CN112020385A - 颗粒沉降装置 - Google Patents

Abstract

一种在众多领域中具有应用的用于从散装流体中分离颗粒的沉降装置。颗粒沉降装置包括具有向上或向下定向的小开口的圆锥体的第一堆叠体。任选地，所述沉降装置可包括具有向下或向上定向的小开口的圆锥体的第二堆叠体。所述圆锥体可以是凹入的或凸出的。这些装置可用于从散装流体中分离小的(毫米或微米尺寸的)颗粒，其在众多领域中具有应用，例如生物(微生物、哺乳动物、植物、昆虫或藻类)细胞培养，从液体或气体中分离固体催化剂颗粒以及废水处理。

Description

颗粒沉降装置

相关申请的交叉引用

本申请依据35U.S.C.§119(e)要求2018年4月18日提交的美国临时专利申请序列No.62/659,295的优先权权益，并且涉及2017年5月4日提交的美国专利申请No.15/586,902，所述申请是2017年1月5日提交的美国专利申请No.15/324,062的部分延续案，以及涉及国际申请日为2015年12月1日并指定为美国的PCT申请No.PCT/US2015/063195。本申请还涉及2016年5月6日提交的美国临时专利申请No.62/332,546和2017年2月15日提交的美国临时专利申请No.62/459,509。美国专利申请No.15/324,062是依据35U.S.C.371的PCT申请No.PCT/US2015/039723的国家阶段申请，所述PCT申请的国际申请日为2015年7月9日，其指定为美国，所述PCT申请要求2014年7月9日提交的美国临时专利申请No.62/022,276的权益，并且涉及2014年8月14日提交的美国临时专利申请No.62/037,513。PCT申请No.PCT/US2015/063195要求2014年12月1日提交的美国临时专利申请No.62/086,122的权益。所有这些申请都通过引用整体并入本文。

技术领域

本公开提供了在多层倾斜表面上具有增强的沉降的细胞或颗粒沉降装置。本公开的装置在众多领域中具有应用，包括：(i)分泌多肽、激素、蛋白质或糖蛋白的高细胞密度生物学(哺乳动物、微生物、植物或藻类)细胞培养，疫苗或疫苗样颗粒，或其它小型化学产品如乙醇、异丁醇、类异戊二烯、调味剂和香料化合物等；(ii)分离和回收在围绕固体颗粒的液相或气相中催化化学反应的多孔或无孔固体催化剂颗粒；(iii)从周围液相中分离并收集在物理转化(例如结晶、絮凝、团聚、沉淀等)中新形成的固体；(iv)在亲和配体例如固定在微球珠粒上的蛋白A上捕获和纯化分泌的蛋白，例如单克隆抗体等；(v)各种哺乳动物细胞的体外扩增，所述细胞例如人间充质干细胞，分化的人类细胞(例如心肌细胞或红细胞)，修饰的人类细胞(例如嵌合抗原受体转染的T淋巴细胞或CAR-T细胞等，用于自体或同种异体细胞疗法应用)；以及(vi)通过沉降和去除复杂的生物群落或活性污泥或其它固体颗粒，在大规模市政或商业废水处理厂中的澄清工艺用水。

背景技术

在所有上述用于沉降装置的应用领域中，最直接适用的公认领域是从重组微生物或哺乳动物细胞的悬浮液培养物中分泌的生物蛋白质、多肽或激素的生产。在重组哺乳动物和微生物细胞中生产生物蛋白质的最常见方法依赖于补料分批培养，其中细胞生长至高细胞密度，然后通常暴露于诱导培养基或诱导剂以触发蛋白质的产生。如果所需蛋白质从细胞中分泌出来，则从补料分批培养转为连续灌注培养更有利可图，这可以在更长的培养持续时间内保持高细胞密度和高生产率。在连续灌注培养期间，活细胞和生产性细胞被保留或再循环回生物反应器，同时从生物反应器中连续收集分泌的蛋白质用于下游纯化工艺。

与补料分批培养相比，连续灌注培养的一些关键优势是：(1)分泌的蛋白质产物被连续地从生物反应器中去除，而不会使这些产物经受从死细胞释放到培养基中的蛋白水解和/或糖酵解酶的潜在降解；(2)在连续灌注生物反应器中，活细胞和生产性细胞被保留或再循环回以达到高细胞密度，其中它们在受控的生物反应器环境中继续产生有价值的蛋白质，培养持续时间远远更长，而不是被杀死并在每次补料分批培养结束时从生物反应器中被去除；(3)与补料分批培养中营养物和废产物的浓度动态变化不同，通过连续添加新鲜营养培养基并去除废产物以及收获的蛋白质产物，可以将灌注生物反应器环境保持在更接近稳态的条件(从而通过设计保持更一致的产物质量)；以及(4)利用细胞保留装置的子集，可以在较小的死亡或垂死细胞裂解并释放其胞内酶之前，从灌注生物反应器中选择性地去除这些细胞，从而在收获时保持细胞的高存活率和分泌蛋白产物的高质量。

在哺乳动物细胞培养工业中已经开发了许多细胞保留装置，例如内部旋转过滤器装置(Himmelfarb等人,Science 164:555-557,1969)，外部过滤模块(Brennan等人,Biotechnol.Techniques,1(3):169-174,1987)，中空纤维模块(Knazek等人,Science,178:65-67,1972)，在旋风分离器中的重力沉降(Kitano等人,Appli.Microbiol.Biotechnol.24,282-286,1986)，倾斜沉降器(Batt等人,BiotechnologyProgress,6:458-464,1990)，连续离心(Johnson等人,Biotechnology Progress,12,855-864,1999)，和声学过滤(Gorenflo等人,Biotechnology Progress,19,30-36,2003)。发现旋风分离器无法产生足够的离心力，以致于无法在哺乳动物细胞培养实验中使用的装置尺寸和收获流量下进行足够的细胞分离(Kitano等人,1986)，并且在有效细胞分离所需的较高流量(和离心力)下哺乳动物细胞受到严重破坏(Elsayed等人,Eng.Life Sci.,6:347-354,2006)。尽管大多数其它装置充分保留来自收获物的所有哺乳动物细胞，但这些装置无法将死细胞与生物反应器中所需的活细胞分离。因此，死细胞保持在灌注生物反应器内部积聚，并且膜过滤器被堵塞，这需要终止连续灌注生物反应器，通常在哺乳动物细胞培养的三周或四周内。

在当今可用的所有细胞保留装置中，只有倾斜沉降器(Batt等人,1990,同上；以及Searles等人,Biotechnology Progress,10:198-206,1994)能够选择性地去除溢流或收获流中的较小的死细胞和细胞碎片，而较大的、活的和生产性的哺乳动物细胞则经由底流持续地再循环回灌注生物反应器。因此，在从倾斜沉降器顶部连续收获蛋白质产物的同时，以高活力和高细胞密度无限期地持续灌注生物反应器操作是可行的。

倾斜沉降器先前已按比例放大为多板或层状沉降器(Probstein,R.F.，美国专利No.4,151,084，1979年4月)，并广泛用于若干大规模工业过程例如废水处理、饮用水澄清、金属精整、采矿和催化剂回收(例如Odueyngbo等人,美国专利No.7,078,439，2006年7月)。

引用我们首次展示的单板倾斜沉降器(Batt等人,1990)来提高哺乳动物细胞培养应用中分泌蛋白的生产率，对于倾斜沉降器按比例放大用于杂交瘤细胞培养，多板或层状沉降器装置已取得专利(Thompson和Wilson,美国专利5,817,505，1998年10月)。这样的层状倾斜沉降器装置已被用于以高生物反应器生产率(由于高细胞密度)和高活力(>90％)在连续灌注生物反应器中培养重组哺乳动物细胞达长持续时间(例如数月，而无需终止灌注培养)。授予Kauling等的美国专利公开No.2011/0097800描述了倾斜沉降器的按比例放大版本，其使用以倾斜角缠绕的圆柱管。所述装置被描述为可用于培养较大的哺乳动物细胞，例如CHO、BHK、HEK、HKB、杂交瘤细胞、纤毛虫和昆虫细胞。

这些细胞保留装置均未证明可在较小的且因此更具挑战性的微生物细胞的灌注生物反应器培养中收获分泌的蛋白质产物。层状沉降器已经用酵母细胞进行了测试，以研究具有有限成功的细胞沉降(Bungay和Millspaugh,Biotechnology and Bioengineering,23:640-641,1984)。水力旋流器已经在酵母悬浮液中进行了测试，主要是从啤酒中分离酵母细胞，再次仅具有有限的成功(Yuan等人,Bioseparation,6:159-163,1996；Cilliers和Harrison,Chemical Engineering Journal,65:21-26,1997)。

提出了一种改进型旋风分离器，其在旋风分离器内部具有螺旋形垂直板，以提高废水处理中的分离效率(Boldyrev VV，DavydovEI，沉降槽，如俄罗斯专利No.2,182,508中所述)，并且已经描述了此布置的较早期描述用于倾析液体悬浮液中的固体(美国专利No.4,048,069，1977年9月)。俄罗斯专利No.2,182,508中公开的改进型旋风分离器包括容纳在具有圆锥形底部的垂直圆柱形筒中的螺旋形卷绕板。沿着中心废水入口管的整个高度设有狭缝，所述入口管在底部被堵塞，以便将废水从入口管引导到垂直的螺旋形卷绕板中。螺旋开始于中心管并终止于圆柱形壳体的壁，从而形成了一条通道，载有颗粒的废水流过该通道。颗粒沉降在螺旋形通道的垂直沉降柱中。沉降区的高度是螺旋板的垂直高度，并且通道的宽度由螺旋形卷绕板的壁形成，其在整个长度上保持恒定。用于去除净化水的管道安装在圆柱体的上部。用于去除沉积物的导管安装在圆锥形底部的底部。在操作中，废水通过中心管进入并通过狭缝或开口进入螺旋区。螺旋形通道用于增加流动路径，并因此增加液体在沉降器中的停留时间。螺旋还用于增加流体的接触(壁)面积。澄清时的主要驱动力是作用在悬浮液的颗粒上的重力，因为悬浮液围绕螺旋卷绕的垂直沉降塔运行。留在螺旋壁上或通道中的浆液落入沉降器的圆锥形底部，并定期从沉降器中除去。从接近顶部的圆柱形壳体的一侧上的管道中抽取净化水。

如俄罗斯专利文献中所述，当脏水经由中心管进入中心并通过狭缝进入螺旋形通道时，含废水的固体的流型与普通旋风分离器的典型流型相反，并且经由净化水管道从垂直圆柱体的外围或外部去除净化水。尚未提出或将这种改进的和反向流动的旋风分离器装置用于除废水处理以外的任何领域。

因此，需要一种可以在相对小的空间中利用作用在液体悬浮液中的颗粒上的离心力和重力的颗粒沉降装置。

发明内容

本公开提供了在布置在壳体内的多层倾斜表面上的沉降增强的细胞或颗粒沉降装置。壳体可以是旋风分离器壳体。本公开的颗粒分离装置可用于众多应用，并且代表了对现有技术分离装置的重大改进。在这些沉降装置中，倾斜表面可附接到多个垂直的圆柱形板。沉降装置可包括螺旋形的圆锥形表面，或者若干靠近连接到螺旋底部的成角度的圆锥形表面的倾斜板。大量的层状倾斜板提高了来自散装流体的颗粒在圆锥形组件内部向下或向上移动时的沉降效率，其中，液体体积从圆锥形或螺旋形沉降表面的外围逐渐移至沉降器装置的中心。

本公开的沉降器装置可包括壳体，该壳体包围位于壳体内部的一系列堆叠的圆锥体，其向下逐渐变细至中心开口，而没有垂直板。该实施方案的圆锥体通过在堆叠体中的连续圆锥体之间保持距离(或通道宽度)的支撑件而在堆叠体中彼此支撑。所述支撑件可包括三个或更多个附接到一个或多个圆锥体的上表面和/或下表面的突出部，以将连续的圆锥体以期望的距离(期望的通道宽度)间隔定位。任选地，支撑件可包括至少三个L形元件，该至少三个L形元件互连到每个圆锥体的表面，该表面远离所述圆锥体的截顶。L形元件包括第一侧面，该第一侧面在顶点处互连到第二侧面，并且互连到所述表面，使得第一侧面在圆锥体的堆叠体中支撑第二圆锥体。第二侧面基本上平行于圆锥体的表面。任选地，第二侧面可突出到圆锥体外，以使圆锥体与壳体的内表面间隔开。在一些实施方案中，没有塞子或其它障碍物来阻止液体或悬浮颗粒从堆叠的圆锥形表面流向中心开口。

本公开的沉降器装置可包括壳体，该壳体包围：

1)两个或更多个堆叠圆锥体的第一堆叠体，每个圆锥体都具有一个中心开口，和

2)两个或更多个堆叠圆锥体的任选的第二堆叠体，每个圆锥体都具有一个中心开口，在其底部处或底部附近与向下逐渐变细至壳体底部的中心开口的圆锥形表面接合。

堆叠的圆锥体(在两个或更多个堆叠圆锥体的第一堆叠体和任选的第二堆叠体中)包括至少三个突出部，该至少三个突出部将每个圆锥体支撑在堆叠体中的下一个连续圆锥体上方。突出部优选地以基本上恒定的距离安置并且形成为大致相等的尺寸，以将堆叠体中的每个连续的圆锥体保持在堆叠体中的所有圆锥体之间的大约相等间距。在一个实施方案中，对于每个圆锥体存在至少三个突出部以适当地支撑每个连续的圆锥体，但是根据需要，每个圆锥体可包括三个以上的突出部以充分地或适当地支撑圆锥体。例如，每个圆锥体可包括四个突出部，或者可包括八个突出部，以支撑堆叠体中的下一个连续的圆锥体。

突出部或“垂直支撑件”可代表对于沉降的颗粒或细胞沿着圆锥体的表面朝着中心开口或在壳体与圆锥体之间围绕壳体的内周的间隙向下滑动的障碍物。这些突出部附接到圆锥体的一个表面，但是这些突出部不需要附接到圆锥体的堆叠体中的另一圆锥体。因此，这些突出部不需要并且在大多数实施方案中不会将堆叠体中的两个或更多个圆锥体彼此附接。

在每个连续圆锥形表面之间优选存在由在圆锥体的堆叠体中支撑每个连续圆锥体的突出部所产生的基本上恒定的间距。连续的圆锥体之间的间距可在约1mm至约2.5cm之间变化。

对于其中颗粒沉降装置和其中的圆锥形表面需要定期或连续维护的分离应用，例如拆卸和清洁沉降器装置内的圆锥形沉降表面，由连续的圆锥体的堆叠体提供的沉降表面的这种布置是特别有用的，每个圆锥体由下一个连续的圆锥体支撑，但不是永久性地附接到下一个连续的圆锥体。

