aspectos son como se describe a continuación o como se define en las reivindicaciones subordinadas.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 es un diagrama de flujo que representa un método de extracción de ácido nucleico de una muestra biológica.

La figura 2 es un diagrama de flujo que representa un segundo método de extracción de ácido nucleico de una muestra biológica.

La figura 3 es un diagrama de flujo que representa un tercer método de extracción de ácido nucleico de una muestra biológica.

Descripción detallada

Materiales que contienen ácido nucleico y colecciones heterogéneas de los mismos

Los materiales biológicos que contienen ácido nucleico se usan a menudo como materiales de partida para la extracción y análisis de ácido nucleico. Las células son un ejemplo de un material biológico que contiene ácido nucleico. Los ejemplos de células que contienen ácidos nucleicos de especial interés incluyen, entre otras, células tumorales circulantes y otras células que han sufrido o están experimentando una transformación relacionada con la enfermedad, u otras células que contienen evidencia genómica del estado físico o la salud de un organismo. Además, los ácidos nucleicos se pueden encontrar en materiales más pequeños que varían en tamaño desde aproximadamente 10 nm de diámetro hasta aproximadamente 10000 nm de diámetro. Por ejemplo, los “exosomas” tienen diámetros de aproximadamente 30 a 200 nm, con desprendimiento de microvesículas y cuerpos apoptóticos a menudo descritos como más grandes (Orozco y Lewis, 2010). Los exosomas, las microvesículas desprendibles, las micropartículas, las nanovesículas, los cuerpos apoptóticos, las nanopartículas y las vesículas de membrana se aíslan conjuntamente mediante diversas técnicas y, por lo tanto, se denominarán colectivamente en toda esta especificación como “microvesículas” a menos que se indique expresamente lo contrario. Otros materiales que contienen ácido nucleico, como los complejos de ARN-proteína, pueden aislarse conjuntamente con células y microvesículas utilizando los diversos métodos y técnicas descritos en este documento. De acuerdo con lo anterior, el término genérico “materiales que contienen ácido nucleico” se usará en el presente documento para referirse a células, microvesículas, complejos de ARN-proteína y otras partículas que contienen ácido nucleico que se encuentran naturalmente en muestras biológicas.

Una “colección heterogénea de materiales que contienen ácido nucleico”, como se usa en el presente documento, es una mezcla de cualquiera de las especies anteriores de materiales que contienen ácido nucleico, por ejemplo, células, cualquier especie de microvesícula, complejos de ARN-proteína y cualquier otra especie de partículas que contienen ácido nucleico. Preferiblemente, la mezcla comprenderá una o más células además de cualquiera o todas las otras especies de materiales que contienen ácido nucleico.

Los materiales que contienen ácido nucleico pueden originarse a partir de células, tejidos u órganos particulares del cuerpo o fluidos corporales. En particular, los materiales que contienen ácido nucleico pueden aislarse de orina, plasma o suero. En algunas realizaciones, los materiales que contienen ácido nucleico pueden originarse a partir de un tumor, crecimiento hiperplásico, nódulo, neoplasia, quiste o masa. Los materiales que contienen ácido nucleico a menudo transportan moléculas de superficie como antígenos, biomarcadores o receptores de sus células donantes. Estas moléculas de superficie pueden usarse para detectar, identificar, aislar, clasificar y/o enriquecer materiales que contienen ácido nucleico de un tipo específico de célula donante (Al-Nedawi et al., 2008; Taylor y Gercel-Taylor, 2008). De esta manera, los materiales que contienen ácido nucleico que se originan de distintas poblaciones celulares pueden analizarse para determinar su contenido de ácido nucleico. Por ejemplo, los materiales que contienen ácido nucleico tumoral (maligno y no maligno) portan antígeno de superficie asociado a tumor y pueden detectarse, aislarse o enriquecerse mediante estos antígenos de superficie específicos de tumor asociados.

Métodos de extracción de ácido nucleico

En un primer ejemplo, se divulga un método para extraer ácido nucleico de una muestra biológica, que comprende los pasos de: obtener una muestra biológica; realizar un paso de preprocesamiento de muestra en la muestra biológica para obtener una fracción que comprende una colección heterogénea de materiales que contienen ácido nucleico (preferiblemente dicha colección heterogénea comprende células además de otros materiales que contienen ácido nucleico); realizar una operación de mejora de extracción; y extraer ácido nucleico de los materiales resultantes. No hay un orden específico para el desempeño del paso de preprocesamiento de muestra y la operación de mejora de extracción, y, de hecho, los dos pueden realizarse simultáneamente. Preferiblemente, este método dará como resultado una extracción de ácido nucleico que cumpla con uno o más de los estándares de calidad descritos a continuación en términos de la relación cuantitativa de 18S ARNr a 28S ARNr, o rendimiento de ácido nucleico.

Una variación de este primer ejemplo se muestra en la figura 1, en el que el método comprende los pasos de obtener una muestra (100) biológica, preprocesar la muestra para obtener una fracción que comprende una colección heterogénea de materiales (110) que contienen ácido nucleico, realizar una operación de mejora de extracción en la fracción (120 ), y extracción de ácido nucleico de la fracción (130).

En variaciones de este primer ejemplo, la operación de mejora de extracción se realiza antes del preprocesamiento de la muestra, o las operaciones de mejora de preprocesamiento y extracción se realizan simultáneamente.

En variaciones adicionales, puede haber un paso adicional de eliminar ácidos nucleicos que no se encuentran dentro de las células o microvesículas que pueden ser parte de la colección heterogénea de materiales que contienen ácido nucleico. Los métodos para eliminar ácidos nucleicos son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, se puede realizar un paso de digestión enzimática en cualquier punto del proceso, por ejemplo, antes del preprocesamiento de la muestra, antes de la realización de la operación de extracción de mejora, o antes de la extracción de ácido nucleico. Dichas enzimas pueden ser un tipo de ribonucleasa que cataliza la digestión enzimática de los ácidos ribonucleicos o un tipo de desoxirribonucleasa que cataliza la digestión enzimática de los ácidos desoxirribonucleicos.

La muestra biológica puede ser cualquier muestra de un organismo, por ejemplo, un mamífero y, en particular, un ser humano. Preferiblemente, la muestra biológica es un fluido corporal tal como orina, sangre, suero o plasma, y también puede incluir esputo, líquido cefalorraquídeo, líquido pleural, aspirados de pezón, líquido linfático, líquido de las vías respiratorias, intestinales y genitourinarias, líquido lagrimal , saliva, leche materna, líquido del sistema linfático, semen, líquido cefalorraquídeo, líquido del sistema intraorgánico, líquido ascítico, líquido de quistes tumorales, líquido amniótico y combinaciones de los mismos.

