BR112020021267A2 - dispositivos de sedimentação de partículas - Google Patents

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Dhinakar S. KOMPALA
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Sudhin Biopharma
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Abstract

A presente invenção refere-se a dispositivos de sedimentação para separar partículas de um fluido volumoso com aplicações em numerosos campos. Os dispositivos de sedimentação de partículas incluem uma primeira pilha de cones com uma abertura pequena orientada para cima ou para baixo. Opcionalmente, os dispositivos de sedimentação podem incluir uma segunda pilha de cones com uma abertura pequena orientada para baixo ou para cima. Os cones podem ser côncavos ou convexos. Estes dispositivos são úteis para separar (em tamanhos em milímetros ou micra) partícula pequenas de um fluido volumoso com aplicações em numerosos campos, tais como culturas de células biológicas (microbianas, mamíferos, plantas, insetos ou algas), separação de partículas de catalisador sólidas de um tratamento de um líquido ou gás e água residual.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "DISPO- SITIVOS DE SEDIMENTAÇÃO DE PARTÍCULAS".
REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDO DE PATENTE RELACIONADO
[0001] O presente pedido de patente reivindica o benefício da prio- ridade sob o 35 U.S.C., 8119(e) para o Pedido de Patente Provisório nº de série U.S. 62/659.295, depositado em 18 de abril de 2018, e está relacionado ao Pedido de Patente nº U.S. 15/586.902, depositado em 4 de maio de 2017, cujo Pedido é uma continuação parcial do Pedido de Patente nº U.S. 15/324.062, depositado em 5 de janeiro de 2017, e para o Pedido PCT nº PCT/US2015/063.195, que tem uma data de depósito internacional de 1 de dezembro de 2015, e que designou os Estados Unidos. Este Pedido também está relacionado ao Pedido de Patente Provisório nº U.S. 62/332.546, depositado em 6 de maio de 2016, e ao Pedido de Patente Provisório nº U.S. 62/459.509, deposita- do em 15 de fevereiro de 2017. O Pedido de Patente nº U.S. 15/324.062 é um Pedido de Estágio Nacional sob o 35 U.S.C. 371 do Pedido PCT nº PCT/US2015/039.723, que tem uma data de depósito internacional de 9 de julho de 2015, que designou os Estados Unidos, cujo Pedido PCT reivindica o benefício do Pedido de Patente Provisó- rio nº U.S. 62/022.276, depositado em 9 de julho de 2014, e ao Pedido de Patente Provisório nº U.S. 62/037.513, depositado em 14 de agosto de 2014. O Pedido PCT nº POT/US2015/063.195 reivindica o benefício do Pedido de Patente Provisório nº 62/086.122, depositado em 1 de dezembro de 2014. Todos esses Pedidos são incorporados no presen- te documento a título de referência em sua totalidade.
CAMPO DA INVENÇÃO
[0002] A presente invenção apresenta dispositivos de sedimenta- ção de células ou de partículas com uma sedimentação aprimorada nas superfícies inclinadas de múltiplas camadas. Os dispositivos da presente invenção têm aplicações em numerosos campos, incluindo:
(i) culturas de células biológicas com alta densidade de células (mamí- feros, microbianas, plantas ou algas) que secretam polipeptídeos, hormônios, proteínas ou glicoproteínas, vacinas ou partículas similares a vacinas ou outros produtos químicos pequenos, tais como etanol, isobutanol, isoprenoides, compostos flavorizantes e de fragrâncias, etc.; (ii) separação e reciclagem de partículas de catalisador sólidas porosas ou não porosas que catalisam as reações químicas na fase de líquido ou de gás que circundam as partículas sólidas; (ili) separação e coleta de sólidos recentemente formados nas transformações físicas, tais como cristalização, floculação, aglomeração, precipitação, etc., da fase de líquido circundante; (iv) captura e purificação de proteínas se- cretadas, tais como anticorpos monoclonais, e outros, nos ligantes de afinidade, tais como a proteína A imobilizada em grânulos microesféri- cos; (v) expansão in vitro de várias células de mamíferos, tais como células tronco mesenquimais humanas, células humanas diferenciadas (por exemplo, cardiomiócitos ou células vermelhas do sangue), células humanas modificadas (por exemplo, linfócitos T transfectados com re- ceptor de antígeno quimérico ou células CAR-T, etc., para aplicações de terapia de células autólogas ou alogênicas); e (vi) processos de cla- reamento da água em grandes usinas de tratamento de águas residu- ais municipais ou comerciais pela sedimentação e remoção em um consórcio biológico complexo ou lama ativada ou outras partículas só- lidas.
DESCRIÇÃO DA TÉCNICA RELACIONADA
[0003] De todos os campos de aplicação dos dispositivos de sedi- mentação acima mencionados, o campo bem estabelecido mais ime- diatamente aplicável é o da produção de proteínas biológicas, polipep- tídeos ou hormônios secretados das culturas em suspensão de células microbianas ou de mamíferos recombinantes. Os métodos mais co- muns de produção de proteínas biológicas em células microbianas ou de mamíferos recombinantes baseiam-se em culturas em batelada alimentada, em que as células são cultivadas a altas densidades de células e então normalmente expostas a um meio de indução ou a um indutor para provocar a produção de proteínas. Se as proteínas dese- jadas forem secretadas para fora das células, é mais rentável mudar de uma cultura em batelada alimentada para uma cultura em perfusão contínua, que possa manter a alta densidade de células e a alta produ- tividade em uma duração muito mais longa da cultura. Durante as cul- turas em perfusão contínuas, as células vivas e produtivas são retidas ou recicladas de volta no biorreator enquanto as proteínas secretadas são continuamente colhidas do biorreator para processos de purifica- ção a jusante.
[0004] Algumas das vantagens-chave das culturas em perfusão contínua em relação às culturas em batelada alimentada são: (1) os produtos de proteína secretada são continuamente removidos do bior- reator, sem submeter esses produtos a uma degradação potencial pe- las enzimas proteolíticas e/ou glicolíticas liberadas no meio de cultura das células mortas; (2) as células vivas e produtivas são retidas ou re- cicladas novamente para conseguir altas densidades de célula nos biorreatores de perfusão contínua, onde eles continuam a produzir pro- teínas valiosas dentro do ambiente controlado do biorreator para uma duração muito mais longa da cultura, em vez de elas serem extermi- nadas e removidas do biorreator no final de cada cultura em batelada alimentada; (3) o ambiente do biorreator de perfusão pode ser mantido muito mais próximo das condições do estado constante (desse modo, mantendo uma qualidade de produto mais consistente pelo desenho) com a adição contínua de meios nutrientes frescos e a remoção de produtos de resíduos junto com os produtos de proteína colhidos, ao contrário das concentrações de nutrientes e de produtos de resíduos em mudança dinâmica na cultura em batelada alimentada; e (4) com um subconjunto de dispositivos de retenção de células, as células me- nores mortas ou que estão morrendo podem ser removidas seletiva- mente do biorreator de perfusão antes que essas células alisem e libe- rem suas enzimas intracelulares, mantendo desse modo uma alta fra- ção de viabilidade das células e uma alta qualidade dos produtos de proteína secretada enquanto são colhidas.
[0005] Muitos dispositivos de retenção de células foram desenvol- vidos na indústria de cultura de células de mamíferos, tais como os dispositivos do filtro rotativo internos (Himmelfarb et al., Science 164: 555-557, 1969), os módulos de filtração externos (Brennan et al., Bio- technol. Techniques, 1 (3): 169-174, 1987), os módulos de fibras ocas (Knazek et al., Science, 178: 65-67, 1972), a sedimentação gravitacio- nal em um ciclone (Kitano et al., Appli. Microbiol Biotechnol. 24, 282- 286, 1986), os sedimentadores inclinados (Batt et al., Biotechnology Progress, 6:458-464, 1990), a centrifugação contínua (Johnson et al., Biotechnology Progress, 12, 855-864, 1999) e a filtragem acústica (Go- renflo et al., Biotechnology Progress, 19, 30-36, 2003). Os ciclones demonstraram ser incapazes de produzir uma força centrífuga sufici- ente para a separação das células nos tamanhos do dispositivo e nas vazões da colheita usados nos experimentos de cultura de células de mamíferos (Kitano et al., 1986) e as células de mamíferos são seria- mente danificadas em vazões mais altas (e em forças centrífugas) ne- cessárias para uma separação de células eficiente (Elsayed, et al. Eng. Life Sci, 6:347-354, 2006). Enquanto a maior parte dos outros dispositivos retém adequadamente todas as células de mamíferos da colheita, esses dispositivos são incapazes de separar as células mor- tas das células vivas desejadas no biorreator. Consequentemente, as células mortas continuam a se acumular dentro do biorreator de perfu- são e os filtros de membrana ficam obstruídos, necessitando da finali- zação do biorreator de perfusão contínua, normalmente dentro de três ou quatro semanas da cultura de células de mamíferos.
[0006] Entre todos os dispositivos de retenção de células hoje dis- poníveis, somente os sedimentadores inclinados (Batt et al., 1990, su- pra, e Searles et al., Biotechnology Progress, 10:198-206, 1994) per- mitem a remoção seletiva de células mortas menores e de resíduos de células no fluxo superior ou no fluxo da colheita, enquanto as células de mamíferos grandes, vivas e produtivas são continuamente recicla- das através de fluxo inferior novamente no biorreator de perfusão. Por- tanto, é viável continuar a operação do biorreator de perfusão indefini- damente a uma alta viabilidade e a altas densidades de célula enquan- to o produto da proteína é continuamente colhido do topo do sedimen- tador inclinado.
[0007] O sedimentador inclinado foi previamente ampliado como um sedimentador de múltiplas placas ou lamelar (Probstein, R. F., Pa- tente U.S. nº 4.151.084, abril de 1979) e usado extensivamente em diversos processos industriais de grande escala, tais como o tratamen- to de águas residuais, o clareamento da água potável, a finalização de metais, a mineração e a reciclagem de catalisador (por exemplo, Odu- eyngbo et al., Patente U.S. nº 7.078.439, julho de 2006).
[0008] Em referência à nossa primeira demonstração de um único sedimentador inclinado de placa (Batt et al., 1990) para melhorar a produtividade das proteínas secretadas em aplicações de cultura de células de mamíferos, um dispositivo sedimentador de múltiplas placas ou lamelar foi patenteado a fim de ampliar os sedimentadores inclina- dos para uso na cultura de células de hibridoma (Thompson e Wilson, Patente U.S. nº 5.817.505, outubro de 1998). Tais dispositivos sedi- mentadores inclinados lamelares foram usados para cultivar as células de mamíferos recombinantes em biorreatores de perfusão contínuos com alta produtividade do biorreator (devido à alta densidade das célu- las) e alta viabilidade (> 90%) por longa duração (por exemplo, vários meses sem nenhuma necessidade de finalizar a cultura em perfusão). O Pedido de Patente nº U.S. 2011/0097800, concedido a Kauling et al., descreve uma versão ampliada dos sedimentadores inclinados que usam tubos cilíndricos envolvidos em ângulos inclinados. O dispositivo é descrito como sendo útil no cultivo de células de mamíferos maiores, tais como CHO, BHK, HEK, HKB, células de hibridoma, ciliados e célu- las de insetos.
[0009] Nenhum desses dispositivos de retenção de células foram demonstrados na colheita de produtos de proteína secretada em cultu- ras do biorreator de perfusão em células menores e, de modo ainda mais desafiador, nas microbianas. Os sedimentadores lamelares foram testados com células de levedura para investigar a sedimentação de células com sucesso limitado (Bungay e Millspaugh, Biotechnology and Bioengineering, 23:640-641, 1984). Os hidrociclones foram testa- dos em suspensões de levedura, principalmente para separar as célu- las de levedura da cerveja, e outra vez somente com sucesso limitado (Yuan et al., Bioseparation, 6:159-163, 1996; Cilliers e Harrison, Che- mical Engineering Journal, 65:21-26, 1997).
[0010] Foi proposto um ciclone modificado com uma placa vertical espiral dentro do ciclone a fim de melhorar a eficiência da separação no tratamento de águas residuais (Boldyrev VV, Davydov El, Settling tanks, tal como descrito na Patente Russa nº 2.182.508), e uma des- crição anterior deste arranjo foi descrita para a decantação de sólidos em suspensão de líquidos (Patente U.S. nº 4.048.069, setembro de 1977). O ciclone modificado descrito na Patente Russa nº 2.182.508 inclui uma placa enrolada em espiral contida em um tambor cilíndrico vertical com uma parte inferior cônica. Uma fenda é provida ao longo de toda a altura de um tubo de entrada de água residual central, que é plugado na parte inferior a fim de canalizar a água residual do tubo de entrada na placa enrolada em espiral vertical. A espiral começa no tu-
bo central e termina na parede do invólucro cilíndrico, formando um canal através do qual flui a água residual carregada de partículas. As partículas sedimentam na coluna de sedimentação vertical do canal em espiral. A altura da zona do sedimentador é a altura vertical da pla- ca em espiral e a largura do canal é formada pelas paredes da placa enrolada em espiral, que é mantida constante por todo seu compri- mento. Uma tubulação para remover a água purificada é instalada na parte superior do corpo cilíndrico. Um conduto para remover o sedi- mento é instalado na parte inferior da porção inferior cônica. Na opera- ção, a água residual entra através do tubo central e entra na zona em espiral através da fenda ou da abertura. O canal em espiral serve para aumentar o trajeto de fluxo e, desse modo, para aumentar o tempo de residência do líquido no sedimentador. A espiral também serve para aumentar a área de contato (parede) para o fluido. A força de impulsão principal no clareamento é a gravidade, que age nas partículas da suspensão, à medida que a suspensão circunda a coluna de sedimen- tação vertical enrolada em espiral. A pasta que é deixada na parede da espiral ou no canal cai na parte inferior cônica do sedimentador e é removida periodicamente do sedimentador. A água purificada é extraí- da por uma tubulação no lado do invólucro cilíndrico próxima do topo.
[0011] Tal como descrito no documento de patente russo, o pa- drão de fluxo das águas residuais que contêm sólidos é invertido do padrão de fluxo típico de um ciclone comum, à medida que a água su- ja entra no centro, através do tubo central, e entra no canal em espiral através das fendas, e a água purificada é removida da periferia ou da parte externa do corpo cilíndrico vertical através de uma tubulação de água purificada. Este dispositivo de ciclone de fluxo invertido modifica- do não foi proposto, nem aplicado, a quaisquer outros campos, com exceção do tratamento de águas residuais.
[0012] Desse modo, é desejado um dispositivo de sedimentação de partículas que possa potencializar as forças centrífugas e as forças gravitacionais nas partículas em suspensão líquida em um espaço re- lativamente pequeno.
SUMÁRIO
[0013] A presente invenção apresenta dispositivos de sedimenta- ção de células ou de partículas com sedimentação aprimorada em su- perfícies de múltiplas camadas, inclinadas, arranjadas dentro de um invólucro. O invólucro pode ser um invólucro de ciclone. Os dispositi- vos de separação de partículas da presente invenção podem ser usa- dos em várias aplicações e representar uma grande melhoria em rela- ção aos dispositivos de separação da técnica anterior. Nesses disposi- tivos de sedimentação, as superfícies inclinadas podem ser fixadas a uma pluralidade de placas cilíndricas verticais. Os dispositivos de se- dimentação podem incluir uma superfície cônica em espiral ou várias placas inclinadas que se aproximam da superfície cônica angular co- nectada à parte inferior de uma espiral. As várias placas inclinadas, em camadas, aprimoram a eficiência da sedimentação das partículas do fluido volumoso que se move para baixo ou para cima dentro de um conjunto cônico em que o volume líquido se move progressivamente da periferia das superfícies de sedimentação cônicas ou espiraladas para o centro do dispositivo de sedimentação.
[0014] Os dispositivos de sedimentação da presente invenção po- dem incluir um invólucro que inclui uma série de cones empilhados po- sicionados dentro do invólucro, afunilando para baixo rumo a uma abertura central, sem nenhuma placa vertical. Os cones da presente modalidade são suportados na pilha, um em cima do outro, por supor- tes que mantêm uma distância (ou largura de canal) entre os cones sucessivos na pilha. Os suportes podem compreender três ou mais projeções fixadas à superfície superior e/ou inferior de um ou mais dos cones para posicionar os cones sucessivos a uma distância desejada
(a largura de canal desejada). Opcionalmente, os suportes podem compreender pelo menos três elementos em forma de L interconecta- dos a uma superfície de cada cone que é distal ao ápice truncado do cone. Os elementos em forma de L incluem um primeiro lado interco- nectado a um segundo lado em um ápice e são interconectados à su- perfície de modo que o primeiro lado suporta um segundo cone na pi- Ilha de cones. O segundo lado é substancialmente paralelo à superfície do cone. Opcionalmente, o segundo lado pode se projetar além do co- ne para espaçar o cone de uma superfície interior do invólucro. Em algumas modalidades, não há nenhum plugue ou outro impedimento que impede o fluxo das partículas líquidas ou suspensas das superfí- cies cônicas empilhadas para a abertura central.
[0015] Os dispositivos de sedimentação da presente invenção po- dem incluir um invólucro que inclui: 1) uma primeira pilha de dois ou mais cones empilhados, cada um dos quais tem uma abertura central, e, 2) uma segunda pilha opcional de dois ou mais cones empilha- dos, cada um dos quais tem uma abertura central, unidos em ou pró- ximos de sua parte inferior, com superfícies cônicas afunilando para baixo rumo a uma abertura central na parte inferior do invólucro.
[0016] Os cones empilhados (tanto na primeira quanto na segunda pilha opcional de dois ou mais cones empilhados) compreendem pelo menos três projeções que suportam cada cone acima do cone seguin- te sucessivo na pilha. De preferência, as projeções são colocadas a uma distância substancialmente constante e formadas em um tama- nho geralmente igual para manter cada cone sucessivo na pilha com um espaçamento igual entre todos os cones nas pilhas. Em uma mo- dalidade, há pelo menos três projeções para cada cone a fim de supor- tar corretamente cada cone sucessivo, mas cada cone pode compre- ender mais de três projeções, tal como necessário para suportar de maneira adequada ou corretamente o cone. Por exemplo, cada cone pode compreender quatro projeções ou pode compreender oito proje- ções, para suportar o cone sucessivo seguinte na pilha.
[0017] As projeções, ou "suportes verticais", podem representar um impedimento para que as partículas ou células sedimentadas des- lizem para baixo da superfície de um cone para a abertura central ou para o espaço em torno da circunferência interna do invólucro entre o invólucro e os cones. Essas projeções são unidas a uma superfície de um cone, mas essas projeções não precisam se unir a um outro cone na pilha de cones. Desse modo, essas projeções não precisam, e na maioria das modalidades, não unem dois ou mais cones em uma pilha uns aos outros.
[0018] De preferência, há um espaçamento substancialmente constante entre cada superfície cônica sucessiva criada pelas proje- ções que suportam cada cone sucessivo em uma pilha de cones. O espaçamento entre os cones sucessivos pode variar entre cerca de 1 mm a cerca de 2,5 cm.
[0019] Este arranjo de superfícies de sedimentação, provido pelas pilhas sucessivas de cones, em que cada um é suportado pelo cone sucessivo seguinte, mas não é unido permanentemente ao cone su- cessivo seguinte, é particularmente útil para aplicações de separação em que o dispositivo de sedimentação de partículas, e as superfícies cônicas no mesmo, requerem um serviço regular ou contínuo, tal como a desmontagem e a limpeza das superfícies de sedimentação cônicas dentro do dispositivo de sedimentação.
[0020] Este arranjo de uma primeira e uma segunda pilha opcional de cones melhora de maneira significativa a eficiência de sedimenta- ção das partículas de um fluido volumoso à medida que o fluido volu- moso se move através do dispositivo de sedimentação. À medida que o líquido volumoso, que inclui partículas tais como células, se move através dos cones empilhados do dispositivo de sedimentação da pre- sente invenção, as partículas maiores (por exemplo, células vivas e produtivas) sedimentam na superfície dos cones. As células que desli- zam para baixo, da parte superior ou da primeira pilha de cones, desli- zam para baixo das superfícies cônicas para as bordas externas dos cones e caem verticalmente na seção cônica do invólucro. Além disso, as células que deslizam para baixo da pilha inferior ou segunda pilha de cones, deslizam para baixo das superfícies cônicas para a abertura central dos cones e caem verticalmente na abertura central do invólu- Cro.
[0021] Esses dispositivos podem ser ampliados ou reduzidos para atender as necessidades de diferentes indústrias ou aplicações ou ta- manhos quando a superfície de separação é ampliada ou reduzida vo- lumetricamente em três dimensões, em comparação a um dimensio- namento uni ou bidimensional mais típico dos dispositivos de sedimen- tação anteriores.
