CN104717980A - 干细胞增强疗法 - Google Patents

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Abstract

本申请披露了用于治疗患者的方法，该患者将得益于患者的干细胞的刺激，该方法包括给予患者特异性地结合于表达在人未分化干细胞上的MUC1蛋白的表位的抗体。

Description

干细胞增强疗法
背景技术
肿瘤学家遇到的一个问题是，在杀伤患者的癌症的过程中，他们必须平衡化疗的益处和杀伤患者的风险。化疗的威胁生命的副作用之一在于，细胞毒性药物杀伤癌细胞但也杀伤健康细胞以及尤其是杀伤患者的干细胞。在骨髓中干细胞不断再生以向身体供给携带氧的红细胞、抗感染的白细胞、和引起血液凝固的血小板。化疗和放疗能够破坏最终成为血细胞的干细胞，因此将患者生命置于危险之中，其使得医师减少了癌症杀伤治疗。设计制剂来对抗癌症治疗的这些不利影响所遇到的问题在于，血细胞是终末分化细胞，这意味着它们不能分裂来复制它们本身。它们发育自在骨髓中的造血干细胞。这意味着，不可能从患者收集一些红细胞或白细胞并体外扩增(expand)它们，然后将它们注射回到患者。
目前在市场上有不多的药物，其用来在患者中调节干细胞发育。第一组，称作红细胞生成刺激剂(ESA)，包括依泊汀，以商品名Procrit和Epogen销售，以及Aranesp。这些药物用来治疗慢性肾脏疾病患者和化疗诱导贫血癌症患者的贫血。这些药物并不在骨髓中刺激干细胞的生长，而是偏斜患者的干细胞的发育，以致更多变成红细胞谱系的血细胞。通过增加在骨髓中分化成红细胞的干细胞的数目，红细胞生成素针剂和红细胞生成素针剂样药物有助于癌症患者和慢性肾脏疾病患者。
用来刺激生产白细胞，集落刺激因子(CSF)，其包括G-CSF(粒细胞集落刺激因子：商品名为非格司亭)和GM-CSF(粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子：沙格司亭，商品名为白细胞素)的另一类药物会刺激生产白细胞的前体，其可以成熟以成为中性粒细胞、巨噬细胞和树突状细胞，并且可以连同或没有连同环磷酰胺一起来给予。CSF还是干细胞动员者，其引起血细胞祖细胞分泌自骨髓。然而，G-CSF和GM-CSF的缺点在于，它们抑制骨形成。造血干细胞的另一种动员者是CXCR4拮抗剂AMD3100，据报道其动员血细胞祖细胞而没有抑制骨形成。
红细胞生成刺激剂(ESA)和CSF均可以用来加速自化疗效果的血细胞的恢复，在骨髓移植以后使用，在干细胞移植以前或以后使用，其可以被移植到周围血液，和/或用来治疗可以得益于造血干细胞或血细胞或它们的祖细胞的增加的生产的患者。
ESA和CSF均是通过使干细胞的成熟偏斜向着造血干细胞谱系并一定使成熟偏离成其它类型的细胞来发挥作用。可以得出，可能存在不想要的和危险的副作用，其起源于在骨髓中生产的其它类型的细胞的抑制。事实上，FDA最近发出警告，重组人类红细胞生成素α、红细胞生成素针剂或Aranesp的使用会增加患上癌症的风险并且还会增加心肌梗死和中风的风险。
因此，改善将是开发这样的制剂，其刺激生产干细胞或使干细胞的发育偏斜于血细胞谱系，其中经由不同于ESA和CSF的途径的途径。对于现有技术状态的更大的改善将是开发这样的制剂，其刺激在骨髓中干细胞的生产，而不仅仅在一个方向上偏斜它们的成熟。对现有技术状态的甚至更大的改善将是开发一种或多种这样的制剂，其将刺激干细胞的生长，但将并不刺激癌细胞的生长或增加患者的患上另一种癌症的风险。还更大的改善将是开发抗癌剂，其将杀伤癌细胞而没有杀伤患者的干细胞。
发明内容
在一个方面，本发明涉及用于治疗患者的方法，其中患者的血细胞或骨髓细胞已被耗尽，在一些情况下，其可以起因于暴露于辐射，上述方法包括给予患者干细胞特异性抗体。在另一个方面，本发明涉及用于治疗患有低血细胞计数的患者的方法，上述方法包括通过给予患者干细胞特异性抗体来刺激造血干细胞或祖细胞的生长。
在另一个方面，本发明涉及体外刺激骨髓细胞、造血干细胞或祖细胞的生长，然后给予患有低血细胞计数患者的周围血液或骨髓的方法，其中上述方法包括给予患者干细胞特异性抗体。
在另一个方面，本发明涉及用优先结合癌细胞(相比于它结合于干细胞)的抗体测试患者样品来诊断癌症的方法。
在一种优选的实施方式中，将本发明的癌症特异性抗体给予患者，患者的治疗方案还包括用干细胞特异性抗体进行治疗。
在另一个方面，本发明涉及选择用于治疗癌症的治疗性抗体的方法，包括去除(de-selecting)那些结合于干细胞的抗体。类似地，本发明涉及选择用于治疗需要再生血细胞或骨髓细胞的病症的治疗性抗体的方法，包括去除那些结合于癌细胞的抗体。
在一个方面，本发明涉及用于治疗将得益于患者的干细胞的刺激的患者的方法，包括给予患者特异性地结合于表达在人未分化干细胞上的MUC1蛋白的表位的抗体。上述抗体可以特异性地结合于SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10或SEQ IDNO:11的肽的至少6个连续氨基酸。尤其是，抗体不可结合于SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8的肽。患者可以患有癌症。患者可以患有癌症并正在接受化疗或放疗。或者，患者可以患有慢性肾脏疾病。
在另一个方面，本发明涉及用于治疗患有癌症或具有发展癌症的风险的患者的方法，包括给予患者一种抗体，该抗体特异性地结合于表达在癌细胞上但并不表达在人未分化干细胞上的MUC1蛋白的表位。上述抗体可以特异性地结合于SEQ ID NO:3的肽但不可结合于SEQ ID NO:4的肽。
在又一个方面，本发明涉及用于治疗被诊断为患有MUC1阳性癌症的患者的方法，包括给予患者单价癌细胞特异性抗体。
在另一个方面，本发明涉及用于治疗被诊断为患有MUC1阳性癌症的患者的方法，包括给予患者单价癌细胞特异性抗体。
在另一个方面，本发明涉及用于治疗被诊断为患有MUC1阳性癌症的患者的方法，包括给予患者单价癌细胞特异性抗体和二价干细胞特异性抗体。
在另一个方面，本发明涉及用于增殖干细胞或祖细胞的方法，包括使上述细胞接触特异性地结合于表达在人干细胞上的MUC1蛋白的表位的抗体，而没有引起癌细胞的增殖。
在再一个方面，本发明涉及用于获得特异性地结合于干细胞但并不结合于癌细胞的抗体的方法，包括以下步骤：
(i)生成混合组的抗体，其识别一种肽，该肽的序列是具有SEQ IDNO:1-11的序列的任何肽的序列；
(ii)选择那些抗体，其结合于SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ IDNO:6的肽，但并不结合于SEQ ID NO:3的肽；
(iii)选择那些抗体，当被吸附到表面上时，其促进干细胞的附着；以及
(iv)选择那些抗体，其当处于二价形式时刺激干细胞的生长，而当处于单价形式时抑制干细胞的生长，同时对癌细胞没有影响。
附图说明
图1是草图，其描绘了识别MUC1*受体的二价抗体如何刺激生长，但那些抗体的单价Fab则抑制生长，其中通过阻断它与其关联配体，二聚体NM23，的相互作用。二价抗体模拟配体NM23的活性以使癌细胞或干细胞生长；单价Fab则阻断它们的生长。
图2是来自ELISA实验的图，其示出各种抗体克隆与PSMGFR肽，其缺少N端10个氨基酸(NΔ10：SEQ ID NO:3)，或PSMGFR肽，其缺少C端10个氨基酸(CΔ10：SEQ ID NO:4)，的结合。图2示出亚克隆对于在肽SED ID NO:3，“NΔ10”和SEQ ID NO:4，“CΔ10”上的MUC1*和MUC1*的滴度。
图3示出FACS，其示出MUC1阳性T47D乳腺癌细胞对癌细胞特异性抗体C2(MIN-C2)或干细胞特异性抗体C3(2D6C3)的反应，以及以图形方式表示的数据。图3示出活MUC1*(+)乳腺癌细胞(T47D细胞)的FACS汇总：仅癌细胞抗体(C2)识别癌细胞；干细胞抗体(C3)则并不识别癌细胞。
图4示出FACS，其示出MUC1阳性ZR-75-1乳腺癌细胞对癌症特异性抗体C2(MIN-C2)或干细胞特异性抗体C3(2D6C3)的反应，以及以图形方式表示的数据。图4示出活MUC1*(+)乳腺癌细胞(1500(ZR-75-1细胞))的FACS汇总；单克隆抗体C2(MIN-C2)结合于癌细胞。C3(2D6C3)并不结合于乳腺癌细胞。