Una muestra biológica a veces puede provenir de un sujeto. El término “sujeto” pretende incluir todos los animales que se muestra o se espera que tengan materiales que contienen ácido nucleico. En realizaciones particulares, el sujeto es un mamífero, un primate humano o no humano, un perro, un gato, un caballo, una vaca, otros animales de granja o un roedor (por ejemplo, ratón, rata, conejillo de indias, etc.). Los términos “sujeto”, “individuo” y “paciente” se usan indistintamente en el presente documento y tienen el mismo significado.

La etapa de preprocesamiento de la muestra proporciona ciertas ventajas que no están presentes en los métodos de extracción de ácido nucleico de la técnica anterior que no emplean un paso de preprocesamiento para obtener de la muestra una fracción que comprende una colección heterogénea de materiales que contienen ácido nucleico. Por ejemplo, los métodos de la presente descripción, que emplean como todos ellos, un paso de preprocesamiento, (1) tienden a producir rendimientos significativamente más altos de ácido nucleico extraído con mayor integridad; (2) proporcionan ventajas asociadas con la escalabilidad, por ejemplo, cuando se usa en apoyo de un ensayo para detectar ácidos nucleicos expresados en un sujeto a niveles bajos, la sensibilidad del ensayo se puede aumentar aislando, en la etapa de preprocesamiento, más materiales que contienen ácido nucleico de un volumen mayor de fluido de muestra; (3) los ácidos nucleicos más puros en esa proteína y lípidos, restos de células muertas y otros contaminantes potenciales e inhibidores de PCR pueden excluirse de los materiales que contienen ácido nucleico aislados en la etapa de preprocesamiento; y (4) más opciones en herramientas y técnicas de extracción de ácido nucleico, ya que la fracción que comprende materiales que contienen ácido nucleico que resulta de la etapa de preprocesamiento es típicamente de un volumen mucho menor que el volumen de muestra inicial, lo que hace posible extraer ácidos nucleicos de la fracción utilizando herramientas y técnicas de pequeño volumen, como filtros de columna de pequeño volumen.

La etapa de preprocesamiento de la muestra puede ser cualquiera de varias técnicas conocidas para separar materiales que contienen ácido nucleico de una muestra biológica. Por ejemplo, un método de aislamiento de células tumorales circulantes se describe en un artículo de Stott et al. (Stott et al., 2010), un método de centrifugación diferencial se describe en un artículo de Raposo et al. (Raposo et al., 1996), un artículo de Skog et. al. (Skog et al., 2008) y un artículo de Nilsson et al. (Nilsson et al., 2009). Los métodos de intercambio aniónico y/o cromatografía de permeación en gel se describen en las Patentes de los Estados Unidos Núms. 6,899,863 y 6,812,023. Los métodos de gradientes de densidad de sacarosa o electroforesis de orgánulos se describen en la Patente de Estados Unidos No. 7.198.923. Taylor y Gercel-Taylor (Taylor y Gercel-Taylor, 2008) describen un método de clasificación de células activadas magnéticamente (MACS). Los métodos de concentración de filtración se describen en un artículo de Cheruvanky ct al. (Cheruvanky et al., 2007) y en la publicación PCT No. WO2011/009104 (Russo et al.). Además, las microvesículas pueden identificarse y aislarse del fluido corporal de un sujeto mediante una tecnología de microchips recientemente desarrollada que utiliza una plataforma microfluídica única para separar de manera eficiente y selectiva las microvesículas derivadas de tumores (Chen et al., 2010).

El propósito del paso de mejora de extracción es eliminar o mitigar factores adversos que evitan la extracción de ácido nucleico de alta calidad de una muestra biológica. En algunas muestras biológicas, factores como el ADN circulante excesivo pueden afectar la calidad de la extracción de ácido nucleico de dichas muestras y contaminar el ADN extraído de los materiales que contienen ácido nucleico. En otras muestras, factores tales como niveles excesivos de RNasa endógena pueden afectar la calidad de la extracción de ácido nucleico de dichas muestras. Se pueden usar muchos agentes y métodos para eliminar estos factores adversos. Estos métodos y agentes se denominan colectivamente en el presente documento como una “operación de mejora de extracción”.

En algunos casos, la operación de mejora de extracción puede implicar la adición de agentes de mejora de extracción de ácido nucleico a la muestra biológica o diversos derivados de la muestra en cualquier etapa dada del proceso. Con el fin de eliminar factores adversos como la RNasa endógena, los agentes potenciadores de la extracción pueden incluir, entre otros, un inhibidor de la RNasa disponible en el mercado, como Superase-In (Ambion Inc.), RNaseIN (Promega Corp.) u otros agentes que funcionan de manera similar; una proteasa; un agente reductor; un sustrato señuelo tal como un ARN sintético; un receptor soluble que puede unirse a RNasa; un ARN de interferencia pequeña (ARNip); una molécula de unión a ARN, tal como un anticuerpo anti-ARN, o una proteína chaperona; una sustancia desnaturalizante de RNasa, tal como una solución de alta osmolaridad, un detergente o una combinación de los mismos. Estos agentes potenciadores pueden ejercer sus funciones de varias maneras, por ejemplo, pero sin limitarse a ellos, mediante la inhibición de la actividad de RNasa (por ejemplo, inhibidores de RNasa), a través de una degradación ubicua de proteínas (por ejemplo, proteasas), o mediante una proteína chaperona (por ejemplo, una proteína de unión a ARN) que se une y protege al ARN. En todos los casos, dichos agentes de mejora de extracción eliminan o mitigan algunos o todos los factores adversos en la muestra biológica que de otro modo evitarían o interferirían con la extracción de alta calidad de ácidos nucleicos de la muestra.

En otros casos, la operación de mejora de extracción puede implicar el desempeño de uno o más pasos de proceso. Tales procesos incluyen un lavado extenso o sustancialmente completo de componentes que contienen ácido nucleico de la fracción o muestra; separación por tamaño de RNasas de la muestra biológica; desnaturalización de proteínas en la muestra biológica mediante diversas técnicas que incluyen, entre otras, generar una condición de pH particular, una condición de temperatura (por ejemplo, el mantenimiento de una temperatura decreciente o más baja), ciclos de congelación/descongelación y combinaciones de los mismos.

