CN105764334B - 加强肿瘤生长的方法 - Google Patents

加强肿瘤生长的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN105764334B
CN105764334B CN201480055352.5A CN201480055352A CN105764334B CN 105764334 B CN105764334 B CN 105764334B CN 201480055352 A CN201480055352 A CN 201480055352A CN 105764334 B CN105764334 B CN 105764334B
Authority
CN
China
Prior art keywords
cells
human
cancer
nme7
nme
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201480055352.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN105764334A (zh
Inventor
辛席亚·C·班姆达德
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Minawa Biotechnology
Original Assignee
Minerva Biotechnologies Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from PCT/US2014/017515 external-priority patent/WO2014130741A2/en
Application filed by Minerva Biotechnologies Corp filed Critical Minerva Biotechnologies Corp
Publication of CN105764334A publication Critical patent/CN105764334A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105764334B publication Critical patent/CN105764334B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New breeds of animals
    • A01K67/027—New breeds of vertebrates
    • A01K67/0271—Chimeric animals, e.g. comprising exogenous cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/0004—Screening or testing of compounds for diagnosis of disorders, assessment of conditions, e.g. renal clearance, gastric emptying, testing for diabetes, allergy, rheuma, pancreas functions
    • A61K49/0008—Screening agents using (non-human) animal models or transgenic animal models or chimeric hosts, e.g. Alzheimer disease animal model, transgenic model for heart failure
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2207/00—Modified animals
    • A01K2207/12—Animals modified by administration of exogenous cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2207/00—Modified animals
    • A01K2207/15—Humanized animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/0331—Animal model for proliferative diseases

Abstract

本发明关于一种测试潜在药剂对于哺乳动物中的癌细胞的功效的方法，包括在哺乳动物中产生癌细胞；通过向该哺乳动物投予潜在药剂使癌细胞与该潜在药剂接触；及量测该潜在药剂对癌细胞的作用，其中该哺乳动物中的癌细胞数目减少指示该潜在药剂对癌细胞的有效性。