当散装流体移动通过沉降装置时，圆锥体的第一堆叠体和任选的第二堆叠体的这种布置显著增强了来自散装流体的颗粒的沉降效率。随着包括例如细胞的颗粒的散装液体移动通过本公开的沉降器装置的堆叠圆锥体，较大的颗粒(例如，活细胞和生产性细胞)沉降在圆锥体的表面上。沿着上部圆锥体或圆锥体的第一堆叠体向下滑动的细胞，沿圆锥形表面向下滑动到圆锥体的外边缘，并且向下垂直落入壳体的圆锥形区段中。另外，沿着下部圆锥体或圆锥体的第二堆叠体向下滑动的细胞，沿圆锥形表面向下滑动到圆锥体的中心开口，并且朝着壳体的中心开口垂直地落下。

因为与以前的沉降装置更典型的一维或二维按比例缩放相比，分离表面在三个维度上将体积按比例放大或缩小，因此这些装置可以按比例放大或缩小以适应不同行业或应用或尺寸的分离需求。

本公开的装置的按比例放大可简单地通过增加壳体的直径(并且相应地增加堆叠在内部的圆锥体的直径)和/或增加壳体的高度(这增加了圆锥体的第一堆叠体和圆锥体的第二堆叠体中的一者或两者中的圆锥体数量)来执行。细胞沉降的有效投影面积与壳体直径的平方成比例地增加，并与内部圆柱体的高度成比例地增加。本公开的紧凑型沉降装置的有效沉降面积与壳体直径的立方成比例地放大(假设内部沉降器的高度也成比例地增大)或等效地与壳体的体积成比例地放大。与先前的倾斜沉降器装置相比，有效沉降面积的这种三维或体积按比例放大使得本公开的沉降装置更加紧凑。

在不同的圆柱体或圆锥体之间的环形区域中的径向间距可以在约1cm至约10cm之间，最佳为约2.5cm左右。倾斜的沉降圆锥体与下一个连续圆锥体的内表面之间的小间隙为约1mm，这为沉降颗粒(例如细胞)沿圆锥体表面向下滑动并在侧面上离开圆锥体而不是一直向下滑动到圆锥形底部提供了有用的空间。离开侧面的细胞沿每个圆柱体的内部垂直沉降。当这些沉降细胞到达每个圆柱体底部的圆锥形表面时，它们在圆锥体的倾斜表面上向下滑动，到达旋风分离器壳体底部的中心开口。当沿着倾斜的圆锥形表面向下到达中心开口时增加流体速度的优点是，沿圆锥体向下滑动的增加数量的沉降细胞被向下扫掠到中心开口，而不是因更快的液体速度而积聚。

沉降表面的倾斜角可以是恒定的或可以不是恒定的，其范围在与垂直方向成约15度至约75度之间。为了用于更粘性的颗粒(通常是哺乳动物细胞)，倾斜角可能更接近于垂直方向(即与垂直方向成约15度)。为了用于非粘性固体催化剂颗粒，倾斜角可以进一步远离垂直方向(例如，与垂直方向成约75度)。在一些实施方案中，圆锥形表面具有弓形的纵向横截面，使得倾斜角相对于纵轴在约10度至约80度之间，或约15度至约75度之间变化。

本公开的所有沉降器装置可在壳体的与第一开口相对的端部处在壳体的至少一部分上包括封闭件或盖子。在所有这些实施方案中，封闭件或盖子还可包括用于去除液体或将液体输入到沉降器装置中的出口或端口。壳体和/或盖子中的开口和额外的端口或出口与壳体的外部和内部液体连通，以允许液体进入和/或离开沉降器装置的壳体，并且在这种开口或入口/出口的每个实例中，进出壳体的这些通道可包括阀或其它机构，其可以被打开或关闭以停止或限制液体流入或流出本公开的沉降器装置。

本公开的颗粒沉降装置可包括壳体和设置在壳体内部的至少一个垂直管，所述至少一个垂直管的一端与圆锥形表面接合，所述圆锥形表面逐渐减小至旋风分离器壳体中的第一开口。壳体中有至少一个与第一开口基本上相对的额外开口。

在一个实施方案中，圆锥形表面的倾斜角与垂直方向成约45度，或者可以在与垂直方向成约15度和与垂直方向成约75度之间变化。任选地，圆锥形表面和/或壳体的顶部或底部可具有凹入或凸出的形状，使得倾斜角在与垂直方向成约15度和与垂直方向成约75度之间变化。

在相邻的垂直管之间形成的环状环形通道的宽度在约1mm和约50mm之间。沉降器装置内的垂直管的数量可在约2个至约30个之间。

沉降器装置可在壳体的与第一开口相对的端部处在壳体的至少一部分上包括封闭件。壳体中的至少一个额外的开口可被配置为从壳体与至少一个垂直管相切的一侧，并与壳体的外部和内部液体连通的开口。

可在封闭件中形成液体收获出口，该液体收获出口与壳体的外部和内部液体连通。

本公开的另一方面是一种颗粒沉降装置，所述颗粒沉降装置可包括但不限于壳体，所述壳体包括以下中的一者或多者：(1)第一圆锥形部分；(2)第二圆锥形部分；(3)位于第一圆锥形部分与第二圆锥形部分之间的圆柱形部分；(4)至少一个用于将液体引入壳体的入口；(5)第一出口端口；(6)第二出口端口；以及(7)位于壳体内的圆锥体的第一堆叠体。在一个实施方案中，第一出口端口与第一圆锥形部分相关联，并且第二出口端口与第二圆锥形部分相关联。任选地，引入到壳体中的液体可以是包括颗粒的液体悬浮液。颗粒可具有多种尺寸。

在一个实施方案中，第一出口端口可用于收获澄清的液体。所述澄清的液体可包括颗粒的第一子集。所述颗粒的第一子集可包括细胞碎片、死细胞等。任选地，第一出口端口可形成在壳体的封闭件中。第一出口端口与壳体的外部和内部液体连通。

任选地，在另一个实施方案中，第二出口端口可用于收获浓缩液体。所述浓缩液体可包括颗粒的第二子集，例如活细胞。通常，颗粒的第二子集的颗粒通常大于颗粒的第一子集的颗粒。颗粒的第二子集的每个颗粒通常具有比颗粒的第一子集的颗粒更大的质量。第二出口端口与壳体的外部和内部液体连通。

圆锥体的第一堆叠体占据第一圆锥形部分的至少一部分。任选地，圆锥体的第一堆叠体占据圆柱形部分的至少一部分。任选地，圆锥体的第一堆叠体中的一个或多个圆锥体包括朝着第一出口端口定向的截顶。另外地或可替代地，圆锥体的第一堆叠体中的至少一个圆锥体没有中心开口。在另一个实施方案中，圆锥体的第一堆叠体中的每个圆锥体包括朝着第二出口端口定向的开放基部。圆锥体的第一堆叠体中的圆锥体通常在壳体中居中，例如，圆锥体的第一堆叠体中的圆锥体可围绕由一个或多个圆锥体的截顶形成的基本上中心开口居中。

任选地，壳体还可包括圆锥体的第二堆叠体。所述圆锥体的第二堆叠体可占据第二圆锥形部分的至少一部分，并且可占据圆柱形部分的至少一部分。在一个实施方案中，圆锥体的第二堆叠体中的每个圆锥体都横向于圆锥体的第一堆叠体中的圆锥体。

任选地，圆锥体的第一堆叠体中的圆锥体表面的倾斜角可在与垂直方向成约15度至约75度之间变化。在一个实施方案中，圆锥体的表面是凸的或凹的，使得圆锥体表面的横截面限定弓形线。在另一个实施方案中，圆锥体的倾斜角可以恒定在与垂直方向成15度至75度之间的任何角度。在一个实施方案中，圆锥体的倾斜角为约45度。

在另一个实施方案中，圆锥体的第二堆叠体中的每个圆锥体包括朝着第二出口端口定向的截顶。圆锥体的第二堆叠体中的每个圆锥体还可包括朝着第一出口端口定向的开放基部。在一个实施方案中，圆锥体的第二堆叠体中的圆锥体通常在壳体中居中。在另一个实施方案中，圆锥体的第二堆叠体中的圆锥体围绕由一个或多个圆锥体的截顶形成的基本上中心开口大致居中。

在一个实施方案中，圆锥体的第二堆叠体中的圆锥体表面的倾斜角与垂直方向成约15度至约75度。圆锥体的第二堆叠体中的圆锥体的倾斜角可为约45度。

在一个实施方案中，圆锥体的第一堆叠体中的圆锥体具有基本上均一的间距。另外，圆锥体的第二堆叠体中的圆锥体可具有基本上均一的间距。在一个实施方案中，与圆锥体的第二堆叠体中的圆锥体相比，圆锥体的第一堆叠体中的圆锥体具有不同的间距。

至少一个入口被配置为与壳体的外部和内部液体连通的入口端口。所述至少一个入口可与壳体的第一圆锥形部分、第二圆锥形部分和圆柱形部分中的至少一者相关联。在一个实施方案中，至少一个入口的第一入口与壳体的圆柱形部分相关联。在另一个实施方案中，至少一个入口的第二入口与第一圆锥形部分和第二圆锥形部分中的一者相关联。在又一个实施方案中，第二入口与第二圆锥形部分相关联。在另一个实施方案中，至少一个入口被配置为互连到一次性生物反应器袋。所述一次性生物反应器袋可包括塑料材料。

本公开的颗粒沉降装置的配置可包括壳体，所述壳体包括：(a)第一圆锥形部分；(b)第二圆锥形部分；(c)位于所述第一圆锥形部分与所述第二圆锥形部分之间的圆柱形部分；(d)至少一个使液体悬浮液进入壳体的入口；(e)用于收获澄清的液体的第一出口端口；(f)用于排出浓缩液体悬浮液的第二出口端口；以及(g)位于壳体内的圆锥体的第一堆叠体。在该装置中，圆锥体的第一堆叠体可占据第一圆锥形部分的至少一部分，并且可占据圆柱形部分的至少一部分。圆锥体的第一堆叠体中的每个圆锥体包括(i)位于第二圆锥形部分远端的截顶，和(ii)靠近第二圆锥形部分定位的开放基部。任选地，第一堆叠体中的圆锥体通常围绕由圆锥体的第一堆叠体中的每个圆锥体中的截顶形成的基本上中心开口居中。

圆锥体的第一堆叠体中的圆锥体表面的倾斜角可在与垂直方向成约15度至约75度之间变化。例如，圆锥体表面的横截面限定弓形线。这些圆锥体可具有凸面或凹面。在其它实施方案中，圆锥体的倾斜角是恒定的，并且可为例如约45度。圆锥体的第一堆叠体中的圆锥体优选地具有基本上均一的间距。

圆锥体的第二堆叠体中的圆锥体表面的倾斜角可在与垂直方向成约15度至约75度之间变化。在另一个实施方案中，圆锥体的第二堆叠体中的圆锥体的倾斜角为约45度。

本公开的另一方面是一种颗粒沉降装置，所述颗粒沉降装置包括：(A)壳体；(B)至少两个设置在壳体内部的锥形板；(C)壳体中的第一开口；以及(D)壳体中的第二开口。在一个实施方案中，至少两个锥形板彼此堆叠。优选地，壳体包括约3个和约30个锥形板。至少两个锥形板可由基本上恒定的距离隔开。任选地，在至少两个锥形板的相邻表面之间形成的通道的宽度在约1mm至约50mm之间。三个或更多个支撑件可将每个锥形板保持在堆叠体中。

每个锥形板可包括靠近第一开口的截顶和位于第一开口远端的开放基部。锥形板通常可以在壳体中居中，并且布置在壳体内的基本上垂直位置。至少两个锥形板中的每个锥形板的表面的倾斜角可在与垂直方向成约15度至约75度之间变化。锥形板可相对于纵轴具有凹形。锥形板可相对于纵轴具有凸形。因此，锥形板的横截面可限定弓形线。在一个实施方案中，锥形板具有由至少一个曲率半径限定的形状。

在这些装置中，壳体包括圆柱形部分和圆锥形部分。第一开口可与圆锥形部分相关联。任选地，第二开口可与圆柱形部分相关联。第二开口可定位在圆柱形部分的侧壁中。第二开口可定位在与圆柱形部分的开口端相关联的盖子中。第二开口可位于圆锥形部分中。

本公开的另一方面是沉降装置，所述沉降装置包括但不限于：(1)上部壳体，其包括：第一圆锥形部分；第一圆柱形部分；以及至少一个端口；(2)下部壳体，其与所述上部壳体可互连，并且包括：第二圆锥形部分；第二圆柱形部分；以及至少一个端口；以及(3)位于沉降装置内的圆锥体的堆叠体，所述圆锥体的堆叠体中的每个圆锥体包括朝着第一圆锥形部分定向的小开口和朝着第二圆锥形部分定向的大开口，圆锥体的第一堆叠体通常围绕沉降装置的纵轴居中。任选地，上部壳体还包括第一凸缘，该第一凸缘被配置为与下部壳体的第二凸缘啮合。上部壳体可永久地连接到下部壳体。

在这些装置中，圆锥体的第一堆叠体中的圆锥体的表面相对于纵轴成大约15度至约85度之间的角度。任选地，第一圆锥形部分和第二圆锥形部分朝着纵轴向内凹入。在一个实施方案中，圆锥体的主体的纵向横截面形成具有弓形形状的线。

另外地或可替代地，第一圆锥形部分朝着纵轴向内凹入，并且第二圆锥形部分远离纵轴向外凹入。在一个实施方案中，沉降装置包括位于沉降装置内的圆锥体的第二堆叠体。在另一个实施方案中，圆锥体的第二堆叠体中的每个圆锥体包括远离第一圆锥形部分定向的小开口和朝着第一圆锥形部分定向的大开口。任选地，圆锥体的第二堆叠体中的圆锥体具有远离纵轴向外凹入的主体。

在本公开的任何沉降器装置中，所述装置的壳体和/或圆锥体和/或任何其它组件可由金属或塑料构成。所述塑料可以是聚丙烯、聚乙烯、聚碳酸酯、聚苯乙烯等中的一种或多种。在一个实施方案中，沉降装置完全由塑料形成。在另一个实施方案中，圆锥体的堆叠体中的至少一个圆锥体至少部分地由不锈钢构成。可对金属表面(尤其是不锈钢)进行电抛光以提供平滑的表面。类似地，在本公开的任何沉降器装置中，所述装置的壳体和/或圆锥体和/或任何其它组件可完全或部分地涂覆有一种或多种非粘性塑料，例如特氟隆(Teflon)或硅酮。

在本公开的任何沉降器装置中，壳体还可包括与第一圆锥形部分、第二圆锥形部分和/或圆柱形部分中的一者或多者相关联的流体护套。在一个实施方案中，流体护套与第二圆锥形部分和圆柱形部分相关联。流体护套可包括至少一个端口，以接收预定温度的流体。任选地，流体护套可包括第二端口，以从流体护套提取流体。可将水或其它流体引导到流体护套中，以将旋风分离器壳体及其所有内容物保持在期望的温度范围内。可在旋风分离器壳体的外壁中形成端口以到达护套。所述端口可用作入口或出口端口，以使冷却或加热流体通过护套循环。