[0022] A ampliação dos dispositivos da presente invenção pode ser realizada simplesmente com o aumento do diâmetro do invólucro (e, de modo correspondente, com o aumento do diâmetro dos cones empilhados dentro) e/ou com o aumento da altura do invólucro (que aumenta o número de cones em uma ou em ambas a primeira e a se- gunda pilhas de cones). A área projetada eficaz para a sedimentação de células aumenta de modo proporcional ao quadrado do diâmetro do invólucro e aumenta de modo proporcional à altura dos cilindros inter- nos. A área de sedimentação eficaz dos dispositivos de sedimentação compactos da presente invenção aumenta de modo proporcional ao cubo do diâmetro do invólucro (supondo que a altura do sedimentador interno também é aumentada de modo proporcional) ou de modo equi- valente ao volume do invólucro. Esta ampliação tridimensional ou vo- lumétrica de uma área de sedimentação eficaz torna o dispositivo de sedimentação da presente descrição muito mais compacto em compa- ração aos dispositivos de sedimentação inclinados anteriores.
[0023] O espaçamento radial nas regiões anulares entre os cilin- dros ou cones diferentes pode ficar entre cerca de 1 cm a cerca de 10 cm, idealmente em torno de cerca de 2,5 cm. Um espaçamento pe- queno de cerca de 1 mm entre os cones de sedimentação inclinados e a superfície interna do cone sucessivo seguinte fornece um espaço útil para que as partículas sedimentadas (por exemplo, células) deslizem para baixo da superfície dos cones e saia dos cones pela lateral, em vez de deslizarem para baixo para a parte inferior do cone. As células que saem pelas laterais sedimentam verticalmente ao longo do interior de cada cilindro. Quando essas células de sedimentação alcançam a superfície cônica na parte inferior de cada cilindro, elas deslizam para baixo, na superfície inclinada no cone, para a abertura central na parte inferior do invólucro do ciclone. Uma vantagem da velocidade de fluido crescente enquanto descem da superfície cônica inclinada para a abertura central é que um número crescente de células sedimentadas que deslizam para baixo do cone são arrastadas para baixo para a abertura central, em vez de ser permitido que elas se acumulem pelas velocidades mais rápidas do líquido.
[0024] O ângulo de inclinação para as superfícies de sedimenta- ção pode ou não ser constante, variando entre cerca de 15 graus a cerca de 75 graus em relação à vertical. Para uso com partículas mais pegajosas (normalmente as células de mamíferos), o ângulo de incli- nação pode ficar mais próximo da vertical (isto é, em torno de 15 graus em relação à vertical). Para uso com partículas de catalisador sólidas não pegajosas, o ângulo de inclinação ainda pode ser mais afastado da vertical (por exemplo, em torno de 75 graus da vertical). Em algu- mas modalidades, as superfícies cônicas têm uma seção transversal longitudinal arqueada de modo que o ângulo de inclinação varia com respeito ao eixo longitudinal entre cerca de 10 graus a cerca de 80 graus, ou cerca de 15 graus a cerca de 75 graus.
[0025] Todos os dispositivos de sedimentação da presente inven- ção podem incluir um fechamento ou tampa sobre pelo menos uma porção do invólucro em uma extremidade do invólucro oposta à primei- ra abertura. Em todas essas modalidades, o fechamento ou tampa também pode incluir uma saída ou porta para a remoção dos líquidos ou para a entrada dos líquidos no dispositivo de sedimentação. A aber- tura e as portas ou saídas adicionais no invólucro e/ou na tampa ficam em comunicação líquida com o exterior e o interior do invólucro para permitir a passagem de líquidos para dentro e/ou para fora do invólu- cro do dispositivo de sedimentação, e em cada exemplo de tal abertu- ra ou entrada/saída, essas vias de passagem para dentro e para fora do invólucro podem incluir válvulas ou outros mecanismos que podem ser abertos ou fechados para interromper ou restringir o fluxo de líqui- dos dentro ou fora dos dispositivos de sedimentação da presente in- venção.
[0026] Os dispositivos de sedimentação de partículas da presente invenção podem incluir um invólucro e pelo menos um tubo vertical disposto dentro do invólucro, e pelo menos um tubo vertical unido a uma extremidade com uma superfície cônica que se afunila para baixo para uma primeira abertura no invólucro do ciclone. Há pelo menos uma abertura adicional no invólucro substancialmente oposta à primei- ra abertura.
[0027] O ângulo de inclinação para as superfícies cônicas é de cerca de 45 graus em relação à vertical em uma modalidade ou pode variar entre cerca de 15 graus em relação à vertical e cerca de 75 graus em relação à vertical. Opcionalmente, as superfícies cônicas e/ou a parte superior ou inferior do invólucro podem ter um formato côncavo ou convexo, de modo que o ângulo de inclinação varia entre cerca de 15 graus em relação à vertical e cerca de 75 graus em rela- ção à vertical.
[0028] A largura de um canal em anel anular formado entre os tu- bos verticais adjacentes fica entre cerca de 1 mm e cerca de 50 mm. O número de tubos verticais dentro do dispositivo de sedimentação pode ficar entre cerca de 2 e cerca de 30.
[0029] O dispositivo de sedimentação pode incluir um fechamento sobre pelo menos uma porção do invólucro em uma extremidade do invólucro oposta à primeira abertura. Pelo menos uma abertura adicio- nal no invólucro pode ser configurada para abrir de um lado do invólu- cro de modo tangencial a pelo menos um tubo vertical, em comunica- ção líquida com a parte exterior e interior do invólucro.
[0030] Uma saída de colheita de líquido pode ser formada no fe- chamento, em comunicação líquida com o exterior e o interior do invó- lucro.
[0031] Um outro aspecto da presente invenção é um dispositivo de sedimentação de partículas que pode incluir, mas sem ficar a eles limi- tado, um invólucro que inclui um ou mais dentre: (1) uma primeira por- ção cônica; (2) uma segunda porção cônica; (3) uma porção cilíndrica localizada entre a primeira e a segunda porções cônicas; (4) pelo me- nos uma entrada para introduzir um líquido no invólucro; (5) um primei- ra porta de saída; (6) uma segunda porta de saída; e (7) uma primeira pilha de cones localizados dentro do invólucro. Em uma modalidade, a primeira porta de saída é associada com a primeira porção cônica e a segunda porta de saída é associada com a segunda porção cônica. Opcionalmente, o líquido introduzido no invólucro pode ser uma sus- pensão líquida que inclui partículas. As partículas podem ter uma plu- ralidade de tamanhos.
[0032] Em uma modalidade, a primeira porta de saída pode servir para a colheita de um líquido clarificado. O líquido clarificado pode in-
cluir um primeiro subconjunto de partículas. O primeiro subconjunto de partículas pode compreender resíduos de células, célula mortas e ou- tros ainda. Opcionalmente, a primeira porta de saída pode ser formada em um fechamento do invólucro. A primeira porta de saída fica em comunicação líquida com o exterior e o interior do invólucro.
[0033] Opcionalmente, em outra modalidade, a segunda porta de saída pode servir para a colheita de um líquido concentrado. O líquido concentrado pode incluir um segundo subconjunto de partículas, tais como célula vivas. Normalmente, as partículas do segundo subconjun- to de partículas geralmente são maiores do que as partículas do pri- meiro subconjunto de partículas. Cada partícula do segundo subcon- junto de partículas tem geralmente uma massa maior do que as partí- culas do primeiro subconjunto de partículas. A segunda porta de saída fica em comunicação líquida com o exterior e o interior do invólucro.
[0034] A primeira pilha de cones ocupa pelo menos uma parte da primeira porção cônica. Opcionalmente, a primeira pilha de cones ocu- pa pelo menos uma porção da porção cilíndrica. Opcionalmente, um ou mais cones da primeira pilha de cones incluem um ápice truncado orientado para a primeira porta de saída. Adicionalmente, ou alternati- vamente, pelo menos um cone da primeira pilha de cones é desprovi- do da abertura central. Em outra modalidade, cada cone da primeira pilha de cones inclui uma base aberta orientada para a segunda porta de saída. Os cones da primeira pilha de cones são geralmente centra- dos no invólucro, por exemplo, os cones da primeira pilha de cones podem ser centrados em torno de uma abertura substancialmente cen- tral formada pelo ápice truncado de um ou mais cones.
[0035] Opcionalmente, o invólucro ainda pode incluir uma segunda pilha de cones. A segunda pilha de cones pode ocupar pelo menos uma parte da segunda porção cônica e pode ocupar pelo menos uma parte da porção cilíndrica. Em uma modalidade, cada cone da segun-
da pilha de cones é transversal aos cones da primeira pilha de cones.
[0036] Opcionalmente, um ângulo de inclinação para a superfície de um cone na primeira pilha de cones pode variar entre cerca de 15 graus a cerca de 75 graus em relação à vertical. Em uma modalidade, a superfície de um cone é convexa ou côncava, de modo que uma se- ção transversal da superfície do cone define uma linha arqueada. Em outra modalidade, o ângulo de inclinação dos cones pode ser constan- te em qualquer ângulo entre 15 e 75 graus em relação à vertical. Em uma modalidade, o ângulo de inclinação dos cones é de cerca de 45 graus.
[0037] Em outra modalidade, cada cone da segunda pilha de co- nes inclui um ápice truncado orientado para a segunda porta de saída. Cada cone da segunda pilha de cones também pode incluir uma base aberta orientada para a primeira porta de saída. Em uma modalidade, os cones da segunda pilha de cones geralmente são centrados no in- vólucro. Em outra modalidade, os cones da segunda pilha de cones são centrados em torno de uma abertura substancialmente central formada pelo ápice truncado de um ou mais cones.
[0038] Em uma modalidade, um ângulo de inclinação para a su- perfície de um cone na segunda pilha de cones fica entre cerca de 15 graus a cerca de 75 graus em relação à vertical. O ângulo de inclina- ção dos cones na segunda pilha de cones pode ser de cerca de 45 graus.
[0039] Em uma modalidade, os cones da primeira pilha de cones têm um espaçamento substancialmente uniforme. Além disso, os co- nes da segunda pilha de cones podem ter um espaçamento substan- cialmente uniforme. Em uma modalidade, os cones da primeira pilha de cones têm um espaçamento diferente em comparação aos cones da segunda pilha de cones.
[0040] Pelo menos uma entrada é configurada como uma porta de entrada em comunicação líquida com o exterior e o interior do invólu- cro. Pelo menos uma entrada pode ser associada com pelo menos uma dentre a primeira porção cônica, a segunda porção cônica e a porção cilíndrica do invólucro. Em uma modalidade, uma primeira en- trada de pelo menos uma entrada é associada com a porção cilíndrica do invólucro. Em outra modalidade, uma segunda entrada de pelo me- nos uma entrada é associada com uma dentre a primeira e a segunda porções cônicas. Em outra modalidade, a segunda entrada é associa- da com a segunda porção cônica. Em outra modalidade, pelo menos uma entrada é configurada para ser interconectada a um saco descar- tável do biorreator. O saco descartável do biorreator pode compreen- der um material de plástico.
[0041] Uma configuração dos dispositivos de sedimentação de partículas da presente invenção pode incluir um invólucro, o qual com- preende: (a) uma primeira porção cônica; (b) uma segunda porção cô- nica; (c) uma porção cilíndrica localizada entre a primeira e a segunda porções cônicas; (d) pelo menos uma entrada para que a suspensão líquida entre no invólucro; (e) uma primeira porta de saída para a co- lheita do líquido clarificado; (f) uma segunda porta de saída para des- carregar a suspensão líquida concentrada; e (g) uma primeira pilha de cones localizada dentro do invólucro. Neste dispositivo, a primeira pi- lha de cones pode ocupar pelo menos uma parte da primeira porção cônica e pode ocupar pelo menos uma parte da porção cilíndrica. Ca- da cone da primeira pilha de cones inclui (i) um ápice truncado posici- onado distal à segunda porção cônica, e (ii) uma base aberta posicio- nada próxima da segunda porção cônica. Opcionalmente, os cones da primeira pilha são geralmente centrados em torno de uma abertura substancialmente central formada pelo ápice truncado em cada cone na primeira pilha de cones.
[0042] Um ângulo de inclinação para a superfície de um cone na primeira pilha de cones pode variar entre cerca de 15 graus a cerca de 75 graus em relação à vertical. Por exemplo, uma seção transversal da superfície do cone define uma linha arqueada. Esses cones podem ter uma superfície convexa ou côncava. Em outras modalidades, o ângulo de inclinação dos cones é constante e pode ser, por exemplo, de cerca de 45 graus. Os cones da primeira pilha de cones têm de preferência um espaçamento substancialmente uniforme.
[0043] Um ângulo de inclinação para a superfície de um cone na segunda pilha de cones pode variar entre cerca de 15 graus a cerca de 75 graus em relação à vertical. Em outra modalidade, o ângulo de inclinação dos cones na segunda pilha de cones é de cerca de 45 graus.
[0044] Outro aspecto da presente invenção consiste em um dispo- sitivo de sedimentação de partículas, o qual compreende: (A) um invó- lucro; (B) pelo menos duas placas cônicas dispostas dentro do invólu- cro; (C) uma primeira abertura no invólucro; e (D) uma segunda aber- tura no invólucro. Em uma modalidade, pelo menos duas placas côni- cas são empilhadas uma em cima da outra. De preferência, o invólucro inclui entre cerca de 3 e cerca de 30 placas cônicas. Pelo menos duas placas cônicas podem ser separadas por uma distância substancial- mente constante. Opcionalmente, a largura de um canal formado entre as superfícies adjacentes de pelo menos duas placas cônicas fica en- tre cerca de 1 mm e cerca de 50 mm. Três ou mais suportes podem manter cada uma das placas cônicas na pilha.
[0045] Cada uma das placas cônicas pode incluir um ápice trunca- do próximo da primeira abertura e uma base aberta posicionada distal à primeira abertura. As placas cônicas geralmente podem ser centra- das no invólucro e são arranjadas em uma posição substancialmente vertical dentro do invólucro. O ângulo de inclinação para a superfície de cada uma dentre pelo menos duas placas cônicas pode variar entre cerca de 15 graus e cerca de 75 graus em relação à vertical. As placas cônicas podem ter um formato côncavo em relação a um eixo longitu- dinal. As placas cônicas podem ter um formato convexo em relação ao eixo longitudinal. Por conseguinte, a seção transversal de uma placa cônica pode definir uma linha arqueada. Em uma modalidade, as pla- cas cônicas têm um formato definido por pelo menos um raio de curva- tura.
[0046] Nesses dispositivos, o invólucro inclui uma porção cilíndrica e uma porção cônica. A primeira abertura pode ser associada com a porção cônica. Opcionalmente, a segunda abertura pode ser associa- da com a porção cilíndrica. A segunda abertura pode ser posicionada na parede lateral da porção cilíndrica. A segunda abertura pode ser posicionada em uma tampa associada com uma extremidade aberta da porção cilíndrica. A segunda abertura pode ser posicionada na por- ção cônica.
[0047] Outro aspecto da presente invenção consiste em um dispo- sitivo de sedimentação que inclui, mas sem ficar a eles limitado: (1) um invólucro superior que inclui: uma primeira porção cônica; uma primei- ra porção cilíndrica; e pelo menos uma porta; (2) um invólucro inferior interconectável ao invólucro superior e que inclui: uma segunda porção cônica; uma segunda porção cilíndrica; e pelo menos uma porta; e (3) uma pilha de cones localizada dentro do dispositivo de sedimentação, e cada cone da pilha de cones inclui uma abertura pequena orientada para a primeira porção cônica e uma abertura grande orientada para a segunda porção cônica, e a primeira pilha de cones geralmente cen- trada em torno de um eixo longitudinal do dispositivo de sedimentação. Opcionalmente, o invólucro superior ainda compreende um primeiro flange configurado para acoplar um segundo flange do invólucro inferi- or. O invólucro superior pode ser unido de modo permanente ao invó- lucro inferior.
[0048] Nesses dispositivos, a superfície de um cone da primeira pilha de cones fica em um ângulo entre cerca de 15 graus a cerca de 85 graus em relação ao eixo longitudinal. Opcionalmente, a primeira e a segunda porções cônicas são côncavas para dentro rumo ao eixo longitudinal. Em uma modalidade, uma seção transversal longitudinal do corpo de um cone forma uma linha com um formato arqueado.
[0049] Adicional ou alternativamente, a primeira porção cônica é côncava para dentro rumo ao eixo longitudinal e a segunda porção cô- nica é côncava para fora afastando-se do eixo longitudinal. Em uma modalidade, o dispositivo de sedimentação inclui uma segunda pilha de cones localizada dentro do dispositivo de sedimentação. Em outra modalidade, cada cone da segunda pilha de cones inclui uma pequena abertura orientada se afastando da primeira porção cônica e uma abertura grande orientada para a primeira porção cônica. Opcional- mente, os cones da segunda pilha de cones têm corpos que são côn- cavos para fora, se afastando do eixo longitudinal.
[0050] Em qualquer um dos dispositivos de sedimentação da pre- sente invenção, o invólucro e/ou os cones e/ou quaisquer outros com- ponentes do dispositivo podem ser compostos de um metal ou de um plástico. O plástico pode ser um ou mais dentre o polipropileno, o poli- etileno, o policarbonato, o poliestireno e outros ainda. Em uma modali- dade, o dispositivo de sedimentação é formado inteiramente de plásti- co. Em outra modalidade, pelo menos um cone da pilha de cones é composto pelo menos parcialmente de aço inoxidável. As superfícies de metal (especialmente de aço inoxidável) podem ser eletropolidas a fim de prover uma superfície lisa. Do mesmo modo, em qualquer um dos dispositivos de sedimentação da presente invenção, o invólucro e/ou os cones e/ou quaisquer outros componentes do dispositivo po- dem ser total ou parcialmente revestidos com um ou mais dentre um plástico não pegajoso, tal como o Teflon ou o silicone.
[0051] Em qualquer um dos dispositivos de sedimentação da pre- sente invenção, o invólucro ainda pode incluir uma camisa de fluido associada a uma ou mais dentre a primeira porção cônica, a segunda porção cônica e/ou a porção cilíndrica. Em uma modalidade, a camisa de fluido é associada à segunda porção cônica e à porção cilíndrica. À camisa de fluido pode incluir pelo menos uma porta para receber o flu- ido de uma temperatura predeterminada. Opcionalmente, a camisa de fluido pode incluir uma segunda porta para extrair o fluido da camisa de fluido. A água ou outros fluidos podem ser direcionados para a ca- misa de fluido a fim de manter o invólucro do ciclone e todo o seu con- teúdo dentro de uma faixa de temperatura desejada. Portas podem ser formadas na parede exterior do invólucro do ciclone para alcançar a camisa. As portas podem funcionar como portas de entrada ou de saí- da para a circulação de fluidos de resfriamento ou de aquecimento através da camisa.
[0052] Em qualquer um dos dispositivos de sedimentação da pre- sente descrição, um ou mais sensores podem ser posicionados para monitorar as condições físicas dentro do interior do dispositivo de se- dimentação. Adicionalmente, ou alternativamente, pelo menos um sensor pode ser posicionado para monitorar as condições dentro de uma linha de tubulação interconectada aos dispositivos de sedimenta- ção da presente descrição. A linha de tubulação pode ser uma linha de retorno interconectada a uma porta de saída inferior do dispositivo de sedimentação.
[0053] Esses sensores podem ser selecionados para determinar um ou mais dentre o pH, o oxigênio dissolvido (OD), a glicose, a tem- peratura e o CO,» (incluindo CO,» dissolvido, conhecido como CO» par- cial) dentro do invólucro ou da linha de tubulação. Os sensores podem incluir uma ou mais sondas em contato com uma solução dentro do invólucro ou da linha de tubulação. A sonda pode ser fixada em uma superfície interior do dispositivo de sedimentação ou da linha de tubu- lação. Nas modalidades preferidas, pelo menos um sensor e/ou uma sonda são posicionados dentro da porção cônica inferior do dispositivo de sedimentação, e eles podem ser espaçados de uma ou mais dentre a porta lateral e a porta inferior.
[0054] Essas sondas podem transmitir dados sem contato com um leitor. Dessa maneira, a sonda pode medir uma condição dentro do dispositivo de sedimentação e/ou da linha e transmitir os dados ao lei- tor fora do dispositivo de sedimentação. Uma ou mais das sondas po- dem ser uma sonda fluorescente. Um ou mais dentre o pH, o OD, a glicose, a temperatura e o pCO> podem ser medidos pela sonda dentro do invólucro do ciclone. A sonda pode ser fixada a uma porção do in- vólucro. A porção do invólucro pode ser operável a fim de transmitir a luz produzida pela sonda fluorescente. Tal como descrito acima, uma porção do invólucro pode ser transparente ou translúcida. O leitor (ou medidor) recebe a luz da sonda fluorescente. O leitor também pode incluir uma fibra óptica que coleta a luz transmitida pela sonda fluores- cente. As sondas e os leitores apropriados estão disponíveis junto a vários vendedores, incluindo a PreSens Precision Sensing GmbH. Em outra configuração, a sonda dentro do dispositivo de sedimentação pode transmitir dados ao leitor fora do dispositivo de sedimentação por uma conexão de rede. Por exemplo, a sonda pode se comunicar com o leitor por WiFi, Bluetooth ou qualquer outra modalidade de comuni- cação sem fio.
