JP7187151B2 - 生存細胞の画像解析のための方法及び装置 - Google Patents
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Description
本出願は、2015年4月10日に出願された米国仮出願第62/145,730号と、2015年6月23日に出願された米国仮出願第62/183,703号とに基づいて、米国特許法第119条(e)のもとでの利益を主張する。ここで、両願とも、「生存細胞の画像解析のための方法及び装置」と題する出願であって、これらの各出願は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本発明は、部分的には、細胞培養で成長させたヒト患者特異的及び制御iPS細胞由来ニューロンを解析する方法を提供する。本明細書に記載されるように、生細胞イメージングは、有意な期間にわたる運動ニューロンのようなニューロンにおける早期及び後期の変化を含む変化を視覚化するために用いられた。この新しい方法は、次の目的で使用できる。
(a)疾患プロセスの非常に早い段階でニューロンに生じる、細胞の変化を発見する
(b)単一細胞を追跡することによって、異種培養物中の多くの異なるタイプの細胞を研究する。
(c)早期表現型の強固な検出に基づいてアッセイを確立する。
(d)細胞がまだ比較的健全な時にこれらの早期段階を阻止するように作用する潜在的な治療法のスクリーニング及びテストを行うこと。
本発明は、ニューロンを生産し、それらをマルチウェルプレートに播種し、それらの成長、発達、増殖などに寄与する環境下で一定期間にわたってそれらを培養し、連続的であろうと離散的な時間間隔であろうと(例えば、Nikon BioStation CTを用いて達成することができるように)細胞をライブイメージングする能力を依然として維持する間、位相差及び蛍光観察法を用いて個々の細胞の多くの特徴を測定し、それらの特徴が時間とともにどのように変化するかを定量化し、時間の経過とともに多数の単一細胞から収集されたデータを解析することを含む方法に関する。
(1)神経栄養因子(TF)の除去、及び
(2)プロテアソーム阻害剤MG132による処理。
多くのMNを解析することにより、我々は、神経突起の変化を注意深く測定することを含む、細胞死のための新しい形態学的な予測因子を定義した。この解析アルゴリズムは、各MNに対して「健全な時間(HT)」を判定し、この測定は、終了点解析では明らかにではない生存応答の動態を明らかにする。疾患発症の指標として破壊された神経突起を定量化することが有利であり、その理由は、これらの変化は死滅のプロセスの早期に起こり、生存細胞を計数することによって見られるものよりも高い感受性を提供するように見えるからである。
上述したように、細胞の分化を誘導しながら、幹細胞又は体細胞由来の細胞を用いて薬効を評価する場合、分化の状態及び細胞の成熟度は、細胞の起源及び/又は培養条件に依存することが知られている。加えて、所与の薬剤の有効性を評価する場合、分化の状態及び細胞の成熟度に起因する薬剤応答については知られている。
前記判定装置は、
培養物中の細胞の画像に含まれかつ細胞体及びノードによって構成される細胞体のうち、少なくとも所定数のノードを有する細胞体の個数に基づく値を計算する計算部を備え、
所定数のノードはあるタイプの細胞に対応し、
前記判定装置は、
前記計算部により計算された値が、ユーザの入力に応じた所定の条件を満たすか否かを判定する第1の判定部と、
前記第1の判定部がその値が所定の条件を満たすことを判定するときに、薬剤を投与するタイミングを示す情報を出力する出力部とを備える。
培養物中の細胞の画像に含まれかつ細胞体及びノードによって構成される細胞体のうち、少なくとも所定数のノードを有する細胞体の個数に基づく値を計算する計算ステップを実行し、ここで、所定数のノードはあるタイプの細胞に対応し、
