KR20130132795A - 짧은 rna 분자 - Google Patents

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KR20130132795A
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팔 새트롬
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Abstract

본 발명은 9 내지 25개의 뉴클레오타이드 길이이고 서열 AUCUGUACUGGAUGAGCGG 또는 UUUCCCGCAGGAGAUUGAC를 포함하는 제 1 가닥을 포함하는,인간 세포에서 MafA 발현을 상향 조절할 수 있는 짧은 RNA를 제공한다. 또한, 본 발명은 이들의 용도, 특히 의학 용도, 및 유도된 세포 및 이들의 용도에 관한 것이다.

Description

짧은 RNA 분자{SHORT RNA MOLECULES}
본 발명은 인슐린을 생산할 수 있는 세포를 생산하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 MafA의 발현을 증가시킬 수 있는 짧은 RNA 분자의 사용을 포함한다. 본 발명은 또한 짧은 RNA 분자 및 치료에서의 이의 용도에 관한 것이다.
당뇨병은 전세계적으로 2억명 이상의 사람들에게서 발생한다. 당뇨병은 혈중 글루코스 수준을 조절하는 호르몬인 인슐린이 체내에서 충분한 양으로 생산될 수 없을 때 발생한다. 건강한 사람에게서, 인슐린은 췌장, 보다 바람직하게는 췌장의 베타-세포에서 생산된다. 제 1 형의 당뇨병은 전형적으로 면역계의 T-세포에 의해 췌장의 베타-세포가 파괴되어 발생하며, 감염, 특히 바이러스 감염 또는 상처가 또한 췌장 베타-세포의 파괴 또는 기능 장애가 원인이 될 수 있음에도 불구하고, 자가 면역 장애가 종종 근본적인 원인이다. 이는 인슐린 생산의 심각한 부족을 야기한다.
현재의 치료 선택은 주로 외래의 인슐린 투여에 의존한다. 단점은 환자의 불편함을 포함하고, 정확하게 조절하기가 어려워서 전형적으로 일부 경우에는 과량의 인슐린을 야기하고, 다른 경우에는 너무 적은 인슐린을 야기한다.
전세계적으로 만연한 제 1 형의 당뇨병은 증가하고 있으며, 이에 부수적으로 이 환자들에게 있어 활성 인슐린 분비의 지속적인 공급원을 유지하기 위한 임상 시험은 이를 달성하기 위한 대안적 기전을 찾는 것에 상당한 노력을 들이고 있다. 그러나 섬(islet) 세포 또는 이식 섬 세포 재생에 대한 현재의 노력은 전체적으로 효과적이지 않으며, 인슐린 생산 세포의 생산에 대한 요구가 남아있다.
증가한 인슐린 생산으로부터 이득을 얻을 수 있는 또다른 질병은 제 2 형 당뇨병, 지방간, 비만, 특히 병적 비만증, 및 글루코스 결핍 및/또는 인슐린 생산, 흡수 및/또는 이용과 관련된 다른 임의의 장애를 포함한다.
췌장은 외분비 및 내분비의 2개의 구역으로 이루어져 있으며, 각각은 특징적인 기능을 갖는다. 내분비 구역은 펩티드 호르몬인 인슐린(베타-세포), 글루카곤(알파-세포), 소마토스타틴(델타-세포) 및 췌장 폴리펩티드(감마-세포)를 합성하는 4가지 세포 유형의 집합체로 구성된 랑게르한스 섬으로 이루어져 있다. 이들 세포는 배 발생 동안 순차적인 분화를 통해 유관 상피 줄기 세포로부터 분화되는 것으로 보여진다(10 내지 12). 췌장은 전장 내배엽의 등 및 항문 영역의 특징적인 배아 파생물로부터 유래하며, 이 파생물은 내분비 및 외분비 세포를 둘 다 생기게 한다(13). 가장 먼저 공지된 췌장 표지의 발현은 Hlxb9 및 PDX1 호메오박스 단백질이다(14 내지 16). 이 전사 인자는 췌장 특정을 위한 1차 신호에 반응하고, 형태 형성보다 우선하여 췌장 줄기 세포를 나타낸다. PDX1은 췌장 상피조직의 형태 형성 및 분화에 필수적이다. 글루카곤 및 인슐린 발현은 하류의 개시기(bud stage)에서 개시된다(16, 17). PDX1은 또한 내분비계의 간세포(progenitor)로서 뉴로제닌3(Ngn3) 양성 세포를 생산한다(18, 19). 이후, Ngn3의 활성화는 이후 성숙한 섬 세포로의 세포의 분화를 지향하는 뉴로(Neuro)D1, Rfx6 및 MafA를 포함하는 추가의 전사 인자의 발현을 개시한다(20, 21). 베타셀룰린 과발현은 인슐린 분비를 유도하는 것으로 나타났다.
프로-인슐린은 소포체에서 합성되며, 이곳에서 프로-인슐린은 접혀지고 다이설파이드 결합이 산화된다. 이후, 프로-인슐린은 골지체로 운반되어 패키징되어 분비 소포로 되고, 이곳에서 프로-인슐린은 일련의 단백질 가수분해효소 의해 가공되어 성숙한 인슐린이 된다. 성숙한 인슐린은 35개 미만의 아미노산을 갖고: 4개는 함께 제거되고 나머지 31개가 C-펩티드를 형성한다. C-펩티드는 프로-인슐린 서열의 중심에서 추출되고, 2개의 다른 말단(B 쇄 및 A 쇄)은 다이설파이드 결합에 의해 연결된다. 그러므로, 프로-인슐린 및 인슐린은 동일한 유전자에 의해 암호화되며, 따라서 "인슐린" 유전자에 대한 본원의 임의의 언급은 프로-인슐린을 암호화하는 유전자를 의미하는 것으로 이해되어야 하며, "프로-인슐린" 유전자에 대한 임의의 언급은 궁극적으로 인슐린이 되는 단백질을 암호화하는 유전자를 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
본원의 발명자는 표적 유전자를 상향 조절하여, 바람직하게는 글루코스-반응성 방식으로 인슐린을 생산할 수 있는 세포를 산출하는 방법을 개발하였다. 이와 같은 세포, 즉 인슐린을 생산하거나 생산할 수 있는 세포는 때때로 본원에서 "특수화된" 세포라고 일컬어진다. "특수화된 세포"에 대한 본원의 임의의 언급은 바람직하게는 "인슐린을 생산하는/생산할 수 있는 세포"이다.
관심있는 유전자의 발현을 상향 조절하는 현재의 방법은 유전자의 추가의 복제본을 숙주의 게놈 안으로 도입하기 위한 바이러스의 이용, 또는 표적 유전자의 추가의 복제본을 발현하는 플라스미드의 도입을 통하여, 세포 내로의 유전자의 추가 복제본의 도입을 요구한다. 그러므로, 상향 조절을 위해, 세포로의 발현 벡터의 침습적인 일시적 형질감염 또는 안정한 바이러스 형질도입이 현재 요구되며, 이는 안전성 문제를 야기한다. 현재의 방법은 전형적으로, 상향 조절제의 비일시적인 적용을 수반한다. 이 방법의 한계는 효과가 마찬가지로 비일시적이라는 것이다.
RNA 간섭(RNAi)은 표적 mRNA의 서열-특이적 하향 조절을 야기하는 중요한 유전자 조절 기전이다. RNAi는 "간섭 RNA(iRNA)"에 의해 매개되며, RNAi는 RNAi 처리에서 작용하는 다양한 짧은 이중 가닥 RNA 분자(dsRNA)를 포함하는 포괄적인 용어이다.
