TWI659210B - 加強腫瘤生長的方法 - Google Patents
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Abstract
本發明關於一種測試潛在藥劑對於哺乳動物中之癌細胞之功效的方法，包括在哺乳動物中產生癌細胞；藉由向該哺乳動物投予潛在藥劑使該等癌細胞與該潛在藥劑接觸；及量測該潛在藥劑對該等癌細胞之作用，其中該哺乳動物中之癌細胞數目減少指示該潛在藥劑對癌細胞之有效性。
Description
本申請案係關於在實驗動物中加強腫瘤移植之方法。本申請案亦關於一種製造癌症幹細胞之方法。
傳統地用於藥物發現中之小鼠、嚙齒動物及其他動物在使用小鼠模型之癌症藥物研究或異種移植實驗中並不精確地模擬人類。首先，如藉由針對醫藥公司之『糟糕藥物』之訴訟的數量證明，小鼠對候選藥物具有之反應通常不反映彼等候選藥物在人類研究中的反應。FDA及藥物公司已顯著提高在允許在人體中進行測試所需的臨床前測試之水準方面的標準，並增加臨床試驗中之測試患者數量。再者，在小鼠及其他測試動物中顯示無毒性之化合物在向人類投予時繼續引起顯著不良事件，包括死亡。似乎在小鼠與人類生物學之間存在關鍵差異從而使小鼠以及其他測試動物，尤其非靈長類測試動物中之藥物安全性測試挫敗。對當前實務之極大改良將為開發使動物，尤其為嚙齒動物對植入或用於研究基礎科學、藥物功效、毒性或劑量之細胞之反應更如同人類之方法。
其次，難以獲得一些移植於小鼠中之癌細胞或癌細胞系。常規地用於試管內測試之多種癌細胞系所具有之移植率對於可靠的動物研究而言過低。舉例而言，T47D乳癌細胞系由於其過度表現致癌基因MUC1而典型地
用於試管內研究。然而，T47D細胞由於其不佳移植率而很少用於小鼠異種移植研究中。已選擇或在基因上改變動物模型以使其模擬某些人類疾病。
一些動物模型自發地獲得某些類型之癌症。然而，此等模型一般僅適用於研究自特異性突變產生之疾病或並不精確模擬人類疾病。如同在傳統小鼠研究中，候選藥物在小鼠中之作用通常不能預測藥物在人體中將具有之作用。因此，對目前先進技術之顯著改良將為開發增加人類癌細胞至測試動物，尤其嚙齒類測試動物中之移植率的方法。
與此相關的是，當前無評估化合物、生物製劑或藥物對腫瘤起始細胞或癌症幹細胞之功效、毒性或劑量的實用方法。舉例而言，Oncomed具有進行此之拖延性方法，其中將來自第一動物之存活腫瘤隨後移植至第二動物中，隨後將來自第二動物之存活腫瘤細胞(其在抗癌劑治療下可能存活)隨後植入第三動物中，隨後以藥劑對第三動物進行測試以測試其抑制存活癌細胞(提議為癌症幹細胞或腫瘤起始細胞)生長之能力。此等方法係基於顯示僅較小比例之癌細胞具有轉移能力之研究及此等『癌症幹細胞』之標記物之鑑別，諸如CD44之高表現伴隨有CD24之低表現(Clarke MF等人2006,Chen K等人2013)。受體CXCR4亦已鑑別為轉移受體，其於癌症幹細胞中之表現較高(Darash-Yahana M,Pikarsky E,Abramovitch R,Zeira E等人2004)。然而，迄今為止，尚無證據表明有可能將癌細胞暴露於使其轉化為癌症幹細胞之一或多種藥劑。因此，對目前先進技術之顯著改良將為開發或鑑別當添加至癌細胞時，將細胞中的一些轉化為癌症幹細胞之藥劑或方法。可隨後對此等癌症幹細胞測試用於治療轉移性癌症或使其進展之藥物及候選藥物。另外，該等藥劑及方法將提供一種富集癌細胞群體用於癌症
幹細胞之實用方法，其亦可用於鑑別轉移性癌細胞之額外但仍未知之標記物，該等標記物隨後將為抗癌藥物之新標靶。
開發加速局部癌細胞轉化為高侵襲性及轉移性癌症幹細胞以使得轉移性藥物標靶可得以鑑別且使得可開發尤其能夠殺死可逃避化學治療之彼等癌症幹細胞之藥物之試管內方法亦為重要的。然而，亦重要的是異種移植NME-7誘導之癌症幹細胞特徵之動物不僅自極低數目之植入癌細胞產生腫瘤，且亦產生轉移性癌症，伴以產生多個腫瘤，包括在遠離植入位點之位置的腫瘤。
基本上，僅存在少數反覆用於研究癌症生物學之基礎科學及測試藥物功效以及藥物毒性之癌細胞系。此係由於人類細胞不同於小鼠細胞，在其開始衰老之前僅可在培養物中分裂極有限次數。研究者現今使用之癌細胞系為自單一轉移性癌症患者之肋膜積液分離之天然不朽化癌細胞或藉由融合至不朽化細胞系(通常來源於小鼠)或最近藉由以不朽化基因轉染癌細胞而誘導變為不朽化。重要的是用於使此等細胞繼續自我複製之方法顯著改變原始或原代癌細胞之分子特徵。事實上此等細胞系為來自數年前存活及死亡之患者的癌細胞且可能決不類似於特定患者所罹患之特定癌症。因此，對目前先進技術之顯著改良將為開發以不改變患者之癌細胞之分子特徵，或若分子特徵改變，彼等改變將理想地模擬患者之身體中該癌症之進展的方式研究來自患者之癌細胞之方法。舉例而言，可接受的改變將為假設增加患者之癌細胞可經受之分裂次數之方法將一或多個癌細胞轉化為該癌症之更具侵襲性形式或該癌症之轉移形式。隨後，可對於患者之自身癌細胞評估化合物、生物製劑或藥物之功效、毒性或劑量。
類似地，僅使用少數如上所述的與特定患者之特定癌症具有極小相似性或無相似性之不朽化癌細胞系在嚙齒動物中建立候選藥物之功效、安全性測試及給藥時程的一級近似。因此，對目前先進技術之顯著改良將為開發使得能夠將患者之癌細胞移植至動物，較佳嚙齒動物中，且視情況評估化合物、生物製劑或藥物對測試動物中之患者之癌症之功效、毒性或劑量的方法。
除上文所述的基本上阻止使用當前方法將患者癌細胞移植至測試動物中之問題以外，必須將約4百萬至6百萬個癌細胞植入測試動物中以於宿主動物中產生腫瘤。關於此之原因為科學家最近發現並非腫瘤內之每一細胞具有產生腫瘤之能力；大多數無法產生腫瘤。在植入時可產生腫瘤之癌細胞之小群體稱作『腫瘤起始細胞』或『癌症幹細胞』。估計100,000個癌細胞中少至1個可產生腫瘤且已定方案通常需要植入數百萬癌細胞以在測試動物中產生腫瘤。研究測試動物中之患者癌細胞之問題隨後變為除上述不朽化問題以外的數量問題。簡言之，典型腫瘤生檢將不會產生對數百隻小鼠各自植入4-6百萬個癌細胞之足夠細胞以對提出之候選藥物之功效、毒性或劑量作出恰當評定。亦已述及，原始患者細胞將不會不朽化，因此將不會與在患者體內一樣在評定實驗之持續時間內增殖。因此，對目前先進技術之顯著改良將為開發使得能夠將極少患者癌細胞移植至動物中之方法。
在一個態樣中，本發明係關於一種用於測試潛在藥劑對於非人類哺乳動物中之癌細胞之功效的測試方法，其包含：(i)在非人類哺乳動物中產生
癌細胞；(ii)藉由將潛在藥劑投予至哺乳動物使癌細胞與潛在藥劑接觸；及(iii)量測潛在藥劑對癌細胞之作用，其中哺乳動物中之癌細胞數目的減少可指示潛在藥劑對癌細胞之有效性，其中該方法包含在進行步驟(i)之前、在進行步驟(i)之後或在進行步驟(i)之前及之後使癌細胞與使幹細胞維持初始(naïve)狀態或使經誘導(primed)幹細胞恢復至初始狀態之藥劑接觸。
在以上方法中，使幹細胞維持初始狀態或使經誘導幹細胞恢復至初始狀態之藥劑可為NME蛋白、2i、5i、化學物質或核酸。NME蛋白可為NME1二聚體、NME7單體、NME7-AB、NME6二聚體或細菌性NME。
哺乳動物可為嚙齒動物，諸如小鼠或大鼠。癌症可自人類自發地產生或植入。
在以上方法中，非人類哺乳動物可為轉殖基因的，其中哺乳動物在生殖細胞或體細胞中表現人類MUC1或MUC1*或NME蛋白，其中生殖細胞及體細胞含有引入至該哺乳動物中之重組人類MUC1或MUC1*或NME基因序列。表現人類MUC1或MUC1*或NME蛋白之基因可在誘導型啟動子控制下。啟動子可誘導性地回應於非人類哺乳動物中的天然存在之蛋白。植入哺乳動物中之細胞之量可為至少約30、約30至約1,000,000、約50至約500,000、約50至100,000或約1,000至約1,000,000。NME蛋白可以單生長因子形式存在於無血清培養基中。
在另一態樣中，本發明可係關於一種在非人類哺乳動物中移植人類腫瘤之方法，包含將人類腫瘤細胞注射或植入哺乳動物中，該方法包含在進行注射或植入步驟之前、在進行注射或植入步驟之後或在進行注射或植入
步驟之前及之後使腫瘤細胞與使幹細胞維持初始狀態或使經誘導幹細胞恢復至初始狀態之藥劑接觸。
在以上方法中，使幹細胞維持初始狀態或使經誘導幹細胞恢復至初始狀態之藥劑可為NME蛋白、2i、5i、化學物質或核酸。NME蛋白可為NME1二聚體、NME7單體、NME7-AB、NME6二聚體或細菌性NME。哺乳動物可為嚙齒動物，諸如小鼠或大鼠。
在以上方法中，非人類哺乳動物可為轉殖基因的，其中哺乳動物在生殖細胞或體細胞中表現人類MUC1或MUC1*或NME蛋白，其中生殖細胞及體細胞含有引入至該哺乳動物中之重組人類MUC1或MUC1*或NME基因序列。表現人類MUC1或MUC1*或NME蛋白之基因可在誘導型啟動子控制下。啟動子可誘導性地回應於非人類哺乳動物中的天然存在之蛋白。植入哺乳動物中之細胞之量可為至少約30、約30至約1,000,000、約50至約500,000、約50至100,000或約1,000至約1,000,000。NME蛋白可以單生長因子形式存在於無血清培養基中。
在另一態樣中，本發明係關於一種產生癌幹細胞之方法，包含使癌細胞與使幹細胞維持初始狀態或使經誘導幹細胞恢復至初始狀態之藥劑接觸。
在以上方法中，使幹細胞維持初始狀態或使經誘導幹細胞恢復至初始狀態之藥劑可為NME蛋白、2i、5i、化學物質或核酸。NME蛋白可為NME1二聚體、NME7單體、NME7-AB、NME6二聚體或細菌性NME。
在此方法中，藥劑可抑制MBD3、CHD4、BRD4或JMJD6之表現。藥劑可為針對MBD3、CHD4、BRD4或JMJD6製得之siRNA，或針對任何編
碼上調MBD3、CHD4、BRD4或JMJD6之表現之蛋白的基因製得之siRNA。癌幹細胞可藉由相比於癌細胞或正常細胞，CXCR4或E-鈣黏蛋白(CDH1)之表現增加表徵。
在另一態樣中，本發明係關於一種在非人類哺乳動物中產生轉移性腫瘤之方法，包含將癌細胞轉移至哺乳動物中，其中該方法包含在進行轉移步驟之前、在進行轉移步驟之後或在進行轉移步驟之前及之後使癌細胞與使幹細胞維持初始狀態或使經誘導幹細胞恢復至初始狀態之藥劑接觸。
在以上方法中，使幹細胞維持初始狀態或使經誘導幹細胞恢復至初始狀態之藥劑可為NME蛋白、2i、5i、化學物質或核酸。NME蛋白可為NME1二聚體、NME7單體、NME7-AB、NME6二聚體或細菌性NME。
在此方法中，藥劑可抑制MBD3、CHD4、BRD4或JMJD6之表現。藥劑可為針對MBD3、CHD4、BRD4或JMJD6製得之siRNA，或針對任何編碼上調MBD3、CHD4、BRD4或JMJD6之表現之蛋白的基因製得之siRNA。癌幹細胞可藉由相比於癌細胞或正常細胞，CXCR4或E-鈣黏蛋白(CDH1)之表現增加表徵。
在以上方法中，哺乳動物可為嚙齒動物，諸如小鼠或大鼠。非人類哺乳動物可為轉殖基因的，其中哺乳動物在生殖細胞或體細胞中表現人類MUC1或MUC1*或NME蛋白，其中生殖細胞及體細胞含有引入至該哺乳動物中之重組人類MUC1或MUC1*或NME基因序列。表現人類MUC1或MUC1*或NME蛋白之基因可在誘導型啟動子控制下。啟動子可誘導性地回應於非人類哺乳動物中的天然存在之蛋白。植入哺乳動物中之細胞之量可為至少約30、約30至約1,000,000、約50至約500,000、約50至100,000或
約1,000至約1,000,000。NME蛋白可以單生長因子形式存在於無血清培養基中。
在另一態樣中，本發明係關於一種用於測試潛在藥劑對於非人類哺乳動物中之癌細胞之功效的測試方法，其包含：(i)將患者的癌細胞轉移至非人類哺乳動物中；(ii)藉由將潛在藥劑投予至哺乳動物使癌細胞與潛在藥劑接觸；及(iii)量測潛在藥劑對癌細胞之作用，其中哺乳動物中之患者的癌細胞數目的減少可指示潛在藥劑對癌細胞之有效性，其中該方法包含在進行步驟(i)之前、在進行步驟(i)之後或在進行步驟(i)之前及之後使患者的癌細胞與使幹細胞維持初始狀態或使經誘導幹細胞恢復至初始狀態之藥劑接觸。
在以上方法中，使幹細胞維持初始狀態或使經誘導幹細胞恢復至初始狀態之藥劑可為NME蛋白、2i、5i、化學物質或核酸。NME蛋白可為NME1二聚體、NME7單體、NME7-AB、NME6二聚體或細菌性NME。
在此方法中，藥劑可抑制MBD3、CHD4、BRD4或JMJD6之表現。藥劑可為針對MBD3、CHD4、BRD4或JMJD6製得之siRNA，或針對任何編碼上調MBD3、CHD4、BRD4或JMJD6之表現之蛋白的基因製得之siRNA。癌幹細胞可藉由相比於癌細胞或正常細胞，CXCR4或E-鈣黏蛋白(CDH1)之表現增加表徵。
在以上方法中，哺乳動物可為嚙齒動物，諸如小鼠或大鼠。非人類哺乳動物可為轉殖基因的，其中哺乳動物在生殖細胞或體細胞中表現人類MUC1或MUC1*或NME蛋白，其中生殖細胞及體細胞含有引入至該哺乳動物中之重組人類MUC1或MUC1*或NME基因序列。表現人類MUC1或
MUC1*或NME蛋白之基因可在誘導型啟動子控制下。啟動子可誘導性地回應於非人類哺乳動物中的天然存在之蛋白。植入哺乳動物中之細胞之量可為至少約30、約30至約1,000,000、約50至約500,000、約50至100,000或約1,000至約1,000,000。NME蛋白可以單生長因子形式存在於無血清培養基中。
在另一態樣中，本發明係關於一種在非人類哺乳動物中自異種移植產生組織之方法，其包含：(i)產生轉殖基因非人類哺乳動物，其中哺乳動物表現生殖細胞及體細胞中之人類MUC1或MUC1*或NME蛋白，其中生殖細胞及體細胞含有引入至該哺乳動物中的重組人類MUC1或MUC1*或NME基因序列，其中可在誘導型及可抑制型調節序列之控制下表現基因序列；(ii)將來源上為異種的幹細胞或祖細胞轉移至非人類哺乳動物中以使得基因可誘發為表現的以使幹細胞或祖細胞之數目倍增；及(iii)抑制基因表現以自異種移植幹細胞產生組織。
在此方法中，在步驟(iii)中，可藉由使幹細胞與組織分化因子接觸進行基因表現抑制，或在步驟(iii)中，可在回應於自然地產生之宿主組織分化因子之哺乳動物中自然地進行基因表現抑制。轉移之細胞可為人類細胞。組織可為腎器官。NME蛋白可為NME1二聚體、NME7單體、NME7-AB、NME6二聚體或細菌性NME。哺乳動物可為嚙齒動物，諸如小鼠或大鼠。
在另一態樣中，本發明係關於一種產生防癌性肽之方法，包含：(i)產生非人類轉殖基因宿主哺乳動物，其中該哺乳動物在生殖細胞或體細胞中表現人類MUC1或MUC1*或NME蛋白，其中生殖細胞及體細胞含有引入至該哺乳動物中之重組人類MUC1或MUC1*或NME基因序列；(ii)以NME
蛋白之片段使哺乳動物免疫；(iii)將人類腫瘤細胞植入哺乳動物中；及(iv)比較哺乳動物與對照轉殖基因非人類哺乳動物中之細胞之腫瘤移植、腫瘤生長速率或腫瘤起始潛能以將引起顯著減少的腫瘤移植、腫瘤生長速率或腫瘤起始潛能之肽選擇為免疫肽。