图5示出FACS，其示出MUC1阳性DU145前列腺癌细胞对癌症特异性抗体C2(MIN-C2)或干细胞特异性抗体C3(2D6C3)的反应，以及以图形方式表示的数据。图5示出MUC1*(+)前列腺癌细胞(DU145细胞)的FACS汇总：癌细胞抗体C2(MIN-C2)和E6(MIN-E6)结合于MUC1阳性前列腺癌细胞DU145；干细胞抗体C3(2D6C3)则没有。
图6示出FACS，其示出MUC1阳性胚胎BGO1V/hOG人干细胞、MUC1阳性T47D乳腺癌细胞、或MUC1阳性DU145前列腺癌细胞对干细胞特异性抗体C3(2D6C3)的反应，以及以图形方式表示的数据。图6示出，干细胞抗体(C3)识别干细胞，但并不识别癌细胞。
图7示出在存在对照8nM NM23(二聚体的)、200ug/ml二价C3(2D6C3)干细胞特异性单克隆抗体、或200ug/ml二价C8(2D6C8)干细胞特异性单克隆抗体的情况下在平板中生长的BGO1V/hOG胚胎干细胞的照片。在72小时生长期以后并以Vialight法来测量得到的细胞并作图(如图所示)。图7示出，二价干细胞抗体C3(2D6C3)和C8(2D6C8)比天然配体NM23更好地刺激干细胞生长。
图8示出在存在对照8nM NM23(二聚体的)或二价C3(2D6C3)干细胞特异性单克隆抗体(在所示浓度下)的情况下在平板中生长的BGO1V/hOG胚胎干细胞的照片。在72小时生长期以后并以Vialight法来测量得到的细胞并作图(如图所示)。利用Vialight法来测量细胞计数。
图9示出在存在对照8nM NM23(二聚体的)或二价C8(2D6C8)干细胞特异性单克隆抗体(在所示浓度下)的情况下在平板中生长的BGO1V/hOG胚胎干细胞的照片。在72小时生长期以后并以Vialight法来测量得到的细胞，并作图(如图所示)。利用Vialight法来测量细胞计数。
图10示出在存在对照8nM NM23(二聚体的)或癌症特异性单克隆抗体C2(MIN-C2)的Fab或干细胞特异性单克隆抗体C3(2D6C3)的Fab(在所指示的浓度下)的情况下，在平板中生长的BGO1V/hOG胚胎干细胞的照片，其表明，仅C3Fab在100ug/ml下显著抑制干细胞的生长。
图11示出在存在对照8nM NM23(二聚体的)或癌症特异性单克隆抗体C2(MIN-C2)和E6(MIN-E6)的Fab的情况下在平板中生长的BGO1V/hOG胚胎干细胞的照片，其表明，癌症特异性抗体均不抑制干细胞的生长。
图12示出在用对照(Ctrl)8nM NM23(二聚体的)或干细胞特异性单克隆抗体C3(2D6C3)和C8(2D6C8)的Fab或用癌症特异性单克隆抗体E6(MIN-E6)的Fab处理干细胞以后，测得的Tra 1-60，在未分化干细胞上的一种标志物，的图形。结果表明，通过另一个措施，癌症特异性抗体并不抑制干细胞的生长。图12表明，干细胞抗体的Fab会抑制干细胞生长并引起多能性标志物Tra 1-60的丧失；在这里，我们表明，干细胞单克隆抗体C3和C8的Fab会减少干细胞标志物Tra 1-60的表达；癌细胞抗体E6的Fab对BG01V细胞生长的抑制没有影响：在t＝72小时时测量Fab的影响。
图13示出在用癌症特异性抗体C2的Fab(CA-C2-Fab(MIN-C2))、E6的Fab(CA-E6-Fab(MIN-E6))或干细胞特异性抗体C3的Fab(STEM-C3-Fab(2D6C3))或C8的Fab(STEM-C8-Fab(2D6C8))处理以后，MUC1阳性DU145前列腺癌细胞的照片，其表明，仅癌症特异性抗体的Fab抑制癌细胞的生长。图13表明，干细胞特异性mAb(C3和C8)并不结合于DU145前列腺癌细胞并且并不抑制癌细胞生长；癌症特异性mAb(C2和E6)的Fab则结合于DU145前列腺癌细胞并且抑制癌细胞生长。Fab结合于并阻断MUC1*的配体诱导的二聚化。
图14示出在用癌症特异性抗体C2的Fab(CA-C2-Fab(MIN-C2))、E6的Fab(CA-E6-Fab(MIN-E6))或干细胞特异性抗体C3的Fab(STEM-C3-FAB(2D6C3))或C8的Fab(STEM-C8-Fab(2D6C8))处理以后，MUC1阳性T47D乳腺癌细胞的细胞计数的照片和图形，其表明，仅癌症特异性抗体的Fab抑制癌细胞的生长。图14表明，干细胞特异性mAb(C3和C8)并不结合于癌细胞并且并不抑制癌细胞生长；癌症特异性mAb(C2和E6)的Fab则结合于癌细胞并且抑制癌细胞生长。
图15示出在用癌症特异性抗体C2的Fab(C2-Fab(MIN-C2))、E6的Fab(E6-Fab(MIN-E6))或干细胞特异性抗体C3的Fab(C3-Fab(2D6C3))或C8的Fab(C8-Fab(2D6C8))处理以后，MUC1阳性DU145前列腺癌细胞的照片以及细胞计数的图形，其表明，仅癌症特异性抗体的Fab抑制癌细胞的生长。
图16是在用癌症特异性抗体C2的Fab(C2-Fab(MIN-C2))、E6的Fab(E6-Fab(MIN-E6))或干细胞特异性抗体C3的Fab(C3-Fab(2D6C3))或C8的Fab(C8-Fab(2D6C8))处理以后，MUC1阴性PC3前列腺癌细胞(其是MUC1阴性的)的细胞计数的图形，其表明，没有Fab对MUC1阴性癌细胞具有任何影响。
图17是实验结果的图示，其中裸鼠被异种移植有人T47D乳腺肿瘤，然后用赋形剂(对照)或80mg/kg E6(MIN-E6)Fab加以治疗，每周两次。在移植后的第14天开始治疗，然后暂停15天，然后恢复。图17表明，借助于雌激素颗粒，人乳腺癌肿瘤(T47D)被植入雌性Nu/Nu小鼠；抗MUC1*Fab抑制肿瘤生长。
图18显示，抗MUC1*Fab缩小肿瘤并减少MUC1*生长因子受体的表达。图18示出来自这项研究的两只小鼠的照片。
图19示出异种移植有人前列腺肿瘤系DU145的NOD/SCID小鼠的肿瘤容积的图形，其中一半小鼠用每48小时160mg/kg的E6 Fab加以治疗，以及另一半则用单独的赋形剂加以治疗。图19说明，抗MUC1*Fab抑制植入雄性NOD/SCID小鼠的DU145肿瘤的生长。miR-145，除V8之外，低miR＝高肿瘤容积，除Fab 5之外，高miR-145＝低肿瘤容积。
图20示出来自切除自所研究小鼠的肿瘤的微RNA 145水平的Western印迹和图形，其表明，通常，用E6 Fab加以治疗的肿瘤变为比对照组具有更少的MUC1*生长因子受体，以及更多的微RNA145，其发信号给细胞以进行分化。图20表明，用抗MUC1*Fab加以治疗的动物表达较少的MUC1*生长因子受体(在治疗后)并变得更加分化的(miR-145增加)。
图21示出异种移植有人前列腺肿瘤系DU145的NOD/SCID小鼠的肿瘤容积的图，其中，当它们的肿瘤超过400mm3以上时开始治疗一半小鼠，以及当它们的肿瘤为175mm3至300mm3时，开始治疗另一半。用E6Fab来治疗一半较大肿瘤以及仅用赋形剂来治疗另一半。类似地，将第二组分为：用E6 Fab来治疗，每48小时160mg/kg，以及仅用赋形剂来治疗另一半。结果表明，在两组中Fab均降低肿瘤生长速率，然而开始于较小肿瘤的组要好得多。图21示出归一化肿瘤生长：在NOD/SCID雄性小鼠中，DU145人前列腺癌。在27天生长以后组1和组2肿瘤是非常大的：在开始治疗时为350-550mm3。在开始治疗时组3和组4肿瘤是175-300mm3。尽管尺寸差异，两个赋形剂组快速合并为相同的生长速率和尺寸；较小肿瘤比非常大肿瘤反应更好(如预期的)；160mg/kg，每48小时。
图22示出接收模拟治疗的携带人前列腺肿瘤的小鼠的照片。
图23示出接收癌症特异性E6(MIN-E6)Fab的携带人前列腺肿瘤的小鼠的照片。
图24示出抗MUC1*IgG单克隆抗体轻链可变区序列。
图25示出抗MUC1*IgG单克隆抗体重链可变区序列。
图26示出MIN-C2(单链片段可变区)设计(重链可变区–接头–轻链可变区)的氨基酸序列。在细菌中表达scFv构建物并利用C端多组氨酸(HHHHHH)标记加以纯化。