외인성 dsRNA는 리보핵산가수분해효소 단백질 다이서(Dicer)에 의해 처리되어 3' 오버행(overhang)을 형성하는 3' 말단에 짝을 이루지 않은 몇몇개의 염기를 갖고 19 내지 25개의 염기쌍, 바람직하게는 21 내지 23개의 염기쌍의 이중 가닥 단편이 될 수 있다. 바람직하게, 3' 오버행 각각은 1 내지 3개, 더욱 바람직하게는 2개의 뉴클레오타이드 길이이다. 이들 짧은 이중 가닥 단편은 작은 간섭 RNA(siRNA)라고 일컬어지며, 이 분자는 표적 유전자 발현의 하향 조절에 영향을 미친다.
siRNA의 기능의 설명 때문에, siRNA는 특정 유전자를 하향 조절하기 위한 도구로서 사용되어 왔다. 이들은 일시적인 억제, 또는 짧은 헤어핀 RNA(shRNA)로서 안정하게 통합되었을 때, 안정한 억제를 줄 수 있다. siRNA 및 shRNA는 유전자 발현의 감소 효과를 관찰함으로써 관심있는 유전자의 기능이 연구되는 "넉다운(knockdown)" 또는 "기능의 손실" 실험에서 광범위하게 사용되어 왔다. RNAi는 유전자 지도작성 및 주석처리를 위한 기술에서 잠재적 이익을 갖는 것으로 고려된다. 치료에서 RNA 간섭의 이용이 또한 시도되어 왔다.
RNA-유도 침묵 복합체(RISC)라고 불리는 단백질 복합체는 siRNA 가닥 중 하나를 혼입하고, 이 가닥을 가이드로서 이용하여 표적 mRNA를 인식한다. 가이드 RNA와 mRNA 사이의 상보성에 의존하여, RISC는 mRNA의 번역을 파괴 또는 억제한다. 완전한 상보성은 mRNA 절단 및 파괴를 야기하고, 절단의 결과 mRNA는 더 이상 단백질로 번역될 수 없다. 부분적인 상보성(특히, mRNA의 3' 비번역 영역(UTR)의 부위)은 번역 억제를 야기한다. RNAi는 대부분의 진핵생물에서 보존되고, 외인성 siRNA 도입을 통해 특정 유전자의 하향 조절을 위한 도구로 사용될 수 있다.
RISC가 주로 유전자를 전사 후에 조절하지만, RNAi는 또한 유전자 전사 그 자체를 조절할 수 있다는 것이 최근에 밝혀졌다. 분열 효모에서, 작은 RNA는 RISC 복합체의 동종체를 통해 염색질을 조절한다. RNA-장착 RISC 복합체는 분명하게 비암호화 RNA(ncRNA)를 결합하여 ncRNA의 좌위에서 히스톤-변형 단백질을 보충한다. 식물, 파리, 선충, 섬모충 및 곰팡이도 역시 유사한 기전을 갖는다. 포유류에서, 수많은 정확한 기전이 불분명하게 남아있지만, 짧은 RNA가 조절된 RNA에 대한 센스 또는 안티센스이고 비암호화 전사물이라 추측되는 파괴 전사물을 표적화함으로써 전사를 조절한다. RNA 표적화를 통한 비암호화 전사물의 파괴는 RNA 표적의 특성에 의존하여 후성적 조절 패턴에 상이한 영향을 미친다. 소정 mRNA에 대한 센스인 ncRNA 표적의 파괴는 mRNA의 전사 억제를 야기하는 반면, 소정 mRNA에 대한 안티센스인 ncRNA 표적의 파괴는 mRNA의 전사 활성을 야기한다. 이와 같은 안티센스 전사물을 표적화함으로써, RNAi는 특정 유전자를 상향 조절하는데 이용될 수 있다.
놀랍게도, 본 발명의 발명자는 세포가 짧은 RNA 분자를 이용하여 MafA 발현을 상향 조절함으로써 인슐린을 생산하기 위해 유도될 수 있다는 것을 발견하였다. 본 발명의 발명자는 MafA 유전자의 상향 조절을 달성하고 인슐린 생산 세포를 생산하며, 선행 기술의 방법과 관련된 문제점을 극복하는 신규한 짧은 RNA(saRNA) 분자를 개발하였다. 특히, 본 발명의 분자는 숙주 세포의 게놈에 통합될 수 있는 유전적 요소의 투여와 관련된 안전성 문제를 야기하지 않는다.
본 발명자는 적절한 RNA 표적 전사물을 식별하고 이 짧은 RNA 분자를 디자인하기 위한 유익한 방법/알고리즘을 사용하였다. 그러므로, 본 발명자는 MafA 발현을 조절하기 위해 숙주 세포에서 RNA 전사물을 표적화하는 신규한 짧은 RNA 분자를 제공하였다. 본 발명의 짧은 RNA는 선행 기술의 발현 벡터보다 작은 분자이며, 따라서 침습성이 적다. 본 발명의 분자가 유전자를 조절하기 위해 숙주 자체의 조절 시스템을 사용한다는 사실은 숙주의 추가의 유전자 복제본을 도입하는 것보다 덜 침습적일 수 있다.
본 발명의 짧은 RNA는 MafA의 단백질 수준을 상향 조절할 수 있고, 이는 mRNA 및 하류 표적의 상향 조절을 야기한다. 본 발명의 짧은 RNA는 또한 본원에서 "특수화-유도" RNA로 언급된다. 본 발명의 MafA-활성화 RNA는 재생 의학에서 사용되는 인슐린 생산 세포의 생산을 위한 효과적이고, 비침습적이며, 안전한 대안이다.
본 발명의 주요한 이점은 유전자-활성화 작은 RNA의 일시적인 적용에 관한 것이며 이들의 효과 또한 일시적이다. 이는 자극에 대해 반응할 수 있는, 특히 글루코스에 대한 반응에서 인슐린을 생산할 수 있는 유도된 세포(즉, 본원에 개시된 방법을 전적으로 사용하기 위해 유도된 세포)의 생산을 가능하게 한다.
따라서, 본 발명의 한 양상은 세포에서 MafA 발현을 상향 조절할 수 있는, 19 내지 25개의 뉴클레오타이드 길이 및 서열 AUCUGUACUGGAUGAGCGG(서열번호 1) 또는 UUUCCCGCAGGAGAUUGAC(서열번호 2)를 갖는 제 1 가닥을 포함하는 짧은 RNA를 제공한다. 상기 RNA는 바람직하게는 19 내지 25개의 뉴클레오타이드 길이를 갖고 상기 제 1 가닥과 함께 이중 가닥을 형성하는 제 2 가닥을 포함한다. 바람직하게, RNA 가닥의 각각은 3' 말단에 1 내지 3개의 짝을 이루지 않은 뉴클레오타이드를 갖고 오버행을 형성한다. 바람직하게, 상기 3' 오버행은 하나 이상의 우라실 뉴클레오타이드를 포함하거나 이로 이루어진다.
하나의 실시양태에서, 상기 짧은 RNA는 서열번호 1을 포함하거나 이로 이루어진 제 1 가닥 및 서열번호 2를 포함하거나 이로 이루어진 제 2 가닥을 포함한다. 다른 실시양태에서, 상기 짧은 RNA는 서열번호 3을 포함하거나 이로 이루어진 제 1 가닥 및 서열번호 4를 포함하거나 이로 이루어진 제 2 가닥을 포함한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 세포에 의해 인슐린 생산을 유도하기 위한 본원에 정의된 짧은 RNA의 용도를 제공한다. 용도는 시험관내 또는 생체내일 수 있다.