在本公开的任何沉降器装置中，可定位一个或多个传感器以监测沉降器装置内部的物理状况。另外地或可替代地，可定位至少一个传感器以监测与本公开的沉降器装置互连的管线内的状况。管线可以是与沉降器装置的底部出口端口互连的返回管线。

可选择这些传感器以确定壳体或管线内的pH、溶解氧(DO)、葡萄糖、温度和CO₂(包括溶解的CO₂，称为部分CO₂)中的一者或多者。传感器可包括一个或多个与壳体或管线内的溶液接触的探针。所述探针可固定至沉降器装置或管线的内表面。在优选的实施方案中，至少一个传感器和/或探针位于沉降器装置的下部圆锥形部分内，并且可与侧端口和底端口中的一者或多者隔开。

这些探针可在不接触读取器的情况下传输数据。以这种方式，探针可测量沉降器装置和/或管线内的状况，并将数据传输到沉降器装置外部的读取器。一个或多个探针可以是荧光探针。pH、DO、葡萄糖、温度和pCO₂中的一者或多者可通过旋风分离器壳体内的探针进行测量。探针可固定至壳体的一部分。壳体的部分可以可操作以传输由荧光探针产生的光。如上所述，壳体的一部分可以是透明的或半透明的。读取器(或仪表)接收来自荧光探针的光。读取器还可包括收集由荧光探针传输的光的光纤。合适的探针和读取器可从各种供应商处获得，包括PreSens Precision Sensing GmbH。在另一种配置中，沉降器装置内的探针可通过网络连接将数据传输到沉降器装置外部的读取器。例如，探针可通过WiFi、蓝牙或任何其它无线通信方式与读取器进行通信。

在本公开的沉降器装置的操作中，来自这些传感器的数据可用于调节流体护套内的流体的温度。在另一个实施方案中，来自传感器的数据可用于调节颗粒沉降装置内的pH、温度、溶解氧浓度、溶解二氧化碳和营养物浓度中的一者或多者。

本公开的另一方面提供了使液体悬浮液中的颗粒或细胞沉降的方法。所述方法包括但不限于：(i)将颗粒的液体悬浮液引入本公开的颗粒沉降装置中；(ii)从沉降器装置的壳体中的第一开口收集颗粒；以及(iii)从沉降装置中的另一个开口收集液体。可从封闭件中的开口收集液体，该封闭件在壳体的与第一开口相对的端部处覆盖壳体的至少一部分。可从壳体中的至少一个额外的开口收集液体，所述开口被配置为从壳体的一侧开口。在这些方法中，将液体悬浮液引入沉降器装置中的步骤可包括将液体悬浮液从塑料生物反应器袋引导至颗粒沉降装置中。

本公开的相关方面提供了一种沉降在悬浮液中的颗粒的方法。所述方法包括以下中的一者或多者：(a)将颗粒的液体悬浮液引入沉降装置中，所述沉降装置包括：(i)上部壳体，其具有第一圆锥形部分、第一圆柱形部分和至少一个端口；(ii)下部壳体，其与所述上部壳体可互连，并包括第二圆锥形部分、第二圆柱形部分和至少一个端口；以及(iii)位于沉降装置内的圆锥体的堆叠体，所述圆锥体的堆叠体中的每个圆锥体包括朝着第一圆锥形部分定向的小开口，并具有朝着沉降装置的纵轴向内凹入的主体；(b)从上部壳体的至少一个端口收集澄清的液体；以及(c)从下部壳体的至少一个端口收集浓缩的液体悬浮液。

在这些方法中，澄清的液体可包括悬浮液的颗粒的第一子集。所述颗粒的第一子集可包括细胞碎片、死细胞等。

浓缩液体还可包括悬浮液的颗粒的第二子集，并且所述颗粒的第二子集可包括活细胞。颗粒的第二子集的颗粒可以大于颗粒的第一子集的颗粒。颗粒的第二子集的每个颗粒可具有比颗粒的第一子集的颗粒更大的质量。

在这些方法中，圆锥体的第二堆叠体可任选地定位在沉降装置内。形成圆锥体的第二堆叠体的这些圆锥体可具有远离沉降装置的纵轴向外凹入的主体。

在这些方法中的任何一种中，液体悬浮液可包括以下中的至少一者：重组细胞悬浮液，酒精发酵，沉淀蛋白质溶液，含有细胞的水性流体和含有由细胞产生的提取的有机产物的有机层的混合物，固体催化剂颗粒于含有大部分产物和消耗的反应物的液体混合物中的悬浮液，包被有蛋白A分子(其可以结合来自细胞培养肉汤的单克隆抗体)的微球悬浮液，微载体珠粒(珠粒上附接有生长的哺乳动物细胞)的悬浮液，市政废水和工业废水。在这些方法中，液体悬浮液可包括以下中的至少一者：哺乳动物细胞、细菌细胞、酵母细胞、植物细胞、藻类细胞、人类干细胞或分化的人类细胞和/或昆虫细胞。在这些方法中，液体悬浮液可包括以下中的至少一者：产生生物柴油的藻类细胞、重组哺乳动物和/或鼠类杂交瘤细胞、产生分泌的有机产物的代谢工程改造的酵母细胞和啤酒中的酵母。在这些方法中，液体悬浮液可包括选自巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、黑曲霉(Aspergillus niger)、大肠埃希氏菌(Escherichia coli)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的重组微生物细胞。

在这些方法中，从沉降器装置收集的液体可包括生物分子、有机或无机化合物、化学反应物和化学反应产物中的至少一者。在这些方法中，从沉降器装置收集的液体包括烃、多肽、蛋白质、醇、脂肪酸、激素、碳水化合物、抗体、抗体、萜烯、类异戊二烯、生物柴油、聚类戊二烯和啤酒中的至少一者。在这些方法中，从沉降器装置收集的液体包括以下中的至少一者：生物柴油组分、分泌的治疗性蛋白质或激素如胰岛素或其类似物、抗体、单克隆抗体、生长因子、亚单位疫苗、病毒、病毒样颗粒、集落刺激因子、促红细胞生成素(EPO)、分泌的调味剂或香料化合物，包括香叶醇、月桂烯、甜味剂蛋白巴西甜蛋白(brazzein)等。

在这些方法中，本公开的沉降器装置可用作用于体外扩增哺乳动物细胞(例如用于自体细胞疗法的干细胞和CAR-T细胞)的独立的灌注生物反应器。在本公开的沉降器装置的这些实例中，无血清或无动物蛋白的细胞培养基的入口可通过底端口和/或侧端口连续泵入沉降器/灌流生物反应器中。还可泵入O₂、CO₂和N₂的受控混合物，以控制沉降器/生物反应器内部的培养上清液的pH和DO。在体外细胞扩增结束时，可从底端口收获在底部收集的浓缩沉降细胞。

前述内容是本公开内容的简化发明内容，旨在提供对本公开的沉降器装置的一些方面的理解。该发明内容不是本发明及其各个方面、实施方案和配置的广泛且详尽的概述。既不旨在标识本公开的关键或重要要素，也不旨在描绘本公开的范围，而是以简化的形式呈现本公开的所选概念，作为对下面呈现的更详细描述的介绍。将会理解，本公开的其它方面、实施方案和配置可以单独地或组合地利用上面阐述或下面详细描述的一个或多个特征是可能的。应当理解，单独或组合使用上面阐述或本文描述的一个或多个特征的其它实施方案是可能的。例如，可以预期的是，关于一个实施方案示出和/或描述的各种特征和装置可以与其它实施方案的特征或装置组合或替代，而不管是否在此具体示出或描述了这种组合或替代。根据具体实施方式，特别是当与附图结合在一起时，本发明的其它方面将变得更加显而易见。

附图说明

图1是本公开的另一配置的沉降器装置的前透视图；

图2是图1的沉降器装置的局部截面前透视图，示出了沉降器装置中的凸锥堆叠体；

图3是图2的沉降器装置的另一局部截面前透视图；

图4是图1的沉降器装置的分解前透视图；

图5A是图1的沉降器装置的壳体的透视图；

图5B是图5A的壳体的俯视图；

图5C是图5A的壳体的侧视图；

图6是图1的沉降器装置的俯视图；

图7是沿着图6的线7-7截取的沉降器装置的横截面正视图，为清楚起见，移除了圆锥体的堆叠体；

图8A是图7的一部分的详细横截面正视图；

图8B是图7的一部分的另一详细横截面正视图；

图9A是图1的沉降器装置的圆锥体的俯视图；

图9B是图1的沉降器装置的圆锥体的底视图；

图9C是图1的沉降器装置的圆锥体的侧视图；

图9D是沿着图9A的线9D-9D截取的沉降器装置的圆锥体的横截面侧视图；

图10是本公开的又一配置的沉降器装置的前透视图；

图11是图10的沉降器装置的局部截面正视图；

图12是图10的沉降器装置的另一局部截面前透视图，示出了沉降器装置内的圆锥体的上部堆叠体和圆锥体的下部堆叠体；

图13是图10的沉降器装置的下部壳体的局部横截面透视图，并且示出了圆锥体的下部堆叠体；

图14和图15是图10的沉降器装置的下部圆锥体的视图；

图16是本公开的另一种配置的沉降器装置的前透视图，其中所述沉降器装置的内部元件用假想线表示；

图17是图16的沉降器装置的横截面正视图；

图18是图16的沉降器装置的分解前透视图，示出了适于定位在沉降器装置内的任选的第二组圆锥体；

图19A和图19B是配置为用于图16的沉降器装置的本公开的一个实施方案的圆锥体的透视图；

图20A和图20B是用于本公开的沉降器装置的任选导管的透视图；

图21A和图21B是透视图，其总体上示出了配置为用于沉降器装置的本公开的实施方案的扩散器；

图22是本公开的一个实施方案的另一沉降器装置的前透视图，并且以假想线示出了沉降器装置的一些内部元件；

图23是图22的沉降器装置的横截面正视图；

图24是本公开的紧凑型细胞/颗粒沉降器装置与模块化生物反应器的连接的示意图；

图25是表示酵母巴斯德毕赤酵母细胞的灌注生物反应器培养结果的图，其中完全填充的紧凑型细胞沉降器作为细胞保留装置并按图24所示进行设置；以及

图26显示了从生物反应器采集的样品和来自如图24中所示的设备设置的沉降器流出物的粒度分析。

具体实施方式

术语“一”或“一个”实体是指一个或多个所述实体。因而，术语“一个”(“一个”)、“一个或多个”和“至少一个”在本文中可互换使用。术语“包含”、“包括”和“具有”可互换使用。

短语“至少一个”、“一个或多个”和“和/或”是在操作中具连系性和分离性两者的开放式表达。例如，表达“A、B和C中的至少一个”、“A、B或C中的至少一个”、“A、B和C中的一个或多个”、“A、B或C中的一个或多个”和“A、B和/或C”中的每一者是指单独的A，单独的B，单独的C，A和B一起，A和C一起，B和C一起，或A、B和C一起。

过渡性术语“包含”与“包括”、“含有”或“特征在于”同义，是包括性的或开放性的，并且不排除其它未叙述的要素或方法步骤。

过渡性短语“由……组成”不包括权利要求中未指定的任何要素、步骤或成分，但不排除与本公开内容无关的其它组分或步骤，例如通常与其相关的杂质。

过渡性短语“基本上由……组成”将权利要求的范围限制为指定的材料或步骤以及那些不会实质性影响所要求保护的发明的基本和新颖特征的材料或步骤。

现在参考图1，示出了用于沉降颗粒或细胞的本公开的沉降器装置300的配置。沉降器装置300通常包括上部壳体301A和下部壳体301B。在一个实施方案中，上部壳体301A和下部壳体301B基本上相同。因此，在一个实施方案中，壳体301A、301B通常是可互换的。

现在参考图2-9，壳体301A、301B通常包括圆锥形部分303A、303B，圆柱形部分308A、308B，第一端口353A、353B，和第二端口354A、354B。

任选地，第一端口353通常与壳体301的纵轴同心地对准。第一端口353可以用作入口以及出口。在实例性实施方案中，第二端口354延伸穿过圆锥形部分303。第二端口354还可以用于从沉降器装置300引入或去除液体、气体和固体。任选地，第二端口354可以大致平行于细胞沉降器装置的纵轴350对准。在实例性实施方案中，第二端口354可延伸穿过圆柱形部分308。可以构想第一端口353和第二端口354的其它配置。壳体301也可具有两个以上的端口。端口353、354被配置为互连到管线。

这样的管线可互连到本公开的任何紧凑型细胞沉降器装置。管线可以具有直径或以其它方式配置为互连到本公开的实施方案的任何端口。所述管线可任选地包括位于中空内部中的至少一个传感器。所述传感器可与管线内的流体和/或颗粒接触。任选地，传感器可布置在管线的内表面上，但是可以构想其它配置。传感器可以可操作以监测管线中的pH、DO、葡萄糖、温度和CO₂(包括溶解的或部分的CO₂)中的一者或多者。任选地，一个或多个传感器可包括荧光探针，该荧光探针发出的光根据探针感测的条件而变化。可以由读取器或仪表收集光。任选地，光可通过任选的光纤电缆收集并传输到仪表。该仪表可操作以报告或显示由荧光探针感测到的pH、DO、葡萄糖、温度和CO₂中的至少一者的水平。管线可包括透明或至少半透明的材料。因此，由传感器产生的光可穿过管线。可替代地，类似于窗口，管线的至少一部分是透明或半透明的。因此，由传感器产生的光可透射通过窗口部分并被仪表收集。

圆锥体309可定位在沉降器装置300内。如图2和图3所示，圆锥体309可布置成堆叠体，其中开放顶点342朝着上部壳体301A的第一端口353A定向，并且基部或大开口346朝着下部壳体301B的第一端口353A定向。在实例性实施方案中，在沉降器装置300内的堆叠体中布置有三至二十五个之间的圆锥体309。然而，当如图4所示组装沉降器装置300时，壳体301的尺寸可设置成容纳任意数量的圆锥体309。

沉降器装置300的元件，例如壳体301和圆锥体309，可以由单次使用的一次性塑料制成。可替代地，壳体301和圆锥体309中的一者或多者可以由金属如不锈钢合金或玻璃制成。圆锥体309的表面以及壳体301的内表面可完全或部分地涂覆有本领域技术人员已知的非粘性塑料、特氟隆、硅酮和类似材料中的一者或多者。另外地或可替代地，可对表面(尤其是当由不锈钢形成时)进行电抛光以提供平滑的表面。这些沉降器装置可以容易地缩放到任何所需的大小。

壳体301可任选地包括流体护套(未示出)。流体护套可以操作为使得水或其它流体可通过一个或多个端口被引导到流体护套中，以将沉降器装置300内的壳体301和内容物保持在期望的温度范围内。

现在参考图5A-5C，多个间隔件315可从壳体301的内表面向内突出。间隔件315被配置为防止位于沉降器装置300内的圆锥体309的堆叠体抵靠在壳体301A、301B的内表面上。任选地，间隔件315可以大致平行于沉降器装置300的纵轴350。可以构想间隔件315的其它配置。间隔件315具有基本上薄的横截面，以防止或最小化对沉降器装置300内的液体和悬浮颗粒的运动或流动的干扰。