[0055] Na operação de um dispositivo de sedimentação da presen- te invenção, os dados desse(s) sensor(es) podem ser usados para ajustar uma temperatura de fluido dentro da camisa de fluido. Em outra modalidade, os dados do sensor podem ser usados para ajustar um ou mais dentre pH, temperatura, concentração de oxigênio dissolvido, dióxido de carbono dissolvido e concentrações de nutrientes dentro do dispositivo de sedimentação de partículas.
[0056] Outro aspecto da presente invenção apresenta métodos de sedimentação de partículas ou células em uma suspensão líquida. O método inclui, mas sem ficar a eles limitado, (i) a introdução de uma suspensão líquida das partículas em um dispositivo de sedimentação de partículas da presente invenção; (ii) a coleta das partículas de uma primeira abertura em um invólucro do dispositivo de sedimentação; e (iii) a coleta de um líquido de uma outra abertura no dispositivo de se- dimentação. O líquido pode ser coletado de uma abertura em um fe- chamento que cobre pelo menos uma porção do invólucro em uma ex- tremidade do invólucro oposta à primeira abertura. O líquido pode ser coletado de pelo menos uma abertura adicional no invólucro, e a aber- tura é configurada para abrir de um lado do invólucro. Nesses méto- dos, a etapa de introdução de uma suspensão líquida no dispositivo de sedimentação pode incluir o direcionamento de uma suspensão líquida de um saco plástico do biorreator para o dispositivo de sedimentação de partículas.
[0057] Um aspecto relacionado da presente descrição apresenta um método de sedimentação de partículas em uma suspensão. O mé- todo inclui um ou mais dentre: (a) a introdução de uma suspensão |í- quida de partículas em um dispositivo de sedimentação que inclui: (i) um invólucro superior com uma primeira porção cônica, uma primeira porção cilíndrica e pelo menos uma porta; (ii) um invólucro inferior in- terconectável ao invólucro superior e que inclui uma segunda porção cônica, uma segunda porção cilíndrica e pelo menos uma porta; e (iii) uma pilha de cones localizada dentro do dispositivo de sedimentação, e cada cone da pilha de cones inclui uma abertura pequena orientada para a primeira porção cônica e que tem corpos que são côncavos pa- ra dentro rumo a um eixo longitudinal do dispositivo de sedimentação; (b) a coleta de um líquido clarificado de pelo menos uma porta do invó-
lucro superior; e (c) a coleta de uma suspensão líquida concentrada de pelo menos uma porta do invólucro inferior.
[0058] Nesses métodos, o líquido clarificado pode incluir um pri- meiro subconjunto de partículas da suspensão. O primeiro subconjunto de partículas pode compreender resíduos de células, célula mortas e outros ainda.
[0059] O líquido concentrado também pode incluir um segundo subconjunto de partículas da suspensão, e o segundo subconjunto de partículas pode incluir células vivas. As partículas do segundo subcon- junto de partículas podem ser maiores do que as partículas do primeiro subconjunto de partículas. Cada partícula do segundo subconjunto de partículas pode ter uma massa maior do que as partículas do primeiro subconjunto de partículas.
[0060] Nestes métodos, uma segunda pilha de cones pode opcio- nalmente ser posicionada dentro do dispositivo de sedimentação. Es- ses cones que formam a segunda pilha de cones podem ter corpos que são côncavos para fora se afastando do eixo longitudinal do dis- positivo de sedimentação.
[0061] Em qualquer um desses métodos, a suspensão líquida po- de incluir pelo menos uma suspensão de células recombinantes, uma fermentação alcoólica, uma solução de proteína de precipitação, uma mistura de células contendo fluidos aquosos e uma camada orgânica que contém produtos orgânicos extraídos produzidos pelas células, uma suspensão de partículas de catalisador sólidas em uma mistura líquida que contém na maior parte os produtos e os reagentes deple- tados, uma suspensão de microesferas revestidas com as moléculas da proteína A que podem ligar os anticorpos monoclonais do caldo da cultura de células, uma suspensão de grânulos de microcarreador com as células de mamíferos crescendo unidas aos grânulos, águas resi- duais municipais e águas residuais industriais. Nesses métodos, a suspensão líquida pode incluir pelo menos uma dentre células de ma- míferos, células bacterianas, células de levedura, células de plantas, células de algas, células tronco humanas ou células humanas diferen- ciadas e/ou células de insetos. Nesses métodos, a suspensão líquida pode incluir pelo menos uma dentre células de algas para produção de biodiesel, células de mamíferos recombinantes e/ou de hibridoma mu- rinas, células de levedura metabolicamente projetadas para a produ- ção de produtos orgânicos secretados e levedura na cerveja. Nesses métodos, a suspensão líquida pode incluir as células microbianas re- combinantes selecionadas dentre Pichia pastoris, Saccharomyces ce- revisiae, Kluyveromyces lactis, Aspergillus niger, Escherichia coli e Bacillus-subtilis.
[0062] Nesses métodos, o líquido coletado do dispositivo de sedi- mentação pode incluir pelo menos um dentre moléculas biológicas, compostos orgânicos ou inorgânicos, reagentes químicos e produtos de reações químicas. Nesses métodos, o líquido coletado do dispositi- vo de sedimentação inclui pelo menos um dentre hidrocarbonetos, po- lipeptídeos, proteínas, álcoois, ácidos graxos, hormônios, carboidratos, anticorpos, anticorpos, terpenos, isoprenoides, biodiesel, poliprenoides e cerveja. Nesses métodos, o líquido coletado do dispositivo de sedi- mentação inclui pelo menos um dentre componentes de biodiesel, pro- teínas terapêuticas secretadas ou hormônios, tais como a insulina ou seus análogos, anticorpos, anticorpos monoclonais, fatores de cresci- mento, subunidades de vacinas, vírus, partículas similares a vírus, fa- tores de estimulação de colônias, eritropoietina (EPO), compostos de sabor ou de fragrâncias secretados, incluindo geraniol, mirceno, prote- íÍna adoçante brazzein, etc.
[0063] Nesses métodos, os dispositivos de sedimentação da pre- sente invenção podem funcionar como um biorreator de perfusão au- tônomo para a expansão in vitro de células de mamíferos, tais como as células tronco e as células CAR-T para a terapia de células autólo- gas. Nesses exemplos dos dispositivos de sedimentação da presente invenção, a entrada de um meio de cultura de células livre de soro ou livre de proteína animal pode ser bombeada continuamente no biorrea- tor de sedimentação/perfusão através da porta inferior e/ou da porta lateral. Uma mistura controlada de O2, CO? e N> também pode ser bombeada para controlar o pH e o DO do sobrenadante da cultura dentro do sedimentador/biorreator. No fim na expansão da célula in vitro, a coleta de células sedimentadas concentradas na parte inferior pode ser colhida de uma porta inferior.
[0064] O exposto acima é um sumário simplificado da descrição que pretende apresentar uma compreensão de alguns aspectos dos dispositivos de sedimentação da presente invenção. O presente sumá- rio não é uma vista geral extensiva nem exaustiva da invenção e de seus vários aspectos, modalidades e configurações. Não se pretende identificar os elementos-chave ou críticos da descrição nem delinear o âmbito da descrição, mas apresentar conceitos selecionados da des- crição de uma forma simplificada, como uma introdução à descrição mais detalhada apresentada abaixo. Tal como será apreciado, outros aspectos, modalidades e configurações da descrição são possíveis utilizando, sozinhas ou em combinação, uma ou mais das característi- cas determinadas acima ou descritas em detalhes abaixo. Tal como será apreciado, outras modalidades são possíveis usando, sozinhas ou em combinação, uma ou mais das características indicadas acima ou descritas no presente documento. Por exemplo, deve ser conside- rado que as várias características e dispositivos mostrados e/ou des- critos com respeito a uma modalidade podem ser combinados ou substituídos com características ou dispositivos de outras modalida- des, independentemente de tal combinação ou substituição ser ou não mostrada ou descrita especificamente no presente documento. Os as-
pectos adicionais da presente invenção ficarão mais evidentes com a Descrição Detalhada, em particular quando considerados junto com os desenhos.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[0065] A Figura 1 é uma vista em perspectiva frontal de um dispo- sitivo de sedimentação de uma outra configuração da presente inven- ção.
[0066] A Figura 2 é uma vista em perspectiva frontal seccional parcial do dispositivo de sedimentação da Figura 1 que ilustra uma pi- lha de cones convexos dentro do dispositivo de sedimentação.
[0067] A Figura 3 é outra vista em perspectiva frontal seccional parcial do dispositivo de sedimentação da Figura 2.
[0068] A Figura 4 é uma vista em perspectiva frontal explodida do dispositivo de sedimentação da Figura 1.
[0069] A Figura 5A é uma vista em perspectiva de um invólucro do dispositivo de sedimentação da Figura 1.
[0070] A Figura 5B é uma vista de planta superior do invólucro da Figura 5A.
[0071] A Figura 5C é uma vista em elevação lateral do invólucro da Figura 5A.
[0072] A Figura 6 é uma vista de planta superior do dispositivo de sedimentação da Figura 1.
[0073] A Figura 7 é uma vista em elevação frontal de seção trans- versal do dispositivo de sedimentação considerado ao longo da linha 7-7 da Figura 6 com a pilha de cones removidos para maior clareza.
[0074] A Figura 8A é uma vista em elevação frontal de seção transversal detalhada de uma porção da Figura 7.
[0075] A Figura 8B é outra vista em elevação frontal de seção transversal detalhada de uma porção da Figura 7.
[0076] A Figura 9A é uma vista de planta superior de um cone do dispositivo de sedimentação da Figura 1.
[0077] A Figura 9B é uma vista de planta inferior do cone do dis- positivo de sedimentação da Figura 1.
[0078] A Figura 9C é uma vista em elevação lateral do cone do dispositivo de sedimentação da Figura 1.
[0079] A Figura 9D é uma vista em elevação lateral de seção transversal do cone do dispositivo de sedimentação considerado ao longo da linha 9D-9D da Figura 9A.
[0080] A Figura 10 é uma vista em perspectiva frontal de um dis- positivo de sedimentação de outra configuração da presente descri- ção.
[0081] A Figura 11 é uma vista em elevação frontal seccional par- cial do dispositivo de sedimentação da Figura 10.
[0082] A Figura 12 é outra vista em perspectiva frontal seccional parcial do dispositivo de sedimentação da Figura 10, ilustrando uma pilha superior de cones e uma pilha inferior de cones dentro do dispo- sitivo de sedimentação.
[0083] A Figura 13 é uma vista em perspectiva de seção transver- sal parcial de um invólucro inferior do dispositivo de sedimentação da Figura 10 e que mostra a pilha inferior de cones.
[0084] As Figuras 14 e 15 são vistas dos cones inferiores do dis- positivo de sedimentação da Figura 10.
[0085] A Figura 16 é uma vista em perspectiva frontal de um dis- positivo de sedimentação de outra configuração da presente descrição com os elementos internos do dispositivo de sedimentação ilustrados em linhas descontínuas.
[0086] A Figura 17 é uma vista em elevação frontal de seção transversal do dispositivo de sedimentação da Figura 16.
[0087] A Figura 18 uma vista em perspectiva frontal explodida do dispositivo de sedimentação da Figura 16, ilustrando um segundo con-
junto opcional de cones adaptados para ser posicionados dentro do dispositivo de sedimentação.
[0088] As Figuras 19A e 19B são vistas em perspectiva dos cones de uma modalidade da presente invenção configurados para uso com o dispositivo de sedimentação da Figura 16.
[0089] As Figuras 20A e 20B são vistas em perspectiva de um conduto opcional para uso com os dispositivos de sedimentação da presente invenção.
[0090] As Figuras 21A e 21B são vistas em perspectiva que ilus- tram de modo geral um difusor de uma modalidade da presente inven- ção que é configurado para uso com os dispositivos de sedimentação.
[0091] A Figura 22 é uma vista em perspectiva frontal de outro dispositivo de sedimentação de uma modalidade da presente descri- ção e ilustra alguns elementos internos do dispositivo de sedimentação em linhas descontínuas.
[0092] A Figura 23 é uma vista em elevação frontal de seção transversal do dispositivo de sedimentação da Figura 22.
[0093] A Figura 24 é uma representação esquemática da fixação de um dispositivo de sedimentação de células/partículas compacto da presente invenção a um biorreator modular.
[0094] A Figura 25 é um gráfico que mostra os resultados da cultu- ra do biorreator de perfusão de células da levedura P. pastoris, com um sedimentador de células compacto completamente compactado como dispositivo de retenção de células e configurado tal como mos- trado na Figura 24; e
[0095] A Figura 26 mostra a análise do tamanho de partículas das amostras retiradas do biorreator e efluente do sedimentador do apare- lho configurado tal como mostrado na Figura 24.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[0096] O termo "um" ou "uma" entidade refere-se a uma ou mais dessas entidades. Dessa maneira, os termos "um" (ou "uma"), "um ou mais" e "pelo menos um" podem ser usados intercambiavelmente no presente documento. Os termos "compreende", "inclui" e "tem" podem ser usados intercambiavelmente.
[0097] As expressões "pelo menos um", "um ou mais" e "e/ou" são as expressões de sentido aberto que são de operação tanto conjuntiva quanto disjuntiva. Por exemplo, cada uma das expressões "pelo me- nos um de A, B e C", "pelo menos um de A, B ou C", "um ou mais de A, B e C", "um ou mais de A, B ou C" e "A, B e/ou C" significa somente A, somente B, somente C, A e B juntos, A e C juntos, B e C juntos, ou A, Be C juntos.
[0098] O termo transicional "compreende" é sinônimo de "inclui", "contém", ou "caracterizado por" é inclusivo ou de sentido aberto e não exclui elementos ou etapas do método não recitados adicionais.
[0099] A expressão transicional "consiste em" exclui qualquer ele- mento, etapa ou ingrediente não especificados na reivindicação, mas não exclui componentes ou etapas adicionais que não são relaciona- dos à invenção, tais como as impurezas associadas ordinariamente com os mesmos.
[0100] A expressão transicional "consiste essencialmente em" limi- ta o âmbito de uma reivindicação aos materiais ou etapas especifica- dos ou etapas e aqueles que não afetam materialmente a(s) caracte- rística(s) básica(s) e nova(s) da invenção reivindicada.
[0101] Com relação agora à Figura 1, é ilustrada uma configuração de um dispositivo de sedimentação 300 da presente invenção, útil para a sedimentação de partículas ou células. O dispositivo de sedimenta- ção 300 inclui geralmente um invólucro superior 301A e um invólucro inferior 301B. Em uma modalidade, os invólucros superior e inferior 301A, 301B são substancialmente idênticos. Por conseguinte, em uma modalidade, os invólucros 301A, 301B são geralmente intercambiá-
veis.
[0102] Com relação agora às Figuras 2 a 9, os invólucros 301A, 301B incluem geralmente uma porção cônica 303A, 303B, uma porção cilíndrica 308A, 308Bb, uma primeira porta 353A, 353B e uma segun- da porta 354A, 354B.
[0103] Opcionalmente, a primeira porta 353 é geralmente alinhada de modo concêntrico com um eixo longitudinal do invólucro 301. À primeira porta 353 pode ser usada como uma entrada bem como uma saída. Em modalidades exemplificadoras, a segunda porta 354 se es- tende através da porção cônica 303. A segunda porta 354 também po- de ser usada para a introdução ou remoção de líquidos, gases e sóli- dos do dispositivo de sedimentação 300. Opcionalmente, a segunda porta 354 pode ser geralmente alinhada paralela ao eixo longitudinal 350 do dispositivo de sedimentação de células. Em modalidades exemplificadoras, a segunda porta 354 pode se estender através da porção cilíndrica 308. Outras configurações da primeira e segunda por- tas 353, 354 são contempladas. O invólucro 301 também pode ter mais de duas portas. As portas 353, 354 são configuradas para a in- terconexão com uma linha de tubulação.
[0104] Tal linha de tubulação pode ser interconectada a qualquer um dos dispositivos de sedimentação de células compactos da presen- te invenção. A linha pode ter um diâmetro ou então ser configurada para a interconexão com qualquer porta das modalidades da presente invenção. A linha pode incluir opcionalmente pelo menos um sensor posicionado dentro de um interior oco. Os sensores podem entrar em contato com fluidos e/ou partículas dentro da linha. Opcionalmente, os sensores podem ser arranjados em uma superfície interna da linha, embora outras configurações sejam contempladas. Os sensores po- dem ser operáveis para monitorar um ou mais dentre o pH, o OD, a glicose, a temperatura e o CO,» (incluindo CO,» dissolvido ou parcial) na linha. Opcionalmente, um ou mais dos sensores podem compreender uma sonda fluorescente que emite uma luz que varia com base em uma condição detectada pela sonda. A luz pode ser coletada por um leitor ou um medidor. Opcionalmente, a luz pode ser coletada por um cabo de fibra opcional e ser transmitida ao medidor. O medidor é ope- rável para relatar ou indicar os níveis de pelo menos um dentre o pH, o OD, a glicose, a temperatura e o CO, detectado pelas sondas fluores- centes. A linha de tubulação pode compreender um material que é transparente ou pelo menos translúcido. Desse modo, a luz gerada por um sensor pode passar através da linha. Alternativamente, pelo menos uma porção de uma linha é transparente ou translúcida, similar a uma janela. Por conseguinte, a luz gerada por um sensor pode ser transmi- tida através da porção da janela e coletada pelo medidor.
[0105] Os cones 309 podem ser posicionados dentro do dispositi- vo de sedimentação 300. Tal como ilustrado nas Figuras 2 e 3, os co- nes 309 podem ser arranjados em uma pilha com um ápice aberto 342 orientado para a primeira porta 353A do invólucro superior 301A e uma base ou abertura grande 346 orientada para a primeira porta 353A do invólucro inferior 301B. Em modalidades exemplificadoras, entre três e vinte e cinco cones 309 são arranjados em uma pilha dentro do dispo- sitivo de sedimentação 300. No entanto, os invólucros 301 podem ser dimensionados para receber qualquer número de cones 309 quando o dispositivo de sedimentação 300 é montado tal como ilustrado na Figu- ra.
[0106] Os elementos do dispositivo de sedimentação 300, tais co- mo os invólucros 301 e os cones 309, podem ser fabricados de um plástico descartável de um só uso. Alternativamente, um ou mais dos invólucros 301 e os cones 309 podem para ser manufaturados a partir de um metal, tal como uma liga de aço inoxidável, ou vidro. As superfí- cies de cones 309, e as superfícies internas dos invólucros 301 podem ser total ou parcialmente revestidas com um ou mais de um plástico não pegajoso, um Teflon, um silicone e materiais similares conhecidos dos elementos versados no estado da técnica. Adicionalmente, ou al- ternativamente, as superfícies (especialmente quando feitas de aço inoxidável) podem ser eletropolidas para obter uma superfície lisa. Es- tes dispositivos de sedimentação podem ser facilmente dimensionados a qualquer tamanho desejado.
[0107] Os invólucros 301 podem incluir opcionalmente uma camisa de fluido (não ilustrado). A camisa de fluido pode operar de maneira tal que a água ou outros líquidos podem ser dirigidos para a camisa de fluido através de uma ou mais portas para manter os invólucros 301 e o conteúdo no interior do dispositivo de sedimentação 300 dentro de uma faixa de temperatura desejada.
[0108] Com relação agora às Figuras 5A a 5C, uma pluralidade de espaçadores 315 pode se projetar para dentro de uma superfície inter- na dos invólucros 301. Os espaçadores 315 são configurados para im- pedir que a pilha de cones 309 que residem dentro do dispositivo de sedimentação 300 seja apoiada de encontro à superfície interna dos invólucros 301A, 301B. Opcionalmente, os espaçadores 315 podem ficar mais ou menos paralelos ao eixo longitudinal 350 do dispositivo de sedimentação 300. Outras configurações dos espaçadores 315 são contempladas. Os espaçadores 315 têm uma seção transversal subs- tancialmente fina para impedir ou minimizar a interferência no movi- mento ou fluxo de partículas líquidas e suspensas dentro do dispositi- vo de sedimentação 300.
[0109] Com relação agora à Figura 7, os espaçadores 315 podem incluir uma pluralidade de primeiros espaçadores 315A, segundos es- paçadores 315B e terceiros espaçadores 315C. Tal como ilustrado de maneira geral, em uma modalidade, cada um dos primeiros espaçado- res 315A se estende ao longo de pelo menos uma porção de uma su-
perfície interna da porção cilíndrica 308. Os segundos espaçadores 315B se estendem de uma superfície interna da porção cônica 303 próxima à porção cilíndrica 308. Os terceiros espaçadores 315C po- dem ser separados dos segundos espaçadores 315B. Especificamen- te, em uma modalidade, os terceiros espaçadores 315C são arranja- dos mais perto da primeira porta 353 do que da porção cilíndrica 303.