在此方法中，NME蛋白之片段可為選自圖61至圖63中之肽編號1至53之肽。NME蛋白可為NME1二聚體、NME7單體、NME7-AB、NME6二聚體或細菌性NME。哺乳動物可為嚙齒動物，諸如小鼠或大鼠。
自下文中給出之實施方式及僅以說明方式給出且因此不限制本發明之隨附圖式，本發明將變得更充分理解，且在隨附圖式中：圖1顯示小鼠中之腫瘤細胞生長之圖。圖(A)顯示與標準基質膠或基質膠加上NME7混合且異種移植至免疫缺陷(nu/nu)小鼠中之T47D乳房腫瘤細胞之生長之圖。在第14天之後，腫瘤細胞與NME7混合之小鼠亦每日注射人類重組NME7一次。圖(B)顯示與基質膠加上NME7混合且異種移植至免疫缺陷小鼠中之T47D乳房腫瘤細胞之生長之圖。在第14天之後，一半小鼠亦每日注射人類重組NME7一次。
圖2顯示個別小鼠中之人類腫瘤細胞生長之圖。圖(A)顯示與標準基質膠混合之T47D乳癌細胞生長之圖。六隻植入小鼠中僅兩隻顯示移植之腫瘤生長特徵。圖(B)顯示與基質膠及NME7混合之T47D乳癌細胞之生長之圖。六隻植入小鼠中的四隻顯示移植之腫瘤生長特徵。虛線表明亦在第14天之後注射NME7之小鼠。
圖3顯示與標準基質膠混合且異種移植至免疫缺陷(nu/nu)小鼠中之
T47D腫瘤細胞之圖。該圖顯示兩組相同的20隻小鼠之平均值，每一組之腫瘤體積具有22%之平均增加但具有向下趨勢。
圖4顯示四十隻個別小鼠中之T47D人類乳房腫瘤細胞之生長之圖，約25%顯示腫瘤移植。
圖5顯示與基質膠混合且異種移植至NOD/SCID小鼠之側腹中之T47D乳癌細胞之生長之圖。圖(A)顯示平均腫瘤生長。圖(B)顯示個別小鼠中之腫瘤生長，其展現使用標準方法之六隻小鼠中僅一隻具有良好腫瘤移植。
圖6顯示據報導在正常RPMI生長培養基或無血清基本培養基(向其中添加重組人類NME7-AB作為單一生長因子)中培養之MUC1陽性T47D乳癌細胞中之一些癌症幹細胞或轉移性癌細胞中過度表現之一組基因之表現的RT-PCR量測值之圖。一部分彼等細胞變得非黏附且在表面浮起且進行收集，同時『+Ri』係指添加至培養基以使得所有細胞將保持附著於表面，因此給出黏附及非黏附細胞之平均讀數之ρ激酶抑制劑。
圖7顯示據報導在正常RPMI生長培養基或無血清基本培養基(向其中添加人類重組NM23(亦稱作NME1)二聚體或NME7-AB作為單一生長因子)中培養之MUC1陽性T47D乳癌細胞中之一些癌症幹細胞或轉移性癌細胞中過度表現之一組基因之表現的RT-PCR量測值之圖。『漂浮物』係指變得非黏附且經收集之彼等細胞，而『+Ri』係指添加至一些細胞以使其黏附至表面之ρ激酶抑制劑。
圖8顯示據報導在正常RPMI生長培養基或無血清基本培養基(向其中添加來自物種HSP593之重組細菌性NME1二聚體)中培養之MUC1陽性
T47D乳癌細胞中之一些癌症幹細胞或轉移性癌細胞中過度表現之一組基因之表現的RT-PCR量測值之圖。『漂浮物』係指變得非黏附且經收集，隨後進行分析之彼等細胞。
圖9顯示據報導在正常RPMI生長培養基或無血清基本培養基(向其中添加『2i』，其為MAP激酶及GSK3之生化抑制劑，先前顯示使經誘導狀態下之幹細胞恢復至較早初始狀態，2i加上重組人類NM23二聚體，或2i加上重組人類NME7-AB)中培養之MUC1陽性T47D乳癌細胞中之一些癌症幹細胞或轉移性癌細胞中過度表現之一組基因之表現的RT-PCR量測值之圖。『漂浮物』係指變得非黏附且經收集，隨後進行分析之彼等細胞。
圖10顯示據報導在正常RPMI生長培養基或無血清基本培養基(向其中添加『2i』，其為MAP激酶及GSK3之生化抑制劑，先前顯示使經誘導狀態下之幹細胞恢復至較早初始狀態，2i加上重組人類NME7-AB或僅NME7-AB)中培養之MUC1陽性T47D乳癌細胞中之一些癌症幹細胞或轉移性癌細胞中過度表現之一組基因之表現的RT-PCR量測值之圖。『漂浮物』係指變得非黏附且經收集，隨後進行分析之彼等細胞。
圖11a顯示據報導在正常RPMI生長培養基或無血清基本培養基(向其中添加人類重組NM23(亦稱作NME1)二聚體或NME7-AB作為單一生長因子)中培養之MUC1陽性DU145前列腺癌細胞中之一些癌症幹細胞或轉移性癌細胞中過度表現之一組基因之表現的RT-PCR量測值之圖。此等細胞未在表面浮起，儘管許多僅鬆散地附著，使得量測值為將為『漂浮物』及黏附細胞之細胞的平均值。
圖11b顯示在DU145前列腺癌細胞在重組人類NME7-AB、細菌性
HSP593 NME1或人類NME1/NM23二聚體中培養9或10繼代之後的一組基因之表現的RT-PCR量測值之圖。該圖顯示在藥劑中之延長培養之後，前列腺癌症標記物CDH1/E-鈣黏蛋白及幹細胞標記物之表現增加。
圖12a顯示據報導在正常RPMI生長培養基或無血清基本培養基(向其中添加重組人類NME1/NM23二聚體或NME7-AB作為單一生長因子)中培養之MUC1陰性PC3前列腺癌細胞中之一些癌症幹細胞或轉移性癌細胞中過度表現之一組基因之表現的RT-PCR量測值之圖。
圖12b顯示在無血清基本培養基(向其中添加重組人類NME1/NM23、細菌性HSP593 NME1或NME7-AB作為單一生長因子)中連續繼代之後的MUC1陰性PC3前列腺癌細胞中之一組基因之表現的RT-PCR量測值之圖。
圖13顯示編碼正常RPMI生長培養基或無血清基本培養基(向其中添加『2i』或重組人類NME7-AB)中培養之MUC1陽性T47D乳癌細胞中之染色質重排因子BRD4、JMJD6、MBD3及CHD4之基因之表現的RT-PCR量測值之圖，其中『漂浮物』細胞為分析之細胞。
圖14顯示編碼正常RPMI生長培養基或無血清基本培養基(向其中添加2i、2i加上重組人類NM23二聚體或2i加上重組人類NME7-AB)中培養之MUC1陽性T47D乳癌細胞中之染色質重排因子BRD4、JMJD6、MBD3及CHD4之基因之表現的RT-PCR量測值之圖。『漂浮物』係指變得非黏附且經收集，隨後進行分析之彼等細胞。
圖15顯示據報導在正常纖維母細胞生長培養基或無血清基本培養基(向其中添加人類重組NM23(亦稱作NME1)二聚體、NME7-AB或HSP593細菌性NME1二聚體)中培養之一些癌症幹細胞或轉移性癌症細胞、體纖
維母細胞『fbb』細胞中過度表現之基因之表現的RT-PCR量測值之圖。『+ROCi』係指添加至一些細胞以使其黏附於表面之ρ激酶抑制劑。『-ROCi』不指漂浮物而係指在不存在ρ激酶抑制劑之情況下保持黏附之細胞。
圖16顯示編碼正常纖維母細胞生長培養基或無血清基本培養基(向其中添加人類重組NM23(亦稱作NME1)二聚體、NME7-AB或HSP593細菌性NME1二聚體)中培養之體纖維母細胞『fbb』細胞中之染色質重排因子BRD4、JMJD6、MBD3及CHD4之基因之表現的RT-PCR量測值之圖。『+ROCi』係指添加至一些細胞以使其黏附於表面之ρ激酶抑制劑。
圖17顯示據報導在編碼正常纖維母細胞生長培養基或無血清基本培養基(向其中添加人類重組NM23(亦稱作NME1)二聚體、NME7-AB或HSP593細菌性NME1二聚體)中培養之體纖維母細胞『fbb』細胞中之染色質重排因子BRD4、JMJD6、MBD3及CHD4之一些癌症幹細胞或轉移性癌細胞及基因中過度表現之基因之表現的RT-PCR量測值之圖。『+ROCi』係指添加至一些細胞以使其黏附於表面之ρ激酶抑制劑。此處之『-ROCi』係指變得非黏附且在表面浮起的細胞。
圖18顯示具有多能性形態之人類胚胎幹細胞之相片，其中已在將重組人類NME1二聚體作為添加之唯一生長因子之情況下於無血清基本培養基中培養幹細胞。
圖19顯示具有多能性形態之人類胚胎幹細胞之相片，其中已在將重組人類NME7-AB作為添加之唯一生長因子之情況下於無血清基本培養基中培養幹細胞。
圖20顯示具有多能性形態之人類胚胎幹細胞之相片，其中已在將重組
HSP593細菌性NME1二聚體作為添加之唯一生長因子之情況下於無血清基本培養基中培養幹細胞。
圖21顯示在側腹中皮下地植入50、100、1,000或10,000個細胞之四組免疫缺陷nu/nu雌性小鼠之腫瘤體積量測值之圖，其中植入之細胞為在重組人類NME7-AB中培養七日之人類MUC1陽性乳癌細胞，其中收集『漂浮物』且驗證過度表現癌轉移受體CXCR4 100倍以上。各組中之一半小鼠每日注射人類重組NME7-AB。圖內的編號係指小鼠追蹤編號。『M』表示具有多個腫瘤之小鼠。
圖22顯示在側腹中皮下地植入50、100、1,000或10,000個細胞之四組免疫缺陷nu/nu雌性小鼠之腫瘤體積量測值之圖，其中植入之細胞為在重組人類NME7-AB中培養七日之人類MUC1陽性乳癌細胞，其中收集『漂浮物』且驗證過度表現癌轉移受體CXCR4 100倍以上。各組中之一半小鼠每日注射人類重組NME7-AB。在接受NME7-AB之每日注射的小鼠中，80%產生多個腫瘤。此圖顯示相同小鼠中之多個腫瘤之合併體積。圖內的編號係指小鼠追蹤編號。『M』表示具有多個腫瘤之小鼠。
圖23顯示植入50個癌細胞且每日注射rhNME7-AB之1號小鼠在第28天及第58天之相片。深色箭頭指出注射位點之腫瘤且淺色箭頭指出在第28天與第63天之間產生的轉移性腫瘤。
圖24顯示植入50個癌細胞且未每日注射rhNME7-AB之2號小鼠在第28天及第58天之相片。深色箭頭指出注射位點之腫瘤。
圖25顯示植入50個癌細胞且每日注射rhNME7-AB之3號小鼠在第28天及第58天之相片。深色箭頭指出注射位點之腫瘤。
圖26顯示植入50個癌細胞且未每日注射rhNME7-AB之4號小鼠在第28天及第58天之相片。深色箭頭指出注射位點之腫瘤。
圖27顯示植入50個癌細胞且每日注射rhNME7-AB之5號小鼠在第28天及第58天之相片。深色箭頭指出注射位點之腫瘤且淺色箭頭指出在第28天與第63天之間產生的轉移性腫瘤。
圖28顯示植入50個癌細胞且未每日注射rhNME7-AB之2號小鼠在第28天及第58天之相片。深色箭頭指出注射位點之腫瘤。
圖29顯示植入100個癌細胞且未每日注射rhNME7-AB之1號小鼠在第28天之相片。深色箭頭指出注射位點之腫瘤。
圖30顯示植入100個癌細胞且每日注射rhNME7-AB之2號小鼠在第28天及第58天之相片。深色箭頭指出注射位點之腫瘤且淺色箭頭指出在第28天與第63天之間產生的轉移性腫瘤。
圖31顯示植入100個癌細胞且未每日注射rhNME7-AB之3號小鼠在第28天之相片。深色箭頭指出注射位點之腫瘤。
圖32顯示植入100個癌細胞且每日注射rhNME7-AB之4號小鼠在第28天及第58天之相片。深色箭頭指出注射位點之腫瘤且淺色箭頭指出在第28天與第63天之間產生的轉移性腫瘤。
圖33顯示植入100個癌細胞且未每日注射rhNME7-AB之5號小鼠在第28天及第58天之相片。在第28天與第63天之間未產生腫瘤。
圖34顯示植入100個癌細胞且每日注射rhNME7-AB之6號小鼠在第28天及第58天之相片。深色箭頭指出注射位點之腫瘤且淺色箭頭指出在第28天與第63天之間產生的轉移性腫瘤。
圖35顯示植入1,000個癌細胞且每日注射rhNME7-AB之1號小鼠在第28天及第58天之相片。深色箭頭指出注射位點之腫瘤且淺色箭頭指出在第28天與第63天之間產生的轉移性腫瘤。
圖36顯示植入1,000個癌細胞且未注射rhNME7-AB之2號小鼠在第28天及第58天之相片。在第28天與第63天之間未產生腫瘤。
圖37顯示植入1,000個癌細胞且每日注射rhNME7-AB之3號小鼠在第28天及第58天之相片。在第28天與第63天之間未產生腫瘤。
圖38顯示植入1,000個癌細胞且未每日注射rhNME7-AB之4號小鼠在第28天及第58天之相片。深色箭頭指出注射位點之腫瘤。
圖39顯示植入1,000個癌細胞且每日注射rhNME7-AB之5號小鼠在第28天及第58天之相片。深色箭頭指出注射位點之腫瘤。
圖40顯示植入1,000個癌細胞且未注射rhNME7-AB之6號小鼠在第28天及第58天之相片。在第28天與第63天之間未產生腫瘤。
圖41顯示植入10,000個細胞且未每日注射rhNME7-AB之1號小鼠由於疾病而在第28天犧牲之相片。深色箭頭指出注射位點之腫瘤。
圖42顯示植入10,000個癌細胞且每日注射rhNME7-AB之2號小鼠在第28天及第58天之相片。深色箭頭指出注射位點之腫瘤且淺色箭頭指出在第28天與第63天之間產生的轉移性腫瘤。
圖43顯示植入10,000個癌細胞且未每日注射rhNME7-AB之3號小鼠在第28天及第58天之相片。深色箭頭指出注射位點之腫瘤。
圖44顯示植入10,000個癌細胞且每日注射rhNME7-AB之4號小鼠在第28天及第58天之相片。深色箭頭指出注射位點之腫瘤且淺色箭頭指出在
第28天與第63天之間產生的轉移性腫瘤。
圖45顯示植入10,000個癌細胞且未每日注射rhNME7-AB之5號小鼠在第28天及第58天之相片。深色箭頭指出注射位點之腫瘤。
圖46顯示植入10,000個癌細胞且每日注射rhNME7-AB之6號小鼠在第28天及第58天之相片。深色箭頭指出注射位點之腫瘤。
圖47顯示來自顯示NME7-AB使MUC1*細胞外域肽二聚化的ELISA夾心法分析之HRP信號之圖。
圖48A至圖48B.(A)顯示來自細菌鹽單胞菌屬(Halomonas Sp.)593之NME之聚丙烯醯胺凝膠，該細菌表現於大腸桿菌中且表現為可溶蛋白及天然二聚體.(B)顯示在ELISA分析中，來自鹽單胞菌屬593之NME結合於MUC1*細胞外域之PSMGFR肽。
圖49顯示來自細菌牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonasgingivalis)W83之NME之聚丙烯醯胺凝膠。
圖50A至圖50C.(A)顯示鹽單胞菌屬593細菌性NME與人類NME-H1之序列對比.(B)顯示鹽單胞菌屬593細菌性NME與人類NME7-A域之序列對比.(C)顯示鹽單胞菌屬953細菌性NME與人類NME7-B域之序列對比。
圖51為與後期經誘導幹細胞相比，最早期初始人類幹細胞中之轉錄因子BRD4及輔因子JMJD6之表現量之RT-PCR量測值之圖。
圖52顯示在含有二聚體形式之人類NME1的無血清培養基中培養18日之後的人類纖維母細胞之4×放大率相片。
圖53顯示在含有二聚體形式之人類NME1的無血清培養基中培養18
日之後的人類纖維母細胞之20×放大率相片。
圖54顯示在含有來自鹽單胞菌屬593之細菌性NME的無血清培養基中培養18日之後的人類纖維母細胞之4×放大率相片。
圖55顯示在含有來自鹽單胞菌屬593之細菌性NME的無血清培養基中培養18日之後的人類纖維母細胞之20×放大率相片。