图27示出MIN-E6scFv(单链片段可变区)设计(重链可变区(MIN-E6VH7)–接头–轻链可变区)的氨基酸序列。在细菌中表达scFv构建物并利用C端多组氨酸(HHHHHH)标记加以纯化。
图28示出2D6C3κ链可变区的氨基酸序列。CDR1：RSSQTIVHSNGNTYLE(SEQ ID NO:70)；CDR2：KVSNRFS(SEQ IDNO:71)；以及CDR3：FQGSHVPFT(SEQ ID NO:72)。
图29示出2D6C3重链可变区的氨基酸序列。CDR1：GYAMS(SEQID NO:73)；CDR2：TISSGGTYIYYPDSVKG(SEQ ID NO:74)；以及CDR3：LGGDNYYEY(SEQ ID NO:75)。
图30示出2D6C8κ链可变区的氨基酸序列。CDR1：RASKSVSTSGYSYMH(SEQ ID NO:76)；CDR2：LVSNLES(SEQ IDNO:77)；以及CDR3：QHIRELTRSE(SEQ ID NO:78)。
图31示出2D6C8重链可变区的氨基酸序列。CDR1：GYAMS(SEQID NO:79)；CDR2：TISSGGTYIYYPDSVKG(SEQ ID NO:80)；以及CDR3：LGGDNYYEY(SEQ ID NO:81)。
图32示出3C2B1κ链可变区的氨基酸序列。CDR1：RASKSISTSDYNYIH(SEQ ID NO:82)；CDR2：LASNLES(SEQ IDNO:83)；以及CDR3：QHSRELPLTF(SEQ ID NO:84)。
图33示出3C2B1重链可变区的氨基酸序列。CDR1：TYTMS(SEQID NO:85)；CDR2：TISTGGDKTYYSDSVKG(SEQ ID NO:86)；以及CDR3：GTTAMYYYAM(SEQ ID NO:87)。
具体实施方式
本发明披露了抗体和抗体变体，其调节涉及MUC1*的途径，其中一组抗体优先结合于MUC1*(当它存在于干细胞上时)但并不识别在癌细胞上的MUC1*，以及另一组抗体优先结合于MUC1*(当它存在于癌细胞上时)但并不识别在干细胞上的MUC1*。本发明进一步披露了用于确定属于这些类别的其它抗体的方法。本发明进一步披露了第一组抗体(以下称为“干细胞抗体”)用于体外和体内刺激干细胞生长的方法。本发明还披露了第二组抗体(以下称为“癌细胞抗体”)用于体外和体内抑制癌细胞生长的方法。
在本申请中，以及在本申请对其要求优先权的所有申请中，在优先权申请以及在本申请中披露的抗体的名称是一致的。例如，癌症特异性抗体MIN-C2(在本文中以及在本申请对其要求优先权的申请中还被称为“C2”)或MIN-E6(在本文中以及在本申请对其要求优先权的申请中还被称为“E6”)是结构上和序列上(sequence-wise)相同的抗体，如在本申请中以及在本申请对其要求优先权的申请中所提及的。同样，干细胞特异性抗体2D6C3(在本文中以及本申请对其要求优先权的申请中还被称为“C3”)或2D6C8(在本文中以及在本申请对其要求优先权的申请中还被称为“C8”)是结构上和序列上相同的抗体，如在本申请中以及在本申请对其要求优先权的申请中所提及的。
在一种优选的实施方式中，将选自干细胞抗体组的二价抗体给予患者，用于刺激患者的干细胞或祖细胞的生长。在一种优选的实施方式中，祖细胞是造血干细胞。在另一种实施方式中，选自干细胞抗体组的二价抗体体内用于刺激患者的干细胞或祖细胞(其已使用另一种试剂，如CSF动员)的生长。在另一种实施方式中。选自干细胞抗体组的二价抗体体外用于刺激人的动员的干细胞的生长，其中上述人的动员的干细胞已提取自宿主用于后来移植：自体地或作为供体细胞移植至另外的同种异体移植物。在又一种实施方式中，选自干细胞抗体组的二价抗体用来刺激体内干细胞的生长。在另一种实施方式中，选自干细胞抗体组的二价抗体用于在一组细胞中诱导多能性或诱导较少分化状态。在另一种实施方式中，选自干细胞抗体组的抗体用来鉴定、选择、分离或捕获，包括在生长表面上捕获，干细胞或祖细胞。在一种优选的实施方式中，上文提到的干细胞和/或祖细胞是人起源。干细胞抗体可以用来加速在暴露于辐射、毒素或化疗以后血细胞的恢复，其是在骨髓移植以后使用，在干细胞移植以前或以后使用，其可以被移植到周围血液，和/或用来治疗这样的患者，其可以得益于造血干细胞或血细胞或它们的祖细胞的增加的生产。
在一种实施方式中，选自癌细胞抗体组的抗体用来治疗癌症患者。在一种优选的实施方式中，选自癌细胞抗体组的抗体预防MUC1蛋白的MUC1*部分的二聚化，其是大多数通过PSMGFR序列N端GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA–C端(SEQ ID NO:1)来举例说明。在一种更优选的实施方式中，选自癌细胞抗体组、用来治疗癌症患者的抗体是单价的，包括Fab、单链构建物以及其它抗体，包括工程抗体样剂，其结合于PSMGFR序列的一部分并预防它的配体诱导的二聚化。
MUC1*一般是指MUC1蛋白或选择性剪接同种型，其缺乏一些或所有的它的自聚集域GFLGLSNIKFRPGSVVVQLTLAFREG(SEQ IDNO:2)。尤其是，MUC1*是指缺少串联重复单元的MUC1变体。在大多数情况下，MUC1*是跨膜切割产物，其胞外域主要由PSMGFR序列的显著部分构成。由于可以在许多位置处切割MUC1，所以切割的确切位点可以因细胞类型而变化。
通常，属于在本文中称作“癌细胞抗体”的组的抗体结合于35个氨基酸，其是在PSMGFR序列的C末端处：QFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(SEQ ID NO:3，在一些图中还被称为“NΔ10”)。
通常，属于在本文中称作“干细胞抗体”的组的抗体结合于35个氨基酸，其是在PSMGFR序列的N末端处：GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDV(SEQ ID NO:4，在一些图中还被称为“CΔ10”)，但还可以结合从N端延伸自SEQ ID NO:4的肽的肽，即包括SEQ ID NO:4的十(10)个氨基酸N端，其是VVQLTLAFRE(SEQ ID NO:5)。可替换地，基于它们结合于序列VVQLTLAFREGTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDV(SEQID NO:6)的肽的能力来选择属于干细胞抗体组的抗体。在一种优选的实施方式中，干细胞抗体并不结合于肽SEQ ID NO:3。
属于癌细胞抗体组的抗体结合于一种肽，其包含SEQ ID NO:3的肽的6-35个连续氨基酸，上述肽可以进一步含有多达4个氨基酸置换(氨基酸取代，amino acid substitution)。
属于干细胞抗体组的抗体结合于一种肽，其含有SEQ ID NO:4、SEQID NO:5、或SEQ ID NO:6的肽的6-35个连续氨基酸序列，上述肽可以进一步含有多达4个氨基酸置换。
为了产生癌细胞抗体，使用的免疫原性肽或抗原性肽含有SEQ IDNO:3的肽的6-35个连续氨基酸序列，上述肽可以进一步含有多达4个氨基酸置换。在一种优选的实施方式中，更为C端的肽的部分用来产生癌细胞抗体。例如，含有氨基酸ASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(SEQ IDNO:7)或DVSVSDVPFPFSAQSGA(SEQ ID NO:8)的肽用来产生癌细胞抗体。为了生成本发明的癌细胞抗体，本发明还包括用于生成人源化抗体、选择人抗体、生成抗体样蛋白的方法，其中肽并不用来免疫所使用的的动物，或使用编码它的核酸，以选择抗体或抗体样蛋白，其识别来自SEQ IDNO:3的肽的至少6个连续氨基酸，如SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8的肽。另外，SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8的肽可以用来选择这样的抗体，其特异性地调节癌细胞但不是干细胞的生长，其中借助于这样的抗体，其结合于更为C端部分如SEQ ID NO:7的肽，优选地其中SEQ IDNO:8是特别优选的。噬菌体展示技术可以用来选择结合于肽的抗体或抗体样蛋白，其中上述肽将其识别为癌症特异性抗体。可替换地，利用整个PSMGFR肽来生成抗体，并且基于它们结合于肽(其含有SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8的肽的6-35个连续氨基酸序列)的能力来选择癌细胞抗体，上述肽可以进一步含有多达4个氨基酸置换。