前記コンピュータは、
前記計算ステップにより計算された値がユーザの入力に応じた所定の条件を満たすか否かを判定する第1の判定ステップと、
前記第1の判定ステップによりその値が所定の条件を満たすことを示すときに、薬剤を投与するタイミングを示す情報を出力する出力ステップとを実行する。
培養物中の細胞の画像に含まれかつ細胞体及びノードによって構成される細胞体のうち、少なくとも所定数のノードを有する細胞体の個数に基づく値を計算する計算ステップを含み、ここで、所定数のノードはあるタイプの細胞に対応し、
前記細胞の生産方法は、
前記計算ステップにより計算された値がユーザの入力に応じた所定の条件を満たすか否かを判定する第1の判定ステップと、
前記第1の判定ステップによりその値が所定の条件を満たすことを判定したときに、薬剤を投与するタイミングを示す情報を出力する出力ステップとを含む。
加えて、線状構造を有する細胞とは、例えば、神経突起又はデンドロンを有する細胞体によって構成される細胞をいう。
・誘導フェーズ
・細胞増殖フェーズ
・成熟フェーズ
(a)各培養容器19を示す指標データ;
(b)ストッカー21内の培養容器19の収容位置;
(c)培養容器19のタイプ及び形状(ウェルプレート、皿、フラスコ等)及び生産者名;
(d)培養容器19中の培養細胞のタイプ(細胞タイプ情報);
(e)培養容器19の観察スケジュール;
(f)時間経過観察時の撮像条件(対物レンズの倍率、血管内の観察位置等);
(g)培養容器19内の培養物中の細胞に投与される薬剤のタイプ(薬剤タイプ情報)を含む。
加えて、複数の小血管の細胞を同時に培養することができる培養容器19では、ウェルプレートの場合のように、各小血管について管理データがそれぞれ生成される。
観察時間が到来したか?
培養容器を観察部に搬送する
細胞タイプ情報を取得する
医薬品のタイプに関する情報を取得する
撮像された画像を読み出す
細胞体数及びノード数を検出する
少なくとも3個のノードで存在する細胞体の比を計算する
通知条件が満たされているか?
通知したか?
薬剤投与タイミングを示す情報を出力する
細胞状態を判定する
細胞の状態は変化したか?
細胞の状態を示す情報を出力する
培養容器をスタッカーに搬送する
刺激に対する細胞応答のための従来技術の方法は、細胞培養物、細胞株、培養パラメータなどに内在する多様性のために欠点を有する。このことは、例えば、患者特異的なiPS細胞などの、患者特異的な多能性幹細胞からの分化した細胞集団などの患者特異的な細胞を扱う場合である。所与の細胞集団をより正確に解析し、それぞれが異なる患者から同時に任意選択でそのような集団の数を解析するためには、本明細書で提供される方法は、エンドユーザが他の細胞集団とは独立して各細胞集団内の変化を追跡することを可能にする。この方法では複数の解析を同時に行うことができるが、個々の集団のベースライン特性及び応答に関して微調整された分解能を有する。加えて、これらのアッセイにおける読み出しは、典型的には生存性がなく、又は生存能力がないため、アッセイをより迅速に行うことができる。このことは、標的集団の死滅よりむしろ機能不全を伴う特定の疾患又は状態のモデルである細胞集団を研究する場合に特に重要である。疾患又は状態が標的集団の死滅に関連している状況であっても、本明細書に記載され提供されるアッセイは、細胞死の早期マーカーを同定するために使用されることができ、従って、そのようなマーカー及び細胞死の上流の事象に影響を及ぼし得る培地の同定を可能にするかもしれない。このように、これらの方法は、疾患の経過を変えることがより難しい後の段階ではなくむしろ、それらのプロセス又は進行の早い時期に特定の疾患又は状態に影響を及ぼすために使用され得る。
(a)個々の培養容器19を示すための指標データ、
(b)ストッカー21内の培養容器19の保管場所、
(c)培養容器19(ウェルプレート、皿、フラスコ等)のタイプ及び形状、生産者名、