圖56顯示在含有人類NME7-AB的無血清培養基中培養18日之後的人類纖維母細胞之4×放大率相片。
圖57顯示在含有人類NME7-AB的無血清培養基中培養18日之後的人類纖維母細胞之20×放大率相片。
圖58顯示在無NME蛋白的標準培養基中培養18日之後的人類纖維母細胞之4×放大率相片。
圖59顯示在無NME蛋白的標準培養基中培養18日之後的人類纖維母細胞之20×放大率相片。
圖60為由本文所述之實驗之分析產生的NME7及相關因子之相互作用圖之草圖。
圖61列舉與NME1具有低序列一致性的來自人類NME7之免疫原性肽。所列肽序列鑑別為產生以人類NME7而非人類NME1為標靶之抗體的免疫原性肽。序列由於其缺乏與人類NME1之序列同源性而被選擇，且用作產生抑制NME7以治療或預防癌症之抗體的NME7特異性肽。
圖62列舉對於結構完整性或對於結合至MUC1*可能重要的來自人類NME7之免疫原性肽。較佳為二價及雙特異性抗體，其中各可變區結合至NME7之不同肽部分。該等肽可藉由使用一種以上肽產生對二者均具特異性
之抗體而產生。該等肽適用作產生抑制NME7以治療或預防癌症之抗體的NME7特異性肽。
圖63列舉對於結構完整性或對於結合至MUC1*可能重要的來自人類NME1之免疫原性肽。所列肽序列來自人類NME1且由於其與人類NME7之高同源性以及由於其與能夠模擬其功能之其他細菌性NME蛋白之同源性而被選擇。特定言之，肽50至53與人類NME7-A或-B以及HSP 593具有高同源性。
定義
如本文所用，「MUC1*」細胞外域主要藉由PSMGFR序列(GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(SEQ ID NO：6))定義。由於MUC1裂解之精確位點取決於截割其之酶，且裂解酶取決於細胞類型、組織類型或細胞演化時間而變化，MUC1*細胞外域之精確序列可在N-端變化。
如本文所用，術語「PSMGFR」為闡述為GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(SEQ ID NO：6)之MUC1生長因子受體之一級序列的縮寫字。就此而言，如在「N-10 PSMGFR」、「N-15 PSMGFR」或「N-20 PSMGFR」中之「N-數目」係指已於PSMGFR之N端缺失之胺基酸殘基數目。同樣，如在「C-10 PSMGFR」、「C-15 PSMGFR」或「C-20 PSMGFR」中之「C-數目」係指已於PSMGFR之C端缺失之胺基酸殘基數目。
如本文所用，「MUC1*之細胞外域」係指缺少串聯重複域之MUC1蛋白
之細胞外部分。在大多數情況下，MUC1*為一種裂解產物，其中MUC1*部分由缺少串聯重複之短細胞外域、跨膜域及細胞質尾區組成。MUC1裂解之精確定位尚未知曉，可能由於似乎其可藉由一種以上的酶裂解。MUC1*之細胞外域將包括大部分PSMGFR序列，但可具有額外10-20種N端胺基酸。
如本文所用，編號為1-10之「NME家族蛋白」或「NME家族成員蛋白」為由於其全部具有至少一個NDPK(核苷酸二磷酸酯激酶)域而分組在一起的蛋白。在某些情況下，就能夠催化ATP轉化為ADP而言，NDPK域不為官能性的。NME蛋白被正式稱為NM23蛋白，編號H1、H2等。在本文中，術語NM23及NME為可互換的。在本文中，術語NME1、NME2、NME6及NME7用於指天然蛋白以及NME變異體。在某些情況下，此等變異體在大腸桿菌中更可溶、表現更佳或比天然序列蛋白更可溶。舉例而言，用於本說明書中之NME7可意謂天然蛋白或變異體，諸如NME7-AB，其由於變異允許在大腸桿菌中可溶、恰當摺疊之蛋白之高產表現而具有優良商業適用性。如本文中所提及之「NME1」可與「NM23-H1」互換。亦預期本發明不受限於NME蛋白之精確序列。突變體NME1-S120G，亦稱作NM23-S120G，在整個本申請案中可互換使用。S120G突變體及P96S突變體由於其偏好二聚體形成而為較佳的，但可在本文中被稱作NM23二聚體或NME1二聚體。
如本文中所提及之NME7欲意謂具有約42kDa之分子量的天然NME7、具有25與33kDa之間的分子量之裂解形式、缺少DM10前導序列之變異體、NME7-AB或重組NME7蛋白或序列可經改變以容許有效表現或增加產率、溶解度或使NME7更有效或在商業上更有活力之其他特徵的其
變異體。
如本文所用，「使幹細胞維持初始狀態或使經誘導幹細胞恢復至初始狀態下之藥劑」係指單獨或以組合形式使幹細胞維持初始狀態之蛋白、小分子或核酸，類似於胚胎之內細胞團之細胞。實例包括(但不限於)人類或細菌性的NME1二聚體、NME7、NME7-AB、2i、5i、核酸，諸如抑制MBD3、CHD4、BRD4或JMJD6之表現的siRNA。
如本文所用，關於稱為「小分子」之藥劑，其可為具有50Da與2000Da之間、更佳150Da與1000Da之間、更佳200Da與750Da之間的分子量之合成化學物質或基於化學之分子。
如本文所用，關於稱為「自然產物」之藥劑，其可為化學分子或生物分子，只要該分子在自然界中存在。
如本文所用，「2i抑制劑」係指MAP激酶傳信路徑之GSK3-β及MEK之小分子抑制劑。名稱2i創造於研究論文(Silva J等人2008)中，然而，在本文中，「2i」係指GSK3-β或MEK之任何抑制劑，因為存在多種若小分子或生物製劑抑制此等標靶，則對多能性或腫瘤形成具有相同作用之小分子或生物製劑。
如本文所用，FGF、FGF-2或bFGF係指纖維母細胞生長因子。
如本文所用，「ρ相關激酶抑制劑」可為小分子、肽或蛋白(Rath N，等人，2012)。ρ激酶抑制劑在本文中及他處縮寫為ROCi或ROCKi或Ri。使用特定ρ激酶抑制劑意欲為例示性的且可以任何其他ρ激酶抑制劑取代。
如本文所用，術語「癌症幹細胞」或「腫瘤起始細胞」係指表現已與更具轉移性狀態或更具侵襲性癌症有關之基因之含量的癌細胞。術語「癌
症幹細胞」或「腫瘤起始細胞」亦可係指當移植至動物中時，需要少得多的細胞以產生腫瘤之癌細胞。癌症幹細胞及腫瘤起始細胞通常對化學治療藥物具抗性。
如本文所用，術語「幹細胞/癌症」、「癌樣」、「幹樣」係指細胞獲得幹細胞或癌細胞之特徵、共用幹細胞、癌細胞或癌症幹細胞之基因表現特徵之重要要素的狀態。幹樣細胞可為經歷誘導至較不成熟狀態，諸如增加多能性基因之表現之體細胞。幹樣細胞亦指已經歷一些去分化或處於介穩定狀態下之細胞，該等細胞可自該狀態改變其終末分化。癌樣細胞可為尚未完全表徵但顯示癌細胞之形態及特徵，諸如能夠錨定非依賴性生長或能夠於動物中產生腫瘤之癌細胞。
序列表非關鍵詞文字
關於使用除a、g、c、t以外的核苷酸符號，其遵循WIPO標準ST.25，附錄2，表1中闡述之慣例，其中k表示t或g；n表示a、c、t或g；m表示a或c；r表示a或g；s表示c或g；w表示a或t且y表示c或t。
ASANL(SEQ ID NO：1)描述全長MUC1受體(黏蛋白1前驅體，基因銀行寄存編號：P15941)。
MTPGTQSPFFLLLLLTVLT(SEQ ID NO：2)
MTPGTQSPFFLLLLLTVLT VVTA(SEQ ID NO：3)
MTPGTQSPFFLLLLLTVLT VVTG(SEQ ID NO：4)
SEQ ID NO：2、3及4描述用於將MUC1受體及截短同功異型物導引至細胞膜表面之N端MUC-1傳信序列。如SEQ ID NO：2、3及4中之變異體所指示，可在C端不存在至多3個胺基酸殘基。
(SEQ ID
NO：5)描述一種在其N-端具有nat-PSMGFR且包括全長MUC1受體之跨膜及細胞質序列之截短MUC1受體同功異構物。
GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(SEQ ID NO：6)描述MUC1生長因子受體之天然一級序列(nat-PSMGFR-「PSMGFR」之實例)之細胞外域。
TINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(SEQ ID NO：7)描述在SEQ ID NO：6之N-端具有單一胺基酸缺失的MUC1生長因子受體之天然一級序列(nat-PSMGFR-「PSMGFR」之實例)之細胞外域。
GTINVHDVETQFNQYKTEAASPYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(SEQ ID NO：8)描述具有增強的穩定性之MUC1生長因子受體之天然一級序列之「SPY」功能變異體(var-PSMGFR-「PSMGFR」之實例)之細胞外域。
TINVHDVETQFNQYKTEAASPYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(SEQ ID NO：9)描述在SEQ ID NO：8之C-端具有單一胺基酸缺失的具有增強的穩定性之MUC1生長因子受體之天然一級序列之「SPY」功能變異體(var-PSMGFR-「PSMGFR」之實例)之細胞外域。
(SEQ ID NO：10)描
述MUC1細胞質域核苷酸序列。
(SEQ ID NO：11)描述MUC1細胞質域胺
基酸序列。
(SEQ ID NO：12)描述NME7核苷酸序列(NME7：基因銀行寄
存號AB209049)。
(SEQ ID NO：13)描述NME7胺基酸序列
(NME7：基因銀行寄存號AB209049)。
(SEQ ID NO：14)描述
NM23-H1核苷酸序列(NM23-H1：基因銀行寄存號AF487339)。
(SEQ ID NO：15)NM23-H1描述胺基酸序
列(NM23-H1：基因銀行寄存號AF487339)。
(SEQ ID NO：16)描述
NM23-H1 S120G突變核苷酸序列(NM23-H1：基因銀行寄存號AF487339)。
(SEQ ID NO：17)描述NM23-H1 S120G突
變胺基酸序列(NM23-H1：基因銀行寄存號AF487339)。
(SEQ ID NO：18)
描述NM23-H2核苷酸序列(NM23-H2：基因銀行寄存號AK313448)。
(SEQ ID NO：19)描述NM23-H2胺基酸序列(NM23-H2：基因銀行寄存號AK313448)。
關於大腸桿菌表現最佳化之人類NM23-H7-2序列：(DNA)
(SEQ ID NO：20)
(胺基酸)
(SEQ ID NO：21)
人類NME7-A：
(DNA)
(SEQ ID
NO：22)
(胺基酸)
(SEQ ID NO：23)
人類NME7-A1：(DNA)
(SEQ ID NO：24)
(胺基酸)
(SEQ ID
NO：25)
人類NME7-A2：(DNA)
(SEQ ID NO：26)
(胺基酸)
(SEQ ID NO：27)
人類NME7-A3：(DNA)
(SEQ ID NO：28)
(胺基酸)
(SEQ ID NO：29)
人類NME7-B：(DNA)
(SEQ
ID NO：30)
(胺基酸)
(SEQ ID NO：31)
人類NME7-B1：(DNA)
(SEQ ID NO：32)
(胺基酸)
(SEQ ID
NO：33)
人類NME7-B2：(DNA)
(SEQ ID NO：34)
(胺基酸)
(SEQ ID NO：35)
人類NME7-B3：(DNA)
(SEQ ID NO：36)
(胺基酸)
(SEQ ID NO：37)
人類NME7-AB：
(DNA)
(SEQ ID NO：38)
(胺基酸)
(SEQ ID NO：39)
人類NME7-AB1：(DNA)
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(胺基酸)
(SEQ ID NO：41)
關於大腸桿菌表現最佳化之人類NME7-A序列：(DNA)
(SEQ
ID NO：42)
(胺基酸)
(SEQ ID NO：43)
關於大腸桿菌表現最佳化之人類NME7-A1序列：(DNA)
(SEQ ID NO：44)
(胺基酸)
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NO：45)
關於大腸桿菌表現最佳化之人類NME7-A2序列：(DNA)
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(胺基酸)
(SEQ ID NO：47)
關於大腸桿菌表現最佳化之人類NME7-A3序列：(DNA)
(SEQ ID NO：48)
(胺基酸)
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關於大腸桿菌表現最佳化之人類NME7-B序列：(DNA)
(SEQ ID NO：50)
(胺基酸)
(SEQ ID NO：51)
關於大腸桿菌表現最佳化之人類NME7-B1序列：(DNA)
(SEQ ID NO：52)
(胺基酸)
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關於大腸桿菌表現最佳化之人類NME7-B2序列：(DNA)
(SEQ ID NO：54)
(胺基酸)
(SEQ ID NO：55)
關於大腸桿菌表現最佳化之人類NME7-B3序列：(DNA)
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(胺基酸)
(SEQ ID NO：57)
關於大腸桿菌表現最佳化之人類NME7-AB序列：(DNA)
(SEQ ID NO：58)
(胺基酸)
(SEQ ID NO：59)
關於大腸桿菌表現最佳化之人類NME7-AB1序列：(DNA)
(SEQ ID NO：60)
(胺基酸)
(SEQ ID NO：61)
小鼠NME6
(DNA)
(SEQ ID NO：62)
(胺基酸)
(SEQ ID NO：63)
人類NME6：(DNA)
(SEQ ID NO：64)
(胺基酸)
(SEQ ID NO：65)
人類NME6 1：(DNA)
(SEQ ID NO：66)
(胺基酸)
(SEQ ID NO：67)
人類NME6 2：(DNA)
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NO：68)
(胺基酸)
(SEQ ID NO：69)
人類NME6 3：(DNA)
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(胺基酸)
(SEQ ID NO：71)
關於大腸桿菌表現最佳化之人類NME6序列：(DNA)
(SEQ ID NO：72)
(胺基酸)
(SEQ ID NO：73)
關於大腸桿菌表現最佳化之人類NME6 1序列：(DNA)
(SEQ ID NO：74)
(胺基酸)