Description

加强肿瘤生长的方法
技术领域
本申请案是关于在实验动物中加强肿瘤移植的方法。本申请案还是关于一种制造癌症干细胞的方法。
背景技术
传统地用于药物发现中的小鼠、啮齿动物及其他动物在使用小鼠模型的癌症药物研究或异种移植实验中并不精确地模拟人类。首先，如通过针对医药公司的『糟糕药物』的诉讼的数量证明，小鼠对候选药物具有的反应通常不反映这些候选药物在人类研究中的反应。FDA及药物公司已显著提高在允许在人体中进行测试所需的临床前测试的水平方面的标准，并增加临床试验中的测试患者数量。再者，在小鼠及其他测试动物中显示无毒性的化合物在向人类投予时继续引起显著不良事件，包括死亡。似乎在小鼠与人类生物学之间存在关键差异从而使小鼠以及其他测试动物，尤其非灵长类测试动物中的药物安全性测试挫败。对当前实务的极大改良将为开发使动物，尤其为啮齿动物对植入或用于研究基础科学、药物功效、毒性或剂量的细胞的反应更如同人类的方法。
其次，难以获得一些移植于小鼠中的癌细胞或癌细胞系。常规地用于试管内测试的多种癌细胞系所具有的移植率对于可靠的动物研究而言过低。举例而言，T47D乳癌细胞系由于其过度表达致癌基因MUC1而典型地用于试管内研究。然而，T47D细胞由于其不佳移植率而很少用于小鼠异种移植研究中。已选择或在基因上改变动物模型以使其仿真某些人类疾病。一些动物模型自发地获得某些类型的癌症。然而，此等模型一般仅适用于研究自特异性突变产生的疾病或并不精确模拟人类疾病。如同在传统小鼠研究中，候选药物在小鼠中的作用通常不能预测药物在人体中将具有的作用。因此，对目前先进技术的显著改良将是开发增加人类癌细胞至测试动物，尤其啮齿类测试动物中的移植率的方法。
与此相关的是，当前无评估化合物、生物制剂或药物对肿瘤起始细胞或癌症干细胞的功效、毒性或剂量的实用方法。举例而言，Oncomed具有进行此的拖延性方法，其中将来自第一动物的存活肿瘤随后移植至第二动物中，随后将来自第二动物的存活肿瘤细胞(其在抗癌剂治疗下可能存活)随后植入第三动物中，随后以药剂对第三动物进行测试以测试其抑制存活癌细胞(提议为癌症干细胞或肿瘤起始细胞)生长的能力。此等方法是基于显示仅较小比例的癌细胞具有转移能力的研究及这类『癌症干细胞』的标记物的鉴别，诸如CD44的高表达伴随有CD24的低表达(Clarke MF等人2006,Chen K等人2013)。受体CXCR4也已鉴别为转移受体，其于癌症干细胞中的表达较高(Darash-Yahana M,Pikarsky E,Abramovitch R,Zeira E等人2004)。然而，迄今为止，尚无证据表明有可能将癌细胞暴露于使其转化为癌症干细胞的一或多种药剂。因此，对目前先进技术的显著改良将是开发或鉴别当添加至癌细胞时，将细胞中的一些转化为癌症干细胞的药剂或方法。可随后对此等癌症干细胞测试用于治疗转移性癌症或使其进展的药物及候选药物。另外，这类药剂及方法将提供一种富集癌细胞群体用于癌症干细胞的实用方法，其亦可用于鉴别转移性癌细胞的额外但仍未知的标记物，这类标记物随后将是抗癌药物的新标靶。
开发加速局部癌细胞转化为高侵袭性及转移性癌症干细胞以使得转移性药物标靶可得以鉴别且使得可开发尤其能够杀死可逃避化学治疗的癌症干细胞的药物的试管内方法亦为重要的。然而，亦重要的是异种移植NME-7诱导的癌症干细胞特征的动物不仅自极低数目的植入癌细胞产生肿瘤，且亦产生转移性癌症，伴以产生多个肿瘤，包括在远离植入位点的位置的肿瘤。
基本上，仅存在少数反复用于研究癌症生物学的基础科学及测试药物功效以及药物毒性的癌细胞系。这是由于人类细胞不同于小鼠细胞，在其开始衰老之前仅可在培养物中分裂极有限次数。研究者现今使用的癌细胞系为自单一转移性癌症患者的肋膜积液分离的天然不朽化癌细胞或通过融合至不朽化细胞系(通常来源于小鼠)或最近通过以不朽化基因转染癌细胞而诱导变为不朽化。重要的是用于使这类细胞继续自我复制的方法显著改变原始或原代癌细胞的分子特征。事实上这类细胞系为来自数年前存活及死亡的患者的癌细胞且可能决不类似于特定患者所罹患的特定癌症。因此，对目前先进技术的显著改良将是开发以不改变患者的癌细胞的分子特征，或若分子特征改变，这些改变将理想地模拟患者的身体中该癌症的进展的方式研究来自患者的癌细胞的方法。举例而言，可接受的改变将为假设增加患者的癌细胞可经受的分裂次数的方法将一或多个癌细胞转化为该癌症的更具侵袭性形式或该癌症的转移形式。随后，可对于患者的自身癌细胞评估化合物、生物制剂或药物的功效、毒性或剂量。
类似地，仅使用少数如上所述的与特定患者的特定癌症具有极小相似性或无相似性的不朽化癌细胞系在啮齿动物中建立候选药物的功效、安全性测试及给药时程的一级近似。因此，对目前先进技术的显著改良将是开发使得能够将患者的癌细胞移植至动物，较佳啮齿动物中，且视情况评估化合物、生物制剂或药物对测试动物中的患者的癌症的功效、毒性或剂量的方法。
除上文所述的基本上阻止使用当前方法将患者癌细胞移植至测试动物中的问题以外，必须将约4百万至6百万个癌细胞植入测试动物中以于宿主动物中产生肿瘤。关于此的原因为科学家最近发现并非肿瘤内的每一细胞具有产生肿瘤的能力；大多数无法产生肿瘤。在植入时可产生肿瘤的癌细胞的小群体称作『肿瘤起始细胞』或『癌症干细胞』。估计100,000个癌细胞中少至1个可产生肿瘤且已定方案通常需要植入数百万癌细胞以在测试动物中产生肿瘤。研究测试动物中的患者癌细胞的问题随后变为除上述不朽化问题以外的数量问题。简言之，典型肿瘤生检将不会产生对数百只小鼠各自植入4-6百万个癌细胞的足够细胞以对提出的候选药物的功效、毒性或剂量作出恰当评定。亦已述及，原始患者细胞将不会不朽化，因此将不会与在患者体内一样在评定实验的持续时间内增殖。因此，对目前先进技术的显著改良将是开发使得能够将极少患者癌细胞移植至动物中的方法。
发明内容
在一个态样中，本发明是关于一种用于测试潜在药剂对于非人类哺乳动物中的癌细胞的功效的测试方法，其包含：(i)在非人类哺乳动物中产生癌细胞；(ii)通过将潜在药剂投予至哺乳动物使癌细胞与潜在药剂接触；及(iii)测量潜在药剂对癌细胞的作用，其中哺乳动物中的癌细胞数目的减少可指示潜在药剂对癌细胞的有效性，其中该方法包含在进行步骤(i)之前、在进行步骤(i)之后或在进行步骤(i)之前及之后使癌细胞与使干细胞维持初始(
Figure BDA0000959735240000041
)状态或使经诱导(primed)干细胞恢复至初始状态的药剂接触。
在以上方法中，使干细胞维持初始状态或使经诱导干细胞恢复至初始状态的药剂可为NME蛋白、2i、5i、化学物质或核酸。NME蛋白可为NME1二聚体、NME7单体、NME7-AB、NME6二聚体或细菌性NME。
哺乳动物可为啮齿动物，诸如小鼠或大鼠。癌症可自人类自发地产生或植入。
在以上方法中，非人类哺乳动物可为转殖基因的，其中哺乳动物在生殖细胞或体细胞中表达人类MUC1或MUC1*或NME蛋白，其中生殖细胞及体细胞含有引入至该哺乳动物中的重组人类MUC1或MUC1*或NME基因序列。表达人类MUC1或MUC1*或NME蛋白的基因可在诱导型启动子控制下。启动子可诱导性地回应于非人类哺乳动物中的天然存在的蛋白。植入哺乳动物中的细胞的量可为至少约30、约30至约1,000,000、约50至约500,000、约50至100,000或约1,000至约1,000,000。NME蛋白可以单生长因子形式存在于无血清培养基中。
在另一态样中，本发明是关于一种在非人类哺乳动物中移植人类肿瘤的方法，包含将人类肿瘤细胞注射或植入哺乳动物中，该方法包含在进行注射或植入步骤之前、在进行注射或植入步骤之后或在进行注射或植入步骤之前及之后使肿瘤细胞与使干细胞维持初始状态或使经诱导干细胞恢复至初始状态的药剂接触。
在以上方法中，使干细胞维持初始状态或使经诱导干细胞恢复至初始状态的药剂可为NME蛋白、2i、5i、化学物质或核酸。NME蛋白可为NME1二聚体、NME7单体、NME7-AB、NME6二聚体或细菌性NME。哺乳动物可为啮齿动物，诸如小鼠或大鼠。
在以上方法中，非人类哺乳动物可为转殖基因的，其中哺乳动物在生殖细胞或体细胞中表达人类MUC1或MUC1*或NME蛋白，其中生殖细胞及体细胞含有引入至该哺乳动物中的重组人类MUC1或MUC1*或NME基因序列。表达人类MUC1或MUC1*或NME蛋白的基因可在诱导型启动子控制下。启动子可诱导性地回应于非人类哺乳动物中的天然存在的蛋白。植入哺乳动物中的细胞的量可为至少约30、约30至约1,000,000、约50至约500,000、约50至100,000或约1,000至约1,000,000。NME蛋白可以单生长因子形式存在于无血清培养基中。
在另一态样中，本发明是关于一种产生癌干细胞的方法，包含使癌细胞与使干细胞维持初始状态或使经诱导干细胞恢复至初始状态的药剂接触。
在以上方法中，使干细胞维持初始状态或使经诱导干细胞恢复至初始状态的药剂可为NME蛋白、2i、5i、化学物质或核酸。NME蛋白可为NME1二聚体、NME7单体、NME7-AB、NME6二聚体或细菌性NME。
在此方法中，药剂可抑制MBD3、CHD4、BRD4或JMJD6的表达。药剂可为针对MBD3、CHD4、BRD4或JMJD6制得的siRNA，或针对任何编码上调MBD3、CHD4、BRD4或JMJD6的表达的蛋白的基因制得的siRNA。癌干细胞可藉由相比于癌细胞或正常细胞，CXCR4或E-钙黏蛋白(CDH1)的表达增加表征。
在另一态样中，本发明系关于一种在非人类哺乳动物中产生转移性肿瘤的方法，包含将癌细胞转移至哺乳动物中，其中该方法包含在进行转移步骤之前、在进行转移步骤之后或在进行转移步骤之前及之后使癌细胞与使干细胞维持初始状态或使经诱导干细胞恢复至初始状态的药剂接触。
在以上方法中，使干细胞维持初始状态或使经诱导干细胞恢复至初始状态的药剂可为NME蛋白、2i、5i、化学物质或核酸。NME蛋白可为NME1二聚体、NME7单体、NME7-AB、NME6二聚体或细菌性NME。
在此方法中，药剂可抑制MBD3、CHD4、BRD4或JMJD6的表达。药剂可为针对MBD3、CHD4、BRD4或JMJD6制得的siRNA，或针对任何编码上调MBD3、CHD4、BRD4或JMJD6的表达的蛋白的基因制得的siRNA。癌干细胞可通过相比于癌细胞或正常细胞，CXCR4或E-钙黏蛋白(CDH1)的表达增加表征。
在以上方法中，哺乳动物可为啮齿动物，诸如小鼠或大鼠。非人类哺乳动物可为转殖基因的，其中哺乳动物在生殖细胞或体细胞中表达人类MUC1或MUC1*或NME蛋白，其中生殖细胞及体细胞含有引入至该哺乳动物中的重组人类MUC1或MUC1*或NME基因序列。表达人类MUC1或MUC1*或NME蛋白的基因可在诱导型启动子控制下。启动子可诱导性地回应于非人类哺乳动物中的天然存在的蛋白。植入哺乳动物中的细胞的量可为至少约30、约30至约1,000,000、约50至约500,000、约50至100,000或约1,000至约1,000,000。NME蛋白可以单生长因子形式存在于无血清培养基中。
在另一态样中，本发明是关于一种用于测试潜在药剂对于非人类哺乳动物中的癌细胞的功效的测试方法，其包含：(i)将患者的癌细胞转移至非人类哺乳动物中；(ii)通过将潜在药剂投予至哺乳动物使癌细胞与潜在药剂接触；及(iii)测量潜在药剂对癌细胞的作用，其中哺乳动物中的患者的癌细胞数目的减少可指示潜在药剂对癌细胞的有效性，其中该方法包含在进行步骤(i)之前、在进行步骤(i)之后或在进行步骤(i)之前及之后使患者的癌细胞与使干细胞维持初始状态或使经诱导干细胞恢复至初始状态的药剂接触。
在以上方法中，使干细胞维持初始状态或使经诱导干细胞恢复至初始状态的药剂可为NME蛋白、2i、5i、化学物质或核酸。NME蛋白可为NME1二聚体、NME7单体、NME7-AB、NME6二聚体或细菌性NME。
在此方法中，药剂可抑制MBD3、CHD4、BRD4或JMJD6的表达。药剂可为针对MBD3、CHD4、BRD4或JMJD6制得的siRNA，或针对任何编码上调MBD3、CHD4、BRD4或JMJD6的表达的蛋白的基因制得的siRNA。癌干细胞可通过相比于癌细胞或正常细胞，CXCR4或E-钙黏蛋白(CDH1)的表达增加表征。
在以上方法中，哺乳动物可为啮齿动物，诸如小鼠或大鼠。非人类哺乳动物可为转殖基因的，其中哺乳动物在生殖细胞或体细胞中表达人类MUC1或MUC1*或NME蛋白，其中生殖细胞及体细胞含有引入至该哺乳动物中的重组人类MUC1或MUC1*或NME基因序列。表达人类MUC1或MUC1*或NME蛋白的基因可在诱导型启动子控制下。启动子可诱导性地回应于非人类哺乳动物中的天然存在的蛋白。植入哺乳动物中的细胞的量可为至少约30、约30至约1,000,000、约50至约500,000、约50至100,000或约1,000至约1,000,000。NME蛋白可以单生长因子形式存在于无血清培养基中。
在另一态样中，本发明是关于一种在非人类哺乳动物中自异种移植产生组织的方法，其包含：(i)产生转殖基因非人类哺乳动物，其中哺乳动物表达生殖细胞及体细胞中的人类MUC1或MUC1*或NME蛋白，其中生殖细胞及体细胞含有引入至该哺乳动物中的重组人类MUC1或MUC1*或NME基因序列，其中可在诱导型及可抑制型调节序列的控制下表达基因序列；(ii)将来源上为异种的干细胞或祖细胞转移至非人类哺乳动物中以使得基因可诱发为表达的以使干细胞或祖细胞的数目倍增；及(iii)抑制基因表达以自异种移植干细胞产生组织。
在此方法中，在步骤(iii)中，可通过使干细胞与组织分化因子接触进行基因表达抑制，或在步骤(iii)中，可在回应于自然地产生的宿主组织分化因子的哺乳动物中自然地进行基因表达抑制。转移的细胞可为人类细胞。组织可为肾器官。NME蛋白可为NME1二聚体、NME7单体、NME7-AB、NME6二聚体或细菌性NME。哺乳动物可为啮齿动物，诸如小鼠或大鼠。
在另一态样中，本发明是关于一种产生防癌性肽的方法，包含：(i)产生非人类转殖基因宿主哺乳动物，其中该哺乳动物在生殖细胞或体细胞中表达人类MUC1或MUC1*或NME蛋白，其中生殖细胞及体细胞含有引入至该哺乳动物中的重组人类MUC1或MUC1*或NME基因序列；(ii)以NME蛋白的片段使哺乳动物免疫；(iii)将人类肿瘤细胞植入哺乳动物中；及(iv)比较哺乳动物与对照转殖基因非人类哺乳动物中的细胞的肿瘤移植、肿瘤生长速率或肿瘤起始潜能以将引起显著减少的肿瘤移植、肿瘤生长速率或肿瘤起始潜能的肽选择为免疫肽。
在此方法中，NME蛋白的片段可为选自图61至图63中的肽编号1至53的肽。NME蛋白可为NME1二聚体、NME7单体、NME7-AB、NME6二聚体或细菌性NME。哺乳动物可为啮齿动物，诸如小鼠或大鼠。
附图说明
自下文中给出的实施方式及仅以说明方式给出且因此不限制本发明的随附图式，本发明将变得更充分理解，且在随附图式中：
图1显示小鼠中的肿瘤细胞生长图。图(A)显示与标准基质胶或基质胶加上NME7混合且异种移植至免疫缺陷(nu/nu)小鼠中的T47D乳房肿瘤细胞的生长图。在第14天之后，肿瘤细胞与NME7混合的小鼠亦每日注射人类重组NME7一次。图(B)显示与基质胶加上NME7混合且异种移植至免疫缺陷小鼠中的T47D乳房肿瘤细胞的生长图。在第14天之后，一半小鼠亦每日注射人类重组NME7一次。
图2显示个别小鼠中的人类肿瘤细胞生长的图。图(A)显示与标准基质胶混合的T47D乳癌细胞生长图。六(6)只植入小鼠中仅两(2)只显示移植的肿瘤生长特征。图(B)显示与基质胶及NME7混合的T47D乳癌细胞的生长图。六(6)只植入小鼠中的四(4)只显示移植的肿瘤生长特征。虚线表明亦在第14天的后注射NME7的小鼠。
图3显示与标准基质胶混合且异种移植至免疫缺陷(nu/nu)小鼠中的T47D肿瘤细胞图。该图显示两组相同的20只小鼠的平均值，每一组的肿瘤体积具有22％的平均增加但具有向下趋势。
图4显示四十(40)只个别小鼠中的T47D人类乳房肿瘤细胞的生长的图，约25％显示肿瘤移植。
图5显示与基质胶混合且异种移植至NOD/SCID小鼠的侧腹中的T47D乳癌细胞的生长图。图(A)显示平均肿瘤生长。图(B)显示个别小鼠中的肿瘤生长，其展现使用标准方法的六(6)只小鼠中仅一(1)只具有良好肿瘤移植。
图6显示据报导在正常RPMI生长培养基或无血清基本培养基(向其中添加重组人类NME7-AB作为单一生长因子)中培养的MUC1阳性T47D乳癌细胞中的一些癌症干细胞或转移性癌细胞中过度表达的一组基因的表达的RT-PCR量测值图。一部分细胞变得非黏附且在表面浮起且进行收集，同时『+Ri』指添加至培养基以使得所有细胞将保持附着于表面，因此给出黏附及非黏附细胞的平均读数的ρ激酶抑制剂。
图7显示据报导在正常RPMI生长培养基或无血清基本培养基(向其中添加人类重组NM23(亦称作NME1)二聚体或NME7-AB作为单一生长因子)中培养的MUC1阳性T47D乳癌细胞中的一些癌症干细胞或转移性癌细胞中过度表达的一组基因的表达的RT-PCR量测值图。『漂浮物』指变得非黏附且经收集的细胞，而『+Ri』是指添加至一些细胞以使其黏附至表面的ρ激酶抑制剂。
图8显示据报导在正常RPMI生长培养基或无血清基本培养基(向其中添加来自物种HSP593的重组细菌性NME1二聚体)中培养的MUC1阳性T47D乳癌细胞中的一些癌症干细胞或转移性癌细胞中过度表达的一组基因的表达的RT-PCR量测值图。『漂浮物』指变得非黏附且经收集，随后进行分析的细胞。
图9显示据报导在正常RPMI生长培养基或无血清基本培养基(向其中添加『2i』，其为MAP激酶及GSK3的生化抑制剂，先前显示使经诱导状态下的干细胞恢复至较早初始状态，2i加上重组人类NM23二聚体，或2i加上重组人类NME7-AB)中培养的MUC1阳性T47D乳癌细胞中的一些癌症干细胞或转移性癌细胞中过度表达的一组基因的表达的RT-PCR量测值图。『漂浮物』是指变得非黏附且经收集，随后进行分析的细胞。
图10显示据报导在正常RPMI生长培养基或无血清基本培养基(向其中添加『2i』，其为MAP激酶及GSK3的生化抑制剂，先前显示使经诱导状态下的干细胞恢复至较早初始状态，2i加上重组人类NME7-AB或仅NME7-AB)中培养的MUC1阳性T47D乳癌细胞中的一些癌症干细胞或转移性癌细胞中过度表达的一组基因的表达的RT-PCR量测值图。『漂浮物』指变得非黏附且经收集，随后进行分析的细胞。
图11a显示据报导在正常RPMI生长培养基或无血清基本培养基(向其中添加人类重组NM23(亦称作NME1)二聚体或NME7-AB作为单一生长因子)中培养的MUC1阳性DU145前列腺癌细胞中的一些癌症干细胞或转移性癌细胞中过度表达的一组基因的表达的RT-PCR量测值图。此等细胞未在表面浮起，尽管许多仅松散地附着，使得量测值为将为『漂浮物』及黏附细胞的细胞的平均值。
图11b显示在DU145前列腺癌细胞在重组人类NME7-AB、细菌性HSP593 NME1或人类NME1/NM23二聚体中培养9或10继代的后的一组基因的表达的RT-PCR量测值图。该图显示在药剂中的延长培养之后，前列腺癌症标记物CDH1/E-钙黏蛋白及干细胞标记物的表达增加。
图12a显示据报导在正常RPMI生长培养基或无血清基本培养基(向其中添加重组人类NME1/NM23二聚体或NME7-AB作为单一生长因子)中培养的MUC1阴性PC3前列腺癌细胞中的一些癌症干细胞或转移性癌细胞中过度表达的一组基因的表达的RT-PCR量测值图。
图12b显示在无血清基本培养基(向其中添加重组人类NME1/NM23、细菌性HSP593NME1或NME7-AB作为单一生长因子)中连续继代之后的MUC1阴性PC3前列腺癌细胞中的一组基因的表达的RT-PCR量测值图。
图13显示编码正常RPMI生长培养基或无血清基本培养基(向其中添加『2i』或重组人类NME7-AB)中培养的MUC1阳性T47D乳癌细胞中的染色质重排因子BRD4、JMJD6、MBD3及CHD4的基因的表达的RT-PCR量测值图，其中『漂浮物』细胞为分析的细胞。
图14显示编码正常RPMI生长培养基或无血清基本培养基(向其中添加2i、2i加上重组人类NM23二聚体或2i加上重组人类NME7-AB)中培养的MUC1阳性T47D乳癌细胞中的染色质重排因子BRD4、JMJD6、MBD3及CHD4的基因的表达的RT-PCR量测值图。『漂浮物』是指变得非黏附且经收集，随后进行分析的细胞。
图15显示据报导在正常纤维母细胞生长培养基或无血清基本培养基(向其中添加人类重组NM23(亦称作NME1)二聚体、NME7-AB或HSP593细菌性NME1二聚体)中培养的一些癌症干细胞或转移性癌症细胞、体纤维母细胞，『fbb』细胞中过度表达的基因的表达的RT-PCR量测值图。『+ROCi』指添加至一些细胞以使其黏附于表面的ρ激酶抑制剂。『-ROCi』不指漂浮物而是指在不存在ρ激酶抑制剂的情况下保持黏附的细胞。
图16显示编码正常纤维母细胞生长培养基或无血清基本培养基(向其中添加人类重组NM23(亦称作NME1)二聚体、NME7-AB或HSP593细菌性NME1二聚体)中培养的体纤维母细胞『fbb』细胞中的染色质重排因子BRD4、JMJD6、MBD3及CHD4的基因的表达的RT-PCR量测值图。『+ROCi』指添加至一些细胞以使其黏附于表面的ρ激酶抑制剂。
图17显示据报导在编码正常纤维母细胞生长培养基或无血清基本培养基(向其中添加人类重组NM23(亦称作NME1)二聚体、NME7-AB或HSP593细菌性NME1二聚体)中培养的体纤维母细胞『fbb』细胞中的染色质重排因子BRD4、JMJD6、MBD3及CHD4的一些癌症干细胞或转移性癌细胞及基因中过度表达的基因的表达的RT-PCR量测值图。『+ROCi』指添加至一些细胞以使其黏附于表面的ρ激酶抑制剂。此处的『-ROCi』指变得非黏附且在表面浮起的细胞。
图18显示具有多能性形态的人类胚胎干细胞的相片，其中已在将重组人类NME1二聚体作为添加的唯一生长因子的情况下于无血清基本培养基中培养干细胞。
图19显示具有多能性形态的人类胚胎干细胞的相片，其中已在将重组人类NME7-AB作为添加的唯一生长因子的情况下于无血清基本培养基中培养干细胞。
图20显示具有多能性形态的人类胚胎干细胞的相片，其中已在将重组HSP593细菌性NME1二聚体作为添加的唯一生长因子的情况下于无血清基本培养基中培养干细胞。
图21显示在侧腹中皮下地植入50、100、1,000或10,000个细胞的四(4)组免疫缺陷nu/nu雌性小鼠的肿瘤体积量测值图，其中植入的细胞为在重组人类NME7-AB中培养七(7)日的人类MUC1阳性乳癌细胞，其中收集『漂浮物』且验证过度表达癌转移受体CXCR4 100倍以上。各组中的一半小鼠每日注射人类重组NME7-AB。图内的编号是指小鼠追踪编号。『M』表示具有多个肿瘤的小鼠。
图22显示在侧腹中皮下地植入50、100、1,000或10,000个细胞的四(4)组免疫缺陷nu/nu雌性小鼠的肿瘤体积量测值图，其中植入的细胞为在重组人类NME7-AB中培养七(7)日的人类MUC1阳性乳癌细胞，其中收集『漂浮物』且验证过度表达癌转移受体CXCR4 100倍以上。各组中的一半小鼠每日注射人类重组NME7-AB。在接受NME7-AB的每日注射的小鼠中，80％产生多个肿瘤。此图显示相同小鼠中的多个肿瘤的合并体积。图内的编号是指小鼠追踪编号。『M』表示具有多个肿瘤的小鼠。
图23显示植入50个癌细胞且每日注射rhNME7-AB的1号小鼠在第28天及第58天的相片。深色箭头指出注射位点的肿瘤且浅色箭头指出在第28天与第63天之间产生的转移性肿瘤。
图24显示植入50个癌细胞且未每日注射rhNME7-AB的2号小鼠在第28天及第58天的相片。深色箭头指出注射位点的肿瘤。
图25显示植入50个癌细胞且每日注射rhNME7-AB的3号小鼠在第28天及第58天的相片。深色箭头指出注射位点的肿瘤。
图26显示植入50个癌细胞且未每日注射rhNME7-AB的4号小鼠在第28天及第58天的相片。深色箭头指出注射位点的肿瘤。
图27显示植入50个癌细胞且每日注射rhNME7-AB的5号小鼠在第28天及第58天的相片。深色箭头指出注射位点的肿瘤且浅色箭头指出在第28天与第63天之间产生的转移性肿瘤。
图28显示植入50个癌细胞且未每日注射rhNME7-AB的2号小鼠在第28天及第58天的相片。深色箭头指出注射位点的肿瘤。
图29显示植入100个癌细胞且未每日注射rhNME7-AB的1号小鼠在第28天的相片。深色箭头指出注射位点的肿瘤。
图30显示植入100个癌细胞且每日注射rhNME7-AB的2号小鼠在第28天及第58天的相片。深色箭头指出注射位点的肿瘤且浅色箭头指出在第28天与第63天之间产生的转移性肿瘤。
图31显示植入100个癌细胞且未每日注射rhNME7-AB的3号小鼠在第28天的相片。深色箭头指出注射位点的肿瘤。
图32显示植入100个癌细胞且每日注射rhNME7-AB的4号小鼠在第28天及第58天的相片。深色箭头指出注射位点的肿瘤且浅色箭头指出在第28天与第63天之间产生的转移性肿瘤。
图33显示植入100个癌细胞且未每日注射rhNME7-AB的5号小鼠在第28天及第58天的相片。在第28天与第63天之间未产生肿瘤。
图34显示植入100个癌细胞且每日注射rhNME7-AB的6号小鼠在第28天及第58天的相片。深色箭头指出注射位点的肿瘤且浅色箭头指出在第28天与第63天之间产生的转移性肿瘤。
图35显示植入1,000个癌细胞且每日注射rhNME7-AB的1号小鼠在第28天及第58天的相片。深色箭头指出注射位点的肿瘤且浅色箭头指出在第28天与第63天之间产生的转移性肿瘤。
图36显示植入1,000个癌细胞且未注射rhNME7-AB的2号小鼠在第28天及第58天的相片。在第28天与第63天之间未产生肿瘤。
图37显示植入1,000个癌细胞且每日注射rhNME7-AB的3号小鼠在第28天及第58天的相片。在第28天与第63天之间未产生肿瘤。
图38显示植入1,000个癌细胞且未每日注射rhNME7-AB的4号小鼠在第28天及第58天的相片。深色箭头指出注射位点的肿瘤。
图39显示植入1,000个癌细胞且每日注射rhNME7-AB的5号小鼠在第28天及第58天的相片。深色箭头指出注射位点的肿瘤。
图40显示植入1,000个癌细胞且未注射rhNME7-AB的6号小鼠在第28天及第58天的相片。在第28天与第63天之间未产生肿瘤。
图41显示植入10,000个细胞且未每日注射rhNME7-AB的1号小鼠由于疾病而在第28天死亡的相片。深色箭头指出注射位点的肿瘤。
图42显示植入10,000个癌细胞且每日注射rhNME7-AB的2号小鼠在第28天及第58天的相片。深色箭头指出注射位点的肿瘤且浅色箭头指出在第28天与第63天之间产生的转移性肿瘤。
图43显示植入10,000个癌细胞且未每日注射rhNME7-AB的3号小鼠在第28天及第58天的相片。深色箭头指出注射位点的肿瘤。
图44显示植入10,000个癌细胞且每日注射rhNME7-AB的4号小鼠在第28天及第58天的相片。深色箭头指出注射位点的肿瘤且浅色箭头指出在第28天与第63天之间产生的转移性肿瘤。
图45显示植入10,000个癌细胞且未每日注射rhNME7-AB的5号小鼠在第28天及第58天的相片。深色箭头指出注射位点的肿瘤。
图46显示植入10,000个癌细胞且每日注射rhNME7-AB的6号小鼠在第28天及第58天的相片。深色箭头指出注射位点的肿瘤。
图47显示来自显示NME7-AB使MUC1*细胞外域肽二聚化的ELISA夹心法分析的HRP信号图。
图48A至图48B.(A)显示来自细菌盐单胞菌属(Halomonas Sp.)593的NME的聚丙烯酰胺凝胶，该细菌表达于大肠杆菌中且表达为可溶蛋白及天然二聚体.(B)显示在ELISA分析中，来自盐单胞菌属593的NME结合于MUC1*细胞外域的PSMGFR肽。
图49显示来自细菌牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonasgingivalis)W83的NME的聚丙烯酰胺凝胶。
图50A至图50C.(A)显示盐单胞菌属593细菌性NME与人类NME-H1的序列对比.(B)显示盐单胞菌属593细菌性NME与人类NME7-A域的序列对比.(C)显示盐单胞菌属953细菌性NME与人类NME7-B域的序列对比。
图51为与后期经诱导干细胞相比，最早期初始人类干细胞中的转录因子BRD4及辅因子JMJD6的表达量的RT-PCR量测值图。
图52显示在含有二聚体形式的人类NME1的无血清培养基中培养18日之后的人类纤维母细胞的4×放大率相片。
图53显示在含有二聚体形式的人类NME1的无血清培养基中培养18日之后的人类纤维母细胞的20×放大率相片。
图54显示在含有来自盐单胞菌属593的细菌性NME的无血清培养基中培养18日之后的人类纤维母细胞的4×放大率相片。
图55显示在含有来自盐单胞菌属593的细菌性NME的无血清培养基中培养18日之后的人类纤维母细胞的20×放大率相片。
图56显示在含有人类NME7-AB的无血清培养基中培养18日之后的人类纤维母细胞的4×放大率相片。
图57显示在含有人类NME7-AB的无血清培养基中培养18日之后的人类纤维母细胞的20×放大率相片。
图58显示在无NME蛋白的标准培养基中培养18日之后的人类纤维母细胞的4×放大率相片。
图59显示在无NME蛋白的标准培养基中培养18日之后的人类纤维母细胞的20×放大率相片。
图60为由本文所述的实验的分析产生的NME7及相关因子的相互作用图的草图。
图61列举与NME1具有低序列一致性的来自人类NME7的免疫原性肽。所列肽序列鉴别为产生以人类NME7而非人类NME1为标靶的抗体的免疫原性肽。序列由于其缺乏与人类NME1的序列同源性而被选择，且用作产生抑制NME7以治疗或预防癌症的抗体的NME7特异性肽。
图62列举对于结构完整性或对于结合至MUC1*可能重要的来自人类NME7的免疫原性肽。较佳为二价及双特异性抗体，其中各可变区结合至NME7的不同肽部分。该等肽可藉由使用一种以上肽产生对二者均具特异性的抗体而产生。该等肽适用作产生抑制NME7以治疗或预防癌症的抗体的NME7特异性肽。
图63列举对于结构完整性或对于结合至MUC1*可能重要的来自人类NME1的免疫原性肽。所列肽序列来自人类NME1且由于其与人类NME7的高同源性以及由于其与能够仿真其功能的其他细菌性NME蛋白的同源性而被选择。特定言之，肽50至53与人类NME7-A或-B以及HSP 593具有高同源性。
具体实施方式
定义
如本文所用，「MUC1*」细胞外域主要藉由PSMGFR序列(GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(SEQ ID NO:6))定义。由于MUC1裂解的精确位点取决于截割其的酶，且裂解酶取决于细胞类型、组织类型或细胞演化时间而变化，MUC1*细胞外域的精确序列可在N-端变化。
如本文所用，术语「PSMGFR」为阐述为GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(SEQ ID NO:6)的MUC1生长因子受体的一级序列的缩写字。就此而言，如在「N-10PSMGFR」、「N-15 PSMGFR」或「N-20 PSMGFR」中的「N-数目」是指已于PSMGFR的N端缺失的氨基酸残基数目。同样，如在「C-10 PSMGFR」、「C-15 PSMGFR」或「C-20 PSMGFR」中的「C-数目」是指已于PSMGFR的C端缺失的氨基酸残基数目。
如本文所用，「MUC1*的细胞外域」是指缺少串联重复域的MUC1蛋白的细胞外部分。在大多数情况下，MUC1*为一种裂解产物，其中MUC1*部分由缺少串联重复的短细胞外域、跨膜域及细胞质尾区组成。MUC1裂解的精确定位尚未知晓，可能由于似乎其可藉由一种以上的酶裂解。MUC1*的细胞外域将包括大部分PSMGFR序列，但可具有额外10-20种N端氨基酸。
如本文所用，编号为1-10的「NME家族蛋白」或「NME家族成员蛋白」为由于其全部具有至少一个NDPK(核苷酸二磷酸酯激酶)域而分组在一起的蛋白。在某些情况下，就能够催化ATP转化为ADP而言，NDPK域不是官能性的。NME蛋白被正式称为NM23蛋白，编号H1、H2等。在本文中，术语NM23及NME为可互换的。在本文中，术语NME1、NME2、NME6及NME7用于指天然蛋白以及NME变异体。在某些情况下，此等变异体在大肠杆菌中更可溶、表达更佳或比天然序列蛋白更可溶。举例而言，用于本说明书中的NME7可意为天然蛋白或变异体，诸如NME7-AB，其由于变异允许在大肠杆菌中可溶、恰当折迭的蛋白的高产表达而具有优良商业适用性。如本文中所提及的「NME1」可与「NM23-H1」互换。亦预期本发明不受限于NME蛋白的精确序列。突变体NME1-S120G，亦称作NM23-S120G，在整个本申请案中可互换使用。S120G突变体及P96S突变体由于其偏好二聚体形成而为较佳的，但可在本文中被称作NM23二聚体或NME1二聚体。
如本文中所提及的NME7欲意为具有约42kDa的分子量的天然NME7、具有25与33kDa之间的分子量的裂解形式、缺少DM10前导序列的变异体、NME7-AB或重组NME7蛋白或序列可经改变以容许有效表达或增加产率、溶解度或使NME7更有效或在商业上更有活力的其他特征的其变异体。
如本文所用，「使干细胞维持初始状态或使经诱导干细胞恢复至初始状态下的药剂」指单独或以组合形式使干细胞维持初始状态的蛋白、小分子或核酸，类似于胚胎的内细胞团的细胞。实例包括(但不限于)人类或细菌性的NME1二聚体、NME7、NME7-AB、2i、5i、核酸，诸如抑制MBD3、CHD4、BRD4或JMJD6的表达的siRNA。
如本文所用，关于称为「小分子」的药剂，其可为具有50Da与2000Da之间、更佳150Da与1000Da之间、更佳200Da与750Da之间的分子量的合成化学物质或基于化学的分子。
如本文所用，关于称为「自然产物」的药剂，其可为化学分子或生物分子，只要该分子在自然界中存在。
如本文所用，「2i抑制剂」是指MAP激酶传信路径的GSK3-β及MEK的小分子抑制剂。名称2i创造于研究论文(Silva J等人2008)中，然而，在本文中，「2i」系指GSK3-β或MEK的任何抑制剂，因为存在多种若小分子或生物制剂抑制此等标靶，则对多能性或肿瘤形成具有相同作用的小分子或生物制剂。
如本文所用，FGF、FGF-2或bFGF系指纤维母细胞生长因子。
如本文所用，「ρ相关激酶抑制剂」可为小分子、肽或蛋白(Rath N,等人,2012)。ρ激酶抑制剂在本文中及他处缩写为ROCi或ROCKi或Ri。使用特定ρ激酶抑制剂意欲为例示性的且可以任何其他ρ激酶抑制剂取代。如本文所用，术语「癌症干细胞」或「肿瘤起始细胞」是指表达已与更具转移性状态或更具侵袭性癌症有关的基因的含量的癌细胞。术语「癌症干细胞」或「肿瘤起始细胞」也可以指当移植至动物中时，需要少得多的细胞以产生肿瘤的癌细胞。癌症干细胞及肿瘤起始细胞通常对化学治疗药物具抗性。
如本文所用，术语「干细胞/癌症」、「癌样」、「干样」是指细胞获得干细胞或癌细胞的特征、共享干细胞、癌细胞或癌症干细胞的基因表达特征的重要要素的状态。干样细胞可为经历诱导至较不成熟状态，诸如增加多能性基因的表达的体细胞。干样细胞亦指已经历一些去分化或处于介稳定状态下的细胞，这类细胞可自该状态改变其终末分化。癌样细胞可为尚未完全表征但显示癌细胞的形态及特征，诸如能够锚定非依赖性生长或能够于动物中产生肿瘤的癌细胞。
序列表自由本文
关于使用除a、g、c、t以外的核苷酸符号，其遵循WIPO标准ST.25,附录2,表1中阐述的惯例，其中k表示t或g；n表示a、c、t或g；m表示a或c；r表示a或g；s表示c或g；w表示a或t且y表示c或t。
Figure BDA0000959735240000171
Figure BDA0000959735240000181
ASANL(SEQ ID NO:1)描述全长MUC1受体(黏蛋白1前驱体，基因银行寄存编号：P15941)。
MTPGTQSPFFLLLLLTVLT(SEQ ID NO:2)
MTPGTQSPFFLLLLLTVLT VVTA(SEQ ID NO:3)
MTPGTQSPFFLLLLLTVLT VVTG(SEQ ID NO:4)
SEQ ID NO:2、3及4描述用于将MUC1受体及截短同功异型物导引至细胞膜表面的N端MUC-1传信序列。如SEQ ID NO:2、3及4中的变异体所指示，可在C端不存在至多3个氨基酸残基。
GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGAGVPGWGIALLVLVCVLVALAIVYLIALAVCQCRRKNYGQLDIFPARDTYHPMSEYPTYHTHGRYVPPSSTDRSPYEKVSAGNGGSSLSYTNPAVAAASANL(SEQ ID NO:5)描述一种在其N-端具有nat-PSMGFR且包括全长MUC1受体的跨膜及细胞质序列的截短MUC1受体同功异构物。
GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(SEQ ID NO:6)描述MUC1生长因子受体的天然一级序列(nat-PSMGFR-「PSMGFR」的实例)的细胞外域。
TINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(SEQ ID NO:7)描述在SEQ IDNO:6的N-端具有单一氨基酸缺失的MUC1生长因子受体的天然一级序列(nat-PSMGFR-「PSMGFR」的实例)的细胞外域。
GTINVHDVETQFNQYKTEAASPYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(SEQ ID NO:8)描述具有增强的稳定性的MUC1生长因子受体的天然一级序列的「SPY」功能变异体(var-PSMGFR-「PSMGFR」的实例)的细胞外域。
TINVHDVETQFNQYKTEAASPYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(SEQ ID NO:9)描述在SEQ IDNO:8的C-端具有单一氨基酸缺失的具有增强的稳定性的MUC1生长因子受体的天然一级序列的「SPY」功能变异体(var-PSMGFR-「PSMGFR」的实例)的细胞外域。
tgtcagtgccgccgaaagaactacgggcagctggacatctttccagcccgggatacctaccatcctatgagcgagtaccccacctaccacacccatgggcgctatgtgccccctagcagtaccgatcgtagcccctatgagaaggtttctgcaggtaacggtggcagcagcctctcttacacaaacccagcagtggcagccgcttctgccaacttg(SEQID NO:10)描述MUC1细胞质域核苷酸序列。
CQCRRKNYGQLDIFPARDTYHPMSEYPTYHTHGRYVPPSSTDRSPYEKVSAGNGGSSLSYTNPAVAAASANL(SEQ ID NO:11)描述MUC1细胞质域氨基酸序列。
gagatcctgagacaatgaatcatagtgaaagattcgttttcattgcagagtggtatgatccaaatgcttcacttcttcgacgttatgagcttttattttacccaggggatggatctgttgaaatgcatgatgtaaagaatcatcgcacctttttaaagcggaccaaatatgataacctgcacttggaagatttatttataggcaacaaagtgaatgtcttttctcgacaactggtattaattgactatggggatcaatatacagctcgccagctgggcagtaggaaagaaaaaacgctagccctaattaaaccagatgcaatatcaaaggctggagaaataattgaaataataaacaaagctggatttactataaccaaactcaaaatgatgatgctttcaaggaaagaagcattggattttcatgtagatcaccagtcaagaccctttttcaatgagctgatccagtttattacaactggtcctattattgccatggagattttaagagatgatgctatatgtgaatggaaaagactgctgggacctgcaaactctggagtggcacgcacagatgcttctgaaagcattagagccctctttggaacagatggcataagaaatgcagcgcatggccctgattcttttgcttctgcggccagagaaatggagttgttttttccttcaagtggaggttgtgggccggcaaacactgctaaatttactaattgtacctgttgcattgttaaaccccatgctgtcagtgaaggtatgttgaatacactatattcagtacattttgttaataggagagcaatgtttattttcttgatgtactttatgtatagaaaataa(SEQ ID NO:12)描述NME7核苷酸序列(NME7：基因银行寄存号AB209049)。