为了产生干细胞抗体，使用的免疫原性肽或抗原性肽包含SEQ IDNO:4或SEQ ID NO:5的肽或具有来自上述两者的序列的肽的6-35个连续氨基酸序列，如在SEQ ID NO:6中，上述肽可以进一步含有多达4个氨基酸置换。在一种优选的实施方式中，肽的更为N端的部分用来产生干细胞抗体。例如包含氨基酸VVQLTLAFREGTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNL(SEQ ID NO:9)的肽优选用于生成干细胞抗体。更优选的是这样的肽，其包含来自上述肽的连续氨基酸。可替换地，利用整个PSMGFR肽来产生抗体，并基于它们结合于肽(其包含SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的肽的6-35个连续氨基酸序列)的能力来选择干细胞抗体，上述肽可以进一步含有多达4个氨基酸置换。
用于干细胞特异性抗体的生成或选择的GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNL(SEQ ID NO:10)。还更优选的是包含来自GTINVHDVETQFNQY(SEQ ID NO:11)的连续氨基酸的肽。为了干细胞抗体的生成，本发明还包括用于生成人源化抗体、选择人抗体、或生成抗体样蛋白的方法，其中肽并不用来免疫所使用的动物，或使用编码它的核酸，以选择抗体或抗体样蛋白，其识别来自SEQ ID NO:4、SEQID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11的肽的至少6个连续氨基酸，其中SEQ ID NO:10是特别优选的。噬菌体展示技术可以用来选择抗体或抗体样蛋白，其结合于将其识别为干细胞特异性抗体的肽。
在一种优选的实施方式中，属于癌细胞抗体组的抗体将结合于MUC1阳性癌细胞，如通过ICC、FACS或其它类似分析所确定的，其中上述其它类似分析包括ELISA和噬菌体展示，其中抗体结合于包含SEQ ID NO:3的一些或所有氨基酸的肽。在一种优选的实施方式中，抗体结合于肽，其包含在SEQ ID NO:3的C端处的最后20个氨基酸。在一种更优选的实施方式中，抗体结合于肽，其仅包含在SEQ ID NO:3的肽的C端处的最后10个氨基酸。在一种仍然更优选的实施方式中，属于癌细胞抗体组的抗体结合于MUC1阳性癌细胞但并不结合于干细胞或祖细胞。此外，借助于它们刺激癌细胞生长(当它们是二价时)和抑制癌细胞生长(当它们是单价(例如Fab)时)的能力来选择属于癌细胞抗体组的抗体。在一种还更优选的实施方式中，抗体的二价和单价形式将均不影响干细胞的生长。
在一种优选的实施方式中，属于干细胞抗体组的抗体结合于干细胞和/或祖细胞，如通过ICC、FACS或其它类似分析所确定的，其中上述其它类似分析包括ELISA和噬菌体展示，其中抗体结合于包含SEQ ID NO:4的一些或所有氨基酸的肽。在一种优选的实施方式中，干细胞和/或祖细胞是人起源。在另一种优选实施方式中，抗体结合于肽，其仅包含在SEQ IDNO:4的N端处的20个氨基酸。在一种更优选的实施方式中，抗体将结合于肽，其仅包含在SEQ ID NO:4的肽的N端处的10个氨基酸。可替换地，抗体将结合于SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6的肽，或包含来自组合SEQ IDNO:4和5的连续氨基酸的肽。在一种仍然更优选的实施方式中，属于干细胞抗体组的抗体将结合于人干细胞和/或祖细胞但并不结合于MUC1阳性癌细胞。此外，将借助于它们刺激干细胞和/或祖细胞生长(当它们是二价时)和抑制干细胞和/或祖细胞生长(当它们是单价，例如Fab，时)的能力来选择属于干细胞抗体组的抗体。在一种还更优选的实施方式中，抗体的二价和单价形式将均不影响癌细胞的生长。
通过标准方法来产生单克隆抗体并基于本文陈述的选择标准来选择产生抗体的杂交瘤。单克隆抗体2D6C3和2D6C8(在本文中还被分别称为C3和C8)被确定为干细胞抗体。它们的序列示于图28至图33。单克隆抗体C2和E6被确定为癌细胞特异性抗体。单克隆抗体C2(MIN-C2)和E6(MIN-E6)的序列示于图24至图27。
gaggtccagctggaggagtcagggggaggcttagtgaagcctggagggtccctgaaactctcctgtgcagcctctggattcactttcagtggctatgccatgtcttgggttcgccagactccggagaagaggctggagtgggtcgcaaccattagtagtggtggtacttatatctactatccagacagtgtgaaggggcgattcaccatctccagagacaatgccaagaacaccctgtacctgcaaatgagcagtctgaggtctgaggacacggccatgtattactgtgcaagacttgggggggataattactacgaatacttcgatgtctggggcgcagggaccacggtcaccgtctcctccgccaaaacgacacccccatctgtctat(SEQ ID NO:12)描述了MIN-C2重链可变区。
EVQLEESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSGYAMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGTYIYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRSEDTAMYYCARLGGDNYYEYFDVWGAGTTVTVSSAKTTPPSVY(SEQ IDNO:13)描述了MIN-C2重链可变区。
gacattgtgatcacacagtctacagcttccttaggtgtatctctggggcagagggccaccatctcatgcagggccagcaaaagtgtcagtacatctggctatagttatatgcactggtaccaacagagaccaggacagccacccaaactcctcatctatcttgcatccaacctagaatctggggtccctgccaggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcaccctcaacatccatcctgtggaggaggaggatgctgcaacctattactgtcagcacagtagggagcttccgttcacgttcggaggggggaccaagctggagataaaacgggctgatgctgcaccaactgtatcc(SEQ IDNO:14)描述了MIN-C2κ链可变区。
DIVITQSTASLGVSLGQRATISCRASKSVSTSGYSYMHWYQQRPGQPPKLLIYLASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHSRELPFTFGGGTKLEIKRADAAPTVS(SEQ ID NO:15)描述了MIN-C2κ链可变区。