Por lo tanto, la operación de mejora de extracción comprende: (a) la adición de uno o más agentes de mejora a la muestra biológica; o (b) el desempeño de uno o más pasos de mejora antes de la extracción de ácido nucleico; o (c) una combinación de agentes de mejora y etapas de mejora. Los agentes potenciadores pueden incluir: (i) inhibidor de RNasa; (ii) proteasa; (iii) agente reductor; (iv) sustrato señuelo, tal como ARN sintético; (v) receptor soluble; (vi) ARN interferente pequeño; (vii) molécula de unión a ARN, tal como anticuerpo anti-ARN, proteína chaperona o una proteína inhibidora de RNasa; y (ix) sustancia desnaturalizante de RNasa, tal como una solución o detergente de alta osmolaridad. Los pasos de mejora de extracción pueden incluir: (x) lavado; (xi) RNasa de separación de tamaño de la muestra; (xii) efectuar la desnaturalización de RNasa a través de un cambio físico, tal como disminuyendo la temperatura o ejecutando un ciclo de congelación/descongelación.

En variaciones en las que la operación de mejora de la extracción implica la adición de un inhibidor de RNasa, el inhibidor de RNasa se puede agregar a la muestra biológica o a la fracción que comprende una colección heterogénea de materiales que contienen ácido nucleico antes de extraer el ácido nucleico. Preferiblemente, el inhibidor de RNasa tiene una concentración de más de 0.027 UA (1X) para una muestra igual o superior a 1 |il; alternativamente, mayor o igual a 0.135 AU (5X) para una muestra igual o mayor a 1 |il; alternativamente, mayor o igual a 0.27 AU (10X) para una muestra igual o mayor a 1 |il; alternativamente, mayor o igual a 0.675 AU (25X) para una muestra igual o mayor a 1 |il; y, alternativamente, mayor o igual a 1.35 AU (50X) para una muestra igual o mayor a la que la concentración de proteasa lx se refiere a una condición enzimática en la que se usa 0.027 AU o más proteasa para tratar microvesículas aisladas de 1 |il o más fluido corporal; la concentración de proteasa 5X se refiere a una condición enzimática en la que se usan 0.135 UA o más proteasa para tratar microvesículas aisladas de 1 |il o más fluido corporal; la concentración de proteasa 10X se refiere a una afección enzimática en la que se usan 0.27 UA o más de proteasa para tratar microvesículas aisladas de 1 |il o más fluido corporal; la concentración de proteasa 25X se refiere a una afección enzimática en la que se usan 0.675 UA o más proteasa para tratar microvesículas aisladas de 1 |il o más fluido corporal; la concentración de proteasa 50X se refiere a una condición enzimática en la que se usa 1.35 UA o más proteasa para tratar microvesículas aisladas de o más fluido corporal. Preferiblemente, el inhibidor de RNasa es una proteasa.

La etapa de extracción de ácido nucleico puede realizarse usando procedimientos que son bien conocidos en la técnica. Las personas expertas seleccionarán un procedimiento de extracción particular según sea apropiado para la muestra biológica particular. Se proporcionan ejemplos de procedimientos de extracción en las publicaciones de patentes WO/2009/100029 y WO/2011/009104. En algunos casos, con algunas técnicas, también puede ser posible analizar el ácido nucleico sin extraerlo primero de los materiales que contienen ácido nucleico.

En un segundo ejemplo, se divulga un método para extraer ácido nucleico de una muestra biológica, que comprende los pasos de: obtener una muestra biológica; realizar un paso de preprocesamiento de muestra en la muestra biológica para obtener una fracción que comprende una colección heterogénea de materiales que contienen ácido nucleico; realizar una operación de exclusión por afinidad en la colección heterogénea de materiales que contienen ácido nucleico; y extraer ácido nucleico de los materiales resultantes. La muestra biológica, el paso de preprocesamiento y el paso de extracción de ácido nucleico son todos los descritos anteriormente en relación con el primer ejemplo. Preferiblemente, este método dará como resultado una extracción de ácido nucleico que cumpla con uno o más de los estándares de calidad descritos a continuación en términos de la relación cuantitativa de 18S ARNr a 28S ARNr, o rendimiento de ácido nucleico.

Una variación de este segundo ejemplo se muestra en la figura 2, en el que el método comprende los pasos de obtener una muestra (200) biológica, preprocesar la muestra para obtener una fracción que comprende una colección heterogénea de materiales que contienen ácido nucleico (210), realizar una operación (220) de exclusión por afinidad, y extracción de ácidos nucleicos de la fracción (230) de afinidad reducida.

La operación de exclusión por afinidad es un medio novedoso para reducir la heterogeneidad de la fracción de materiales que contienen ácido nucleico obtenidos de la etapa de preprocesamiento. En lugar de utilizar técnicas de selección por afinidad para enriquecer materiales de interés que contienen ácido nucleico, en la operación de exclusión por afinidad, se utilizan técnicas de afinidad para eliminar materiales que contienen ácido nucleico que no son de interés (por ejemplo, Materiales que contienen ácido nucleico procedentes de una célula tipo que no es de interés en un ensayo de biomarcadores que se realizará en el ácido nucleico extraído). Por ejemplo, usando los métodos y técnicas descritos en este documento, las células epiteliales, eritrocitos, leucocitos, neutrófilos, linfocitos, monocitos, basófilos, trombocitos, fibroblastos y células mesenquimales pueden eliminarse de la muestra antes de la ejecución de la etapa de extracción de ácido nucleico. El agotamiento puede ser completo o parcial. Por ejemplo, en algunos casos, un agotamiento del 50% de los materiales indeseables sería suficiente para lograr una extracción de ácido nucleico de alta calidad.

Debido a que los materiales que contienen ácido nucleico a menudo transportan moléculas de superficie, como los antígenos, de sus células donantes, se pueden usar moléculas de superficie para identificar y agotar los materiales que contienen ácido nucleico que se originan de un tipo específico de célula donante. En un ejemplo, la molécula de superficie utilizada en la operación de exclusión por afinidad es una molécula específica para el tipo de célula, por ejemplo, pero sin limitarse a, cualquiera de los marcadores de tipo de células enumerados en la Tabla 1. Alternativamente, dependiendo del diseño del ensayo, la molécula de superficie usado en la operación de exclusión por afinidad puede ser una molécula de superficie listada en la Tabla 2 si los materiales que contienen ácido nucleico que se originan a partir de un tipo específico de célula tumoral deben excluirse en el ensayo.