바람직하게, 본원에 개시되어 있는 용도 또는 방법에서, 서열AUCUGUACUGGAUGAGCGG(서열번호 1)를 포함하는 짧은 RNA와 서열 UUUCCCGCAGGAGAUUGAC(서열번호 2)를 포함하는 짧은 RNA는 조합되어 사용된다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 세포를 본원에 정의된 짧은 RNA와 접촉시키는 것을 포함하는, 세포에 의한 인슐린 생산 유도 방법을 제공한다. 상기 방법은 생체내, 시험관내 또는 생체외일 수 있다.
바람직하게, 본원에 개시된 용도 및 방법에서, 인슐린 생산은 글루코스-반응성이다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 본원에 정의된 하나 이상의 짧은 RNA를 포함하는 생체외 또는 시험관내 세포를 제공한다. 또한, 본 발명은 본원에 정의된 방법에 의하여 수득되는 인슐린을 생산하기 위해 유도된, 생체외 또는 시험관내 세포를 제공한다.
도 1 은 PDX1 좌위 및 잠재적 안티센스 표적 후보를 나타내는 모식도이다. 상기 도면은 PDX1의 게놈 위치, PDX1 전사물의 구조 및 주변의 영역으로부터 스플라이싱된 EST를 나타낸다(UCSC 게놈 브라우저로부터의 개작된 이미지). 상자는 PDX1 프로모터 영역 및 PDX1의 가장 근접한 안티센스 EST 상류(CR593175)를 나타낸다. EST는 PDX1의 전사 시작 부위(TSS)로부터 1.4kb에서 개시하고 90kb에서 종결한다. EST가 PDX1의 TSS를 통하여 전사되고 오버랩된다는 것을 주목한다. 화살표는 작은 RNA 후보에 대한 잠재적인 표적 부위를 나타낸다.
도 2 는 Ngn3의 좌위 및 잠재적 안티센스 표적 후보를 나타내는 모식도이다. 상기 도면은 Ngn3의 게놈 위치, Ngn3 전사물의 구조 및 주변의 영역으로부터 스플라이싱된 EST를 나타낸다(UCSC 게놈 브라우저로부터의 이미지). 상자는 Ngn3 프로모터 영역 및 Ngn3의 가장 근접한 안티센스 전사물 상류(AI744512)를 나타낸다. EST는 Ngn3의 TSS로부터 2.4kb에서 개시하고 3.7kb에서 종결한다. 화살표는 작은 RNA 후보에 대한 잠재적인 표적 부위를 나타낸다.
도 3 은 Rfx6 좌위 및 잠재적 안티센스 표적 후보를 나타내는 모식도이다. 상기 도면은 Rfx6의 게놈 위치, Rfx6 전사물의 구조 및 주변의 영역으로부터 스플라이싱된 EST를 나타낸다(UCSC 게놈 브라우저로부터의 이미지). 상자는 Rfx6 프로모터 영역 및 Rfx6의 근접한 안티센스 전사물 상류를 나타낸다. EST는 GPRC6A라고 지칭되며 Rfx6의 TSS로부터 48kb에서 개시하고 85kb에서 종결한다. 화살표는 작은 RNA 후보에 대한 잠재적인 표적 부위를 나타낸다.
도 4 는 MafA 좌위 및 잠재적 안티센스 표적 후보를 나타내는 모식도이다. 상기 도면은 MafA의 게놈 위치, MafA 전사물의 구조 및 주변의 영역으로부터 스플라이싱된 EST를 나타낸다(UCSC 게놈 브라우저로부터의 이미지). 화살표는 작은 RNA 후보에 대한 잠재적인 표적 부위를 나타낸다.
도 5의 A : RNA를 보여주는 젤의 사진. 신선하게 단리된 옴니사이트(제 0 일) 및 배양 3일 후 세포(제 3 일)로부터 단리된 전체 RNA는 mRNA 선별을 위해 역전사된다. 액틴 RNA 발현이 대조군으로서 측정된다. 제 0 일의 세포는 중배엽 표지 예컨대 SOX17을 발현하지만 이들 세포는 또한 인슐린을 생산하는 베타-세포로 특수화하는데 요구되는 전사 인자 뉴로D, PDX1 및 Rfx6을 발현한다. 제 3 일의 결과는 이러한 인자가 처음 3일의 확장 이내에서 하향 조절되었음을 보여준다.
도 5의 B : RNA를 보여주는 젤의 사진. 옴니사이트가 3일 동안 배양되었고 PDX1을 표적화하는 saRNA로 형질감염되었다. 4개의 가능성 있는 세트의 어닐링된 올리고뉴클레오타이드(CR1, CR2, PR1 및 PR2)가 시험되었다. 9일 후(제 9 일) RNA가 분석되었다. 제 9 일에 CR2 및 PR1은 PDX1, Rfx6 및 인슐린의 발현을 증가시켰다.
도 5의 C : 제 9 일에 PDX1(CR2 및 PR1)로 형질감염된 세포가 섬 세포 집단의 형성을 연상시키는 형태학적 변화를 보였다. 인슐린 1차 항체에 대해 알렉사(Alexa)-488 접합된 2차 항체를 이용한 형광 염색은 이 세포 집단이 인슐린을 발현했음을 증명하였다. 2차 항체 단독 염색은 자가 형광 또는 비특이적 결합을 보이지 않는다(데이타는 나타나 있지 않음).
도 6의 A : RNA를 보여주는 젤의 사진. 섬 세포의 후기 특수화에 수반된 전사 인자를 표적화하는 어닐링된 saRNA 올리고뉴클레오타이드의 일시적인 형질감염이 배양의 제 3 일 및 제 6 일에 수행되었다. 뉴로제닌 3(AL2) 및 MafA(PR1 및 PR2)가 프로-인슐린의 발현을 상향 조절하는 반면, 뉴로제닌 3(PR1 및 PR2), Rfx6(PR1 및 NM1)은 프리프로-인슐린의 발현을 상향 조절하였다.
도 6의 B : 글루코스 구배에 노출된 후의 인슐린 발현을 분석하였다. 세포를 saRNA 올리고뉴클레오타이드의 조합으로 일시적으로 형질감염하였다. 배양의 제 3 일 및 제 6 일에 Rfx6(PR1), Ngn3(PR1) 및 MafA(PR2)를 단독으로 형질감염하거나, PDX1(CR2)로 형질감염하였다. 제 9 일에 16시간 동안 세포를, 10mM 니코틴아마이드, 50ng IGF-II, 10ng HGF, 25ng 엑센딘-4 및 10ng 액티빈 A로 보충된 α-MEM으로 예비-처리하고, 이어서 3시간 동안 2.8mM의 글루코스를 첨가하고 추가의 3시간 동안 20mM의 글루코스를 첨가하였다. 프로-인슐린 ELISA를 위해 배양 배지를 단리하고 처리하였다. 결과는 키트에 의해 제공된 양성 대조군에 대한 백분율로 나타내었다(인슐린 7.9pM).
도 7 : 인슐린 생산 세포의 유도를 나타내는 흐름도.
도 8 은 (프로)인슐린 좌위 및 잠재적인 안티센스 표적 후보를 나타내는 모식도이다. 도면은 (프로)인슐린의 게놈 위치, (프로)인슐린 전사물의 구조 및 주변의 영역으로부터 스플라이싱된 EST를 나타낸다(UCSC 게놈 브라우저로부터 개작된 이미지). 상자는 (프로)인슐린의 프로모터 영역을 나타낸다. 화살표는 작은 RNA 후보에 대한 잠재적인 표적 부위를 나타낸다.