DPETMNHSERFVFIAEWYDPNASLLRRYELLFYPGDGSVEMHDVKNHRTFLKRTKYDNLHLEDLFIGNKVNVFSRQLVLIDYGDQYTARQLGSRKEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGMLNTLYSVHFVNRRAMFIFLMYFMYRK(SEQ ID NO:13)描述NME7氨基酸序列(NME7：基因银行寄存号AB209049)。
atggtgctactgtctactttagggatcgtctttcaaggcgaggggcctcctatctcaagctgtgatacaggaaccatggccaactgtgagcgtaccttcattgcgatcaaaccagatggggtccagcggggtcttgtgggagagattatcaagcgttttgagcagaaaggattccgccttgttggtctgaaattcatgcaagcttccgaagatcttctcaaggaacactacgttgacctgaaggaccgtccattctttgccggcctggtgaaatacatgcactcagggccggtagttgccatggtctgggaggggctgaatgtggtgaagacgggccgagtcatgctcggggagaccaaccctgcagactccaagcctgggaccatccgtggagacttctgcatacaagttggcaggaacattatacatggcagtgattctgtggagagtgcagagaaggagatcggcttgtggtttcaccctgaggaactggtagattacacgagctgtgctcagaactggatctatgaatga(SEQ ID NO:14)描述NM23-H1核苷酸序列(NM23-H1：基因银行寄存号AF487339)。
MVLLSTLGIVFQGEGPPISSCDTGTMANCERTFIAIKPDGVQRGLVGEIIKRFEQKGFRLVGLKFMQASEDLLKEHYVDLKDRPFFAGLVKYMHSGPVVAMVWEGLNVVKTGRVMLGETNPADSKPGTIRGDFCIQVGRNIIHGSDSVESAEKEIGLWFHPEELVDYTSCAQNWIYE(SEQ ID NO:15)NM23-H1描述氨基酸序列(NM23-H1：基因银行寄存号AF487339)。
atggtgctactgtctactttagggatcgtctttcaaggcgaggggcctcctatctcaagctgtgatacaggaaccatggccaactgtgagcgtaccttcattgcgatcaaaccagatggggtccagcggggtcttgtgggagagattatcaagcgttttgagcagaaaggattccgccttgttggtctgaaattcatgcaagcttccgaagatcttctcaaggaacactacgttgacctgaaggaccgtccattctttgccggcctggtgaaatacatgcactcagggccggtagttgccatggtctgggaggggctgaatgtggtgaagacgggccgagtcatgctcggggagaccaaccctgcagactccaagcctgggaccatccgtggagacttctgcatacaagttggcaggaacattatacatggcggtgattctgtggagagtgcagagaaggagatcggcttgtggtttcaccctgaggaactggtagattacacgagctgtgctcagaactggatctatgaatga(SEQ ID NO:16)描述NM23-H1S120G突变核苷酸序列(NM23-H1：基因银行寄存号AF487339)。
MVLLSTLGIVFQGEGPPISSCDTGTMANCERTFIAIKPDGVQRGLVGEIIKRFEQKGFRLVGLKFMQASEDLLKEHYVDLKDRPFFAGLVKYMHSGPVVAMVWEGLNVVKTGRVMLGETNPADSKPGTIRGDFCIQVGRNIIHGGDSVESAEKEIGLWFHPEELVDYTSCAQNWIYE(SEQ ID NO:17)描述NM23-H1 S120G突变氨基酸序列(NM23-H1：基因银行寄存号AF487339)。
atggccaacctggagcgcaccttcatcgccatcaagccggacggcgtgcagcgcggcctggtgggcgagatcatcaagcgcttcgagcagaagggattccgcctcgtggccatgaagttcctccgggcctctgaagaacacctgaagcagcactacattgacctgaaagaccgaccattcttccctgggctggtgaagtacatgaactcagggccggttgtggccatggtctgggaggggctgaacgtggtgaagacaggccgagtgatgcttggggagaccaatccagcagattcaaagccaggcaccattcgtggggacttctgcattcaggttggcaggaacatcattcatggcagtgattcagtaaaaagtgctgaaaaagaaatcagcctatggtttaagcctgaagaactggttgactacaagtcttgtgctcatgactgggtctatgaataa(SEQ ID NO:18)描述NM23-H2核苷酸序列(NM23-H2：基因银行寄存号AK313448)。
MANLERTFIAIKPDGVQRGLVGEIIKRFEQKGFRLVAMKFLRASEEHLKQHYIDLKDRPFFPGLVKYMNSGPVVAMVWEGLNVVKTGRVMLGETNPADSKPGTIRGDFCIQVGRNIIHGSDSVKSAEKEISLWFKPEELVDYKSCAHDWVYE(SEQ ID NO:19)描述NM23-H2氨基酸序列(NM23-H2：基因银行寄存号AK313448)。
关于大肠杆菌表达优化的人类NM23-H7-2序列：
(DNA)
atgcatgacgttaaaaatcaccgtacctttctgaaacgcacgaaatatgataatctgcatctggaagacctgtttattggcaacaaagtcaatgtgttctctcgtcagctggtgctgatcgattatggcgaccagtacaccgcgcgtcaactgggtagtcgcaaagaaaaaacgctggccctgattaaaccggatgcaatctccaaagctggcgaaattatcgaaattatcaacaaagcgggtttcaccatcacgaaactgaaaatgatgatgctgagccgtaaagaagccctggattttcatgtcgaccaccagtctcgcccgtttttcaatgaactgattcaattcatcaccacgggtccgattatcgcaatggaaattctgcgtgatgacgctatctgcgaatggaaacgcctgctgggcccggcaaactcaggtgttgcgcgtaccgatgccagtgaatccattcgcgctctgtttggcaccgatggtatccgtaatgcagcacatggtccggactcattcgcatcggcagctcgtgaaatggaactgtttttcccgagctctggcggttgcggtccggcaaacaccgccaaatttaccaattgtacgtgctgtattgtcaaaccgcacgcagtgtcagaaggcctgctgggtaaaattctgatggcaatccgtgatgctggctttgaaatctcggccatgcagatgttcaacatggaccgcgttaacgtcgaagaattctacgaagtttacaaaggcgtggttaccgaatatcacgatatggttacggaaatgtactccggtccgtgcgtcgcgatggaaattcagcaaaacaatgccaccaaaacgtttcgtgaattctgtggtccggcagatccggaaatcgcacgtcatctgcgtccgggtaccctgcgcgcaatttttggtaaaacgaaaatccagaacgctgtgcactgtaccgatctgccggaagacggtctgctggaagttcaatactttttcaaaattctggataattga(SEQ ID NO:20)
(氨基酸)
MHDVKNHRTFLKRTKYDNLHLEDLFIGNKVNVFSRQLVLIDYGDQYTARQLGSRKEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFFKILDN-(SEQ ID NO:21)
人类NME7-A：
(DNA)
atggaaaaaacgctagccctaattaaaccagatgcaatatcaaaggctggagaaataattgaaataataaacaaagctggatttactataaccaaactcaaaatgatgatgctttcaaggaaagaagcattggattttcatgtagatcaccagtcaagaccctttttcaatgagctgatccagtttattacaactggtcctattattgccatggagattttaagagatgatgctatatgtgaatggaaaagactgctgggacctgcaaactctggagtggcacgcacagatgcttctgaaagcattagagccctctttggaacagatggcataagaaatgcagcgcatggccctgattcttttgcttctgcggccagagaaatggagttgtttttttga(SEQ ID NO:22)
(氨基酸)
MEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFF-(SEQ ID NO:23)
人类NME7-A1：
(DNA)
atggaaaaaacgctagccctaattaaaccagatgcaatatcaaaggctggagaaataattgaaataataaacaaagctggatttactataaccaaactcaaaatgatgatgctttcaaggaaagaagcattggattttcatgtagatcaccagtcaagaccctttttcaatgagctgatccagtttattacaactggtcctattattgccatggagattttaagagatgatgctatatgtgaatggaaaagactgctgggacctgcaaactctggagtggcacgcacagatgcttctgaaagcattagagccctctttggaacagatggcataagaaatgcagcgcatggccctgattcttttgcttctgcggccagagaaatggagttgttttttccttcaagtggaggttgtgggccggcaaacactgctaaatttacttga(SEQID NO:24)
(氨基酸)
MEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFT-(SEQ ID NO:25)
人类NME7-A2：
(DNA)
atgaatcatagtgaaagattcgttttcattgcagagtggtatgatccaaatgcttcacttcttcgacgttatgagcttttattttacccaggggatggatctgttgaaatgcatgatgtaaagaatcatcgcacctttttaaagcggaccaaatatgataacctgcacttggaagatttatttataggcaacaaagtgaatgtcttttctcgacaactggtattaattgactatggggatcaatatacagctcgccagctgggcagtaggaaagaaaaaacgctagccctaattaaaccagatgcaatatcaaaggctggagaaataattgaaataataaacaaagctggatttactataaccaaactcaaaatgatgatgctttcaaggaaagaagcattggattttcatgtagatcaccagtcaagaccctttttcaatgagctgatccagtttattacaactggtcctattattgccatggagattttaagagatgatgctatatgtgaatggaaaagactgctgggacctgcaaactctggagtggcacgcacagatgcttctgaaagcattagagccctctttggaacagatggcataagaaatgcagcgcatggccctgattcttttgcttctgcggccagagaaatggagttgtttttttga(SEQ IDNO:26)
(氨基酸)
MNHSERFVFIAEWYDPNASLLRRYELLFYPGDGSVEMHDVKNHRTFLKRTKYDNLHLEDLFIGNKVNVFSRQLVLIDYGDQYTARQLGSRKEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFF-(SEQ ID NO:27)
人类NME7-A3：
(DNA)
atgaatcatagtgaaagattcgttttcattgcagagtggtatgatccaaatgcttcacttcttcgacgttatgagcttttattttacccaggggatggatctgttgaaatgcatgatgtaaagaatcatcgcacctttttaaagcggaccaaatatgataacctgcacttggaagatttatttataggcaacaaagtgaatgtcttttctcgacaactggtattaattgactatggggatcaatatacagctcgccagctgggcagtaggaaagaaaaaacgctagccctaattaaaccagatgcaatatcaaaggctggagaaataattgaaataataaacaaagctggatttactataaccaaactcaaaatgatgatgctttcaaggaaagaagcattggattttcatgtagatcaccagtcaagaccctttttcaatgagctgatccagtttattacaactggtcctattattgccatggagattttaagagatgatgctatatgtgaatggaaaagactgctgggacctgcaaactctggagtggcacgcacagatgcttctgaaagcattagagccctctttggaacagatggcataagaaatgcagcgcatggccctgattcttttgcttctgcggccagagaaatggagttgttttttccttcaagtggaggttgtgggccggcaaacactgctaaatttacttga(SEQ ID NO:28)
(氨基酸)
MNHSERFVFIAEWYDPNASLLRRYELLFYPGDGSVEMHDVKNHRTFLKRTKYDNLHLEDLFIGNKVNVFSRQLVLIDYGDQYTARQLGSRKEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFT-(SEQ ID NO:29)
人类NME7-B：
(DNA)
atgaattgtacctgttgcattgttaaaccccatgctgtcagtgaaggactgttgggaaagatcctgatggctatccgagatgcaggttttgaaatctcagctatgcagatgttcaatatggatcgggttaatgttgaggaattctatgaagtttataaaggagtagtgaccgaatatcatgacatggtgacagaaatgtattctggcccttgtgtagcaatggagattcaacagaataatgctacaaagacatttcgagaattttgtggacctgctgatcctgaaattgcccggcatttacgccctggaactctcagagcaatctttggtaaaactaagatccagaatgctgttcactgtactgatctgccagaggatggcctattagaggttcaatacttcttctga(SEQ ID NO:30)
(氨基酸)
MNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFF-(SEQ IDNO:31)
人类NME7-B1：
(DNA)
atgaattgtacctgttgcattgttaaaccccatgctgtcagtgaaggactgttgggaaagatcctgatggctatccgagatgcaggttttgaaatctcagctatgcagatgttcaatatggatcgggttaatgttgaggaattctatgaagtttataaaggagtagtgaccgaatatcatgacatggtgacagaaatgtattctggcccttgtgtagcaatggagattcaacagaataatgctacaaagacatttcgagaattttgtggacctgctgatcctgaaattgcccggcatttacgccctggaactctcagagcaatctttggtaaaactaagatccagaatgctgttcactgtactgatctgccagaggatggcctattagaggttcaatacttcttcaagatcttggataattagtga(SEQ ID NO:32)
(氨基酸)
MNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFFKILDN—(SEQ ID NO:33)
人类NME7-B2：
(DNA)
atgccttcaagtggaggttgtgggccggcaaacactgctaaatttactaattgtacctgttgcattgttaaaccccatgctgtcagtgaaggactgttgggaaagatcctgatggctatccgagatgcaggttttgaaatctcagctatgcagatgttcaatatggatcgggttaatgttgaggaattctatgaagtttataaaggagtagtgaccgaatatcatgacatggtgacagaaatgtattctggcccttgtgtagcaatggagattcaacagaataatgctacaaagacatttcgagaattttgtggacctgctgatcctgaaattgcccggcatttacgccctggaactctcagagcaatctttggtaaaactaagatccagaatgctgttcactgtactgatctgccagaggatggcctattagaggttcaatacttcttctga(SEQ ID NO:34)
(氨基酸)
MPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFF-(SEQ ID NO:35)
人类NME7-B3：
(DNA)
atgccttcaagtggaggttgtgggccggcaaacactgctaaatttactaattgtacctgttgcattgttaaaccccatgctgtcagtgaaggactgttgggaaagatcctgatggctatccgagatgcaggttttgaaatctcagctatgcagatgttcaatatggatcgggttaatgttgaggaattctatgaagtttataaaggagtagtgaccgaatatcatgacatggtgacagaaatgtattctggcccttgtgtagcaatggagattcaacagaataatgctacaaagacatttcgagaattttgtggacctgctgatcctgaaattgcccggcatttacgccctggaactctcagagcaatctttggtaaaactaagatccagaatgctgttcactgtactgatctgccagaggatggcctattagaggttcaatacttcttcaagatcttggataattagtga(SEQ ID NO:36)
(氨基酸)
MPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFFKILDN--(SEQ ID NO:37)
人类NME7-AB：
(DNA)
atggaaaaaacgctagccctaattaaaccagatgcaatatcaaaggctggagaaataattgaaataataaacaaagctggatttactataaccaaactcaaaatgatgatgctttcaaggaaagaagcattggattttcatgtagatcaccagtcaagaccctttttcaatgagctgatccagtttattacaactggtcctattattgccatggagattttaagagatgatgctatatgtgaatggaaaagactgctgggacctgcaaactctggagtggcacgcacagatgcttctgaaagcattagagccctctttggaacagatggcataagaaatgcagcgcatggccctgattcttttgcttctgcggccagagaaatggagttgttttttccttcaagtggaggttgtgggccggcaaacactgctaaatttactaattgtacctgttgcattgttaaaccccatgctgtcagtgaaggactgttgggaaagatcctgatggctatccgagatgcaggttttgaaatctcagctatgcagatgttcaatatggatcgggttaatgttgaggaattctatgaagtttataaaggagtagtgaccgaatatcatgacatggtgacagaaatgtattctggcccttgtgtagcaatggagattcaacagaataatgctacaaagacatttcgagaattttgtggacctgctgatcctgaaattgcccggcatttacgccctggaactctcagagcaatctttggtaaaactaagatccagaatgctgttcactgtactgatctgccagaggatggcctattagaggttcaatacttcttcaagatcttggataattagtga(SEQ ID NO:38)
(氨基酸)
MEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFFKILDN--(SEQ IDNO:39)
人类NME7-AB1：
(DNA)
atggaaaaaacgctagccctaattaaaccagatgcaatatcaaaggctggagaaataattgaaataataaacaaagctggatttactataaccaaactcaaaatgatgatgctttcaaggaaagaagcattggattttcatgtagatcaccagtcaagaccctttttcaatgagctgatccagtttattacaactggtcctattattgccatggagattttaagagatgatgctatatgtgaatggaaaagactgctgggacctgcaaactctggagtggcacgcacagatgcttctgaaagcattagagccctctttggaacagatggcataagaaatgcagcgcatggccctgattcttttgcttctgcggccagagaaatggagttgttttttccttcaagtggaggttgtgggccggcaaacactgctaaatttactaattgtacctgttgcattgttaaaccccatgctgtcagtgaaggactgttgggaaagatcctgatggctatccgagatgcaggttttgaaatctcagctatgcagatgttcaatatggatcgggttaatgttgaggaattctatgaagtttataaaggagtagtgaccgaatatcatgacatggtgacagaaatgtattctggcccttgtgtagcaatggagattcaacagaataatgctacaaagacatttcgagaattttgtggacctgctgatcctgaaattgcccggcatttacgccctggaactctcagagcaatctttggtaaaactaagatccagaatgctgttcactgtactgatctgccagaggatggcctattagaggttcaatacttcttctga(SEQ ID NO:40)
(氨基酸)
MEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFF-(SEQ ID NO:41)
关于大肠杆菌表达优化的人类NME7-A序列：
(DNA)
atggaaaaaacgctggccctgattaaaccggatgcaatctccaaagctggcgaaattatcgaaattatcaacaaagcgggtttcaccatcacgaaactgaaaatgatgatgctgagccgtaaagaagccctggattttcatgtcgaccaccagtctcgcccgtttttcaatgaactgattcaattcatcaccacgggtccgattatcgcaatggaaattctgcgtgatgacgctatctgcgaatggaaacgcctgctgggcccggcaaactcaggtgttgcgcgtaccgatgccagtgaatccattcgcgctctgtttggcaccgatggtatccgtaatgcagcacatggtccggactcattcgcatcggcagctcgtgaaatggaactgtttttctga(SEQ ID NO:42)
(氨基酸)
MEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFF-(SEQ ID NO:43)
关于大肠杆菌表达优化的人类NME7-A1序列：
(DNA)
atggaaaaaacgctggccctgattaaaccggatgcaatctccaaagctggcgaaattatcgaaattatcaacaaagcgggtttcaccatcacgaaactgaaaatgatgatgctgagccgtaaagaagccctggattttcatgtcgaccaccagtctcgcccgtttttcaatgaactgattcaattcatcaccacgggtccgattatcgcaatggaaattctgcgtgatgacgctatctgcgaatggaaacgcctgctgggcccggcaaactcaggtgttgcgcgtaccgatgccagtgaatccattcgcgctctgtttggcaccgatggtatccgtaatgcagcacatggtccggactcattcgcatcggcagctcgtgaaatggaactgtttttcccgagctctggcggttgcggtccggcaaacaccgccaaatttacctga(SEQID NO:44)
(氨基酸)
MEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFT-(SEQ ID NO:45)
关于大肠杆菌表达优化的人类NME7-A2序列：
(DNA)
atgaatcactccgaacgctttgtttttatcgccgaatggtatgacccgaatgcttccctgctgcgccgctacgaactgctgttttatccgggcgatggtagcgtggaaatgcatgacgttaaaaatcaccgtacctttctgaaacgcacgaaatatgataatctgcatctggaagacctgtttattggcaacaaagtcaatgtgttctctcgtcagctggtgctgatcgattatggcgaccagtacaccgcgcgtcaactgggtagtcgcaaagaaaaaacgctggccctgattaaaccggatgcaatctccaaagctggcgaaattatcgaaattatcaacaaagcgggtttcaccatcacgaaactgaaaatgatgatgctgagccgtaaagaagccctggattttcatgtcgaccaccagtctcgcccgtttttcaatgaactgattcaattcatcaccacgggtccgattatcgcaatggaaattctgcgtgatgacgctatctgcgaatggaaacgcctgctgggcccggcaaactcaggtgttgcgcgtaccgatgccagtgaatccattcgcgctctgtttggcaccgatggtatccgtaatgcagcacatggtccggactcattcgcatcggcagctcgtgaaatggaactgtttttctga(SEQ IDNO:46)
(氨基酸)
MNHSERFVFIAEWYDPNASLLRRYELLFYPGDGSVEMHDVKNHRTFLKRTKYDNLHLEDLFIGNKVNVFSRQLVLIDYGDQYTARQLGSRKEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFF-(SEQ ID NO:47)
关于大肠杆菌表达优化的人类NME7-A3序列：
(DNA)
atgaatcactccgaacgctttgtttttatcgccgaatggtatgacccgaatgcttccctgctgcgccgctacgaactgctgttttatccgggcgatggtagcgtggaaatgcatgacgttaaaaatcaccgtacctttctgaaacgcacgaaatatgataatctgcatctggaagacctgtttattggcaacaaagtcaatgtgttctctcgtcagctggtgctgatcgattatggcgaccagtacaccgcgcgtcaactgggtagtcgcaaagaaaaaacgctggccctgattaaaccggatgcaatctccaaagctggcgaaattatcgaaattatcaacaaagcgggtttcaccatcacgaaactgaaaatgatgatgctgagccgtaaagaagccctggattttcatgtcgaccaccagtctcgcccgtttttcaatgaactgattcaattcatcaccacgggtccgattatcgcaatggaaattctgcgtgatgacgctatctgcgaatggaaacgcctgctgggcccggcaaactcaggtgttgcgcgtaccgatgccagtgaatccattcgcgctctgtttggcaccgatggtatccgtaatgcagcacatggtccggactcattcgcatcggcagctcgtgaaatggaactgtttttcccgagctctggcggttgcggtccggcaaacaccgccaaatttacctga(SEQ ID NO:48)
(氨基酸)
MNHSERFVFIAEWYDPNASLLRRYELLFYPGDGSVEMHDVKNHRTFLKRTKYDNLHLEDLFIGNKVNVFSRQLVLIDYGDQYTARQLGSRKEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFT-(SEQ ID NO:49)
关于大肠杆菌表达优化的人类NME7-B序列：
(DNA)
atgaattgtacgtgctgtattgtcaaaccgcacgcagtgtcagaaggcctgctgggtaaaattctgatggcaatccgtgatgctggctttgaaatctcggccatgcagatgttcaacatggaccgcgttaacgtcgaagaattctacgaagtttacaaaggcgtggttaccgaatatcacgatatggttacggaaatgtactccggtccgtgcgtcgcgatggaaattcagcaaaacaatgccaccaaaacgtttcgtgaattctgtggtccggcagatccggaaatcgcacgtcatctgcgtccgggtaccctgcgcgcaatttttggtaaaacgaaaatccagaacgctgtgcactgtaccgatctgccggaagacggtctgctggaagttcaatactttttctga(SEQ ID NO:50)
(氨基酸)
MNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFF-(SEQ IDNO:51)
关于大肠杆菌表达优化的人类NME7-B1序列：
(DNA)
atgaattgtacgtgctgtattgtcaaaccgcacgcagtgtcagaaggcctgctgggtaaaattctgatggcaatccgtgatgctggctttgaaatctcggccatgcagatgttcaacatggaccgcgttaacgtcgaagaattctacgaagtttacaaaggcgtggttaccgaatatcacgatatggttacggaaatgtactccggtccgtgcgtcgcgatggaaattcagcaaaacaatgccaccaaaacgtttcgtgaattctgtggtccggcagatccggaaatcgcacgtcatctgcgtccgggtaccctgcgcgcaatttttggtaaaacgaaaatccagaacgctgtgcactgtaccgatctgccggaagacggtctgctggaagttcaatactttttcaaaattctggataattga(SEQ ID NO:52)
(氨基酸)
MNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFFKILDN-(SEQIDNO:53)
关于大肠杆菌表达优化的人类NME7-B2序列：
(DNA)
atgccgagctctggcggttgcggtccggcaaacaccgccaaatttaccaattgtacgtgctgtattgtcaaaccgcacgcagtgtcagaaggcctgctgggtaaaattctgatggcaatccgtgatgctggctttgaaatctcggccatgcagatgttcaacatggaccgcgttaacgtcgaagaattctacgaagtttacaaaggcgtggttaccgaatatcacgatatggttacggaaatgtactccggtccgtgcgtcgcgatggaaattcagcaaaacaatgccaccaaaacgtttcgtgaattctgtggtccggcagatccggaaatcgcacgtcatctgcgtccgggtaccctgcgcgcaatttttggtaaaacgaaaatccagaacgctgtgcactgtaccgatctgccggaagacggtctgctggaagttcaatactttttctga(SEQ ID NO:54)
(氨基酸)
MPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFF-(SEQ ID NO:55)
关于大肠杆菌表达优化的人类NME7-B3序列：
(DNA)
atgccgagctctggcggttgcggtccggcaaacaccgccaaatttaccaattgtacgtgctgtattgtcaaaccgcacgcagtgtcagaaggcctgctgggtaaaattctgatggcaatccgtgatgctggctttgaaatctcggccatgcagatgttcaacatggaccgcgttaacgtcgaagaattctacgaagtttacaaaggcgtggttaccgaatatcacgatatggttacggaaatgtactccggtccgtgcgtcgcgatggaaattcagcaaaacaatgccaccaaaacgtttcgtgaattctgtggtccggcagatccggaaatcgcacgtcatctgcgtccgggtaccctgcgcgcaatttttggtaaaacgaaaatccagaacgctgtgcactgtaccgatctgccggaagacggtctgctggaagttcaatactttttcaaaattctggataattga(SEQID NO:56)
(氨基酸)
MPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFFKILDN-(SEQ ID NO:57)
关于大肠杆菌表达优化的人类NME7-AB序列：
(DNA)
atggaaaaaacgctggccctgattaaaccggatgcaatctccaaagctggcgaaattatcgaaattatcaacaaagcgggtttcaccatcacgaaactgaaaatgatgatgctgagccgtaaagaagccctggattttcatgtcgaccaccagtctcgcccgtttttcaatgaactgattcaattcatcaccacgggtccgattatcgcaatggaaattctgcgtgatgacgctatctgcgaatggaaacgcctgctgggcccggcaaactcaggtgttgcgcgtaccgatgccagtgaatccattcgcgctctgtttggcaccgatggtatccgtaatgcagcacatggtccggactcattcgcatcggcagctcgtgaaatggaactgtttttcccgagctctggcggttgcggtccggcaaacaccgccaaatttaccaattgtacgtgctgtattgtcaaaccgcacgcagtgtcagaaggcctgctgggtaaaattctgatggcaatccgtgatgctggctttgaaatctcggccatgcagatgttcaacatggaccgcgttaacgtcgaagaattctacgaagtttacaaaggcgtggttaccgaatatcacgatatggttacggaaatgtactccggtccgtgcgtcgcgatggaaattcagcaaaacaatgccaccaaaacgtttcgtgaattctgtggtccggcagatccggaaatcgcacgtcatctgcgtccgggtaccctgcgcgcaatttttggtaaaacgaaaatccagaacgctgtgcactgtaccgatctgccggaagacggtctgctggaagttcaatactttttcaaaattctggataattga(SEQ ID NO:58)
(氨基酸)
MEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFFKILDN-(SEQ IDNO:59)
关于大肠杆菌表达优化的人类NME7-AB1序列：
(DNA)