Tabla 1: Ejemplos de marcadores específicos de tipo celular.

En variaciones de este segundo ejemplo, el método puede comprender adicionalmente una operación de mejora de extracción, como se describió anteriormente en relación con el primer ejemplo. La operación de mejora de extracción se puede realizar en cualquier momento del proceso antes de la etapa final de extracción de ácido nucleico.

En variaciones adicionales, puede haber un paso adicional de eliminación de ácidos nucleicos que no están ubicados dentro de las células o microvesículas que pueden ser parte de la colección heterogénea de materiales que contienen ácido nucleico. Los métodos para eliminar ácidos nucleicos son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, se puede realizar un paso de digestión enzimática en cualquier punto del proceso. Dichas enzimas pueden ser un tipo de ribonucleasa que cataliza la digestión enzimática de los ácidos ribonucleicos o un tipo de desoxirribonucleasa que cataliza la digestión enzimática de los ácidos desoxirribonucleicos.

En un tercer ejemplo, se divulga un método para extraer ácido nucleico de una muestra biológica, que comprende los pasos de: obtener una muestra biológica; realizar un paso de preprocesamiento de muestra en la muestra biológica para obtener una fracción que comprende una colección heterogénea de materiales que contienen ácido nucleico; realizar una operación de mejora de extracción; realizar una operación de exclusión por afinidad; y extraer ácido nucleico de los materiales resultantes. La muestra biológica, el paso de preprocesamiento, la operación de mejora de extracción, la operación de exclusión de afinidad y el paso de extracción de ácido nucleico son todos los descritos anteriormente en relación con el primer y segundo ejemplos.

En este ejemplo, la etapa de preprocesamiento de la muestra debe ocurrir antes de la operación de exclusión de afinidad, pero la operación de mejora de extracción puede ocurrir en cualquier momento antes de la etapa de extracción de ácido nucleico.

Preferentemente, este ejemplo también dará como resultado una extracción de ácido nucleico que cumple con uno o más de los estándares de calidad descritos a continuación en términos de la relación cuantitativa de 18S ARNr a 28S ARNr, o rendimiento de ácido nucleico.

Una variación del método descrito en este ejemplo se muestra en la figura 3, en donde el método comprende los pasos de obtener una muestra (300) biológica, preprocesar la muestra para obtener una fracción que comprende una colección heterogénea de materiales (310) que contienen ácido nucleico, realizar una operación (320) de exclusión por afinidad, realizar una operación (330) de mejora de extracción y extracción de ácidos nucleicos.

Como con el primer y segundo ejemplos, este tercer ejemplo puede comprender además un paso adicional de eliminación de ácidos nucleicos que no se encuentran dentro de las células o microvesículas que pueden ser parte de la colección heterogénea de materiales que contienen ácido nucleico. Los métodos para eliminar ácidos nucleicos son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, se puede realizar un paso de digestión enzimática en cualquier punto del proceso, por ejemplo, antes del preprocesamiento de la muestra, antes de realizar la operación de extracción de mejora, o antes de la extracción de ácido nucleico. Dichas enzimas pueden ser un tipo de ribonucleasa que cataliza la digestión enzimática de los ácidos ribonucleicos o un tipo de desoxirribonucleasa que cataliza la digestión enzimática de los ácidos desoxirribonucleicos.

Enriquecimiento de afinidad

Todos los ejemplos y variaciones anteriores de los métodos de extracción de ácido nucleico descritos anteriormente pueden comprender además una operación de enriquecimiento de afinidad, en la que los métodos de selección de afinidad se usan para enriquecer materiales que contienen ácido nucleico de cierto tipo o que se originan a partir de una célula particular, tejido u órgano del cuerpo, por ejemplo, pulmón, páncreas, estómago, intestino, vejiga, riñón, ovario, testículo, piel, colorrectal, mama, próstata, cerebro, esófago, hígado, placenta o células fetales.

Debido a que los materiales que contienen ácido nucleico a menudo transportan moléculas de superficie tales como antígenos de sus células donantes, las moléculas de superficie pueden usarse para identificar, aislar y/o enriquecer materiales que contienen ácido nucleico de un tipo específico de célula donante (Al-Nedawi et al., 2008; Taylor y Gercel-Taylor, 2008). De esta manera, los materiales que contienen ácido nucleico que se originan de distintas poblaciones celulares pueden analizarse para determinar su contenido de ácido nucleico. Por ejemplo, materiales que contienen ácido nucleico de tumor (maligno y no maligno) pueden llevar antígenos de superficie asociados a tumor y pueden detectarse, aislarse o enriquecerse mediante estos antígenos de superficie específicos de tumores asociados.

En un ejemplo, el antígeno de superficie es la molécula de adhesión de células epiteliales (EpCAM), que es específica de los materiales que contienen ácido nucleico de carcinomas de pulmón, colorrectal, mama, próstata, cabeza y cuello, y de origen hepático, pero no de origen celular hematológico (Balzar et al., 1999; Went et al., 2004). En otro ejemplo, el antígeno de superficie es CD24, que es una glucoproteína específica de los materiales que contienen ácido nucleico en la orina (Keller et al., 2007).

En otro ejemplo más, el antígeno de superficie se selecciona de un grupo de moléculas tales como CD70, antígeno carcinoembrionario (CEA), EGFR, EGFRvIII y otras variantes, ligando Fas, TRAIL, receptor de transferrina, p38.5, p97 y HSP72. Además, los materiales que contienen ácido nucleico específico de tumor pueden caracterizarse por la falta de marcadores de superficie, tales como CD80 y CD86.

En otros ejemplos, los antígenos de superficie son cualquiera de los marcadores tumorales, enumerados en la Tabla 2. Los antígenos de superficie en la Tabla 2 pueden usarse para realizar una operación de enriquecimiento de afinidad para que los materiales que contienen ácido nucleico de un tipo de célula tumoral específica se enriquecen. Alternativamente, dependiendo del diseño del ensayo, el antígeno de superficie en la operación de enriquecimiento de afinidad puede ser cualquiera de los marcadores de superficie enumerados en la Tabla 1 anterior.