(SEQ ID NO：75)
關於大腸桿菌表現最佳化之人類NME6 2序列：(DNA)
(SEQ ID NO：76)
(胺基酸)
(SEQ ID NO：77)
關於大腸桿菌表現最佳化之人類NME6 3序列：(DNA)
(SEQ ID NO：78)
(胺基酸)
(SEQ ID NO：79)
OriGene-NME7-1全長
(DNA)
(SEQ ID NO：80)
(胺基酸)
(SEQ ID
NO：81)
Abnova NME7-1全長
(胺基酸)
(SEQ ID NO：82)
Abnova Partial NME7-B
(胺基酸)
(SEQ ID NO：83)
組胺酸標籤(ctcgag)caccaccaccaccaccactga(SEQ ID NO：84)
Strept II標籤(accggt)tggagccatcctcagttcgaaaagtaatga(SEQ ID NO：85)
N-10肽：QFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPESAQSGA(SEQ ID NO：86)
C-10肽GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDV(SEQ ID NO：87)
藉由允許小鼠中之人類移植癌細胞接觸NME7或NME7-AB使小鼠對針對癌細胞之藥物測試之反應更如同人類
NME家族成員蛋白可起促進癌症之作用。傳統地用於藥物發現中之小鼠、嚙齒動物及其他動物在其對測試功效或毒性之藥物之反應中並不精確地模擬人類。若干『糟糕藥物』已成為關於在人類中引起嚴重不良反應(包括死亡)之訴訟的主題，而相同藥物在小鼠中未顯示毒性。小鼠中之作用與人類中之作用之間不一致的一個原因為與人類相比，小鼠中之疾病之分
子機制以及健康功能不同。
吾人已發現人類幹細胞及人類癌細胞藉由相同機制生長。癌細胞及多能性幹細胞二者均過度表現作為強力生長因子受體之MUC1*(Mahanta S等人2008)。二聚形式的MUC1*之配位體NM23-H1(亦稱作NME1)單獨就足以使得人類幹細胞在多能性狀態下生長而無需飼養細胞、條件培養基或任何其他生長因子或細胞激素(Hikita S等人2008)。吾人先前顯示NM23-H1二聚體為MUC1*生長因子受體之配位體，其中MUC1*為在大部分細胞外域已裂解及自細胞表面脫落之後剩餘的跨膜部分。細胞外域之剩餘部分主要由PSMGFR序列組成。NM23二聚體結合至MUC1*受體且使其二聚化。使用合成PSMGFR肽對NME-MUC1*相互作用進行競爭性抑制誘發多能性幹細胞之分化，由此顯示多能性幹細胞生長藉由NM23二聚體與MUC1*生長因子受體之間的相互作用介導。類似地，較大比例之癌症藉由幾乎相同的機制生長。在超過75%的所有人類癌症中，MUC1裂解為MUC1*形式。如同人類幹細胞，人類癌細胞分泌NM23，其中在二聚化之後，其結合至MUC1*受體且刺激人類癌細胞之生長。藉由添加PSMGFR肽或藉由添加抗MUC1*(抗PSMGFR)抗體之Fab來競爭性抑制相互作用引起試管內及活體內人類腫瘤細胞生長之極大減少。
吾人發現NME家族之新生長因子NME7，其在不存在FGF或任何其他生長因子之情況下使人類幹細胞生長且抑制其分化。據報導，NME7僅在胚胎中表現，但不在除睪丸外之任何成人組織中表現。出人意料地，吾人發現多種人類癌症(尤其為侵襲性癌症)表現NME7且以已經歷轉譯後裂解之活化形式分泌該NME7以產生以約33kDa之表觀分子量出現之NME7物
質。此與具有約42kDa之計算分子量且似乎侷限於細胞質之全長NME7形成對比。分泌之NME7充當人類幹細胞及人類癌症之生長因子。如同NM23二聚體，NME7結合至MUC1*生長因子受體且使其二聚化；然而，NME7以單體形式實現此舉，因為其具有兩個用於MUC1*之細胞外域的結合位點。因此，人類幹細胞及人類癌症藉助於相同生長因子生長：二聚體形式的NM23(亦稱作NME1)或NME7。
NME蛋白促進胚胎及iPS細胞之生長及多能性以及誘導細胞恢復為幹樣狀態。由於幹樣狀態及癌性狀態之許多基因特徵現為共用的(Kumar SM等人2012,Liu K等人2013,Yeo JC等人2014,Oshima N等人2014,Wang ML等人2013)，吾人得出NME家族成員蛋白亦能夠誘發癌性狀態之結論。在一較佳具體實例中，NME家族成員蛋白為與NME1具有大於30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或97%序列一致性之NME1或NME蛋白，其中該蛋白為二聚體。在一更佳具體實例中，NME家族成員蛋白為與NME7域A或B中之至少一者具有大於30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或97%序列一致性且能夠使MUC1*生長因子受體二聚化之NME7或NME蛋白。
本文中，吾人報導二聚體形式之NME1、二聚體形式之細菌性NME1、NME7或NME7-AB能夠：a)完全支撐人類ES或iPS生長及多能性，同時抑制分化；b)將體細胞恢復至更幹樣或癌樣狀態；及c)將癌細胞轉化至高度轉移性癌症幹細胞狀態，亦稱為腫瘤起始細胞。
吾人製得重組人類NM23(亦稱作NME1)二聚體，其攜有使二聚體穩
定之S120G突變體。吾人先前報導人類NME1二聚體結合至MUC1*受體之細胞外域之PSMGFR部分(Smagghe等人2013)。吾人亦製得以單體形式分泌之重組人類NME7-AB。圖47顯示NME7-AB單體結合至MUC1*受體之細胞外域之PSMGFR部分且使其二聚化。吾人製得與人類NME1具有高序列同源性且據報導以二聚體狀態存在的發現於鹽單胞菌屬(Halomonas Sp.)593(『HSP593』)及牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonasgingivalis)W83中之重組細菌NME蛋白(圖48及圖49)。HSP 593在大腸桿菌中較佳地表現且很大一部分以二聚體形式存在，該群體隨後藉由FPLC純化且確認為二聚體群體(圖48a)。進行直接結合實驗，其顯示來自鹽單胞菌屬593之細菌NME結合於MUC1*細胞外域之PSMGFR肽，圖48b。HSP 593與人類NME1或人類NME7域A或B之間的序列比對顯示結合於MUC1*細胞外域之細菌NME與人類NME1及人類NME7-A具有40%-41%一致性，且與NME7-B具有34%一致性，圖50 A-C。
進行額外實驗，其顯示與人類NME1或NME7具有大於30%或更佳40%一致性之細菌性NME與促進癌症及幹細胞生長及存活之人類NME起相同作用。多種與人類NME具有此高序列一致性之細菌性NME據報導與人類癌症有關。本文中，吾人報導與人類NME具有高序列一致性之細菌性NME蛋白能夠與人類NME起相同作用以促進癌症生長及促進癌細胞轉化為癌症幹細胞或更具轉移性之癌細胞。相對於人類NME1及NME7在功能分析中測試細菌性NME。
然而，已知小鼠幹細胞藉由與人類幹細胞不同之機制生長。小鼠LIF，白血病起始因子可完全支撐小鼠幹細胞生長，儘管LIF對人類幹細胞生長
無作用。用於人類幹細胞培養物中之主生長因子為bFGF(Xu C等人2005)或鹼性纖維母細胞生長因子。bFGF無法支撐小鼠幹細胞生長。此顯示小鼠幹細胞生長之基礎生物學極不同於人類幹細胞生長之基礎生物學。當考慮在小鼠中測試癌症藥物時，此事實變得極重要。
在小鼠及其他動物中測試癌症藥物之當前實務為將人類癌細胞注射至動物中且緊接著移植或在移植之後數日或數週用測試藥物對動物進行注射。然而，此方法為基本上有缺陷的，因為宿主並不自然地產生人類癌細胞需要生長或移植之生長因子。另外，由於宿主並不產生生長因子或相同含量之生長因子或人類形式之生長因子，動物中測試之藥物將不具有與其將在人類中所具有的相同作用。小鼠NME7僅與人類NME7具有84%同源性且在成人中不表現。因此，用於抗癌藥物測試之當前異種移植方法通常在預測人類對彼等藥物之反應中達不到要求。可藉由將NM23二聚體或NME7引入至小鼠中以使得人類腫瘤細胞具有供養腫瘤之其同源生長因子而解決此問題。可藉由多種方法將NM23二聚體或NME7引入至動物中。其可在植入之前與腫瘤細胞混合，或其可注射至攜有腫瘤之動物中。
在一較佳具體實例中，產生表現人類NME7或其片段之轉殖基因動物。可在誘導型啟動子上攜帶NME7以使得可自然地產生動物，但可在植入人類腫瘤期間或在評定藥物功效或毒性中開啟NME7或NME7片段之表現。在一較佳具體實例中，引入至測試動物中之NME7物種為NME7-AB。
或者，可製得一種轉殖基因動物，其中該動物表現人類MUC1、MUC1*、NME7及/或NM23-H1或-H2、偏好二聚體形成之H1或H2之變異體、形成二聚體之單鏈構築體或其他變異體。由於NME蛋白及MUC1為人體中之反
饋迴路之部分，其中表現一者可引起另一者之上調，其可對產生表現人類NME蛋白及MUC1或裂解形式MUC1*之轉殖基因動物有利。天然或工程改造NME物種可藉由包括以下之多種方法中之任一者引入至動物，諸如小鼠中：產生轉殖基因動物、用天然或重組NME蛋白或NME蛋白之變異體對動物進行注射，其中NME1(NM23-H1)、NME6及NME7蛋白或變異體較佳且能夠使MUC1*二聚化之NME NME1(NM23-H1)、NME6及NME7蛋白或變異體，特定言之PSMGFR肽尤佳。在一較佳具體實例中，NME物種為具有約33kDa之分子量之NME7之截短形式。在一更佳具體實例中，NME7物種缺少其N-端之DM10域。在一更佳具體實例中，NME7物種為人類。
NME家族蛋白，尤其為NME1、NME6及NME7表現於人類癌症中，其中其充當促進人類癌症之生長及癌轉移之生長因子。因此，應存在人類NME蛋白或NME蛋白之活性形式以便人類癌症恰當生長、演化及評定及判定其對於化合物、生物製劑或藥物之反應。
NME7之存在增加人類癌細胞於非人類動物中之移植率
測試人類癌症及藥物以在嚙齒動物及其他動物中對其進行處理之另一問題為多種人類癌症不易於在宿主動物中移植。多種常規地用於試管內測試之癌細胞系僅具有對於可靠的動物研究太低之移植率。舉例而言，T47D乳癌細胞系由於其過度表現致癌基因MUC1而典型地用於試管內研究。然而，T47D細胞由於其不佳移植率而偶爾用於小鼠異種移植研究中。
如同多種人類癌症，T47D細胞表現及分泌NME1及NME7。在驗證攜有人類腫瘤之動物中之試管內結果時出現的問題為T47D移植至小鼠中之速率通常在25%至35%之間。其意謂吾人需要以比實驗所需多至少四倍之
小鼠開始且等待數週以鑑別移植腫瘤之彼等小鼠。更重要地，有問題的是移植率如此低且引發宿主不產生模擬人類之環境，且因此，藥物測試結果可能用途有限之擔憂。
藉由NME蛋白之存在極大增強將人類癌症移植至嚙齒動物及其他測試動物中，其中NME蛋白可為NME1、NME6或NME7。存在多種熟習此項技術者已知的用於將NME蛋白引入至測試動物中之方法。NME蛋白可注射至測試動物中或可產生表現NME蛋白之轉殖基因動物。在一些情況下，期望能夠控制NME蛋白之表現定時。在此等情況下，蛋白表現可與誘導型遺傳成分，諸如可調控啟動子有關。在一較佳具體實例中，引入至動物中以增加人類幹細胞或癌細胞之移植之NME蛋白為人類NME7。在一更佳具體實例中，NME7蛋白為約33kDa之片段。在一更佳具體實例中，NME蛋白為人類NME7-AB。
在小鼠研究中，注射人類NME7-AB之動物顯示人類腫瘤細胞之移植率之增加。藉由在植入動物中之前將癌細胞與NME7混合極大增強MUC1*陽性腫瘤細胞(T47D)之移植且藉由每日將NME7注射至攜有腫瘤之小鼠中進一步增強。在一個實驗中，當腫瘤在植入之前與NME7混合時，第7天直至第21天之平均生長增加為144%，且在不混合之情況下為57%(參見圖1a)。在相同研究中，單獨在植入之前將癌細胞與NME7混合，或加上在細胞植入之後將NME7注射至動物中。結果顯示移植率分別為33%及66%，圖1b。圖2顯示個別小鼠中之人類腫瘤細胞生長之圖。圖(A)顯示與標準基質膠混合之T47D乳癌細胞生長之圖。六隻植入小鼠中僅兩隻顯示移植之腫瘤生長特徵。圖(B)顯示與基質膠及NME7混合之T47D乳癌細胞之生
長之圖。六隻植入小鼠中的四隻顯示移植之腫瘤生長特徵。虛線指示在第14天之後亦注射NME7之小鼠。在使用40隻免疫缺陷小鼠進行之另一研究中顯示在不與NME7預先混合及無NME7注射之情況下植入之癌細胞具有約25%之真實移植率。第7天至第24天之平均生長顯示22%之適度生長增加，但在腫瘤尺寸中具有減小趨勢。圖3顯示與標準基質膠混合且異種移植至四十隻免疫缺陷(nu/nu)小鼠中之T47D腫瘤細胞之圖。該圖顯示兩組相同的20隻小鼠之平均值，每一組之腫瘤體積具有22%之平均增加但具有向下趨勢。圖4顯示四十隻個別小鼠中之T47D人類乳房腫瘤細胞之生長之圖，約25%顯示腫瘤移植。圖5顯示與基質膠混合且異種移植至六隻NOD/SCID小鼠之側腹中之T47D乳癌細胞之生長之圖。圖(A)顯示平均腫瘤生長。圖(B)顯示個別小鼠中之腫瘤生長，其展現使用標準方法之六隻小鼠中僅一隻具有良好腫瘤移植。此等實例展示將人類癌細胞移植至宿主動物中之難度。
癌症幹細胞
與此相關的是，當前無用於評估化合物、生物製劑或藥物對『腫瘤起始細胞』(其亦稱作『癌症幹細胞』)之功效、毒性或劑量的實用方法。癌症幹細胞為具有起始腫瘤形成能力的腫瘤中之少數細胞。認為此等細胞為造成癌轉移之細胞，因為從腫瘤掙脫之單一細胞在理論上可引起遠端癌轉移。研究者亦已證明癌症幹細胞可逃脫化學治療之殺傷效應(Fessler S等人2009,LissaNurrul Abdullah及Edward Kai-Hua Chow 2013)。首先藉由特異性分子標記物，諸如CD44-高及CD24-低之存在鑑別癌症幹細胞。最近，受體CXCR4已鑑別為在癌症幹細胞及轉移性癌細胞中之表現較高的轉移性受
體。現存在一組被認作癌症幹細胞之標記物之基因(Miki J等人2007,Jeter CR等人2011,Hong X等人2012,Faber A等人2013,Mukherjee D等人2013,Herreros-Villanueva M等人，2013,Sefah K等人，2013；Su H-T等人2013)。
若極小量之細胞能夠在動物中產生腫瘤，則將實驗視為癌症幹細胞之決定性證明。儘管將腫瘤移植至nu/nu小鼠之側腹中所需的典型癌細胞數目為4,000,000至6,000,000，但癌症幹細胞能夠自少至大約100細胞起始腫瘤形成，儘管在大部分公開之報導中，此等癌症幹細胞植入乳房脂肪墊中且需要數月來發展。儘管存在鑑別癌症幹細胞之方法，但迄今為止，尚無證據證明有可能將癌細胞暴露於使其轉變為癌症幹細胞之一或多種藥劑。因此，當前無測試化合物、生物製劑或藥物抑制此等轉移性癌症幹細胞之能力的實用方法。目前先進技術之巨大改良將為產生一種影響常規癌細胞快速變為癌症幹細胞之方法以使得除原始癌細胞以外，轉移性癌症幹細胞亦可經篩選以鑑別將對其進行抑制之治療。以此方式，可用抑制原發癌之藥物，以及用將抑制可在癌症幹細胞轉移之後數年殺死患者之癌症幹細胞之亞群的藥物治療患者。