Atggaaaaaacgctggccctgattaaaccggatgcaatctccaaagctggcgaaattatcgaaattatcaacaaagcgggtttcaccatcacgaaactgaaaatgatgatgctgagccgtaaagaagccctggattttcatgtcgaccaccagtctcgcccgtttttcaatgaactgattcaattcatcaccacgggtccgattatcgcaatggaaattctgcgtgatgacgctatctgcgaatggaaacgcctgctgggcccggcaaactcaggtgttgcgcgtaccgatgccagtgaatccattcgcgctctgtttggcaccgatggtatccgtaatgcagcacatggtccggactcattcgcatcggcagctcgtgaaatggaactgtttttcccgagctctggcggttgcggtccggcaaacaccgccaaatttaccaattgtacgtgctgtattgtcaaaccgcacgcagtgtcagaaggcctgctgggtaaaattctgatggcaatccgtgatgctggctttgaaatctcggccatgcagatgttcaacatggaccgcgttaacgtcgaagaattctacgaagtttacaaaggcgtggttaccgaatatcacgatatggttacggaaatgtactccggtccgtgcgtcgcgatggaaattcagcaaaacaatgccaccaaaacgtttcgtgaattctgtggtccggcagatccggaaatcgcacgtcatctgcgtccgggtaccctgcgcgcaatttttggtaaaacgaaaatccagaacgctgtgcactgtaccgatctgccggaagacggtctgctggaagttcaatactttttctga(SEQ ID NO:60)
(氨基酸)
MEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFF-(SEQ ID NO:61)
小鼠NME6
(DNA)
Atgacctccatcttgcgaagtccccaagctcttcagctcacactagccctgatcaagcctgatgcagttgcccacccactgatcctggaggctgttcatcagcagattctgagcaacaagttcctcattgtacgaacgagggaactgcagtggaagctggaggactgccggaggttttaccgagagcatgaagggcgttttttctatcagcggctggtggagttcatgacaagtgggccaatccgagcctatatccttgcccacaaagatgccatccaactttggaggacactgatgggacccaccagagtatttcgagcacgctatatagccccagattcaattcgtggaagtttgggcctcactgacacccgaaatactacccatggctcagactccgtggtttccgccagcagagagattgcagccttcttccctgacttcagtgaacagcgctggtatgaggaggaggaaccccagctgcggtgtggtcctgtgcactacagtccagaggaaggtatccactgtgcagctgaaacaggaggccacaaacaacctaacaaaacctag(SEQ ID NO:62)
(氨基酸)
MTSILRSPQALQLTLALIKPDAVAHPLILEAVHQQILSNKFLIVRTRELQWKLEDCRRFYREHEGRFFYQRLVEFMTSGPIRAYILAHKDAIQLWRTLMGPTRVFRARYIAPDSIRGSLGLTDTRNTTHGSDSVVSASREIAAFFPDFSEQRWYEEEEPQLRCGPVHYSPEEGIHCAAETGGHKQPNKT-(SEQ ID NO:63)
人类NME6：
(DNA)
Atgacccagaatctggggagtgagatggcctcaatcttgcgaagccctcaggctctccagctcactctagccctgatcaagcctgacgcagtcgcccatccactgattctggaggctgttcatcagcagattctaagcaacaagttcctgattgtacgaatgagagaactactgtggagaaaggaagattgccagaggttttaccgagagcatgaagggcgttttttctatcagaggctggtggagttcatggccagcgggccaatccgagcctacatccttgcccacaaggatgccatccagctctggaggacgctcatgggacccaccagagtgttccgagcacgccatgtggccccagattctatccgtgggagtttcggcctcactgacacccgcaacaccacccatggttcggactctgtggtttcagccagcagagagattgcagccttcttccctgacttcagtgaacagcgctggtatgaggaggaagagccccagttgcgctgtggccctgtgtgctatagcccagagggaggtgtccactatgtagctggaacaggaggcctaggaccagcctga(SEQ ID NO:64)
(氨基酸)
MTQNLGSEMASILRSPQALQLTLALIKPDAVAHPLILEAVHQQILSNKFLIVRMRELLWRKEDCQRFYREHEGRFFYQRLVEFMASGPIRAYILAHKDAIQLWRTLMGPTRVFRARHVAPDSIRGSFGLTDTRNTTHGSDSVVSASREIAAFFPDFSEQRWYEEEEPQLRCGPVCYSPEGGVHYVAGTGGLGPA-(SEQ IDNO:65)
人类NME6 1：
(DNA)
Atgacccagaatctggggagtgagatggcctcaatcttgcgaagccctcaggctctccagctcactctagccctgatcaagcctgacgcagtcgcccatccactgattctggaggctgttcatcagcagattctaagcaacaagttcctgattgtacgaatgagagaactactgtggagaaaggaagattgccagaggttttaccgagagcatgaagggcgttttttctatcagaggctggtggagttcatggccagcgggccaatccgagcctacatccttgcccacaaggatgccatccagctctggaggacgctcatgggacccaccagagtgttccgagcacgccatgtggccccagattctatccgtgggagtttcggcctcactgacacccgcaacaccacccatggttcggactctgtggtttcagccagcagagagattgcagccttcttccctgacttcagtgaacagcgctggtatgaggaggaagagccccagttgcgctgtggccctgtgtga(SEQ ID NO:66)
(氨基酸)
MTQNLGSEMASILRSPQALQLTLALIKPDAVAHPLILEAVHQQILSNKFLIVRMRELLWRKEDCQRFYREHEGRFFYQRLVEFMASGPIRAYILAHKDAIQLWRTLMGPTRVFRARHVAPDSIRGSFGLTDTRNTTHGSDSVVSASREIAAFFPDFSEQRWYEEEEPQLRCGPV-(SEQ ID NO:67)
人类NME6 2：
(DNA)
Atgctcactctagccctgatcaagcctgacgcagtcgcccatccactgattctggaggctgttcatcagcagattctaagcaacaagttcctgattgtacgaatgagagaactactgtggagaaaggaagattgccagaggttttaccgagagcatgaagggcgttttttctatcagaggctggtggagttcatggccagcgggccaatccgagcctacatccttgcccacaaggatgccatccagctctggaggacgctcatgggacccaccagagtgttccgagcacgccatgtggccccagattctatccgtgggagtttcggcctcactgacacccgcaacaccacccatggttcggactctgtggtttcagccagcagagagattgcagccttcttccctgacttcagtgaacagcgctggtatgaggaggaagagccccagttgcgctgtggccctgtgtga(SEQ ID NO:68)
(氨基酸)
MLTLALIKPDAVAHPLILEAVHQQILSNKFLIVRMRELLWRKEDCQRFYREHEGRFFYQRLVEFMASGPIRAYILAHKDAIQLWRTLMGPTRVFRARHVAPDSIRGSFGLTDTRNTTHGSDSVVSASREIAAFFPDFSEQRWYEEEEPQLRCGPV-(SEQ ID NO:69)
人类NME6 3：
(DNA)
Atgctcactctagccctgatcaagcctgacgcagtcgcccatccactgattctggaggctgttcatcagcagattctaagcaacaagttcctgattgtacgaatgagagaactactgtggagaaaggaagattgccagaggttttaccgagagcatgaagggcgttttttctatcagaggctggtggagttcatggccagcgggccaatccgagcctacatccttgcccacaaggatgccatccagctctggaggacgctcatgggacccaccagagtgttccgagcacgccatgtggccccagattctatccgtgggagtttcggcctcactgacacccgcaacaccacccatggttcggactctgtggtttcagccagcagagagattgcagccttcttccctgacttcagtgaacagcgctggtatgaggaggaagagccccagttgcgctgtggccctgtgtgctatagcccagagggaggtgtccactatgtagctggaacaggaggcctaggaccagcctga(SEQ ID NO:70)
(氨基酸)
MLTLALIKPDAVAHPLILEAVHQQILSNKFLIVRMRELLWRKEDCQRFYREHEGRFFYQRLVEFMASGPIRAYILAHKDAIQLWRTLMGPTRVFRARHVAPDSIRGSFGLTDTRNTTHGSDSVVSASREIAAFFPDFSEQRWYEEEEPQLRCGPVCYSPEGGVHYVAGTGGLGPA-(SEQ ID NO:71)
关于大肠杆菌表达优化的人类NME6序列：
(DNA)
Atgacgcaaaatctgggctcggaaatggcaagtatcctgcgctccccgcaagcactgcaactgaccctggctctgatcaaaccggacgctgttgctcatccgctgattctggaagcggtccaccagcaaattctgagcaacaaatttctgatcgtgcgtatgcgcgaactgctgtggcgtaaagaagattgccagcgtttttatcgcgaacatgaaggccgtttcttttatcaacgcctggttgaattcatggcctctggtccgattcgcgcatatatcctggctcacaaagatgcgattcagctgtggcgtaccctgatgggtccgacgcgcgtctttcgtgcacgtcatgtggcaccggactcaatccgtggctcgttcggtctgaccgatacgcgcaataccacgcacggtagcgactctgttgttagtgcgtcccgtgaaatcgcggcctttttcccggacttctccgaacagcgttggtacgaagaagaagaaccgcaactgcgctgtggcccggtctgttattctccggaaggtggtgtccattatgtggcgggcacgggtggtctgggtccggcatga(SEQ ID NO:72)
(氨基酸)
MTQNLGSEMASILRSPQALQLTLALIKPDAVAHPLILEAVHQQILSNKFLIVRMRELLWRKEDCQRFYREHEGRFFYQRLVEFMASGPIRAYILAHKDAIQLWRTLMGPTRVFRARHVAPDSIRGSFGLTDTRNTTHGSDSVVSASREIAAFFPDFSEQRWYEEEEPQLRCGPVCYSPEGGVHYVAGTGGLGPA-(SEQ ID NO:73)
关于大肠杆菌表达优化的人类NME6 1序列：
(DNA)
Atgacgcaaaatctgggctcggaaatggcaagtatcctgcgctccccgcaagcactgcaactgaccctggctctgatcaaaccggacgctgttgctcatccgctgattctggaagcggtccaccagcaaattctgagcaacaaatttctgatcgtgcgtatgcgcgaactgctgtggcgtaaagaagattgccagcgtttttatcgcgaacatgaaggccgtttcttttatcaacgcctggttgaattcatggcctctggtccgattcgcgcatatatcctggctcacaaagatgcgattcagctgtggcgtaccctgatgggtccgacgcgcgtctttcgtgcacgtcatgtggcaccggactcaatccgtggctcgttcggtctgaccgatacgcgcaataccacgcacggtagcgactctgttgttagtgcgtcccgtgaaatcgcggcctttttcccggacttctccgaacagcgttggtacgaagaagaagaaccgcaactgcgctgtggcccggtctga(SEQ ID NO:74)
(氨基酸)
MTQNLGSEMASILRSPQALQLTLALIKPDAVAHPLILEAVHQQILSNKFLIVRMRELLWRKEDCQRFYREHEGRFFYQRLVEFMASGPIRAYILAHKDAIQLWRTLMGPTRVFRARHVAPDSIRGSFGLTDTRNTTHGSDSVVSASREIAAFFPDFSEQRWYEEEEPQLRCGPV-(SEQ ID NO:75)
关于大肠杆菌表达优化的人类NME6 2序列：
(DNA)
Atgctgaccctggctctgatcaaaccggacgctgttgctcatccgctgattctggaagcggtccaccagcaaattctgagcaacaaatttctgatcgtgcgtatgcgcgaactgctgtggcgtaaagaagattgccagcgtttttatcgcgaacatgaaggccgtttcttttatcaacgcctggttgaattcatggcctctggtccgattcgcgcatatatcctggctcacaaagatgcgattcagctgtggcgtaccctgatgggtccgacgcgcgtctttcgtgcacgtcatgtggcaccggactcaatccgtggctcgttcggtctgaccgatacgcgcaataccacgcacggtagcgactctgttgttagtgcgtcccgtgaaatcgcggcctttttcccggacttctccgaacagcgttggtacgaagaagaagaaccgcaactgcgctgtggcccggtctga(SEQ ID NO:76)
(氨基酸)
MLTLALIKPDAVAHPLILEAVHQQILSNKFLIVRMRELLWRKEDCQRFYREHEGRFFYQRLVEFMASGPIRAYILAHKDAIQLWRTLMGPTRVFRARHVAPDSIRGSFGLTDTRNTTHGSDSVVSASREIAAFFPDFSEQRWYEEEEPQLRCGPV-(SEQ ID NO:77)
关于大肠杆菌表达优化的人类NME6 3序列：
(DNA)
Atgctgaccctggctctgatcaaaccggacgctgttgctcatccgctgattctggaagcggtccaccagcaaattctgagcaacaaatttctgatcgtgcgtatgcgcgaactgctgtggcgtaaagaagattgccagcgtttttatcgcgaacatgaaggccgtttcttttatcaacgcctggttgaattcatggcctctggtccgattcgcgcatatatcctggctcacaaagatgcgattcagctgtggcgtaccctgatgggtccgacgcgcgtctttcgtgcacgtcatgtggcaccggactcaatccgtggctcgttcggtctgaccgatacgcgcaataccacgcacggtagcgactctgttgttagtgcgtcccgtgaaatcgcggcctttttcccggacttctccgaacagcgttggtacgaagaagaagaaccgcaactgcgctgtggcccggtctgttattctccggaaggtggtgtccattatgtggcgggcacgggtggtctgggtccggcatga(SEQ ID NO:78)
(氨基酸)
MLTLALIKPDAVAHPLILEAVHQQILSNKFLIVRMRELLWRKEDCQRFYREHEGRFFYQRLVEFMASGPIRAYILAHKDAIQLWRTLMGPTRVFRARHVAPDSIRGSFGLTDTRNTTHGSDSVVSASREIAAFFPDFSEQRWYEEEEPQLRCGPVCYSPEGGVHYVAGTGGLGPA-(SEQ ID NO:79)
OriGene-NME7-1全长
(DNA)
gacgttgtatacgactcctatagggcggccgggaattcgtcgactggatccggtaccgaggagatctgccgccgcgatcgccatgaatcatagtgaaagattcgttttcattgcagagtggtatgatccaaatgcttcacttcttcgacgttatgagcttttattttacccaggggatggatctgttgaaatgcatgatgtaaagaatcatcgcacctttttaaagcggaccaaatatgataacctgcacttggaagatttatttataggcaacaaagtgaatgtcttctctcgacaactggtattaattgactatggggatcaatatacagctcgccagctgggcagtaggaaagaaaaaacgctagccctaattaaaccagatgcaatatcaaaggctggagaaataattgaaataataaacaaagctggatttactataaccaaactcaaaatgatgatgctttcaaggaaagaagcattggattttcatgtagatcaccagtcaagaccctttttcaatgagctgatccagtttattacaactggtcctattattgccatggagattttaagagatgatgctatatgtgaatggaaaagactgctgggacctgcaaactctggagtggcacgcacagatgcttctgaaagcattagagccctctttggaacagatggcataagaaatgcagcgcatggccctgattcttttgcttctgcggccagagaaatggagttgttttttccttcaagtggaggttgtgggccggcaaacactgctaaatttactaattgtacctgttgcattgttaaaccccatgctgtcagtgaaggactgttgggaaagatcctgatggctatccgagatgcaggttttgaaatctcagctatgcagatgttcaatatggatcgggttaatgttgaggaattctatgaagtttataaaggagtagtgaccgaatatcatgacatggtgacagaaatgtattctggcccttgtgtagcaatggagattcaacagaataatgctacaaagacatttcgagaattttgtggacctgctgatcctgaaattgcccggcatttacgccctggaactctcagagcaatctttggtaaaactaagatccagaatgctgttcactgtactgatctgccagaggatggcctattagaggttcaatacttcttcaagatcttggataatacgcgtacgcggccgctcgagcagaaactcatctcagaagaggatctggcagcaaatgatatcctggattacaaggatgacgacgataaggtttaa(SEQ ID NO:80)
(氨基酸)
MNHSERFVFIAEWYDPNASLLRRYELLFYPGDGSVEMHDVKNHRTFLKRTKYDNLHLEDLFIGNKVNVFSRQLVLIDYGDQYTARQLGSRKEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFFKILDNTRTRRLEQKLISEEDLAANDILDYKDDDDKV(SEQ ID NO:81)
Abnova NME7-1全长
(氨基酸)
MNHSERFVFIAEWYDPNASLLRRYELLFYPGDGSVEMHDVKNHRTFLKRTKYDNLHLEDLFIGNKVNVFSRQLVLIDYGDQYTARQLGSRKEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFFKILDN(SEQ ID NO:82)
Abnova Partial NME7-B
(氨基酸)
DRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFFKIL(SEQ ID NO:83)
组氨酸标签
(ctcgag)caccaccaccaccaccactga(SEQ ID NO:84)
Strept II标签
(accggt)tggagccatcctcagttcgaaaagtaatga(SEQ ID NO:85)
N-10肽：
QFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(SEQ ID NO:86)
C-10肽
GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDV(SEQ ID NO:87)
LALIKPDA(SEQ ID NO:88)
MMMLSRKEALDFHVDHQS(SEQ ID NO:89)
ALDFHVDHQS(SEQ ID NO:90)
EILRDDAICEWKRL(SEQ ID NO:91)
FNELIQFITTGP(SEQ ID NO:92)
RDDAICEW(SEQ ID NO:93)
SGVARTDASESIRALFGTDGIRNAA(SEQ ID NO:94)
ELFFPSSGG(SEQ ID NO:95)
KFTNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMA(SEQ ID NO:96)
LMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVT(SEQ ID NO:97)
EFYEVYKGVVTEYHD(SEQ ID NO:98)
EIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNA(SEQ IDNO:99)
YSGPCVAM(SEQ ID NO:100)
FREFCGP(SEQ ID NO:101)
VHCTDLPEDGLLEVQYFFKILDN(SEQ ID NO:102)
IQNAVHCTD(SEQ ID NO:103)
TDLPEDGLLEVQYFFKILDN(SEQ ID NO:104)
PEDGLLEVQYFFK(SEQ ID NO:105)
EIINKAGFTITK(SEQ ID NO:106)
MLSRKEALDFHVDHQS(SEQ ID NO:107)
NELIQFITT(SEQ ID NO:108)
EILRDDAICEWKRL(SEQ ID NO:109)
SGVARTDASESIRALFGTDGI(SEQ ID NO:110)
SGVARTDASES(SEQ ID NO:111)
ALFGTDGI(SEQ ID NO:112)
NCTCCIVKPHAVSE(SEQ ID NO:113)
LGKILMAIRDA(SEQ ID NO:114)
EISAMQMFNMDRVNVE(SEQ ID NO:115)
EVYKGVVT(SEQ ID NO:116)
EYHDMVTE(SEQ ID NO:117)
EFCGPADPEIARHLR(SEQ ID NO:118)
AIFGKTKIQNAV(SEQ ID NO:119)
LPEDGLLEVQYFFKILDN(SEQ ID NO:120)
GPDSFASAAREMELFFP(SEQ ID NO:121)
衍生自人类NME7的免疫肽
ICEWKRL(SEQ ID NO:122)
LGKILMAIRDA(SEQ ID NO:123)
HAVSEGLLGK(SEQ ID NO:124)
VTEMYSGP(SEQ ID NO:125)
NATKTFREF(SEQ ID NO:126)
AIRDAGFEI(SEQ ID NO:127)
AICEWKRLLGPAN(SEQ ID NO:128)
DHQSRPFF(SEQ ID NO:129)
AICEWKRLLGPAN(SEQ ID NO:130)
VDHQSRPF(SEQ ID NO:131)
PDSFAS(SEQ ID NO:132)
KAGEIIEIINKAGFTITK(SEQ ID NO:133)
衍生自人类NME1的免疫肽
MANCERTFIAIKPDGVQRGLVGEIIKRFE(SEQ ID NO:134)
VDLKDRPF(SEQ ID NO:135)
HGSDSVESAEKEIGLWF(SEQ ID NO:136)
ERTFIAIKPDGVQRGLVGEIIKRFE(SEQ ID NO:137)
VDLKDRPFFAGLVKYMHSGPVVAMVWEGLN(SEQ ID NO:138)
NIIHGSDSVESAEKEIGLWFHPEELV(SEQ ID NO:139)
KPDGVQRGLVGEII(SEQ ID NO:140)
通过使小鼠中的人类移植癌细胞接触NME7或NME7-AB使小鼠对针对癌细胞的药物测试的反应更如同人类
NME家族成员蛋白可起促进癌症的作用。传统地用于药物发现中的小鼠、啮齿动物及其他动物在其对测试功效或毒性的药物的反应中并不精确地模拟人类。若干『糟糕药物』已成为关于在人类中引起严重不良反应(包括死亡)的诉讼的主题，而相同药物在小鼠中未显示毒性。小鼠中的作用与人类中的作用之间不一致的一个原因为：与人类相比，小鼠中的疾病的分子机制以及健康功能不同。
我们已发现人类干细胞及人类癌细胞具有相同的生长机制。癌细胞及多能性干细胞二者均过度表达作为强力生长因子受体的MUC1*(Mahanta S等人2008)。二聚形式的MUC1*的配位体NM23-H1(也称作NME1)单独就足以使得人类干细胞在多能性状态下生长而无需饲养细胞、条件培养基或任何其他生长因子或细胞激素(Hikita S等人2008)。我们先前显示NM23-H1二聚体为MUC1*生长因子受体的配位体，其中MUC1*为在大部分细胞外域已裂解及自细胞表面脱落之后剩余的跨膜部分。细胞外域的剩余部分主要由PSMGFR序列组成。NM23二聚体结合至MUC1*受体且使其二聚化。使用合成PSMGFR肽对NME-MUC1*相互作用进行竞争性抑制诱发多能性干细胞的分化，由此显示多能性干细胞生长是通过NM23二聚体与MUC1*生长因子受体之间的相互作用介导。类似地，较大比例的癌症经过几乎相同的机制生长。在超过75％的所有人类癌症中，MUC1裂解为MUC1*形式。如同人类干细胞，人类癌细胞分泌NM23，其中在二聚化的后，其结合至MUC1*受体且刺激人类癌细胞的生长。通过添加PSMGFR肽或通过添加抗MUC1*(抗PSMGFR)抗体的Fab来竞争性抑制相互作用引起试管内及活体内人类肿瘤细胞生长的极大减少。
我们发现NME家族的新生长因子NME7，其在不存在FGF或任何其他生长因子的情况下使人类干细胞生长且抑制其分化。据报导，NME7仅在胚胎中表达，但不在除睪丸外的任何成人组织中表达。出人意料地，我们发现多种人类癌症(尤其为侵袭性癌症)表达NME7且以已经历转译后裂解的活化形式分泌该NME7以产生以约33kDa的表观分子量出现的NME7物质。此与具有约42kDa的计算分子量且似乎局限于细胞质的全长NME7形成对比。分泌的NME7充当人类干细胞及人类癌症的生长因子。如同NM23二聚体，NME7结合至MUC1*生长因子受体且使其二聚化；然而，NME7以单体形式实现此举，因为其具有两个用于MUC1*的细胞外域的结合位点。因此，人类干细胞及人类癌症借助于相同生长因子生长：二聚体形式的NM23(也称作NME1)或NME7。
NME蛋白促进胚胎及iPS细胞的生长及多能性以及诱导细胞恢复为干样状态。由于干样状态及癌性状态的许多基因特征现为共享的(Kumar SM等人2012,Liu K等人2013,YeoJC等人2014,Oshima N等人2014,Wang ML等人2013)，我们得出NME家族成员蛋白也能够诱发癌性状态的结论。在一较佳具体实例中，NME家族成员蛋白为与NME1具有大于30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或97％序列一致性的NME1或NME蛋白，其中该蛋白为二聚体。在一更佳具体实例中，NME家族成员蛋白为与NME7域A或B中的至少一者具有大于30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或97％序列一致性且能够使MUC1*生长因子受体二聚化的NME7或NME蛋白。
本文中，我们报导二聚体形式的NME1、二聚体形式的细菌性NME1、NME7或NME7-AB能够：a)完全支撑人类ES或iPS生长及多能性，同时抑制分化；b)将体细胞恢复至更干样或癌样状态；及c)将癌细胞转化至高度转移性癌症干细胞状态，亦称为肿瘤起始细胞。
我们制得重组人类NM23(亦称作NME1)二聚体，其携有使二聚体稳定的S120G突变体。我们先前报导人类NME1二聚体结合至MUC1*受体的细胞外域的PSMGFR部分(Smagghe等人2013)。我们还制得以单体形式分泌的重组人类NME7-AB。图47显示NME7-AB单体结合至MUC1*受体的细胞外域的PSMGFR部分且使其二聚化。我们制得与人类NME1具有高序列同源性且据报导以二聚体状态存在的发现于盐单胞菌属(Halomonas Sp.)593(『HSP593』)及牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonasgingivalis)W83中的重组细菌NME蛋白(图48及图49)。HSP593在大肠杆菌中较佳地表达且很大一部分以二聚体形式存在，该群体随后经过FPLC纯化且确认为二聚体群体(图48a)。进行直接结合实验，其显示来自盐单胞菌属593的细菌NME结合于MUC1*细胞外域的PSMGFR肽，图48b。HSP 593与人类NME1或人类NME7域A或B之间的序列比对显示结合于MUC1*细胞外域的细菌NME与人类NME1及人类NME7-A具有40％-41％一致性，且与NME7-B具有34％一致性，图50A-C。
进行额外实验,其显示与人类NME1或NME7具有大于30％或更佳40％一致性的细菌性NME与促进癌症及干细胞生长及存活的人类NME起相同作用。多种与人类NME具有此高序列一致性的细菌性NME据报导与人类癌症有关。本文中，我们报导与人类NME具有高序列一致性的细菌性NME蛋白能够与人类NME起相同作用以促进癌症生长及促进癌细胞转化为癌症干细胞或更具转移性的癌细胞。相对于人类NME1及NME7在功能分析中测试细菌性NME。
然而，已知小鼠干细胞具有与人类干细胞不同的机制生长。小鼠LIF，白血病起始因子可完全支撑小鼠干细胞生长，尽管LIF对人类干细胞生长无作用。用于人类干细胞培养物中的主生长因子为bFGF(Xu C等人2005)或碱性纤维母细胞生长因子。bFGF无法支撑小鼠干细胞生长。此显示小鼠干细胞生长的基础生物学极不同于人类干细胞生长的基础生物学。当考虑在小鼠中测试癌症药物时，此事实变得极重要。
在小鼠及其他动物中测试癌症药物的当前实务为将人类癌细胞注射至动物中且紧接着移植或在移植之后数日或数周用测试药物对动物进行注射。然而，此方法为基本上有缺陷的，因为宿主并不自然地产生人类癌细胞需要生长或移植的生长因子。另外，由于宿主并不产生生长因子或相同含量的生长因子或人类形式的生长因子，动物中测试的药物将不具有与其将在人类中所具有的相同作用。小鼠NME7仅与人类NME7具有84％同源性且在成人中不表达。因此，用于抗癌药物测试的当前异种移植方法通常在预测人类对这类药物的反应中达不到要求。可经过将NM23二聚体或NME7引入至小鼠中以使得人类肿瘤细胞具有供养肿瘤的其同源生长因子而解决此问题。可通过多种方法将NM23二聚体或NME7引入至动物中。其可在植入之前与肿瘤细胞混合，或其可注射至携有肿瘤的动物中。
在一较佳具体实例中，产生表达人类NME7或其片段的转基因动物。可在诱导型启动子上携带NME7以使得可自然地产生动物，但可在植入人类肿瘤期间或在评定药物功效或毒性中开启NME7或NME7片段的表达。在一较佳具体实例中，引入至测试动物中的NME7物种为NME7-AB。
或者，可制得一种转基因动物，其中该动物表达人类MUC1、MUC1*、NME7及/或NM23-H1或-H2、偏好二聚体形成的H1或H2的变异体、形成二聚体的单链构筑体或其他变异体。由于NME蛋白及MUC1为人体中的反馈回路的部分，其中表达一者可引起另一者的上调，其可对产生表达人类NME蛋白及MUC1或裂解形式MUC1*的转基因动物有利。天然或工程改造NME物种可通过包括以下的多种方法中的任一者引入至动物，诸如小鼠中：产生转基因动物、用天然或重组NME蛋白或NME蛋白的变异体对动物进行注射，其中NME1(NM23-H1)、NME6及NME7蛋白或变异体较佳且能够使MUC1*二聚化的NME NME1(NM23-H1)、NME6及NME7蛋白或变异体，特定言之PSMGFR肽尤佳。在一较佳具体实例中，NME物种为具有约33kDa的分子量的NME7的截短形式。在一更佳具体实例中，NME7物种缺少其N-端的DM10域。在一更佳具体实例中，NME7物种为人类。
NME家族蛋白，尤其为NME1、NME6及NME7表达于人类癌症中，其中其充当促进人类癌症的生长及癌转移的生长因子。因此，应存在人类NME蛋白或NME蛋白的活性形式以便人类癌症恰当生长、演化及评定及判定其对于化合物、生物制剂或药物的反应。
NME7的存在增加人类癌细胞于非人类动物中的移植率
测试人类癌症及药物以在啮齿动物及其他动物中对其进行处理的另一问题为多种人类癌症不易于在宿主动物中移植。多种常规地用于试管内测试的癌细胞系仅具有对于可靠的动物研究太低的移植率。举例而言，T47D乳癌细胞系由于其过度表达致癌基因MUC1而典型地用于试管内研究。然而，T47D细胞由于其不佳移植率而偶尔用于小鼠异种移植研究中。
如同多种人类癌症，T47D细胞表达及分泌NME1及NME7。在验证携有人类肿瘤的动物中的试管内结果时出现的问题为T47D移植至小鼠中的速率通常在25％至35％之间。其意谓我们需要以比实验所需多至少四倍的小鼠开始且等待数周以鉴别移植肿瘤的这类小鼠。更重要地，有问题的是移植率如此低且引发宿主不产生模拟人类的环境，且因此，药物测试结果可能用途有限的担忧。
借助NME蛋白的存在极大增强将人类癌症移植至啮齿动物及其他测试动物中，其中NME蛋白可为NME1、NME6或NME7。存在多种熟习此项技术者已知的用于将NME蛋白引入至测试动物中的方法。NME蛋白可注射至测试动物中或可产生表达NME蛋白的转基因动物。在一些情况下，期望能够控制NME蛋白的表达定时。在此等情况下，蛋白表达可与诱导型遗传成分，诸如可调控启动子有关。在一较佳具体实例中，引入至动物中以增加人类干细胞或癌细胞的移植的NME蛋白为人类NME7。在一更佳具体实例中，NME7蛋白为约33kDa的片段。在一更佳具体实例中，NME蛋白为人类NME7-AB。
在小鼠研究中，注射人类NME7-AB的动物显示人类肿瘤细胞的移植率的增加。经过植入动物中之前将癌细胞与NME7混合极大增强MUC1*阳性肿瘤细胞(T47D)的移植且经过每日将NME7注射至携有肿瘤的小鼠中进一步增强。在一个实验中，当肿瘤在植入之前与NME7混合时，第7天直至第21天的平均生长增加为144％，且在不混合的情况下为57％(参见图1a)。在相同研究中，单独在植入之前将癌细胞与NME7混合，或加上在细胞植入之后将NME7注射至动物中。结果显示移植率分别为33％及66％，图1b。图2显示个别小鼠中的人类肿瘤细胞生长图。图(A)显示与标准基质胶混合的T47D乳癌细胞生长图。六(6)只植入小鼠中仅两(2)只显示移植的肿瘤生长特征。图(B)显示与基质胶及NME7混合的T47D乳癌细胞的生长图。六(6)只植入小鼠中的四(4)只显示移植的肿瘤生长特征。虚线指示在第14天之后亦注射NME7的小鼠。在使用40只免疫缺陷小鼠进行的另一研究中显示在不与NME7预先混合及无NME7注射的情况下植入的癌细胞具有约25％的真实移植率。第7天至第24天的平均生长显示22％的适度生长增加，但在肿瘤尺寸中具有减小趋势。图3显示与标准基质胶混合且异种移植至四十(40)只免疫缺陷(nu/nu)小鼠中的T47D肿瘤细胞图。该图显示两组相同的20只小鼠的平均值，每一组的肿瘤体积具有22％的平均增加但具有向下趋势。图4显示四十(40)只个别小鼠中的T47D人类乳房肿瘤细胞的生长图，约25％显示肿瘤移植。图5显示与基质胶混合且异种移植至六(6)只NOD/SCID小鼠的侧腹中的T47D乳癌细胞的生长图。图(A)显示平均肿瘤生长。图(B)显示个别小鼠中的肿瘤生长，其展现使用标准方法的六(6)只小鼠中仅一(1)只具有良好肿瘤移植。此等实例展示将人类癌细胞移植至宿主动物中的难度。
癌症干细胞
与此相关的是，当前无用于评估化合物、生物制剂或药物对『肿瘤起始细胞』(其也称作『癌症干细胞』)的功效、毒性或剂量的实用方法。癌症干细胞为具有起始肿瘤形成能力的肿瘤中的少数细胞。认为此等细胞为造成癌转移的细胞，因为从肿瘤挣脱的单一细胞在理论上可引起远程癌转移。研究者亦已证明癌症干细胞可逃脱化学治疗的杀伤效应(Fessler S等人2009,LissaNurrul Abdullah及Edward Kai-Hua Chow 2013)。首先借助特异性分子标记物，诸如CD44-高及CD24-低的存在鉴别癌症干细胞。最近，受体CXCR4已鉴别为在癌症干细胞及转移性癌细胞中的表达较高的转移性受体。现存在一组被认作癌症干细胞的标记物的基因(Miki J等人2007,Jeter CR等人2011,Hong X等人2012,Faber A等人2013,Mukherjee D等人2013,Herreros-Villanueva M等人,2013,Sefah K等人,2013；SuH-T等人2013)。
若极小量的细胞能够在动物中产生肿瘤，则将实验视为癌症干细胞的决定性证明。尽管将肿瘤移植至nu/nu小鼠的侧腹中所需的典型癌细胞数目为4,000,000至6,000,000，但癌症干细胞能够自少至大约100细胞起始肿瘤形成，尽管在大部分公开的报导中，此等癌症干细胞植入乳房脂肪垫中且需要数月来发展。尽管存在鉴别癌症干细胞的方法，但迄今为止，尚无证据证明有可能将癌细胞暴露于使其转变为癌症干细胞的一或多种药剂。因此，当前无测试化合物、生物制剂或药物抑制此等转移性癌症干细胞的能力的实用方法。目前先进技术的巨大改良将为产生一种影响常规癌细胞快速变为癌症干细胞的方法以使得除原始癌细胞以外，转移性癌症干细胞亦可经筛选以鉴别将对其进行抑制的治疗。以此方式，可用抑制原发癌的药物，以及用将抑制可在癌症干细胞转移之后数年杀死患者的癌症干细胞的亚群的药物治疗患者。