Tabla 2 Ejemplos de biomarcadores tumorales

Un experto en la materia apreciará que los marcadores de superficie descritos en las Tablas 1 y 2 pueden usarse indistintamente para una operación de exclusión de afinidad o una operación de enriquecimiento de afinidad dependiendo de los objetivos de un ensayo dado y método de extracción de ácido nucleico practicado de acuerdo con a las enseñanzas de esta divulgación. Por ejemplo, por un lado, los marcadores de superficie para fibroblastos pueden usarse para excluir materiales que contienen ácido nucleico derivados de fibroblastos cuando se realiza un procedimiento para evaluar biomarcadores de glioblastoma. Por otro lado, los marcadores de superficie para fibroblastos pueden usarse para enriquecer materiales que contienen ácido nucleico derivados de fibroblastos cuando se realiza un procedimiento para evaluar el fibroblastoma.

Se puede lograr un procedimiento de afinidad para el agotamiento o enriquecimiento de materiales que contienen ácido nucleico de un tipo de célula específico, por ejemplo, usando anticuerpos, aptámeros, análogos de aptámeros o polímeros impresos molecularmente específicos para un antígeno de superficie deseado (en adelante agente de “afinidad”). En una realización, el antígeno de superficie es específico para un tipo de cáncer. En otra realización, el antígeno de superficie es específico para un tipo celular que no es necesariamente canceroso.

Un ejemplo de un método de separación de material que contiene ácido nucleico basado en el antígeno de la superficie celular proporcionado en la Patente de los Estados Unidos Núm. 7,198,923. Allí se usó el anticuerpo CD81 para enriquecer los exosomas que contienen antígeno CD81 para preparar ARN de VHC a partir de una muestra de sangre.

Se describe otro ejemplo, por ejemplo, en las patentes de Estados Unidos números 5.840.867 y 5.582.981, WO/2003/050290 y una publicación de Johnson et al. (Johnson et al., 2008). Allí, los aptámeros y sus análogos que se unen específicamente a las moléculas de superficie se usaron como una herramienta de separación para enriquecer los materiales que contienen ácido nucleico específico del tipo de célula. Además, los polímeros impresos molecularmente también pueden reconocer específicamente moléculas de superficie tal como se describe, por ejemplo, en las patentes estadounidenses números 6.525,154, 7,332,553 y 7,384,589 y una publicación de Bossi et al. (Bossi et al., 2007) y también puede ser una herramienta para recuperar y aislar materiales que contienen ácido nucleico de tipo celular específico.

Estándares de calidad para extracciones de ácido nucleico

Las extracciones de ácido nucleico obtenidas por los nuevos métodos descritos en el presente documento se caracterizan por un alto rendimiento y una alta integridad, lo que hace que los ácidos nucleicos extraídos sean útiles para diversas aplicaciones en las que se requieren o prefieren extracciones de ácido nucleico de alta calidad.

Como se mencionó anteriormente, el rendimiento de cualquiera de los diversos métodos de extracción de ácido nucleico de acuerdo con la presente descripción preferiblemente da como resultado una extracción de ácido nucleico que cumple con uno o más de los estándares de calidad descritos a continuación en términos de la relación cuantitativa de 18S ARNr a 28S ARNr, o rendimiento de ácido nucleico.

Preferentemente, los métodos de extracción de ácido nucleico de esta descripción darán como resultado una extracción de ácido nucleico en la que se pueden detectar cantidades significativas de ARN ribosómico (ARNr), específicamente ARNr 18S y 28S, preferiblemente en una relación de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 1:2; y más preferiblemente, en una proporción de aproximadamente 1:2.

Además, los métodos de extracción de ácido nucleico de la presente descripción preferiblemente darán como resultado rendimientos mejorados de ácido nucleico extraído. Por ejemplo, usando los métodos descritos en este documento, se puede obtener un rendimiento de ácido nucleico mayor o igual a 50 pg/ml a partir de una muestra biológica baja en proteínas de 20 ml como la orina. Alternativamente, se puede obtener un rendimiento de ácido nucleico mayor o igual a 50 pg/ml a partir de 1 ml de una muestra biológica alta en proteínas, como el masa de tejido o el plasma.

Por lo tanto, las nuevas extracciones de ácido nucleico obtenidas por los métodos descritos en el presente documento cumplen preferiblemente uno o más de los siguientes estándares de calidad: (1) la detección de ARNr 18S y 28S, preferiblemente en una relación de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 1:2; y más preferiblemente, aproximadamente 1:2; y/o (2) un rendimiento de ácido nucleico mayor o igual a 50 pg/ml de una muestra biológica baja en proteínas de 20 ml o una muestra biológica alta en proteínas de 1 ml.

Uso de los métodos de extracción de ácido nucleico, y las extracciones de ácido nucleico resultantes, en análisis de ácido nucleico para investigación y aplicaciones clínicas.

Los métodos de extracción de ácido nucleico de la presente divulgación se pueden usar para producir extracciones de ácido nucleico novedosas y mejoradas para diversas aplicaciones, que incluyen pero no se limitan a análisis de ácido nucleico para investigación (por ejemplo, investigación en apoyo del descubrimiento de nuevos biomarcadores o asociaciones de biomarcadores) o análisis clínicos de ácido nucleico en ayuda del diagnóstico del paciente, pronósticos, teranósticos, monitorización, medicina predictiva, medicina personalizada, medicina integrada, farmacodiagnóstico y diagnóstico/asociación de prescripción (diagnóstico complementario).

En un ejemplo, los ácidos nucleicos extraídos, que incluyen ADN y/o ARN, se analizan directamente sin un paso de amplificación. El análisis directo se puede realizar con diferentes métodos que incluyen, entre otros, la tecnología de nanocadenas. La tecnología de nanocadenas permite la identificación y cuantificación de moléculas objetivo individuales en una muestra biológica al unir un indicador fluorescente codificado por color a cada molécula objetivo. Este enfoque es similar al concepto de medición de inventario escaneando códigos de barras. Los reporteros se pueden hacer con cientos o incluso miles de códigos diferentes que permiten un análisis altamente multiplexado. La tecnología se describe en una publicación de Geiss et al. (Geiss et al., 2008).

En otro ejemplo, puede ser beneficioso o deseable amplificar el ácido nucleico antes de analizarlo. Los métodos de amplificación de ácido nucleico se usan comúnmente y generalmente se conocen en la técnica, muchos ejemplos de los cuales se describen aquí. Si se desea, la amplificación se puede realizar de manera que sea cuantitativa. La amplificación cuantitativa permitirá la determinación cuantitativa de cantidades relativas de los diversos ácidos nucleicos, para generar un perfil como se describe a continuación.