도 9 : 인슐린 생산 세포의 유도를 위한 최적화된 프로토콜을 나타내는 흐름도. PSG는 페니실린, 스트렙토마이신 및 글루타민을 의미한다.
도 10 : 비처리된 세포(대조군) 및 saRNA 처리된 세포의 인슐린 발현 및 액틴의 웨스턴 블랏.
도 11 : 베타-세포 발달과 관련된 주요 전사 인자의 정량적인 PCR의 그래프. 정량적 PCR은 비형질감염된(대조군) 세포, MafA 발현을 상향 조절하는 saRNA로 형질감염된 세포, 및 전체 정상 췌장 RNA에서 수행된다.
도 12 : 전자 현미경 이미지.
도 13 : 인슐린 및 C-펩티드의 ELISA 결과를 나타내는 그래프.
도 14 : 비형질감염된 세포에 대한 형질감염된 간 상피 세포에서 MafA의 상대적인 양을 나타내는 액틴으로 정규화된 그래프. 동시발생을 위하여 차콜 스트리핑된 페놀 레드-부재 RPMI에 세포를 종균하였다. 16시간 이후 세포를 MafA(PR1, PR2 및 이 둘의 조합)를 표적화하는 saRNA로 형질감염하였다.
"인슐린 생산 유도"는 분화, 즉, 세포를 특정(췌장의) 계통으로 추진시키는 것 및 세포의 분화능이 감소하는 것을 포함할 수 있다. 따라서, 다능 세포 또는 만능 세포는 특정 계통의 특수화된 세포, 예컨대 베타-세포로 분화되기 위해 유도될 수 있다. 인슐린 생산 유도는 전환분화, 즉 특정 계통의 세포가 상이한 계통의 특수 기능 특성을 갖도록 유도될 수 있는 것을 포함할 수 있다. 예컨대, 분화된 세포, 예컨대 상피 세포, 간 세포, 예컨대 헤파토사이트, 또는 섬유아세포는 다른 세포 유형의 표적 단백질 특성, 예컨대 인슐린을 생산하도록 유도될 수 있다. 선택적으로, 인슐린 생산 유도는 만능성 또는 다능성 표현형을 보유하는 동시에 특수화된 특성(인슐린 생산)을 갖게 하기 위해 세포를 유도할 수 있다. 그러므로, 인슐린을 생산하기 위한 줄기 세포의 유도는 인슐린을 생산할 수 있는 췌장 베타-세포를 생산하는 결과를 야기할 수 있지만, 선택적으로, 이는 인슐린을 생산할 수 있는 만능 세포, 또는 인슐린을 생산할 수 있는 비췌장 체세포, 예컨대 헤파토사이트를 생산하는 결과를 야기할 수 있다.
본원에 개시된 방법에 의하여 생산된 특수화된 세포, 즉 인슐린 생산 세포는 인슐린 생산 유도에 의하여 생산되었고, 따라서 이는 "유도된" 세포로 지칭될 수 있다.
본 발명의 방법에서, 표적 유전자 MafA의 상향 조절은 인슐린 생산에 직접적으로 영향을 미친다. MafA는 즉시 또는 궁극적으로 인슐린 생산을 조절한다(간접 효과). 생산의 조절은 그 중에서도, 표적 단백질 인슐린을 암호화하고 있는 유전자의 전사 활성화, 또는 표적 단백질 인슐린을 암호화하고 있는 유전자의 전사 억제를 포함할 수 있다. MafA는 또한 "하류" 조절이라 일컬어질 수 있는 일련의 사건의 조절에 의해 표적 단백질 인슐린의 생산에 영향을 미칠 수 있다. 하류 조절은, 표적 단백질 인슐린을 조절할 수 있거나 제 3 유전자를 조절할 수 있고 이 일련의 사건이 표적 단백질 인슐린 생산을 상향 조절하는 제 2 유전자를 조절하는 표적 유전자 MafA의 짧은 RNA의 사용을 통한 상향 조절을 포함할 수 있다.
인슐린 생산에 영향(간접 효과)을 미치는 유전자는 PDX1, 뉴로제닌 3(Ngn3), Rfx6, MafA, Hlxb9, Hnf6, Ptf1a, 뉴로D, 베타셀룰린 및 Nkx6-1을 포함한다.
2개 이상의 상이한 saRNA 분자는 본 발명의 임의의 방법에서 함께 사용될 수 있다. 이들은 동일한 표적 RNA 전사물을 하향 조절할 수 있거나, saRNA 분자 각각은 상이한 RNA 전사물을 하향 조절할 수 있다.
본 발명의 발명자는 유도된 세포에 의해 오직 인슐린 발현을 달성한 것만은 아니다. 실시예에 나타난 바와 같이, 본 발명의 방법은 또한 많은 적용을 위해 바람직한 인슐린의 분비로 이어진다. 세포가 시험관내 인슐린 생산을 위해 의도되는 경우, 인슐린 분비는 시간 소모적인 인슐린 추출 공정을 피한다. 세포가 이식을 위해 의도되는 경우, 또는 상기 방법이 생체내에서 이용되는 경우, 유도된 세포가 인슐린을 분비할 수 있다는 것은 필수적이다.
본 발명의 방법은 또한 글루코스-반응성 방식으로 인슐린 생산을 달성한다. 실시예에 나타난 바와 같이, 유도된 세포는 글루코스의 부재시보다 글루코스의 존재시 상당히 많은 인슐린을 생산한다. 이는 생체내 적용에 있어 분명하게 매우 유리하다.
우리의 지식이 미치는 한, 이것은 글루코스-반응성 방식으로의 인슐린의 생산 및 분비를 위한 세포의 유도 방법의 첫 보고이다. 이론에 얽매이려는 것은 아니지만, 글루코스-반응성 방식으로의 인슐린의 생산 및 분비는 saRNA 기술의 사용, 특히 MafA를 상향 조절하기 위한 saRNA 기술의 사용을 통해 달성된다는 것으로 여겨진다.
본 발명의 방법/사용은 바람직하게는 글루코스-반응성 방식으로 인슐린을 생산/생산할 수 있는 세포를 생산할 것이다. 표현 "글루코스-반응성"은 당해 분야에 널리 공지되어 있으며, 따라서 숙련자는 "글루코스-반응성"이 인슐린 생산 및/또는 분비가 글루코스의 부재시보다 글루코스의 존재시에 더 크다는 것을 의미한다는 것을 알고 있다. 이는 적어도 생체내 맥락에서, "글루코스의 존재"가 생리학적으로 유의한 농도의 글루코스를 의미하며, "글루코스의 부재"가 완전한 글루코스의 부재 뿐만 아니라 매우 낮아서 생리학적으로 유의하지 않는 글루코스 농도를 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 바람직하게, 글루코스-반응성 세포는 글루코스의 부재시보다 글루코스의 존재시에 적어도 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95 또는 100% 더 인슐린을 생산한다. 바람직하게, 인슐린 생산은 글루코스 농도와 양성적인 관계에 있고, 즉, 높은 글루코스 농도에 노출되었을 때, 세포는 낮은 농도의 글루코스에 노출되었을 때보다 많은 인슐린을 생산한다. 바람직하게, 세포외 환경에서 증가하는 글루코스의 농도는 인슐린 생산의 증가를 수반하는 결과를 야기한다. 바람직하게, 세포는 건강한 췌장 베타-세포의 반응성을 모방하는 글루코스-반응성을 보인다.
그러므로, 바람직하게, 세포는 글루코스-반응성 방식에서 인슐린을 생산하기 위해 유도된다. 또한 바람직하게, 세포는 인슐린을 분비하기 위해 유도된다.