现在参考图7，间隔件315可包括多个第一间隔件315A、第二间隔件315B和第三间隔件315C。如一般所示，在一个实施方案中，第一间隔件315A中的每一者沿着圆柱形部分308的内表面的至少一部分延伸。第二间隔件315B从圆锥形部分303的内表面延伸到圆柱形部分308附近。第三间隔件315C可以与第二间隔件315B隔开。具体来说，在一个实施方案中，第三间隔件315C被布置成比圆柱形部分303更接近第一端口353。

在一个实施方案中，上部壳体301A和下部壳体301B固定地接合。例如，上部壳体和下部壳体301可以被胶合、热焊接或超声焊接在一起。

可替代地，并再次参考图1，任选地，凸缘318可以从壳体301的大体上圆柱形部分308延伸。在实例性实施方案中，所述凸缘大致垂直于纵轴350延伸。任选的凸缘318A被配置为将上部壳体301A与下部壳体301B的凸缘318B互连。凸缘318A、318B可以任选地包括在图5A中最好地看到的突出部320。在实例性实施方案中，在每个突出部320的自由端形成锁扣或钩322。

至少一个突起324也可以形成在凸缘318上。突起324可具有大体上圆柱形的形状。突起324适于容纳在另一凸缘的相应凹座326中。另外地或可替代地，凸缘318可包括适于对准上部壳体301A和下部壳体301B的特征332、334。在实例性实施方案中，特征包括凸片332和相关联的凹陷334。如图1所示，当上部壳体301A和下部壳体301B对准时，凸片332与相对凸缘的凹陷334相配合。

任选地，凸缘突起324和凹座326可包括孔。突起和凹座的孔被配置为当上部壳体301A的突起324容纳在下部壳体301B的凹座326中时对准(如图8A所示)。以这种方式，例如螺栓的固定装置328可以穿过对准的孔。然后可以将螺母330互连到固定装置328，以将壳体301A、301B可释放地锁定在一起。如图8B中大体上所示，当上部壳体301A与下部壳体301B对准时，凸缘318的突出部320被配置为互锁。具体来说，在一个实施方案中，突出部320的钩322可释放地互锁。

凹槽336可以形成在任选的凸缘318中。凹槽336被配置为保持如图8A和图8B中大体上示出的位于上部壳体301A与下部壳体301B之间的垫片或垫圈338。

在一个实施方案中，壳体301的圆锥形部分303不是线性的。更具体来说，圆锥形部分303沿着弓形路径从靠近圆柱形部分308的最大直径到靠近第一端口353的最小直径逐渐变细。更具体来说，并且现在参考图5C和图7，壳体301的圆锥形部分303的纵向横截面在圆柱形部分308与第一端口353之间限定具有弓形形状的线。在一个实施方案中，圆锥形部分303朝着沉降器装置300的中心向内凹入。在另一个实施方案中，圆锥形部分303可具有恒定的曲率半径。任选地，在另一个实施方案中，圆锥形部分303可具有两个或更多个曲率半径。例如，圆锥形部分303可具有靠近圆柱形部分308的第一曲率半径和靠近第一端口353的第二曲率半径。第一曲率半径和第二曲率半径的中心点位于壳体的内部。任选地，圆锥形部分308的斜率可以相对于纵轴350在大约15°至大约85°之间变化。在一个实施方案中，圆锥形部分303包括靠近第一端口353的凸出部分。所述凸出部分具有曲率半径，其曲率半径的中心点在壳体的外部。

现在参考图9A-9D，圆锥体309通常包括主体340，其具有带有小开口344的顶点342和带有大开口346的基部。任选地，每个圆锥体是分开形成的。在实例性实施方案中，圆锥体具有基本上相同的尺寸和形状。

在一些实施方案中，主体340在小开口344和大开口346之间可能不是线性的。如图9D所示，主体340的纵向横截面形成具有弓形形状的线。每个圆锥体309的弓形形状可以与壳体301的圆锥形部分303大致相同。

在一些实施方案中，主体340朝着纵轴350向内凹入。因此，从大开口346处的点到小开口344处的点所画的线在主体的内部。

任选地，主体340具有恒定的曲率半径。可替代地，主体可具有两个或更多个曲率半径。因此，主体可具有靠近小开口344的第一曲率半径和靠近大开口346的第二曲率半径。第一曲率半径和第二曲率半径的中心点位于圆锥体309的内部。以这种方式，主体340的靠近小开口344的部分可具有与主体的靠近大开口的斜率不同的斜率。例如，靠近小开口344，主体可相对于纵轴350以至少大约40°的角度对准。相反，在大开口346附近，主体可以更接近于垂直(或更接近于纵轴)。更具体来说，主体可在靠近大开口346的点处相对于纵轴以小于约45°的角度倾斜。任选地，主体340的斜率可在相对于纵轴大约5°至大约85°之间变化。

如图9B、图9D所示，每个圆锥体309可包括突出部313，该突出部被配置为接触相邻的圆锥体，以将每个连续的圆锥体309以基本上相等的间距保持在圆锥体的堆叠体中。在一个实施方案中，突出部313从主体340的内表面向内延伸。突出部313被配置为接触相邻圆锥体的主体340的外表面。可替代地，突出部313可以从主体340的外表面延伸。

突出部313的尺寸可设置成在相邻的圆锥体之间提供任何期望的间距。任选地，突出部313被配置为将相邻的圆锥体隔开大约1mm至大约2.5cm之间的距离。在示例性实施方案中，每个圆锥体309包括至少三个突出部313。

现在参考图2和图3，当圆锥体309位于上部壳体301A内时，底圆锥体309A的主体340由下部壳体301B的第二间隔件315B支撑。下部壳体301B的至少圆锥形部分303以及圆柱形部分308A、308B的部分可能没有圆锥体。因此，培养中的细胞可以保留在沉降器装置300中。

在图1-9D中描绘的实施方案的沉降器装置300的操作期间，无血清或无动物蛋白的细胞培养基可通过下部壳体301B的第一端口353和第二端口354中的一者或多者泵入沉降器装置300中。细胞培养基可以连续地或周期性地泵入沉降器装置300中。具体来说，沉降器装置300可以分批或连续模式操作进行操作。

还可将O₂、CO₂和N₂的受控混合物泵入沉降器装置300中，以控制沉降器装置300内部的培养上清液的pH和DO。任选地，第二端口354A、354B和下部壳体301B第一端口353B中的一者或多者可用于对生物反应器内容物采样，例如以检查细胞活力，以及连续测量液体pH和DO，以输入到计算机控制的多气体质量流量控制器中。

在体外细胞扩增结束时，可以从下部壳体的第一端口353B收获在下部壳体301B内的沉降器装置300的底部收集的浓缩沉降细胞。可通过上部壳体301A的第一端口353A除去含有任何代谢废产物如氨和乳酸盐的澄清培养液，或气体，以及尚未沉降的较小的死细胞和细胞碎片。

任选地，沉降器装置300可以用作独立的生物反应器/细胞分选器组合。可通过第一端口353和第二端口354中的一者或多者将生长培养基添加到细胞沉降器装置中。因此，沉降器装置300可在没有灌注生物反应器的情况下使用。

在一个实施方案中，传感器可定位在沉降器装置300内。任选地，传感器可布置在壳体301A、301B中的一者或多者的内表面上。壳体301的至少一部分可包括塑料。在示例性实施方案中，整个壳体可由塑料构成。在示例性实施方案中，塑料是透明的或至少半透明的。任选地，壳体301的至少一部分是透明或半透明的。例如，可将透明或半透明材料互连到壳体301中类似于窗口的孔。透明部分可包括玻璃、塑料或任何其它合适的材料。透明部分可由对波长的一个或多个预定范围的光透明的材料形成。

当存在时，传感器被定位成与沉降器装置300内的介质接触。传感器可以可操作以监测沉降器装置300中的pH、DO、葡萄糖、温度和CO₂(包括溶解的或部分的CO₂)中的一者或多者。

任选地，一个或多个传感器可包括荧光探针，该荧光探针可操作以发射基于由荧光探针感测的条件而变化的光。荧光探针可布置在沉降器装置300内的各种不同位置。更具体来说，荧光探针可以布置成测量细胞沉降器装置内的不同区域处的不同条件或条件变化。任选地，至少一个荧光探针固定在下部壳体301B的圆锥形部分303B的内表面上。

荧光探针发出的光穿过壳体301的表面(或壳体的透明部分)，并且可能被读取器或仪表收集。如本文所述，该仪表可操作以报告或显示由沉降器装置300内的荧光探针感测到的pH、DO、葡萄糖、温度和CO₂中的至少一者的水平。任选地，荧光探针发出的光可通过任选的光纤电缆收集并传输到仪表。

现在参考图10-15，示出了本公开的沉降器装置400的另一种配置，其可用于沉降细胞或颗粒。沉降器装置400通常包括上部壳体301和下部壳体401。上部壳体301包括圆锥体309的第一堆叠体，并且下部壳体401包括圆锥体409的第二堆叠体。上部壳体301和圆锥体309与结合图1-9D描述的壳体301和圆锥体309相同或相似。

下部壳体401通常包括圆锥形部分403、圆柱形部分408、第一端口453和第二端口454。端口453、454被配置为互连到管线。

在一个实施方案中，下部壳体401固定地连接到上部壳体301。例如，下部壳体和上部壳体可以焊接(包括热焊接)、胶合在一起或通过本领域技术人员已知的另一种手段接合。

可替代地，下部壳体401可以任选地包括凸缘418。任选的凸缘418被配置为可释放地互连到壳体301的任选凸缘318。因此，凸缘418可包括钩状突出部、突起、凹座、凸片和凹陷，其功能类似于凸缘318的特征。任选地，间隔件415可从圆柱形部分408向内延伸。

现在参考图13，壳体401的圆锥形部分403朝着纵轴450向内凸出。具体来说，从圆锥形部分的靠近第一端口453的点到圆锥形部分与圆柱形部分408相交的点所画的直线将位于壳体401的外部。

圆锥形部分403可具有恒定的曲率半径。可替代地，圆锥形部分403可具有两个或更多个曲率半径。例如，圆锥形部分403可具有靠近圆柱形部分408的第一曲率半径和靠近第一端口453的第二曲率半径。第一曲率半径和第二曲率半径的中心点位于壳体401的外部。在一个实施方案中，圆锥形部分403在靠近第一端口453的点处相对于纵轴450以小于大约45°的角度倾斜。任选地，在靠近圆柱形部分408的点处，圆锥形部分具有相对于纵轴大于大约45°的斜率。在另一个实施方案中，圆锥形部分403的斜率可以相对于纵轴在大约15°至大约85°之间变化。

在示例性实施方案中，传感器可定位在沉降器装置400内。传感器可布置在壳体301、401中的一者或多者的内表面上。传感器可布置成与沉降器装置400内的介质接触。传感器可操作以监测沉降器装置400中的pH、DO、葡萄糖、温度和CO₂(包括溶解的或部分的CO₂)中的一者或多者。所述传感器可与本文所述的其它传感器相同。因此，一个或多个传感器可包括荧光探针，该荧光探针可操作以发射基于由荧光探针感测的条件而变化的光。光可传输穿过壳体301、401的透明部分或穿过壳体中的窗口。

如图12和图13所示，圆锥体409堆叠在下部壳体401中。圆锥体409定向成具有靠近第一端口453定位的小开口444。每个圆锥体409的主体440的形状大致对应于壳体圆锥形部分403的形状。具体来说，圆锥体主体440可具有与壳体的圆锥形部分的至少一部分相对应的弓形形状。在示例性实施方案中，圆锥体主体朝着纵轴450向内凸起。任选地，圆锥体主体具有恒定的曲率半径。可替代地，圆锥体主体可具有两个或更多个曲率半径。在一个实施方案中，主体的斜率可相对于纵轴在大约5°至大约85°之间变化。

突出部413可形成在圆锥体主体440上，使得相邻的圆锥体间隔开预定距离。在一个实施方案中，突出部413从圆锥体主体的内表面向内延伸。另外地或可替代地，突出部413可以任选地形成在圆锥体主体的外表面上。当圆锥体被堆叠在一起时，突出部413接触下部圆锥体的内表面，使得相邻的圆锥体间隔开预定距离。当圆锥体位于壳体401中时，最下面的圆锥体409A的突出部413将接触圆锥形部分403的内表面。最上面的圆锥体409E可任选地包括延伸超过大开口446的突出部448。如图12所示，最上面的圆锥体409E的突出部448可以接触圆锥体309的上部堆叠体的最下面的圆锥体309A的内表面。突出部448和圆锥体309A之间的接触可防止圆锥体409的堆叠体意外或无意的运动。

如图14和图15所示，在一些实施方案中，圆锥体409具有不同的直径。最下面的圆锥体409A可具有比堆叠体中的其它圆锥体大的直径。每个圆锥体409B-409E可具有连续较小的直径，而最上面的圆锥体409E具有最小的直径。在一个实施方案中，六个圆锥体409A-409E可堆叠在下部壳体401中。在另一个实施方案中，下部壳体中的圆锥体409的堆叠体可包括从四个至十个的圆锥体。

包括壳体301、401和圆锥体309、409的沉降器装置400可以由与本文所述的其它实施方案相同的材料形成。在示例性实施方案中，一个或多个壳体和圆锥体由单次使用的一次性塑料制成。可替代地，壳体和圆锥体中的一者或多者由金属如不锈钢合金或玻璃制成。圆锥体309、409的表面以及壳体301、401的内表面可完全或部分地涂覆有本领域技术人员已知的非粘性塑料、特氟隆、硅酮和类似材料中的一者或多者。沉降器装置400的表面(尤其是当由不锈钢形成时)可被电抛光以提供平滑的表面。沉降器装置400可以缩放到任何期望的尺寸。

沉降器装置400可以与沉降器装置300相同或相似的方式操作。具体来说，无血清或无动物蛋白的细胞培养基可通过下部壳体401的第一端口453和第二端口454中的一者或多者泵入沉降器装置400中。细胞培养基也可以连续地或周期性地泵入沉降器装置400中。具体来说，沉降器装置400可以分批或连续操作进行操作。

还可将O₂、CO₂和N₂的受控混合物泵入沉降器装置400中以控制细胞沉降器装置内部的培养上清液的pH和DO。任选地，第二端口354、454和下部壳体301第一端口353中的一者或多者可用于对生物反应器内容物采样，例如以检查细胞活力，以及连续测量液体pH和DO以输入到计算机控制的多气体质量流量控制器中。

在体外细胞扩增结束时，可以从下部壳体401的第一端口453收获在沉降器装置400的底部收集的浓缩沉降细胞。包含任何代谢废产物如氨和乳酸盐的澄清培养液或气体以及任何尚未沉降的较小的死细胞和细胞碎片可通过上部壳体301的第一端口353被去除。