能够使经诱导干细胞恢复至初始状态(Nichols J,Smith A 2009,Hanna J等人2010,Smagghe B等人2013)或能够将初始干细胞维持初始状态下的药剂亦能够将癌细胞转化为更具转移性状态，有时亦称为癌症干细胞或肿瘤起始细胞。举例而言，NME蛋白能够使干细胞维持初始状态且能够使经诱导状态干细胞恢复至初始状态。特定言之，二聚形式的NME1及NME6或单体形式的NME7能够使干细胞维持初始状态且亦能够将癌细胞转化至更具侵袭性或转移性的状态。NME7将癌细胞转化为癌症干细胞。
NME1及NME7具有将癌细胞转化至更具转移性的癌症干细胞状态，亦称作肿瘤起始细胞的能力。以人类NME7-AB或人类NME1二聚体(图中的『NM23』)作为唯一生长因子或细胞激素在无血清基本培养基中培养一组癌细胞。在此培养基中数日之后，细胞开始在表面浮起且继续在溶液中生长。收集『漂浮物』且分别藉由PCR进行分析。用ρ激酶抑制剂(图中的『Ri』)处理其他孔中的细胞。定量PCR量测显示癌症干细胞标记物的增加，其中一些在过去惯常地仅被认作干细胞标记物。
其他人已报导称作『2i』(Silva J等人2008)及『5i』(Theunissen TW等人2014)的抑制剂能够使干细胞维持初始状态。我们推论其亦将能够将癌细胞转化为癌症干细胞或转移性状态。我们的实验展示也是这样的。以人类重组NME7-AB处理癌细胞7-10日显著增加癌症干细胞的标记物的表达。类似地，NME1二聚体、细菌性NME1二聚体中或用『2i』抑制剂或『5i』抑制剂处理的培养物使得癌细胞转化成癌症干细胞。2i是指MAP激酶路径的抑制剂及GSK3抑制剂，诸如PD0325901及CHIR99021。在某些情况下，癌转移受体CXCR4的表达极大增加，癌症干细胞的其他标记物，诸如E-钙黏蛋白、Oct4及Nanog同样如此。人类NME7-AB中培养的癌细胞的CXCR4表达增加几乎200倍。另外，在暴露于使人类经诱导干细胞恢复至初始状态的NME1二聚体、NME7、细菌性NME1二聚体或抑制剂之后，癌细胞的形态改变。通常黏附的NME处理的细胞在表面浮起且在悬浮液中生长。分析显示保持黏附的细胞在癌症干细胞的标记物的表达中增加较少。
在一个实验中，MUC1阳性T47D乳癌细胞培养于正常RPMI生长培养基或无血清基本培养基中，向其中添加重组人类NME7-AB作为单一生长因子。一部分细胞变得非黏附且在表面浮起且进行收集，同时『+Ri』是指添加至培养基以使得所有细胞将保持附着于表面，因此给出黏附及非黏附细胞的平均读数的ρ激酶抑制剂。图6显示据报导在所得细胞中的一些癌症干细胞或转移性癌症细胞中过度表达的一组基因的表达的RT-PCR量测值图。如该图中所显示，转移性受体CXCR4的表达几乎为正常生长培养基中培养的T47D细胞的表达量的200倍。均与癌症进展有关的CDH1(亦称作E-钙黏蛋白)及MUC1二者均提高约10倍(Hugo HJ等人2011)。亦报导为癌细胞的标记物的干细胞标记物亦经提高。OCT4及SOX2分别提高约50倍及200倍。其他干细胞标记物，诸如NANOG、KLF2、KLF4及TBX3显示适度表达增加。如同NME7，NME1二聚体(亦称作NM23)可完全支撑干细胞生长及使干细胞维持初始状态。此处，我们展示了NME1二聚体也将癌细胞转化为更具转移性的、癌症干细胞状态。图7显示在正常RPMI生长培养基或无血清基本培养基中培养的T47D乳癌细胞的RT-PCR量测值图，向该培养基中添加人类重组NM23(亦称作NME1)二聚体或NME7-AB作为单一生长因子。『漂浮物』是指变得非黏附且经收集的这类细胞，而『+Ri』是指添加至一些细胞以使其黏附至表面的ρ激酶抑制剂。如该图中可见，NME1二聚体或NME7-AB中培养的癌细胞在CXCR4、SOX2及OCT4的表达中具有显著增加，接着为CDH1(亦称作E-钙黏蛋白)、MUC1及NANOG的表达的增加。干细胞标记物KLF2及KLF4的表达存在适度增加。
类似地，细菌HSP593表达形成二聚体且可完全支撑干细胞生长，同时抑制分化的NME1。此外，其可将初始干细胞维持初始状态下。此处，我们表明细菌性NME1也将癌细胞转化至癌症干细胞状态，参见图8。添加至T47D，MUC1阳性乳癌细胞的重组HSP593细菌性NME1亦引起细胞形态改变且亦使得细胞变为非黏附。图8显示在CXCR4、NANOG及OCT4的表达中显示显著增加，接着为SOX2的较少增加及CDH1(亦称作E-钙黏蛋白)的5倍增加的RT-PCR量测值图。在某些情况下，藉由将CXCR4受体的配位体CXCL12(Epstein RJ等人2004,Müller,A等人2001)添加至培养基增加具有CXCR4受体的高表达的癌症干细胞的增殖。
其他人先前报导激酶抑制剂能够使干细胞自经诱导状态恢复至初始状态及将其维持初始状态。已报导(Silva J等人,2008)2i抑制剂(其为MAP激酶传信路径的GSK3-β及MEK的小分子抑制剂)将小鼠经诱导干细胞恢复至初始状态。我们疑惑此等抑制剂是否亦可将人类癌细胞恢复至癌症干细胞状态。此处，我们报导2i抑制剂诱使癌细胞变得转变为癌症干细胞或更具转移性状态。本发明设想使得经诱导状态下的人类干细胞恢复至较不成熟的初始状态的基因、蛋白、核酸或化学药剂的任何组合亦可用于将癌细胞转化为通常称作癌症干细胞或肿瘤起始细胞的更具转移性状态。
此处，我们显示此等『2i』抑制剂亦将癌细胞转化为显示转移性状态的标记物的癌症干细胞状态。图9显示添加至T47D乳癌细胞的2i增加癌转移受体CXCR4以及其他干细胞及癌症干细胞标记物的表达。2i与NM23二聚体或2i加上NME7-AB的组合增加此等标记物的表达。然而，图10显示NME7-AB单独产生具有癌症干细胞标记物的较高表达量的癌细胞。
当用能够使干细胞自经诱导状态恢复至较不成熟的初始状态的药剂，诸如NME1、NME6二聚体、NME7、2i或5i处理时，多种类型的癌细胞经历过渡至更具转移性状态的此过渡。在一个具体实例中，添加此等药剂中之一者的常规癌症生长培养基或无血清培养基中培养的DU145前列腺癌细胞也显示干细胞、癌症干细胞及转移性标记物，包括CDH1(亦称作E-钙黏蛋白，在转移性前列腺癌中通常较高)的表达的增加。亦借助人类NME1二聚体、细菌性NME1二聚体、NME7-AB或2i抑制剂如上文所述培养前列腺癌细胞。不同于T47D细胞，前列腺癌细胞未变得非黏附。因此，癌症干细胞标记物的RT-PCR量测值低于T47D细胞的该等量测值，其可经过其为转化细胞及非转化细胞的量度解释。在乳癌细胞的情况下，我们能够通过收集漂浮细胞分离完全转化的癌症干细胞，但在此处不能够如此。在RPMI培养基(作为对照组)及添加重组人类NME1/NM23二聚体、细菌性HSP593二聚体或人类NME7-AB的基本培养基中培养DU145 MUC1阳性前列腺癌细胞。图11a显示在rhNME1二聚体或rhNME7-AB中培养10日产生癌症干细胞的标记物的适度增加。OCT4、MUC1及CDH1/E-钙黏蛋白增加约2至8倍。然而，在此等相同培养条件下连续继代之后，癌症干细胞标记物的表达增加变得更显著。我们推论连续继代使细胞具有更多转化时间，因为我们不可快速收集漂浮细胞。图11b显示在rhNME7-AB、细菌性HSP593 NME1二聚体或rhNME1/NM23二聚体中9至10继代之后，CDH1/E-钙黏蛋白的表达通常比前列腺癌症中的表达分别增加9倍、8倍及6倍。NANOG及OCT4的表达也显著增加。
亦测试在能够使干细胞维持初始状态下的药剂中培养时，PC3 MUC1阴性前列腺癌细胞转化为癌症干细胞的能力。藉由人类NME1二聚体、细菌性NME1二聚体或NME7-AB如上文所述培养PC3细胞。如同DU145前列腺癌细胞，PC3细胞未变得非黏附。因此，癌症干细胞标记物的RT-PCR量测值可能较低，因为量测值将为转化细胞及非转化细胞的平均值。图12a显示在rhNME1/NM23二聚体或rhNME7-AB中继代之后的基因子组的RT-PCR量测值。图12a显示干细胞标记物SOX2、OCT4及NANOG的表达的适度增加。培养基中的连续继代不增加癌症干细胞或干细胞标记物的表达，相反地，其减少，如图12b中所显示。
已报导其他药剂使干细胞维持初始状态或使经诱导干细胞恢复至初始状态。最近报导染色质重排因子MBD3及CHD4阻断多能性诱导(Rais Y等人,2013)。举例而言，显示染色质重排因子MBD3及CHD4的siRNA抑制为将人类经诱导干细胞恢复至初始状态的方法的关键组分。转录因子BRD4及辅因子JMJD6据报导抑制NME7及上调NME1(Lui W等人,2013)。我们发现此等因子在初始干细胞中以比其在后期经诱导干细胞中较低的含量表达，图51。此结果支持我们的以下假设：NME7为相比于NME1的较早表达干细胞生长因子，因为前者无法以NME1的方式自身关闭或调节自我复制；作为二聚体，其活化干细胞生长，但当细胞分泌更多且其形成六聚物时，六聚物并不结合MUC1*且诱发分化。
我们观测到此等四(4)种基因：MBD3、CHD4、BRD4及JMJD6在2i、NME1二聚体或NME7中培养的癌细胞中天然受到抑制。图13显示一个该实验图，其中记录编码正常RPMI生长培养基或无血清基本培养基(向其中添加『2i』或重组人类NME7-AB)中培养的MUC1阳性T47D乳癌细胞中的染色质重排因子BRD4、JMJD6、MBD3及CHD4的基因表达的RT-PCR量测值，其中『漂浮物』细胞为分析的细胞。如图14中所显示，2i及NME1二聚体或NME7的组合亦抑制BRD4、JMJD6、MBD3及CHD4。
能够使干细胞维持初始状态的药剂也能够将体细胞转化为癌样或干细胞样状态。人类NME1二聚体或人类NME7能够使体细胞恢复较不成熟状态，表达干细胞标记物及癌细胞标记物。与人类同系物一起测试来自HSP 593的细菌性NME以测定其是否可模拟人类同系物能够将体细胞恢复癌样状态的功能。以HSP 593、人类NME1二聚体或人类NME7-AB作为唯一生长因子或细胞激素在无血清基本培养基中培养人类纤维母细胞。RT-PCR量测值显示如同人类NME，细菌性NME1HSP 593在第19天将体细胞恢复至OCT4阳性期。前已述及干细胞及转移性癌细胞可锚定非依赖性(anchorage-independent)地生长，我们重复该实验，但此次添加ρ激酶抑制剂至一组细胞以使细胞黏附于表面。当迫使漂浮细胞黏附于表面时，RT-PCR显示实际上，干细胞/癌症标记物OCT4增加7倍且干细胞/癌症标记物Nanog增加高达12倍。由于纤维母细胞在人类或细菌性NME中培养时恢复，实验像片显示形态的显著改变，图52至图59。将体细胞恢复至较不成熟状态的效率的相对顺序为NME7>NME1二聚体>NME1细菌。人类NME1或NME7或细菌性NME1中的人类纤维母细胞生长的RT-PCR量测值显示NME蛋白抑制所有四种(BRD4、JMJD6、MBD3及CHD4)多能性阻断剂。RT-PCR实验的复合图显示增加多能性基因及减少多能性阻断剂的相对效能为NME7>NME1>HSP 593 NME。然而，来自HSP 593的细菌性NME明显上调人类NME7及NME1的表达。图15显示据报导在正常纤维母细胞生长培养基或无血清基本培养基(向其中添加人类重组NM23(亦称作NME1)二聚体、NME7-AB或HSP593细菌性NME1二聚体)中培养的一些癌症干细胞或转移性癌细胞、体纤维母细胞『fbb』细胞中过度表达的基因的表达的RT-PCR量测值图。『+ROCi』指添加至一些细胞以使其黏附于表面的ρ激酶抑制剂。『-ROCi』不指漂浮物而指在不存在ρ激酶抑制剂的情况下保持黏附的细胞。图16显示编码正常纤维母细胞生长培养基或无血清基本培养基(向其中添加人类重组NM23(亦称作NME1)二聚体、NME7-AB或HSP593细菌性NME1二聚体)中培养的体纤维母细胞『fbb』细胞中的染色质重排因子BRD4、JMJD6、MBD3及CHD4的基因的表达的RT-PCR量测值图。『+ROCi』系指添加至一些细胞以使其黏附于表面的ρ激酶抑制剂。图17显示据报导在编码正常纤维母细胞生长培养基或无血清基本培养基(向其中添加人类重组NM23(亦称作NME1)二聚体、NME7-AB或HSP593细菌性NME1二聚体)中培养的体纤维母细胞『fbb』细胞中的染色质重排因子BRD4、JMJD6、MBD3及CHD4的一些癌症干细胞或转移性癌细胞及基因中过度表达的基因的表达的RT-PCR量测值图。『+ROCi』是指添加至一些细胞以使其黏附于表面的ρ激酶抑制剂。『-ROCi』是指变得非黏附且在表面浮起的细胞。
将癌细胞转化至更具转移性的癌症干细胞状态的药剂减少多能性阻断基因BRD4、JMJD6、MBD3及CHD4的表达。此等药剂亦减少体细胞中的BRD4、JMJD6、MBD3及CHD4的表达。因此，NME1二聚体、NME7及细菌性NME1二聚体使得体细胞恢复较不成熟癌样/干细胞样状态。
能够使干细胞维持初始状态下的因子亦能够将细胞转化至癌样或干样状态且亦能够将癌细胞转化至癌症干细胞状态或更具转移性状态。本文中，我们已显示能够与人类NME1二聚体起相同作用，亦能够与NME7或NME7-AB起相同作用的细菌性NME1的若干实例。然而，此等因子以极类似方式起作用的主要实例为其促进干细胞生长、抑制分化及将其维持初始状态下的能力。我们已展示人类NME1二聚体(亦称作NM23-H1)、细菌性NME1及NME7-AB促进胚胎干细胞生长及诱发多能性干细胞、抑制其分化及将其维持初始状态下，如借助若干细胞供体为人类，则两个X染色体均在活性状态下的全局基因分析及藉由具有在宿主动物中形成畸胎瘤的能力证明。以HSP 593、人类NME1或NME7-二聚体或人类NME7-AB作为唯一生长因子或细胞激素在无血清基本培养基中培养人类HES-3胚胎干细胞。正如人类NME1及NME7完全支持人类干细胞生长，来自HSP 593的细菌性NME亦如此。图18显示已在重组人类NME1二聚体中连续培养的多能性人类胚胎干细胞的相片。图19显示已在重组人类NME7-AB中培养十(10)个或十个以上继代的多能性人类胚胎干细胞的相片。图20显示已在重组细菌性NME1中培养十(10)个或十个以上继代的多能性人类胚胎干细胞的相片。
已在本文中呈现若干表明将细胞与一或多种能够使干细胞自经诱导状态恢复至较不成熟的初始状态的药剂接触亦能够将多种细胞类型恢复至较不成熟状态：体细胞至干细胞或祖细胞或癌细胞至更具转移性状态，亦称作癌症干细胞状态的实例。因此，本发明不意欲限于特定细胞类型或特定癌细胞类型。类似地，不预期本发明限于使用已显示使干细胞自经诱导状态恢复至初始状态的本文所揭示的药剂的子组。
一种用于鉴别或测试治疗癌症及转移性癌症的药剂的方法特定言之包含以下步骤：1)使癌细胞与能够使干细胞维持初始状态下的实体接触；2)使癌细胞与药剂接触；3)评估药剂抑制癌细胞生长或转移潜能的能力；4)得出抑制癌细胞生长或转移潜能的药剂适合于治疗具有癌症的患者的结论；及5)向患者投予该药剂。借助CXCR4、E-钙黏蛋白、MUC1、NME1、NME7或干细胞标记物OCT4、SOX2、NANOG、KLF2或KLF4的表达减少或MBD3、CHD4、BRD4或JMJD6的表达增加指示癌细胞转移潜能的抑制。
或者，随后将已在能够使干细胞维持初始状态下的药剂存在下培养的细胞移植至测试动物中。由于在就爱那个干细胞维持初始状态下的药剂存在下培养的癌细胞变为癌症干细胞且更具转移性，其可以极低数目植入测试动物中。可随后测试药物及候选药物的功效、毒性或建立植入以此方式产生的癌症干细胞的动物中的给药方案。
在一个实验中，以人类重组NME7-AB培养T47D乳癌细胞7日。收集漂浮细胞且经过RT-PCR进行分析，其显示与癌症干细胞关联的基因的表达的增加。特定言之，癌转移受体CXCR4(其为转移潜能的关键指示物)的表达比亲本细胞的表达高130倍。将这些细胞植入免疫缺陷，nu/nu雌性小鼠中。植入的细胞数目为50、100、1,000或10,000。前已述及通常需要4,000,000至6,000,000个细胞以获得肿瘤移植，同时已知少至100个癌症干细胞在免疫缺陷小鼠中产生肿瘤，尽管生长速率极缓慢，诸如肿瘤发展持续数月。
另外，一半小鼠每日注射重组人类NME7-AB。甚至对于仅植入50个细胞的组达成肿瘤移植。出人意料地，每日注射NME7的组具有增加的移植速率且该组中的一些动物亦形成多个肿瘤。换言之，每日注射NME7组的癌症在约50日之后转移且在远离初始植入位点的位点产生多个肿瘤。在此特定实验中，植入NME7诱发的癌症干细胞的24只小鼠中的67％产生肿瘤。然而，仔细看数据显示仅50％的小鼠无循环的NME7形成的肿瘤，而83％接受NME7的每日注射的小鼠形成肿瘤。在形成肿瘤的该83％中，80％产生癌转移，因为其在实验的约第50天具有多个肿瘤。图21为在植入已在含有NME7、NME7-AB的重组形式的培养基中培养的癌细胞的后63日量测的肿瘤体积图。与每一数据点一起的编号是指小鼠追踪编号且「M」表示具有多个肿瘤的动物。图22为总肿瘤体积图，其中已将一只小鼠中的所有肿瘤与转移性癌症的体积添加在一起。图23至图46显示在研究的第28天及第58天的各小鼠的相片，其用以显示肿瘤生长的进展且在大多数情况下，其中小鼠每日注射NME7-AB以显示癌转移进展。在图23至图46中，深色箭头指出初始癌细胞的注射位点且浅色箭头指出在第28天与第63天之间产生的远处转移。
一般而言，动物本身不必注射使干细胞恢复至初始状态下的药剂，诸如NME1二聚体、NME7-AB、2i、5i及其类似物。在替代方法中，可通过注射、吸收或摄食向动物投予药剂。
因此，一种用于将癌细胞转化为癌症干细胞的方法为在使经诱导干细胞恢复至初始状态下的NME1二聚体、NME7、细菌性NME1二聚体或抑制剂中培养癌细胞。在一较佳具体实例中，使经诱导干细胞恢复至初始状态下的药剂为2i抑制剂或5i抑制剂。在一较佳具体实例中，NME7为人类NME7。在一更佳具体实例中，NME7为NME7-AB。随后在此等癌症干细胞上测试用于治疗癌症或抑制癌症，尤其为转移性癌症进展的药物及候选药物。另外，可分析藉由此等方法产生的癌症干细胞以鉴别转移性癌细胞的仍未知标记物，其随后将为抗癌药物的新颖标靶。
因此，一种评估化合物、生物制剂或药物治疗癌症或预防癌转移或抑制癌转移的方法包含：1)通过在含有人类或细菌性的NME1二聚体、NME7或其片段或NME7-AB、2i抑制剂或5i抑制剂的培养基中培养细胞将癌细胞转化为更具转移性癌细胞；2)将细胞与测试药剂试管内接触或将细胞植入动物中，随后以测试药剂治疗动物；3)评估测试药剂对肿瘤生长或癌转移的作用；4)得出抑制肿瘤生长或转移至远程位点的测试药剂为适合于治疗诊断具有癌症的患者、具有癌症复发或转移性癌症的患者或具有罹患癌症风险的患者的药剂的结论。在一较佳具体实例中，测试动物经注射NME蛋白、2i或5i，或为表达人类NME或人类NME7或NME7-AB的转基因动物。或者，动物为转基因动物，其中通过2i或5i抑制的激酶经抑制，或向测试动物投予抑制激酶的药剂。
小鼠中的癌转移
如上所述，低数目的癌细胞能够在动物或注射NME7-AB的动物中转移的癌细胞中起始肿瘤。然而，通过产生表达人类NME7或NME7-AB的转基因动物易于实现相同作用。在本发明的一个态样中，动物为啮齿动物。
表达人类NME7、人类NME1或偏好二聚化的突变体或细菌性NME、人类MUC1或MUC1*的转基因小鼠将在药物发现中具有极大用途，其用以活体内生长癌细胞及测试使作为抗癌疫苗成分的衍生自NME的肽免疫的作用及产生可在其发展器官中支持人类干细胞生长以产生具有一些人类心脏组织的动物，诸如小鼠的动物及其类似者。鼠类NME蛋白显著不同于人类NME蛋白，其对于人类癌症生长及人类干细胞生长为所需的。因此，正常小鼠并不产生必需蛋白以支持人类癌细胞或人类干细胞的生长。将自发形成肿瘤或对经测试或将较好地允许人类肿瘤移植的药物的反应更如同人类的小鼠或其他哺乳动物将为有利的。因此通过使动物表达人类NME基因产生较好地支持人类癌细胞或人类干细胞生长的转基因动物。在一较佳具体实例中，人类NME基因为人类NME7。在一更佳具体实例中，人类NME基因为人类NME7-AB。使用多种方法产生转基因动物。一般而言，将外来基因转移至寄主动物的生殖细胞中。转基因可整合至宿主动物的基因组中。一些转基因整合方法使得位点特异性整合成为可能。一些位点特异性整合方法的优势中之一为其允许转基因的表达受控于宿主动物中天然存在的基因的表达。产生转殖基因动物的方法为熟习此项技术者已知。该等方法包括嵌入、基因剔除、CRISPR、TALENS及其类似方法。本发明设想使用任何使哺乳动物表达人类NME1、细菌性NME1、NME7或NME7-AB的方法。
在一较佳具体实例中，产生表达人类NME7或NME7-AB的转基因动物。由于人类或细菌性NME1及NME7抑制干细胞的分化，使用可控制转基因动物中的NME蛋白，特别是NME7或NME7抗体的表达定时的技术可为有利的。在诱导型启动子上具有人类NME7将为有利的，例如以在动物发展期间避免NME7表达的潜在问题。使外来基因的表达在宿主动物中可诱导的方法为熟习此项技术者已知。可使用此项技术中已知的用于控制转基因的表达的多种方法中的任一者使NME7或NME7-AB的表达可诱导。
或者，可通过哺乳动物自然地表达的另一基因的表达控制NME7的表达或定时表达。举例而言，NME7或NME7变异体在某一组织，诸如心脏中表达可为所需的。NME7的基因随后可操作地连接于在心脏中表达的蛋白，诸如MHC的表达。在此情况下，在表达MHC基因产品的时间及地点关闭NME7的表达。类似地，我们可能想要在前列腺中开启或关闭人类NME1、NME6或NME7的表达以使得其表达的定位及定时受控于例如前列腺特异性蛋白的表达。类似地，人类NME6或NME7于非人类哺乳动物中的表达可受控于乳房组织中表达的基因。举例而言，在转基因小鼠中，自促乳素启动子或类似基因表达人类NME6或人类NME7。以此方式，将可能以位点特异性方式诱导或抑制人类NME蛋白的表达。
异种移植人类肿瘤且亦注射人类NME7的动物发展转移性癌症。因此，通过制造表达人类NME7或更佳NME7-AB的转基因动物产生用于发展癌转移的动物模型。最佳地，NME7在允许动物恰当发展的诱导型启动子上。或者，通过制造表达人类NME或人类NME7或NME7-AB的转基因动物制得转移性动物模型，较佳啮齿动物。或者，动物为转基因动物，其中经由诱导型启动子抑制通过2i或5i抑制的激酶或向测试动物投予抑制激酶的药剂。转移性动物模型随后用于研究癌症发展或进展的基本科学以及测试化合物、生物制剂、药物及其类似物对癌症发展的作用。
因此，一种鉴别及选择治疗癌症及转移性癌症的药剂的方法特定言之包含以下步骤：1)产生表达NME或NME7的形式的转基因动物；2)对动物植入人类癌细胞；3)以候选药物治疗动物以治疗癌症或转移性癌症；4)评估候选药物对癌症尺寸或扩散的作用；及5)得出抑制测试动物中的癌症生长或扩散的候选药物适合于治疗人类中的癌症或转移性癌症的结论。
通过扩展患者癌细胞增殖时段以测试对候选药物的反应的个性化药物发现
使用极少已定癌细胞系进行几乎所有的临床前药物测试及药物选择。这些细胞系来源于数十年以前存活及死亡的患者的肿瘤且已传播数百万代，使得所得测试细胞与供体的原始癌症具有极少相似性或无相似性且与新颖患者的癌症具有更少相似性。因此，能够使用待治疗的患者的细胞作为测试细胞筛选药物及建立剂量将极为有益。令人遗憾的是，难以(即使并非不可能)使来自患者的癌细胞在培养皿中生长且更难以在动物中传播患者细胞。这是由于人类细胞不同于小鼠细胞，在其开始衰老的前仅可在培养物中分裂极有限次数。研究者现今使用的癌细胞系为自单一转移性癌症患者的肋膜积液分离的天然不朽化癌细胞或通过融合至不朽化细胞系或通过以不朽化基因转染癌细胞诱发为变得不朽化。后者方法显著改变原始或原发癌细胞的分子特征。
一种适用于传播来自特定患者的癌细胞的方法为使用将癌细胞转化为癌症干细胞的方法培养细胞。另一种方法为使用用于使经诱导干细胞恢复至初始状态的试剂及方法培养患者细胞。所得癌症干细胞更健康、存活较长时段且传播较长时段。如以上部分中所述，患者癌细胞可藉由在可为人类或细菌性的NME1二聚体、NME7或其片段或NME7-AB、2i抑制剂或5i抑制剂中培养其来传播。所得癌细胞可分成两部分：黏附于表面的癌细胞及在表面浮起的癌细胞。黏附细胞将紧密地类似于原始肿瘤细胞而漂浮的细胞将为癌症干细胞且将看起来像患者可在未来或响应于以化学治疗药物的治疗而发展的转移性癌细胞。这种患者细胞随后用于鉴别及选择将有效抑制该特定患者的癌症的药物及候选药物以及鉴别将抑制由癌症干细胞的存活造成的其癌症进展至转移性状态的药物。在本发明的另一态样中，以此方式传播的患者的癌细胞用于测定将有效抑制该特定患者的癌症的最佳药物组合或用于确立一或多种药物的剂量。
由于移植所需的细胞数量较小而将患者癌细胞移植至多个动物中以用于药物测试的个性化药物发现
前已述及已在可为人类或细菌性的NME1二聚体、NME7或其片段或NME7-AB、2i抑制剂或5i抑制剂中培养的癌细胞能够以极低植入细胞数量于测试动物中起始肿瘤。使用此等方法培养的患者癌细胞随后能够在多个测试动物中形成肿瘤，因为每只小鼠需要少至50或100个细胞而非数百万个。起始肿瘤所需的细胞数量的减小随后使得将患者的癌细胞植入测试动物中，其中一些动物可注射可为人类或细菌性的NME1二聚体、NME7或其片段或NME7-AB、2i抑制剂或5i抑制剂或可为如上文所述的转基因动物，例如使得动物表达人类NME7或NME7-AB为可行的。
在一个具体实例中，对宿主动物注射候选药物或化合物且评估功效以预测患者对用候选药物或化合物的治疗的反应。在另一实例中，向携有恢复至较不成熟状态的患者的癌细胞的动物投予正向患者投予或考虑用于治疗患者的第一线治疗或药物。第一线治疗可能影响癌细胞用于逃避第一线治疗的突变。可随后自宿主动物移除所得癌细胞及分析或表征以鉴别响应于某些治疗可能出现的突变。或者，癌细胞可保持于宿主动物中且随后用其他治疗剂治疗宿主动物以测定抑制或杀死耐药性细胞或癌症干细胞的药剂。
因此，一种用于鉴别抑制患者的癌症生长或扩散的适合的治疗的本发明的方法包含以下步骤：1)自患者获得癌细胞；2)在可为人类或细菌性的NME1二聚体、NME7或其片段或NME7-AB、2i抑制剂或5i抑制剂存在下培养患者的癌细胞；3)将该等细胞与抑制癌症或癌转移的测试药剂接触；4)评估化合物、生物制剂或药物对患者的癌细胞的功效、毒性或剂量或评估测试药剂对通过细胞表达的癌症干细胞标记物的含量的作用；及5)确定被称为癌症干细胞标记物的降低癌细胞活力或减少基因表达的测试药剂为用于患者的适合的治疗。
另一种用于鉴别抑制患者的癌症生长或扩散的适合的治疗的本发明的方法包含以下步骤：1)自患者获得癌细胞；2)在可为人类或细菌性的NME1二聚体、NME7或其片段或NME7-AB、2i抑制剂或5i抑制剂存在下培养患者的癌细胞；3)在测试动物中植入细胞，该测试动物亦可注射可为人类或细菌性的NME1二聚体、NME7或其片段或NME7-AB、2i抑制剂或5i抑制剂或为表达NME蛋白、NME7、NME7-AB或抑制2i或5i的标靶的表达的转基因动物；4)向测试动物投予用于抑制癌症或癌转移的测试药剂；5)评估化合物、生物制剂或药物的功效、毒性或剂量对患者的细胞移植于动物中的能力、肿瘤尺寸或癌转移发展的影响；及6)确定减小移植率、肿瘤生长速率或癌转移发展的测试药剂为用于患者的适合的治疗。
或者，可为了除供体以外的患者的利益使用使得能够增殖或植入患者癌细胞的上文所述的方法。根据本发明的方法增殖或植入的患者癌细胞将更精确地类似于天然存在的癌症，因此可替代已通过用不朽化基因转染而经人工不朽化的现今在使用中的标准癌细胞系。特定言之，表达高含量的干细胞标记物、癌症干细胞标记物或CXCR4的NME1二聚体、NME7、NME7-AB、2i抑制剂或5i抑制剂中培养的癌细胞可用于发现、测试及选择试管内、活体外或活体内治疗转移性癌症的药物。
产生表达人类组织的动物
预想其他应用，其中对于人类NME1、细菌性NME1或人类NME7，较佳NME7-AB为转基因的动物经植入或移植可为干细胞或祖细胞的人类细胞。举例而言，在某些情况下，期望产生诸如小鼠的动物，将在其心脏、肝脏、皮肤或其他器官中生长人类组织。一种进行此方法是通过将人类干细胞植入已使得表达人类NME7或人类NME7-AB的动物中产生一种嵌合动物。可在动物发展的各个阶段，包括试管内及活体内，在发展的囊胚、胚胎或胎儿阶段植入人类干细胞或祖细胞。由于NME7抑制分化，NME7或NME7-AB转基因将与可控制其表达的定时的方法有关。熟习此项技术者已知可使用以使得人类NME7或NME7-AB的表达在期望出现分化或成熟的时间或位置关闭或减小的方法。一种使转基因，较佳NME7可诱导或可抑制的方法为将其表达或抑制连接至仅在发展中晚期表达的基因的表达。在该等情况下，我们将制造一种转基因动物，其中NME7或NME7-AB的表达连接于在心脏或心脏祖细胞中表达的晚期基因的表达。因此，通过哺乳动物自然地表达的另一基因的表达控制NME7的表达或定时表达。举例而言，NME7或NME7变异体在某一组织，诸如心脏中表达可为所需的。NME7的基因随后可操作地连接于在心脏中表达的蛋白，诸如MHC的表达。在此情况下，NME7的表达在表达MHC基因产品的时间及地点减少或关闭。类似地，我们可能想要在前列腺中开启人类NME1、NME6或NME7的表达以使得其表达的定位及定时受控于例如前列腺特异性蛋白的表达。类似地，人类NME1或NME7于非人类哺乳动物中的表达可受控于乳房组织中表达的基因。举例而言，在转基因小鼠中，可通过促乳素启动子或类似基因表达或抑制人类NME1或人类NME7。
以此方式，可使对于人类NME7或NME7-AB为转基因的动物生长至一定程度，随后植入人类干细胞或祖细胞，其中其由于与人类NME蛋白接触而增殖。随后关闭人类NME的表达以使得动物中的特定器官或器官的一部分将作为人类组织发展。
本发明涵盖对于人类NME1、细菌性NME1或人类NME7或NME7-AB为转基因的动物的多种应用。在本发明的一个态样中，将人类干细胞或祖细胞植入NME转基因动物或将为转基因动物的动物的生殖细胞中。NME的表达可为可诱导或可抑制的。取决于植入干细胞或祖细胞的位点及定时，可使所得动物表达人类心脏、肝脏、神经元细胞或皮肤。
因此，人类组织可产生于转基因非人类哺乳动物中，其中哺乳动物表达生殖细胞或体细胞中的人类MUC1或MUC1*或NME蛋白，其中生殖细胞或体细胞含有引入至该哺乳动物中的重组人类MUC1或MUC1*或NME基因序列，其中基因序列的表达可通过引入外部组成物或通过将其表达或抑制连接至宿主动物的天然存在的基因的表达或抑制来诱发或抑制。将对于非人类哺乳动物在来源上为异种的干细胞或祖细胞转移至转基因动物中以使得基因诱发为表达的以使干细胞或祖细胞倍增且接着抑制基因表达以自异种移植干细胞产生组织。一种方法通过使干细胞或祖细胞与组织分化因子接触进行转基因的抑制。亦响应于自然产生的宿主组织分化因子而于哺乳动物中自然地进行转基因抑制。
这类动物可用于药物发现。其亦可用于毒性测试，使用动物测定化合物、生物制剂或药物对人类组织或人类组织发展的作用。或者，将植入人类干细胞或祖细胞的转基因动物用于生长用于移植至人类患者中的人类组织。在某些情况下，植入的干细胞或祖细胞来自将为收集自转基因动物的人类组织的接受者的患者。
在一个态样中，可诱发MUC1、MUC1*或NME蛋白表达直至转移的干细胞或祖细胞的量足够大。随后可通过对宿主哺乳动物注射抑制MUC1、MUC1*或NME蛋白的表达的物质关闭MUC1、MUC1*或NME蛋白表达。可通过自然方法，诸如通过在小鼠中表达对于特定组织或器官类型的分化诱导因子，或可将化学或蛋白物质在干细胞或母细胞转移的位点处注射至宿主中以使得分化为所需组织类型诱发干细胞或祖细胞群体的分化。
用于内胚层细胞组织的诱导、分化/转化药剂可包括(但不限于)以下药剂：肝细胞生长因子、抑瘤素-M、表皮生长因子、纤维母细胞生长因子-4、碱性纤维母细胞生长因子、胰岛素、运铁蛋白、硒酸、BSA、亚麻油酸、抗坏血酸2-磷酸酯、VEGF及地塞米松(dexamethasone)，其用于以下细胞类型：肝脏、肺脏、胰腺、甲状腺及肠细胞。
用于中胚层组织的诱导、分化/转化药剂包括(但不限于)以下药剂：胰岛素、运铁蛋白、硒酸、BSA、亚麻油酸、TGF-β1、TGF-β3、抗坏血酸2-磷酸酯、地塞米松、β-甘油磷酸酯、抗坏血酸2-磷酸酯、BMP及吲哚美辛(indomethacine)，其用于以下细胞类型：软骨、骨、脂肪、肌肉及血细胞。
用于外胚层组织的诱导、分化/转化药剂包括(但不限于)以下药剂：二丁酰细胞周期蛋白AMP、异丁基甲基黄嘌呤、人类表皮生长因子、碱性纤维母细胞生长因子、纤维母细胞生长因子-8、脑源性神经营养因子及/或其他神经营养生长因子，其用于以下细胞类型：神经、皮肤、脑及眼细胞。
用于发现及测试疫苗的对NME蛋白为转基因的动物
表达人类NME，尤其为NME7-AB的转基因动物亦将适用于评估何等免疫肽可安全地用于产生针对NME蛋白，包括NME1、细菌性NME及NME7的抗体。举例而言，可藉由如图61至图63，肽编号1-53中阐述的免疫肽中的一或多者使对于人类NME1、NME7或NME7-AB为转基因的小鼠免疫。分析对照组小鼠以确保产生抗NME抗体。人类肿瘤细胞将随后植入转殖基因小鼠中，其中若使用诱导型启动子，则诱发宿主动物中的人类NME蛋白的表达。随后通过比较移植至转基因小鼠与对照小鼠或未开启诱导型NME启动子的小鼠中的细胞的肿瘤移植、肿瘤生长速率及肿瘤起始潜能评估免疫肽的功效及潜在毒性。除测定整体骨髓数量、循环血细胞的数量及类型及回应于用对骨髓细胞具细胞毒性的药剂的治疗的骨髓细胞的再生的响应时间以外，通过检查器官，诸如心脏、肝脏及其类似物评估毒性。将伴以可容许的副作用而显著降低肿瘤移植、肿瘤生长速率或肿瘤起始潜能的衍生自图61至图63，肽编号1-53中所列的肽的免疫肽选作用于在患者外部或在人体内部产生作为抗癌治疗、防治物或疫苗的抗体的免疫肽。
可取代NME蛋白的NME蛋白的调节因子或NME蛋白的下游效应子
此等研究已显示NME蛋白起促进干样或癌样生长的作用的一种方式为通过结合至MUC1跨膜蛋白的截短形式，本文中称为MUC1*，其主要由PSMGFR序列组成。MUC1*细胞外域的二聚化刺激体细胞、干细胞及癌细胞的生长及去分化，使其更具转移性。
NME蛋白发挥其作用的另一方式为通过运送至细胞核，其于这类细胞核中直接或间接起刺激或抑制其他基因的作用。先前已报导(Boyer等人,2005)OCT4及SOX2结合至MUC1及其裂解酶MMP16的启动子位点。相同研究报导SOX2及NANOG结合至NME7的启动子位点。我们基于我们的实验得出此等『Yamanaka』多能性因子(Takahashi及Yamanaka,2006)上调MUC1、其裂解酶MMP16及其活化配位体NME7的结论。先前亦已报导BRD4抑制NME7，而其辅因子JMJD6上调NME1(Thompson等人)，我们以论证其为比胚胎发生中的NME7表达更晚的自调节干细胞生长因子。再者，其他人最近报导Mbd3或Chd4的siRNA抑制极大减小对iPS产生的抵抗性(Rais Y等人2013)且能够使干细胞维持初始状态下。本文中呈现的证据显示存在互逆反馈回路，其中NME7抑制BRD4及JMJD6，同时亦抑制多能性Mbd3及CHD4的抑制剂。我们应注意在初始人类干细胞中，此等四种因子BRD4、JMJD6、Mbd3及CHD4与其在后期『经诱导』干细胞中的表达相比受抑制。我们亦应注意将小鼠经诱导干细胞恢复至初始状态下的2i抑制剂(Gsk3β及MEK的抑制剂)亦下调相同四种因子BRD4、JMJD6、Mbd3及CHD4。
我们还已发现NME7上调SOX2(>150×)、NANOG(约10×)、OCT4(约50×)、KLF4(4×)及MUC1(10×)。重要的是，我们已显示NME7上调癌症干细胞标记物，包括CXCR4(约200×)及E-钙黏蛋白(CDH1)。将此等众多证据结合在一起指出NME7为最原始干细胞生长及多能性介体及其在将体细胞转化至癌性状态以及将癌细胞转化为更具转移性癌症干细胞中为强大因子的结论。图60为本文所述的实验证明的干细胞/癌症状态的NME7及相关调节因子的相互作用图的草图。二聚体形式的NME1在能够将体细胞转化至干样/癌样状态及能够将癌细胞转化为转移性癌症干细胞中与NME7大致相同地起作用，尽管程度略微较低。类似地，与人类NME1或NME7具有高同源性的细菌性NME二聚体，诸如盐单胞菌属593，如同NME1二聚体及NME7单体，能够完全支持人类干细胞生长、多能性及存活、癌细胞生长及存活、将体细胞恢复至癌细胞/干细胞状态及将癌细胞转化为更具转移性癌症干细胞。
因此，本发明涵盖关于NME7的增加NME7表达的替代基因及基因产物。类似地，本发明涵盖关于NME7的NME7的替代下游效应子。举例而言，抑制MBD3、CHD4、BRD4或JMJD6的单独或组合形式的药剂可以本文所述的方法中的任一者替代我们已显示抑制MBD3、CHD4、BRD4或JMJD6的NME7。
实施例
实施例1.对40-60日龄之间的免疫缺陷nu/nu小鼠植入90天雌激素释放丸粒以促进乳房肿瘤细胞的移植及生长。将人类T47D乳癌细胞与基质胶以1:2混合，随后注射至小鼠侧腹中(各小鼠4百万)，六(6)只小鼠/组。在第二组中，将癌细胞与基质胶以相同的1:2之比(100μL细胞:200μl基质胶)混合，除了将人类重组NME7-AB添加至细胞/基质胶混合物中以达成16nM的最终NME7浓度(6只小鼠)。在第14天之后，在这六(6)只小鼠中，随机选择三(3)只每日接受NME7注射(100uL，32nM下)。图1显示小鼠中的肿瘤细胞生长图。图(A)显示与标准基质胶或基质胶加上NME7混合且异种移植至免疫缺陷(nu/nu)小鼠中的T47D乳房肿瘤细胞的生长图。在第14天之后，肿瘤细胞与NME7混合的小鼠亦每日注射人类重组NME7一次。图(B)显示与基质胶加上NME7混合且异种移植至免疫缺陷小鼠中的T47D乳房肿瘤细胞的生长图。在第14天之后，一半小鼠亦每日注射人类重组NME7一次。图2显示个别小鼠中的人类肿瘤细胞的生长图。图(A)显示与标准基质胶混合的T47D乳癌细胞生长图。六(6)只植入小鼠中仅两(2)只显示移植的肿瘤生长特征。图(B)显示与基质胶及NME7混合的T47D乳癌细胞的生长图。六(6)只植入小鼠中的四(4)只显示移植的肿瘤生长特征。虚线表明亦在第14天之后注射NME7的小鼠。
实施例2.在40-60日龄之间的若干组免疫缺陷小鼠中植入90天雌激素释放丸粒以促进乳房肿瘤细胞的移植及生长且植入各小鼠的侧腹中。将人类T47D乳癌细胞与基质胶以1:2混合(100μL细胞:200μl基质胶)，随后注射至各小鼠的一个侧腹中(各小鼠4百万)。动物初始且量测肿瘤生长以追踪肿瘤生长速率及评估此细胞系的肿瘤移植百分比。图3显示与标准基质胶混合且异种移植至四十(40)只免疫缺陷(nu/nu)小鼠中的T47D肿瘤细胞图。该图显示两组相同的20只小鼠的平均值，肿瘤体积平均增幅为22％，但具有向下趋势。图4显示四十(40)只个别小鼠中的T47D人类乳房肿瘤细胞的生长图，约25％显示肿瘤移植。图5显示与基质胶混合且异种移植至六(6)只NOD/SCID小鼠的侧腹中的T47D乳癌细胞的生长图。图(A)显示平均肿瘤生长。图(B)显示个别小鼠中的肿瘤生长，其展现使用标准方法的六(6)只小鼠中仅一(1)只具有良好肿瘤移植。
实施例3.能够使干细胞维持初始状态的药剂将癌细胞转型为癌症干细胞，其中移植仅需要少量细胞。根据标准实务培养癌细胞。在对照组中，癌细胞培养于其正常培养基中：RPMI用于T47D乳癌细胞、DU145及PC3前列腺癌细胞。然而，将测试药剂重组蛋白人类NME1二聚体、细菌性HSP593NME1二聚体、人类NME7-AB及2i添加至无血清基本培养基中以消除来自血清中的多种生长因子及细胞激素的潜在干涉。作为另一对照组，癌细胞培养于不含NME1、NME7或2i，但不增殖，所得细胞亦不上调癌症干细胞的标记物的基本培养基中。
500mL无血清基本培养基包括以下组分：
394mL DMEM/F12,GlutaMAX；100mLKnockoutTM血清替代物；
5.0mL 100×MEM非必需氨基酸溶液；
0.9mLβ-巯基乙醇，55mM储备液。
向此无血清基本培养基中添加rhNME1(亦称NM23)至8nM的最终浓度，或添加细菌性HSP593重组NME1至8nM的最终浓度，或添加rhNME7-AB至4nM的最终浓度，或添加分别抑制MAP激酶路径及GSK3的2i抑制剂PD0325901及CHIR99021至3μM及1μM的最终浓度。