인슐린 생산은 표준 프로토콜 예컨대, 면역형광법, ELISA 또는 웨스턴 블랏을 이용하여 분석될 수 있다. 적절한 분석법은 실시예에 기술되어 있다. 예컨대, 샘플은 항-인슐린 항체에 접촉될 수 있고, 결합된 항체는 표지된 2차 항체를 사용하여 검출될 수 있다. 인슐린 생산은 또한 RNA 수준에서, 예컨대 (역전사효소) PCR, 바람직하게는 반-정량적 또는 정량적 PCR을 이용하여 분석될 수 있다. 숙련자는 ELISA가 인슐린 분비를 분석하기 위해 사용될 수 있다는 것을 알고 있다. 글루코스-반응성은 글루코스에 노출된 세포의 인슐린 생산을 글루코스에 노출되지 않은 세포와 비교함으로써 측정될 수 있다.
본 발명의 방법은 전능 세포, 만능 세포, 다능 세포 또는 체세포를 사용하여 수행될 수 있다. 즉, 임의의 이들 세포는 인슐린을 생산하기 위하여, 특수화하기 위해 유도되는 출발 세포로서 사용될 수 있다. 본원에 개시된 방법은 출발 세포로부터 특수화된 인슐린 생산 세포를 생산한다. 이러한 방법을 통해 생산된 특수화된 세포는 적어도 표적 단백질 인슐린의 발현에서의 출발 세포와 다르다.
적절한 출발 세포가 하기에 더욱 자세히 논의되어 있다. 전능 세포는 유기체에서 발견되고 유기체 전체를 형성하는 모든 유형의 세포로 분화할 수 있는 능력이 있다. 만능 세포는 3개의 배엽층 중 임의의 것으로 분화할 수 있는 능력이 있는 세포이다: 내배엽(위 내벽 내부, 위장관, 폐), 중배엽(근육, 뼈, 혈액, 생식기), 또는 외배엽(상피 조직 및 신경계). 분화능은 세포가 다른 유형의 세포로 분화될 수 있는 정도이다. 만능 세포는 다능 세포보다 훨씬 큰 분화능을 갖는다. 세포 집단 내에서, 각각의 세포는 상이한 분화능을 가질 수 있다. 다능 세포의 집단은, 추후, 체세포로 분화되는 일부 세포 및 분화되지 않고 여전히 다능성인 일부 세포를 포함한다. 유사하게, 만능 세포의 집단은, 추후, 만능 세포뿐만 아니라 다능 세포 및 체세포를 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법은 전능 세포, 만능 세포, 다능 세포 또는 체세포의 집단과 연계하여 사용될 수 있다. 세포는 성체 또는 배아, 예컨대 성체 줄기 세포, 배아 줄기 세포 또는 종양-유도된 줄기 세포일 수 있으며, 성체 줄기 세포가 바람직하다.
세포는 바람직하게는 인간 세포이다.
만능 세포는 유도된 만능 줄기 세포(약어로 iPSC 또는 iPS 세포)(즉, 특정 유전자의 "강제" 발현 유도에 의해 비-만능 세포로부터 인위적으로 유도된 만능 줄기 세포의 유형, 전형적으로 성체 체세포)로 유도될 수 있다.
국제특허공개 제 2005/059113 호는 특히 유리한 유형의 만능 줄기 세포를 개시한다. 이 줄기 세포는 골수 및/또는 혈액, 예컨대 말초 혈액으로부터, 또는 탯줄 또는 태반으로부터 얻어진 물질로부터 직접 단리될 수 있으며, 외배엽, 중배엽 및 내배엽 세포로 분화될 수 있는 독특한 능력을 갖는다. 이들 세포는 전능성이지 않다면, 분명히 다능성 또는 만능성이다. 그러므로 국제특허공개 제 2005/059113 호에 기술되어 있는 줄기 세포는 자가(자기-대-자기) 방식으로 이용될 수 있는 조직 이식을 위한 유용한 세포 공급원을 제공한다.
국제특허공개 제 2005/059113 호에 개시되어 있는 세포는 당해 분야에서 "옴니사이트(Omnicyte)"로 공지되어 있다. 국제특허공개 제 2005/059113 호의 교시는 전체의 내용이 본원에 참고로서 혼입된다. 옴니사이트는 자가 생산 능력, 및 외배엽, 중배엽 및 내배엽 세포로 분화될 수 있는 능력을 갖는 CD34+인 줄기 세포, 예컨대 조혈 세포이다. 상기 언급된 바와 같이, 이들은 골수 및/또는 혈액으로부터 직접 단리될 수 있다. 이들은 또한 배양 동안 플라스틱(예컨대, 표준 조직 배양 용기의 플라스틱)에 부착될 수 있는 능력으로 특징지어진다. 적절한 용기는 미국 뉴욕 소재 코닝 인코포레이티드(Corning Incorporated)로부터 제조된 것들이다.
옴니사이트는 또한 영양 세포층, 즉, 줄기 세포의 성장을 지지하는 세포(전형적으로, 이들의 추가 성장 또는 분열 없이 중요한 대사산물을 제공하는 감마 조사에 의해 비활성화됨)를 요구하지 않는다는 사실로 특징지어진다.
옴니사이트는 하기 단계에 의해 수득되는 것으로 추가로 특징지어진다:
(a) CD34+ 세포의 조직 또는 혈액 샘플을 강화하는 단계; 및
(b) 샘플을 고체 지지체와 접촉시키고, 상기 고체 지지체에 부착하는 세포를 회수하는 단계.
적절한 조직 또는 혈액 샘플은 골수, 말초 혈액, 탯줄 혈액 또는 조직, 태반 및 지방 흡입술로부터 수득된 샘플을 포함한다.
보다 특히, 이들은 하기 단계에 의해 수득된다:
조직 또는 혈액 샘플(바람직하게, 조혈 조직, 예컨대 혈액 또는 골수 샘플)을 밀도 구배 분리하는 단계;
낮은 밀도의 세포를 CD34(바람직하게는, 상자성 비드에 부착됨)를 위한 친화성 리간드에 노출하는 단계;
상기 CD34 리간드에 부착된 세포를 회수하는 단계;
CD34+ 하위집단을 조직 배양 등급의 플라스틱에 노출하는 단계; 및
플라스틱에 부착된 CD34+ 세포를 회수하는 단계.
옴니사이트는 바람직하게는 성체이고, 따라서 비태아이다.
옴니사이트의 샘플을 2004년 9월 24일에 영국 에스피40제이쥐 솔리스베리 포르톤 다운 소재의 ECACC에 수탁번호 제 04092401 호로서 기탁하였다. 기탁은 영국 버크셔 알쥐42 5큐에이치 빈필드 스피닝 휠 레인 소재 윌로우 트리 코티지(Willow Tree Cottage)의 미어틀 고든(Myrtle Gordon) 교수에 의해 수행되었으며, 세포주는 "스템 셀 옴니사이트(Stem Cell Omnicyte)"라는 명칭을 부여받았다.
본 발명의 방법은 바람직하게는 옴니사이트, 조혈 줄기 세포(HSC) 및 간엽 줄기 세포(MSC)로부터 선택된 세포, 특히 바람직하게는 옴니사이트에서 수행된다.
다능 세포는 세포를 배수로 생기게 하는 능력이 있지만 한정된 계통수를 갖는 다. 다능 세포의 예는, 몇몇의 혈액 세포 유형으로 발전될 수 있지만 뇌 세포 또는 다른 유형의 세포로는 발전될 수 없는 혈액 줄기 세포인 조혈 세포이다. 간엽 줄기 세포(MSC)는 오스테오블라스트(골 세포), 콘드로사이트(연골 세포) 및 아디포사이트(지방 세포)를 포함하는 다양한 세포 유형으로 분화할 수 있는 다능 줄기 세포이다.