[0110] Em uma modalidade, o invólucro superior 301A e o invólu- cro inferior 301B são unidos de maneira fixa. Por exemplo, os invólu- cros superior e inferior 301 podem ser colados, soldados a quente, ou soldados por sonicação um ao outro.
[0111] Alternativamente, e com relação outra vez à Figura 1, opci- onalmente um flange 318 pode se estender da porção geralmente ci- líndrica 308 dos invólucros 301. Em modalidades exemplificadoras, o flange se estende mais ou menos perpendicular ao eixo longitudinal
350. O flange opcional 318A é configurado para a interconexão com o invólucro superior 301A a um flange 318B do invólucro inferior 301B. Os flanges 318A, 318B podem incluir opcionalmente as projeções 320 que são mais bem vistas na Figura SA. Em modalidades exemplifica- doras, um prendedor ou gancho 322 é formado em uma extremidade livre de cada projeção 320.
[0112] Pelo menos uma protuberância 324 também pode ser for- mada no flange 318. A protuberância 324 pode ter um formato que é geralmente cilíndrico. A protuberância 324 é adaptada para ser recebi- da em um rebaixo correspondente 326 de um outro flange. Adicional- mente, ou alternativamente, o flange 318 pode incluir os elementos 332, 334 adaptados para alinhar os invólucros superior e inferior 301A, 301B. Em modalidades exemplificadoras, os elementos compreendem as abas 332 e as depressões associadas 334. Tal como ilustrado na Figura 1, quando os invólucros superior e inferior 301A, 301B são ali- nhados, as abas 332 encaixam nas depressões 334 de um flange oposto.
[0113] Opcionalmente, a protuberância 324 do flange e o rebaixo 326 podem incluir furos. Os furos da protuberância e do rebaixo são configurados para alinhar quando uma protuberância 324 de um invó- lucro superior 301A é recebida em um rebaixo 326 de um invólucro inferior 301B (tal como ilustrado na Figura 8A). Desta maneira, um acessório 328, tal como um parafuso, pode passar através dos furos alinhados. Uma porca 330 pode então ser interconectada ao acessório 328 para travar os invólucros 301A, 301B um ao outro de maneira libe- rável. Tal como ilustrado de modo geral na Figura 8B, as projeções 320 do flange 318 são configuradas para travar quando um invólucro superior 301A é alinhado com um invólucro inferior 301B. Especifica- mente, em uma modalidade, os ganchos 322 das projeções 320 tra- vam de maneira liberável.
[0114] Um sulco 336 pode ser formado no flange opcional 318. O sulco 336 é configurado para reter uma arruela ou uma gaxeta 338 po- sicionada entre os invólucros superior e inferior 301A, 301B tal como ilustrado de modo geral nas Figuras 8A e 8B.
[0115] Em uma modalidade, a porção cônica 303 dos invólucros 301 não é linear. Mais especificamente, a porção cônica 303 afunila ao longo de uma passagem arqueada de um diâmetro máximo próxima à porção cilíndrica 308 a um diâmetro mínimo próxima à primeira porta
353. Mais especificamente, e com relação agora às Figuras 5C e 7, uma seção transversal longitudinal da porção cônica 303 do invólucro 301 define uma linha com um formato arqueado entre a porção cilín- drica 308 e a primeira porta 353. Em uma modalidade, a porção cônica 303 é côncava para dentro rumo a um centro do dispositivo de sedi- mentação 300. Em uma outra modalidade, a porção cônica 303 pode ter um raio de curvatura constante. Opcionalmente, em uma outra mo- dalidade, a porção cônica 303 pode ter dois ou mais raios de curvatu-
ra. Por exemplo, a porção cônica 303 pode ter um primeiro raio de curvatura próximo à porção cilíndrica 308 e um segundo raio da curva- tura próximo à primeira porta 353. Os pontos centrais do primeiro e segundo raios de curvatura são posicionados dentro de um interior do invólucro. Opcionalmente, a inclinação da porção cônica 308 pode va- riar entre cerca de 15º e cerca de 85º em relação ao eixo longitudinal
350. Em uma modalidade, a porção cônica 303 inclui uma porção con- vexa próxima à primeira porta 353. A porção convexa tem um raio de curvatura com um ponto central que fica fora do invólucro.
[0116] Com relação agora às Figuras 9A a 9D, os cones 309 in- cluem geralmente um corpo 340 que tem um ápice 342 com uma aber- tura pequena 344 e uma base com uma abertura grande 346. Opcio- nalmente, cada um dos cones é formado separadamente. Em modali- dades exemplificadoras, os cones são substancialmente do mesmo tamanho e formato.
[0117] Em algumas modalidades, o corpo 340 pode não ser linear entre as aberturas pequena e grande 344, 346. Tal como ilustrado na Figura 9D, uma seção transversal longitudinal do corpo 340 forma uma linha com um formato arqueado. O formato arqueado de cada cone 309 pode ser mais o menos o mesmo que a porção cônica 303 do in- vólucro 301.
[0118] Em algumas modalidades, o corpo 340 é côncavo para dentro rumo ao eixo longitudinal 350. Desse modo, uma linha dese- nhada de um ponto na abertura grande 346 a um ponto na abertura pequena 344 fica dentro de um interior do corpo.
[0119] Opcionalmente, o corpo 340 tem um raio de curvatura cons- tante. Alternativamente, o corpo pode ter dois ou mais raios de curva- tura. Desse modo, o corpo pode ter um primeiro raio de curvatura pró- ximo à abertura pequena 344 e um segundo raio de curvatura próximo à abertura grande 346. Os pontos centrais do primeiro e segundo raios de curvatura são posicionados dentro de um interior do cone 309. Des- ta maneira, uma porção do corpo 340 próxima à abertura pequena 344 pode ter uma inclinação que é diferente do que uma inclinação do cor- po próxima à abertura grande. Por exemplo, próximo à abertura pe- quena 344, o corpo pode ser alinhado a um ângulo de pelo menos cerca de 40 graus em relação ao eixo longitudinal 350. Por outro lado, perto da abertura grande 346, o corpo pode ficar mais perto da vertical (ou mais perto do eixo longitudinal). Mais especificamente, o corpo po- de ser inclinado a um ângulo menor do que de cerca de 45 graus em relação ao eixo longitudinal em um ponto próximo à abertura grande
346. Opcionalmente, a inclinação do corpo 340 pode variar entre cerca de 5 e cerca de 85 graus em relação ao eixo longitudinal.
[0120] Tal como mostrado nas Figuras 9B e 9D, cada cone 309 pode incluir as projeções 313 configuradas para contatar um cone ad- jacente para prender cada cone sucessivo 309 em uma pilha de cones a um espaçamento substancialmente igual. Em uma modalidade, as projeções 313 se estendem para dentro de uma superfície interna do corpo 340. As projeções 313 são configuradas para contatar uma su- perfície externa de um corpo 340 de um cone adjacente. Alternativa- mente, as projeções 313 podem se estender de uma superfície exter- na do corpo 340.
[0121] As projeções 313 podem ser dimensionadas para prover qualquer espaçamento desejado entre os cones adjacentes. Opcio- nalmente, as projeções 313 são configuradas para separar os cones adjacentes por uma distância entre cerca de 1 mm e cerca de 2,5 cm. Em modalidades exemplificadoras, cada cone 309 inclui pelo menos três projeções 313.
[0122] Com relação agora às Figuras 2 e 3, quando os cones 309 são posicionados dentro do invólucro superior 301A, o corpo 340 do cone inferior 309A é suportado pelos segundos espaçadores 315B do invólucro inferior 301B. Pelo menos a porção cônica 303 do invólucro inferior 301B e partes das porções cilíndricas 308A, 308B podem estar sem nenhum cone. Por conseguinte, as células na cultura podem ser retidas no dispositivo de sedimentação 300.
[0123] Durante a operação do dispositivo de sedimentação 300 das modalidades mostradas nas Figuras 1 a 9D, o meio de cultura de células livre de soro ou livre de proteína animal pode ser bombeado no dispositivo de sedimentação 300 através de um ou mais dentre a pri- meira e a segunda portas 353, 354 do invólucro inferior 301B. O meio de cultura de células pode ser bombeado contínua ou periodicamente no dispositivo de sedimentação 300. Especificamente, o dispositivo de sedimentação 300 pode operar em uma operação no modo descontí- nuo ou contínuo.
[0124] Uma mistura controlada de O2, CO? e No também pode ser bombeada no dispositivo de sedimentação 300 para controlar o pl e o OD do sobrenadante da cultura dentro do dispositivo de sedimentação
300. Opcionalmente, uma ou mais das segundas portas 354A, 354B e da primeira 353B do invólucro inferior 301B podem ser usadas para amostrar o conteúdo do biorreator, por exemplo, verificar a viabilidade das células, e a medição contínua do pH do líquido e do OD para as entradas em um controlador de fluxo de massa de múltiplos gases controlado por computador.
[0125] No final na expansão da célula in vitro, as células sedimen- tadas concentradas que são coletadas no fundo do dispositivo de se- dimentação 300 dentro de um invólucro inferior 301B podem ser colhi- das da primeira porta 353B do invólucro inferior. O fluido de cultura clarificado contendo quaisquer produtos residuais metabólicos, tais como amônios e lactato, ou gases, junto com quaisquer células mortas menores e resíduos de células ainda não sedimentados, pode ser re- movido através da primeira porta 353A do invólucro superior 301A.
[0126] Opcionalmente, o dispositivo de sedimentação 300 pode ser usado como uma combinação de biorreator/classificador de células autônoma. Os meios do crescimento podem ser adicionados ao dispo- sitivo de sedimentação de células através de uma ou mais dentre a primeira e a segunda portas 353, 354. Por conseguinte, o dispositivo de sedimentação 300 pode ser usado sem um biorreator de perfusão.
[0127] Em uma modalidade, sensores podem ser posicionados dentro do dispositivo de sedimentação 300. Opcionalmente, os senso- res podem ser arranjados em uma superfície interna de um ou mais dos invólucros 301A, 301B. Pelo menos uma porção dos invólucros 301 pode compreender um plástico. Em modalidades exemplificado- ras, o invólucro inteiro pode ser composto de plástico. Em modalida- des exemplificadoras, o plástico é transparente ou pelo menos translú- cido. Opcionalmente, pelo menos uma porção do invólucro 301 é transparente ou translúcida. Por exemplo, um material transparente ou translúcido pode ser interconectado a uma abertura no invólucro 301 similar a uma janela. A porção transparente pode compreender o vidro, o plástico, ou qualquer outro material apropriado. A porção transparen- te pode ser formada de um material que é transparente à luz de uma faixa ou faixas predeterminadas de comprimentos de onda.
[0128] Quando presentes, os sensores são posicionados para en- trar em contato com os meios dentro do dispositivo de sedimentação
300. Os sensores podem ser operáveis para monitorar um ou mais dentre o pH, o OD, a glicose, a temperatura e o CO,» (incluindo o CO? dissolvido ou parcial) no dispositivo de sedimentação 300.
[0129] Opcionalmente, um ou mais dos sensores podem compre- ender uma sonda fluorescente operável para emitir uma luz que varia com base em uma condição detectada pela sonda fluorescente. As sondas fluorescentes podem ser arranjadas em uma variedade de po- sições diferentes dentro do dispositivo de sedimentação 300. Mais es-
pecificamente, as sondas fluorescentes podem ser arranjadas para medir condições diferentes, ou as mudanças de condições, em áreas diferentes dentro do dispositivo de sedimentação de células. Opcio- nalmente, pelo menos uma sonda fluorescente é afixada a uma super- fície interna da porção cônica 303B do invólucro inferior 301B.
[0130] A luz emitida pelas sondas fluorescentes passa através da superfície do invólucro 301 (ou uma porção transparente do invólucro) e pode ser coletada por um leitor ou um medidor. Tal como descrito no presente documento, o medidor é operável para relatar ou indicar os níveis de pelo menos um dentre o pH, o OD, a glicose, a temperatura e o CO, detectados pelas sondas fluorescentes dentro do dispositivo de sedimentação 300. Opcionalmente, a luz emitida por uma sonda fluorescente pode ser coletada por um cabo de fibra opcional e ser transmitida ao medidor.
[0131] Com relação agora às Figuras 10 a 15, é ilustrada uma ou- tra configuração de um dispositivo de sedimentação 400 da presente invenção, útil para a sedimentação de células ou partículas. O disposi- tivo de sedimentação 400 inclui geralmente um invólucro superior 301 e um invólucro inferior 401. O invólucro superior 301 inclui uma primei- ra pilha de cones 309 e o invólucro inferior 401 inclui uma segunda pi- lha de cones 409. O invólucro superior 301 e os cones 309 são os mesmos, ou similares, aos invólucros 301 e aos cones 309 descritos conjuntamente com as Figuras 1 a 9D.
[0132] O invólucro inferior 401 inclui geralmente uma porção côni- ca 403, uma porção cilíndrica 408, uma primeira porta 453 e uma se- gunda porta 454. As portas 453, 454 são configuradas para a interco- nexão com uma linha de tubulação.
[0133] Em uma modalidade, o invólucro inferior 401 é unido de maneira fixa ao invólucro superior 301. Por exemplo, o invólucro inferi- or e o invólucro superior podem ser soldados (incluindo a soldagem a quente), colados um ao outro, ou unidos por uns outros meios conhe- cidos dos elementos versados no estado da técnica.
[0134] Alternativamente, o invólucro inferior 401 pode incluir opci- onalmente um flange 418. O flange opcional 418 é configurado para a interconexão de maneira liberável com um flange opcional 318 do in- vólucro 301. Por conseguinte, o flange 418 pode incluir projeções en- ganchadas, protuberâncias, rebaixos, abas e depressões que funcio- nam similarmente às características do flange 318. Opcionalmente, os espaçadores 415 podem se estender para dentro da porção cilíndrica
408.
[0135] Com relação agora à Figura 13, a porção cônica 403 do in- vólucro 401 é convexa para dentro rumo ao eixo longitudinal 450. Es- pecificamente, uma linha reta desenhada de um ponto da porção côni- ca próximo à primeira porta 453 a um ponto onde a porção cônica in- tercepta a porção cilíndrica 408 vai ficar fora do invólucro 401.
[0136] A porção cônica 403 pode ter um raio de curvatura constan- te. Alternativamente, a porção cônica 403 pode ter dois ou mais raios de curvatura. Por exemplo, a porção cônica 403 pode ter um primeiro raio de curvatura próximo à porção cilíndrica 408 e um segundo raio de curvatura próximo à primeira porta 453. Os pontos centrais do pri- meiro e segundo raios de curvatura são posicionados fora do invólucro
401. Em uma modalidade, a porção cônica 403 é inclinada a um ângu- lo menor do que de cerca de 45 graus em relação ao eixo longitudinal 450 em um ponto próximo à primeira porta 453. Opcionalmente, em um ponto próximo à porção cilíndrica 408, a porção cônica tem uma inclinação maior do que cerca de 45 graus em relação ao eixo longitu- dinal. Em uma outra modalidade, a inclinação da porção cônica 403 pode variar entre cerca de 15 e cerca de 85 graus em relação ao eixo longitudinal.
[0137] Em modalidades exemplificadoras, sensores podem ser posicionados dentro do dispositivo de sedimentação 400. Os sensores podem ser arranjados em uma superfície interna de um ou mais dos invólucros 301, 401. Os sensores podem ser arranjados para entrar em contato com os meios dentro do dispositivo de sedimentação 400. Os sensores são operáveis para monitorar um ou mais dentre o pH, o OD, a glicose, a temperatura e o CO, (incluindo o CO» dissolvido ou parcial) no dispositivo de sedimentação 400. Os sensores podem ser os mesmos que os outros sensores descritos no presente documento. Por conseguinte, um ou mais dos sensores podem compreender uma sonda fluorescente operável para emitir uma luz que varia com base em uma condição detectada pela sonda fluorescente. A luz pode ser transmitida através de uma porção transparente dos invólucros 301, 401 ou através de uma janela nos invólucros.
[0138] Tal como ilustrado nas Figuras 12 e 13, os cones 409 são empilhados no invólucro inferior 401. Os cones 409 são orientados com uma abertura pequena 444 posicionada próxima à primeira porta
453. O corpo 440 de cada cone 409 tem um formato que corresponde geralmente ao formato da porção cônica 403 do invólucro. Especifica- mente, o corpo 440 do cone pode ter um formato arqueado que cor- responde a pelo menos uma parte da porção cônica do invólucro. Em modalidades exemplificadoras, os corpos do cone são convexos para dentro rumo ao eixo longitudinal 450. Opcionalmente, os corpos do cone têm um raio de curvatura constante. Alternativamente, os corpos do cone podem ter dois ou mais raios de curvatura. Em uma modali- dade, a inclinação dos corpos pode variar entre cerca de 5 e cerca de 85 graus em relação ao eixo longitudinal.
[0139] As projeções 413 podem ser formadas no corpo 440 do co- ne de maneira tal que os cones adjacentes são separados por uma distância predeterminada. Em uma modalidade, as projeções 413 se estendem para dentro de uma superfície interna do corpo do cone.
Adicionalmente, ou alternativamente, as projeções 413 podem ser op- cionalmente formadas em uma superfície externa do corpo do cone. Quando os cones são empilhados juntos, as projeções 413 contatam uma superfície interna de um cone inferior de maneira tal que os cones adjacentes são separados por uma distância predeterminada. As pro- jeções 413 do cone mais inferior 409A irão contatar uma superfície in- terna da porção cônica 403 quando os cones forem posicionados no invólucro 401. Um cone mais superior 409E pode incluir opcionalmente as projeções 448 que se estendem além da abertura grande 446. Tal como mostrado na Figura 12, as projeções 448 do cone mais superior 409E podem contatar uma superfície interna do cone mais inferior 309A da pilha superior de cones 309. O contato entre as projeções 448 e o cone 309A impede o movimento não intencional ou inadvertido da pilha de cones 409.
[0140] Tal como ilustrado nas Figuras 14 e 15, em algumas moda- lidades, os cones 409 têm diâmetros diferentes. Um cone mais inferior 409A pode ter um diâmetro que é maior do que aqueles de outros co- nes na pilha. Cada cone 409B a 409E pode ter um diâmetro sucessi- vamente menor com o cone mais superior 409E que tem o menor diâ- metro. Em uma modalidade, seis cones 409A a 409E podem ser empi- lhados no invólucro inferior 401. Em uma outra modalidade, uma pilha de cones 409 no invólucro inferior pode incluir de quatro a dez cones.
[0141] O dispositivo de sedimentação 400, incluindo os invólucros 301, 401 e os cones 309, 409, pode ser formado a partir dos mesmos materiais que outras modalidades descritas no presente documento. Em modalidades exemplificadoras, um ou mais dos invólucros e cones são fabricadas de um plástico descartável de um só uso. Alternativa- mente, um ou mais dos invólucros e cones são manufaturados de um metal, tal como uma liga de aço inoxidável, ou um vidro. As superfícies dos cones 309, 409 e as superfícies internas dos invólucros 301, 401 podem ser total ou parcialmente revestidas com um ou mais de um plástico não pegajoso, um Teflon, um silicone e materiais similares co- nhecidos dos elementos versados no estado da técnica. As superfícies do dispositivo de sedimentação 400 (especialmente quando formadas de aço inoxidável) podem ser eletropolidas para obter uma superfície lisa. O dispositivo de sedimentação 400 pode ser dimensionado a qualquer tamanho desejado.
[0142] O dispositivo de sedimentação 400 pode operar de uma maneira idêntica ou similar àquela do dispositivo de sedimentação
300. Especificamente, o meio de cultura de células livre de soro ou li- vre de proteína animal pode ser bombeado no dispositivo de sedimen- tação 400 através de uma ou mais dentre a primeira e segunda portas 453, 454 do invólucro inferior 401. O meio de cultura de células tam- bém pode ser bombeado contínua ou periodicamente no dispositivo de sedimentação 400. Especificamente, o dispositivo de sedimentação 400 pode operar em uma operação no modo descontínuo ou contínuo.
[0143] Uma mistura controlada de O2, CO? e No também pode ser bombeada no dispositivo de sedimentação 400 para controlar o pl e o OD do sobrenadante da cultura dentro do dispositivo de sedimentação de células. Opcionalmente, uma ou mais dentre as segundas portas 354, 454 e a primeira porta 353 do invólucro inferior 301 podem ser usadas para amostrar o conteúdo do biorreator, por exemplo, verificar a viabilidade das células, e a medição contínua do pH do líquido e do OD para as entradas em um controlador de fluxo de massa de múlti- plos gases controlado por computador.