当添加ρ激酶抑制剂「Ri」或「ROCi」时，其为获自Stemgent(Cambridge,MA)的Y27632，在临用前添加直至10μM的最终浓度。
实施例3a.乳癌T47D细胞培养于传统的RPMI生长培养基或基本干细胞培养基中，向其中添加人类NME1二聚体(亦称为NM23-H1)、细菌性HSP593NME1二聚体、人类NME7-AB或被称为『2i』的激酶抑制剂。这些药剂具有的共同点为其各能够促进初始状态下的干细胞的生长或能够使经诱导状态干细胞恢复至较不成熟的初始状态。我们观测到在此等药剂中的任一者中培养的T47D癌细胞中的一些变得非黏附。这些『漂浮物』亦在形态上不同。添加ρ激酶抑制剂(在本文中称作『Ri』或『ROCi』)使大部分细胞保持附着于表面。图6至图10的图中显示的RT-PCR量测值显示漂浮细胞为具有癌症干细胞标记物或干细胞标记物的最高表达的细胞。当添加ρ激酶抑制剂时，所有细胞保持附着但RT-PCR量测值表明所得量测为经转化的细胞及未转化或尚未转化的细胞的混合物。结果显示于图6至图10中。
图6显示据报导在正常RPMI生长培养基或无血清基本培养基(向其中添加重组人类NME7-AB作为单一生长因子)中培养的MUC1阳性T47D乳癌细胞中的一些癌症干细胞或转移性癌细胞中过度表达的一组基因的表达的RT-PCR量测值图。一部分这类细胞变得非黏附且在表面浮起且进行收集，同时『+Ri』是指添加至培养基以使得所有细胞将保持附着于表面，因此给出黏附及非黏附细胞的平均读数的ρ激酶抑制剂。如该图中所显示，转移性受体CXCR4的表达几乎为正常生长培养基中培养的T47D细胞的表达量的200倍。均与癌症进展有关的CDH1(亦称作E-钙黏蛋白)及MUC1二者均提高约10倍。亦报导为癌细胞的标记物的干细胞标记物亦经提高。OCT4及SOX2分别提高约50倍及200倍。其他干细胞标记物，诸如NANOG、KLF2、KLF4及TBX3显示适度表达增加。
图7显示据报导在正常RPMI生长培养基或无血清基本培养基(向其中添加人类重组NM23(亦称作NME1)二聚体或NME7-AB作为单一生长因子)中培养的MUC1阳性T47D乳癌细胞中的一些癌症干细胞或转移性癌细胞中过度表达的一组基因的表达的RT-PCR量测值图。『漂浮物』是指变得非黏附且经收集的细胞，而『+Ri』是指添加至一些细胞以使其黏附至表面的ρ激酶抑制剂。如该图中可见，NME1二聚体或NME7-AB中培养的癌细胞在CXCR4、SOX2及OCT4的表达中具有显著增加，接着为CDH1(亦称作E-钙黏蛋白)、MUC1及NANOG的表达的增加。干细胞标记物KLF2及KLF4的表达存在适度增加。
在图8中，我们看到细菌性NME1以类似于人类NME1的方式起作用。添加至T47D、MUC1阳性乳癌细胞的重组HSP593细菌性NME1亦引起细胞形态改变且亦使细胞变得非黏附。图8显示在CXCR4、NANOG及OCT4的表达中显示显著增加，接着为SOX2的较少增加及CDH1(亦称作E-钙黏蛋白)的5倍增加的RT-PCR量测值图。
在『2i』激酶抑制剂存在下培养T47D乳癌细胞的结果显示于图9中。2i为MAP激酶及GSK3的生化抑制剂，先前显示使经诱导状态下的干细胞恢复至较早初始状态。2i使T47D细胞稳健增加CXCR4、SOX2、OCT4、MUC1及CDH1/E-钙黏蛋白(以该顺序)的表达。若将NME1二聚体或NME7-AB添加至2i，则此等癌症干细胞标记物的表达增加，NME7-AB具有最大效果。然而，图10显示NME7-AB单独产生具有癌症干细胞标记物的较高表达量的癌细胞。
实施例3b.亦通过人类NME1二聚体、细菌性NME1二聚体、NME7-AB或2i抑制剂如上文所述培养前列腺癌细胞。不同于T47D细胞，前列腺癌细胞未变得非黏附。因此，癌症干细胞标记物的RT-PCR量测值低于T47D细胞的该等量测值，其可通过其为转化细胞及非转化细胞的量度解释。在乳癌细胞的情况下，我们能够通过收集漂浮细胞分离完全转化的癌症干细胞，但在此处不能够如此。在RPMI培养基(作为对照组)及添加重组人类NME1/NM23二聚体、细菌性HSP593二聚体或人类NME7-AB的基本培养基中培养DU145MUC1阳性前列腺癌细胞。图11a显示在rhNME1二聚体或rhNME7-AB中培养10日产生癌症干细胞的标记物的适度增加。OCT4、MUC1及CDH1/E-钙黏蛋白增加约2至8倍。然而，在此等相同培养条件下连续继代之后，癌症干细胞标记物的表达增加变得更显著。我们推论连续继代使细胞具有更多转化时间，因为我们不可快速收集漂浮细胞。图11b显示在rhNME7-AB、细菌性HSP593NME1二聚体或rhNME1/NM23二聚体中9至10继代之后，CDH1/E-钙黏蛋白的表达通常比前列腺癌症中的表达分别增加9倍、8倍及6倍。NANOG及OCT4的表达亦显著增加。
亦测试在能够使干细胞维持初始状态下的药剂中培养时，PC3MUC1阴性前列腺癌细胞转化为癌症干细胞的能力。藉由人类NME1二聚体、细菌性NME1二聚体或NME7-AB如上文所述培养PC3细胞。如同DU145前列腺癌细胞，PC3细胞未变得非黏附。因此，癌症干细胞标记物的RT-PCR量测值可能较低，因为量测值将为转化细胞及非转化细胞的平均值。图12a显示在rhNME1/NM23二聚体或rhNME7-AB中继代的后的基因子组的RT-PCR量测值。图12a的图显示干细胞标记物SOX2、OCT4及NANOG的表达的适度增加。培养基中的连续继代不增加癌症干细胞或干细胞标记物的表达，相反地，其减少，如图12b中所显示。
实施例3c.在此实施例中，测试『2i』抑制剂对癌细胞的作用。前已述及2i为给予分别抑制MAP激酶路径及GSK3的2个小分子CHIR99021及PD0325901的名称。在干细胞实验中，展示2i能够使经诱导状态下的干细胞恢复回较不成熟的初始状态。在此实验中，我们在基本培养基中培养MUC1阳性T47D乳癌细胞，向基本培养基中添加2i或NME7-AB。获取RT-PCR量测值，其显示2i以及NME7-AB抑制染色质重排因子MBD3及CHD4的表达，参见图13。据报导MBD3及CHD4的siRNA抑制为亦使干细胞恢复至初始状态下的培养基的关键添加物。当在2i加上rhNME1/NM23或rhNME7-AB中培养时，MBD3及CHD4经类似抑制，图14。
实施例3d.在此实施例中，在重组人类NME1/NM23二聚体、细菌性HSP593NME1二聚体或NME7-AB存在下培养纤维母细胞。纤维母细胞培养于其正常培养基中作为对照组，正常培养基为500mL、445mL DMEM高葡萄糖基本培养基、5mL GlutaMAX及50mL胎牛血清(FBS)。在与NME1/NM23二聚体、细菌性HSP593NME1二聚体或NME7-AB在培养物中15-20日之后，细胞形态完全改变以使其不再可辨识为纤维母细胞。RT-PCR显示所得细胞极大增加干细胞标记物基因OCT4及NANOG的表达，参见图15。正如癌细胞，其亦减少BRD4、JMJD6、MBD3及CHD4的表达。图16显示编码染色质重排因子BRD4、JMJD6、MBD3及CHD4的基因的表达的RT-PCR量测值的图。图17显示据报导在编码染色质重排因子BRD4、JMJD6、MBD3及CHD4的一些癌症干细胞或转移性癌细胞及基因中过度表达的基因的表达的RT-PCR量测值图。此处，『-ROCi』是指变得非黏附且在表面浮起的细胞。
实施例4.通过在NME7-AB中培养所产生的癌症干细胞藉由植入少至50个细胞而在小鼠中起始肿瘤。
如以上实施例3a中所述培养T47D乳癌细胞。在添加有rhNME7-AB至4nM的最终浓度的基本培养基中培养7-10日之后，收集漂浮细胞。RT-PCR量测值显示CXCR4的表达相比于在RPMI培养基中培养的对照细胞增加130倍。对漂浮细胞进行计数且再悬浮于PBS中。将NME7诱导的癌症干细胞与生长因子减少的基质胶(Matrigel)以1:2混合；亦即2份基质胶比1份细胞。预期癌细胞与NME7的一系列比率或NME7的注射时程在一个小鼠品系至另一小鼠品系及一种肿瘤类型至另一肿瘤类型之间变化。
在先前已于肩部区域中植入90天释放雌激素丸粒的雌性nu/nu小鼠的侧腹中植入癌症干细胞。四(4)组各六(6)只小鼠植入50、100、1,000或10,000个T47D癌症干细胞。在每一情况下，注射至各小鼠中的总体积为100μL。各组中的一半小鼠每日在侧腹中在接近但不位于癌症干细胞植入位点处注射200μL重组人类NME7-AB。
监测动物的食物摄入及体重，其为正常及稳定的。每周一次获取两(2)个独立且盲法的肿瘤量测值且进行记录。
甚至对于仅植入50个细胞的组达成肿瘤移植。出人意料地，每日注射NME7的组具有增加的移植率且该组中的一些动物亦形成多个肿瘤。换言之，每日注射NME7的组的癌症在约50日之后转移且在远离初始植入位点的位点产生多个肿瘤。在此特定实验中，植入NME7诱发的癌症干细胞的24只小鼠中有67％产生肿瘤。然而，仔细查看数据显示无循环NME7的小鼠中仅有50％形成肿瘤，而接受NME7的每日注射的小鼠中有83％形成肿瘤。在形成肿瘤的该83％中，80％产生癌转移，因为其在实验的约第50天具有多个肿瘤。图21为在植入已在含有NME7的重组形式NME7-AB的培养基中培养的癌细胞之后63日量测的肿瘤体积图。每一数据点旁的数字指小鼠追踪号且「M」表示该动物具有多个肿瘤。图22为总肿瘤体积的图，其中已将具有转移性癌症的一只小鼠的所有肿瘤的体积加在一起。图23至图46显示在研究的第28天及第58天的各小鼠的相片，其用以显示肿瘤生长的进展且在大多数情况下，在小鼠每日注射NME7-AB的情况下，显示癌转移进展。在图23至图46中，深色箭头指出初始癌细胞的注射位点且浅色箭头指出在第28天与第63天之间产生的远处转移。
所有引用的参考文献以全文引用的方式并入本文中。
所引用的参考文献清单
Clarke MF,Dick JE,Dirks PB,Eaves CJ,Jamieson CH,Jones DL,Visvader J,Weissman IL,Wahl GM.(2006)Cancer stem cells--perspectives on current statusand future directions:AACR Workshop on cancer stem cell..Cancer Res.10月1日；66(19):9339-44.电子版2006年9月21日.
Chen K,Huang YH,Chen JL.(2013)Understanding and targeting cancer stemcells:therapeutic implications and challenges.Acta Pharmacologica Sinica 34:732-740；Review
Darash-Yahana M,Pikarsky E,Abramovitch R,Zeira E,Pal B,Karplus R,Beider K,Avniel S,Kasem S,Galun E,Peled A(2004)Role of high expression levelsof CXCR4in tumor growth,vascularization,and metastasis.FASEB J 18(11):1240-1242
Mahanta S,Fessler S,Park J,Bamdad C.A Minimal Fragment of MUC1Mediates Growth of Cancer Cells,2008 PLoS ONE 3:e2054-2065.
Hikita S,Clegg O,Kosik K,Bamdad C.MUC1*Mediates the Growth of HumanPluripotent Stem Cells,2008PLoS ONE 3:e3312-3325.
Kumar SM,Liu S,Lu H,Zhang H,Zhang PJ,Gimotty PA,Guerra M,Guo W,Xu X.(2012)Acquired cancer stem cell phenotypes through Oct4-mediateddedifferentiation.Oncogene.11月22日；31(47):4898-911.
Liu K,Lin B,Zhao M,Yang X,Chen M,Gao A,Liu F,Que J,Lan X.(2013)Themultiple roles for Sox2in stem cell maintenance and tumorigenesis.CellularSignaling 5月；25(5):1264-71.Review
Yeo JC,Jiang J,Tan ZY,Yim GR,Ng JH,
Figure BDA0000959735240000691
J,Kraus P,Liang H,GonzalesKA,Chong HC,Tan CP,Lim YS,Tan NS,Lufkin T,Ng HH.(2014)Klf2 is an essentialfactor that sustains ground state pluripotency.Cell Stem Cell.6月5日；14(6):864-72.
Oshima N,Yamada Y,Nagayama S,Kawada K,Hasegawa S,Okabe H,Sakai Y,AoiT.(2014)Induction of cancer stem cell properties in colon cancer cells bydefined factors.PLoS One.7月9日；9(7):e101735
Wang ML,Chiou SH,Wu CW.(2013)Targeting cancer stem cells:emergingrole of Nanog transcription factor.Onco targets and Therapy.9月4日；6:1207-20.Review.
Xu C,Rosler E,Jiang J,Lebkowski JS,Gold JD,等人(2005)Basic FibroblastGrowth Factor Supports Undifferentiated Human Embryonic Stem Cell GrowthWithout Conditioned Medium.STEM CELLS 23:315-323.
Fessler S,Wotkowicz M,Mahanta S,Bamdad C(2009)MUC1*is a determinantof trastuzumab(Herceptin)resistance in breast cancer cells,Breast Cancer ResTreat 118:113-124 DOI 10.1007/s10549-009-0412-3
Lissa Nurrul Abdullah及Edward Kai-Hua Chow(2013)Mechanisms ofchemoresistance in cancer stem cells.Clinical and Translational Medicine 1月17日；2(1):3
Miki J,Furusato B,Li H,Gu Y,Takahashi H,Egawa S,Sesterhenn IA,McLeodDG,Srivastava S,Rhim JS.Identification of putative stem cell markers,CD133and CXCR4,in hTERT-immortalized primary nonmalignant and malignant tumor-derived human prostate epithelial cell lines and in prostate cancerspecimens.Cancer Res.2007年4月1日；67(7):3153-61.
Jeter CR,Liu B,Liu X,Chen X,Liu C,Calhoun-Davis T,Repass J,Zaehres H,Shen JJ,Tang DG.NANOG promotes cancer stem cell characteristics and prostatecancer resistance to androgen deprivation.Oncogene.2011年9月8日；30(36):3833-45.PMCID:
Hong X,Chedid K,Kalkanis SN.Glioblastoma cell line-derived spheres inserum-containing medium versus serum-free medium:a comparison of cancer stemcell properties.Int.J.Oncol.2012年11月；41(5):1693-700.
Faber A,Goessler UR,Hoermann K,Schultz JD,Umbreit C,Stern-StraeterJ.SDF-1-CXCR4axis:cell trafficking in the cancer stem cell niche of head andneck squamous cell carcinoma.Oncol.Rep.2013年6月；29(6):2325-31.
Mukherjee D,Zhao J.The Role of chemokine receptor CXCR4 in breastcancer metastasis.Am J Cancer Res.2013；3(1):46-57.PMCID:PMC3555200
Herreros-Villanueva M,Zhang J-S,Koenig A,Abel EV,Smyrk TC,Bamlet WR,de Narvajas AA-M,Gomez TS,Simeone DM,Bujanda L,Billadeau DD.SOX2 promotesdedifferentiation and imparts stem cell-like features to pancreatic cancercells.Oncogenesis.2013；2:e61.PMCID:PMC3759123
Sefah K,Bae K-M,Phillips JA,Siemann DW,Su Z,McClellan S,Vieweg J,TanW.Cell-based selection provides novel molecular probes for cancer stemcells.Int.J.Cancer.2013年6月1日；132(11):2578-88.
Su H-T,Weng C-C,Hsiao P-J,Chen L-H,Kuo T-L,Chen Y-W,Kuo K-K,Cheng K-H.Stem cell marker nestin is critical for TGF-β1-mediated tumor progressionin pancreatic cancer.Mol.Cancer Res.2013年7月；11(7):768-79.
Nichols J,Smith A(2009)Naive and primed pluripotent states.Cell StemCell 4:487-492.
Hanna J,Cheng AW,Saha K,Kim J,Lengner CJ,等人(2010)Human embryonicstem cells with biological and epigenetic characteristics similar to those ofmouse ESCs.ProcNatlAcadSci U S A 107:9222-9227.
Smagghe,B.J.Stewart A.K.,Carter M.G.,Shelton L.S.,Bernier K.J.,Hartman E.J.,Calhoun A.K.,Hatziioannou V.M.,Lillacci G.,Kirk B.A.,DiNardoB.A.,Kosik K.S.,Bamdad C.(2013)MUC1*Ligand,NM23-H1,Is a Novel Growth FactorThat Maintains Human Stem Cells in a More
Figure BDA0000959735240000711
State.PLoS ONE 8(3):e58601
Silva J,Barrandon O,Nichols J,Kawaguchi J,Theunissen TW,Smith A(2008).Promotion of reprogramming to ground state pluripotency by signalinhibition.PLoS Biol.21；6(10)
Theunissen TW,Powell BE,Wang H,Mitalipova M,Faddah DA,Reddy J,Fan ZP,Maetzel D,Ganz K,Shi L,Lungjangwa T,Imsoonthornruksa S,Stelzer Y,RangarajanS,D'Alessio A,Zhang J,Gao Q,Dawlaty MM,Young RA,Gray NS,Jaenisch R.(2014)Systematic Identification of Culture Conditions for Induction and Maintenanceof Naive Human Pluripotency.Cell Stem Cell.2014年7月24日,S1934-5909(14)00298-7.
Hugo HJ,Kokkinos MI,Blick T,等人Defining the E-cadherin repressorinteractome in epithelial-mesenchymal transition:the PMC42 model as a casestudy.(2011)Cells Tissues Organs；193:23-40
Epstein RJ(2004)The CXCL12-CXCR4chemotactic pathway as a target ofadjuvant breast cancer therapies.Nat Rev Cancer 4(11):901-909
Müller,A.；Homey,B.；Soto,H.；Ge,N.；Catron,D.；Buchanan,M.E.；McClanahan,T.；Murphy,E.；Yuan,W.；Wagner,S.N.；Barrera,J.L.；Mohar,A.；Verástegui,E.；Zlotnik,A.(2001)Involvement of chemokine receptors in breast cancermetastasis.Nature,410(6824),50-56.
Rais Y1,Zviran A,Geula S,Gafni O,Chomsky E,Viukov S,Mansour AA,CaspiI,Krupalnik V,Zerbib M,Maza I,Mor N,Baran D,Weinberger L,Jaitin DA,Lara-Astiaso D,Blecher-Gonen R,Shipony Z,Mukamel Z,Hagai T,Gilad S,Amann-Zalcenstein D,Tanay A,Amit I,Novershtern N,Hanna JH(2013).Deterministicdirect reprogramming of somatic cells to pluripotency.,502(7469):65-70.
Liu W,Ma Q,Wong K,Li W,Ohgi K,Zhang J,Aggarwal AK,Rosenfeld MG.Brd4and JMJD6-Associated Anti-Pause Enhancers in Regulation of TranscriptionalPause Release.Cell.2013年12月19日；155(7):1581-95.PMCID:PMC3886918.
Amit M,Carpenter MK,Inokuma MS,Chiu C-P,Harris CP,等人(2000)ClonallyDerived Human Embryonic Stem Cell Lines Maintain Pluripotency andProliferative Potential for Prolonged Periods of Culture.DevelopmentalBiology 227:271-278.
Ludwig TE,Levenstein ME,Jones JM,Berggren WT,Mitchen ER,等人(2006)Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions.Nat Biotechnol24:185-187.
Xu RH,Peck RM,Li DS,Feng X,Ludwig T,等人(2005)Basic FGF andsuppression of BMP signaling sustain undifferentiated proliferation of humanES cells.Nat Methods 2:185-190.
Liu W,Ma Q,Wong K,Li W,Ohgi K,Zhang J,Aggarwal AK,RosenfeldMG.Brd4and JMJD6-Associated Anti-Pause Enhancers in Regulation ofTranscriptional Pause Release.Cell.2013年12月19日；155(7):1581-95.PMCID:PMC3886918.
Rais Y,Zviran A,Geula S,Gafni O,Chomsky E,Viukov S,Mansour AA,CaspiI,Krupalnik V,Zerbib M,Maza I,Mor N,Baran D,Weinberger L,Jaitin DA,Lara-Astiaso D,Blecher-Gonen R,Shipony Z,Mukamel Z,Hagai T,Gilad S,Amann-Zalcenstein D,Tanay A,Amit I,Novershtern N,Hanna JH.Deterministic directreprogramming of somatic cells to pluripotency.2013年9月18日,Nature 502,65-70DOI:10.1038/nature 12587
Herreros-Villanueva M,Zhang J-S,Koenig A,Abel EV,Smyrk TC,Bamlet WR,de Narvajas AA-M,Gomez TS,Simeone DM,Bujanda L,Billadeau DD.SOX2 promotesdedifferentiation and imparts stem cell-like features to pancreatic cancercells.Oncogenesis.2013；2:e61.PMCID:PMC3759123
Hong X,Chedid K,Kalkanis SN.Glioblastoma cell line-derived spheres inserum-containing medium versus serum-free medium:a comparison of cancer stemcell properties.Int.J.Oncol.2012年11月；41(5):1693-700.
Silva J,Barrandon O,Nichols J,Kawaguchi J,Theunissen TW,SmithA.Promotion of reprogramming to ground state pluripotency by signalinhibition.PLoS Biol.2008年10月21日；6(10):e253.PMCID:PMC2570424
Boyer等人,2005,「Core Transcriptional Regulatory Circuitry in HumanEmbryonic Stem Cells」,Cell,第122卷,947-956
Takahashi K及Yamanaka S(2006)Induction of pluripotent stem cells frommouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.Cell 126(4):663-676.
Porter D等人(2011)Chimeric antigen receptor-modified T cells inchronic lymphoid leukemia.N Engl J Med 365:725-733DOI:10.1056/NEJMoa1103849
Tiller T等人(2013)A fully synthetic human Fab antibody library basedon fixed VH/VL framework pairings with favorable biophysical properties.MABs9:5(3)PMID:23571156
Webb PA,Perisic O,Mendola CE,Backer JM及Williams RL.The crystalstructure of a human nucleoside diphosphate kinase,NM23-H2.J Mol Biol.1995,251:574-587.
Min K,Song HK,Chang C,Kim SY,Lee KJ及Suh SW.Crystal structure ofhuman nucleoside diphosphate kinase A,a metastasis suppressor.Proteins.2002,46:340-342.
*****
仅使用常规实验，熟习此项技术者将识别或能够确定本文中特定描述的本发明的特定具体实例的多种等效形式。该等等效形式意欲包涵于申请专利范围的范畴中。
Figure IDA0000959735280000011
Figure IDA0000959735280000021
Figure IDA0000959735280000031
Figure IDA0000959735280000041
Figure IDA0000959735280000051
Figure IDA0000959735280000061
Figure IDA0000959735280000071
Figure IDA0000959735280000081
Figure IDA0000959735280000091
Figure IDA0000959735280000101
Figure IDA0000959735280000111
Figure IDA0000959735280000121
Figure IDA0000959735280000131
Figure IDA0000959735280000141
Figure IDA0000959735280000151
Figure IDA0000959735280000161
Figure IDA0000959735280000171
Figure IDA0000959735280000181
Figure IDA0000959735280000191
Figure IDA0000959735280000201
Figure IDA0000959735280000211
Figure IDA0000959735280000221
Figure IDA0000959735280000231
Figure IDA0000959735280000241
Figure IDA0000959735280000251
Figure IDA0000959735280000261
Figure IDA0000959735280000271
Figure IDA0000959735280000281
Figure IDA0000959735280000291
Figure IDA0000959735280000301
Figure IDA0000959735280000311
Figure IDA0000959735280000321
Figure IDA0000959735280000331
Figure IDA0000959735280000341
Figure IDA0000959735280000351
Figure IDA0000959735280000361
Figure IDA0000959735280000371
Figure IDA0000959735280000381
Figure IDA0000959735280000391
Figure IDA0000959735280000401
Figure IDA0000959735280000411
Figure IDA0000959735280000421
Figure IDA0000959735280000431
Figure IDA0000959735280000451
Figure IDA0000959735280000461
Figure IDA0000959735280000471
Figure IDA0000959735280000481
Figure IDA0000959735280000491
Figure IDA0000959735280000501
Figure IDA0000959735280000511
Figure IDA0000959735280000521
Figure IDA0000959735280000531
Figure IDA0000959735280000541
Figure IDA0000959735280000551
Figure IDA0000959735280000561
Figure IDA0000959735280000571
Figure IDA0000959735280000581
Figure IDA0000959735280000591
Figure IDA0000959735280000601
Figure IDA0000959735280000611
Figure IDA0000959735280000621
Figure IDA0000959735280000631
Figure IDA0000959735280000641
Figure IDA0000959735280000651
Figure IDA0000959735280000661
Figure IDA0000959735280000671
Figure IDA0000959735280000681
Figure IDA0000959735280000691
Figure IDA0000959735280000701
Figure IDA0000959735280000711
Figure IDA0000959735280000721
Figure IDA0000959735280000731
Figure IDA0000959735280000741
Figure IDA0000959735280000751
Figure IDA0000959735280000761
Figure IDA0000959735280000771
Figure IDA0000959735280000781
Figure IDA0000959735280000791
Figure IDA0000959735280000801
Figure IDA0000959735280000811
Figure IDA0000959735280000821
Figure IDA0000959735280000831
Figure IDA0000959735280000841
Figure IDA0000959735280000851
Figure IDA0000959735280000861
Figure IDA0000959735280000871
Figure IDA0000959735280000881
Figure IDA0000959735280000891
Figure IDA0000959735280000901
Figure IDA0000959735280000911
Figure IDA0000959735280000921
Figure IDA0000959735280000931
Figure IDA0000959735280000941
Figure IDA0000959735280000951
Figure IDA0000959735280000961
Figure IDA0000959735280000971
Figure IDA0000959735280000981
Figure IDA0000959735280000991
Figure IDA0000959735280001001
Figure IDA0000959735280001011
Figure IDA0000959735280001021
Figure IDA0000959735280001031
Figure IDA0000959735280001041
Figure IDA0000959735280001051
Figure IDA0000959735280001061
Figure IDA0000959735280001071
Figure IDA0000959735280001081
Figure IDA0000959735280001091
Figure IDA0000959735280001101
Figure IDA0000959735280001111
Figure IDA0000959735280001121
Figure IDA0000959735280001131
Figure IDA0000959735280001141
Figure IDA0000959735280001151
Figure IDA0000959735280001161
Figure IDA0000959735280001171
Figure IDA0000959735280001181
Figure IDA0000959735280001191
Figure IDA0000959735280001201
Figure IDA0000959735280001211
Figure IDA0000959735280001221
Figure IDA0000959735280001231
Figure IDA0000959735280001241
Figure IDA0000959735280001251
Figure IDA0000959735280001261
Figure IDA0000959735280001271
Figure IDA0000959735280001281
Figure IDA0000959735280001291
Figure IDA0000959735280001301
Figure IDA0000959735280001311
Figure IDA0000959735280001321
Figure IDA0000959735280001331
Figure IDA0000959735280001341
Figure IDA0000959735280001351
Figure IDA0000959735280001361
Figure IDA0000959735280001371
Figure IDA0000959735280001381
Figure IDA0000959735280001391