체세포는 생식계열 세포(생식 세포), 생식 세포가 만들어지는 세포(가메토사이트), 다능 세포 및 만능 세포(생식 세포)를 제외한 유기체의 본체를 형성하는 임의의 유형의 세포이다. 체세포는 임의의 동물로부터 유도될 수 있지만, 바람직하게는 포유동물 세포, 가장 바람직하게는 인간 세포로부터 유도된다. 적절한 예는 간 세포, 예컨대 헤파토사이트, 췌장 세포, 예컨대 베타-세포, 상피세포 및 섬유아세포이고, 헤파토사이트 및 췌장 세포가 바람직하다.
본 발명의 방법이 본 발명의 짧은 RNA와 접촉하고 있는 세포 집단 내의 모든 세포의 유도를 달성하지 않을 수 있고, 실제로 달성할 필요가 없다는 것이 반드시 인지되어야 할 것이다. 그러므로, 일부 실시양태에서 적어도 50, 60, 70, 80 또는 90%가 인슐린을 생산하기 위해 유도됨에도 불구하고, 본 발명의 방법을 거치는 세포 집단(즉, 본 발명의 짧은 RNA와 접촉하고 있는 세포 집단)으로부터 바람직하게는 적어도 10, 20, 30, 35, 38, 40, 42 또는 45%, 예컨대 약 25 내지 55%, 30 내지 50%, 35 내지 50%가 인슐린을 생산하기 위해 유도된다.
본원에 사용된 용어 "RNA"는 하나 이상의 리보뉴클레오타이드 잔기를 포함하는 분자를 의미한다. "리보뉴클레오타이드"는 베타-D-리보-퓨라노즈 잔기의 2' 위치에 하이드록실 기를 갖는 뉴클레오타이드를 의미한다. 상기 용어는 하나 이상의 뉴클레오타이드의 추가, 결실, 치환 및/또는 변경에 의해 자연발생적 RNA와 다른 변경된 RNA뿐만 아니라, 이중 가닥 RNA, 단일 가닥 RNA, 단리된 RNA 예컨대 부분적으로 정제된 RNA, 본질적으로 순수한 RNA, 합성 RNA 및 재조합적으로 생산된 RNA를 포함한다. 상기 변형은 예컨대 RNA 말단 또는 내부로의(예를 들어, RNA의 하나 이상의 뉴클레오타이드에서) 비뉴클레오타이드 물질의 추가를 포함할 수 있다. 본 발명의 RNA 분자의 뉴클레오타이드는 또한 비표준 뉴클레오타이드 예컨대 비자연발생적 뉴클레오타이드, 화학적으로 합성된 뉴클레오타이드 또는 데옥시뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 이들 변경된 RNA는 유사체 또는 자연발생적 RNA의 유사체로 지칭될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "이중 가닥 RNA" 또는 "dsRNA"는 내생적 또는 인위적 siRNA, 짧은 헤어핀 RNA(shRNA) 및 마이크로 RNA(miRNA)를 포함하지만 이에 한정되지 않는 리보핵산 이중 가닥을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "짧은 간섭 RNA" 또는 "siRNA"는 하나 이상의 표적 RNA 전사물의 서열-특이적-매개 절단에 의하여 RNAi를 통해 유전자의 발현을 조절할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 전형적으로 RNAi에서, RNA 전사물은 mRNA이며, 이 표적의 절단은 유전자 발현의 하향 조절을 야기한다. 그러나, 본 발명에서, 표적 유전자의 상향 조절 또는 하향 조절은 관심있는 표적 유전자에 대해 각각 안티센스 또는 센스인 RNA 전사물의 절단에 의해 달성될 수 있다.
siRNA는 각각의 3' 말단에 짝을 이루지 못한 몇몇개의 염기를 갖고 3' 오버행을 형성하는 19 내지 25개 길이의 염기 쌍의 이중 가닥 RNA 분자이다. 바람직하게, 각각의 3' 오버행은 1 내지 3개 뉴클레오타이드 길이이고, 보다 바람직하게는 2개 길이이다. siRNA는 표적 RNA 전사물 영역에 대해 완전하게 또는 거의 완전하게 상보적인 서열을 갖는 하나의 가닥을 함유한다. RNA-유도된 침묵 복합체(RISC)로 공지된 단백질 복합체는 siRNA 이중 가닥의 이 가닥(가이드 가닥)을 혼입하고, 표적 RNA 전사물을 인식하기 위해 이를 주형으로 사용한다. RISC는 이후 혼입된 가닥에 대해 완전하게 또는 거의 완전하게 상보적인 표적 RNA 전사물의 절단에 관여한다. 표적 RNA 전사물에 영역에 대해 상보성을 갖지 않는 siRNA의 다른 가닥은 패신저(passenger) 가닥이라 일컬어진다.
siRNA 분자는 아니지만, RISC-관련 절단에 의해 완전한 또는 거의 완전한 상보성을 갖는 표적 RNA 전사물을 하향 조절할 수 있는 단일 가닥 또는 이중 가닥의 RNA 분자는 siRNA-유사 활성을 갖는다고 일컬어진다. 본 발명의 짧은 RNA 분자는 상기 활성을 갖는다.
"상보성(complementarity)" 및 "상보적인(complementary)"은, 예컨대 왓슨-크릭(Watson-Crick) 염기 짝짓기에 의해 제 1 핵산이 제 2 핵산과 수소 결합을 형성할 수 있는 것을 의미한다. 비-왓슨-크릭 염기 짝짓기를 통해 다른 핵산과 수소 결합을 형성할 수 있는 핵산은 또한 상보성을 갖는다는 정의 내에 포함된다. % 상보성은 제 2 핵산 서열과 수소 결합(예컨대, 왓슨-크릭 염기 짝짓기)을 형성할 수 있는 핵산 분자의 잔기의 백분율을 나타낸다(예컨대, 10개 당 5, 6, 7, 8, 9, 10개는 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 및 100% 상보적이다).
"완전하게 상보적인" 또는 "완전한 상보성"은 제 1 핵산 서열의 모든 연속적 잔기가 제 2 핵산 서열의 연속적 잔기의 동일한 수와 수소 결합을 형성하는 것을 의미한다. "거의 완전한" 상보적인은 본질적으로 제 1 핵산 서열의 모든 연속적 잔기가 제 2 핵산 서열의 연속적인 잔기의 동일한 수와 수소 결합을 형성하지만, 제 1 핵산이 불완전한 과정 예컨대 전사 또는 생물학적 분자의 이용을 수반하는 분자 생물학적 과정에 의해 제조된다는 사실에 기인하여, 제 1 서열이 제 2 서열과 100% 상보적이지 않을 수 있다는 것을 의미한다. 그러나, 제 2 서열의 상응하는 잔기와 수소 결합을 형성할 수 없는 제 1 서열의 잔기 수는 충분히 낮고, 이 2개의 핵산 서열은 수소 결합을 통해 원하는 목적을 위해 요구되는 정도로 여전히 결합된다. 전형적으로, "거의 완전한 상보적인"은 제 1 핵산 서열이 제 2 핵산 서열과 95% 이상의 상보성을 갖는 것을 의미한다.