任选地，沉降器装置400可用作独立的生物反应器/细胞分选器组合。可通过第一和第二端口353、354、453、454中的一者或多者将生长培养基添加到细胞沉降器装置中。因此，沉降器装置300可在没有灌注生物反应器的情况下使用。

现在参考图16-21，示出了本公开的用于颗粒或细胞的沉降器装置500的另一种配置。沉降器装置500包括与本公开的沉降器装置300、400相同或相似的元件。更具体来说，沉降器装置500通常包括上部圆锥形部分503A、圆柱形部分508和下部圆锥形部分503B，它们限定了大致中空的内部。在一个实施方案中，上部圆锥形部分503A和下部圆锥形部分503B基本上相同。圆锥体509的至少一个堆叠体位于沉降器装置500内。

圆锥形部分503A、503B通常包括第一端口553和任选地第二端口554。任选地，第一端口553与沉降器装置500的纵轴550基本上同心地对准。第一端口553可以用作入口以及出口。

第二端口554还可用于从沉降器装置500的中空内部引入或去除液体、气体和固体。在示例性实施方案中，第二端口554延伸穿过圆锥形部分503。任选地，第二端口554可以大致平行于细胞沉降器装置的纵轴550对准。在其它实施方案中，第二端口554可延伸穿过圆柱形部分508。在一个实施方案中，第二端口554可横向于或垂直于纵轴550定向。可以构想第一端口553和第二端口554的其它配置。沉降器装置500也可具有四个以上的端口。

端口553、554被配置为互连到管线。这样的管线可互连到本公开的任何紧凑型细胞沉降器装置。管线可具有直径或以其它方式配置成互连到本公开的实施方案的任何端口。管线可任选地包括位于中空内部中的至少一个传感器。传感器可与管线内的流体和/或颗粒接触。任选地，传感器可布置在管线的内表面上，但是可以构想其它配置。传感器可用于监测管线中的pH、DO、葡萄糖、温度和CO₂(包括溶解的或部分的CO₂)中的一者或多者。

任选地，一个或多个传感器可包括荧光探针，该荧光探针发出的光根据探针感测的条件而变化。可由读取器或仪表收集光。可任选地通过任选的光纤电缆收集光并将其传输到仪表。该仪表可操作以报告或显示由荧光探针感测到的pH、DO、葡萄糖、温度和CO₂中的至少一者的水平。管线可包括透明或至少半透明的材料。因此，由传感器产生的光可穿过管线。可替代地，类似于窗口，管线的至少一部分是透明或半透明的。因此，由传感器产生的光可传输穿过窗口部分并由仪表收集。

导管560可任选地互连到沉降器装置500内部的第二端口554中的至少一者。本公开的导管560的一个实施方案总体上在图20A、图20B中示出。内腔562延伸穿过导管。在一个实施方案中，导管560不是线性的。更具体来说，导管560可以弯曲。以这种方式，导管被配置为在沉降器装置500内向内延伸，其中导管的自由端564被定位成靠近纵轴550，如图17中大体上所示。因此，穿过导管560的内腔562可以被定位成从沉降器装置500的中间部分，例如从圆锥体509的内部，注入或抽出流体。以这种方式，通过导管560从沉降器装置500中抽出流体可以促进流体在沉降器装置内向上流动，使得流体中的细胞或颗粒沉降到圆锥体上并朝着下部圆锥形部分503B迁移。

沉降器装置500还可包括如在图21A、图21B中大体上示出的扩散器570，其位于中空内部中。扩散器570可以与第二端口之一，例如下部第二端口554B相关联。流体可通过扩散器从沉降器装置500注入或抽出，而不会干扰已经沉降到下部圆锥形部分503B附近的颗粒或细胞。当流体通过扩散器注入到沉降器装置500中时，可能包含细胞或颗粒的流体均匀地分布在沉降器的下部圆锥形部分503B中。

现在参考图21A、图21B，扩散器可包括从杆572延伸的圆环或环574。杆572可以是大体上线性的并且被配置为平行于纵轴550定向。当扩散器570互连到沉降器装置500时，环574可配置成围绕纵轴550延伸。在一个实施方案中，环574适于与纵轴基本上同心。

孔576穿过环574形成，以促进流体、细胞或颗粒穿过扩散器的传输。在一个实施方案中，孔576形成在连接到杆572的环的一侧上。以这种方式，当扩散器互连到下部第二端口554时，孔576可以朝着下部第一端口553B定向。孔576可以被配置为单个通道或凹槽。凹槽可基本上连续地围绕环延伸。

可替代地，所述环可包括多个单独的孔576。在一个实施方案中，所述孔轴向地定向以大体上平行于纵轴喷射流体。孔576可全部沿相同方向定向。可替代地，一些孔可以面对不同或相反的方向。任选地，一个或多个孔576可以横向于纵轴550定向。另外地或可替代地，一些孔可径向或轴向定向。

再次参考图17，圆锥体509可以定位在沉降器装置500内并且定向成面向上部圆锥形部分503A和下部圆锥形部分503B中的一者或多者。在一个实施方案中，沉降器装置包括圆锥体的一个堆叠体，其中圆锥体509B的小端或顶点542朝着下部圆锥形部分503B的下部第一端口553B定向。在该实施方案中，圆锥体的基部或大开口546朝着上部圆锥形部分503A的上部第一端口553A定向。在示例性实施方案中，在沉降器装置500内的堆叠体中布置了三至二十五个之间的圆锥体509。在另一个实施方案中，堆叠体包括6至14个圆锥体或10个圆锥体。然而，当如图16-17所示地组装沉降器装置500时，沉降器装置500的尺寸可设置成容纳任意数量的圆锥体509。下部圆锥形部分503B的至少一部分可以没有圆锥体。更具体来说，最下部的圆锥体509可以与下部圆锥形部分503B的内表面隔开预定距离。因此，培养中的细胞可以例如靠近下部第一端口553B保留在沉降器装置500中。

当圆锥体509B以其顶点542靠近下部第一端口553B定向时，底部圆锥体509的主体540可以由扩散器570支撑。更具体来说，如图17中大体上所示，底部圆锥体509可延伸穿过扩散器环574，使得圆锥体主体540接触扩散器环。底部圆锥体可以任选地接合或焊接到扩散器环。以这种方式，扩散器570可操作以将底部圆锥体509定位成距下部圆锥形部分503B的内表面预定距离。

再次参考图17，任选地，凸缘518可以从沉降器装置的圆锥形部分503的大端延伸。凸缘518的内径可以大约等于但大于圆柱形部分508的外径。在一个实施方案中，当组装沉降器装置时，凸缘518延伸到圆柱形部分508的外表面之外并且大致平行于纵轴550。任选的凸缘518被配置为将相关的圆锥形部分503互连到圆柱形部分508。例如，圆锥形部分503可以被焊接或否则固定到靠近凸缘518的圆柱形部分508上。

另外地或可替代地，凸缘518可包括适于使相关的圆锥形部分503与圆柱形部分508对准的特征。在示例性实施方案中，特征包括配置成与圆柱形部分中的相应凹座啮合的突出部。

凸缘可被配置为保持位于圆锥形部分与圆柱形部分之间的垫片或垫圈。垫圈可以与图8A和图8B中大体示出的垫圈338相同或相似。

在一个实施方案中，沉降器装置500的一个或多个圆锥形部分503不是线性的。更具体来说，圆锥形部分503可以沿着弓形路径从靠近圆柱形部分508的最大直径到靠近第一端口553的最小直径逐渐变细。更具体来说，并且再次参考图17，每个圆锥形部分503的纵向横截面在圆柱形部分508与第一端口553之间限定具有弓形形状的线。在一个实施方案中，圆锥形部分503朝着沉降器装置500的中心向内凹入。在另一个实施方案中，圆锥形部分503可具有恒定的曲率半径。任选地，在另一个实施方案中，一个或多个圆锥形部分503可具有两个或更多个曲率半径。例如，圆锥形部分503可具有靠近圆柱形部分508的第一曲率半径和靠近相关联的第一端口553的第二曲率半径。第一曲率半径和第二曲率半径的中心点位于沉降器装置500的内部。任选地，圆锥形部分508的斜率可相对于纵轴550在大约5°和大约85°之间变化。在一个实施方案中，圆锥形部分503可包括靠近第一端口553的凸出部分。所述凸出部分具有曲率半径，所述曲率半径的中心点在沉降器装置500的外部。

现在参考图19A和图19B，圆锥体509通常包括主体540，其具有带有小开口544的顶点542和带有大开口546的基部。任选地，每个圆锥体是分开形成的。在示例性实施方案中，圆锥体具有基本上相同的尺寸和形状。

在一些实施方案中，主体540在小开口544和大开口546之间可能不是线性的。如图17中大体上所示，主体540的纵向横截面将形成具有弓形形状的线。每个圆锥体509的弓形形状可与沉降器装置500的一个或多个圆锥形部分503大致相同。

在一些实施方案中，主体540朝着纵轴550向内凹入。因此，从大开口546处的点到小开口544处的点所画的直线在主体的内部。

任选地，主体540具有恒定的曲率半径。可替代地，主体可具有两个或更多个曲率半径。因此，主体可具有靠近小开口544的第一曲率半径和靠近大开口546的第二曲率半径。第一曲率半径和第二曲率半径的中心点位于圆锥体509的内部。以这种方式，主体540的靠近小开口544的部分的斜率可以不同于靠近大开口的主体的斜率。例如，靠近小开口544，主体可以相对于纵轴550以至少大约40°的角度对准。相反，在大开口546附近，主体可以更接近于垂直(或更接近于纵轴)。更具体来说，主体可在靠近大开口546的点处相对于纵轴以小于大约45°的角度倾斜。任选地，主体540的斜率可相对于纵轴在大约5°与大约85°之间变化。

如图19A、图19B所示，每个圆锥体509可包括突出部513，该突出部513被配置为接触相邻的圆锥体，以将每个连续的圆锥体509以基本上相等的间距保持在圆锥体的堆叠体中。在一个实施方案中，突出部513从主体540的外表面向外延伸。突出部513被配置为接触相邻圆锥体的主体540的内表面。可替代地，突出部513可以从主体340的内表面延伸。在一些实施方案中，突出部513大体上平行于纵轴550定向。

突出部513的尺寸可设置成在相邻的圆锥体之间提供任何期望的间距。任选地，突出部513被配置为将相邻的圆锥体隔开大约1mm至大约2.5cm之间的距离。在示例性实施方案中，每个圆锥体509包括至少三个突出部513。

突出部513可任选地配置成相对于第二圆锥体固定第一圆锥体。更具体来说，突出部513可包括凸缘532和凹槽536。第一圆锥体的凹槽536可容纳第二相邻圆锥体的凸缘532，如图19A中大体上所示。

现在参考图18，沉降器装置500可任选地包括圆锥体509A的第二堆叠体。圆锥体的第二堆叠体中的圆锥体509A可与圆锥体509B相同。可替代地，圆锥体509A可具有与圆锥体509B不同的尺寸或形状。在一个实施方案中，圆锥体的第二堆叠体中的圆锥体509A可各自具有不同的尺寸。例如，圆锥体509A的最上面的圆锥体可具有大于下部圆锥体之一的直径。类似地，圆锥体509A中的最下面的圆锥体可具有小于圆锥体的第二堆叠体中的其它圆锥体的直径。

任选地，一个或多个间隔件(未示出)可从沉降装置500的内表面向内突出。间隔件被配置为防止位于沉降器装置500内的圆锥体509的堆叠体抵靠在圆锥形部分503或圆柱形部分508的内表面上。任选地，间隔件可大致平行于沉降器装置300的纵轴550。间隔件可具有基本上薄的横截面，以防止或最小化对沉降器装置500内的液体和悬浮颗粒的运动或流动的干扰。尽管在图16-18中未示出，但是间隔件可以与在图5A、图5B和图7中示出并且在本文中描述的间隔件315相同或相似。

沉降器装置500的元件，例如圆锥形部分503、圆柱形部分508和圆锥体509，可以由单次使用的一次性塑料制成。可替代地，圆锥形部分503、圆柱形部分508和圆锥体509中的一者或多者可以由金属如不锈钢合金或玻璃制成。圆锥体509的表面以及圆锥形部分503和圆柱形部分508的内表面可以完全或部分地涂覆有本领域技术人员已知的非粘性塑料、特氟隆、硅酮和类似材料中的一者或多者。另外地或可替代地，可对表面(特别是当由不锈钢形成时)进行电抛光以提供平滑的表面。这些沉降器装置可以容易地缩放到任何期望的大小。

在一个实施方案中，圆锥形部分例如通过焊接(例如声波焊接或热焊接)、粘合剂或胶固定地接合到圆柱形部分。任选地，一个或多个圆锥体可以接合到沉降器装置的内表面上。例如，在一个实施方案中，在圆锥体的堆叠体中的最上面圆锥体509的一部分可以接触并固定到上部圆锥形部分503A的内表面，如图17中大体上所示。在一个实施方案中，圆锥体可以接合在一起以形成圆锥体的堆叠体。

沉降器装置500可以任选地包括流体护套(未示出)。流体护套可以与圆锥形部分503和圆柱形部分508中的一者或多者相关联。水或其它流体可通过一个或多个端口被引导到流体护套中以将沉降器装置500及其内容物(包括其中的流体)保持在期望的温度范围内。

在图16-18中描绘的实施方案的沉降器装置500的操作期间，无血清或无动物蛋白的细胞培养基可通过下部圆锥形部分503B的第一端口553B和第二端口554B中的一者或多者泵入沉降器装置300中。细胞培养基可以连续地或周期性地泵入沉降器装置500中。具体来说，沉降器装置500可以分批或连续操作进行操作。

还可将O₂、CO₂和N₂的受控混合物泵入沉降器装置500中，以控制沉降器装置500内部的培养上清液的pH和DO。任选地，第二端口554A、554B和下部圆锥形部分503B和第一端口553B中的一者或多者可用于对生物反应器内容物采样，例如以检查细胞活力，以及连续测量液体pH和DO，以输入到计算机控制的多气体质量流量控制器中。

在体外细胞扩增结束时，可以从沉降器装置500的第一端口553B收获在下部圆锥形部分503B内的沉降器装置500的底部收集的浓缩沉降细胞。包含任何代谢废产物如氨和乳酸盐的澄清培养液或气体以及任何尚未沉降的较小的死细胞和细胞碎片可通过上部圆锥形部分503A的第一端口553A被去除。

任选地，沉降器装置500可以用作独立的生物反应器/细胞分选器组合。可通过第一端口553和第二端口554中的一者或多者将生长培养基添加到细胞沉降器装置中。因此，沉降器装置500可在不连接到灌注生物反应器的情况下使用。

