JP3775223B2

JP3775223B2 - 線状構造を有する細胞体の評価方法

Info

Publication number: JP3775223B2
Application number: JP2001004686A
Authority: JP
Inventors: 寛司八尋
Original assignee: Panasonic Corp; Matsushita Electric Industrial Co Ltd
Current assignee: Panasonic Corp; Panasonic Holdings Corp
Priority date: 2001-01-12
Filing date: 2001-01-12
Publication date: 2006-05-17
Anticipated expiration: 2021-01-12
Also published as: JP2002207993A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、神経細胞の神経突起や樹状突起などの線状構造を有する細胞体の状態を定量的に評価する線状構造を有する細胞体の評価方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
生化学分野における各種の試験では、動植物の細胞や微生物などの生体試料を種々の条件下で培養し観察することが行われる。そして観察においては顕微観察によって得られた画像から、特定項目についての数値データを抽出する評価が行われ、例えば神経細胞が観察対象である場合には、神経細胞から延びる線状の神経突起の伸長度合いを数値化した数値データを求める処置が行われる。従来はこのような生体試料を対象とした評価は専ら人手に依存しており、実験担当者が顕微鏡視野内で神経細胞を目視によって観察し、観察対象部位に注目して計数対象となる箇所のカウントやスケールとの目視対比によるサイズ抽出などの数値データ化を行い記録するという作業を行っていた。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
ところがこのような観察作業は、作業自体が多大の手間と時間を要する煩瑣な作業であり、この観察によって実験作業全体の効率の低下を招くとともに、実験担当者に過大の作業負荷を強いることとなっていた。また、観察結果をデータ化する際には、一般に全試料中から適宜抜き出されたサンプルとしての計測エリアを対象としてサイズ測定やカウントなどの数値データ抽出が行われるが、計測エリアによっては必ずしも計測目的にかなった適切な計測結果が得られない場合がある。
【０００４】
例えば上述の神経細胞の神経突起の伸長度合いを計測する際に、細胞が過度に集中して増殖したような範囲を計測エリアとして抜き出すと、伸長した突起が増殖した細胞の陰に隠れて観察されない結果、必ずしも正しい伸長度合いを示すデータが得られない場合があった。そして従来はこのような計測エリアの選択を含めて、観察作業は全て作業者の勘と経験に依存していたため、個人の熟練度・技量によってデータの精度・信頼性に大きなばらつきを生じていた。このように従来の生体試料の評価には、効率よく客観性の高い数値データを抽出することが困難であるという問題点があった。
【０００５】
そこで本発明は、神経細胞など線状構造を有する細胞体の状態の定量評価を効率よく高精度で行うことができる線状構造を有する細胞体の評価方法を提供することを目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
請求項１記載の線状構造を有する細胞体の評価方法は、線状構造を有する複数の細胞体を撮像して得られた画像データから当該複数の細胞体の状態を示す数値データを取得する線状構造を有する細胞体の評価方法であって、画像データを画像処理することにより前記複数の細胞体およびこれらの細胞体から延伸する複数の線状構造の数量をそれぞれ定量化する細胞体数量指標および線状構造数量指標を求め、これらの線状構造数量指標と細胞体数量指標とに基づいて細胞体１個当たりの線状構造の数量を示す数値指標を求めるものであり、前記線状構造数量指標は、複数の細胞体から延伸する複数の線状構造の長さ（Ｌ）およびまたは面積（Ｓ１）であり、また前記細胞体数量指標は、複数の細胞体の個数（Ｎ）およびまたは面積（Ｓ２）であり、また前記細胞体が神経細胞であり、前記線状構造が神経細胞から延伸する神経突起である。