"동일성", "동일한" 또는 "서열 동일성"은 제 1 핵산 서열이 제 2 핵산 서열과 서열이 동일하다는 것을 의미한다. % 동일성은 제 2 핵산 서열과 동일한 제 1 핵산 분자에 있는 잔기의 백분율을 나타낸다(예컨대, 10개 당 5, 6, 7, 8, 9, 10은 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 및 100% 동일하다).
"완전한 동일성" 또는 "완전히 동일한"은 제 1 핵산 서열의 모든 연속적 잔기가 제 2 핵산 서열의 연속적 잔기의 동일한 수와 동일하다는 것을 의미한다. "거의 완전한" 동일성은 본질적으로 제 1 핵산 서열의 모든 연속적 잔기가 제 2 핵산 서열의 연속적 잔기의 동일한 수와 동일하지만, 제 1 핵산이 불완전한 과정 예컨대 전사 또는 생물학적 분자의 사용을 수반하는 분자 생물학적 과정에 의해 제조되므로 제 1 서열이 제 2 서열과 100% 동일하지 않을 수 있다는 것을 의미한다. 그러나, 제 2 서열의 상응하는 잔기와 동일하지 않은 제 1 서열의 잔기의 수는 충분히 낮아서 2개의 핵산 서열은 여전히 주어진 목적을 위해서는 충분히 동일하다. 전형적으로, "거의 완전한 동일성"은 제 1 핵산 서열이 제 2 핵산 서열과 95% 이상의 동일성을 갖음을 의미한다.
본원에 사용된 서열 상보성 또는 동일성에 대한 모든 언급은 특별하게 언급되지 않는 한 짧은 RNA 분자의 전체 길이를 지칭한다.
짧은 RNA는 표적 RNA 전사물과 상보적이지 않은 매우 짧은 3' 또는 5' 서열을 포함할 수 있다. 바람직하게, 상기 서열은 3'이다. 상기 서열은 1 내지 5개, 바람직하게는 2 내지 3개, 예컨대 2 또는 3개 길이의 뉴클레오타이드일 수 있다. 상기 서열은 바람직하게는 우라실을 포함하거나 우라실로 이루어질 수 있고, 매우 가장 바람직하게 이는 2 또는 3개의 우라실의 3' 스트레치이다. 이 비상보성 서열은 "테일(tail)"로 지칭될 수 있다. 따라서, 짧은 RNA는 바람직하게 (i) 표적 RNA 영역에 대해 95% 이상의 상보성을 갖는 서열; 및 (ii) 바람직하게 우라실 잔기를 포함하거나 우라실 잔기로 이루어진 1 내지 5개의 뉴클레오타이드의 3' 테일로 이루어진다. 짧은 RNA는 따라서 전형적으로, 존재한다면 3' 테일을 제외하고, 표적 RNA 전사물의 전체 길이에 걸친 영역에 대해 상보성을 갖는다.
본원에 개시된 임의의 짧은 RNA 서열은 선택적으로 상기 3' 테일을 포함할 수 있다. 따라서, 표에 개시된 임의의 서열은 선택적으로 상기 3' 테일을 포함할 수 있다.
서열 정렬 및 % 동일성 또는 % 상보성 계산은 라자진(LASARGENE) 바이오인포매틱스 컴퓨팅 스위트(미국 위스콘신주 매디슨 소재의 디엔에이스타 인코포레이션 (DNASTAR Inc.))의 프로그램 메가라인(Megalign), 클러스털 브이(Clustal V) 정렬 방법(문헌[Higgims and Sharp (1989) CABIOS. 5:151-153]) 및 BLAST 2.0 프로그램 스위트를 비제한적으로 포함하는 당해 분야의 임의의 방법 또는 도구를 이용하여 측정될 수 있다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 예컨대 내셔널 센터 포 바이오테크놀로지 인포메이션(National Center for Biotechnology Information)을 통해 공개적으로 이용가능하다. 숙련자는 그의 원하는 목적에 맞추기 위해 이들 도구의 파라미터를 설정할 수 있을 것이다.
하나의 서열이 DNA 서열이고 다른 것이 RNA 서열인 제 1 및 제 2 핵산 서열의 동일성 또는 상보성을 평가할 때, RNA 서열이 우라실을 포함하는 반면 DNA 서열은 우라실 대신 티민을 포함한다는 것을 명심해야 한다. 그러므로, 이 예에서, 서열 동일성을 평가할 때 우라실 잔기는 티민 잔기와 동일한 것으로 간주되고, 상보성을 평가할때 우라실 잔기는 아데닌 잔기와 수소 결합을 형성하는/형성할 수 있는 상보성으로 간주된다.
유전자의 "억제" 또는 "하향 조절"은 본 발명의 짧은 RNA 분자의 부재시에 관찰되는 수준보다 낮은, 유전자 발현 수준, 유전자에 의해 암호화된 폴리펩티드의 수준 또는 이것의 활성도, 또는 유전자로부터 전사된 RNA 분자 수준의 감소를 의미한다. RNA 분자가 "하향 조절"되었다고 하면, 이는 RNA 분자 수준이 본 발명의 짧은 RNA 분자의 부재시에 관찰되는 수준보다 낮게 감소하는 것을 의미한다.
유전자의 "활성화" 또는 "상향 조절"은 본 발명의 짧은 RNA 분자의 부재시에 관찰되는 수준보다 높은, 유전자 발현 수준, 유전자에 의해 암호화된 폴리펩티드의 수준 또는 이것의 활성도, 또는 유전자로부터 전사된 RNA 분자 수준의 증가를 의미한다.
바람직하게, 본 발명의 모든 방법은 생체내 방법이 고려될지라도, 시험관내 또는 생체외에서 수행된다. 따라서, 이 방법들은 이전에 환자로부터 단리된 세포 또는 조직 샘플상에서 수행될 수 있다. 이 방법들은 확립된 세포주의 세포상에서 수행될 수 있다.
바람직하게, 상기 방법에서 사용된 "짧은" RNA 분자는 13 내지 30개의 뉴클레오타이드 길이, 보다 바람직하게는 16 내지 25개의 뉴클레오타이드 길이, 더욱 바람직하게는 17 내지 21개의 뉴클레오타이드 길이, 가장 바람직하게는 19, 20, 21, 22 또는 23개의 뉴클레오타이드 길이의 분자이다.
짧은 RNA 분자는 단일, 또는 바람직하게는 이중 가닥일 수 있다. 이중 가닥인 경우, 바람직하게 이중 가닥의 가닥 각각은 14개 이상, 보다 바람직하게는 18개 이상, 예컨대 19개의 뉴클레오타이드 길이이다. 바람직하게 이중 가닥은 12개 이상, 보다 바람직하게는 15개 이상, 보다 바람직하게는 17개, 보다 더 바람직하게는 19개 이상의 뉴클레오타이드 길이에 걸쳐 잡종화된다. 가닥 각각은 정확하게 19개 뉴클레오타이드 길이, 또는 19개의 뉴클레오타이드 더하기 3' 테일, 따라서 20, 21, 22, 23 또는 25개의 뉴클레오타이드 길이가 될 수 있다. 바람직하게 이중 가닥의 길이는 30개의 뉴클레오타이드 미만인데, 이는 이 길이를 초과하는 이중 가닥은 인터페론 반응 유도의 위험을 증가시킬 수 있기 때문이다. dsRNA 이중 가닥을 형성하는 가닥은 길이가 동일하거나 동일하지 않을 수 있다.
가장 바람직하게 짧은 RNA 분자는 짧은 간섭 RNA(siRNA) 분자이다.