能夠使經誘導幹細胞恢復至初始狀態(Nichols J,Smith A 2009,Hanna J等人2010,Smagghe B等人2013)或能夠將初始幹細胞維持初始狀態下之藥劑亦能夠將癌細胞轉化為更具轉移性狀態，有時亦稱為癌症幹細胞或腫瘤起始細胞。舉例而言，NME蛋白能夠使幹細胞維持初始狀態且能夠使經誘導狀態幹細胞恢復至初始狀態。特定言之，二聚形式之NME1及NME6或單體形式的NME7能夠使幹細胞維持初始狀態且亦能夠將癌細胞轉化至更具侵襲性或轉移性之狀態。NME7將癌細胞轉化為癌症幹細胞。
NME1及NME7具有將癌細胞轉化至更具轉移性之癌症幹細胞狀態，亦稱作腫瘤起始細胞之能力。以人類NME7-AB或人類NME1二聚體(圖中之『NM23』)作為唯一生長因子或細胞激素在無血清基本培養基中培養一組癌細胞。在此培養基中數日之後，細胞開始在表面浮起且繼續在溶液中生長。收集『漂浮物』且分別藉由PCR進行分析。用ρ激酶抑制劑(圖中之『Ri』)處理其他孔中之細胞。定量PCR量測顯示癌症幹細胞標記物之增加，其中一些在過去慣常地僅被認作幹細胞標記物。
其他人已報導稱作『2i』(Silva J等人2008)及『5i』(Theunissen TW等人2014)之抑制劑能夠使幹細胞維持初始狀態。吾人推論其亦將能夠將癌細胞轉化為癌症幹細胞或轉移性狀態。吾人之實驗展示此為如此的。以人類重組NME7-AB處理癌細胞7-10日顯著增加癌症幹細胞之標記物之表現。類似地，NME1二聚體、細菌性NME1二聚體中或用『2i』抑制劑或『5i』抑制劑處理之培養物使得癌細胞轉化成癌症幹細胞。2i係指MAP激酶路徑之抑制劑及GSK3抑制劑，諸如PD0325901及CHIR99021。在某些情況下，癌轉移受體CXCR4之表現極大增加，癌症幹細胞之其他標記物，諸如E-鈣黏蛋白、Oct4及Nanog同樣如此。人類NME7-AB中培養之癌細胞之CXCR4表現增加幾乎200倍。另外，在暴露於使人類經誘導幹細胞恢復至初始狀態之NME1二聚體、NME7、細菌性NME1二聚體或抑制劑之後，癌細胞之形態改變。通常黏附之NME處理之細胞在表面浮起且在懸浮液中生長。分析顯示保持黏附之細胞在癌症幹細胞之標記物之表現中增加較少。
在一個實驗中，MUC1陽性T47D乳癌細胞培養於正常RPMI生長培養基或無血清基本培養基中，向其中添加重組人類NME7-AB作為單一生長因
子。一部分彼等細胞變得非黏附且在表面浮起且進行收集，同時『+Ri』係指添加至培養基以使得所有細胞將保持附著於表面，因此給出黏附及非黏附細胞之平均讀數之ρ激酶抑制劑。圖6顯示據報導在所得細胞中之一些癌症幹細胞或轉移性癌症細胞中過度表現之一組基因之表現之RT-PCR量測值之圖。如該圖中所顯示，轉移性受體CXCR4之表現幾乎為正常生長培養基中培養之T47D細胞之表現量的200倍。均與癌症進展有關之CDH1(亦稱作E-鈣黏蛋白)及MUC1二者均提高約10倍(Hugo HJ等人2011)。亦報導為癌細胞之標記物之幹細胞標記物亦經提高。OCT4及SOX2分別提高約50倍及200倍。其他幹細胞標記物，諸如NANOG、KLF2、KLF4及TBX3顯示適度表現增加。如同NME7，NME1二聚體(亦稱作NM23)可完全支撐幹細胞生長及使幹細胞維持初始狀態。此處，吾人顯示NME1二聚體亦將癌細胞轉化為更具轉移性、癌症幹細胞狀態。圖7顯示在正常RPMI生長培養基或無血清基本培養基中培養之T47D乳癌細胞之RT-PCR量測值之圖，向該培養基中添加人類重組NM23(亦稱作NME1)二聚體或NME7-AB作為單一生長因子。『漂浮物』係指變得非黏附且經收集之彼等細胞，而『+Ri』係指添加至一些細胞以使其黏附至表面之ρ激酶抑制劑。如該圖中可見，NME1二聚體或NME7-AB中培養之癌細胞在CXCR4、SOX2及OCT4之表現中具有顯著增加，接著為CDH1(亦稱作E-鈣黏蛋白)、MUC1及NANOG之表現之增加。幹細胞標記物KLF2及KLF4之表現存在適度增加。
類似地，細菌HSP593表現形成二聚體且可完全支撐幹細胞生長，同時抑制分化之NME1。此外，其可將初始幹細胞維持初始狀態下。此處，吾人顯示細菌性NME1亦將癌細胞轉化至癌症幹細胞狀態，參見圖8。添加至
T47D，MUC1陽性乳癌細胞之重組HSP593細菌性NME1亦引起細胞形態改變且亦使得細胞變為非黏附。圖8顯示在CXCR4、NANOG及OCT4之表現中顯示顯著增加，接著為SOX2之較少增加及CDH1(亦稱作E-鈣黏蛋白)之5倍增加之RT-PCR量測值之圖。在某些情況下，藉由將CXCR4受體之配位體CXCL12(Epstein RJ等人2004,Mü ller,A等人2001)添加至培養基增加具有CXCR4受體之高表現之癌症幹細胞之增殖。
其他人先前報導激酶抑制劑能夠使幹細胞自經誘導狀態恢復至初始狀態及將其維持初始狀態。已報導(Silva J等人，2008)2i抑制劑(其為MAP激酶傳信路徑之GSK3-β及MEK之小分子抑制劑)將小鼠經誘導幹細胞恢復至初始狀態。吾人疑惑此等抑制劑是否亦可將人類癌細胞恢復至癌症幹細胞狀態。此處，吾人報導2i抑制劑誘使癌細胞變得轉變為癌症幹細胞或更具轉移性狀態。本發明設想使得經誘導狀態下之人類幹細胞恢復至較不成熟的初始狀態之基因、蛋白、核酸或化學藥劑之任何組合亦可用於將癌細胞轉化為通常稱作癌症幹細胞或腫瘤起始細胞之更具轉移性狀態。
此處，吾人顯示此等『2i』抑制劑亦將癌細胞轉化為顯示轉移性狀態之標記物的癌症幹細胞狀態。圖9顯示添加至T47D乳癌細胞之2i增加癌轉移受體CXCR4以及其他幹細胞及癌症幹細胞標記物之表現。2i與NM23二聚體或2i加上NME7-AB之組合增加此等標記物之表現。然而，圖10顯示NME7-AB單獨產生具有癌症幹細胞標記物之較高表現量的癌細胞。
當用能夠使幹細胞自經誘導狀態恢復至較不成熟的初始狀態之藥劑，諸如NME1、NME6二聚體、NME7、2i或5i處理時，多種類型之癌細胞經歷過渡至更具轉移性狀態之此過渡。在一個具體實例中，添加此等藥劑中
之一者的常規癌症生長培養基或無血清培養基中培養的DU145前列腺癌細胞亦顯示幹細胞、癌症幹細胞及轉移性標記物，包括CDH1(亦稱作E-鈣黏蛋白，在轉移性前列腺癌中通常較高)之表現的增加。亦藉由人類NME1二聚體、細菌性NME1二聚體、NME7-AB或2i抑制劑如上文所述培養前列腺癌細胞。不同於T47D細胞，前列腺癌細胞未變得非黏附。因此，癌症幹細胞標記物之RT-PCR量測值低於T47D細胞之該等量測值，其可藉由其為轉化細胞及非轉化細胞之量度解釋。在乳癌細胞之情況下，吾人能夠藉由收集漂浮細胞分離完全轉化之癌症幹細胞，但在此處不能夠如此。在RPMI培養基(作為對照組)及添加重組人類NME1/NM23二聚體、細菌性HSP593二聚體或人類NME7-AB之基本培養基中培養DU145 MUC1陽性前列腺癌細胞。圖11a顯示在rhNME1二聚體或rhNME7-AB中培養10日產生癌症幹細胞之標記物之適度增加。OCT4、MUC1及CDH1/E-鈣黏蛋白增加約2至8倍。然而，在此等相同培養條件下連續繼代之後，癌症幹細胞標記物之表現增加變得更顯著。吾人推論連續繼代使細胞具有更多轉化時間，因為吾人不可快速收集漂浮細胞。圖11b顯示在rhNME7-AB、細菌性HSP593 NME1二聚體或rhNME1/NM23二聚體中9至10繼代之後，CDH1/E-鈣黏蛋白之表現通常比前列腺癌症中之表現分別增加9倍、8倍及6倍。NANOG及OCT4之表現亦顯著增加。
亦測試在能夠使幹細胞維持初始狀態下之藥劑中培養時，PC3 MUC1陰性前列腺癌細胞轉化為癌症幹細胞之能力。藉由人類NME1二聚體、細菌性NME1二聚體或NME7-AB如上文所述培養PC3細胞。如同DU145前列腺癌細胞，PC3細胞未變得非黏附。因此，癌症幹細胞標記物之RT-PCR
量測值可能較低，因為量測值將為轉化細胞及非轉化細胞之平均值。圖12a顯示在rhNME1/NM23二聚體或rhNME7-AB中繼代之後的基因子組之RT-PCR量測值。圖12a之圖顯示幹細胞標記物SOX2、OCT4及NANOG之表現的適度增加。培養基中之連續繼代不增加癌症幹細胞或幹細胞標記物之表現，相反地，其減少，如圖12b中所顯示。
已報導其他藥劑使幹細胞維持初始狀態或使經誘導幹細胞恢復至初始狀態。最近報導染色質重排因子MBD3及CHD4阻斷多能性誘導(Rais Y等人，2013)。舉例而言，顯示染色質重排因子MBD3及CHD4之siRNA抑制為將人類經誘導幹細胞恢復至初始狀態之方法的關鍵組分。轉錄因子BRD4及輔因子JMJD6據報導抑制NME7及上調NME1(Lui W等人，2013)。吾人發現此等因子在初始幹細胞中以比其在後期經誘導幹細胞中較低之含量表現，圖51。此結果支持吾人之以下假設：NME7為相比於NME1之較早表現幹細胞生長因子，因為前者無法以NME1之方式自身關閉或調節自我複製；作為二聚體，其活化幹細胞生長，但當細胞分泌更多且其形成六聚物時，六聚物並不結合MUC1*且誘發分化。
吾人觀測到此等四種基因：MBD3、CHD4、BRD4及JMJD6在2i、NME1二聚體或NME7中培養之癌細胞中天然受到抑制。圖13顯示一個該實驗之圖，其中記錄編碼正常RPMI生長培養基或無血清基本培養基(向其中添加『2i』或重組人類NME7-AB)中培養之MUC1陽性T47D乳癌細胞中之染色質重排因子BRD4、JMJD6、MBD3及CHD4之基因表現的RT-PCR量測值，其中『漂浮物』細胞為分析之細胞。如圖14中所顯示，2i及NME1二聚體或NME7之組合亦抑制BRD4、JMJD6、MBD3及CHD4。
能夠使幹細胞維持初始狀態之藥劑亦能夠將體細胞轉化為癌樣或幹細胞樣狀態。人類NME1二聚體或人類NME7能夠使體細胞恢復較不成熟狀態，表現幹細胞標記物及癌細胞標記物。與人類同系物一起測試來自HSP 593之細菌性NME以測定其是否可模擬人類同系物能夠將體細胞恢復癌樣狀態之功能。以HSP 593、人類NME1二聚體或人類NME7-AB作為唯一生長因子或細胞激素在無血清基本培養基中培養人類纖維母細胞。RT-PCR量測值顯示如同人類NME，細菌性NME1 HSP 593在第19天將體細胞恢復至OCT4陽性期。前已述及幹細胞及轉移性癌細胞可錨定非依賴性(anchorage-independent)地生長，吾人重複該實驗，但此次添加ρ激酶抑制劑至一組細胞以使細胞黏附於表面。當迫使漂浮細胞黏附於表面時，RT-PCR顯示實際上，幹細胞/癌症標記物OCT4增加7倍且幹細胞/癌症標記物Nanog增加高達12倍。由於纖維母細胞在人類或細菌性NME中培養時恢復，實驗像片顯示形態之顯著改變，圖52至圖59。將體細胞恢復至較不成熟狀態之效率的相對順序為NME7>NME1二聚體>NME1細菌。人類NME1或NME7或細菌性NME1中之人類纖維母細胞生長之RT-PCR量測值顯示NME蛋白抑制所有四種(BRD4、JMJD6、MBD3及CHD4)多能性阻斷劑。RT-PCR實驗之複合圖顯示增加多能性基因及減少多能性阻斷劑之相對效能為NME7>NME1>HSP 593 NME。然而，來自HSP 593之細菌性NME明顯上調人類NME7及NME1之表現。圖15顯示據報導在正常纖維母細胞生長培養基或無血清基本培養基(向其中添加人類重組NM23(亦稱作NME1)二聚體、NME7-AB或HSP593細菌性NME1二聚體)中培養的一些癌症幹細胞或轉移性癌細胞、體纖維母細胞『fbb』細胞中過度表現之基因的表現之
RT-PCR量測值之圖。『+ROCi』係指添加至一些細胞以使其黏附於表面之ρ激酶抑制劑。『-ROCi』不指漂浮物而指在不存在ρ激酶抑制劑之情況下保持黏附之細胞。圖16顯示編碼正常纖維母細胞生長培養基或無血清基本培養基(向其中添加人類重組NM23(亦稱作NME1)二聚體、NME7-AB或HSP593細菌性NME1二聚體)中培養之體纖維母細胞『fbb』細胞中之染色質重排因子BRD4、JMJD6、MBD3及CHD4之基因之表現的RT-PCR量測值之圖。『+ROCi』係指添加至一些細胞以使其黏附於表面之ρ激酶抑制劑。圖17顯示據報導在編碼正常纖維母細胞生長培養基或無血清基本培養基(向其中添加人類重組NM23(亦稱作NME1)二聚體、NME7-AB或HSP593細菌性NME1二聚體)中培養之體纖維母細胞『fbb』細胞中之染色質重排因子BRD4、JMJD6、MBD3及CHD4之一些癌症幹細胞或轉移性癌細胞及基因中過度表現之基因之表現的RT-PCR量測值之圖。『+ROCi』係指添加至一些細胞以使其黏附於表面之ρ激酶抑制劑。『-ROCi』係指變得非黏附且在表面浮起的細胞。
將癌細胞轉化至更具轉移性之癌症幹細胞狀態之藥劑減少多能性阻斷基因BRD4、JMJD6、MBD3及CHD4之表現。此等藥劑亦減少體細胞中之BRD4、JMJD6、MBD3及CHD4之表現。因此，NME1二聚體、NME7及細菌性NME1二聚體使得體細胞恢復較不成熟癌樣/幹細胞樣狀態。
能夠使幹細胞維持初始狀態下之因子亦能夠將細胞轉化至癌樣或幹樣狀態且亦能夠將癌細胞轉化至癌症幹細胞狀態或更具轉移性狀態。本文中，吾人已顯示能夠與人類NME1二聚體起相同作用，亦能夠與NME7或NME7-AB起相同作用之細菌性NME1之若干實例。然而，此等因子以極類
似方式起作用之主要實例為其促進幹細胞生長、抑制分化及將其維持初始狀態下之能力。吾人已展示人類NME1二聚體(亦稱作NM23-H1)、細菌性NME1及NME7-AB促進胚胎幹細胞生長及誘發多能性幹細胞、抑制其分化及將其維持初始狀態下，如藉由若干細胞供體為人類，則兩個X染色體均在活性狀態下之全局基因分析及藉由具有在宿主動物中形成畸胎瘤之能力證明。以HSP 593、人類NME1或NME7-二聚體或人類NME7-AB作為唯一生長因子或細胞激素在無血清基本培養基中培養人類HES-3胚胎幹細胞。正如人類NME1及NME7完全支持人類幹細胞生長，來自HSP 593之細菌性NME亦如此。圖18顯示已在重組人類NME1二聚體中連續培養之多能性人類胚胎幹細胞之相片。圖19顯示已在重組人類NME7-AB中培養十個或十個以上繼代之多能性人類胚胎幹細胞之相片。圖20顯示已在重組細菌性NME1中培養十個或十個以上繼代之多能性人類胚胎幹細胞之相片。