gaggttaagctggaggagtctgggggagacttagtgaagcctggagggtccctgaaactctcctgtgcagcctctggattcactttcagtagatatggcatgtcttgggttcgccagactccagacaagaggctggagtgggtcgcaaccattagtagtggtggtacttacatctactatccagacagtgtgaaggggcgattcaccatctccagagacaatgccaagaacaccctgtacctgcaaatgagcagtctgaagtctgaggacacagccatgtattactgtgcaagggataactacggtagtagctacgactatgctatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctcagccaaaacaacagccccatcggtctat(SEQ ID NO:16)描述了MIN-E6重链-7可变区。
EVKLEESGGDLVKPGGSLKLSCAASGFTFSRYGMSWVRQTPDKRLEWVATISSGGTYIYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYYCARDNYGSSYDYAMDYWGQGTSVTVSSAKTTAPSVY(SEQ IDNO:17)描述了MIN-E6重链-7可变区。
gaggtaaagctggaggagtctgggggagacttagtgaagcctggagggtccctgaaactctcctgtgtagtctctggattcactttcagtagatatggcatgtcttgggttcgccagactccaggcaagaggctggagtgggtcgcaaccattagtggtggcggtacttacatctactatccagacagtgtgaaggggcgattcaccatctccagagacaatgccaagaacaccctgtacctgcaaatgagcagtctgaagtctgaggacacagccatgtatcactgtacaagggataactacggtaggaactacgactacggtatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctcagccaaaacaacagccccatcggtctatccactggcccctgtgtgtggagatacaactggctcctcggtgactctaggatgcctggtcaag(SEQ ID NO:18)描述了MIN-E6重链-8可变区。
EVKLEESGGDLVKPGGSLKLSCVVSGFTFSRYGMSWVRQTPGKRLEWVATISGGGTYIYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYHCTRDNYGRNYDYGMDYWGQGTSVTVSSAKTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVK(SEQ ID NO:19)描述了MIN-E6重链-8可变区。
gatattgtgatcacccagactacagcaatcatgtctgcatctccaggggaggaggtcaccctaacctgcagtgccacctcaagtgtaagttacatacactggttccagcagaggccaggcacttctcccaaactctggatttatagcacatccaacctggcttctggagtccctgttcgcttcagtggcagtggatatgggacctcttactctctcacaatcagccgaatggaggctgaagatgctgccacttattactgccagcaaaggagtagttccccattcacgttcggctcggggacaaagttggaaataaaacgggctgatgctgcaccaactgtatcc(SEQ ID NO:20)描述了MIN-E6κ链可变区。
DIVITQTTAIMSASPGEEVTLTCSATSSVSYIHWFQQRPGTSPKLWIYSTSNLASGVPVRFSGSGYGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQRSSSPFTFGSGTKLEIKRADAAPTVS(SEQ ID NO:21)描述了MIN-E6κ链可变区。
gaggtccagctggaggagtctgggggaggcttagtgaagcctggagggtccctgaaactctcctgtgcagcctctggattcactttcagtggctatgccatgtcttgggttcgccagactccggagaagaggctggagtgggtcgcaaccattagtagtggtggtacttatatctactatccagacagtgtgaaggggcgattcaccatctccagagacaatgccaagaacaccctgtacctgcaaatgagcagtctgaggtctgaggacacggccatgtattactgtgcaagacttgggggggataattactacgaatacttcgatgtctggggcgcagggaccacggtcaccgtctcctccgccaaaacgacacccccatctgtctatccactggcccctggatctgctgcccaaactaactccatggtgaccctgggatgcctggtcaagggctatttccctgagccagtgacagtgacctggaactctggatccctgtccagcggtgtgcacaccttcccagctgtcctgcagtctgacctctacactctgagcagctcagtgactgtcccctccagcacctggcccagcgagaccgtcacctgcaacgttgcccacccagccagcaggaccgcg(SEQ ID NO:22)描述了MIN-C2 Fab重链。
gacattgtgatcacacagtctacagcttccttaggtgtatctctggggcagagggccaccatctcatgcagggccagcaaaagtgtcagtacatctggctatagttatatgcactggtaccaacagagaccaggacagccacccaaactcctcatctatcttgcatccaacctagaatctggggtccctgccaggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcaccctcaacatccatcctgtggaggaggaggatgctgcaacctattactgtcagcacagtagggagcttccgttcacgttcggaggggggaccaagctggagataaaacgggctgatgctgcaccaactgtatccatcttcccaccatccagtgagcagttaacatctggaggtgcctcagtcgtgtgcttcttgaacaacttctaccccaaagacatcaatgtcaagtggaagattgatggcagtgaacgacaaaatggcgtcctgaacagttggactgatcaggacagcaaagacagcacctacagcatgagcagcaccctcacgttgaccaaggacgagtatgaacgacataacagctatacctgtgaggccactcacaagacatcaacttcacccattgtcaagagcttcaacaggaatgagtgt(SEQ IDNO:23)描述了MIN-C2Fabκ链。
EVQLEESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSGYAMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGTYIYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRSEDTAMYYCARLGGDNYYEYFDVWGAGTTVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASRTA(SEQ ID NO:24)描述了MIN-C2Fab重链。
DIVITQSTASLGVSLGQRATISCRASKSVSTSGYSYMHWYQQRPGQPPKLLIYLASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHSRELPFTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC(SEQ ID NO:25)描述了MIN-C2Fabκ链。
RADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC(SEQ ID NO:26)描述了MIN-C2轻CL区氨基酸序列。
FDVWGAGTTVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASRTA(SEQ ID NO:27)描述了MIN-C2重链CH1区氨基酸序列。
DIVITQSTASLGVSLGQRATISC(SEQ ID NO:28)描述了MIN-C2轻链可变构架区1(FWR1)氨基酸序列。
DIVITQTTAIMSASPGEEVTLTC(SEQ ID NO:29)描述了MIN-E6轻链可变构架区1(FWR1)氨基酸序列。
RASKSVSTSGYSYMH(SEQ ID NO:30)描述了MIN-C2轻链可变互补决定区1(CDR1)氨基酸序列。
SATSSVSYIH(SEQ ID NO:31)描述了MIN-E6轻链可变互补决定区1(CDR1)氨基酸序列。
WYQQRPGQPPKLLIY(SEQ ID NO:32)描述了MIN-C2轻链可变构架区2(FWR2)氨基酸序列。
WFQQRPGTSPKLWIY(SEQ ID NO:33)描述了MIN-E6轻链可变构架区2(FWR2)氨基酸序列。
LASNLES(SEQ ID NO:34)描述了MIN-C2轻链可变互补决定区2(CDR2)氨基酸序列。
STSNLAS(SEQ ID NO:35)描述了MIN-E6轻链可变互补决定区2(CDR2)氨基酸序列。
GVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYC(SEQ ID NO:36)描述了MIN-C2轻链可变构架区3(FWR3)氨基酸序列。
GVPVRFSGSGYGTSYSLTISRMEAEDAATYYC(SEQ ID NO:37)描述了MIN-E6轻链可变构架区3(FWR3)氨基酸序列。
QHSRELPFT(SEQ ID NO:38)描述了MIN-C2轻链可变互补决定区3(CDR3)氨基酸序列。
QQRSSSPFT(SEQ ID NO:39)描述了MIN-E6轻链可变互补决定区3(CDR3)氨基酸序列。
EVQLEESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFS(SEQ ID NO:40)描述了MIN-C2重链可变构架区1(FWR1)氨基酸序列。
EVKLEESGGDLVKPGGSLKLSCAASGFTFS(SEQ ID NO:41)描述了MIN-E6-7重链可变构架区1(FWR1)氨基酸序列。
EVKLEESGGDLVKPGGSLKLSCVVSGFTFS(SEQ ID NO:42)描述了MIN-E6-8重链可变构架区1(FWR1)氨基酸序列。
GYAMS(SEQ ID NO:43)描述了MIN-C2重链可变互补决定区1(CDR1)氨基酸序列。
RYGMS(SEQ ID NO:44)描述了MIN-E6-7重链可变互补决定区1(CDR1)氨基酸序列。
RYGMS(SEQ ID NO:45)描述了MIN-E6-8重链可变互补决定区1(CDR1)氨基酸序列。
WVRQTPEKRLEWVA(SEQ ID NO:46)描述了MIN-C2重链可变构架区2(FWR2)氨基酸序列。
WVRQTPDKRLEWVA(SEQ ID NO:47)描述了MIN-E6-7重链可变构架区2(FWR2)氨基酸序列。
WVRQTPGKRLEWVA(SEQ ID NO:48)描述了MIN-E6-8重链可变构架区2(FWR2)氨基酸序列。
TISSGGTYIYYPDSVKG(SEQ ID NO:49)描述了MIN-C2重链可变互补决定区2(CDR2)氨基酸序列。
TISSGGTYIYYPDSVKG(SEQ ID NO:50)描述了MIN-E6-7重链可变互补决定区2(CDR2)氨基酸序列。
TISGGGTYIYYPDSVKG(SEQ ID NO:51)描述了MIN-E6-8重链可变互补决定区2(CDR2)氨基酸序列。
RFTISRDNAKNTLYLQMSSLRSEDTAMYYCAR(SEQ ID NO:52)描述了MIN-C2重链可变构架区3(FWR3)氨基酸序列。
RFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYYCAR(SEQ ID NO:53)描述了MIN-E6-7重链可变构架区3(FWR3)氨基酸序列。
RFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYHCTR(SEQ ID NO:54)描述了MIN-E6-8重链可变构架区3(FWR3)氨基酸序列。
LGGDNYYEY(SEQ ID NO:55)描述了MIN-C2重链可变互补决定区3(CDR3)氨基酸序列。
DNYGSSYDYA(SEQ ID NO:56)描述了MIN-E6-7重链可变互补决定区3(CDR3)氨基酸序列。
DNYGRNYDYG(SEQ ID NO:57)描述了MIN-E6-8重链可变互补决定区3(CDR3)氨基酸序列。
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCA ASGFTFS(SEQ ID NO:58)描述了IGHV3(名称来自Igblast)：FWR1：人IgG抗体构架区序列，其相对于MIN-C2的可变重链区具有84.7％同源性(249/294)。
WVRQAPGKGLEWVS(SEQ ID NO:59)描述了IGHV3(名称来自Igblast)：FWR2：人IgG抗体构架区序列，其相对于MIN-C2的可变重链区具有84.7％同源性(249/294)。
RFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAV(SEQ ID NO:60)描述了IGHV3(名称来自Igblast)：FWR3：人IgG抗体构架区序列，其相对于MIN-C2的可变重链区具有84.7％同源性(249/294)。
DIVLTQSPASLAVSPGQRATITC(SEQ ID NO:61)描述了IGkV7(名称来自Igblast)：FWR1：人IgG抗体构架区序列，其相对于MIN-C2的可变轻链区具有76.4％同源性(226/296)。
WYQQKPGQPPKLLIY(SEQ ID NO:62)描述了IGkV7(名称来自Igblast)：FWR2：人IgG抗体构架区序列，其相对于MIN-C2的可变轻链区具有76.4％同源性(226/296)。
GVPARFSGSGSGTDFTLTINPVEANDTANYY(SEQ ID NO:63)描述了IGkV7(名称来自Igblast)：FWR 3：人IgG抗体构架区序列，其相对于MIN-C2的可变轻链区具有76.4％同源性(226/296)。
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFS(SEQ ID NO:64)描述了IGHV3(名称来自Igblast)：FWR1：人IgG抗体构架区序列，其相对于MIN-E6的可变重链区具有84.1％同源性(249/296)。
WVRQAPGKGLEWVS(SEQ ID NO:65)描述了IGHV3(名称来自Igblast)：FWR2：人IgG抗体构架区序列，其相对于MIN-E6的可变重链区具有84.1％同源性(249/296)。
RFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO:66)描述了IGHV3(名称来自Igblast)：FWR3：人IgG抗体构架区序列，其相对于MIN-E6的可变重链区具有84.1％同源性(249/296)。
EIVMTQSPATLSVSPGERATLSC(SEQ ID NO:67)描述了IGkV3(名称来自Igblast)：FWR1：人IgG抗体构架区序列，其相对于MIN-E6的可变轻链区具有69.5％同源性(187/269)。