請求項２記載の線状構造を有する細胞体の評価方法は、請求項１記載の線状構造を有する細胞体の評価方法であって、前記画像処理によって線状構造部を消去した画像より前記細胞体数量指標を求め、線状構造部を抽出した画像より前記線状構造数量指標を求めるものである。
【００１０】
本発明によれば、線状構造を有する細胞体を撮像して得られた画像データから細胞体および線状構造の数量をそれぞれ定量化する細胞体数量指標および線状構造数量指標を求め、線状構造数量指標と細胞体数量指標とに基づいて細胞体１個当たりの線状構造の数量を示す数値指標を求めることにより、細胞体の状態の定量評価を効率よく高精度で行うことができる。
【００１１】
【発明の実施の形態】
次に本発明の実施の形態を図面を参照して説明する。図１は本発明の一実施の形態の生体試料の評価装置の斜視図、図２は本発明の一実施の形態の生体試料の評価装置の構成を示すブロック図、図３は本発明の一実施の形態の生体試料の評価装置の機能を示す機能ブロック図、図４、図５は本発明の一実施の形態の生体試料の評価装置の基本動作プログラムの処理フロー図、図６は本発明の一実施の形態の生体試料の評価装置による生体試料の画像図である。
【００１２】
まず図１、図２を参照して生体試料の評価装置について説明する。この生体試料の評価装置は、容器に収容された神経細胞などの生体試料の状態を評価する数値データを抽出するために用いられる。図１において生体試料の評価装置１は、架台２上に顕微観察部３および操作・演算部４を並置して構成されている。顕微観察部３は、筐体５の内部に内蔵されたカメラ（後述）、動植物の細胞などの生体試料の容器であるマイクロプレート７を保持する試料テーブル６を備えており、カメラによって光学系８を介して試料テーブル６上のマイクロプレート７に収容された生体試料の顕微鏡画像を撮像する。また、顕微観察部３は接眼レンズ９を備えており、マイクロプレート７内の生体試料を接眼レンズ９を介して目視により観察できるようになっている。
【００１３】
操作・演算部４にはパーソナルコンピュータ１０が配置されており、顕微観察部３によって撮像された画像をモニタ１０ａ上で表示することができるようになっている。また入力画面や操作画面をモニタ１０ａに表示させることにより、キーボード１０ｂやマウス１０ｃによって各種データや操作コマンドの入力が行われる。
【００１４】
次に図２を参照して顕微観察部３および制御系の構成を説明する。図２においてマイクロプレート７には生体試料を収容する試料収容部であるウエル７ａが格子状に多数設けられている。マイクロプレート７は試料テーブル６に保持されており、試料テーブル６はテーブル移動機構１１によってＸＹ方向に水平移動する。試料テーブル６の下方には光学系８およびカメラ１３が配設されており、カメラ１３は試料テーブル６の上方に配置された照明部１２によって照明されたウエル７ａ内の生体試料を撮像する。したがってカメラ１３は容器内の生体試料の顕微鏡画像を撮像する撮像手段となっている。光学系８およびテーブル移動機構１１は、機構制御部１４によって制御される。テーブル移動機構１１は、カメラ１３に対してマイクロプレート７を相対的に移動させる移動手段となっている。これにより、所望のウエル７ａの所望の位置にカメラ１３による撮像視野を移動させることができ、したがってウエル７ａ内の生体試料を撮像して得られる画像中に、数値データ抽出対象として設定される計測エリアを所望の位置に移動させて変更することができる。
【００１５】
処理部１５はＣＰＵであり、データ記憶部１８に記憶されたデータに基づきプログラム格納部１９に格納された各種プログラムを実行することにより、各種演算・処理を行う。第１画像記憶部１６は、カメラ１３によって撮像された画像データを記憶する。第２画像記憶部１７は、第１画像記憶部１６から読み出された画像データを画像処理した結果の処理画像を記憶する。
【００１６】
データ記憶部１８には、前提条件１８ａなどの各種データが記憶されている。前提条件１８ａは、評価対象の画像から数値データを適正に抽出することができる条件として予め設定された条件である。この前提条件１８ａとしては、例えば画像中に数値データ抽出用のサンプルエリアとして設定される計測エリア中の細胞体の個数や、面積の総和が適正範囲内にあること、などを内容として設定される。