已在本文中呈現若干表明將細胞與一或多種能夠使幹細胞自經誘導狀態恢復至較不成熟的初始狀態之藥劑接觸亦能夠將多種細胞類型恢復至較不成熟狀態：體細胞至幹細胞或祖細胞或癌細胞至更具轉移性狀態，亦稱作癌症幹細胞狀態之實例。因此，本發明不意欲限於特定細胞類型或特定癌細胞類型。類似地，不預期本發明限於使用已顯示使幹細胞自經誘導狀態恢復至初始狀態的本文所揭示之藥劑之子組。
一種用於鑑別或測試治療癌症及轉移性癌症之藥劑之方法特定言之包含以下步驟：1)使癌細胞與能夠使幹細胞維持初始狀態下之實體接觸；2)使癌細胞與藥劑接觸；3)評估藥劑抑制癌細胞生長或轉移潛能之能力；4)
得出抑制癌細胞生長或轉移潛能之藥劑適合於治療具有癌症之患者之結論；及5)向患者投予該藥劑。藉由CXCR4、E-鈣黏蛋白、MUC1、NME1、NME7或幹細胞標記物OCT4、SOX2、NANOG、KLF2或KLF4之表現減少或MBD3、CHD4、BRD4或JMJD6之表現增加指示癌細胞轉移潛能之抑制。
或者，隨後將已在能夠使幹細胞維持初始狀態下之藥劑存在下培養之細胞移植至測試動物中。由於在就愛那個幹細胞維持初始狀態下之藥劑存在下培養之癌細胞變為癌症幹細胞且更具轉移性，其可以極低數目植入測試動物中。可隨後測試藥物及候選藥物之功效、毒性或建立植入以此方式產生之癌症幹細胞之動物中之給藥方案。
在一個實驗中，以人類重組NME7-AB培養T47D乳癌細胞7日。收集漂浮細胞且藉由RT-PCR進行分析，其顯示與癌症幹細胞關聯之基因之表現的增加。特定言之，癌轉移受體CXCR4(其為轉移潛能之關鍵指示物)之表現比親本細胞之表現高130倍。將此等細胞植入免疫缺陷，nu/nu雌性小鼠中。植入之細胞數目為50、100、1,000或10,000。前已述及通常需要4,000,000至6,000,000個細胞以獲得腫瘤移植，同時已知少至100個癌症幹細胞在免疫缺陷小鼠中產生腫瘤，儘管生長速率極緩慢，諸如腫瘤發展持續數月。
另外，一半小鼠每日注射重組人類NME7-AB。甚至對於僅植入50個細胞之組達成腫瘤移植。出人意料地，每日注射NME7之組具有增加之移植速率且該組中的一些動物亦形成多個腫瘤。換言之，每日注射NME7之組的癌症在約50日之後轉移且在遠離初始植入位點之位點產生多個腫瘤。在此特定實驗中，植入NME7誘發之癌症幹細胞之24隻小鼠中的67%產生腫瘤。然而，仔細看資料顯示僅50%之小鼠無循環的NME7形成之腫瘤，而
83%接受NME7之每日注射之小鼠形成腫瘤。在形成腫瘤的該83%中，80%產生癌轉移，因為其在實驗的約第50天具有多個腫瘤。圖21為在植入已在含有NME7、NME7-AB之重組形式之培養基中培養之癌細胞之後63日量測的腫瘤體積之圖。與每一資料點一起的編號係指小鼠追蹤編號且「M」表示具有多個腫瘤之動物。圖22為總腫瘤體積之圖，其中已將一隻小鼠中之所有腫瘤與轉移性癌症之體積添加在一起。圖23至圖46顯示在研究之第28天及第58天的各小鼠之相片，其用以顯示腫瘤生長之進展且在大多數情況下，其中小鼠每日注射NME7-AB以顯示癌轉移進展。在圖23至圖46中，深色箭頭指出初始癌細胞之注射位點且淺色箭頭指出在第28天與第63天之間產生的遠處轉移。
一般而言，動物本身不必注射使幹細胞恢復至初始狀態下之藥劑，諸如NME1二聚體、NME7-AB、2i、5i及其類似物。在替代方法中，可藉由注射、吸收或攝食向動物投予藥劑。
因此，一種用於將癌細胞轉化為癌症幹細胞之方法為在使經誘導幹細胞恢復至初始狀態下之NME1二聚體、NME7、細菌性NME1二聚體或抑制劑中培養癌細胞。在一較佳具體實例中，使經誘導幹細胞恢復至初始狀態下之藥劑為2i抑制劑或5i抑制劑。在一較佳具體實例中，NME7為人類NME7。在一更佳具體實例中，NME7為NME7-AB。隨後在此等癌症幹細胞上測試用於治療癌症或抑制癌症，尤其為轉移性癌症進展之藥物及候選藥物。另外，可分析藉由此等方法產生之癌症幹細胞以鑑別轉移性癌細胞之仍未知標記物，其隨後將為抗癌藥物之新穎標靶。
因此，一種評估化合物、生物製劑或藥物治療癌症或預防癌轉移或抑
制癌轉移之方法包含：1)藉由在含有可為人類或細菌性的NME1二聚體、NME7或其片段或NME7-AB、2i抑制劑或5i抑制劑之培養基中培養細胞將癌細胞轉化為更具轉移性癌細胞；2)將細胞與測試藥劑試管內接觸或將細胞植入動物中，隨後以測試藥劑治療動物；3)評估測試藥劑對腫瘤生長或癌轉移之作用；4)得出抑制腫瘤生長或轉移至遠端位點之測試藥劑為適合於治療診斷具有癌症之患者、具有癌症復發或轉移性癌症之患者或具有罹患癌症風險之患者之藥劑的結論。在一較佳具體實例中，測試動物經注射NME蛋白、2i或5i，或為表現人類NME或人類NME7或NME7-AB之轉殖基因動物。或者，動物為轉殖基因動物，其中藉由2i或5i抑制之激酶經抑制，或向測試動物投予抑制激酶之藥劑。
小鼠中之癌轉移
如上所述，低數目之癌細胞能夠在動物或注射NME7-AB之動物中轉移之癌細胞中起始腫瘤。然而，藉由產生表現人類NME7或NME7-AB之轉殖基因動物易於實現相同作用。在本發明之一個態樣中，動物為嚙齒動物。
表現人類NME7、人類NME1或偏好二聚化之突變體或細菌性NME、人類MUC1或MUC1*之轉殖基因小鼠將在藥物發現中具有極大用途，其用以活體內生長癌細胞及測試使作為抗癌疫苗成分的衍生自NME之肽免疫之作用及產生可在其發展器官中支持人類幹細胞生長以產生具有一些人類心臟組織之動物，諸如小鼠的動物及其類似者。鼠類NME蛋白顯著不同於人類NME蛋白，其對於人類癌症生長及人類幹細胞生長為所需的。因此，正常小鼠並不產生必需蛋白以支持人類癌細胞或人類幹細胞之生長。將自發形成腫瘤或對經測試或將較好地允許人類腫瘤移植之藥物之反應更如同人
類之小鼠或其他哺乳動物將為有利的。因此藉由使動物表現人類NME基因產生較好地支持人類癌細胞或人類幹細胞生長之轉殖基因動物。在一較佳具體實例中，人類NME基因為人類NME7。在一更佳具體實例中，人類NME基因為人類NME7-AB。使用多種方法產生轉殖基因動物。一般而言，將外來基因轉移至寄主動物之生殖細胞中。轉殖基因可整合至宿主動物之基因組中。一些轉殖基因整合方法使得位點特異性整合成為可能。一些位點特異性整合方法之優勢中之一者為其允許轉殖基因之表現受控於宿主動物中天然存在之基因之表現。產生轉殖基因動物之方法為熟習此項技術者已知。該等方法包括嵌入、基因剔除、CRISPR、TALENS及其類似方法。本發明設想使用任何使哺乳動物表現人類NME1、細菌性NME1、NME7或NME7-AB之方法。
在一較佳具體實例中，產生表現人類NME7或NME7-AB之轉殖基因動物。由於人類或細菌性NME1及NME7抑制幹細胞之分化，使用可控制轉殖基因動物中之NME蛋白，較佳NME7或NME7抗體之表現定時之技術可為有利的。在誘導型啟動子上具有人類NME7將為有利的，例如以在動物發展期間避免NME7表現之潛在問題。使外來基因之表現在宿主動物中可誘導之方法為熟習此項技術者已知。可使用此項技術中已知的用於控制轉殖基因之表現之多種方法中之任一者使NME7或NME7-AB之表現可誘導。
或者，可藉由可由哺乳動物自然地表現之另一基因之表現控制NME7之表現或表現定時。舉例而言，NME7或NME7變異體在某一組織，諸如心臟中表現可為所需的。NME7之基因隨後可操作地連接於在心臟中表現之蛋白，諸如MHC之表現。在此情況下，在表現MHC基因產品之時間及地點
關閉NME7之表現。類似地，吾人可能想要在前列腺中開啟或關閉人類NME1、NME6或NME7之表現以使得其表現之定位及定時受控於例如前列腺特異性蛋白之表現。類似地，人類NME6或NME7於非人類哺乳動物中之表現可受控於乳房組織中表現之基因。舉例而言，在轉殖基因小鼠中，自促乳素啟動子或類似基因表現人類NME6或人類NME7。以此方式，將可能以位點特異性方式誘導或抑制人類NME蛋白之表現。
異種移植人類腫瘤且亦注射人類NME7之動物發展轉移性癌症。因此，藉由製造表現人類NME7或更佳NME7-AB之轉殖基因動物產生用於發展癌轉移之動物模型。最佳地，NME7在允許動物恰當發展之誘導型啟動子上。或者，藉由製造表現人類NME或人類NME7或NME7-AB之轉殖基因動物製得轉移性動物模型，較佳嚙齒動物。或者，動物為轉殖基因動物，其中經由誘導型啟動子抑制藉由2i或5i抑制之激酶或向測試動物投予抑制激酶之藥劑。轉移性動物模型隨後用於研究癌症發展或進展之基本科學以及測試化合物、生物製劑、藥物及其類似物對癌症發展之作用。
因此，一種鑑別及選擇治療癌症及轉移性癌症之藥劑之方法特定言之包含以下步驟：1)產生表現NME或NME7之形式的轉殖基因動物；2)對動物植入人類癌細胞；3)以候選藥物治療動物以治療癌症或轉移性癌症；4)評估候選藥物對癌症尺寸或擴散之作用；及5)得出抑制測試動物中之癌症生長或擴散之候選藥物適合於治療人類中之癌症或轉移性癌症的結論。
藉由擴展患者癌細胞增殖時段以測試對候選藥物之反應的個性化藥物發現
使用極少已定癌細胞系進行幾乎所有的臨床前藥物測試及藥物選擇。
彼等細胞系來源於數十年以前存活及死亡之患者之腫瘤且已傳播數百萬代，使得所得測試細胞與供體之原始癌症具有極少相似性或無相似性且與新穎患者之癌症具有更少相似性。因此，能夠使用待治療之患者之細胞作為測試細胞篩選藥物及建立劑量將極為有益。令人遺憾的是，難以(即使並非不可能)使來自患者之癌細胞在培養皿中生長且更難以在動物中傳播患者細胞。此係由於人類細胞不同於小鼠細胞，在其開始衰老之前僅可在培養物中分裂極有限次數。研究者現今使用之癌細胞系為自單一轉移性癌症患者之肋膜積液分離之天然不朽化癌細胞或藉由融合至不朽化細胞系或藉由以不朽化基因轉染癌細胞誘發為變得不朽化。後者方法顯著改變原始或原發癌細胞之分子特徵。
一種適用於傳播來自特定患者之癌細胞之方法為使用將癌細胞轉化為癌症幹細胞之方法培養細胞。另一種方法為使用用於使經誘導幹細胞恢復至初始狀態之試劑及方法培養患者細胞。所得癌症幹細胞更健康、存活較長時段且傳播較長時段。如以上部分中所述，患者癌細胞可藉由在可為人類或細菌性的NME1二聚體、NME7或其片段或NME7-AB、2i抑制劑或5i抑制劑中培養其來傳播。所得癌細胞可分成兩部分：黏附於表面之彼等癌細胞及在表面浮起之彼等癌細胞。黏附細胞將緊密地類似於原始腫瘤細胞而漂浮之彼等細胞將為癌症幹細胞且將看起來像患者可在未來或回應於以化學治療藥物之治療而發展之轉移性癌細胞。此等患者細胞隨後用於鑑別及選擇將有效抑制該特定患者之癌症的藥物及候選藥物以及鑑別將抑制由癌症幹細胞之存活造成的其癌症進展至轉移性狀態之藥物。在本發明之另
一態樣中，以此方式傳播的患者之癌細胞用於測定將有效抑制該特定患者之癌症之最佳藥物組合或用於確立一或多種藥物之劑量。
由於移植所需的細胞數量較小而將患者癌細胞移植至多個動物中以用於藥物測試的個性化藥物發現
前已述及已在可為人類或細菌性的NME1二聚體、NME7或其片段或NME7-AB、2i抑制劑或5i抑制劑中培養之癌細胞能夠以極低植入細胞數量於測試動物中起始腫瘤。使用此等方法培養之患者癌細胞隨後能夠在多個測試動物中形成腫瘤，因為每隻小鼠需要少至50或100個細胞而非數百萬個。起始腫瘤所需的細胞數量之減小隨後使得將患者之癌細胞植入測試動物中，其中一些動物可注射可為人類或細菌性的NME1二聚體、NME7或其片段或NME7-AB、2i抑制劑或5i抑制劑或可為如上文所述之轉殖基因動物，例如使得動物表現人類NME7或NME7-AB為可行的。
在一個具體實例中，對宿主動物注射候選藥物或化合物且評估功效以預測患者對用候選藥物或化合物之治療的反應。在另一實例中，向攜有恢復至較不成熟狀態的患者之癌細胞之動物投予正向患者投予或考慮用於治療患者之第一線治療或藥物。第一線治療可能影響癌細胞用於逃避第一線治療之突變。可隨後自宿主動物移除所得癌細胞及分析或表徵以鑑別回應於某些治療可能出現之突變。或者，癌細胞可保持於宿主動物中且隨後用其他治療劑治療宿主動物以測定抑制或殺死耐藥性細胞或癌症幹細胞之藥劑。
因此，一種用於鑑別抑制患者之癌症生長或擴散之適合之治療的本發明之方法包含以下步驟：1)自患者獲得癌細胞；2)在可為人類或細菌性
的NME1二聚體、NME7或其片段或NME7-AB、2i抑制劑或5i抑制劑存在下培養患者之癌細胞；3)將該等細胞與抑制癌症或癌轉移之測試藥劑接觸；4)評估化合物、生物製劑或藥物對患者之癌細胞之功效、毒性或劑量或評估測試藥劑對藉由細胞表現之癌症幹細胞標記物之含量的作用；及5)確定被稱為癌症幹細胞標記物的降低癌細胞活力或減少基因表現之測試藥劑為用於患者的適合之治療。
另一種用於鑑別抑制患者之癌症生長或擴散之適合之治療的本發明之方法包含以下步驟：1)自患者獲得癌細胞；2)在可為人類或細菌性的NME1二聚體、NME7或其片段或NME7-AB、2i抑制劑或5i抑制劑存在下培養患者之癌細胞；3)在測試動物中植入細胞，該測試動物亦可注射可為人類或細菌性的NME1二聚體、NME7或其片段或NME7-AB、2i抑制劑或5i抑制劑或為表現NME蛋白、NME7、NME7-AB或抑制2i或5i之標靶之表現的轉殖基因動物；4)向測試動物投予用於抑制癌症或癌轉移之測試藥劑；5)評估化合物、生物製劑或藥物之功效、毒性或劑量對患者之細胞移植於動物中之能力、腫瘤尺寸或癌轉移發展的影響；及6)確定減小移植率、腫瘤生長速率或癌轉移發展之測試藥劑為用於患者的適合之治療。
或者，可為了除供體以外的患者之利益使用使得能夠增殖或植入患者癌細胞的上文所述之方法。根據本發明之方法增殖或植入的患者癌細胞將更精確地類似於天然存在之癌症，因此可替代已藉由用不朽化基因轉染而經人工不朽化的現今在使用中的標準癌細胞系。特定言之，表現高含量之幹細胞標記物、癌症幹細胞標記物或CXCR4的NME1二聚體、NME7、NME7-AB、2i抑制劑或5i抑制劑中培養之癌細胞可用於發現、測試及選擇
試管內、活體外或活體內治療轉移性癌症之藥物。
產生表現人類組織之動物
預想其他應用，其中對於人類NME1、細菌性NME1或人類NME7，較佳NME7-AB為轉殖基因之動物經植入或移植可為幹細胞或祖細胞之人類細胞。舉例而言，在某些情況下，期望產生諸如小鼠之動物，將在其心臟、肝臟、皮膚或其他器官中生長人類組織。一種進行此之方法為藉由將人類幹細胞植入已使得表現人類NME7或人類NME7-AB之動物中產生一種嵌合動物。可在動物發展之各個階段，包括試管內及活體內，在發展之囊胚、胚胎或胎兒階段植入人類幹細胞或祖細胞。由於NME7抑制分化，NME7或NME7-AB轉殖基因將與可控制其表現之定時的方法有關。熟習此項技術者已知可使用以使得人類NME7或NME7-AB之表現在期望出現分化或成熟之時間或位置關閉或減小之方法。一種使轉殖基因，較佳NME7可誘導或可抑制之方法為將其表現或抑制連接至僅在發展中隨後表現之基因的表現。在該等情況下，吾人將製造一種轉殖基因動物，其中NME7或NME7-AB之表現連接於在心臟或心臟祖細胞中表現之隨後基因的表現。因此，藉由可由哺乳動物自然地表現之另一基因之表現控制NME7之表現或表現定時。舉例而言，NME7或NME7變異體在某一組織，諸如心臟中表現可為所需的。NME7之基因隨後可操作地連接於在心臟中表現之蛋白，諸如MHC之表現。在此情況下，NME7之表現在表現MHC基因產品之時間及地點減少或關閉。類似地，吾人可能想要在前列腺中開啟人類NME1、NME6或NME7之表現以使得其表現之定位及定時受控於例如前列腺特異性蛋白之表現。類似地，人類NME1或NME7於非人類哺乳動物中之表現可受控於