(d)培養容器19内で培養される細胞タイプ(細胞タイプ情報)、
(e)培養容器19内の観察スケジュール、
(f)時間経過観察用の撮像パラメータ(対物レンズ倍率、容器内の観察点など)、
(g)培養容器19内で培養される細胞に投与される薬剤のタイプ(薬剤タイプ情報)等
を含む。ウェルプレートのような、複数の小型容器内で細胞を同時に培養できる培養容器19のために、個々の小容器毎にそれぞれの管理データが生成される。
制御装置41を備えた培養器11の処理手順について図5を参照して以下に説明する。図5は、制御装置41を備えた培養器11による処理の一例を示すフローチャートである。この実施形態では、例えば、前記観察対象である特定のタイプのニューロンを示す細胞タイプ情報と、前記ニューロンに投与される薬剤のタイプを示す薬剤タイプ情報などの、観察のための各種パラメータを示す情報(以下、「観察パラメータ」と略記する)は予め取得して記憶しておく。
検出部434が細胞体及び細胞体当たりのノードを検出した後、時間的変化計算部436は、検出部434によって検出された細胞体当たりの細胞体及びノードと、様々な細胞体及び様々なノードを相関させる細胞体同定情報とに基づいて、細胞体数の時間的変化と細胞体当たりのノード数Nの時間的変化をそれぞれ計算する。次いで、時間的変化取得部438は、時間的変化計算部436により計算された、細胞体数の時間的変化と細胞体当たりのノード数Nの時間的変化を取得する(ステップS108)。
培養容器を観察装置に搬送する
観察パラメータを取得する
画像データを取得する
細胞体計数値の時間的変化及びノード計数値Nの時間的変化を取得する
ノード計数値N≧しきい値Nthであるか?
画像データを取得する
細胞体計数値の時間的変化及びノード計数値Nの時間的変化を取得する
ノード計数値N≧しきい値Vthであるか?
クロックの計時を停止する
細胞の健全期間を示す情報を出力する
観察を終了するか?
培養容器をストッカーに搬送する
ホームページ(又は表示環境)を提示するための環境を含んでもよい。
一例として、ストレス回復性の刺激は、栄養因子を運動ニューロン細胞培養物に添加することである。本明細書で提供されるプロセス及び方法は、運動ニューロンの集団ならびに個々の運動ニューロンに対するこのような刺激の効果を評価するために使用され得る。運動ニューロンは、例えば、培養物中の細胞体数、細胞当たりのノード数、神経突起長、0,1,2,3,4又はそれ以上のノードを有する細胞の分布、個々のニューロンが3個以上のノードを有する時間(場合によっては「健全な時間」と呼ばれる)などに従って評価することができる。
12 上部筐体
13 下部筐体
15 恒温槽/恒温槽
15a 温度調整装置/温度調整装置
15b 湿度調整装置/湿度調整装置
16 大扉
17 中扉
18 小扉
19 培養容器/培養容器
21 ストッカー
22 観察部
23 容器搬送装置/容器搬送装置
24 搬送台/搬送台
31 サンプル台/サンプル台
32 台アーム
33 本体部/本体部
34 撮像装置
35 回転ステージ
35a 回転シャフト
36 ミニステージ
37 アーム部
38 垂直ロボット
39 LED光源
41 制御装置
42 記憶部
42A 入力部
43 入力受付部
43A 制御部/制御部
45 出力部
45A 表示部/表示部
46 制御部
46A 記憶部
432 画像データ取得部
434 検出部
436 時間的変化計算部
438 時間的変化取得部
440 タイミング計算部
442 出力部
461 画像読取部
462 検出部
463 計算部
464 第1の判定部
465 第2の判定部
466 出力制御部
467 記憶制御部
Claims (16)
- 細胞集団をインビトロで培養することと、
連続的に又は離散的な時間間隔でのいずれかの期間にわたって細胞集団内の標的細胞の画像を繰り返し取得することと、