【００１７】
プログラム格納部１９には、基本動作プログラム１９ａ、前提条件合否判定プログラム１９ｂ，数値化処理プログラム１９ｃ、評価プログラム１９ｄが格納されている。基本動作プログラム１９ａは、生体試料の評価装置１による基本動作の処理プログラムである。前提条件合否判定プログラム１９ｂは、数値データを抽出する対象とされている画像が、評価対象の画像から数値データを適正に抽出することができる条件として予め設定された前提条件と合致しているか否かを判定する処理を行うためのプログラムである。本実施の形態では、上述のように計測エリア内の細胞体の数や面積が予め設定された範囲内にあることが前提条件として設定される。
【００１８】
数値化処理プログラム１９ｃは、評価対象の画像から目的とする数値データを抽出する数値化処理を行うプログラムである。本実施の形態では、計測エリア内の細胞体（神経細胞）から延伸する線状構造（神経突起）の伸長度合いを示す数値指標として、線状構造の長さや面積を数値データとして求める例を示している。
【００１９】
評価プログラム１９ｄは、求められた数値データを所定形式でグラフ化して視覚的評価を可能にする処理や、数値データを予め設定された基準値と比較し比較結果を図示する処理など、各種の評価処理を行うプログラムである。
【００２０】
操作・入力部２０は、パーソナルコンピュータ１０のキーボード１０ｂやマウス１０ｃであり、操作画面上での入力操作を行う。表示部２１はパーソナルコンピュータ１０のモニタ１０ａであり、撮像された画像や操作画面の表示を行う。数値化データ記憶部２２は、撮像画面を数値化処理して得られた各種の数値データを記憶する。記憶媒体アクセス手段２３はＣＤ−ＲＯＭやフロッピーディスクなどの外部記憶媒体２３ａのドライブ装置である。前述の基本動作プログラム１９ａ、前提条件合否判定プログラム１９ｂ、数値化処理プログラム１９ｃ、評価プログラム１９ｄを格納した外部記憶媒体２３ａからこれらのプログラムを読み取ることにより、入力、記憶、演算、表示の各機能を備えた一般のパーソナルコンピュータを、生体試料の評価装置の処理演算部として用いることができる。
【００２１】
次に図３を参照して、生体試料の評価装置の処理機能を説明する。図３において、前提条件合否判定手段２４，数値化手段２５，評価手段２６は、それぞれ前提条件合否判定プログラム１９ｂ，数値化処理プログラム１９ｃ，評価プログラム１９ｄを処理部１５によって実行することにより実現される処理機能を示している。数値データの抽出に際しては、まず第１画像記憶部１６に記憶された撮像画像は前提条件合否判定手段２４に読み込まれ、ここで前提条件合否判定が行われる。すなわち数値化処理を行う対象の画像が、評価対象の画像から数値データを適正に抽出することができる条件として予め設定された前提条件と合致しているか否かが判定される。
【００２２】
ここで前提条件に合致していると判定された画像は、数値化手段２５による数値化処理の対象となる。そして数値化処理により抽出され数値化された数値化データは、数値化データ記憶部２２に記憶される。記憶された数値化データは、評価手段２６に読み込まれ、これらの数値化データに基づいて各種の評価処理が行われる。また数値化手段２５によって処理された数値化処理画像は、第２画像記憶部１７に記憶される。
【００２３】
前提条件合否判定手段２４によって前提条件に合致していないと判定されたならば、機構制御部１４はテーブル移動機構１１を制御してマイクロプレート７をカメラ１３に対して相対的に移動させ、撮像視野を新たな計測エリアに移動する。これにより、新しい計測エリアが撮像視野内に設定されこの計測エリアを対象として撮像が行われる。すなわち、機構制御部１４は数値データ抽出対象エリアとして設定される計測エリアを変更する計測エリア変更手段となっている。
【００２４】
次に図４、図５を参照して、生体試料の評価装置の基本動作プログラムによって行われる処理フロー図を説明する。図４において、評価対象の生体試料を収容したマイクロプレート７が試料テーブル６上に載置され評価処理が開始されると、まず計測対象のウエル７ａの計測エリアへカメラ１３の撮像視野を移動する（ＳＴ１）。次いで数値化処理カウンターＪ、前提条件不一致カウンターＫを０（ゼロ）に初期化する。