乳房組織中表現之基因。舉例而言，在轉殖基因小鼠中，可藉由促乳素啟動子或類似基因表現或抑制人類NME1或人類NME7。
以此方式，可使對於人類NME7或NME7-AB為轉殖基因之動物生長至一定程度，隨後植入人類幹細胞或祖細胞，其中其由於與人類NME蛋白接觸而增殖。隨後關閉人類NME之表現以使得動物中之特定器官或器官的一部分將作為人類組織發展。
本發明涵蓋對於人類NME1、細菌性NME1或人類NME7或NME7-AB為轉殖基因之動物之多種應用。在本發明之一個態樣中，將人類幹細胞或祖細胞植入NME轉殖基因動物或將為轉殖基因動物之動物的生殖細胞中。NME之表現可為可誘導或可抑制的。取決於植入幹細胞或祖細胞之位點及定時，可使所得動物表現人類心臟、肝臟、神經元細胞或皮膚。
因此，人類組織可產生於轉殖基因非人類哺乳動物中，其中哺乳動物表現生殖細胞或體細胞中之人類MUC1或MUC1*或NME蛋白，其中生殖細胞或體細胞含有引入至該哺乳動物中之重組人類MUC1或MUC1*或NME基因序列，其中基因序列之表現可藉由引入外部組成物或藉由將其表現或抑制連接至宿主動物之天然存在之基因之表現或抑制來誘發或抑制。將對於非人類哺乳動物在來源上為異種的幹細胞或祖細胞轉移至轉殖基因動物中以使得基因誘發為表現的以使幹細胞或祖細胞倍增且接著抑制基因表現以自異種移植幹細胞產生組織。一種方法藉由使幹細胞或祖細胞與組織分化因子接觸進行轉殖基因之抑制。亦回應於自然產生之宿主組織分化因子而於哺乳動物中自然地進行轉殖基因抑制。
此等動物可用於藥物發現。其亦可用於毒性測試，使用動物測定化合
物、生物製劑或藥物對人類組織或人類組織發展之作用。或者，將植入人類幹細胞或祖細胞之轉殖基因動物用於生長用於移植至人類患者中之人類組織。在某些情況下，植入之幹細胞或祖細胞來自將為收集自轉殖基因動物之人類組織之接受者的患者。
在一個態樣中，可誘發MUC1、MUC1*或NME蛋白表現直至轉移之幹細胞或祖細胞之量足夠大。隨後可藉由對宿主哺乳動物注射抑制MUC1、MUC1*或NME蛋白之表現的物質關閉MUC1、MUC1*或NME蛋白表現。可藉由自然方法，諸如藉由在小鼠中表現對於特定組織或器官類型之分化誘導因子，或可將化學或蛋白物質在幹細胞或母細胞轉移之位點處注射至宿主中以使得分化為所需組織類型誘發幹細胞或祖細胞群體之分化。
用於內胚層細胞組織之誘導、分化/轉化藥劑可包括(但不限於)以下藥劑：肝細胞生長因子、抑瘤素-M、表皮生長因子、纖維母細胞生長因子-4、鹼性纖維母細胞生長因子、胰島素、運鐵蛋白、硒酸、BSA、亞麻油酸、抗壞血酸2-磷酸酯、VEGF及地塞米松(dexamethasone)，其用於以下細胞類型：肝臟、肺臟、胰腺、甲狀腺及腸細胞。
用於中胚層組織之誘導、分化/轉化藥劑包括(但不限於)以下藥劑：胰島素、運鐵蛋白、硒酸、BSA、亞麻油酸、TGF-β 1、TGF-β 3、抗壞血酸2-磷酸酯、地塞米松、β-甘油磷酸酯、抗壞血酸2-磷酸酯、BMP及吲哚美辛(indomethacine)，其用於以下細胞類型：軟骨、骨、脂肪、肌肉及血細胞。
用於外胚層組織之誘導、分化/轉化藥劑包括(但不限於)以下藥劑：二丁醯細胞週期蛋白AMP、異丁基甲基黃嘌呤、人類表皮生長因子、鹼性
纖維母細胞生長因子、纖維母細胞生長因子-8、腦源性神經營養因子及/或其他神經營養生長因子，其用於以下細胞類型：神經、皮膚、腦及眼細胞。
用於發現及測試疫苗的對NME蛋白為轉殖基因之動物
表現人類NME，尤其為NME7-AB之轉殖基因動物亦將適用於評估何等免疫肽可安全地用於產生針對NME蛋白，包括NME1、細菌性NME及NME7之抗體。舉例而言，可藉由如圖61至圖63，肽編號1-53中闡述之免疫肽中之一或多者使對於人類NME1、NME7或NME7-AB為轉殖基因之小鼠免疫。分析對照組小鼠以確保產生抗NME抗體。人類腫瘤細胞將隨後植入轉殖基因小鼠中，其中若使用誘導型啟動子，則誘發宿主動物中之人類NME蛋白之表現。隨後藉由比較移植至轉殖基因小鼠與對照小鼠或未開啟誘導型NME啟動子之小鼠中之細胞之腫瘤移植、腫瘤生長速率及腫瘤起始潛能評估免疫肽之功效及潛在毒性。除測定整體骨髓數量、循環血細胞之數量及類型及回應於用對骨髓細胞具細胞毒性之藥劑的治療之骨髓細胞之再生之回應時間以外，藉由檢查器官，諸如心臟、肝臟及其類似物評估毒性。將伴以可容許的副作用而顯著降低腫瘤移植、腫瘤生長速率或腫瘤起始潛能的衍生自圖61至圖63，肽編號1-53中所列之肽的免疫肽選作用於在患者外部或在人體內部產生作為抗癌治療、防治物或疫苗之抗體的免疫肽。
可取代NME蛋白的NME蛋白之調節因子或NME蛋白之下游效應子
此等研究已顯示NME蛋白起促進幹樣或癌樣生長之作用的一種方式為藉由結合至MUC1跨膜蛋白之截短形式，本文中稱為MUC1*，其主要由PSMGFR序列組成。MUC1*細胞外域之二聚化刺激體細胞、幹細胞及癌細胞之生長及去分化，使其更具轉移性。
NME蛋白發揮其作用之另一方式為藉由運送至細胞核，其於該等細胞核中直接或間接起刺激或抑制其他基因之作用。先前已報導(Boyer等人，2005)OCT4及SOX2結合至MUC1及其裂解酶MMP16之啟動子位點。相同研究報導SOX2及NANOG結合至NME7之啟動子位點。吾人基於吾人之實驗得出此等『Yamanaka』多能性因子(Takahashi及Yamanaka,2006)上調MUC1、其裂解酶MMP16及其活化配位體NME7之結論。先前亦已報導BRD4抑制NME7，而其輔因子JMJD6上調NME1(Thompson等人)，吾人以論證其為比胚胎發生中之NME7表現更晚的自調節幹細胞生長因子。再者，其他人最近報導Mbd3或Chd4之siRNA抑制極大減小對iPS產生之抵抗性(Rais Y等人2013)且能夠使幹細胞維持初始狀態下。本文中呈現之證據顯示存在互逆反饋迴路，其中NME7抑制BRD4及JMJD6，同時亦抑制多能性Mbd3及CHD4之抑制劑。吾人應注意在初始人類幹細胞中，此等四種因子BRD4、JMJD6、Mbd3及CHD4與其在後期『經誘導』幹細胞中之表現相比經抑制。吾人亦應注意將小鼠經誘導幹細胞恢復至初始狀態下之2i抑制劑(Gsk3 β及MEK之抑制劑)亦下調相同四種因子BRD4、JMJD6、Mbd3及CHD4。
吾人亦已發現NME7上調SOX2(>150×)、NANOG(約10×)、OCT4(約50×)、KLF4(4×)及MUC1(10×)。重要的是，吾人已顯示NME7上調癌症幹細胞標記物，包括CXCR4(約200×)及E-鈣黏蛋白(CDH1)。將此等眾多證據結合在一起指出NME7為最原始幹細胞生長及多能性介體及其在將體細胞轉化至癌性狀態以及將癌細胞轉化為更具轉移性癌症幹細胞中為強大因子的結論。圖60為如藉由本文所述之實驗證明的幹細胞/癌症狀態之NME7及相關調節因子之相互作用圖之草圖。二聚體形式之NME1在能
夠將體細胞轉化至幹樣/癌樣狀態及能夠將癌細胞轉化為轉移性癌症幹細胞中與NME7大致相同地起作用，儘管程度略微較低。類似地，與人類NME1或NME7具有高同源性之細菌性NME二聚體，諸如鹽單胞菌屬593，如同NME1二聚體及NME7單體，能夠完全支持人類幹細胞生長、多能性及存活、癌細胞生長及存活、將體細胞恢復至癌細胞/幹細胞狀態及將癌細胞轉化為更具轉移性癌症幹細胞。
因此，本發明涵蓋關於NME7的增加NME7表現之替代基因及基因產物。類似地，本發明涵蓋關於NME7的NME7之替代下游效應子。舉例而言，抑制MBD3、CHD4、BRD4或JMJD6的單獨或組合形式之藥劑可以本文所述之方法中之任一者替代吾人已顯示抑制MBD3、CHD4、BRD4或JMJD6之NME7。
實施例
實施例1.對40-60日齡之間的免疫缺陷nu/nu小鼠植入90天雌激素釋放丸粒以促進乳房腫瘤細胞之移植及生長。將人類T47D乳癌細胞與基質膠以1：2混合，隨後注射至小鼠側腹中(各小鼠4百萬)，六隻小鼠/組。在第二組中，將癌細胞與基質膠以相同的1：2之比(100μL細胞：200μl基質膠)混合，除了將人類重組NME7-AB添加至細胞/基質膠混合物中以達成16nM之最終NME7濃度(6隻小鼠)。在第14天之後，在彼等六隻小鼠中，隨機選擇三隻每日接受NME7注射(100uL，32nM下)。圖1顯示小鼠中之腫瘤細胞生長之圖。圖(A)顯示與標準基質膠或基質膠加上NME7混合且異種移植至免疫缺陷(nu/nu)小鼠中之T47D乳房腫瘤細胞之生長之圖。在第
14天之後，腫瘤細胞與NME7混合之小鼠亦每日注射人類重組NME7一次。圖(B)顯示與基質膠加上NME7混合且異種移植至免疫缺陷小鼠中之T47D乳房腫瘤細胞之生長之圖。在第14天之後，一半小鼠亦每日注射人類重組NME7一次。圖2顯示個別小鼠中之人類腫瘤細胞之生長之圖。圖(A)顯示與標準基質膠混合之T47D乳癌細胞生長之圖。六隻植入小鼠中僅兩隻顯示移植之腫瘤生長特徵。圖(B)顯示與基質膠及NME7混合之T47D乳癌細胞之生長之圖。六隻植入小鼠中的四隻顯示移植之腫瘤生長特徵。虛線表明亦在第14天之後注射NME7之小鼠。
實施例2.在40-60日齡之間的若干組免疫缺陷小鼠中植入90天雌激素釋放丸粒以促進乳房腫瘤細胞之移植及生長且植入各小鼠之側腹中。將人類T47D乳癌細胞與基質膠以1：2混合(100μL細胞：200μl基質膠)，隨後注射至各小鼠之一個側腹中(各小鼠4百萬)。動物初始且量測腫瘤生長以追蹤腫瘤生長速率及評估此細胞系之腫瘤移植百分比。圖3顯示與標準基質膠混合且異種移植至四十隻免疫缺陷(nu/nu)小鼠中之T47D腫瘤細胞之圖。該圖顯示兩組相同的20隻小鼠之平均值，腫瘤體積平均增幅為22%，但具有向下趨勢。圖4顯示四十隻個別小鼠中之T47D人類乳房腫瘤細胞之生長圖，約25%顯示腫瘤移植。圖5顯示與基質膠混合且異種移植至六隻NOD/SCID小鼠之側腹中之T47D乳癌細胞之生長圖。圖(A)顯示平均腫瘤生長。圖(B)顯示個別小鼠中之腫瘤生長，其展現使用標準方法之六隻小鼠中僅一隻具有良好腫瘤移植。
實施例3.能夠使幹細胞維持初始狀態之藥劑將癌細胞轉型為癌症幹細胞，其中移植僅需要少量細胞。根據標準實務培養癌細胞。在對照組中，
癌細胞培養於其正常培養基中：RPMI用於T47D乳癌細胞、DU145及PC3前列腺癌細胞。然而，將測試藥劑重組蛋白人類NME1二聚體、細菌性HSP593 NME1二聚體、人類NME7-AB及2i添加至無血清基本培養基中以消除來自血清中之多種生長因子及細胞激素之潛在干涉。作為另一對照組，癌細胞培養於不含NME1、NME7或2i，但不增殖，所得細胞亦不上調癌症幹細胞之標記物的基本培養基中。
500mL無血清基本培養基包括以下組分：394mL DMEM/F12,GlutaMAX；100mLKnockoutTM血清替代物；5.0mL 100×MEM非必需胺基酸溶液；0.9mL β-巰基乙醇，55mM儲備液。
向此無血清基本培養基中添加rhNME1(亦稱NM23)至8nM之最終濃度，或添加細菌性HSP593重組NME1至8nM之最終濃度，或添加rhNME7-AB至4nM之最終濃度，或添加分別抑制MAP激酶路徑及GSK3之2i抑制劑PD0325901及CHIR99021至3μM及1μM之最終濃度。
當添加ρ激酶抑制劑「Ri」或「ROCi」時，其為獲自Stemgent(Cambridge,MA)之Y27632，在臨用前添加直至10μM之最終濃度。
實施例3a.乳癌T47D細胞培養於傳統的RPMI生長培養基或基本幹細胞培養基中，向其中添加人類NME1二聚體(亦稱為NM23-H1)、細菌性HSP593NME1二聚體、人類NME7-AB或被稱為『2i』之激酶抑制劑。此等藥劑具有之共同點為其各能夠促進初始狀態下之幹細胞之生長或能夠使經誘導狀態幹細胞恢復至較不成熟的初始狀態。吾人觀測到在此等藥劑中之任一者中培養之T47D癌細胞中的一些變得非黏附。此等『漂浮物』亦在形態上不
同。添加ρ激酶抑制劑(在本文中稱作『Ri』或『ROCi』)使大部分細胞保持附著於表面。圖6至圖10之圖中顯示之RT-PCR量測值顯示漂浮細胞為具有癌症幹細胞標記物或幹細胞標記物之最高表現之細胞。當添加ρ激酶抑制劑時，所有細胞保持附著但RT-PCR量測值表明所得量測為經轉化之細胞及未轉化或尚未轉化之細胞之混合物。結果顯示於圖6至圖10中。
圖6顯示據報導在正常RPMI生長培養基或無血清基本培養基(向其中添加重組人類NME7-AB作為單一生長因子)中培養之MUC1陽性T47D乳癌細胞中之一些癌症幹細胞或轉移性癌細胞中過度表現之一組基因之表現的RT-PCR量測值之圖。一部分彼等細胞變得非黏附且在表面浮起且進行收集，同時『+Ri』係指添加至培養基以使得所有細胞將保持附著於表面，因此給出黏附及非黏附細胞之平均讀數之ρ激酶抑制劑。如該圖中所顯示，轉移性受體CXCR4之表現幾乎為正常生長培養基中培養之T47D細胞之表現量的200倍。均與癌症進展有關之CDH1(亦稱作E-鈣黏蛋白)及MUC1二者均提高約10倍。亦報導為癌細胞之標記物之幹細胞標記物亦經提高。OCT4及SOX2分別提高約50倍及200倍。其他幹細胞標記物，諸如NANOG、KLF2、KLF4及TBX3顯示適度表現增加。
圖7顯示據報導在正常RPMI生長培養基或無血清基本培養基(向其中添加人類重組NM23(亦稱作NME1)二聚體或NME7-AB作為單一生長因子)中培養之MUC1陽性T47D乳癌細胞中之一些癌症幹細胞或轉移性癌細胞中過度表現之一組基因之表現的RT-PCR量測值之圖。『漂浮物』係指變得非黏附且經收集之彼等細胞，而『+Ri』係指添加至一些細胞以使其黏附至表面之ρ激酶抑制劑。如該圖中可見，NME1二聚體或NME7-AB中培
養之癌細胞在CXCR4、SOX2及OCT4之表現中具有顯著增加，接著為CDH1(亦稱作E-鈣黏蛋白)、MUC1及NANOG之表現之增加。幹細胞標記物KLF2及KLF4之表現存在適度增加。
在圖8中，吾人看到細菌性NME1以類似於人類NME1之方式起作用。
添加至T47D、MUC1陽性乳癌細胞之重組HSP593細菌性NME1亦引起細胞形態改變且亦使細胞變得非黏附。圖8顯示在CXCR4、NANOG及OCT4之表現中顯示顯著增加，接著為SOX2之較少增加及CDH1(亦稱作E-鈣黏蛋白)之5倍增加之RT-PCR量測值之圖。
在『2i』激酶抑制劑存在下培養T47D乳癌細胞之結果顯示於圖9中。