WFQQRPGTSPK LLIY(SEQ ID NO:68)描述了IGkV3(名称来自Igblast)：FWR2：人IgG抗体构架区序列，其相对于MIN-E6的可变轻链区具有69.5％同源性(187/269)。
GIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYC(SEQ ID NO:69)描述了IGkV3(名称来自Igblast)：FWR3：人IgG抗体构架区序列，其相对于MIN-E6的可变轻链区具有69.5％同源性(187/269)。
首先通过ELISA来测试通过各种克隆产生的抗体。理想地，癌细胞特异性抗体将结合于肽SEQ ID NO:3，其缺少PSMGFR肽(SEQ ID NO:1)的最后10个N端氨基酸，但并不结合于SEQ ID NO:4的肽，其缺少在PSMGFR肽的C端处的最后10个氨基酸。理想地，干细胞特异性抗体将具有相反的结合模式；它们将结合于SEQ ID NO:4的肽，但并不结合于SEQ ID NO:3的肽。通过ELISA，单克隆抗体2D6C3和2D6C8(在本文中还被分别称为C3和C8)结合于SEQ ID NO:4的肽，但并不结合于SEQID NO:3的肽。相反地，单克隆抗体C2和E6结合于SEQ ID NO:3的肽，但并不结合于SEQ ID NO:4的肽，见图2。
在用来确定对于干细胞具有特异性的单克隆抗体的另一种方法中，将抗体涂布在细胞培养板的表面上。由于人干细胞不是粘着的，所以它们将不附着于培养板，除非培养板涂布有识别在干细胞的表面上的受体的抗体。以这种方式，克隆2D6C3和2D6C8(在本文中还被分别称为C3和C8)被确定为是干细胞特异性抗体。在一种优选的实施方式中，抗体结合于其序列对应于MUC1*胞外域的肽，但并不结合于膜近侧部分(SEQ IDNO:3)。在一种更优选的实施方式中，抗体结合于PSMGFR肽的远侧部分肽(SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6)并且不结合于膜近侧部分(SEQ ID NO:3)。
可以通过FACS来另外测试单克隆抗体的结合特异性，以确定它们是否结合于癌细胞或干细胞。图3-图6示出FACS数据，其共同显示，癌症特异性抗体C2(MIN-C2)和E6(MIN-E6)仅结合于MUC1阳性癌细胞，但并不结合于人干细胞。相反地，图3-图6表明，干细胞抗体2D6C3和2D6C8仅结合于干细胞，但并不结合于癌细胞。
作为用来确定单克隆抗体的特异性的又一种测试，可以测试它们对干细胞或癌细胞的生长的影响。如在图1的草图中可以看到的，二价抗MUC1*抗体二聚化MUC1*的胞外域并刺激生长，而单价Fab则抑制生长。测试抗体的二价形式的刺激人干细胞的生长的能力以及测试单价Fab的抑制干细胞的生长的能力。图7-图9示出照片和绘出的数据，其表明，二价干细胞抗体2D6C3和2D6C8(C3和C8)刺激人干细胞生长。图10-图12表明，干细胞抗体C3的Fab，在100uM下，抑制干细胞的生长，但癌症特异性抗体C2(MIN-C2)和E6(MIN-E6)的Fab则不。图13–图15表明，癌症特异性抗体C2(MIN-C2)和E6(MIN-E6)的Fab抑制MUC1阳性癌细胞的生长，但干细胞特异性抗体2D6C3和2D6C8(C3和C8)的Fab则不。图16表明，癌症特异性或干细胞特异性抗体的Fab对于MUC1阴性细胞，如PC3前列腺癌细胞，均没有影响。
作为结合特异性的再一种测试，可以体内测试选择为干细胞特异性的抗体并测定它们刺激干细胞或祖细胞生长的能力。可以体内测试癌症特异性抗体抑制癌细胞生长的能力。在一个实施例中，为了测试利用本发明的方法确定的癌细胞抗体的体内效应，其中已植入雌激素颗粒的雌性裸鼠被异种移植有人乳腺肿瘤细胞(T47D)。在用80mg/kg的E6 Fab，每周两次，来治疗小鼠以前，允许植入肿瘤14天。对同等数目的对照小鼠仅注射缓冲液。在第31天至第45天的14天期限暂停治疗以确定经治疗的小鼠是否将发展对治疗的抗性。图17的图形表明，相比于对照小鼠，E6 Fab有效地降低了肿瘤生长速率和容积。在治疗的14天流逝以后小鼠继续回应E6 Fab的事实表明，它们并没有发展耐药性。图18示出所研究的两只小鼠的照片。
在另一种体内研究中，使雄性NOD/SCID小鼠异种移植有人前列腺肿瘤(DU-145)。在开始治疗或模拟治疗以前，允许肿瘤发展14天。在肿瘤移植60天以后，组被交换；接收癌细胞抗体E6 Fab的小鼠仅被给予缓冲液，以及对照组开始接收E6 Fab。治疗是每24小时给予160mg/kg的E6 Fab。图19的图形表明，治疗组具有比对照组显著更小的肿瘤。在交换治疗组以前，在对照组中的肿瘤比治疗组中的肿瘤大三倍以上。此外，当暂停治疗时，经治疗的小鼠的仅之一具有肿瘤生长的增加。图20是MUC1*的Western印迹，其表明，甚至在没有治疗的2周以后，平均而言，治疗组也具有比对照组更少的MUC1*。另外，图20的图形表明，治疗组具有增加量的它们产生的微RNA-145(miR-145)，其说明，E6 Fab治疗引起癌细胞分化，其限制了它们自我复制的能力。
在用来测试利用本发明方法确定的癌细胞抗体的功效的另一动物研究中，使雄性NOD/SCID小鼠异种移植有人前列腺肿瘤(DU-145)。在开始治疗或模拟治疗以前，允许肿瘤发展27天。将动物分为四组，其中组1和2具有350-500mm3的肿瘤容积以及组3和组4具有175-300mm3的肿瘤容积。治疗是每24小时给予160mg/kg的E6 Fab(组1和3)以及模拟治疗是仅给予缓冲液(组2和组4)。图21的图形表明，在对照小鼠中的肿瘤以相同的速率进行生长而不管它们的起始容积。虽然两个治疗组均具有比对照组小得多的肿瘤，但其肿瘤为175-300mm3的小鼠反应好于携带350-500mm3的肿瘤(在开始治疗以前)的组。图22示出来自对照组的小鼠的代表性照片以及图23示出来自治疗组的小鼠的代表性照片。
因此，可以差不多以和使用ESA和CSF如红细胞生成素针剂和白细胞素的相同的方式来使用干细胞特异性抗体2D6C3和2D6C8(C3和C8)、以及利用本发明方法鉴定或选择的其它单克隆抗体、多克隆抗体和抗体变体，包括以加速自化疗效果的血细胞的恢复，在骨髓移植以后使用，在干细胞移植以前或以后使用，其可以被移植到周围血液，和/或以治疗患者，其可以得益于造血干细胞或血细胞或它们的祖细胞的增加的生产。有几种方法来人源化干细胞特异性抗体2D6C3和2D6C8(C3和C8)、以及利用本发明方法鉴定或选择的其它单克隆抗体、多克隆抗体和抗体变体，其中小鼠单克隆抗体的恒定区被同源人恒定区替代以及其中可变区可以保留为小鼠序列或被同源人序列替代。噬菌体展示技术可以连同本发明的肽一起用来选择最好结合于优选的MUC1*肽的抗体。可替换地，可以从头筛选完全人抗体文库结合于用于选择干细胞特异性抗体的肽或用于选择癌症特异性抗体的肽的能力。如果期望干细胞特异性抗体，则可以在去选择过程中筛查候选抗体结合于癌症特异性肽的能力。
癌症特异性抗体如C2(MIN-C2)和E6(MIN-E6)以及利用本发明方法鉴定或选择的其它单克隆抗体、多克隆抗体和抗体变体可以用来治疗癌症患者，并具有降低的杀伤患者的干细胞或血细胞前体和祖细胞的风险。有几种方法来人源化癌症特异性抗体C2(MIN-C2)和E6(MIN-E6)、以及利用本发明方法鉴定或选择的其它单克隆抗体、多克隆抗体和抗体变体，其中小鼠单克隆抗体的恒定区被同源人恒定区替代以及其中可变区可以保留为小鼠序列或被同源人序列替代。噬菌体展示技术可以连同本发明的肽一起用来选择最好结合于优选的MUC1*肽的抗体。可替换地，可以从头筛选完全人抗体文库结合于用于选择干细胞特异性抗体的肽或用于选择癌症特异性抗体的肽的能力。如果期望癌症特异性抗体，则可以在去选择过程中筛查候选抗体结合于干细胞特异性肽的能力。
本发明包括抗体以及抗体样蛋白，包括但不限于多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、单链抗体、抗体片段等。此外，本发明包括蛋白支架应用于生成抗体模拟物以获得蛋白质，其可以通过本文描述的结合测定和按照本发明的方法被表征为是干细胞抗体或癌细胞抗体，因而能够特异性地结合于MUC1*(当它存在于癌细胞上时)，或结合于MUC1*(当它存在于干细胞、祖细胞或工程细胞(其表达一种形式的MUC1*)上时。本发明进一步包括利用在这里阐述的方法来确定抗体，它们识别在MUC1*胞外域内的特异性表位，其表达在不同类型的祖细胞或非肿瘤癌细胞上。