En una realización, el ácido nucleico extraído es ARN. El ARN se transcribe preferiblemente de manera inversa en ADN complementario (ADNc) antes de una amplificación adicional. Dicha transcripción inversa puede realizarse sola o en combinación con un paso de amplificación. Un ejemplo de un método que combina los pasos de transcripción inversa y amplificación es la reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa (RT-PCR), que puede modificarse adicionalmente para que sea cuantitativa, por ejemplo, RT-PCR cuantitativa como se describe en la Patente de Estados Unidos No. 5,639,606.

Los métodos de amplificación de ácido nucleico incluyen, sin limitación, reacción en cadena de polimerasa (PCR) (Patente de EE. UU. No. 5,219,727) y sus variantes tales como reacción en cadena de polimerasa in situ (Patente de EE. UU. No. 5,538,871), reacción en cadena de polimerasa cuantitativa (Patente de EE. UU. 5,219,727), reacción en cadena de la polimerasa anidada (Patente de los Estados Unidos No. 5,556,773), replicación de secuencia autosostenida y sus variantes (Guatelli et al., 1990), sistema de amplificación transcripcional y sus variantes (Kwoh et al., 1989), Qb Replicase y sus variantes (Miele et al., 1983), PCR en frío (Li et al., 2008) o cualquier otro método de amplificación de ácido nucleico, seguido de la detección de las moléculas amplificadas utilizando técnicas bien conocidas por los expertos en la técnica. Las técnicas Especialmente útiles son aquellos esquemas de detección diseñados para la detección de moléculas de ácido nucleico si tales moléculas están presentes en cantidades muy bajas.

El análisis de los ácidos nucleicos presentes en los materiales que contienen ácido nucleico puede ser cuantitativo y/o cualitativo. Para el análisis cuantitativo, las cantidades (niveles de expresión), ya sean relativos o absolutos, de ácidos nucleicos específicos de interés dentro de los materiales que contienen ácido nucleico se miden con métodos conocidos en la técnica (descritos a continuación). Para el análisis cualitativo, las especies de ácidos nucleicos específicos de interés dentro de los materiales que contienen ácido nucleico, ya sean de tipo salvaje o variantes, se identifican con métodos conocidos en la técnica.

Perfiles de ácido nucleico.

Esta divulgación incluye además un perfil novedoso de ácidos nucleicos de alta calidad de una muestra biológica. Dichos perfiles se generan realizando cualquiera de las diversas realizaciones y variaciones de los métodos de extracción de ácido nucleico divulgados aquí, y analizando el ácido nucleico resultante.

Un perfil, como se usa el término en el presente documento, se refiere a una colección de características, que puede determinarse a través del análisis cuantitativo o cualitativo de uno o más componentes o materiales biológicos (tales como ácido nucleico) contenidos en una muestra (tales como una extracción de ácido nucleico obtenida por cualquiera de los métodos divulgados aquí). Un perfil de referencia es un perfil obtenido de un sujeto independiente o del mismo sujeto en un punto de tiempo diferente.

Los ácidos nucleicos del perfil pueden ser ARN. El ARN puede codificar ARN, por ejemplo, ARN mensajero que puede codificar proteínas. El a Rn también puede ser ARN no codificante (ARNnc), por ejemplo, ARN ribosómico, ARN de transferencia, microARN y otras transcripciones no codificantes que pueden originarse a partir de ADN genómico. Estas transcripciones de ARN no codificantes pueden incluir transcripciones que se transcriben a partir de repeticiones de satélite y transposones, que pueden ser transposones de ADN o retrotransposones.

Los ácidos nucleicos también pueden ser ADN. El ADN puede ser ADN de cadena sencilla, por ejemplo, ADNc, que se transcribe inversamente a partir del ARN. El ADN también puede ser ADN de cadena sencilla que se genera durante la replicación del ADN. El ADN genómico se replica en el núcleo mientras la célula se divide. Parte del ADN replicado puede salir de su plantilla, exportarse fuera del núcleo y empacarse en microvesículas. También es posible que el ADN sea ADN de cadena doble. Además, el ADN puede ser ^a Dⁿ no codificante (ADNnc).

Los perfiles de ácido nucleico de alta calidad son altamente deseables para muchos usos, tales como la investigación (por ejemplo, investigación en apoyo del descubrimiento de nuevos biomarcadores o asociaciones de biomarcadores) o usos clínicos tales como diagnósticos, pronósticos, teranósticos, monitorización, medicina predictiva, medicina personalizada, medicina integrada, farmacodiagnóstico y asociación de diagnóstico/prescripción (diagnóstico complementario). Es deseable que tales perfiles sean consistentes entre las muestras. Dicha consistencia no puede lograrse sin extracciones de ácido nucleico de alta calidad.

En un ejemplo, el perfil de ácido nucleico incluye una o más aberraciones genéticas, que se usa en el presente documento para referirse a cantidades de ácido nucleico, así como a variantes de ácido nucleico. Preferiblemente, el ácido nucleico es endógeno al sujeto. Las aberraciones genéticas incluyen, sin limitación, sobreexpresión de uno o más elementos genómicos, subexpresión de uno o más elementos genómicos, producción alternativa de variantes de empalme de uno o más elementos genómicos, variantes de número de copias (CNV) de uno o más elementos genómicos (por ejemplo, minutos dobles de ADN) (Hahn, 1993), modificaciones de ácidos nucleicos (por ejemplo, metilación, acetilación y fosforilaciones), polimorfismos de un solo nucleótido (SNP), reordenamientos cromosómicos (por ejemplo, inversiones, eliminaciones y duplicaciones) y mutaciones (inserciones, eliminaciones, duplicaciones, sentido erróneo, sin sentido, sinónimos o cualquier otro cambio de nucleótidos) de uno o más elementos genómicos, cuyas mutaciones, en muchos casos, afectan en última instancia la actividad y la función del genoma, conducen a variantes de empalme transcripcional alternativas y/o cambios en el nivel de expresión génica.