Claims (16)

1.一种测试潜在药剂对于非人类哺乳动物中的癌细胞的功效的方法，其包含：
(i)在非人类哺乳动物中产生癌细胞；
(ii)通过向该哺乳动物投予潜在药剂使癌细胞与该潜在药剂接触；及
(iii)测量该潜在药剂对癌细胞的作用，其中该哺乳动物中的癌细胞数目减少表示该潜在药剂对于癌细胞的有效性，其中该方法包含在进行步骤(i)之前、在进行步骤(i)之后或在进行步骤(i)之前及之后使癌细胞与使干细胞维持初始状态或使经诱导干细胞恢复初始状态的药剂接触，其中使干细胞维持初始状态或使经诱导干细胞恢复初始状态的药剂为NME7蛋白。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述NME7蛋白为NME7单体或NME7-AB。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述哺乳动物为啮齿动物。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述啮齿动物为小鼠或大鼠。
5.如权利要求1所述的方法，其中在步骤(i)中，所述癌细胞是自然产生或自人类植入。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述非人类哺乳动物为转殖基因动物，其中所述哺乳动物在生殖细胞或体细胞中表达人类MUC1或MUC1*或NME蛋白，其中所述生殖细胞及体细胞含有引入所述哺乳动物中的重组人类MUC1或MUC1*或NME基因序列。
7.如权利要求6所述的方法，其中表达所述人类MUC1或MUC1*或NME蛋白的基因受控于诱导型启动子。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述启动子诱导性地回应于所述非人类哺乳动物中的天然存在的蛋白。
9.如权利要求5所述的方法，其中植入所述哺乳动物中的细胞量为至少30。
10.如权利要求5所述的方法，其中植入所述哺乳动物中的细胞量为30至1,000,000。
11.如权利要求5所述的方法，其中植入所述哺乳动物中的细胞量为50至500,000。
12.如权利要求5所述的方法，其中植入所述哺乳动物中的细胞量为50至100,000或1,000至1,000,000。
13.如权利要求1所述的方法，其中使干细胞维持初始状态或使经诱导干细胞恢复初始状态的药剂在进行步骤(i)之前与癌细胞接触。
14.如权利要求1所述的方法，其中使干细胞维持初始状态或使经诱导干细胞恢复初始状态的药剂在进行步骤(i)之后与癌细胞接触。
15.如权利要求1所述的的方法，其中使干细胞维持初始状态或使经诱导干细胞恢复初始状态的药剂在进行步骤(i)之前及之后与癌细胞接触。
16.如权利要求2所述的方法，其中所述NME7蛋白作为单一生长因子存在于无血清培养基中。
CN201480055352.5A 2013-08-12 2014-08-12 加强肿瘤生长的方法 Active CN105764334B (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201361865092P 2013-08-12 2013-08-12
US61/865,092 2013-08-12
USPCT/US14/17515 2014-02-20
PCT/US2014/017515 WO2014130741A2 (en) 2013-02-20 2014-02-20 Nme inhibitors and methods of using nme inhibitors
PCT/US2014/050773 WO2015023694A2 (en) 2013-08-12 2014-08-12 Method for enhancing tumor growth