在一个实施方案中，传感器可定位在沉降器装置500内。任选地，传感器可布置在圆锥形部分503和圆柱形部分508中的一者或多者的内表面上。在示例性实施方案中，沉降器装置500的至少一部分可包括塑料。在示例性实施方案中，整个壳体可由塑料构成。在示例性实施方案中，塑料是透明的或至少半透明的。任选地，沉降器装置500的至少一部分是透明或半透明的。例如，可将透明或半透明材料互连到沉降器装置500中类似于窗口的孔。透明部分可包括玻璃、塑料或任何其它合适的材料。透明部分可由对波长的一个或多个预定范围的光透明的材料形成。

当存在时，传感器被定位成与沉降器装置500内的介质接触。传感器可以可操作以监测沉降器装置500中的pH、DO、葡萄糖、温度和CO₂(包括溶解的或部分的CO₂)中的一者或多者。

任选地，一个或多个传感器可包括荧光探针，该荧光探针可操作以发射基于由荧光探针感测的条件而变化的光。荧光探针可布置在沉降器装置500内的各种不同位置。更具体来说，荧光探针可以布置成测量细胞沉降器装置内的不同区域处的不同条件或条件变化。任选地，至少一个荧光探针被固定在沉降器装置的下部圆锥形部分503B的内表面上。

荧光探针发出的光穿过沉降器装置的表面(或沉降器装置的透明部分)，并且可能被读取器或仪表收集。如本文所述，该仪表可操作以报告或显示由沉降器装置500内的荧光探针感测到的pH、DO、葡萄糖、温度和CO₂中的至少一者的水平。任选地，可通过任选的光纤电缆收集由荧光探针发出的光并传输到仪表。

现在参考图22-23，总体上示出了本公开的另一个沉降器装置600。沉降器装置600类似于沉降器装置500并且包括许多相同的特征。例如，沉降器装置600通常包括上部圆锥形部分503A、圆柱形部分508和下部圆锥形部分503B，它们限定了大致中空的内部。扩散器570可以定位在与下部第二端口553B流体连通的中空内部中。

圆锥体509A的堆叠体可以定位在沉降器装置600内。值得注意的是，圆锥体509A以其顶点542靠近上部圆锥形部分503A和第一上部端口553A定向。

圆锥体509A可固定到上部圆锥形部分503A的内表面。更具体来说，在一个实施方案中，圆锥体包括如本文所述的突出部513。上部圆锥体509A的突出部513可以固定或焊接到上部圆锥形部分503A的内表面，如图23中大体上所示。

任选地，圆锥体的第二堆叠体(未示出)可以定位在沉降器装置600内。圆锥体的第二堆叠体中的圆锥体可以利用其顶点靠近下部圆锥形部分503B来定向。在一个实施方案中，圆锥体的第二堆叠体中的圆锥体与圆锥体509A相同或相似。可替代地，圆锥体的第二堆叠体中的圆锥体可具有与圆锥体509A不同的尺寸或形状。在一个实施方案中，第二圆锥体可具有与图14和图15中所示的圆锥体409相似的连续增加的直径。

在本公开的每个实施方案中，堆叠圆锥体的圆锥形表面的表面的倾斜角可以与垂直方向成约30度至约60度。在某些实施方案中，圆锥形表面或堆叠圆锥体的表面的倾斜角与垂直方向成约45度。在又一个实施方案中，倾斜角在约15度和约75度之间的范围内。如上所述，为了分离更粘性的颗粒(通常是哺乳动物细胞)，倾斜角优选更接近于垂直方向(即，与垂直方向成约30度)。对于粘性较小的固体颗粒(例如，催化剂颗粒)，倾斜角可以距垂直方向更远(优选地，与垂直方向成约60度)。

本公开的任何沉降器装置(包括壳体、圆锥体和/或沉降器装置的任何其它组件)的构造的材料可以是不锈钢(尤其是不锈钢316)，或用于微生物或哺乳动物细胞培养的类似材料，以及用于化学加工行业例如催化剂分离和回收的其它金属。可对不锈钢表面部分或完全地进行电抛光以提供平滑的表面，使细胞或颗粒可在从液体悬浮液中沉淀出来后向下滑动。本公开的沉降器装置的一些或全部表面可涂覆有非粘性塑料或硅酮，例如二甲基二氯硅烷。可替代地或另外地，本公开的任何这些沉降器装置的材料构造可以是非金属，包括塑料，例如单次使用的一次性塑料。尽管可以经由标准板轧制和将钢角板焊接到螺旋板的底部来构造本公开的金属沉降装置，但是本公开的塑料沉降器装置或其单个部件可更容易地连续制造为使用例如注塑成型或三维印刷技术的单件。

在本公开的任何沉降器装置中，液体可通过一个或多个与端口或开口液体连通的泵(例如蠕动泵)被引导到沉降器装置的壳体中的任何端口或开口中或从其中抽出。这样的泵或导致液体流入或流出沉降器装置的其它装置可以连续或间歇地操作。如果间歇操作，则在泵关闭的时段期间，在周围流体静止的同时会发生颗粒或细胞沉降。这允许已经沉降的那些颗粒或细胞沿倾斜的圆锥形表面向下滑动，而不受液体向上流动的阻碍。间歇操作的优点在于其可以提高细胞向下滑动的速度，从而提高细胞活力和生产率。在具体的实施方案中，使用泵将来自生物反应器或发酵培养基的细胞的液体悬浮液引导到本公开的沉降器装置中。

构建安置在本公开的任何沉降器装置的壳体内的圆锥体的材料的厚度优选尽可能地薄，以保持形状的刚度并最小化将被支撑在壳体内部的同心圆锥体的堆叠体的重量。这些装置的半径和高度可以根据大规模过程所需尽可能独立地按比例放大，这可以根据例如对于倾斜板沉降器提供的预测等式进行计算(Batt等人,1990，同上)。

在本公开的沉降器装置中引起颗粒分离的一个重要因素是在倾斜表面上的沉降增强，这已经由Boycott(Nature,104:532,1920)用血细胞成功地证明，并且在倾斜的矩形表面上的沉降增强，如由Batt等人(1990,同上)用产生单克隆抗体的杂交瘤细胞成功地证明。增强细胞/颗粒分离的其它因素是细胞/颗粒在其沿连续圆柱体之间的环形区域行进期间的离心力以及由于重力而沉降在沉降表面上。

虽然层状板已被用于独立地按比例放大倾斜板沉降器的每个尺寸，即增加堆叠在每块板顶部的板的长度或宽度或数量，但螺旋圆锥形沉降区可以通过简单地增加该装置的水平半径而同时在三个维度上按比例放大。当装置的水平半径增加时，可以通过在连续的螺旋之间保持恒定的距离(或通道宽度)来按比例增加垂直表面和圆锥表面的数量。颗粒分离效率与倾斜沉降表面的总投影水平面积成正比。随着装置半径的增加，投影的水平面积与半径的平方成比例地增加，从而通过简单地增加半径就可以在总投影面积中进行三维按比例放大(即与半径的立方成比例)。

沉降器装置600可以与本公开的其它沉降器装置相似的方式操作。例如，沉降器装置600可以如结合沉降器装置300、400、500所描述的那样使用和操作。

使用方法和工艺操作

现在描述使用本公开的沉降装置的示例性方法。通过端口将含有颗粒的液体(包括例如细胞培养液、废水或含有固体催化剂颗粒的反应液等)引入本公开的沉降器装置中。大约50％-99％的进入液体(通常约90％)通过沉降器装置底部的端口被除去，而其余1％-50％(通常约10％)的液体则通过装置顶部的端口被除去。可使用泵(例如蠕动泵)将液体从顶部端口吸出，而由于重力，无需泵就可使离开底部的浓缩液体离开旋风分离器壳体的底部出口。可替代地，可在进入液体流量的约50％-99％下，从圆锥形沉降器的底部端口泵出包含沉降的细胞或颗粒的液体，并且剩余的澄清的液体(1％-50％)可经由顶部端口离开。任选地，离开端口的流体可被泵出到收获管线中。

进入时，大多数进入的细胞(或颗粒)会通过离心力被推向沉降器装置组件的壁，最初通过轻轻的涡旋运动向下沉降在圆锥形部分上，随着液体和颗粒/细胞下落而变得更快并经由底部端口离开。尚未沉降的细胞或颗粒将向上移动穿过圆锥体的堆叠体。随着液体缓慢地向上移动穿过圆锥体的堆叠体，较大的颗粒(例如活细胞)将沉降在圆锥体表面上，并且沿着圆锥体向下滑动，或者沿圆锥体与旋风分离器壳体外壁之间的小间距下落。这些沉降的颗粒沿着外圆柱壁垂直下落，直到它们到达组件的底部圆锥形区段，并且继续沿圆锥形区段向下滑动至底部端口。

通过增加通过端口的液体入口流量，可减少液体在倾斜沉降区内的停留时间，从而使较小的颗粒(例如死细胞和细胞碎片)在液体到达沉降区顶部时不会沉降，因此，这些较小的颗粒经由顶部端口离开沉降装置。这种特征提供了一种简单的方法，以经由顶部端口选择性地去除较小的颗粒(例如死细胞和细胞碎片)进入收获流，而较大的颗粒(例如活细胞和生产性细胞)从底部端口返回到另一个容器(例如生物反应器)。

因此，在这些方法中，将液体悬浮液引入这些沉降器装置的步骤可包括将液体悬浮液从塑料生物反应器袋引导至颗粒沉降装置中。

可通过与端口或开口液体连通的一个或多个泵(例如蠕动泵)将液体引导到沉降装置中的任何端口或开口中或者从其中抽出。这样的泵或导致液体流入或流出沉降器装置的其它装置可连续或间歇地操作。如果间歇操作，则在泵关闭期间，在周围流体静止时会发生颗粒或细胞沉降。这允许已经沉降的那些颗粒或细胞沿倾斜的圆锥形表面向下滑动，而不受液体的向上流动的阻碍。间歇操作的优点在于其可以提高细胞向下滑动的速度，从而提高细胞活力和生产率。在具体的实施方案中，使用泵将来自生物反应器或发酵培养基的细胞的液体悬浮液引导至本公开的沉降器装置中。

在使用本公开的沉降器装置的这些方法中可调节的一个参数是流入和流出沉降器装置的液体流量。液体流量将完全取决于装置的具体应用，并且可以改变流量以保护被从澄清的液体中沉降并分离出来的颗粒。具体来说，可能需要调节流量以保护可能在本公开的沉降器装置中分离并返回到细胞培养的活细胞的活力，但是还应该调节流量以防止大量的细胞或颗粒在沉降器装置中积聚或将液体转移进出沉降器装置的导管堵塞。

在这些方法中，从沉降器装置收集的澄清的液体可包括生物分子、有机或无机化合物、化学反应物和化学反应产物中的至少一者。从沉降器装置收集的澄清的液体可包括烃、多肽、蛋白质、醇、脂肪酸、激素、碳水化合物、抗体、类异戊二烯、生物柴油和啤酒中的至少一者。在这些方法的实例中，从沉降器装置收集的澄清的液体包括胰岛素或其类似物、单克隆抗体、生长因子、亚单位疫苗、病毒、病毒样颗粒、集落刺激因子和促红细胞生成素(EPO)中的至少一者。

本文引用的每个出版物或专利均通过引用整体并入本文。通过参考以下实施例，将更容易地理解现在总体上描述的本公开的沉降器装置，所述实施例仅出于说明本公开的实施方案的某些方面的目的而被包括在内。所述实施例并非旨在限制本公开，因为本领域技术人员将从以上教导和以下实施例中认识到，其它技术和方法可以满足权利要求并且可以在不脱离本公开范围的情况下被采用。

实施例

实施例1

酵母或分泌蛋白质产物的其它微生物细胞

重组微生物细胞，例如酵母或真菌(巴斯德毕赤酵母、酿酒酵母、乳酸克鲁维酵母、黑曲霉等)或细菌(大肠埃希氏菌、枯草芽孢杆菌等)细胞，其经过工程改造以分泌异源蛋白质(例如，胰岛素或巴西甜蛋白)或天然分泌酶(例如黑曲霉、枯草芽孢杆菌等)，可在附接于本公开的紧凑型沉降器装置的生物反应器中生长，以将活细胞和生产性细胞再循环回生物反应器，从而将实现高细胞密度和高生产率。新鲜的营养培养基连续地供应到高细胞密度生物反应器内部的活细胞和生产性细胞，并且分泌的蛋白质或酶从顶部端口(或顶部侧出口353A、354A、553A、554A)在澄清的出口中连续地收集，而浓缩的活细胞和生产性细胞则返回到生物反应器中。随着死细胞和一小部分活细胞经由收获出口连续地从生物反应器中被移出，细胞生长和蛋白质生产可以无限期地保持，而无需真正终止生物反应器操作。在使用利用本公开的圆锥形沉降器装置的毕赤酵母细胞的操作中，灌注生物反应器已经操作了一个月以上。随着微生物细胞在悬浮液培养中的生长以及细胞保留装置可以按比例扩大到任何所需的尺寸，本公开的沉降器可以附接到尺寸从实验室规模(<1升)到工业规模(>50,000升)变化或两者之间的任何尺寸的悬浮液生物反应器以实现高细胞密度灌注培养。

在一个特定实施例中，描述了酵母巴斯德毕赤酵母细胞的灌注生物反应器培养。酵母巴斯德毕赤酵母细胞在5升的计算机控制的生物反应器中生长，最初以分批模式使来自接种物的细胞生长前50小时，然后在接下来的100小时内以补料分批模式缓慢地填充附接的12升细胞沉降器，然后以连续灌注模式利用本公开的紧凑型细胞沉降器去除较小的死细胞并将较大的活细胞再循环回生物反应器中。图24中描绘了本公开的紧凑型细胞/颗粒沉降器附接到任何模块化生物反应器的典型示意图。

参考图24，酵母巴斯德毕赤酵母细胞在灌注生物反应器(218)中生长。经由与输入管线(201)互连的第一泵(202)，将生长培养基从培养基储集器(200)添加到生物反应器(218)。通过溶解氧监测器(206)和pH监测器(204)连续监测生物反应器(218)中的溶解氧含量和pH。来自生物反应器(218)的酵母细胞培养经由与管线(212)互连的第二泵(214)被递送至本公开的12升紧凑型细胞沉降器(208)。含有较小死细胞的来自紧凑型细胞沉降器(208)的流出物通过流出物管线(210)排空。较大的活细胞经由第三泵(216)和返回管线(217)从细胞沉降器(208)再循环回生物反应器(218)。通过经由第四泵(220)和去除管线(222)去除过量的细胞培养以捕获或丢弃，来控制生物反应器(218)中的培养基和细胞培养水平。

图25显示了利用本公开的紧凑型细胞/颗粒沉降器以该灌注生物反应器设置获得的结果。圆圈显示了在约150小时的初始分批和补料分批培养期间增加并接着连续灌注操作长达1600小时或超过2个月的在600nm处测量的生物反应器样品的光密度。通过操纵沉降器入口泵设置和/或沉降器再循环泵设置来调节沉降器流出物或收获率。细胞浓度(如通过在600nm处的OD所测量)和大小分布由从生物反应器进入的细胞的收获流量和细胞大小分布以及其它因素(如来自沉降器的再循环比率)确定。即使随着灌注速率从2000毫升/天逐渐增加到超过6,000毫升/天，流出物流也含有非常少的细胞，如通过在0至30范围内的极低OD所测量。这些结果表明，由于大多数活细胞再循环回到生物反应器并选择性去除较小的死细胞和细胞碎片，因此在生物反应器中获得并维持了非常高的细胞密度。即使在这些增加的灌注速率下，生物反应器也可以在高细胞密度下无限期地操作，而没有任何终止生物反应器的原因，例如基于竞争性膜的细胞保留装置中的膜堵塞。