Los ácidos nucleicos en los materiales que contienen ácido nucleico pueden ser cualquier tipo de ácido nucleico, incluidos, entre otros, los ejemplos proporcionados aquí. En la categoría de ARN, los ácidos nucleicos pueden codificar ARN, por ejemplo, ^a Rⁿ mensajero que puede codificar proteínas; ARN no codificante (ARNnc), por ejemplo, ARN ribosómico, ARN de transferencia, microARN y otras transcripciones no codificantes que pueden originarse a partir de ADN genómico. Las transcripciones de ^a Rⁿ no codificantes pueden incluir transcripciones que se transcriben desde repeticiones de satélite y transposones, que pueden ser transposones de ADN o retrotransposones. En la categoría de ADN, los ácidos nucleicos pueden incluir ADN de cadena sencilla (ADNcs), por ejemplo, ADNc, que se transcribe inversamente a partir de ARN y ADNcs que se genera durante la replicación de ADN; ADN de cadena doble (ADNcd); ADN que codifica proteínas (ADN codificante); y ADN que no codifica proteínas, es decir, ADN no codificante (ADNn).

La determinación de tales aberraciones genéticas se puede realizar mediante una variedad de técnicas conocidas por el experto en la materia. Por ejemplo, los niveles de expresión de ácidos nucleicos, variantes de empalme alternativas, reordenamiento cromosómico y números de copias de genes se pueden determinar mediante análisis de micromatriz (patentes de EE. UU. Nos. 6,913,879, 7,364,848, 7,378,245, 6,893,837 y 6,004,755) y PCR cuantitativa. Particularmente, los cambios en el número de copias pueden detectarse con el ensayo de genotipado de genoma completo Illumina Infinium II o el Microarray Agilent Human Genome CGH (Steemers et al., 2006). Las modificaciones de ácido nucleico se pueden analizar mediante métodos descritos en, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos No. 7,186,512 y la publicación de patente WO/2003/023065. En particular, los perfiles de metilación se pueden determinar, por ejemplo, mediante el Illumina DNA Methylation OMA003 Cancer Panel. Los SNP y las mutaciones pueden detectarse mediante hibridación con sondas específicas de alelos, detección de mutaciones enzimáticas, escisión química de heterodúplex no coincidente (Cotton et al., 1988), escisión de ribonucleasa de bases no coincidentes (Myers et al., 1985), espectrometría de masas (Patentes de EE. UU. Nos. 6,994,960, 7,074,563 y 7,198,893), secuenciación de ácidos nucleicos, polimorfismo de conformación de cadena sencilla (SSCP) (Orita et al., 1989), electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante (DGGE) (Fischer y Lerman, 1979a; Fischer y Lerman, 1979b), electroforesis en gel con gradiente de temperatura (TGGE) (Fischer y Lerman, 1979a; Fischer y Lerman, 1979b), polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción (RFLP) (Kan y Dozy, 1978a; Kan y Dozy, 1978b), ensayo de ligadura de oligonucleótidos (OLA), PCR alelo-específica (ASPCR) (Patente de Estados Unidos No. 5.639.611), reacción en cadena de ligadura (LCR) y sus variantes (Abravaya et al., 1995; Landegren et al., 1988; Nakazawa et al., 1994), flow- análisis de heteroduplex citométrico (Wo /2006/113590) y combinaciones o modificaciones de los mismos. En particular, los niveles de expresión génica pueden determinarse mediante el análisis en serie de la técnica de expresión génica (SAGE) (Velculescu et al., 1995). En general, los métodos para analizar las aberraciones genéticas se informan en numerosas publicaciones, no limitadas a las citadas aquí, y están disponibles para profesionales expertos. El método de análisis apropiado dependerá de los objetivos específicos del análisis, la condición/historial del paciente y las cancelaciones específicas), enfermedades u otras condiciones médicas que se detectarán, controlarán o tratarán.

Kits para obtener ácidos nucleicos

La presente descripción también se dirige a un kit para obtener ácidos nucleicos a partir de muestras biológicas. El kit puede comprender un agente de afinidad; un agente de mejora de extracción; y un tampón de lisis. En algunos ejemplos, el agente de afinidad es capaz de unirse a uno o más marcadores enumerados en la Tabla 1 o la Tabla 2.

En algunos casos, el kit puede comprender además instrucciones para usar el kit. Las instrucciones para usar el kit pueden incluirse en el paquete con los otros componentes del kit o en una ubicación diferente a la que pueda acceder un usuario del kit (por ejemplo, en un sitio web o página web accesible para el comprador del kit). El contenido de las instrucciones puede incluir, entre otras, instrucciones sobre cómo usar el agente de afinidad, cómo realizar una operación de exclusión de afinidad, cómo reconstituir reactivos, cómo mejorar el ácido nucleico, cómo usar el tampón de lisis y cómo llevar a cabo todo el procedimiento para obtener ácidos nucleicos mediante el uso del kit.

En algunos ejemplos del kit, el agente potenciador de extracción puede ser un inhibidor de RNasa; proteasa; agente reductor; sustrato señuelo; receptor soluble; ARN de interferencia corta; Molécula de unión a ARN; Sustancia desnaturalizante RNase; o cualquier combinación de cualquiera de los anteriores.

En algunos ejemplos, el agente de afinidad es adecuado para realizar una operación de exclusión, y las instrucciones incluidas en o con el kit comprenden instrucciones para usar el agente de afinidad en una operación de exclusión de afinidad. Los kits de esta naturaleza pueden comprender además un segundo agente de afinidad e instrucciones para usar el segundo agente de afinidad en una operación de enriquecimiento de afinidad.

En ejemplos adicionales, el kit puede comprender además DNasa, RNasa, o ambas, e instrucciones para su uso. Estos reactivos pueden usarse para eliminar ADN o ARN que no tienen interés en el ensayo previsto, por ejemplo, ADN o ARN que se adhiere al exterior de los materiales que contienen ácido nucleico en la extracción. La cantidad de DNasa o RNasa puede depender de la fuente de la muestra biológica. En algunas muestras, la cantidad de ADN o ARN sin interés es relativamente alta y, por lo tanto, será necesario agregar más DNasa o RNasa en el proceso de extracción.

Las metodologías, protocolos y reactivos particulares, divulgados aquí, pueden variar. La terminología utilizada en este documento tiene el propósito de describir realizaciones particulares solamente.

Aunque la presente invención se ha descrito con referencia a ciertas realizaciones, son posibles numerosas modificaciones, alteraciones y cambios en las realizaciones descritas.