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105764334A CN105764334A (zh) 2016-07-13
CN105764334B true CN105764334B (zh) 2020-07-28

Family

ID=52468797

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201480055352.5A Active CN105764334B (zh) 2013-08-12 2014-08-12 加强肿瘤生长的方法

Country Status (8)

Country Link
EP (2) EP3038462B1 (zh)
JP (2) JP6640086B2 (zh)
CN (1) CN105764334B (zh)
AU (2) AU2014306778B2 (zh)
CA (1) CA2921187A1 (zh)
IL (1) IL244093B (zh)
TW (1) TWI659210B (zh)
WO (1) WO2015023694A2 (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2016326718B2 (en) 2015-09-23 2022-12-15 Minerva Biotechnologies Corporation Method of screening for agents for differentiating stem cells
WO2018183654A1 (en) * 2017-03-29 2018-10-04 Minerva Biotechnologies Corporation Agents for differentiating stem cells and treating cancer
CN108434452A (zh) * 2018-03-13 2018-08-24 安徽瀚海博兴生物技术有限公司 一种将pd-1抗体和jmjd6联合用于制备抗癌药物的应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102272290A (zh) * 2008-10-09 2011-12-07 米纳瓦生物技术公司 用于在细胞中诱导多能性的方法

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8562988B2 (en) * 2005-10-19 2013-10-22 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Strategies for improved cancer vaccines
CA2656548A1 (en) * 2005-06-30 2007-01-11 Whitehead Institute Progenitor cells and uses thereof
CN101501187A (zh) * 2006-06-06 2009-08-05 田纳西大学研究基金会 富含赘生干细胞的组合物及包含其的方法
AU2008207945A1 (en) * 2007-01-22 2008-07-31 Macrogenics West, Inc. Human cancer stem cells
WO2012126013A2 (en) * 2011-03-17 2012-09-20 Minerva Biotechnologies Corporation Method for making pluripotent stem cells
EP2719759A4 (en) * 2011-05-27 2014-12-24 Public Univ Corp Yokohama City METHOD OF MANUFACTURING ARTIFICIAL CANCER STRAIN CELLS AND INDUCED DIFFERENTIATION METHOD THEREFOR
JP6466170B2 (ja) * 2011-10-17 2019-02-06 ミネルバ バイオテクノロジーズ コーポレーション 幹細胞の増殖及び誘導用の培地
WO2013081188A1 (ja) * 2011-11-30 2013-06-06 独立行政法人国立がん研究センター 誘導悪性幹細胞
JP6546087B2 (ja) * 2012-07-24 2019-07-17 ミネルバ バイオテクノロジーズ コーポレーション Ｎｍｅバリアント種の発現および抑制
EP2958940A4 (en) * 2013-02-20 2016-07-20 Minerva Biotechnologies Corp NME INHIBITORS AND METHODS OF USING NME INHIBITORS

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102272290A (zh) * 2008-10-09 2011-12-07 米纳瓦生物技术公司 用于在细胞中诱导多能性的方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A shRNA Functional Screen Reveals Nme6 and Nme7 are Crucial for Embryonic Stem Cell Renewal;CHIA-HUI WANG et al;《stem cells》;20120816;第30卷;第2199-2211页 *
Benoit J. Smagghe at el.MUC1* Ligand, NM23-H1, Is a Novel Growth Factor That Maintains Human Stem Cells in a More Naïve State.《plos one》.2013,第8卷(第3期),第1-15页. *
Local Effects of Regulatory T Cells in MUC1 Transgenic Mice Potentiate Growth of MUC1 Expressing Tumor Cells In Vivo;Daisuke Sugiura et al;《plos one》;20120917;第7卷(第9期);摘要 *
NuRD Blocks Reprogramming of Mouse Somatic Cells into Pluripotent Stem Cells;MIN LUO et al;《stem cells》;20130326;第31卷;第1278-1286页 *

Also Published As

Publication number Publication date
IL244093A0 (en) 2016-04-21
EP4233536A2 (en) 2023-08-30
JP2019213551A (ja) 2019-12-19
JP2016527901A (ja) 2016-09-15
TW201537172A (zh) 2015-10-01
AU2014306778B2 (en) 2020-10-29
TWI659210B (zh) 2019-05-11
EP3038462A4 (en) 2017-06-14
CN105764334A (zh) 2016-07-13
EP4233536A3 (en) 2023-10-25
CA2921187A1 (en) 2015-02-19
WO2015023694A2 (en) 2015-02-19
EP3038462B1 (en) 2023-03-15
IL244093B (en) 2022-01-01
AU2021200429C1 (en) 2023-11-30
JP6902577B2 (ja) 2021-07-14
AU2014306778A1 (en) 2016-03-03
EP3038462A2 (en) 2016-07-06
AU2021200429A1 (en) 2021-02-25
AU2021200429B2 (en) 2023-05-11
WO2015023694A3 (en) 2015-04-23
JP6640086B2 (ja) 2020-02-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20220193270A1 (en) Method for enhancing tumor growth
AU2021200429C1 (en) Method for enhancing tumor growth
CN105316278B (zh) 用于转染细胞的方法和产品
JP6840084B2 (ja) 多能性細胞を肝細胞系統の細胞へと分化させるためのラミニンの使用
AU2013221839B2 (en) Feeder-free method for culture of bovine and porcine spermatogonial stem cells
CN108884441B (zh) 集落形成培养基及其用途
EP2554660A1 (en) Intervertebral disc nucleus pulposus stem/progenitor cell, method for culturing same, and application
Dever et al. CRISPR/Cas9 genome engineering in engraftable human brain-derived neural stem cells
CN109456932A (zh) 用于干细胞增殖和诱导的培养基
JP7285520B2 (ja) 皮膚由来多能性前駆細胞の作製方法
CN110121555B (zh) 包含工程化内皮细胞的血脑屏障
JP2022535274A (ja) セリアック病の診断、スクリーニング、および治療のための患者由来腸オルガノイドの使用
AU2016287603A1 (en) Method of stem cell-based organ and tissue generation
WO2009154265A1 (ja) 癌幹細胞及び癌細胞株の製造方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CP01 Change in the name or title of a patent holder
CP01 Change in the name or title of a patent holder

Address after: Massachusetts, USA

Patentee after: Minawa Biotechnology

Address before: Massachusetts, USA

Patentee before: Minerva Biotechnology