[0144] No final na expansão das células in vitro, as células sedi- mentadas concentradas que são coletadas no fundo do dispositivo de sedimentação 400 podem ser colhidas da primeira porta 453 do invó- lucro inferior 401. O fluido de cultura clarificado contendo quaisquer produtos residuais metabólicos, tais como amônia e lactato, ou gases,
junto com quaisquer células mortas menores e resíduos de células ainda não sedimentados, pode ser removido através da primeira porta 353 do invólucro superior 301.
[0145] Opcionalmente, o dispositivo de sedimentação 400 pode ser usado como uma combinação de biorreator/classificador de células autônoma. Os meios do crescimento podem ser adicionados ao dispo- sitivo de sedimentação da célula através de uma ou mais dentre a pri- meira e a segunda portas 353, 354, 453, 454. Por conseguinte, o dis- positivo de sedimentação 300 pode ser usado sem um biorreator de perfusão.
[0146] Com relação agora às Figuras 16-21, é ilustrada uma outra configuração de um dispositivo de sedimentação 500 para partículas ou células da presente invenção. O dispositivo de sedimentação 500 inclui elementos que são os mesmos que, ou similares aos dispositivos de sedimentação 300, 400 da presente invenção. Mais especificamen- te, o dispositivo de sedimentação 500 inclui geralmente uma porção cônica superior 503A, uma porção cilíndrica 508 e uma porção cônica inferior 503B que definem um interior geralmente oco. Em uma moda- lidade, as porções cônicas superior e inferior 503A, 503B são substan- cialmente idênticos. Pelo menos uma pilha de cones 509 é posiciona- da dentro do dispositivo de sedimentação 500.
[0147] As porções cônicas 503A, 503B incluem geralmente uma primeira porta 553 e opcionalmente uma segunda porta 554. Opcio- nalmente, a primeira porta 553 é alinhado substancialmente de modo concêntrico com um eixo longitudinal 550 do dispositivo de sedimenta- ção 500. A primeira porta 553 pode ser usada como uma entrada, bem como uma saída.
[0148] A segunda porta 554 também pode ser usada para a intro- dução ou a remoção de líquidos, gases e sólidos do interior oco do dispositivo de sedimentação 500. Em modalidades exemplificadoras, a segunda porta 554 se estende através da porção cônica 503. Opcio- nalmente, a segunda porta 554 pode ser geralmente alinhada paralela ao eixo longitudinal 550 do dispositivo de sedimentação de células. Em outras modalidades, a segunda porta 554 pode se estender através da porção cilíndrica 508. Em uma modalidade, a segunda porta 554 pode ser orientada transversal ou perpendicular ao eixo longitudinal 550. Outras configurações da primeira e segunda portas 553, 554 são con- templadas. O dispositivo de sedimentação 500 também pode ter mais de quatro portas.
[0149] As portas 553, 554 são configuradas para a interconexão com uma linha de tubulação. Tal linha de tubulação pode ser interco- nectada a qualquer um dos dispositivos de sedimentação de células compactos da presente invenção. A linha de tubulação pode ter um diâmetro ou então ser configurada para uma interconexão com qual- quer porta das modalidades da presente invenção. A linha pode incluir opcionalmente pelo menos um sensor posicionado dentro de um inte- rior oco. Os sensores podem entrar em contato com os fluidos e/ou partículas dentro da linha. Opcionalmente, os sensores podem ser ar- ranjados em uma superfície interna da linha, embora outras configura- ções sejam contempladas. Os sensores podem ser operáveis para monitorar um ou mais dentre o pH, o OD, a glicose, a temperatura e o CO, (incluindo o CO» dissolvido ou parcial) na linha.
[0150] Opcionalmente, um ou mais dos sensores podem compre- ender uma sonda fluorescente que emite uma luz que varia com base em uma condição detectada pela sonda. A luz pode por ser coletada por um leitor ou um medidor. A luz pode ser opcionalmente coletada por um cabo de fibra opcional e ser transmitida ao medidor. O medidor é operável para relatar ou indicar os níveis de pelo menos um dentre o PH, o OD, a glicose, a temperatura e o CO, detectados pelas sondas fluorescentes. A linha pode compreender um material que é transpa-
rente ou pelo menos translúcido. Desse modo, a luz gerada por um sensor pode passar através da linha. Alternativamente, pelo menos uma porção de uma linha é transparente ou translúcida, similar a uma janela. Por conseguinte, a luz gerada por um sensor pode ser transmi- tida através da porção da janela e coletada pelo medidor.
[0151] Um conduto 560 pode ser opcionalmente interconectado a pelo menos uma das segundas portas 554 dentro do interior do dispo- sitivo de sedimentação 500. Uma modalidade de um conduto 560 da presente invenção é ilustrada de modo geral nas Figuras 20A e 20B. Um lúmen 562 se estende através do conduto. Em uma modalidade, o conduto 560 não é linear. Mais especificamente, o conduto 560 pode ser dobrado. Desta maneira, o conduto é configurado para se estender para dentro no interior do dispositivo de sedimentação 500 com uma extremidade livre 564 do conduto posicionada próxima ao eixo longitu- dinal 550 tal como ilustrado de modo geral na Figura 17. Por conse- guinte, o lúmen 562 através do conduto 560 pode ser posicionado para injetar dentro ou retirar fluido de uma porção mediana do dispositivo de sedimentação 500, tal como de um interior de um cone 509. Desta maneira, a retirada de fluido do dispositivo de sedimentação 500 atra- vés do conduto 560 pode facilitar o fluxo de fluido para cima dentro do dispositivo de sedimentação de maneira tal que as células ou partícu- las dentro do fluido sedimentam nos cones e migram para a porção cônica inferior 503B.
[0152] O dispositivo de sedimentação 500 também pode incluir um difusor 570 tal como ilustrado de modo geral nas Figuras 21A e 21B posicionado dentro do interior oco. O difusor 570 pode ser associado com uma das segundas portas, tal como a segunda porta inferior 554B. O fluido pode ser injetado ou retirado do dispositivo de sedimen- tação 500 através do difusor sem perturbar as partículas ou células que sedimentaram próximas à porção cônica inferior 503B. Quando fluido é injetado no dispositivo de sedimentação 500 através do difu- sor, o fluido, que pode conter células ou partículas, é distribuído uni- formemente por toda a porção cônica inferior 503B do sedimentador.
[0153] Com relação agora às Figuras 21A e 21B, o difusor pode compreender um toro ou anel 574 que se estende de uma haste 572. A haste 572 pode ser geralmente linear e configurada para ser orien- tada paralela ao eixo longitudinal 550. O anel 574 pode ser configura- do para se estender em torno do eixo longitudinal 550 quando o difu- sor 570 é interconectado ao dispositivo de sedimentação 500. Em uma modalidade, o anel 574 é adaptado para ser substancialmente concên- trico com o eixo longitudinal.
[0154] Uma abertura 576 é formada através do anel 574 para faci- litar o transporte de fluido, células ou partículas através do difusor. Em uma modalidade, a abertura 576 é formada em um lado do anel conec- tado à haste 572. Desta maneira, a abertura 576 pode ser orientada para a primeira porta inferior 553B quando o difusor é interconectado à segunda porta inferior 554. A abertura 576 pode ser configurada como um único canal ou sulco. O sulco pode se estender de maneira subs- tancialmente contínua em torno do anel.
[0155] Alternativamente, o anel pode compreender uma pluralida- de de aberturas individuais 576. Em uma modalidade, as aberturas são orientadas axialmente para ejetar o fluido geralmente paralelo ao eixo longitudinal. Todas as aberturas 576 podem ser orientadas na mesma direção. Alternativamente, algumas das aberturas podem ficar voltadas para direções diferentes ou opostas. Opcionalmente, uma ou mais das aberturas 576 podem ser orientadas transversais ao eixo longitudinal 550. Adicionalmente, ou alternativamente, algumas das aberturas podem ser orientadas radial ou axialmente.
[0156] Com relação outra vez à Figura 17, os cones 509 podem ser posicionados dentro do dispositivo de sedimentação 500 e ser ori-
entados para ficar voltados a uma ou mais dentre a porção cônica su- perior 503A e a porção cônica inferior 503B. Em uma modalidade, o dispositivo de sedimentação inclui uma pilha de cones com uma ex- tremidade pequena ou ápice 542 dos cones 509B orientados para a primeira porta inferior 553B da porção cônica inferior 503B. Nesta mo- dalidade, uma base ou uma abertura grande 546 de cones é orientada para a primeira porta superior 553A da porção cônica superior 503A. Em modalidades exemplificadoras, entre três e vinte e cinco cones 509 são arranjados em uma pilha dentro do dispositivo de sedimentação
500. Em uma outra modalidade, a pilha inclui de 6 a 14 cones, ou 10 cones. No entanto, o dispositivo de sedimentação 500 pode ser di- mensionado para receber qualquer número de cones 509 quando o dispositivo de sedimentação 500 é montado tal como ilustrado nas Fi- guras 16 e 17. Pelo menos uma parte da porção cônica inferior 503B pode não conter nenhum cone. Mais especificamente, um cone mais inferior 509 pode ser espaçado a uma distância predeterminada de uma superfície interna da porção cônica inferior 503B. Por conseguin- te, as células na cultura podem ser retidas no dispositivo de sedimen- tação 500, por exemplo, próximo à primeira porta inferior 553B.
[0157] Quando os cones 509B são orientados com seus ápices 542 próximos à primeira porta inferior 553B, um corpo 540 do cone inferior 509 pode ser suportado pelo difusor 570. Mais especificamen- te, tal como ilustrado de maneira geral na Figura 17, o cone inferior 509 pode se estender através do anel 574 do difusor de maneira tal que o corpo 540 do cone contata o anel do difusor. O cone inferior po- de ser opcionalmente unido ou soldado ao anel do difusor. Desta ma- neira, o difusor 570 é operável para posicionar o cone inferior 509 a uma distância predeterminada da superfície interna da porção cônica inferior 503B.
[0158] Com relação outra vez à Figura 17, opcionalmente um flan-
ge 518 pode se estender de uma extremidade grande das porções cô- nicas 503 do dispositivo de sedimentação. O flange 518 pode ter um diâmetro interno que é mais ou menos igual, mas maior, do que o dià- metro externo da porção cilíndrica 508. Em uma modalidade, quando o dispositivo de sedimentação é montado, o flange 518 se estende para fora de uma superfície externa da porção cilíndrica 508 e mais ou me- nos paralelo ao eixo longitudinal 550. O flange opcional 518 é configu- rado para a interconexão com uma porção cônica associada 503 à porção cilíndrica 508. Por exemplo, uma porção cônica 503 pode ser soldada ou então fixada à porção cilíndrica 508 próxima ao flange 518.
[0159] Adicionalmente, ou alternativamente, o flange 518 pode in- cluir elementos adaptados para alinhar uma porção cônica associada 503 com a porção cilíndrica 508. Em uma modalidade exemplificadora, os elementos compreendem projeções configuradas para acoplar nos rebaixos correspondentes na porção cilíndrica.
[0160] O flange pode ser configurado para reter uma arruela ou uma gaxeta posicionada entre a porção cônica e a porção cilíndrica. À gaxeta pode ser idêntica ou similar à gaxeta 338 ilustrada de maneira geral nas Figuras 8A e 8B.
[0161] Em uma modalidade, uma ou mais das porções cônicas 503 do dispositivo de sedimentação 500 não são lineares. Mais espe- cificamente, as porções cônicas 503 podem afunilar ao longo de uma passagem arqueada de um diâmetro máximo próximo à porção cilín- drica 508 a um diâmetro mínimo próximo à primeira porta 553. Mais especificamente, e com relação outra vez à Figura 17, uma seção transversal longitudinal de cada uma das porções cônicas 503 define uma linha com um formato arqueado entre a porção cilíndrica 508 e a primeira porta 553. Em uma modalidade, as porções cônicas 503 são côncavas para dentro rumo a um centro do dispositivo de sedimenta- ção 500. Em uma outra modalidade, as porções cônicas 503 podem ter um raio de curvatura constante. Opcionalmente, em uma outra mo- dalidade, uma ou mais das porções cônicas 503 podem ter dois ou mais raios de curvatura. Por exemplo, uma porção cônica 503 pode ter um primeiro raio de curvatura próximo à porção cilíndrica 508 e um segundo raio de curvatura próximo a uma primeira porta associada
553. Os pontos centrais do primeiro e segundo raios de curvatura são posicionados dentro de um interior do dispositivo de sedimentação
500. Opcionalmente, a inclinação de uma porção cônica 508 pode va- riar entre cerca de 5 e cerca de 85 graus em relação ao eixo longitudi- nal 550. Em uma modalidade, uma porção cônica 503 pode incluir uma porção convexa próxima à primeira porta 553. A porção convexa tem um raio de curvatura com um ponto central que fica fora do dispositivo de sedimentação 500.
[0162] Com relação agora às Figuras 19A e 19B, os cones 509 incluem geralmente um corpo 540 que tem um ápice 542 com uma abertura pequena 544 e uma base com uma abertura grande 546. Op- cionalmente, cada um dos cones é formado separadamente. Em mo- dalidades exemplificadoras, os cones são substancialmente do mesmo tamanho e formato.
[0163] Em algumas modalidades, o corpo 540 pode não ser linear entre as aberturas pequena e grande 544, 546. Tal como ilustrado de maneira geral na Figura 17, uma seção transversal longitudinal do cor- po 540 irá formar uma linha com um formato arqueado. O formato ar- queado de cada cone 509 pode ser mais o menos o mesmo que aque- le de uma ou mais das porções cônicas 503 do dispositivo de sedi- mentação 500.
[0164] Em algumas modalidades, o corpo 540 é côncavo para dentro rumo ao eixo longitudinal 550. Desse modo, uma linha reta de- senhada de um ponto na abertura grande 546 a um ponto na abertura pequena 544 fica dentro de um interior do corpo.
[0165] Opcionalmente, o corpo 540 tem um raio de curvatura cons- tante. Alternativamente, o corpo pode ter dois ou mais raios de curva- tura. Desse modo, o corpo pode ter um primeiro raio de curvatura pró- ximo à abertura pequena 544 e um segundo raio de curvatura próximo à abertura grande 546. Os pontos centrais do primeiro e segundo raios de curvatura são posicionados dentro de um interior do cone 509. Des- ta maneira, uma porção do corpo 540 próxima à abertura pequena 544 pode ter uma inclinação que é diferente de uma inclinação do corpo próxima à abertura grande. Por exemplo, próximo à abertura pequena 544, o corpo pode ser alinhado a um ângulo de pelo menos cerca de 40 graus em relação ao eixo longitudinal 550. Por outro lado, perto da abertura grande 546, o corpo pode ficar mais perto da vertical (ou mais perto do eixo longitudinal). Mais especificamente, o corpo pode ser in- clinado a um ângulo menor do que cerca de 45 graus em relação ao eixo longitudinal em um ponto próximo à abertura grande 546. Opcio- nalmente, a inclinação do corpo 540 pode variar entre cerca de 5 e cerca de 85 graus em relação ao eixo longitudinal.
[0166] Tal como mostrado nas Figuras 19A e 19B, cada cone 509 pode incluir as projeções 513 configuradas para contatar um cone ad- jacente para prender substancialmente cada cone sucessivo 509 em uma pilha de cones a um mesmo espaçamento. Em uma modalidade, as projeções 513 se estendem para fora de uma superfície externa do corpo 540. As projeções 513 são configuradas para contatar uma su- perfície interna de um corpo 540 de um cone adjacente. Alternativa- mente, as projeções 513 podem se estender de uma superfície inter- nar do corpo 340. Em algumas modalidades, as projeções 513 são ge- ralmente orientadas paralelas ao eixo longitudinal 550.
[0167] As projeções 513 podem ser dimensionadas para obter qualquer espaçamento desejado entre os cones adjacentes. Opcio- nalmente, as projeções 513 são configuradas para separar os cones adjacentes por uma distância entre cerca de 1 mm e cerca de 2,5 cm. Em modalidades exemplificadoras, cada cone 509 inclui pelo menos três projeções 513.
[0168] As projeções 513 podem ser opcionalmente configuradas para fixar um primeiro cone em relação a um segundo cone. Mais es- pecificamente, a projeção 513 pode incluir um flange 532 e um sulco
536. O sulco 536 de um primeiro cone pode receber um flange 532 de um segundo cone adjacente tal como ilustrado de maneira geral na Figura 19A.
[0169] Com relação agora à Figura 18, o dispositivo de sedimenta- ção 500 pode incluir opcionalmente uma segunda pilha de cones 509A. Os cones 509A da segunda pilha de cones podem ser os mes- mos que os cones 509B. Alternativamente, os cones 509A podem ser de um tamanho ou formato diferente do que os cones 509B. Em uma modalidade, cada um dos cones 509A da segunda pilha de cones po- de ser de um tamanho diferente. Por exemplo, o mais superior dos co- nes 509A pode ter um diâmetro que é maior do que o mais inferior dos cones. Similarmente, o mais inferior dos cones 509A pode ter um dià- metro que é menor do que os outros cones da segunda pilha de co- nes.
[0170] Opcionalmente, um ou mais espaçadores (não ilustrado) podem se projetar para dentro de uma superfície interna do dispositivo de sedimentação 500. Os espaçadores são configurados para impedir que a pilha de cones 509 que residem dentro do dispositivo de sedi- mentação 500 seja apoiada de encontro à superfície interna das por- ções cônicas 503 ou da porção cilíndrica 508. Opcionalmente, os es- paçadores podem ficar mais ou menos paralelos ao eixo longitudinal 550 do dispositivo de sedimentação 300. Os espaçadores podem ter uma seção transversal substancialmente fina para impedir ou minimi- zar a interferência no movimento ou fluxo de partículas líquidas e sus-
pensas dentro do dispositivo de sedimentação 500. Embora não seja ilustrado nas Figuras 16 a 18, os espaçadores podem ser idênticos ou similares aos espaçadores 315 ilustrados nas Figuras 5A, 5Be7e descritos no presente documento.
[0171] Os elementos do dispositivo de sedimentação 500, tais co- mo as porções cônicas 503, a porção cilíndrica 508 e os cones 509, podem ser fabricados de um plástico descartável de um só uso. Alter- nativamente, uma ou mais dentre as porções cônicas 503, a porção cilíndrica 508 e os cones 509 podem ser manufaturados a partir de um metal, tal como uma liga de aço inoxidável, ou vidro. As superfícies de cones 509, e as superfícies internas das porções cônicas 503 e da porção cilíndrica 508 podem ser total ou parcialmente revestidas com um ou mais dentre um plástico não pegajoso, um Teflon, um silicone e materiais similares conhecidos dos elementos versados no estado da técnica. Adicionalmente, ou alternativamente, as superfícies (especi- almente quando formadas de aço inoxidável) podem ser eletropolidas para obter uma superfície lisa. Estes dispositivos de sedimentação po- dem ser facilmente ser dimensionados a qualquer tamanho desejado.
[0172] Em uma modalidade, as porções cônicas são unidas de maneira fixa à porção cilíndrica, por exemplo, por uma solda (tal como uma solda sônica ou uma solda a quente), um adesivo, ou uma cola. Opcionalmente, um ou mais dos cones podem ser unidos a uma su- perfície interna do dispositivo de sedimentação. Por exemplo, em uma modalidade, uma porção de um cone mais superior 509 na pilha de cones pode contatar, e ser fixada, a uma superfície interna da porção cônica superior 503A tal como ilustrado de maneira geral na Figura 17. Em uma modalidade, os cones podem ser unidos uns aos outros para formar a pilha de cones.
[0173] O dispositivo de sedimentação 500 pode incluir opcional- mente uma camisa de fluido (não ilustrado). A camisa de fluido pode ser associada com uma ou mais das porções cônicas 503 e a porção cilíndrica 508. A água ou outros líquidos podem ser dirigidos à camisa de fluido através de uma ou mais portas para manter o dispositivo de sedimentação 500 e seu conteúdo, incluindo o fluido, dentro de uma faixa de temperatura desejada.
[0174] Durante a operação do dispositivo de sedimentação 500 das modalidades mostradas nas Figuras 16 a 18, o meio de cultura de células livre de soro ou livre de proteína animal pode ser bombeado no dispositivo de sedimentação 300 através de uma ou mais dentre a primeira e a segundas portas 553B, 554B da porção cônica inferior 503B. O meio de cultura de células pode ser bombeado contínua ou periodicamente no dispositivo de sedimentação 500. Especificamente, o dispositivo de sedimentação 500 pode operar em uma operação no modo descontínuo ou contínuo.
[0175] Uma mistura controlada de O2, CO? e No também pode ser bombeada no dispositivo de sedimentação 500 para controlar o pl e o OD do sobrenadante de cultura dentro do dispositivo de sedimentação
500. Opcionalmente, uma ou mais dentre as segunda portas 554A, 554B e a porção cônica inferior 503B, e a primeira porta 553B, podem ser usadas para amostrar o conteúdo do biorreator, por exemplo, veri- ficar a viabilidade das células, e a medição contínua do pH do líquido e do OD para as entradas em um controlador de fluxo de massa de múl- tiplos gases controlado por computador.