【００２５】
次に前提条件合否判定が行われる。まずカメラ１３により判定対象の画像（図６（ａ）参照）を取り込み（ＳＴ３）、計測エリア内の細胞体数量指標としての細胞数（Ｎ）をカウントする（ＳＴ４）。このカウントは、図６（ａ）に示す画像を画像処理した処理画像に基づいて行われる。すなわち画像内の細胞体３０を示す画像から線状構造部３０ｂを消去して細胞体３０の本体部３０ａのみを残した画像（図６（ｂ）参照）を求め、この処理画像上で、本体部３０ａの個数をカウントすることにより求められる。
【００２６】
次いで求められた細胞数Ｎが、予め設定された前提条件に合致しているか否かを判定する。ここでは細胞数Ｎが（Ａ−Ｂ）と（Ａ＋Ｂ）の間の範囲にあるか否かを判定する（ＳＴ５）。Ａは判定基準となる細胞数Ｎの基準値であり、Ｂは許容範囲幅を示す数値である。そして前提条件に合致しているならば、後述する数値化データ処理（ＳＴ２４）が行われる。
【００２７】
ここで前提条件に合致していないならば、以下の処理が行われる。まず前提条件不一致カウンタ−Ｋの値に１をプラスしてＫ＝Ｋ＋１とおき（ＳＴ６）、このカウンター値Ｋが予め設定された不一致設定回数に到達したか否かを判定する（ＳＴ７）。不一致設定回数に到達していないならば、同一ウエル７ａ内で計測エリアを移動する（ＳＴ８）。すなわち、機構制御部１４によってテーブル移動機構１１を制御し、マイクロプレート７をカメラ１３に対して移動させ、ウエル７ａ内に設定された別の計測エリアをカメラ１３の撮像視野に移動させる。そして再び（ＳＴ３）以降の前提条件合致判定を反復する。
【００２８】
（ＳＴ７）にて不一致設定回数に到達したならば、前提条件変更の可否を判断し（ＳＴ９）、前提条件変更が可能な場合には、前提条件を緩和する処理が行われる（ＳＴ１０）。すなわち、（ＳＴ５）の許容範囲幅を示すＢの値を大きくすることにより、細胞数Ｎの許容範囲を拡大した後、（ＳＴ２）に戻り、以降の処理を反復する。そして前提条件の変更不可の場合には、未計測の計測対象ウエルの有無を判断する（ＳＴ１１）。ここで未計測の計測対象ウエルが有る場合には、計測対象ウエルを当該未計測のウエルに変更した（ＳＴ１２）後に、（ＳＴ２）に戻り、以降の処理を反復する。また（ＳＴ１１）にて未計測の計測対象ウエルがない場合には、計測処理を終了する。
【００２９】
次の図５を参照して、前提条件に合致していると判定された画像について行われる数値化処理について説明する。まず、計測対象画像について、線状構造数量指標としての細胞突起長さ（Ｌ）と、細胞突起面積（Ｓ１）を計測する（ＳＴ２１）。この処理は、図６（ｃ）に示すように、原画像（図６（ａ））から線状構造部３０ｂのみを抽出した処理画像上で、細胞突起に相当する線状構造部３０ｂの長さ、面積を画像処理演算によって求めることにより行われる。なお線状構造数量指標としては、細胞長さ（Ｌ）か細胞突起面積（Ｓ１）のいずれか一方を用いてもよい。
【００３０】
次いで図６（ｂ）に示す処理画像上で、同様に画像処理演算によって本体部３０ａの面積を求めることにより、細胞体数量指標としての細胞数（Ｎ）と細胞体面積（Ｓ２）を計測する（ＳＴ２２）。細胞数（Ｎ）は、（ＳＴ４）で計測した細胞数を利用する場合は、（ＳＴ２２）での計測を省略してもよい。また細胞体数量指標としては、細胞数（Ｎ）または細胞体面積（Ｓ２）のどちらか１つを用いてもよい。
【００３１】
次にこのようにして求められた数値化データ（Ｎ）、（Ｌ）、（Ｓ１）、（Ｓ２）を数値化データ記憶部２２に記憶させる（ＳＴ２３）。そしてこれらの数値化データに基づき、ｄ１＝（Ｌ）／（Ｎ），ｄ２＝（Ｓ１）／（Ｎ），ｄ３＝（Ｌ）／（Ｓ２），ｄ４＝（Ｓ１）／（Ｓ２）を算出する（ＳＴ２４）。算出された数値指標ｄ１，ｄ２，ｄ３，ｄ４は、数値化データ記憶部２２に記憶される（ＳＴ２５）。これらの数値指標は、細胞体１個当たりの線状構造の数量を示すものである。このとき、計測対象となった計測エリアの位置情報と当該計測エリアの画像データも、上記数値指標と関連づけられて記憶される。
【００３２】
なお、上述の数値化処理において、細胞体の個数（Ｎ）、面積（Ｓ２）を求める際に、神経突起を有する細胞体のみを対象とすることが望ましい。これにより、既に神経突起の伸長能力を喪失した細胞体を計測対象に含めることによる誤差を排除することができ、より精度の高い数値データを得ることができる。