用粒度分析仪分析在同一时间点从生物反应器和沉降器流出物中采集的样品。图26中所示的归一化的细胞大小分布结果清楚地表明，与对于生物反应器中的细胞所发现的相比，沉降器流出物含有显著较小的细胞大小分布。这些结果表明，沉降器优先去除了流出物中的较小的死细胞和任何细胞碎片，而较大的活细胞则优先返回生物反应器。因此，通过沉降器流出物选择性去除死细胞和细胞碎片来连续清洁生物反应器，并且因此如同所有其它细胞保留装置常规发生的那样，生物反应器内没有死细胞和细胞碎片的积聚。

将灌注培养期间的早期时间点的生物反应器和沉降器流出物样品收集并在2ml小瓶中离心。从来自沉降器装置(208)的流出物中沉淀的细胞和在生物反应器(218)中沉淀的细胞显示，来自生物反应器的沉淀细胞几乎占据了小瓶中湿浓集细胞体积的50％，而沉降器流出物中的沉淀细胞仅占湿浓集细胞体积的约5％。这些结果再次证实，来自生物反应器的完整较小细胞中只有极小部分在沉降器流出物中被去除，而大部分较大的完整细胞则优先返回生物反应器。

在此为期两个月的灌注操作期间，测量了生物反应器和沉降器流出物中的总蛋白质浓度，并且表明，在最初的分批操作和补料分批操作之后，即在长时间的灌注操作期间，来自沉降器装置(208)的流出物样品中的总蛋白质含量始终大于生物反应器(218)样品中的总蛋白质含量。这些结果非常强烈地表明，在沉降器(208)内没有蛋白质过筛，正如在哺乳动物细胞的灌注培养中通常用基于膜的细胞保留装置如ATF所观察到的那样。此外，这些结果表明，在沉降器(208)中存在一些额外的蛋白质产生，从而同时导致流出物蛋白质浓度始终高于生物反应器(218)中的蛋白质浓度。

可以将来自图24中所示的连续灌注生物反应器配置的收获流中的总累积蛋白质与可以在超过158小时或将近6天进行的单个补料分批生物反应器(218)的无细胞上清液中收获的蛋白质进行比较，并且在例如1600小时的相同培养持续时间内一次又一次重复。尽管补料分批培养通常需要较长的停机时间才能收获或清空生物反应器，清洁内表面，用蒸汽就地灭菌，冷却，用无菌培养基重新填充生物反应器，用新鲜细胞接种生物反应器并且然后使细胞生长至足够高的细胞密度以看到蛋白质效价显著提高，但是连续灌注生物反应器在整个培养操作中以高细胞密度和高生产率不间断地持续运行。因此，连续收获的产物流中的总累积蛋白质随着灌注速率增加以显著更快的速率增加，并且累积至160g，这比在相同的5升生物反应器中从8次重复补料分批培养操作的无细胞上清液中可收获的蛋白质量高5倍。

实施例2

从啤酒中去除酵母细胞

在大规模酿造操作中，通过过滤装置(其定期被堵塞)或离心装置(其为昂贵的高速机械装置)从产物啤酒中去除酵母细胞。以前，水力旋流器未能成功测试用于此应用(Yuan等人,1996；Cilliers和Harrison,1997)。这些装置可以容易地被本公开的沉降器装置代替，以从顶部出口澄清啤酒并从底部出口去除浓缩的酵母细胞悬浮液。由于在本公开的圆锥形沉降器区域中增加的停留时间和增强的沉降，本发明人已成功地从细胞培养液中分离出酵母细胞，在第一次操作中收获了仅含有进入到沉降器装置中的细胞的约5％的培养上清液。由于所述装置可以按比例放大或缩小以增加或降低其细胞分离效率，因此，如果需要，从收获端口获得完全不含细胞的啤酒是可行的。因此，本公开的装置在酿造啤酒以及澄清啤酒和连续酿造布置中可能特别有用。

实施例3

从哺乳动物细胞培养肉汤中澄清或去除细胞

与上述实施例2相似，在补料分批生物反应器培养结束时从细胞培养肉汤中澄清哺乳动物细胞是收获分泌产物(例如抗体或治疗性糖蛋白)的必要的第一步骤，随后进行一系列其它下游处理操作。当前，离心和深度过滤被用作从细胞培养肉汤中去除哺乳动物细胞和细胞碎片的常见单元操作。然而，从连续离心过程中定期去除积聚的细胞会导致细胞进入澄清细胞培养上清液中的反复暴涌。本公开的沉降器装置产生连续澄清的(无细胞或细胞显著耗尽的)上清液，因为哺乳动物细胞容易沉降在装置内部。这些紧凑型沉降器装置可更一致地从细胞培养肉汤中去除细胞，从而潜在地取代了对任何离心的需求，并减少了二次深度过滤操作中所需的膜面积量，以完全消除任何残留的细胞和所有细胞碎片。可以在如下所述的灌注生物反应器中以分批操作或连续操作进行澄清。

实施例4

哺乳动物细胞灌注培养

已经成功地证明了鼠类杂交瘤和重组哺乳动物细胞在倾斜沉降器中的沉降增强(Batt等人,1990和Searles等人,1994)并在层状沉降器中按比例放大(Thompson和Wilson,美国专利No.5,817,505)。尽管层状沉降器独立地在三个维度上按比例放大，但是如上文所讨论，本公开的圆锥形沉降器装置可通过简单地增加其半径而同时在三个维度上按比例放大。因此，本公开的沉降器更紧凑，包含更多的倾斜表面以在较小的占地面积上沉降，并且是可更容易按比例放大的细胞保留装置，其在分泌糖蛋白例如单克隆抗体和其它治疗性蛋白的哺乳动物细胞培养中的应用得到证实。从细胞保留装置连续收获来自顶部端口的含有分泌蛋白的澄清收获输出，而来自底部出口的浓缩细胞则被再循环回生物反应器，从而产生高细胞密度的灌注生物反应器，其可以无限期地操作，(即超过数月的连续灌注操作)。来自单个1000升高细胞密度灌注生物反应器的连续高效价收获可能超过每年大型(>20,000升)补料分批生物反应器的累计产量。

重组中国仓鼠卵巢细胞(其通常用于治疗性糖蛋白的过表达和分泌)在1升受控生物反应器中培养，该反应器附接有4英寸紧凑型细胞沉降器，如图24示意性所示。测量了生物反应器、沉降器顶部流出物和沉降器底部返回生物反应器中的活细胞密度。在60小时开始进行灌注操作后不久，几乎没有活细胞从沉降器顶部流出物中被去除，并且增加量的活细胞从沉降器底部出口返回到生物反应器。因此，在灌注操作开始后，生物反应器的活细胞密度(VCD)逐渐增加，并且当灌注开始时，生物反应器中的活力百分比(菱形)更急剧地增加。

在第5天对来自生物反应器和沉降器顶部流出物的样品进行细胞大小分布测量，并通过Beckman-Coulter多尺寸分析仪对生物反应器样品进行测量的细胞/颗粒尺寸的直方图显示，活细胞分布广泛，以及可能的尺寸范围在约10微米至约30微米内的双重峰，其峰值为约16微米，死细胞的尖峰尺寸在8至9微米之间，以及在小于8微米的较小尺寸范围内的细胞碎片的巨大尾部。通过相同仪器对来自紧凑型细胞沉降器(208)的顶部端口流出物的样品测量的细胞/颗粒尺寸的另一个直方图显示，尺寸在8至9微米之间的死细胞的峰增强，尺寸小于8微米的细胞碎片尾部，并且完全不存在任何约16微米的活细胞峰。这些尺寸测量强烈地证明，沉降器顶部流出物选择性地从灌注生物反应器(218)中去除较小的死细胞和细胞碎片，而较大的活细胞连续地返回至灌注生物反应器(218)。使用倾斜板沉降器对较小死细胞和细胞碎片的这种选择性去除已经得到证实(Batt等人,1990和Searles等人,1994)。本公开的紧凑型细胞沉降器再次以更紧凑和更容易缩放的设计再现了那些连续的结果。当今可用于哺乳动物细胞的其它细胞保留装置在仅去除较小的死细胞和细胞碎片方面没有表现出任何这种选择性。

实施例5

疫苗、病毒或病毒样颗粒或基因治疗载体的生产

疫苗例如病毒或病毒样颗粒(VLP)，或基因治疗载体例如腺相关病毒(AAV)、慢病毒等的生产，通常是通过在分批或补料分批生物反应器培养中感染和裂解活的哺乳动物或昆虫细胞来进行的。在大量细胞内产生这些病毒或病毒样颗粒后，在裂解过程中从被感染的细胞中释放出病毒或病毒样颗粒。利用这些颗粒的大小(亚微米或纳米级)与活的哺乳动物和昆虫细胞的大小(约5-20微米)相比的巨大差异，从分批或补料分批生物反应器培养中分离病毒或病毒样颗粒非常简单。通过控制主要包含病毒或VLP以及细胞碎片的澄清细胞培养肉汤的连续收获率或出口率，也可能将少量的感染性颗粒与正在生长的活细胞一起保留在生物反应器内部，以在附接至本公开的沉降器装置的连续灌注生物反应器中持续感染和生产疫苗以连续收获病毒和VLP。

实施例6

固体催化剂颗粒的分离和再循环

以前已经用层状沉降器证实了将固体催化剂颗粒分离以再循环至反应器中并在进一步催化液相化学反应如Fischer-Tropsch合成中再利用(美国专利No.6,720,358,2001)。可以通过本公开的颗粒沉降装置来增强许多这样的涉及液相或气相反应中的固体催化剂颗粒的两相化学反应，所述装置提供了一种更紧凑的颗粒分离装置，以实现与层状沉降器所示相同的固体分离和再循环。

实施例7

植物和藻类细胞收获

分泌有价值的产物的重组植物细胞培养虽然在商业上还不可行，但仍是本公开沉降装置的潜在应用的另一个领域。倾斜沉降器已用于若干植物细胞培养应用。这样的装置可以被本公开的更紧凑的圆锥形螺旋沉降器装置代替。由于植物细胞的大小大于酵母或哺乳动物细胞的大小，因此利用单个植物细胞或植物组织培养物的细胞分离效率将更高。

本公开的沉降器装置的更直接的商业应用可能是从大规模培养池中收获藻类细胞以从藻类细胞内部收获生物柴油产物。通过本公开的圆锥形螺旋沉降器装置，可以容易地收获将太阳能转换为细胞内脂肪或脂肪酸储藏的大型(英亩大小)浅池中相对稀释的藻类细胞团，并且可以从底部出口收获浓缩的藻类细胞。

实施例8

市政废水处理

大规模市政废水处理厂(使用活性污泥或多种细菌物种的群落来降解污水或废水中的生物和有机废物)通常使用大型沉降槽，并且这些工厂的更现代型式使用层状沉降器从污泥中移除澄清水。本公开的圆锥形螺旋沉降器装置可以按比例放大到这些工厂中所需的较大尺寸，而尺寸仍然小于当前在这些处理厂中使用的大型沉降槽或层状沉降器。

实施例9

工业过程水澄清

清洁工业废水或含有悬浮固体的天然来源的浑浊水的大规模水处理厂使用大规模沉降槽或层状倾斜沉降器。这些大规模装置现在可以用本公开的更紧凑的圆锥形螺旋沉降器装置代替，以实现用于工业再利用或市政淡水供应的澄清水的相同目的。

实施例10

在蛋白A包被的珠粒上捕获和纯化单克隆抗体

含有单克隆抗体的细胞培养上清液可以经由两个不同的入口与我们的沉降器内部的蛋白A包被的微球或珠粒(40-200微米)接触，例如从顶部入口进入的珠粒和经由底部端口进入的细胞培养上清液，以最大化其接触和捕获效率。单克隆抗体在蛋白A珠粒上的捕获非常快，通常在竞争性亲和色谱柱内的停留时间不到10分钟。包被有蛋白A的微球珠粒将很快地沉降下来，并且可以通过从底部入口泵入，将其保持在悬浮液中并充分混合以与细胞培养上清液接触。耗尽的细胞培养上清液可以在分批装载操作中从本公开的细胞沉降器的顶部出口连续的被去除。被向上流动的液体夹带的任何珠粒将沉降在倾斜表面上并返回到底部搅拌区域。装载量接近所添加珠粒的最大结合能力后，可用约3-5倍体积的沉降器的典型洗涤溶液洗涤珠粒，以经由顶部出口除去上清液中存在的未结合的宿主细胞蛋白以及死细胞碎片。

完成彻底洗涤后，将缓慢泵入洗脱介质，以将结合的抗体去除到液体培养基中，并经由顶部端口除去浓缩的抗体溶液，同时将珠粒保留在沉降器内部。洗脱完成后，通过从底部入口泵入平衡溶液来进行珠粒的平衡，同时通过这种进入溶液将珠粒保持在悬浮液中。平衡后，将下一批细胞培养上清液装载到沉降器中以重复上述四步过程，类似于色谱柱中使用的顺序。使用本公开的细胞沉降器装置进行单克隆抗体捕获的一些优点是：(i)细胞培养上清液可以直接装载以与蛋白A珠粒接触，而无需去除通常存在于上清液中的死细胞或细胞碎片；以及(ii)使所有悬浮的珠粒与进入的上清液更有效地立即接触，而不是将单克隆抗体逐渐或延迟暴露于柱后部的珠粒固定床。当亲和柱色谱法被悬浮在本公开实施方案的沉降器装置内部的蛋白A珠粒亲和捕获抗体所代替时，消除目前所需的离心和/或深度过滤以去除死细胞和细胞碎片的单元操作将导致显著的成本节省。

通过蛋白A包被的珠粒亲和捕获分泌的抗体产物，然后进行洗涤、洗脱和再生步骤，这可以在单个沉降器中以一系列分批操作进行，或者在一系列沉降器中连续进行。在操作中，在本公开的实施方案的每个沉降器中，蛋白A珠粒将与细胞培养肉汤或不同缓冲液以真正的逆流或错流操作从一个沉降器流向下一沉降器。