[0176] No final na expansão das células in vitro, as células sedi- mentadas concentradas que são coletadas no fundo do dispositivo de sedimentação 500 dentro da porção cônica inferior 503B podem ser colhidas da primeira porta 553B do dispositivo de sedimentação 500. O fluido de cultura clarificado contendo quaisquer produtos residuais metabólicos, tais como amônia e lactato, ou gases, junto com quais- quer células mortas menores e resíduos de células ainda não sedi-
mentados, pode ser removido através da primeira porta 553A da por- ção cônica superior 503A.
[0177] Opcionalmente, o dispositivo de sedimentação 500 pode ser usado como uma combinação de biorreator/classificador de células autônoma. Os meios de crescimento podem ser adicionados ao dispo- sitivo de sedimentação de células através de uma ou mais dentre a primeira e a segunda portas 553, 554. Por conseguinte, o dispositivo de sedimentação 500 pode ser usado sem uma conexão a um biorrea- tor de perfusão.
[0178] Em uma modalidade, sensores podem ser posicionados dentro do dispositivo de sedimentação 500. Opcionalmente, os senso- res podem ser arranjados em uma superfície interna de uma ou mais dentre as porções cônicas de 503 e da porção cilíndrica 508. Em mo- dalidades exemplificadoras, pelo menos uma porção do dispositivo de sedimentação 500 pode compreender um plástico. Em modalidades exemplificadoras, o invólucro inteiro pode ser composto de plástico. Em modalidades exemplificadoras, o plástico é transparente ou pelo menos translúcido. Opcionalmente, pelo menos uma porção do dispo- sitivo de sedimentação 500 é transparente ou translúcida. Por exem- plo, um material transparente ou translúcido pode ser interconectado a uma abertura no dispositivo de sedimentação 500, similar a uma jane- la. A porção transparente pode compreender um vidro, um plástico, ou qualquer outro material apropriado. A porção transparente pode ser formada de um material que é transparente à luz de uma faixa ou fai- xas predeterminadas de comprimentos de onda.
[0179] Quando presentes, os sensores são posicionados para en- trar em contato com os meios dentro do dispositivo de sedimentação
500. Os sensores podem ser operáveis para monitorar um ou mais dentre o pH, o OD, a glicose, a temperatura e o CO,» (incluindo o CO? dissolvido ou parcial) no dispositivo de sedimentação 500.
[0180] Opcionalmente, um ou mais dos sensores podem compre- ender uma sonda fluorescente operável para emitir a luz que varia com base em uma condição detectada pela sonda fluorescente. As sondas fluorescentes podem ser arranjadas em uma variedade de posições diferentes dentro do dispositivo de sedimentação 500. Mais especifi- camente, as sondas fluorescentes podem ser arranjadas para medir condições diferentes, ou as mudanças de condições, em áreas dife- rentes dentro do dispositivo de sedimentação de células. Opcional- mente, pelo menos uma sonda fluorescente é afixada a uma superfície interna da porção cônica inferior 503B do dispositivo de sedimentação.
[0181] A luz emitida pela sonda fluorescente passa através da su- perfície do dispositivo de sedimentação (ou uma porção transparente do dispositivo de sedimentação) e pode ser coletada por um leitor ou um medidor. Tal como descrito no presente documento, o medidor é operável para relatar ou indicar os níveis de pelo menos um dentre o PH, o OD, a glicose, a temperatura e o CO, detectados pelas sondas fluorescentes dentro do dispositivo de sedimentação 500. Opcional- mente, a luz emitida por uma sonda fluorescente pode ser coletada por um cabo de fibra opcional e ser transmitida ao medidor.
[0182] Com relação agora às Figuras 22 e 23, um outro dispositivo de sedimentação 600 da presente invenção é ilustrado de maneira ge- ral. O dispositivo de sedimentação 600 é similar ao dispositivo de se- dimentação 500 e inclui muitas das mesmas características. Por exemplo, o dispositivo de sedimentação 600 inclui geralmente uma porção cônica superior 503A, uma porção cilíndrica 508 e uma porção cônica inferior 503B que definem um interior geralmente oco. Um difu- sor 570 pode ser posicionado dentro do interior oco em comunicação fluida com uma segunda porta inferior 553B.
[0183] Uma pilha de cones 509A pode ser posicionada dentro do dispositivo de sedimentação 600. De modo marcante, os cones 509A são orientados com seu ápice 542 próximo à porção cônica superior 503A e uma primeira porta superior 553A.
[0184] Os cones 509A podem ser fixados a uma superfície interna da porção cônica superior 503A. Mais especificamente, em uma moda- lidade, os cones incluem as projeções 513 tal como descrito no pre- sente documento. As projeções 513 de um cone superior 509A podem ser fixadas ou soldadas a uma superfície interna da porção cônica su- perior 503A tal como ilustrado de maneira geral na Figura 23.
[0185] Opcionalmente, uma segunda pilha de cones (não ilustra- do) pode ser posicionada dentro do dispositivo de sedimentação 600. Os cones da segunda pilha de cones podem ser orientados com seus ápices próximos à porção cônica inferior 503B. Em uma modalidade, os cones da segunda pilha de cones são idênticos ou similares aos cones 509A. Alternativamente, os cones da segunda pilha de cones podem ser de um tamanho ou formato diferente daquele dos cones 509A. Em uma modalidade, os segundos cones podem ter diâmetros sucessivamente crescentes similares aos cones 409 ilustrados nas Figuras 14 e 15.
[0186] Em cada uma das modalidades da presente invenção, o ângulo de inclinação das superfícies das superfícies cônicas de cones empilhados pode ficar entre cerca de 30 graus e cerca de 60 graus em relação à vertical. Em determinadas modalidades, o ângulo de inclina- ção para as superfícies das superfícies cônicas ou os cones empilha- dos é de cerca de 45 graus em relação à vertical. Em ainda uma outra modalidade, o ângulo de inclinação varia entre cerca de 15 graus e cerca de 75 graus. Tal como foi descrito acima, para a separação de partículas mais pegajosas (tipicamente células de mamíferos), o ângu- lo de inclinação fica de preferência mais perto da vertical (isto é, a cer- ca de 30 graus da vertical). Para partículas sólidas menos pegajosas (por exemplo, partículas de catalisador), o ângulo de inclinação pode ser mais afastado da vertical (de preferência, a cerca de 60 graus da vertical).
[0187] O material de construção de qualquer um dos dispositivos de sedimentação da presente invenção, incluindo o invólucro, os co- nes e/ou quaisquer componentes adicionais do dispositivo de sedi- mentação, pode ser o aço inoxidável (especialmente o aço inoxidável 316), ou materiais similares usados para aplicações na cultura de célu- las microbianas ou de mamíferos, assim como outros metais usados para aplicações em indústrias de processos químicos, tais como a se- paração e a reciclagem de catalisadores. As superfícies de aço inoxi- dável podem ser total ou parcialmente eletropolidas para prover super- fícies lisas nas quais as células ou as partículas podem deslizar depois da sedimentação da suspensão líquida. Algumas ou todas as superfí- cies do dispositivo de sedimentação da presente invenção podem ser revestidas com um plástico não pegajoso ou silicone, tal como dimetil dicloro silano. Alternativa ou adicionalmente, a construção de material de qualquer um destes dispositivos de sedimentação da presente in- venção pode ser não metais, incluindo plásticos, tais como os plásticos descartáveis de um só uso. Embora os dispositivos de sedimentação de metal da invenção possam ser construídos através de laminação de placa padrão e de soldagem de placas angulares de aço ao fundo da placa espiral, um dispositivo de sedimentação de plástico da presente invenção, ou as peças individuais do mesmo, pode ser fabricado mais facilmente continuamente como uma única peça ao usar, por exemplo, tecnologias de moldagem a injeção ou de impressão tridimensional.
[0188] Em qualquer um dos dispositivos de sedimentação da pre- sente invenção, o líquido pode ser dirigido para, ou extraído de, qual- quer uma das portas ou aberturas no dispositivo de sedimentação por uma ou mais bombas (por exemplo, uma bomba peristáltica) em co- municação líquida com a porta ou abertura. Tais bombas, ou outros meios que fazem com que o líquido flua para dentro ou fora dos dispo- sitivos de sedimentação, podem operar contínua ou intermitentemente. Se forem operados intermitentemente, durante o período quando a bomba está desligada, a sedimentação das partículas ou células ocor- re enquanto o fluido circundante ainda está quiescente. Isto permite que as partículas ou as células que já sedimentaram deslizem pelas superfícies cônicas inclinadas desimpedidas pelo fluxo ascendente de líquido. A operação intermitente tem a vantagem que pode melhorar a velocidade à qual as células deslizam, desse modo melhorando a via- bilidade das células e a produtividade. Em uma modalidade específica, uma bomba é usada para dirigir uma suspensão líquida de células de um biorreator ou um meio de fermentação aos dispositivos de sedi- mentação da presente invenção.
[0189] A espessura do material que constrói os cones colocados dentro do invólucro de qualquer um dos dispositivos de sedimentação da presente invenção é de preferência tão fina quanto necessário para manter a rigidez da forma e minimizar o peso da pilha concêntrica de cones a ser suportada dentro do invólucro. O raio e a altura destes dispositivos podem ser ampliados independentemente de tanto quanto se faz necessário para os processos em larga escala tal como pode ser calculado a partir das equações preditivas tal como provido para sedimentadores de placa inclinados (Batt et al. 1990, supra).
[0190] Um fator importante que causa a separação das partículas nos dispositivos de sedimentação da presente invenção é a sedimen- tação realçada nas superfícies inclinadas, o que foi demonstrado com sucesso por Boycott (Nature, 104:532, 1920) com células do sangue e em superfícies retangulares inclinadas tal como demonstrado com su- cesso por Batt et al. (1990, supra) com células de hibridoma produzin- do anticorpos monoclonais. Os fatores adicionais que realçam a sepa- ração das células/partículas são a força centrífuga nas célu-
las/partículas durante o seu curso acima das regiões anulares entre os cilindros sucessivos e a sedimentação devida à gravidade nas superfí- cies de sedimentação.
[0191] Embora as placas lamelares sejam usadas para ampliar os sedimentadores de placa inclinados por cada dimensão independen- temente, isto é, o aumento do comprimento, ou da largura ou do nú- mero de placas empilhadas em cima de cada placa, a zona de sedi- mentação cônica espiral pode ser ampliada em três dimensões simul- taneamente simplesmente ao aumentar o raio horizontal desse dispo- sitivo. À medida que o raio horizontal do dispositivo aumenta, o núme- ro de superfícies verticais e cônicas pode ser proporcionalmente au- mentado ao manter uma distância constante (ou largura de canal) en- tre as espirais sucessivas. A eficiência da separação de partículas é diretamente proporcional à área horizontal projetada total das superfí- cies de sedimentação inclinadas. Com um aumento no raio do disposi- tivo, a área horizontal projetada aumenta proporcionalmente ao qua- drado do raio, o que resulta em uma faixa tridimensional na área proje- tada total (isto é, proporcional ao cubo do raio) simplesmente ao au- mentar o raio.
[0192] O dispositivo de sedimentação 600 pode operar de uma maneira similar a outros dispositivos de sedimentação da presente in- venção. Por exemplo, o dispositivo de sedimentação 600 pode ser usado e operado tal como descrito em conjunto com os dispositivos de sedimentação 300, 400, 500. Métodos de Uso e Operação dos Processos
[0193] Os métodos exemplificadores do uso dos dispositivos de sedimentação da presente invenção são agora descritos. Um líquido contendo partículas (incluindo, por exemplo, líquido de cultura de célu- las, água residual ou fluido de reação contendo partícula de catalisa- dor sólidas, etc.) é introduzida em um dispositivo de sedimentação da presente invenção através de uma porta. Cerca de 50% a 99% do lí- quido de entrada (tipicamente cerca de 90%) são removidos através de uma porta no fundo do dispositivo de sedimentação, ao passo que os 1% a 50% restantes (tipicamente cerca de 10%) do líquido são re- movidos através de uma porta no topo do dispositivo. Uma bomba (tal como uma bomba peristáltica) pode ser usada para sugar o líquido pa- ra fora da porta superior, ao passo que o líquido concentrado que sai pelo fundo pode sair pela saída inferior do invólucro do ciclone devido à gravidade, sem a necessidade de uma bomba. Alternativamente, o líquido que contêm células ou partículas sedimentadas pode ser bom- beado para fora de uma porta inferior do sedimentador cônico a cerca de 50% a 99% de vazão do líquido de entrada, e o líquido clarificado remanescente (1% a 50%) pode sair através de uma porta superior. Opcionalmente, o fluido que sai pela porta pode ser bombeado para fora em uma linha de colheita.
[0194] A maior parte das células (ou partículas) de entrada é em- purrada de encontro às paredes conjunto do dispositivo de sedimenta- ção através de forças centrífugas na entrada, sedimenta a porção cô- nica através de um movimento suave de vórtex inicialmente, ficando mais rápido quando o líquido e as partículas seguem para baixo e sa- em através da porta inferior. As células ou as partículas que não sedi- mentaram irão se mover para cima através das pilhas de cones. À medida que o líquido se move lentamente para cima através das pilhas de cones, as partículas maiores (por exemplo, células vivas) irão se- dimentar nas superfícies dos cones e deslizar pelos cones ou então cair pelo espaçamento pequeno provido entre os cones e as paredes externas do invólucro do ciclone. Essas partículas sedimentadas caem verticalmente ao longo das paredes cilíndricas externas até alcançar a seção cônica inferior do conjunto e prosseguem deslizando pela seção cônica até a porta inferior.
[0195] Com o aumento da vazão de entrada de líquido através da porta, é possível reduzir o tempo de residência do líquido dentro das zonas de sedimentação inclinadas de maneira tal que as partículas menores (por exemplo, células mortas e resíduos de células) não terão sedimentado no momento em que o líquido alcança o topo da zona de sedimentação e, portanto, essas partículas menores saem do disposi- tivo de sedimentação através da porta superior. Esta característica provê um método simples para remover seletivamente as partículas menores (tais como células mortas e resíduos de células) através da porta superior em uma corrente de colheita, ao passo que as partícu- las maiores (tais como células vivas e produtivas) são retornadas da porta inferior a um outro vaso (tal como um biorreator).
[0196] Desse modo, nestes métodos, a etapa de introdução de uma suspensão líquida nesses dispositivos de sedimentação pode in- cluir a o direcionamento de uma suspensão líquida de um saco do biorreator de plástico ao dispositivo de sedimentação de partículas.
[0197] O líquido pode ser dirigido para, ou extraído fora, de quais- quer portas ou aberturas no dispositivo de sedimentação por uma ou mais bombas (por exemplo, uma bomba peristáltica) em comunicação líquida com a porta ou abertura. Tais bombas, ou outros meios que fazem com que o líquido flua para dentro ou fora dos dispositivos de sedimentação, podem operar contínua ou intermitentemente. Se forem operados intermitentemente, durante o período em que a bomba está desligada, a sedimentação das partículas ou células ocorre quando o fluido circundante ainda está quiescente. Isto permite que as partículas ou células que já sedimentaram deslizem pelas superfícies cônicas inclinadas desimpedidas pelo fluxo ascendente de líquido. A operação intermitente tem a vantagem que pode melhorar a velocidade em que as células deslizam para baixo, desse modo melhorando a viabilidade das células e a produtividade. Em uma modalidade específica, uma bomba é usada para dirigir uma suspensão líquida das células de um biorreator ou meio de fermentação aos dispositivos de sedimentação da presente invenção.
[0198] Um parâmetro que pode ser ajustado nestes métodos de uso dos dispositivos de sedimentação da presente invenção é a vazão de líquido para dentro e fora dos dispositivos de sedimentação. A va- zão de líquido irá depender totalmente da aplicação particular do dis- positivo, e a taxa pode ser variada a fim de proteger as partículas que estão sendo sedimentadas e separadas do líquido clarificado. Especi- ficamente, a vazão pode ter que ser ajustada para proteger a viabilida- de das células vivas que podem ser separadas nos dispositivos de se- dimentação da presente invenção e ser retornadas a uma cultura de células, mas a vazão também deve ser ajustada para impedir a acu- mulação substancial das células ou das partículas nos dispositivos de sedimentação ou a obturação dos condutos que transferem o líquido para dentro e fora dos dispositivos de sedimentação.
[0199] Nestes métodos, o líquido clarificado coletado do dispositi- vo de sedimentação pode incluir pelo menos um dentre moléculas bio- lógicas, compostos orgânicos ou inorgânicos, reagentes químicos e produtos de reações químicas. O líquido clarificado coletado do dispo- sitivo de sedimentação pode incluir pelo menos um dentre hidrocarbo- netos, polipeptídeos, proteínas, álcoois, ácidos graxos, hormônios, carboidratos, anticorpos, isoprenoides, biodiesel e cerveja. Nos exem- plos destes métodos, o líquido clarificado coletado do dispositivo de sedimentação inclui pelo menos um dentre a insulina ou seus análo- gos, anticorpos monoclonais, fatores do crescimento, vacinas de su- bunidades, vírus, partículas do tipo vírus, fatores estimuladores de co- lônias e a eritropoietina (EPO).
[0200] Cada publicação ou patente citada no presente documento é incorporada no presente documento a título de referência em sua totalidade. Os dispositivos de sedimentação da presente invenção que estão agora sendo descritos de modo geral serão compreendidos mais prontamente mediante referência aos exemplos a seguir, os quais são incluídos meramente para finalidades de ilustração de determinados aspectos das modalidades da presente invenção. Os exemplos não se prestam a limitar a invenção, tal como um elemento versado no estado da técnica deve reconhecer a partir os ensinamentos acima e dos exemplos a seguir que outras técnicas e métodos podem satisfazer as reivindicações e podem ser empregados sem desviar do âmbito da presente invenção.
EXEMPLOS Exemplo 1 Levedura ou outras células microbianas que secretam produtos de proteínas
[0201] Células microbianas recombinantes, tais como de leveduras ou fungos (Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces lactis, Aspergillus niger, etc.) ou células de bactérias (Escherichia coli, Bacillus subtilis, etc.), que foram projetadas para secretar proteínas heterólogas (por exemplo, insulina ou brazeína) ou secretar natural- mente enzimas (por exemplo A. niger, B. subtilis, etc.) podem ser culti- vadas em biorreatores unidos aos dispositivos de sedimentação com- pactos da presente invenção, para reciclar célula vivas e produtivas de volta ao biorreator, o que irá acarretar desse modo densidades eleva- das de células e produtividades elevadas. Os meios nutrientes frescos são fornecidos continuamente às células vivas e produtivas dentro dos biorreatores de alta densidade de células e as proteínas ou enzimas secretadas são colhidas continuamente na saída clarificada da porta superior (ou saídas do lado de cima 353A, 354A, 553A, 554A), ao pas- so que as células vivas e produtivas concentradas são retornadas de volta ao biorreator. Uma vez que as células mortas e uma fração pe-
quena de célula vivas são removidas continuamente do biorreator através da saída de colheita, o crescimento das células e a produção das proteínas podem ser mantidos indefinidamente, sem nenhuma ne- cessidade real de terminar a operação do biorreator. Nas operações que usam células de levedura Pichia com os dispositivos de sedimen- tação cônicos da presente invenção, o biorreator de perfusão é opera- do por mais de um mês. Uma vez que as células microbianas crescem na cultura em suspensão e o dispositivo de retenção de células pode ser dimensionado até qualquer tamanho desejado, um sedimentador da presente invenção pode ser unido aos biorreatores de suspensão de tamanhos que variam da escala de laboratório (< 1 litro) à escala industrial (> 50.000 litros) ou qualquer tamanho entre os mesmos para obter culturas de perfusão de elevada densidade de célula.
[0202] Em um exemplo específico, é descrita uma cultura do bior- reator de perfusão de células da levedura Pichia pastoris. As células de levedura Pichia pastoris foram cultivadas em um biorreator de 5 li- tros controlado por computador, no modo de batelada para crescer as células a partir do inoculum para as primeiras 50 horas, a seguir no modo de batelada alimentada para encher lentamente o sedimentador de células de 12 litros para as 100 horas seguintes, e então no modo de perfusão contínua com um sedimentador de células compacto da presente invenção para remover as células mortas menores e reciclar as células vivas maiores de volta ao biorreator. Um diagrama esque- mático típico da ligação de um sedimentador de células/partículas compacto da presente invenção para qualquer biorreator modular é mostrado na Figura 24.