通常，用于癌症的治疗的抗体应抑制MUC1*受体的二聚化。因此，在一种优选的实施方式中，用于治疗MUC1阳性癌症的抗体是单价抗体，如Fab、单链抗体，或双特异性抗体。本发明确实设想将抗体如五价IgM用于癌症的治疗，这是因为多价可以用来再群集MUC1*胞外域。然而，在足够高的浓度下，二价抗体将一个抗体结合于每个受体而不是一个抗体/每一个受体并且在这样做时对于肿瘤生长和发展也是抑制性的。
通常，本发明的适合于刺激干细胞和祖细胞生长的抗体是二价的以致它们激活生长，存活和多能性途径，其中通过二聚化MUC1*胞外域。干细胞和祖细胞特异性抗体可以用来治疗患有贫血、低白细胞计数、低血小板或任何血细胞或血液祖细胞缺乏的患者。另外，本发明设想干细胞和祖细胞特异性抗体用作抗老化治疗剂、用来促进整体健康的制剂、用来增强干细胞或祖细胞生长或用来增强细胞植活的制剂。如在用于用机械方式可到达的身体的眼睛或其它区域的药剂中，可以全身或局部地、作为注射剂或作为局部治疗，将这里描述的干细胞和祖细胞特异性抗体给予患者。
二价干细胞特异性抗体2D6C3和2D6C8(C3和C8)、以及利用本发明方法鉴定或选择的其它单克隆抗体、多克隆抗体和抗体变体可以用来体外或体内刺激干细胞生长或可以可替换地用来增强干细胞移植物的植活，而不考虑来源。在另一种实施方式中，本发明的干细胞特异性二价抗体用来体外或体内刺激造血干细胞的生长。在一些情况下，干细胞抗体用来治疗患有贫血或低白细胞计数或具有发展贫血或低白细胞计数的风险的患者。这些患者可以患有癌症并且可以用本发明的癌细胞抗体加以同时治疗，用于抑制他们的癌细胞生长。
在另一个方面，本发明的抗体和肽用于诊断。使患者细胞接触癌症特异性抗体并获得显著结合将表明患者患有癌症。类似地，使患者细胞接触干细胞特异性抗体并获得显著结合将表明患者未患癌症并且将进一步确定那些细胞为干细胞或祖细胞。可以用两种类型的抗体来接触患者细胞以区别开干细胞和癌细胞。可以体外或体内进行上述诊断。在体外，可以利用癌症或干细胞特异性抗体来分析组织样品、血液样品、或体液样品。在体内，可以将显像剂附着于本发明的抗体以能够鉴定在患者中的癌症或干细胞。
实施例
实施例1–促进人干细胞附着于表面的单克隆抗体、2D6C8和2D6C3(在本文中还被称为C3和C8)的开发
鉴定了MUC1*单克隆抗体，这些抗体优先结合于MUC1*胞外域的部分，其更远离细胞表面，以及这些单克隆抗体显示更好的促进人ES和iPS细胞到表面的附着。用由PSMGFR序列定义的肽使小鼠免疫。通过ELISA来测试杂交瘤克隆的上清液结合于PSMGFR肽的能力以及通过FACS来确定何者结合于活的MUC1*阳性细胞。如果它们优先结合于PSMGFR肽(缺少10个C端氨基酸)，但如果肽缺少10个N端肽则并不结合，那么进一步选择杂交瘤。此外，筛选杂交瘤促进干细胞附着于表面如塑料细胞培养板的能力。在这些克隆中，选择了两种，2D6C8和2D6C3，当被涂布在表面上时其捕获干细胞并促进它们的生长。

Claims (18)

1.一种用于治疗患者的方法，所述患者将得益于所述患者的干细胞的刺激，所述方法包括给予所述患者特异性地结合于表达在人未分化干细胞上的MUC1蛋白的表位的抗体。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述抗体特异性地结合于SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的肽的至少6个连续氨基酸。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述抗体并不结合于或显著较少结合于SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8的肽。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述患者患有癌症。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述患者患有癌症并且正在接受化疗或放疗。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述患者患有慢性肾脏疾病。
7.一种用于治疗患有癌症或具有发展癌症的风险的患者的方法，包括给予所述患者抗体，所述抗体特异性地结合于表达在癌细胞上但并不表达在人未分化干细胞上的MUC1蛋白的表位。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述抗体特异性地结合于SEQ IDNO:3的肽并且并不结合于或显著较少结合于SEQ ID NO:4的肽。
9.一种用于治疗被诊断为患有MUC1阳性癌症的患者的方法，包括给予所述患者单价癌细胞特异性抗体。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述癌细胞特异性抗体特异性地结合于SEQ ID NO:3的肽并且并不结合于或显著较少结合于SEQID NO:4的肽。
11.一种用于治疗被诊断为患有MUC1阳性癌症的患者的方法，包括给予所述患者单价癌细胞特异性抗体和二价干细胞特异性抗体。
12.根据权利要求11所述的方法，其中，所述癌细胞特异性抗体特异性地结合于SEQ ID NO:3的肽并且并不结合于或显著较少结合于SEQID NO:4的肽。
13.根据权利要求11所述的方法，其中，所述干细胞特异性抗体特异性地结合于SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的肽的至少6个连续氨基酸，并且并不结合于或显著较少结合于SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:7或SEQID NO:8的肽。
14.一种用于增殖干细胞或祖细胞的方法，包括使所述细胞接触抗体，所述抗体特异性地结合于表达在人干细胞上的MUC1蛋白的表位，而没有引起癌细胞的增殖。
15.根据权利要求14所述的方法，其中，所述抗体特异性地结合于SEQID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的肽的至少6个连续氨基酸。
16.根据权利要求15所述的方法，其中，所述抗体并不结合于或显著较少结合于SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8的肽。
17.一种获得特异性地结合于干细胞但并不结合于癌细胞的抗体的方法，包括以下步骤：
(i)生成混合的抗体的组，所述抗体识别肽，所述肽的序列是具有SEQ ID NO:1-11的序列的任何肽的序列；
(ii)选择结合于SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、或SEQ ID NO:6的肽但并不结合于SEQ ID NO:3的肽的那些抗体；
(iii)选择当被吸附到表面上时促进干细胞的附着的那些抗体；以及
(iv)选择当处于二价形式时刺激干细胞的生长而当处于单价形式时抑制干细胞的生长，同时对癌细胞没有影响的那些抗体。
18.一种获得特异性地结合于癌细胞但并不结合于干细胞的抗体的方法，包括以下步骤：
(i)生成混合的抗体的组，所述抗体识别肽，所述肽的序列是具有SEQ ID NO:1-11的序列的任何肽的序列；
(ii)选择结合于SEQ ID NO:3的肽但并不结合于SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的肽那些抗体；
(iii)选择当被吸附到表面上时促进癌细胞的附着的那些抗体，；以及
(iv)选择当处于二价形式刺激癌细胞的增殖而当处于单价形式时抑制癌细胞的生长，同时对干细胞的增殖没有影响的那些抗体。
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