实施例11

用于从细胞中原位提取分泌的有机产物的倾析器/细胞沉降器

若干香料和调味化合物的产生和分泌正以代谢方式工程改造至微生物酵母细胞例如酿酒酵母中。这些化合物中的一些化合物对细胞可能更具毒性，并且可以容易地提取到有机液体中以降低细胞毒性以及提高酵母细胞的生产率。来自搅拌槽生物反应器的含有分泌产物的有机液体和含有生产性微生物细胞的水层的乳液可以被泵入本公开的紧凑型细胞沉降器装置的入口端口中。在沉降器的静止区域内，乳液容易地被分离成漂浮在顶部的有机层，并经由顶部端口收获，并且含有活细胞和生产性细胞的水层沉降到底部并经由底部端口再循环到生物反应器。任何细胞碎片都会分级到有机层中，并且容易地从沉降器顶部去除。使水层中的活细胞和生产性细胞返回到生物反应器，以增加灌注生物反应器内部的细胞密度和生产率。

实施例12

各种哺乳动物细胞在用作独立的灌注生物反应器的紧凑型细胞沉降器中的体外扩增

目前，利用无菌单次使用的一次性培养袋作为置于摇摆平台上以用于混合或置于CO₂培养箱内以用于pH控制的生物反应器，各种哺乳动物细胞如干细胞和CAR-T细胞的体外扩增领域正在迅速扩大。这种袋式生物反应器越来越多地以连续灌注模式操作，以使用微滤膜作为袋上的细胞保留装置来去除积聚的废物代谢副产物如氨和乳酸盐，以在扩增期间保持高细胞活力。然而，在延长的灌注操作期间，死细胞和细胞碎片会积聚在这些袋子中，并且无法通过袋子上的微滤膜去除。本公开的细胞沉降器装置可以作为独立的气提生物反应器有效地操作，其以连续灌注的方式操作以引入新鲜的营养物并去除代谢废产物，以及选择性地去除任何死细胞和细胞碎片。底部端口可用作多种气体CO₂、O₂和N₂的受控混合物的入口，以维持生物反应器中所需的pH和DO。通过中心部分的上升空气会夹带或带走一些细胞培养液，在生物反应器中提供营养物的温和混合，并在顶部出口离开，而液体则在沉降器的圆柱形部分中分离，并在圆锥形沉降器上再循环。可以对返回的细胞培养液进行采样，以连续测量pH、DO，将其输入计算机以控制入口气体混合物，并根据需要偶尔采样以测量细胞密度和活力。在所需的细胞扩增后，通过将气流切换到细胞收集袋，经由底部端口收集浓缩的活细胞。我们的细胞沉降器/生物反应器的主要优势在于，它可以轻松去除死细胞和细胞碎片以及有毒的代谢废物副产物，从而在体外扩增后产生高细胞密度的活细胞以用于自体细胞疗法。

实施例13

连续分离沉淀和浓缩的治疗性蛋白质

可以通过添加简单的盐(例如，用于甘精氨酸(glargine)的氯化锌或用于抗体的硫酸铵)，调节pH以及其它溶剂(例如用于甘精氨酸的间甲酚或其它酚类以及用于抗体的乙醇)，使若干治疗性蛋白质(例如胰岛素类似物甘精氨酸和单克隆抗体)沉淀。在这些治疗性蛋白质的下游纯化过程中，这种沉淀是色谱法的低成本替代。当前，这些沉淀步骤以分批模式进行，然后离心或倾析以从沉淀剂中除去上清液。

使用本公开的分离装置，可实施连续分离过程。将富含蛋白质的收获培养基(在通过微滤或离心或其它方法除去任何细胞之后)连同其它所需的化学物质如溶剂或pH调节溶液中的盐如NaOH或HCl一起输入到本公开的紧凑型细胞沉降器中。沉淀过程将在沉降器内部进行，并且富含蛋白质的沉淀剂可以远离蛋白质耗尽的上清液在底部出口连续地被去除，所述蛋白质耗尽的上清液从顶部出口连续地被去除。

实施例14

间充质基质/干细胞(MSC)在微载体珠粒上的离体扩增和扩增干细胞的纯化。

MSC能够在合适的生长培养基存在下离体扩增，并且通常附着在表面，例如组织培养瓶、皮氏培养皿、滚瓶、细胞立方体和微载体珠粒上生长。微载体珠粒(尺寸范围从100微米至500微米)的附着生长非常容易按比例放大，因为它们悬浮在搅拌或搅动的生物反应器中，所述生物反应器针对最佳生长条件(例如pH、温度、溶解氧浓度和营养物浓度)加以控制。然而，将扩增的干细胞与微载体分离是一个挑战，需要进行酶分离，迅速洗去多余的酶，并将干细胞与微载体珠粒分离。当前使用劳动密集型和易污染的批处理步骤来尝试这些不同的步骤。在本公开的生物反应器/细胞沉降器装置中，这些困难步骤中的每一者都可以更容易地完成，所述装置可包括位于旋风分离器壳体内的传感器探针。在一个实施方案中，传感器探针包括荧光探针，以测量旋风分离器壳体内的pH、溶解氧(DO)、葡萄糖浓度、温度和CO₂水平中的一者或多者。更具体来说，在这些沉降器装置中：(i)通过经由底部端口馈入在新鲜的营养培养基中，非常容易经由顶部端口洗涤或除去多余的酶，而较慢沉降的分离细胞和快速沉降的新鲜剥落的微载体珠粒在沉降器内部保持循环；(ii)裸露的微载体珠粒(100-500微米)比干细胞(10-20微米)的沉降速度快得多，并且可以在干细胞在悬浮液中循环的同时被从底部端口除去；以及(iii)最后可以经由底部端口以所需浓度收获扩增的干细胞，以用于后续的细胞治疗应用。

实施例15

在微载体珠粒上共培养基质细胞以分泌必要的生长因子来支持其它分化细胞(例如T淋巴细胞或心肌细胞)的体外扩增或生长

多能干细胞生长和分化为心肌细胞或活化的淋巴细胞(CAR-T细胞)需要昂贵的生长因子来补充至生长生物反应器。通过将所需细胞与将所需生长因子分泌到生长培养基中的工程改造的间充质干细胞(MSC)共同培养，可以降低这种成本。这些分泌生长因子的细胞支持其它所需细胞例如CAR-T细胞、心肌细胞等的生长。这种共培养可在本公开的生物反应器/细胞分选器组合装置内实现，并且此类细胞的生产或扩增成本显著降低。通过以所需流量馈入新鲜培养基以去除扩增的单个细胞或细胞聚集体，同时将较大的微载体珠粒保留在生物反应器/细胞沉降器内部，可以容易地从共培养物中去除扩增的细胞。

实施例16

将任何混合细胞群体(例如来自骨髓)分级或分选为具有期望或不期望特征的若干不同亚群

在向本公开的任何生物反应器/细胞沉降器装置中装入一些初始大剂量的混合细胞群体(例如骨髓细胞)后，我们可以缓慢的逐步增加的流量馈入新鲜的营养培养基，使得最小的细胞(例如血小板、红细胞等)经由顶部流出物流以最低的流量离开，接着是更大的细胞类型(淋巴细胞、单核细胞等)以更高的流量离开，然后是最大的细胞类型(例如巨噬细胞、巨核细胞等)以最高的流量离开。通过以缓慢增加的逐步流量增加营养物进料和顶部流出物流量，可获得单一所需细胞类型的相对纯净的群体，从而留在生物反应器/细胞分选器装置的健康细胞培养生长培养基中，以使得它们可以进一步增殖以供后续使用。

实施例17

通用红细胞的体外生产

正在开发用于将造血干细胞定向分化为红系细胞谱系的新型基因工程方法。原成红细胞(红细胞生成的最早定型阶段)相当大(12-20微米)，高达正常红细胞的三倍大。多染性正成红细胞(红系谱系的后续阶段)比原成红细胞小(12-15微米)。正色性正成红细胞(有核的红系前体细胞)更小(8-12微米)，接着是更小的成熟去核红细胞。(Geiler,C.等人,International Journal of Stem Cells,9:53-59)。基于本公开的生物反应器/细胞分选器装置的大小分级能力，保留了所有较大的前体细胞，并且仅从装置的顶部流出物中去除了最小的成熟去核红细胞，而所有较大的前体细胞在生物反应器/细胞分选器装置内不断扩增。

实施例18

大规模血小板生产

在基本水平上越来越多地理解了高倍体巨核细胞在受控生物反应器培养条件中的离体扩增及其剪切成较小的血小板细胞的能力(Panuganti,S.等人,TissueEngineering Part A,19:998-1014)。随着这种理解的进一步发展，可以获得这些必要的培养参数并在这些生物反应器/细胞分选器装置内控制以用于巨核细胞的生长和分化，同时经由顶部出口从沉降器仅收获成熟的剪切下来的较小的血小板。

为了提供额外的背景知识、上下文，并进一步满足35U.S.C.§112的书面说明要求，以下参考文献通过引用整体并入本文：美国专利5,624,580，美国专利申请公开2009/159523，美国专利申请公开2011/097800，美国专利申请公开2012/180662，美国专利申请公开2014/011270。

已经出于说明和描述的目的提供了本公开的前述实施例。这些实施例并非旨在将本公开限制为本文公开的形式。因此，与本公开的描述的教导以及相关领域的技术或知识相称的变形和修改在本公开的范围内。本文提供的实施例中描述的特定实施方案旨在进一步解释已知用于实践本公开的最佳模式，并使本领域的其它技术人员能够以此类实施方案或其它实施方案利用本公开，并进行本公开的特定应用或用途所需的各种修改。意图将所附权利要求解释为包括现有技术所允许的程度的替代实施方案。

Claims (23)

1.一种沉降装置，所述沉降装置包括：

上部圆锥形部分，所述上部圆锥形部分具有至少一个端口；

圆柱形部分；

下部圆锥形部分，所述下部圆锥形部分具有至少一个端口；以及

位于所述沉降装置内的圆锥体的堆叠体，所述圆锥体的堆叠体中的每个圆锥体包括小开口和大开口，所述小开口朝着所述上部圆锥形部分和所述下部圆锥形开口中的一者定向，所述圆锥体的堆叠体通常围绕所述沉降装置的纵轴居中。

2.如权利要求1所述的沉降装置，其中所述圆锥体的堆叠体中的至少一个圆锥体由金属、塑料和玻璃中的一者构成。

3.如权利要求1所述的沉降装置，其中上部壳体还包括第一凸缘，所述第一凸缘被配置为与下部壳体的第二凸缘啮合。

4.如权利要求1所述的沉降装置，其中所述圆锥体的第一堆叠体中的圆锥体的表面相对于所述纵轴成大约25度至约85度之间的角度。

5.如权利要求1所述的沉降装置，其中所述第一圆锥形部分和所述第二圆锥形部分朝着所述纵轴向内凹入。

6.如权利要求6所述的沉降装置，其中圆锥体主体的纵向横截面形成具有弓形形状的线。

7.如权利要求1所述的沉降装置，其中所述第一圆锥形部分朝着所述纵轴向内凹入，并且所述第二圆锥形部分远离所述纵轴向外凹入。

8.如权利要求7所述的沉降装置，所述沉降装置还包括位于所述沉降装置内的圆锥体的第二堆叠体，所述圆锥体的第二堆叠体中的每个圆锥体包括远离所述第一圆锥形部分定向的小开口和朝着所述第一圆锥形部分定向的大开口。

9.如权利要求8所述的沉降装置，其中所述圆锥体的第二堆叠体中的圆锥体具有远离所述纵轴向外凹入的主体。

10.如权利要求1所述的沉降装置，所述沉降装置还包括传感器以测量所述沉降装置内的状况。

11.如权利要求10所述的沉降装置，其中所述传感器包括荧光探针；以及其中以下之一：

靠近所述传感器的第二圆锥形部分的至少一部分是透明或半透明的；以及

所述第二圆锥形部分是透明或半透明的。

12.如权利要求10所述的沉降装置，其中所述传感器可操作以测量pH、溶解氧(DO)、葡萄糖、温度和溶解CO₂(pCO₂)中的至少一者。

13.一种沉降在悬浮液中的颗粒的方法，所述方法包括：

(a)将颗粒的液体悬浮液引入沉降装置中，所述沉降装置包括：

上部壳体，所述上部壳体具有第一圆锥形部分、第一圆柱形部分和至少一个端口；

下部壳体，所述下部壳体可与所述上部壳体互连，并包括第二圆锥形部分、第二圆柱形部分和至少一个端口；以及

位于所述沉降装置内的圆锥体的堆叠体，所述圆锥体的堆叠体中的每个圆锥体包括朝着所述第一圆锥形部分定向的小开口，并具有朝着所述沉降装置的纵轴向内凹入的主体；

(b)从所述上部壳体的至少一个端口收集澄清的液体；以及

(c)从所述下部壳体的至少一个端口收集浓缩的液体悬浮液。

14.如权利要求13所述的方法，其中所述液体悬浮液包括以下中的至少一者：重组细胞悬浮液，酒精发酵，固体催化剂颗粒的悬浮液，市政废水，工业废水，哺乳动物细胞，细菌细胞，酵母细胞，植物细胞，藻类细胞，植物细胞，哺乳动物和/或鼠类杂交瘤细胞，干细胞，CAR-T细胞，红血前体和成熟细胞，心肌细胞或在微载体珠粒上附着生长的其它易于附着的细胞，啤酒中的酵母，和真核细胞。

15.如权利要求13所述的方法，其中所述液体悬浮液包括以下中的至少一者：

(a)重组微生物细胞，其选自巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、黑曲霉(Aspergillus niger)、大肠埃希氏菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)和其它微生物细胞中的至少一者；以及

(b)非细胞颗粒，例如用于附着干细胞生长的微载体珠粒、亲和配体包被的微球珠粒或树脂以及表面活化的微球珠粒中的一者或多者。

16.如权利要求13所述的方法，其中引入液体悬浮液包括将所述液体悬浮液从一次性塑料生物反应器袋引导到所述沉降装置中。

17.如权利要求13所述的方法，其中所收集的澄清的液体包括生物分子、有机或无机化合物、化学反应物和化学反应产物中的至少一者。

18.如权利要求13所述的方法，其中所收集的澄清的液体包括烃、多肽、蛋白质、醇、脂肪酸、激素、碳水化合物、抗体、糖蛋白、萜烯、类异戊二烯、聚类戊二烯、香料和调味化合物以及啤酒中的至少一者。

19.如权利要求13所述的方法，其中所收集的澄清的液体包括生物柴油、胰岛素或其类似物、巴西甜蛋白、抗体、生长因子、集落刺激因子和促红细胞生成素(EPO)中的至少一者。

20.如权利要求13所述的方法，所述方法还包括将流体引入与所述上部壳体和所述下部壳体中的至少一者相关联的流体护套。

21.如权利要求13所述的方法，所述方法还包括从位于所述沉降装置内的传感器收集数据，所述传感器可操作以测量pH、DO、葡萄糖、温度和pCO₂中的至少一者。

22.如权利要求21所述的方法，所述方法还包括使用从所述传感器接收的数据来调节所述沉降装置内的pH、温度、溶解氧浓度、溶解二氧化碳和营养物浓度中的一者或多者。

23.如权利要求13所述的方法，所述方法还包括将圆锥体的第二堆叠体定位在所述沉降装置内，所述圆锥体的第二堆叠体中的圆锥体具有远离所述沉降装置的纵轴向外凹入的主体。

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