[0203] Com relação à Figura 24, as células de levedura Pichia pastoris foram cultivadas em um biorreator de perfusão 218. Os meios de crescimento foram adicionados ao biorreator 218 provenientes do reservatório de meios 200 através de uma primeira bomba 202 inter-
conectada à linha de entrada 201. O teor de oxigênio dissolvido e o pH foram monitorados continuamente no biorreator 218 pelo monitor de oxigênio dissolvido 206 e pelo monitor do pH 204. A cultura de células de levedura do biorreator 218 foi passada a um sedimentador de célu- las compacto de 12 litros 208 da presente invenção através de uma segunda bomba 214 interconectada à linha 212.O efluente do sedi- mentador de células compacto 208, que continha células mortas me- nores, foi evacuado pela linha de efluentes 210. As células vivas maio- res foram recicladas do sedimentador de células 208 de volta ao bior- reator 218 através da terceira bomba 216 e da linha de retorno 217. Os níveis dos meios e de cultura de células no biorreator 218 foram controlados ao remover o excesso da cultura de células através da quarta bomba 220 e da linha da remoção 222 para ser capturado ou descartado.
[0204] Os resultados obtidos com este biorreator de perfusão con- figurado com um sedimentador de células compacto da presente in- venção são mostrados na Figura 25. Os círculos mostram a densidade óptica de amostras do biorreator, medida a 600 nm, formada durante o período inicial de cultura de batelada e de batelada alimentada de cer- ca de 150 horas, seguida pela operação de perfusão contínua de até
1.600 horas ou mais do que 2 meses. A taxa de efluente ou de colheita do sedimentador é ajustada ao manipular o ajuste da bomba de entra- da do sedimentador e/ou o ajuste da bomba de reciclagem do sedi- mentador. A concentração de células (tal como medida pelo OD a 600 nm) e a distribuição de tamanho são determinadas pela vazão da co- lheita e pela distribuição de tamanho de célula das células que entram no biorreator e outros fatores tais como a razão de reciclagem do se- dimentador. A corrente de efluente contém células muito pequenas, tal como medido pelos ODs muito baixos na faixa de O a 30, mesmo quando a taxa de perfusão é aumentada gradualmente de 2.000 ml/dia para mais de 6.000 ml/dia. Estes resultados demonstram que a densi- dade muito elevada de células foi obtida e mantida no biorreator devi- do à reciclagem da maior parte das células vivas de volta ao biorreator e à remoção seletiva de células mortas pequenas e resíduos de célu- las. Mesmo a essas taxas de perfusão crescentes, o biorreator pode ser operado indefinidamente a uma densidade elevada de células sem nenhuma razão para encerrar o biorreator, tais como as membranas obturadas em dispositivos de retenção de células à base de membra- nas competitivos.
[0205] As amostras do biorreator e o efluente do sedimentador fo- ram analisadas ao mesmo tempo com um analisador de tamanho de partícula. Os resultados normalizados da distribuição de tamanho de célula mostrados na Figura 26 indicam claramente que o efluente do sedimentador contém uma distribuição de tamanho de célula significa- tivamente menor em comparação àquela encontrada para as células no biorreator. Estes resultados demonstram que o sedimentador re- moveu as células mortas menores e todos os resíduos de células de preferência no efluente, ao passo que as células vivas maiores são de preferência retornadas ao biorreator. Desse modo, o biorreator é lim- pado continuamente pela remoção seletiva de células mortas e resí- duos de células pelo efluente do sedimentador e consequentemente não há nenhuma acumulação de células mortas e resíduos de células dentro do biorreator, tal como acontece rotineiramente com todos os outros dispositivos de retenção de células.
[0206] As amostras de efluentes do biorreator e do sedimentador de um ponto adiantado no tempo durante a cultura de perfusão foram coletadas e centrifugadas em frascos pequenos de 2 ml. As células empelotadas do efluente do dispositivo de sedimentação 208 e as cé- lulas empelotadas dentro do biorreator 218 mostraram que as células empelotadas do biorreator ocupam quase 50% do volume de células compactadas úmidas no frasco, ao passo que as células empelotadas no efluente do sedimentador ocupam somente cerca de 5% do volume de células compactadas úmidas. Estes resultados confirmam outra vez que somente uma fração muito pequena das células menores intactas do biorreator é removida no efluente do sedimentador ao passo que a maior parte das células intactas maiores são de preferência retornadas ao biorreator.
[0207] As concentrações de proteína total no efluente do biorreator e do sedimentador durante esta operação de perfusão de 2 meses de duração foram medidas e mostraram que após a operação inicial de batelada e de batelada alimentada, isto é, durante a operação de per- fusão prolongada, o teor de proteína total na amostra de efluente do dispositivo de sedimentação 208 é consistentemente maior do que o teor de proteína total na amostra do biorreator 218. Estes resultados sugerem muito intensamente que não há nenhuma peneiração de pro- teína dentro do sedimentador 208, tal como é observado geralmente com dispositivos de retenção de células à base de membranas tais como ATF em culturas de perfusão de células de mamíferos. Além disso, estes resultados sugerem que há alguma produção adicional de proteína no sedimentador 208, fazendo com que as concentrações de efluentes de proteínas sejam consistentemente mais elevadas do que aquelas no biorreator 218 ao mesmo tempo.
[0208] A proteína acumulada total na corrente da colheita da con- figuração de biorreator de perfusão contínua ilustrada na Figura 24 pode ser comparada com a proteína que pode ser colhida no sobrena- dante livre de células de um único biorreator de batelada alimentada 218 executado mais de 158 horas ou quase 6 dias, e repetido várias vezes pela mesma duração da cultura, digamos 1.600 horas. Embora as culturas de batelada alimentada tenham tipicamente um longo perí- odo de paralisação para colher ou esvaziar o biorreator, limpar as su-
perfícies internas, esterilizar in situ com vapor, resfriar, reencher o bior- reator com meio estéril, inocular o biorreator com células frescas e permitir então que as células cresçam até uma densidade de células alta o bastante para ver um aumento significativo no título da proteína, o biorreator de perfusão contínua continua a operar sem interrupção a uma densidade elevada de células e uma taxa elevada de produção durante toda a operação da cultura. Consequentemente, a proteína acumulada total na corrente de produto continuamente colhida está aumentando, a uma taxa significativamente mais rápida enquanto a taxa de perfusão é aumentada, e se acumula até 160 g, uma quanti- dade 5 vezes maior de proteína do que o que pode ser colhido nos so- brenadantes livres de células de 8 operações repetidas de cultura de batelada alimentada no mesmo biorreator de 5 litros. Exemplo 2 Remoção das células de levedura de cerveja
[0209] Em operações de fabricação de cerveja em larga escala, as células de levedura são removidas da cerveja produzida por dispositi- vos de filtração, que ficam regularmente obturados, ou dispositivos de centrifugação, que são dispositivos mecânicos de alta velocidade dis- pendiosos. Anteriormente, os hidrociclones foram testados em vão pa- ra esta aplicação (Yuan et al., 1996; Cilliers and Harrison, 1997). Estes dispositivos podem ser substituídos de imediato pelos dispositivos de sedimentação da presente invenção para clarificar a cerveja das saí- das superiores e para remover a suspensão concentrada de células de levedura das saídas inferiores. Devido ao tempo de residência aumen- tado e à sedimentação realçada nas zonas cônicas do sedimentador da presente invenção, o autor da presente invenção obteve uma sepa- ração bem-sucedida de células de levedura do líquido de cultura de células, colhendo o sobrenadante da cultura que contém somente cer- ca de 5% das células que entram no dispositivo de sedimentação em sua primeira operação. Uma vez que o dispositivo pode ser ampliado ou reduzido para aumentar ou diminuir a sua eficiência de separação de células, é possível obter a cerveja completamente livre de células da porta da colheita, caso desejado. Desse modo, os dispositivos da presente invenção podem ser particularmente úteis na fabricação de cerveja, bem como no clareamento da cerveja, e em arranjos de fer- mentação de cerveja contínuos. Exemplo 3 Clareamento ou remoção de células de caldo de cultura de célu- las de mamíferos
[0210] Similarmente ao exemplo acima, o clareamento de células de mamíferos do caldo de cultura de células no final de uma cultura do biorreator de batelada alimentada é uma primeira etapa necessária na colheita do produto secretado, tais como os anticorpos ou glicoproteí- nas terapêuticas, a ser seguido por uma série de outras operações de processamento a jusante. Atualmente, a centrifugação e a filtração em profundidade são usadas como operações unitárias comuns para re- mover as células de mamíferos e os resíduos de células do caldo de cultura de células. No entanto, a remoção periódica de células acumu- ladas do processo de centrifugação contínua resulta no aguaceiro re- petido das células no sobrenadante clarificado da cultura de células. Os dispositivos de sedimentação da presente invenção produzem um sobrenadante clarificado continuamente (livre de células ou significati- vamente esgotado de células) uma vez que as células de mamíferos são facilmente sedimentadas dentro do dispositivo. Estes dispositivos de sedimentação compactos oferecem uma remoção mais consistente das células do caldo de cultura de células, substituindo potencialmente a necessidade de qualquer centrifugação e reduzindo a quantidade de área da membrana necessária em uma operação de filtração em pro- fundidade secundária para eliminar completamente quaisquer células remanescentes e todos os resíduos de células. O clareamento pode ser em operações descontínuas ou em operações contínuas em bior- reatores de perfusão tal como descrito a seguir. Exemplo 4 Culturas de perfusão de células de mamíferos
[0211] A sedimentação realçada do hibridoma de murinho e das células de mamíferos recombinantes em sedimentadores inclinados já foi demonstrada com sucesso (Batt et al., 1990 e Searles et al., 1994) e ampliado em sedimentadores lamelares (Thompson e Wilson, Paten- te U.S. no. 5.817.505). Embora os sedimentadores lamelares sejam ampliados em três dimensões independentemente, um dispositivo de sedimentação cônico da presente invenção pode ser ampliado em três dimensões simultaneamente ao aumentar simplesmente o seu raio, tal como discutido acima. Desse modo, os sedimentadores da presente invenção são mais compactos, contêm superfícies muito mais inclina- das para a sedimentação em uma área útil de cobertura menor, e são dispositivos de retenção de células mais facilmente escalonáveis com aplicações provadas em culturas de células de mamíferos que secre- tam glicoproteínas, tais como anticorpos monoclonais, e outras proteí- nas terapêuticas. A saída de colheita clarificada da porta superior que contém a proteína secretada é colhida continuamente do dispositivo de retenção de células, ao passo que as células concentradas das saídas inferiores são recicladas de volta ao biorreator, o que resulta em um biorreator de perfusão de elevada densidade de células, o qual pode ser operado indefinidamente (por vários meses de operação de perfu- são contínua). A colheita de título elevado contínua de um único bior- reator de perfusão de elevada densidade de células de 1.000 litros po- de ser maior do que a produção acumulada de um biorreator de bate- lada alimentada grande (> 20.000 litros) em uma base anual.
[0212] As células de ovário de hamster chinês recombinantes, que são usadas geralmente na superexpressão e na secreção de glicopro- teínas terapêuticas, são cultivadas em um biorreator controlado de 1 litro unido com um sedimentador de células de 4" compacto tal como mostrado esquematicamente na Figura 24. As densidades de células viáveis no biorreator, no efluente superior do sedimentador, e no retor- no do fundo do sedimentador ao biorreator foram medidas. Logo de- pois que a operação de perfusão começa em 60 horas, muito poucas células vivas são removidas do efluente de cima do sedimentador e as quantidades crescentes de células viáveis vão sendo retornadas ao biorreator proveniente da saída do fundo do sedimentador. Conse- quentemente, a densidade de célula viável do biorreator (VCD) é au- mentada gradualmente depois que a operação de perfusão começa e mais drasticamente a porcentagem de viabilidade (losangos) no bior- reator aumenta quando a perfusão começa.
[0213] As distribuições de tamanhos de células foram medidas em amostras do biorreator e o efluente superior do sedimentador no dia 5 e um histograma dos tamanhos de células medidos por um Beckman- Coulter Multisize Analyzer para a amostra do biorreator mostra uma ampla distribuição de células vivas e possivelmente duplicatas nos ta- manhos que variam de cerca de 10 micra a cerca de 30 micra com um pico de cerca de 16 micra, um pico agudo de células mortas em tama- nhos entre 8 e 9 micra e cauda enorme de resíduos de células na faixa menor de tamanho menor do que 8 micra. Um outro histograma de tamanhos de células/partículas medidos pelo mesmo instrumento na amostra do efluente da porta superior do sedimentador de células compacto 208, mostrou um pico realçado de célula mortas em um ta- manho entre 8 e 9 micra, uma cauda de resíduos de células em tama- nhos menores do que 8 micra e drasticamente uma ausência total de qualquer pico para células vivas de cerca de 16 micra. Estas medições do tamanho demonstram intensamente que o efluente superior do se-
dimentador remove seletivamente as células mortas menores e os re- síduos de células do biorreator de perfusão 218, ao passo que as célu- las vivas maiores são retornadas continuamente ao biorreator de per- fusão (218. Esta remoção seletiva de células mortas menores e de re- síduos de células foi demonstrada (Batt et al. 1990 e Searles et al. 1994) com sedimentadores de placas inclinadas. A presente invenção de sedimentadores de células compactos reproduziu outra vez esses resultados sucessivos em um desenho mais compacto e mais facil- mente escalonável. Nenhum dos outros dispositivos de retenção de células atualmente disponíveis para células de mamíferos exibe tal se- letividade na remoção de apenas as células mortas menores e os re- síduos de células. Exemplo 5 Vacinas, vírus ou partículas do tipo vírus ou produção de vetor de terapia de gene
[0214] A produção das vacinas, tais como vírus ou partículas do tipo vírus (VLPs), ou de vetores de terapia de gene, tais como os vírus adeno-associados (AAV), lentivírus, etc., é normalmente realizada pela infecção e lise de células vivas de mamíferos ou de insetos em uma cultura de biorreator de batelada ou de batelada alimentada. Os vírus ou as partículas do tipo vírus são liberados da célula infectada em um processo lítico após uma grande produção intracelular desses vírus ou partículas do tipo vírus. Com a grande diferença no tamanho (escala de submícron ou de nanômetro) dessas partícula em comparação ao tamanho (cerca de 5 a 20 micra) de célula vivas de mamíferos e de insetos, a separação dos vírus ou das partículas do tipo vírus da cultu- ra do biorreator de batelada ou de batelada alimentada é muito sim- ples. Com o controle da taxa contínua de colheita ou de saída do caldo de cultura de células clarificado que contém principalmente vírus ou VLPs, junto com resíduos de células, também é possível reter um nú-
mero menor de partícula infectivas dentro do biorreator junto com as células vivas em crescimento para infectar e produzir continuamente vacinas em um biorreator de perfusão contínua unido a um dispositivo de sedimentação da presente invenção para a colheita contínua de vírus e VLPs. Exemplo 6 Separação e reciclagem de partículas de catalisador sólidas
[0215] A separação de uma partícula de catalisador sólida para reciclagem no reator e reutilização em outras reações químicas de fa- se líquida de catálise, tais como a síntese de Fischer-Tropsch, foi de- monstrada antes com sedimentadores lamelares (Patente U.S. no.
6.720.358, 2001). Muitas de tais reações químicas bifásicas, envol- vendo partículas de catalisador sólidas em reações de fase líquida ou gasosa, podem ser realçadas pelos dispositivos de sedimentação de partículas da presente invenção, a qual apresenta um dispositivo de separação de partículas mais compacto para realizar a mesma sepa- ração e reciclagem de sólidos que foi demonstrada com os sedimenta- dores lamelares. Exemplo 7 Colheita de células de plantas e algas
[0216] As culturas de células de plantas recombinantes que secre- tam produtos valiosos, embora ainda não sejam comercialmente viá- veis, contudo, constituem um outro campo de aplicações potenciais para os dispositivos de sedimentação da presente invenção. Os sedi- mentadores inclinados têm sido usados em várias aplicações de cultu- ra de células de plantas. Tais dispositivos podem ser substituídos pe- los dispositivos de sedimentação espirais cônicos mais compactos da presente invenção. Com o tamanho das células de plantas maiores do que aqueles da levedura ou de células de mamíferos, a eficiência da separação de células será maior com células de plantas simples ou culturas de tecidos de plantas.
[0217] Uma aplicação comercial mais imediata dos dispositivos de sedimentação da presente invenção pode ser na colheita de células de algas de lagoas de cultivo em larga escala para colher produtos de bi- odiesel do interior de células de algas. A massa de células de algas relativamente diluída (do tamanho de acre) em grandes lagoas rasas que convertem a energia solar em gordura intracelular ou armazena- gem de ácido graxo pode ser colhida facilmente através do dispositivo de sedimentação espiral cônico da presente invenção, e as células de algas concentradas podem ser colhidas da saída inferior. Exemplo 8 Tratamento de água residual municipal
[0218] As usinas de tratamento de água residual municipal em lar- ga escala (ao usar a lama ativada ou consórcios de múltiplas espécies bacterianas para a degradação de resíduo biológico e orgânico no es- goto ou na água residual) usam geralmente grandes tanques de sedi- mentação e versões mais modernas destas usinas usam sedimentado- res lamelares para remover a água clarificada da lama. Os dispositivos de sedimentação espirais cônicos da presente invenção podem ser ampliados até os tamanhos maiores requeridos nessas usinas, ao passo que continuam menores no tamanho do que os tanques de se- dimentação grandes ou os sedimentadores lamelares usados atual- mente nessas usinas de tratamento. Exemplo 9 Clareamento da água do processo industrial
[0219] As usinas de tratamento de água em larga escala, que lim- pam tanto a água residual industrial quanto as fontes naturais da água túrbida que contém sólidos suspensos, usam tanques de sedimenta- ção em larga escala ou sedimentadores inclinados lamelares. Esses dispositivos em larga escala podem ser agora substituídos pelos dis-
positivos de sedimentação espirais cônicos mais compactos da pre- sente invenção para atingir o mesmo objetivo de clarear a água para reuso industrial ou fornecimento municipal de água potável. Exemplo 10 Captura e purificação de anticorpos monoclonais em grânulos revestidos com proteína À
[0220] Os sobrenadantes de culturas de células que contêm anti- corpos monoclonais podem ser contatados com microesferas ou grâ- nulos revestidos de proteína A (40 a 200 micra) dentro do presente sedimentador através de duas entradas diferentes, por exemplo, os grânulos que entram provenientes de uma entrada superior e o sobre- nadante de culturas de células que entra através da porta inferior para maximizar a sua eficiência no contato e na captura. A captura de anti- corpos monoclonais em grânulos de proteína A é muito rápida, tipica- mente sob um tempo de residência de 10 minutos dentro das colunas de cromatografia de afinidade competitivas. Os grânulos microesféri- cos revestidos com proteína A irão sedimentar rapidamente e podem ser mantidos em suspensão e bem misturados para contatar com o sobrenadante de cultura de células mediante o seu bombeamento da entrada inferior. Os sobrenadantes de culturas de células esgotados podem ser removidos continuamente da saída superior dos sedimen- tadores de células da presente invenção em uma operação de carre- gamento de batelada. Todos os grânulos arrastados com o líquido que flui para cima irão sedimentar nas superfícies inclinada e irão retornar à região agitada inferior. Depois que o carregamento chega perto da capacidade de ligação máxima dos grânulos da adição, os grânulos podem ser lavados com a solução de lavagem típica a um volume de cerca de 3 a 5 vezes do sedimentador para remover a proteína de cé- lula hospedeira não ligada junto com os resíduos de células mortas que estão presentes no sobrenadante através da saída superior.
[0221] Depois de ter terminado a lavagem completa, os meios de eluição serão bombeados lentamente para remover os anticorpos liga- dos no meio líquido e a solução concentrada de anticorpo é removida através da porta superior, enquanto os grânulos são retidos dentro do sedimentador. Depois que a eluição é terminada, o equilíbrio dos grâ- nulos é efetuado por meio de bombeamento na solução de equilíbrio a partir da entrada inferior, ao passo que os grânulos são mantidos em suspensão por esta solução de entrada. Após o equilíbrio, a batelada seguinte de sobrenadante de cultura de célula é carregada no sedi- mentador para repetir o processo de quatro etapas acima, similar à sequência usada em uma coluna de cromatografia. Algumas vanta- gens do uso dos dispositivos de sedimentação de células da presente invenção para a captura de anticorpos monoclonais são que: (i) o so- brenadante de cultura de célula pode ser diretamente carregado para entrar em contato com os grânulos de proteína A, sem a necessidade de remover as células mortas ou os resíduos de células geralmente presentes no sobrenadante; e (ii) o contato imediato mais eficiente de todos os grânulos suspensos no sobrenadante de entrada, ao invés da exposição gradual ou retardada de anticorpos monoclonais ao leito fixo dos grânulos nas partes posteriores da coluna. A eliminação de opera- ções unitárias atualmente requeridas de centrifugação e/ou filtração em profundidade para remover as células mortas e os resíduos de cé- lulas irá resultar em economias de custo significativas, quando a cro- matografia de coluna da afinidade é substituída pela captura de afini- dade dos anticorpos por grânulos de proteína A suspensos dentro dos dispositivos de sedimentação das modalidades da presente invenção.