【００３３】
この後数値化処理回数カウンターのカウント値Ｊの値に１をプラスしてＪ＝Ｊ＋１とおき（ＳＴ２６）、このカウント値Ｊが予め設定された計測設定回数に到達したか否かを判定する（ＳＴ２７）。計測設定回数に到達していないならば、同一ウエル７ａ内で計測エリアを移動する（ＳＴ８）。すなわち、機構制御部１４によってテーブル移動機構１１を制御し、マイクロプレート７をカメラ１３に対して移動させる。そしてウエル７ａ内の別の計測エリアをカメラ１３の撮像視野内に移動させ、再び（ＳＴ３）以降の前提条件合致判定を反復する。
【００３４】
そして（ＳＴ２７）にて計測設定回数に到達したならば、当該ウエル７ａ内の数値データの平均値算出を行う（ＳＴ２８）。すなわちＤ１＝（ｄ１の合計）／Ｊ、Ｄ２＝（ｄ２の合計）／Ｊ、Ｄ３＝（ｄ３の合計）／Ｊ、Ｄ４＝（ｄ４の合計）／Ｊの演算を行い、求められたＤ１，Ｄ２，Ｄ３，Ｄ４を数値化データ記憶部２２に記憶させる（ＳＴ２９）。この後、図４に示す（ＳＴ１１）に戻り、同様の処理が反復される。
【００３５】
上記説明したように、上記生体試料の評価方法は、神経突起のような線状構造を有する細胞体を撮像して得られた画像データから当該細胞体の状態を示す数値データ、すなわち神経突起の伸長度合いを示す数値データを取得する線状構造を有する細胞体の評価方法において、画像データを画像処理することにより細胞体および線状構造の数量をそれぞれ定量化する細胞体数量指標（細胞体の個数Ｎ、面積Ｓ２）および線状構造数量指標（細胞突起長さＬ、細胞突起面積Ｓ１）を求め、これらの線状構造数量指標と細胞体数量指標に基づいて細胞体１個当たりの線状構造の数量を示す数値指標を求めるものである。
【００３６】
これにより、神経突起の伸長度合いの観察を効率よく行うことができるとともに、観察を行う各担当者の経験・熟練度によってデータ化された結果にばらつきを生じることなく、データの精度・信頼性を確保することができる。
【００３７】
【発明の効果】
本発明によれば、線状構造を有する細胞体を撮像して得られた画像データから細胞体および線状構造の数量をそれぞれ定量化する細胞体数量指標および線状構造数量指標を求め、線状構造数量指標を細胞体数量指標で除して得られる数値を細胞体１個当たりの線状構造の数量を示す指標として求めるようにしたので、細胞体の状態の定量評価を効率よく高精度で行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の一実施の形態の生体試料の評価装置の斜視図
【図２】本発明の一実施の形態の生体試料の評価装置の構成を示すブロック図
【図３】本発明の一実施の形態の生体試料の評価装置の機能を示す機能ブロック図
【図４】本発明の一実施の形態の生体試料の評価装置の基本動作プログラムの処理フロー図
【図５】本発明の一実施の形態の生体試料の評価装置の基本動作プログラムの処理フロー図
【図６】本発明の一実施の形態の生体試料の評価装置による生体試料の画像図
【符号の説明】
３顕微観察部
４操作・演算部
６試料テーブル
１１テーブル移動機構
１４機構制御部
１５処理部
１８ａ前提条件
１９ｂ前提条件合否判定プログラム
１９ｃ数値化処理プログラム

Claims

線状構造を有する複数の細胞体を撮像して得られた画像データから当該複数の細胞体の状態を示す数値データを取得する線状構造を有する細胞体の評価方法であって、画像データを画像処理することにより前記複数の細胞体およびこれらの細胞体から延伸する複数の線状構造の数量をそれぞれ定量化する細胞体数量指標および線状構造数量指標を求め、これらの線状構造数量指標と細胞体数量指標とに基づいて細胞体１個当たりの線状構造の数量を示す数値指標を求めるものであり、前記線状構造数量指標は、複数の細胞体から延伸する複数の線状構造の長さ（Ｌ）およびまたは面積（Ｓ１）であり、また前記細胞体数量指標は、複数の細胞体の個数（Ｎ）およびまたは面積（Ｓ２）であり、また前記細胞体が神経細胞であり、前記線状構造が神経細胞から延伸する神経突起であることを特徴とする細胞体の評価方法。
前記画像処理によって線状構造部を消去した画像より前記細胞体数量指標を求め、線状構造部を抽出した画像より前記線状構造数量指標を求めることを特徴とする請求項１記載の線状構造を有する細胞体の評価方法。