個々の前記標的細胞に対する前記画像の解析に基づいて、個々の前記標的細胞のマーカーの変化を検出することと、
を含み、
前記標的細胞はニューロンであり、
前記標的細胞のマーカーはニューロン当たりのノード数であり、
前記ノード数はニューロン細胞体と神経突起との間の物理的位置の数であり、
個々の前記標的細胞のマーカーの変化を検出することは、前記標的細胞の個々のニューロンのノード数の時間的変化を検出し、前記標的細胞に対する刺激の効果を判定することを含む、
刺激を判定する方法。 - 前記標的細胞は運動ニューロンであり、前記標的細胞は個々に解析される請求項1に記載の刺激を判定する方法。
- ある割合の所定の表現型を有する標的細胞が存在するまで細胞集団を培養することをさらに含み、
前記表現型はニューロン当たりのノード数である、
請求項1又は2に記載の刺激を判定する方法。 - 所定の表現型は健全な表現型である請求項3に記載の刺激を判定する方法。
- 細胞培養物中の標的細胞を刺激と接触させることと、ここで、前記標的細胞は異種細胞集団中に存在し、
連続的に又は離散的な時間間隔でのいずれかの期間にわたって標的細胞の画像を繰り返し取得することと、
個々の前記標的細胞に対する前記画像の解析に基づいて、個々の前記標的細胞のマーカーの変化を検出することと
を含み、
前記標的細胞はニューロンであり、
前記標的細胞のマーカーはニューロン当たりのノード数であり、
前記ノード数はニューロン細胞体と神経突起との間の物理的位置の数であり、
個々の前記標的細胞のマーカーの変化を検出することは、前記標的細胞の個々のニューロンのノード数の時間的変化を検出し、前記標的細胞に対する刺激の効果を判定することを含む、
刺激を判定する方法。 - 前記マーカーの変化は、前記刺激に対するマーカーを曝露前及び曝露後に測定して比較することによって判定される請求項5に記載の刺激を判定する方法。
- 前記マーカーの変化は、正常標的細胞と疾患標的細胞の両方における刺激に対するマーカーを曝露後に測定して比較することによって判定される請求項5に記載の刺激を判定する方法。
- 前記標的細胞は、多能性幹細胞のインビトロ分化によって得られる請求項5~7のうちのいずれか1つに記載の刺激を判定する方法。
- 前記多能性幹細胞は、神経学的障害を有するヒト被験者由来の誘導多能性幹細胞である請求項8に記載の刺激を判定する方法。
- 少なくとも1つのプロセッサと、
記憶媒体上に符号化した実行可能命令を有する記憶媒体であって、前記実行可能命令が前記少なくとも1つのプロセッサによって実行されるとき、前記少なくとも1つのプロセッサに対して方法を実行させる記憶媒体とを備えた判定装置であって、
前記方法は、
培養中の細胞でありかつ細胞体とノードとを備える細胞の画像に含まれる細胞体の数と、前記各細胞体に対するノード数とを検出することと、ここで、前記ノード数はニューロン細胞体と神経突起との間の物理的位置の数であり、
前記細胞の画像に含まれる細胞体のうち、少なくとも所定数のノードを有する細胞体の数に基づいて値を計算することと、ここで、前記少なくとも所定数のノードは少なくともいくつかの細胞の細胞種に対応し、
前記値がユーザ入力に対応する所定の条件を満たすか否かを判定することと、
前記値が前記所定の条件を満たすと判定したことに応答して、薬剤を投与するタイミングを示す情報を出力することとを含み、
前記値を計算することは、前記細胞体の数と、前記各細胞体に対するノード数とに少なくとも部分的に基づいて前記値を計算することを含み、
前記細胞及び前記細胞種はニューロンであり、
前記細胞体の数と、前記各細胞体に対するノード数とを検出することは、前記ニューロンの数と、個々の前記ニューロンのノード数との各時間的変化を検出し、前記細胞に対する刺激の効果を判定することを含む、
判定装置。 - 前記方法はさらに、複数の所定の判定条件と、前記細胞の状態を示す情報とが協調される状態判定情報を記憶することと、