Ejemplos

Ejemplo 1: Extracción de ácido nucleico con operación de mejora de extracción

Una variación del método divulgado se muestra en la Figura 1, donde el método comprende los pasos de obtener una muestra (100) biológica, preprocesar la muestra para obtener una fracción que comprende una colección heterogénea de materiales (110) que contienen ácido nucleico, realizando una operación de mejora de extracción en la fracción (120), y extrayendo ácido nucleico de la fracción (130).

Ejemplo 2: Extracción de ácido nucleico con operación de exclusión de afinidad

Una variación del método divulgado se muestra en la figura 2, donde el método comprende los pasos de obtener una muestra (200) biológica, preprocesar la muestra para obtener una fracción que comprende una colección heterogénea de materiales que contienen ácido nucleico (210), realizar una operación (220) de exclusión por afinidad, y extracción de ácidos nucleicos de la fracción (230) de afinidad reducida.

Ejemplo 3: Extracción de ácido nucleico con operación de mejora de extracción y operación de exclusión de afinidad Una variación del método divulgado se muestra en la figura 3, donde el método comprende los pasos de obtener una muestra (300) biológica, preprocesar la muestra para obtener una fracción que comprende una colección heterogénea de materiales (310) que contienen ácido nucleico, realizar una operación (320) de exclusión por afinidad, realizar una operación (330) de mejora de extracción y extracción de ácidos nucleicos.

Ejemplo 4: Extracción y análisis de ácido nucleico de una colección heterogénea de materiales que contienen ácido nucleico

Las colecciones heterogéneas de materiales que contienen ácido nucleico pueden aislarse de una muestra biológica de un sujeto que tiene o se sospecha que tiene cáncer. Se recoge una muestra de orina del sujeto. En la etapa de preprocesamiento, una fracción que contiene materiales que contienen ácido nucleico se enriquece por centrifugación o filtración de la orina. La fracción resultante contiene una colección heterogénea de materiales que contienen ácido nucleico, que incluye una mezcla de microvesículas y células además de otros materiales que contienen ácido nucleico. Esta fracción se incuba con agentes de mejora de la extracción, como los inhibidores de la RNasa, para prevenir o mitigar aquellos factores que pueden prevenir la extracción de ácido nucleico de alta calidad. Luego, la fracción se somete a una operación de enriquecimiento de afinidad para enriquecer las posibles células tumorales circulantes y microvesículas de particular interés. Se utiliza un antígeno de superficie transportado tanto por las células tumorales circulantes como por las microvesículas para seleccionar y purificar estos materiales que contienen ácido nucleico particulares de la mezcla restante. Los ácidos nucleicos de las células tumorales purificadas circulantes y las microvesículas se extraen y analizan para detectar la presencia, ausencia o niveles de aberraciones genéticas asociadas con la presencia o ausencia de cáncer maligno; o etapa o grado del tumor a partir del cual las células y las microvesículas pueden haberse originado.

Referencias:

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15:6830-40.

Claims (9)

REIVINDICACIONES

1. Un método para extraer ácido nucleico de una muestra biológica, que comprende los pasos de:

(a) proporcionar una muestra biológica obtenida de un sujeto, en el que la muestra comprende una colección heterogénea de materiales que contienen ácido nucleico que comprenden células o microvesículas, o ambos;

(b) realizar un paso de preprocesamiento de muestra en la muestra biológica para obtener una fracción que comprende la colección heterogénea de materiales que contienen ácido nucleico, en el que el paso de preprocesamiento excluye proteínas, lípidos, restos de células muertas y otros contaminantes potenciales e inhibidores PCR de los materiales que contienen ácido nucleico heterogéneo;

(c) realizar una operación de exclusión por afinidad poniendo en contacto la colección heterogénea de materiales que contienen ácido nucleico con un agente de afinidad que se une a un marcador de superficie y eliminando los materiales de ácido nucleico que se unen al agente de afinidad para agotar los materiales que contienen ácido nucleico procedentes de un célula de tipo donante específico o un tipo de célula tumoral específica, seguido de una operación de mejora de extracción, en el que el marcador de superficie es un marcador tumoral seleccionado de los marcadores listados en la Tabla 2, y en el que la operación de mejora de extracción comprende el uso de un agente seleccionado del grupo que consiste en un inhibidor de RNasa, una proteasa, un agente reductor, un sustrato señuelo, un receptor soluble, un ARN de interferencia corta, una molécula de unión a ARN, una sustancia desnaturalizante de RNasa y cualquier combinación de los mismos, en combinación con un paso de procesamiento seleccionada del grupo que consiste en lavar los materiales que contienen ácido nucleico; separación por tamaño de RNasas de la muestra biológica; desnaturalización de proteínas en la muestra biológica; y combinaciones de los mismos; y

(d) extraer ácido nucleico de los materiales resultantes.

2. El método de la reivindicación 1, en el que el agente de afinidad comprende un anticuerpo, un aptámero, un análogo de aptámero o un polímero impreso molecularmente específico para el marcador.

3. El método de la reivindicación 1, en el que la muestra biológica es orina, suero o plasma.

4. El método de la reivindicación 1, en el que el sustrato señuelo comprende ARN sintético; o en el que la molécula de unión a ARN comprende un anticuerpo anti-ARN, proteína chaperona o una proteína inhibidora de RNasa; o en el que la sustancia desnaturalizante de RNasa comprende una solución o detergente de alta osmolaridad.

5. El método de la reivindicación 1, en el que la operación de mejora de extracción comprende la adición de un inhibidor de RNasa, opcionalmente en el que:

(a) el inhibidor de RNasa tiene una concentración mayor que concentración [1X]; alternativamente, mayor o igual a concentración [5X]; alternativamente, mayor o igual a concentración [10X]; alternativamente, mayor o igual a concentración [25X]; y alternativamente, mayor o igual a concentración [50X]; o

(b) el inhibidor de RNasa es una proteasa.

6. El método de la reivindicación 1, en el que el marcador de superficie es glicoforina A (CD235).

7. El método de la reivindicación 1, en el que la operación de exclusión de afinidad es seguida por una operación de enriquecimiento de afinidad con un agente de afinidad que une uno o más marcadores de superficie.

8. El método de la reivindicación 7, en el que el uno o más marcadores de superficie se selecciona de P-selectina, CD45, L1cam, CD44, CD184, PDGFR, RH, CD3, CD19, CD20, CD56, CD11, CD14, CD90, CD326, o CD324.

9. El método de la reivindicación 7, en el que el uno o más marcadores de superficie se seleccionan de L1cam, CD45, CD3, CD44 o CD184.