[0222] Esta captura de afinidade do produto de anticorpo secreta- do pelos grânulos revestidos com proteína A, seguida pelas etapas de lavagem, eluição e regeneração, pode ser realizada em uma sequên- cia de operações de batelada em um único sedimentador ou continu-
amente em uma sequência de sedimentadores. Em operação, os grâ- nulos de proteína A irão fluir de um sedimentador ao sedimentador se- guinte em uma operação verdadeiramente em contracorrente ou de fluxo cruzado com o caldo de cultura de células ou tampões diferentes em cada sedimentador das modalidades da presente invenção. Exemplo 11 Decantador/sedimentador de célula para a extração in situ de produtos orgânicos secretados de células
[0223] A produção e a secreção de vários compostos de fragrância e de sabor estão sendo projetados metabolicamente em células de levedura microbianas, tais como Saccharomyces cerevisiae. Alguns destes compostos podem ser mais tóxicos às células e podem ser ex- traídos de imediato em um líquido orgânico para reduzir a toxicidade celular, bem como aumentar a produtividade das células de levedura. As emulsões de líquido orgânico que contêm o produto secretado e a camada aquosa que contém as células microbianas secretadas produ- tivas do biorreator de tanque agitado podem ser bombeadas na porta de entrada de um dispositivo de sedimentação de células compacto da presente invenção. Dentro das zonas quietas do sedimentador, a emulsão é separada facilmente na camada orgânica que flutua no alto e é colhida através da porta superior e na camada aquosa que contém as células vivas e produtivas que sedimentam no fundo e são recicla- das ao biorreator através da porta inferior. Todos os resíduos celulares serão fracionados na camada orgânica e removidos facilmente do topo do sedimentador. As células vivas e produtivas nas camadas aquosas são retornadas ao biorreator para aumentar as densidades da célula e a produtividade dentro do biorreator de perfusão. Exemplo 12 Expansão in vitro de várias células de mamíferos, em um sedi- mentador de células compacto usado como um biorreator de per-
fusão autônomo
[0224] Atualmente, o campo da expansão in vitro de várias células de mamíferos tais como células tronco e células CAR-T está se ex- pandindo rapidamente com sacos de cultura descartáveis de um só uso estéreis como biorreatores colocados na plataforma de oscilação para misturação ou dentro de uma incubadora de CO, para o controle do pH. Tais biorreatores de saco são operados cada vez mais no mo- do de perfusão contínua para remover os subprodutos metabólicos residuais acumulados, tais como amônia e lactato, ao usar membranas de microfiltração como dispositivos de retenção de células no saco pa- ra manter a viabilidade elevada da célula durante a expansão. No en- tanto, durante a operação de perfusão prolongada, as células mortas e os resíduos de células se acumulam nestes sacos e não podem ser removidos através das membranas de microfiltração no saco. Os dis- positivos de sedimentação de células da presente invenção podem ser operados eficazmente como biorreatores aéreos autônomos operados em uma perfusão contínua para obter nutrientes frescos e para remo- ver os produtos residuais metabólicos, bem como para remover seleti- vamente todas as células mortas e os resíduos de células. A porta in- ferior pode ser usada como uma entrada para a mistura controlada de múltiplos gases CO, O2 e N2 para manter o pH e o OD desejados no biorreator. O ar que se eleva através da porção central arrasta ou car- rega um pouco do líquido de cultura de célula, propicia uma mistura- ção suave dos nutrientes no biorreator, e sai na saída superior, ao passo que líquido é desacoplado na porção cilíndrica do sedimentador e reciclado sobre os sedimentadores cônicos. O líquido de cultura de célula de retorno pode ser amostrado para medições contínuas do pH, OD, para entradas no computador controlando a mistura de gás de entrada e a amostragem ocasional para a densidade da célula e a via- bilidade tal como desejado. Após a expansão desejada da célula, as células vivas concentradas são coletadas através da porta inferior ao comutar o fluxo de gás para um saco de coleta de células. A vantagem principal do presente sedimentador de células/biorreator é que ele pro- vê uma remoção fácil de células mortas e resíduos de células junto com subprodutos residuais metabólicos tóxicos, o que resulta em uma densidade elevada de célula das células vivas depois da expansão in vitro para a terapia de célula autóloga. Exemplo 13 Separação contínua de proteínas terapêuticas precipitadas e con- centradas
[0225] Várias proteínas terapêuticas (por exemplo, glargina análo- ga da insulina e anticorpos monoclonais) podem ser precipitadas ao adicionar sais simples (por exemplo, cloreto de zinco para a glargina, ou sulfato de amônio para os anticorpos), ao ajustar o pH, e outros solventes (por exemplo, m-cresol ou outros fenólicos para a glargina e o etanol para os anticorpos). Esta precipitação é uma alternativa de baixo custo à cromatografia nos processos de purificação a jusante para estas proteínas terapêuticas. Atualmente, estas etapas de preci- pitação são realizadas no modo de batelada, seguida pela centrifuga- ção ou decantação para remover o sobrenadante do precipitante.
[0226] Ao usar os dispositivos de separação da presente invenção, um processo de separação contínuo pode ser executado. O meio de colheita rico em proteína (depois da remoção de quaisquer células por meio de microfiltração ou centrifugação ou outros métodos) é inserido em um sedimentador de células compacto da presente invenção, junto com outros produtos químicos requeridos, tais como solventes, ou sais em uma solução modificadora do pH, tais como NaOH ou HCl. O pro- cesso de precipitação irá ocorrer dentro do sedimentador e o precipi- tante rico em proteína pode ser continuamente removido na saída infe- rior, afastado do sobrenadante esgotado em proteína, o qual é removi-
do continuamente da saída superior. Exemplo 14 Expansão ex vivo de células estromais mesenquimais/tronco (MSCs) em grânulos de microcarreador e purificação de células tronco expandidas
[0227] As MSCs podem se expandir ex vivo na presença do meio apropriado de crescimento e são normalmente cultivadas unidas às superfícies, tais como frascos de cultura de tecidos, placas de petri, frascos de rolo, cubos de células e grânulos de microcarreador. O crescimento unido em grânulos de microcarreador (tamanho variando de 100 micra a 500 micra) é muito facilmente escalonável, uma vez que são suspensos em biorreatores sacudidos ou agitados, controla- dos quanto às condições ideais de crescimento tais como o pH, a tem- peratura, a concentração de oxigênio dissolvido e as concentrações de nutrientes. No entanto, a separação de células tronco expandidas dos microcarreadores é um desafio, requerendo o destacamento enzimáti- co, a remoção da enzima adicional por lavagem rapidamente, e a se- paração das células tronco dos grânulos de microcarreador. Estas etapas diferentes são experimentadas atualmente ao usar etapas de processamento descontínuo que consomem trabalho e são suscetíveis à contaminação. Cada uma destas etapas difíceis pode ser realizada mais facilmente nos biorreatores/dispositivos de sedimentação de cé- lulas da presente invenção que podem incluir as sondas de sensor po- sicionadas dentro do invólucro do ciclone. Em uma modalidade, as sondas de sensor compreendem sondas fluorescentes para medir um ou mais dentre o pH, o oxigênio dissolvido (OD), as concentrações de glicose, a temperatura e os níveis de CO, dentro do invólucro do ciclo- ne. Mais especificamente, dentro destes dispositivos de sedimentação: (i) o excesso de enzima é lavado muito facilmente ou removido através da porta superior mediante a alimentação no meio nutriente fresco através da porta inferior, ao passo que as células destacadas com se- dimentação mais lenta e os grânulos de microcarreador recentemente desnudados de sedimentação rápida são mantidos em circulação den- tro do sedimentador, (ii) os grânulos de microcarreador nus (100 a 500 micra) irão sedimentar muito mais rapidamente do que as células tron- co (10 a 20 micra) e podem ser removidos da porta inferior enquanto as células tronco são circuladas em suspensão, e (iii) finalmente as células tronco expandidas podem ser colhidas através da porta inferior à concentração desejada para aplicações subsequentes de terapia de células. Exemplo 15 Co-cultura de células estromais em grânulos de microcarreador para secretar os fatores de crescimento necessários para supor- tar a expansão in vitro ou o crescimento de outras células dife- renciadas, tais como T-linfócitos ou cardiomiócitos
[0228] O crescimento e a diferenciação de células tronco pluripo- tentes em cardiomiócitos ou linfócitos ativados (células CAR-T) reque- rem que fatores de crescimento dispendiosos sejam suplementados ao biorreator de crescimento. Este custo pode ser reduzido mediante a cocultura das células desejadas com as células tronco mesenquimais projetadas (MSCs) que secretam os fatores de crescimento desejados no meio de crescimento. Essas células que secretam o fator do cres- cimento suportam o crescimento de outras células desejadas, tais co- mo células CAR-T, cardiomiócitos, etc. Esta cocultura pode ser efetu- ada dentro dos dispositivos de combinação de biorreator/classificador de células da presente invenção, e o custo de produção ou de expan- são de tais células é reduzido de maneira significativa. As células ex- pandidas podem ser facilmente removidas da cocultura mediante a alimentação no meio fresco em uma vazão requerida para remover as células simples expandidas ou os agregados de células, enquanto mantém os grânulos de microcarreador maiores dentro do biorrea- tor/sedimentador de células. Exemplo 16 Fracionamento ou classificação de qualquer população de células mistas, tal como da medula óssea, em várias subpopulações dis- tintas com características desejáveis ou indesejáveis
[0229] Depois do carregamento de qualquer um dos biorreato- res/dispositivos de sedimentação de células da presente invenção com algum bolus inicial de uma população de células mistas (tais como cé- lulas da medula óssea), é possível alimentar o meio nutriente fresco a vazões crescentes lentas, por etapas, de maneira tal que as células menores (por exemplo, plaquetas, glóbulos vermelhos do sangue, etc.) saem através da corrente efluente superior às menores vazões, segui- das por tipos de células maiores (linfócitos, células mononucleares, etc.) a vazões cada vez mais elevadas, e então pelos tipos maiores de células (tais como macrófagos, megacariócitos, etc.) às maiores va- zões. Com o aumento da alimentação de nutriente e das vazões de efluente superiores a vazões de aumento lento por etapas, as popula- ções relativamente puras de um único tipo desejado de célula são ob- tidas ao deixar o biorreator dispositivo de classificação de células em um meio saudável do crescimento da cultura de células de modo que possam ser propagadas ainda mais para o uso subsequente. Exemplo 17 Produção in vitro de glóbulos vermelhos do sangue universais
[0230] Novos métodos de engenharia genética estão sendo de- senvolvidos para a diferenciação dirigida de células tronco hemato- poiéticas em linhagem de células eritroides. As células de proeri- troblasto, o primeiro estágio perpetrado na eritropoiese, são bastante grandes (12 a 20 micra), até três vezes maiores do que um eritrócito normal. Os normoblastos policromatofílicos, o estágio subsequente na linhagem de eritróides, são menores (12 a 15 micra) do que as células de proeritroblastos. As células de normoblastos ortocromatofílicas, as células de precursores de eritroides nucleadas, são ainda menores (8 a 12 micra), seguidas pelas células vermelhas do sangue enucleadas maduras menores. (Geiler, C., et al., International Journal of Stem Cells, 9:53-59). Com base nas capacidades de fracionamento de ta- manho dos biorreatores/dispositivos classificadores de células da pre- sente invenção, todas as células de precursores maiores são retidas, e somente as células vermelhas do sangue enucleadas maduras meno- res são removidas do efluente superior do dispositivo, ao passo que todas as células de precursores maiores se expandirem continuamen- te dentro do biorreator/dispositivo classificador de células. Exemplo 18 Produção de plaquetas em larga escala
[0231] A expansão ex de vivo de células megacariocíticas de ele- vada ploidia em condições de cultura do biorreator controladas e o seu seccionamento em células de plaquetas menores é cada vez mais compreendida em um nível fundamental (Panuganti, S., et al., Tissue Engineering Part A, 19:998-1014). À medida que este entendimento se desenvolve ainda mais, estes parâmetros de cultura necessários po- dem ser obtidos e controlados dentro desses biorreatores/dispositivos de células para o crescimento e a diferenciação de células megacario- cíticas, enquanto colhe somente as plaquetas menores seccionadas maduras através da saída superior do sedimentador.
[0232] Para fornecer antecedentes adicionais, contexto, e ainda para preencher os requisitos da descrição redigida do 35 U.S.C. $ 112, as referências a seguir são incorporadas a título de referência no pre- sente documento em suas totalidades: Patente U.S. 5.624.580, Publi- cação de Pedido de Patente U.S. 2009/159523, Publicação de Pedido de Patente U.S. 2011/097800, Publicação de Pedido de Patente U.S.
2012/180662, Publicação de Pedido de Patente U.S. 2014/011270.
[0233] Os exemplos acima da presente invenção foram apresen- tados para finalidades de ilustração e descrição. Estes exemplos não se prestam a limitar a invenção à forma descrita no presente documen- to. Consequentemente, as variações e as modificações comensuráveis com os ensinamentos da descrição da invenção, e a habilidade ou o conhecimento da técnica relevante, estão dentro do âmbito da presen- te invenção. As modalidades específicas descritas nos exemplos for- necidos no presente documento se prestam a explicar ainda mais o melhor modo conhecido para a prática da invenção e permitir que ou- tros elementos versados no estado da técnica utilizem a invenção em tais, ou outras, modalidades e com as várias modificações requeridas pelas aplicações ou usos particulares da presente invenção. Pretende- se que as reivindicações anexas sejam interpretadas como incluindo modalidades alternativas até a extensão permitida pela técnica anteri- or.

Claims (23)

REIVINDICAÇÕES
1. Dispositivo de sedimentação, caracterizado pelo fato de que compreende: uma porção cônica superior com pelo menos uma porta; uma porção cilíndrica; uma porção cônica inferior com pelo menos uma porta; e uma pilha de cones localizados dentro do dispositivo de se- dimentação, em que cada cone da pilha de cones inclui uma abertura pequena e uma abertura grande, com a abertura pequena orientada para uma dentre a porção cônica superior e a abertura cônica inferior, e a pilha de cones geralmente centrada em torno de um eixo longitudi- nal do dispositivo de sedimentação.
2. Dispositivo de sedimentação, de acordo com a reivindi- cação 1, caracterizado pelo fato de que pelo menos um cone da pilha de cones é composto de um metal, plástico e vidro.
3. Dispositivo de sedimentação, de acordo com a reivindi- cação 1, caracterizado pelo fato de que o invólucro superior ainda compreende um primeiro flange configurado para acoplar um segundo flange do invólucro inferior.
4. Dispositivo de sedimentação, de acordo com a reivindi- cação 1, caracterizado pelo fato de que uma superfície de um cone da primeira pilha de cones fica a um ângulo entre cerca de 25 graus e cerca de 85 graus em relação ao eixo longitudinal.
5. Dispositivo de sedimentação, de acordo com a reivindi- cação 1, caracterizado pelo fato de que as primeiras e segundas por- ções cônicas são côncavas para dentro rumo ao eixo longitudinal.
6. Dispositivo de sedimentação, de acordo com a reivindi- cação 6, caracterizado pelo fato de que uma seção transversal longi- tudinal de um corpo de um cone forma uma linha com um formato ar- queado.
7. Dispositivo de sedimentação, de acordo com a reivindi- cação 1, caracterizado pelo fato de que a primeira porção cônica é côncava para dentro rumo ao eixo longitudinal e a segunda porção cô- nica côncava para fora se afastando do eixo longitudinal.
8. Dispositivo de sedimentação, de acordo com a reivindi- cação 7, caracterizado pelo fato de que ainda compreende uma se- gunda pilha de cones localizados dentro do dispositivo de sedimenta- ção, em que cada cone da segunda pilha de cones inclui uma abertura pequena orientada afastada da primeira porção cônica e uma abertura grande orientada para a primeira porção cônica.
9. Dispositivo de sedimentação, de acordo com a reivindi- cação 8, caracterizado pelo fato de que os cones da segunda pilha de cones têm os corpos que são côncavos para fora se afastando do eixo longitudinal.
10. Dispositivo de sedimentação, de acordo com a reivindi- cação 1, caracterizado pelo fato de que ainda compreende um sensor para medir uma condição dentro do dispositivo de sedimentação.
11. Dispositivo de sedimentação, de acordo com a reivindi- cação 10, caracterizado pelo fato de que o sensor compreende uma sonda fluorescente; e em que uma de: pelo menos uma porção da segunda porção cônica próxima ao sensor é transparente ou translúcida; e a segunda porção cônica é transparente ou translúcida.
12. Dispositivo de sedimentação, de acordo com a reivindi- cação 10, caracterizado pelo fato de que o sensor é operável para medir pelo menos um dentre o pH, o oxigênio dissolvido (OD), a glico- se, a temperatura e o CO, dissolvido (pCO;>).
13. Método de sedimentação de partículas em uma sus- pensão, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) a introdução de uma suspensão líquida de partícula em um dispositivo de sedimentação que inclui: um invólucro superior com uma primeira porção cônica, uma primeira porção cilíndrica e pelo menos uma porta; um invólucro inferior interconectável ao invólucro superior e incluindo uma segunda porção cônica, uma segunda porção cilíndrica e pelo menos uma porta; e uma pilha de cones localizados dentro do dispositivo de se- dimentação, em que cada cone da pilha de cones inclui uma abertura pequena orientada para a primeira porção cônica e dotada de corpos que são côncavos para dentro rumo a um eixo longitudinal do disposi- tivo de sedimentação; (b) a coleta de um líquido clarificado de pelo menos uma porta do invólucro superior; e (c) a coleta de uma suspensão líquida concentrada de pelo menos uma porta do invólucro inferior.
14. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracteriza- do pelo fato de que a suspensão líquida compreende pelo menos um dentre uma suspensão de células recombinantes, uma fermentação alcoólica, uma suspensão de partículas de catalisador sólidas, uma água residual municipal, água residual industrial, células de mamífe- ros, células de bactérias, células de leveduras, células de plantas, cé- lulas de algas, células vegetais, células de hibridoma de mamíferos e/ou murinos, células tronco, células CAR-T, células vermelhas do sangue precursoras e maduras, cardiomiócitos ou outras células sus- cetíveis a ligação em grânulos de microcarreador, levedura na cerveja, e células eucariópticas.
15. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracteriza- do pelo fato de que a suspensão líquida compreende pelo menos um de: (a) células microbianas recombinantes selecionadas de pe-
lo menos um de Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, Kluyve- romyces lactis, Aspergillus niger, Escherichia coli, Bacillus subtilis, e outras células microbianas; e (b) partículas não celulares tais como um ou mais de grânu- los de microcarreador para o crescimento de células tronco unidas, um grânulo ou resina microesférico revestido com ligante de afinidade, e grânulos microesféricos ativados na superfície.
16. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracteriza- do pelo fato de que a introdução de uma suspensão líquida compreen- de o direcionamento da suspensão líquida de um saco de biorreator descartável de plástico para o dispositivo de sedimentação.
17. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracteriza- do pelo fato de que o líquido clarificado coletado compreende pelo menos um dentre moléculas biológicas, compostos orgânicos ou inor- gânicos, reagentes químicos e produtos de reação química.
18. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracteriza- do pelo fato de que o líquido clarificado coletado compreende pelo menos um dentre hidrocarbonetos, polipeptídeos, proteínas, álcoois, ácidos graxos, hormônios, carboidratos, anticorpos, glicoproteínas, terpenos, isoprenoides, poliprenoides, compostos de fragrância e de sabor, e cerveja.
19. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracteriza- do pelo fato de que o líquido clarificado coletado compreende pelo menos um dentre o biodiesel, a insulina ou seus análogos, brazeína, anticorpos, fatores de crescimento, fatores estimuladores de colônia, e eritropoietina (EPO).
20. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracteriza- do pelo fato de que compreende ainda a introdução de um fluido a uma camisa de fluido associada com pelo menos um dentre o invólu- cro superior e o invólucro inferior.
21. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracteriza- do pelo fato de que ainda compreende a coleta dos dados de um sen- sor posicionado dentro do dispositivo de sedimentação, em que o sen- sor é operável para medida pelo menos um dentre o pH, a glicose, a temperatura e o pCO,».
22. Método, de acordo com a reivindicação 21, caracteriza- do pelo fato de que ainda compreende o uso dos dados recebidos do sensor para ajustar um ou mais dentre o pH, a temperatura, a concen- tração de oxigênio dissolvido, o dióxido de carbono dissolvido, e con- centrações de nutrientes dentro do dispositivo de sedimentação.
23. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracteriza- do pelo fato de que compreende ainda o posicionamento de uma se- gunda pilha de cones dentro do dispositivo de sedimentação, em que os cones da segunda pilha de cones têm os corpos que são côncavos para fora se afastando do eixo longitudinal do dispositivo de sedimen- tação.
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