前記状態判定情報を読み出し、現時点よりも所定時間前の期間において前記値の変化率が前記複数の所定の判定条件のいずれかを満たしていることを判定することとを含み、
前記出力することはさらに、前記変化率が複数の所定の判定条件のうちの少なくとも1つを満たすと判定したことに応答して、前記変化率によって満たされる前記複数の所定の判定条件と調整された前記細胞の状態を示す情報を出力することを含む請求項10に記載の判定装置。 - 記憶媒体上に符号化した実行可能命令を有する少なくとも1つのコンピュータにより読出可能な記憶媒体であって、
前記記憶媒体は、前記実行可能命令が前記少なくとも1つのプロセッサによって実行されるとき、前記少なくとも1つのプロセッサに対して方法を実行させ、
前記方法は、
培養中の細胞でありかつ細胞体とノードとを備える細胞の画像に含まれる細胞体の数と、前記各細胞体に対するノード数とを検出することと、ここで、前記ノード数はニューロン細胞体と神経突起との間の物理的位置の数であり、
前記細胞の画像に含まれる細胞体のうち、少なくとも所定数のノードを有する細胞体の数に基づいて値を計算することと、ここで、前記少なくとも所定数のノードは少なくともいくつかの細胞の細胞種に対応し、
前記値がユーザ入力に対応する所定の条件を満たすか否かを判定することと、
前記値が前記所定の条件を満たすと判定したことに応答して、薬剤を投与するタイミングを示す情報を出力することとを含み、
前記値を計算することは、前記細胞体の数と、前記各細胞体に対するノード数とに少なくとも部分的に基づいて前記値を計算することを含み、
前記細胞及び前記細胞種はニューロンであり、
前記細胞体の数と、前記各細胞体に対するノード数とを検出することは、前記ニューロンの数と、個々の前記ニューロンのノード数との各時間的変化を検出し、前記細胞に対する刺激の効果を判定することを含む、
記憶媒体。 - 少なくとも1つのプロセッサと、
記憶媒体上に符号化した実行可能命令を有する記憶媒体であって、前記実行可能命令が前記少なくとも1つのプロセッサによって実行されるとき、前記少なくとも1つのプロセッサに対して方法を実行させる記憶媒体とを備えた判定装置であって、
前記方法は、
細胞の取得された時系列画像に示される個々の前記細胞のノード数の時間的変化を取得することと、ここで、前記ノード数はニューロン細胞体と神経突起との間の物理的位置の数であり、
前記取得することにおいて前記取得された細胞のノード数の時間的変化に基づいて、前記ノード数がしきい値以上になったときから前記ノード数がしきい値未満になるまでの時間期間を計算することと、
前記時間期間を示す情報を出力することとを含み、
前記細胞はニューロンであり、
個々の前記細胞のノード数の時間的変化を取得することは、個々の前記ニューロンのノード数の時間的変化を取得し、前記細胞に対する刺激の効果を判定することを含む、
判定装置。 - 前記取得することは、前記取得したノード数の時系列変化を平滑化する請求項13に記載の判定装置。
- 前記取得することはさらに、細胞数の時間的変化を取得し、
前記時間期間を計算することは、前記細胞のノード数の時間的変化と、前記取得した細胞数の時間的変化とに基づいて、前記取得することにおいて前記取得されたノード数と、前記取得されたノード数がしきい値以上であるときの細胞数との比が所定値以上になるときから、前記比が前記所定数未満になるまでの時間期間を計算することを含む請求項13又は14に記載の判定装置。 - 前記方法はさらに、前記細胞の取得された時系列画像から前記細胞内のノードを検出することを含み、
前記取得することは、前記検出することにおいて前記検出されたノード数の時間的変化を取得することを含む請求項13~15のうちのいずれか1つに記載の判定装置。
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