2i為MAP激酶及GSK3之生化抑制劑，先前顯示使經誘導狀態下之幹細胞恢復至較早初始狀態。2i使T47D細胞穩健增加CXCR4、SOX2、OCT4、MUC1及CDH1/E-鈣黏蛋白(以該順序)之表現。若將NME1二聚體或NME7-AB添加至2i，則此等癌症幹細胞標記物之表現增加，NME7-AB具有最大效果。然而，圖10顯示NME7-AB單獨產生具有癌症幹細胞標記物之較高表現量的癌細胞。
實施例3b.亦藉由人類NME1二聚體、細菌性NME1二聚體、NME7-AB或2i抑制劑如上文所述培養前列腺癌細胞。不同於T47D細胞，前列腺癌細胞未變得非黏附。因此，癌症幹細胞標記物之RT-PCR量測值低於T47D細胞之該等量測值，其可藉由其為轉化細胞及非轉化細胞之量度解釋。在乳癌細胞之情況下，吾人能夠藉由收集漂浮細胞分離完全轉化之癌症幹細胞，但在此處不能夠如此。在RPMI培養基(作為對照組)及添加重組人類NME1/NM23二聚體、細菌性HSP593二聚體或人類NME7-AB之基本培養基
中培養DU145 MUC1陽性前列腺癌細胞。圖11a顯示在rhNME1二聚體或rhNME7-AB中培養10日產生癌症幹細胞之標記物之適度增加。OCT4、MUC1及CDH1/E-鈣黏蛋白增加約2至8倍。然而，在此等相同培養條件下連續繼代之後，癌症幹細胞標記物之表現增加變得更顯著。吾人推論連續繼代使細胞具有更多轉化時間，因為吾人不可快速收集漂浮細胞。圖11b顯示在rhNME7-AB、細菌性HSP593 NME1二聚體或rhNME1/NM23二聚體中9至10繼代之後，CDH1/E-鈣黏蛋白之表現通常比前列腺癌症中之表現分別增加9倍、8倍及6倍。NANOG及OCT4之表現亦顯著增加。
亦測試在能夠使幹細胞維持初始狀態下之藥劑中培養時，PC3 MUC1陰性前列腺癌細胞轉化為癌症幹細胞之能力。藉由人類NME1二聚體、細菌性NME1二聚體或NME7-AB如上文所述培養PC3細胞。如同DU145前列腺癌細胞，PC3細胞未變得非黏附。因此，癌症幹細胞標記物之RT-PCR量測值可能較低，因為量測值將為轉化細胞及非轉化細胞之平均值。圖12a顯示在rhNME1/NM23二聚體或rhNME7-AB中繼代之後的基因子組之RT-PCR量測值。圖12a之圖顯示幹細胞標記物SOX2、OCT4及NANOG之表現的適度增加。培養基中之連續繼代不增加癌症幹細胞或幹細胞標記物之表現，相反地，其減少，如圖12b中所顯示。
實施例3c.在此實施例中，測試『2i』抑制劑對癌細胞之作用。前已述及2i為給予分別抑制MAP激酶路徑及GSK3的2個小分子CHIR99021及PD0325901之名稱。在幹細胞實驗中，展示2i能夠使經誘導狀態下之幹細胞恢復回較不成熟的初始狀態。在此實驗中，吾人在基本培養基中培養MUC1陽性T47D乳癌細胞，向基本培養基中添加2i或NME7-AB。獲取
RT-PCR量測值，其顯示2i以及NME7-AB抑制染色質重排因子MBD3及CHD4之表現，參見圖13。據報導MBD3及CHD4之siRNA抑制為亦使幹細胞恢復至初始狀態下之培養基之關鍵添加物。當在2i加上rhNME1/NM23或rhNME7-AB中培養時，MBD3及CHD4經類似抑制，圖14。
實施例3d.在此實施例中，在重組人類NME1/NM23二聚體、細菌性HSP593 NME1二聚體或NME7-AB存在下培養纖維母細胞。纖維母細胞培養於其正常培養基中作為對照組，正常培養基為500mL、445mL DMEM高葡萄糖基本培養基、5mL GlutaMAX及50mL胎牛血清(FBS)。在與NME1/NM23二聚體、細菌性HSP593 NME1二聚體或NME7-AB在培養物中15-20日之後，細胞形態完全改變以使其不再可辨識為纖維母細胞。RT-PCR顯示所得細胞極大增加幹細胞標記物基因OCT4及NANOG之表現，參見圖15。正如癌細胞，其亦減少BRD4、JMJD6、MBD3及CHD4之表現。圖16顯示編碼染色質重排因子BRD4、JMJD6、MBD3及CHD4之基因之表現的RT-PCR量測值之圖。圖17顯示據報導在編碼染色質重排因子BRD4、JMJD6、MBD3及CHD4之一些癌症幹細胞或轉移性癌細胞及基因中過度表現之基因之表現的RT-PCR量測值之圖。此處，『-ROCi』係指變得非黏附且在表面浮起之細胞。
實施例4.藉由在NME7-AB中培養所產生之癌症幹細胞藉由植入少至50個細胞而在小鼠中起始腫瘤。
如以上實施例3a中所述培養T47D乳癌細胞。在添加有rhNME7-AB至4nM之最終濃度的基本培養基中培養7-10日之後，收集漂浮細胞。RT-PCR量測值顯示CXCR4之表現相比於在RPMI培養基中培養之對照細胞增加130
倍。對漂浮細胞進行計數且再懸浮於PBS中。將NME7誘導之癌症幹細胞與生長因子減少之基質膠(Matrigel)以1：2混合；亦即2份基質膠比1份細胞。預期癌細胞與NME7之一系列比率或NME7之注射時程在一個小鼠品系至另一小鼠品系及一種腫瘤類型至另一腫瘤類型之間變化。
在先前已於肩部區域中植入90天釋放雌激素丸粒之雌性nu/nu小鼠之側腹中植入癌症幹細胞。四組各六隻小鼠植入50、100、1,000或10,000個T47D癌症幹細胞。在每一情況下，注射至各小鼠中之總體積為100μL。各組中之一半小鼠每日在側腹中在接近但不位於癌症幹細胞植入位點處注射200μL重組人類NME7-AB。
監測動物之食物攝入及體重，其為正常及穩定的。每週一次獲取兩個獨立且盲法的腫瘤量測值且進行記錄。
甚至對於僅植入50個細胞之組達成腫瘤移植。出人意料地，每日注射NME7之組具有增加之移植率且該組中的一些動物亦形成多個腫瘤。換言之，每日注射NME7之組的癌症在約50日之後轉移且在遠離初始植入位點之位點產生多個腫瘤。在此特定實驗中，植入NME7誘發之癌症幹細胞之24隻小鼠中有67%產生腫瘤。然而，仔細查看資料顯示無循環NME7之小鼠中僅有50%形成腫瘤，而接受NME7之每日注射之小鼠中有83%形成腫瘤。在形成腫瘤的該83%中，80%產生癌轉移，因為其在實驗的約第50天具有多個腫瘤。圖21為在植入已在含有NME7之重組形式NME7-AB之培養基中培養之癌細胞之後63日量測的腫瘤體積之圖。每一資料點旁的數字指小鼠追蹤號且「M」表示該動物具有多個腫瘤。圖22為總腫瘤體積之圖，其中已將具有轉移性癌症之一隻小鼠之所有腫瘤之體積加在一起。圖23至
圖46顯示在研究之第28天及第58天的各小鼠之相片，其用以顯示腫瘤生長之進展且在大多數情況下，在小鼠每日注射NME7-AB的情況下，顯示癌轉移進展。在圖23至圖46中，深色箭頭指出初始癌細胞之注射位點且淺色箭頭指出在第28天與第63天之間產生的遠處轉移。
所有引用之參考文獻以全文引用的方式併入本文中。
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<223> OriGene-NME7-1全長
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Claims (50)
- 一種產生用於癌症之非人類哺乳動物的動物模型之方法，其包含將癌細胞投予至非人類哺乳動物以及使該等癌細胞與NME7蛋白接觸的步驟，其中投予至該哺乳動物中之癌細胞的量為約30至約1,000,000、約50至約500,000、約50至100,000或約1,000至約1,000,000個。
- 如申請專利範圍第1項之方法，其中該NME7蛋白抑制MBD3、CHD4、BRD4或JMJD6之表現。
- 如申請專利範圍第1項之方法，其中該NME7蛋白為NME7單體或NME7-AB。
- 如申請專利範圍第1項之方法，其中在該等癌細胞與該NME7蛋白接觸後所產生的癌症幹細胞增加CXCR4或E-鈣黏蛋白(CDH1)之表現。
- 如申請專利範圍第1項之方法，其中該非人類哺乳動物的動物模型係用於測試潛在藥劑對抗癌細胞之功效，其包含以下步驟：(i)藉由向該哺乳動物的動物模型投予潛在藥劑使該等癌細胞與該潛在藥劑接觸；及(ii)量測該潛在藥劑對該等癌細胞之作用，其中該哺乳動物的動物模型中之癌細胞數目減少指示該潛在藥劑對抗癌細胞之有效性，其中在該等癌細胞存在於該非人類哺乳動物中之前、在該等癌細胞存在於該非人類哺乳動物中之後或在該等癌細胞存在於該非人類哺乳動物中之前及之後，使該等癌細胞與該NME7蛋白接觸。
- 如申請專利範圍第5項之方法，其中該NME7蛋白為NME7單體或NME7-AB。
- 如申請專利範圍第5項之方法，其中該哺乳動物為嚙齒動物。
- 如申請專利範圍第7項之方法，其中該嚙齒動物為小鼠或大鼠。
- 如申請專利範圍第5項之方法，其中該非人類哺乳動物為轉殖基因動物，其中該哺乳動物在生殖細胞或體細胞中表現人類MUC1或MUC1*或NME蛋白，其中該等生殖細胞及體細胞含有引入該哺乳動物中之重組人類MUC1或MUC1*或NME基因序列。
- 如申請專利範圍第9項之方法，其中表現該人類MUC1或MUC1*或NME蛋白之基因受控於誘導型啟動子。
- 如申請專利範圍第10項之方法，其中該啟動子誘導性地回應於該非人類哺乳動物中的天然存在之蛋白。
- 如申請專利範圍第5項之方法，其中該NME7蛋白在該等癌細胞存在於該非人類哺乳動物中之前與該等癌細胞接觸。
- 如申請專利範圍第5項之方法，其中該NME7蛋白在該等癌細胞存在於該非人類哺乳動物中之後與該等癌細胞接觸。
- 如申請專利範圍第5項之方法，其中該NME7蛋白在該等癌細胞存在於該非人類哺乳動物中之前及之後與該等癌細胞接觸。
- 如申請專利範圍第6項之方法，其中該NME7蛋白作為單一生長因子存在於無血清培養基中。
- 如申請專利範圍第1項之方法，其中該等癌細胞係來自人類腫瘤，並且在投予該等癌細胞之前、在投予該等癌細胞之後或在投予該等癌細胞之前及之後，使該NME7蛋白與該等癌細胞接觸。
- 如申請專利範圍第16項之方法，其中該NME7蛋白為NME7單體或NME7-AB。
- 如申請專利範圍第16項之方法，其中該哺乳動物為嚙齒動物。
- 如申請專利範圍第18項之方法，其中該嚙齒動物為小鼠或大鼠。
- 如申請專利範圍第16項之方法，其中該非人類哺乳動物為轉殖基因動物，其中該哺乳動物在生殖細胞或體細胞中表現人類MUC1或MUC1*或NME蛋白，其中該等生殖細胞及體細胞含有引入該哺乳動物中之重組人類MUC1或MUC1*或NME基因序列。
- 如申請專利範圍第20項之方法，其中表現該人類MUC1或MUC1*或NME蛋白之基因受控於誘導型啟動子。
- 如申請專利範圍第21項之方法，其中該啟動子誘導性地回應於該非人類哺乳動物中的天然存在之蛋白。
- 如申請專利範圍第16項之方法，其中在投予該等癌細胞之前使該NME7蛋白與該等癌細胞接觸。
- 如申請專利範圍第16項之方法，其中在投予該等癌細胞之後使該NME7蛋白與該等癌細胞接觸。
- 如申請專利範圍第16項之方法，其中在投予該等癌細胞之前及之後使該NME7蛋白與該等癌細胞接觸。
- 如申請專利範圍第17項之方法，其中該NME7蛋白作為單一生長因子存在於無血清培養基中。
- 如申請專利範圍第1項之方法，其中在該非人類哺乳動物中產生轉移性腫瘤，且在癌細胞存在於該非人類哺乳動物中之前、在癌細胞存在於該非人類哺乳動物中之後或在癌細胞存在於該非人類哺乳動物中之前及之後，使該NME7蛋白與該等癌細胞接觸。
- 如申請專利範圍第27項之方法，其中該NME7蛋白抑制MBD3、CHD4、BRD4或JMJD6之表現。
- 如申請專利範圍第27項之方法，其中該NME7蛋白為NME7單體或NME7-AB。
- 如申請專利範圍第27項之方法，其中該哺乳動物為嚙齒動物。
- 如申請專利範圍第30項之方法，其中該嚙齒動物為小鼠或大鼠。
- 如申請專利範圍第27項之方法，其中該非人類哺乳動物為轉殖基因動物，其中該哺乳動物在生殖細胞或體細胞中表現人類MUC1或MUC1*或NME蛋白，其中該等生殖細胞及體細胞含有引入該哺乳動物中之重組人類MUC1或MUC1*或NME基因序列。
- 如申請專利範圍第32項之方法，其中表現該人類MUC1或MUC1*或NME蛋白之基因受控於誘導型啟動子。
- 如申請專利範圍第33項之方法，其中該啟動子誘導性地回應於該非人類哺乳動物中的天然存在之蛋白。
- 如申請專利範圍第27項之方法，其中該NME7蛋白在癌細胞存在於該非人類哺乳動物中之前與該等癌細胞接觸。
- 如申請專利範圍第27項之方法，其中該NME7蛋白在癌細胞存在於該非人類哺乳動物中之後與該等癌細胞接觸。
- 如申請專利範圍第27項之方法，其中該NME7蛋白在癌細胞存在於該非人類哺乳動物中之前及之後與該等癌細胞接觸。
- 如申請專利範圍第29項之方法，其中該NME7蛋白作為單一生長因子存在於無血清培養基中。
- 如申請專利範圍第1項之方法，其中該等癌細胞係來自人類患者且該哺乳動物之動物模式是用於測試潛在藥劑對抗該患者的癌細胞之功效，其包含以下步驟：(i)藉由向該哺乳動物的動物模型投予潛在藥劑使該等癌細胞與該潛在藥劑接觸；及(ii)量測該潛在藥劑對該等癌細胞之作用，其中該哺乳動物的動物模型中之該等患者癌細胞數目減少指示該潛在藥劑對抗癌細胞之有效性，其中在該等患者癌細胞存在於該非人類哺乳動物中之前、在該等患者癌細胞存在於該非人類哺乳動物中之後或在該等患者癌細胞存在於該非人類哺乳動物中之前及之後，使該等患者癌細胞與該NME7蛋白接觸。
- 如申請專利範圍第39項之方法，其中該NME7蛋白抑制MBD3、CHD4、BRD4或JMJD6之表現。
- 如申請專利範圍第39項之方法，其中該NME7蛋白為NME7單體或NME7-AB。
- 如申請專利範圍第39項之方法，其中該哺乳動物為嚙齒動物。
- 如申請專利範圍第42項之方法，其中該嚙齒動物為小鼠或大鼠。
- 如申請專利範圍第39項之方法，其中該非人類哺乳動物為轉殖基因動物，其中該哺乳動物在生殖細胞或體細胞中表現人類MUC1或MUC1*或NME蛋白，其中該等生殖細胞及體細胞含有引入該哺乳動物中之重組人類MUC1或MUC1*或NME基因序列。
- 如申請專利範圍第44項之方法，其中表現該人類MUC1或MUC1*或NME蛋白之基因受控於誘導型啟動子。
- 如申請專利範圍第45項之方法，其中該啟動子誘導性地回應於該非人類哺乳動物中的天然存在之蛋白。
- 如申請專利範圍第39項之方法，其中該NME7蛋白在該等患者癌細胞存在於該非人類哺乳動物中之前與該等癌細胞接觸。
- 如申請專利範圍第39項之方法，其中該NME7蛋白在該等患者癌細胞存在於該非人類哺乳動物中之後與該等癌細胞接觸。
- 如申請專利範圍第39項之方法，其中該NME7蛋白在該等患者癌細胞存在於該非人類哺乳動物中之前及之後與該等癌細胞接觸。
- 如申請專利範圍第41項之方法，其中該NME7蛋白作為單一生長因子存在於無血清培養基中。
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