선택적으로, 짧은 RNA 분자는 각 가닥의 3' 말단에서 수많은 짝지어지지 않은 뉴클레오타이드가 3' 오버행을 형성하며 안정하게 염기쌍을 이룬 2개의 가닥으로 이루어진 dsRNA 분자이다. 각각의 가닥에서 3' 오버행을 형성하는 짝지어지지 않은 뉴클레오타이드의 수는 바람직하게는 1 내지 5개 뉴클레오타이드, 보다 바람직하게는 1 내지 3개 뉴클레오타이드 및 가장 바람직하게는 2개 뉴클레오타이드이다. 3' 오버행은 상기에 언급된 3' 테일로 형성될 수 있고, 따라서 3' 테일은 3' 오버행일 수 있다.
짧은 RNA 분자는 반드시 효과적이고 특이적으로 표적 RNA 전사물을 하향 조절해야한다. 상기 언급된 바와 같이, 이는 표적 RNA 전사물의 서열에 대해 높은 정도의 상보성을 갖는 짧은 RNA에 의해 달성될 수 있다. 짧은 RNA는 표적 RNA 전사물 영역과 불일치가 5개 이하, 바람직하게는 4 또는 3개 이하, 보다 바람직하게는 2개 이하, 보다 더 바람직하게는 1개 이하, 가장 바람직하게는 없다.
2개 이상의 서열의 상보성 정도의 측정은 당해 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 수행될 수 있다. 바람직하게는, 사용된 방법은 상기 호스바흐(Hossbach) 등에 의해 설명된 것이다. 이 방법에 따르면, 웹사이트 [http://www.mpibpc.mpg.de/groups/luehrmann/siRNA]에서 이용가능한 펄(Perl) 스크립트가 사용된다.
또한, 짧은 RNA 분자를 디자인하고 분석하기 위한 다양한 도구가 널리 공지되어 있으며, 이는 당해 분야의 숙련자가 표적 RNA 전사물의 효과적이고 특이적인 하향 조절을 달성할 수 있는 RNA 분자를 측정하는 것을 가능하게 한다. 확립된 방법은 예컨대 쥐피부스트(GPboost) 및 레이놀즈(Reynolds) 알고리즘(PMID: 15201190, 14758366)을 포함한다. 또한, 짧은 RNA가 표적 RNA의 효과적인 하향 조절을 야기할 수 있는 능력은 세포의 RNA 수준 또는 단백질 수준을 측정하기 위한 표준 기술을 이용하여 평가될 수 있다. 예컨대, 본 발명의 짧은 RNA는 배양 세포에 옮겨질 수 있고, 표적 RNA 수준은 노던 블랏 또는 도트 블랏 테크닉을 비제한적으로 포함하는 기술에 의해, 또는 정량적 RT-PCR에 의해 측정될 수 있다.
바람직하게, 짧은 RNA는 모티프 aaaa, cccc, gggg 또는 uuuu를 갖지 않는다. 바람직하게, 짧은 RNA는 20% 이상 및 75% 이하, 즉 20 내지 75%, 바람직하게는 20 내지 55%의 GC-백분율을 갖는다. 상기 방법의 짧은 RNA는 이상적으로 열역학적으로 안정한 이중 가닥이며, 이 경우, 가닥 각각의 GC-백분율은 25% 이상 및 75% 이하, 즉 25 내지 75%, 바람직하게는 20 내지 55%이다.
RNA가 모티프 aaaa, cccc, gggg 또는 uuuu를 갖는지 갖지 않는지를 측정하고, 분자/가닥의 GC 함량 백분율을 측정하기 위한 도구 및 알고리즘이 당해 분야의 숙련자에게 공지되어 있다. 상기 도구는 문헌[Saetrom and Snove, (2004) Biochem Biophys Res Commun 321:247-253] 및 문헌[Vert et al., (2006) BMC Bioinformatics 7:520(17 pages)]에 기술되고 참고된 것을 포함한다.
짧은 RNA는 RISC 단백질 복합체에 혼입되어 있는 짧은 RNA 가닥과 제한적인 수로 불일치를 갖는 비표적 전사물의 하향 조절을 유도할 수 있다. 이는 짧은 RNA 분자의 효율을 감소시키고, 따라서 바람직하지 않다. 따라서, 짧은 RNA 분자는 의도하지 않는 표적을 벗어나는 효과를 방지하기 위하여, 의도하는 표적 외의 전사물에 제한적인 상보성을 가져야 한다. 절단을 기초로 하는 표적을 벗어나는 효과를 갖는 짧은 RNA 후보의 가능성은 비표적 RNA 서열에 대한 이의 상보성의 작용이고, 당해 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 측정될 수 있다. 선택적으로, 비간극 스미스-워터만(Smith-Waterman) 방법(문헌[TF Smith & MS Waterman (1981) Journal of molecular biology 147: 195-197])은 짧은 RNA의 잠재적인 표적을 벗어난 전사물을 식별하기 위한, 앙상블(Ensembl)(문헌[Flicet, P., et al. (2008) Ensembl 2008. Nucleic Acids Res 36: D 707-714])의 인간 전사체 데이타베이스(문헌[ Snove, O., Jr., et al. (2004) Biochem Biophys Res Commun 325: 769-773])와 비교하여 짧은 RNA 후보를 선별하는데 이용될 수 있다. 선택적으로, 짧은 RNA는 선택된 RNA 서열의 집단, 예컨대, 전체 앙상블 인간 전사체 데이타베이스를 포함하지 않는 진뱅크(GenBank) 서열의 선별과 비교하여 선별될 수 있다. 선택적으로, 해밍(Hamming) 거리 측정이 이용될 수 있다.
바람직하게, 짧은 RNA 분자는 식별된 표적을 벗어난 전사체에 대해 2개 초과의 불일치를 가질 수 있다. 선택적인 관점에서, 바람직하게 짧은 RNA 분자는 모든 표적을 벗어날 가능성이 있는 전사물에 대해 2 이상의 해밍 거리를 갖는다. 짧은 RNA가 이중 가닥인 경우, 바람직하게 두 가닥은 모두 이 요건을 만족한다.
선택적으로, 짧은 RNA 분자는 공지된 매우 효과적인 표준 siRNA와 공통적인 특성을 갖는다. 바람직하게, 짧은 RNA, 또는 이중 가닥인 경우 짧은 RNA의 하나 또는 두 가닥이 0.1 초과의 쥐피부스트 스코어를 갖는다. 쥐피부스트는 유전자 프로그래밍-기반의 siRNA 효능 예측 시스템으로 공지되어 있고, siRNA 가닥의 쥐피부스트 스코어를 측정하기 위해 사용되는 방법은 이의 내용이 본원에 참고로서 혼입되어 있는 문헌["Predicting the efficacy of short oligonucleotides in antisense and RNAi experiments with boosted genetic programming", Pal Saetrom (2004) Bioinformatics 20(17): 3055-3063]에 개시되어 있다. 선택적으로 또는 추가로, 짧은 RNA 분자는 매우 효과적인 siRNA와 관련된 특정 서열 특징을 갖는다. 본원에 참고로서 혼입된 레이놀즈에 의해 기술된 알고리즘(문헌[Reynolds et. al. (2004) Nature biotechnology 22(3):326-330])은 짧은 RNA가 이러한 유형의 특징을 충분히 가졌는지 갖지 않았는지를 결정할 수 있도록 해준다. 당해 분야의 숙련자는 그의 특정 목적을 위해 그의 역치를 정의하고 개선할 수 있을 것이다.
선택적으로, 짧은 RNA 분자는 매우 효과적인 siRNA와 결합된 위치-특이적 서열 모티프를 함유한다. siRNA 효능 예측 알고리즘은 당해 분야에 널리 공지되어 있으며, 매우 효과적인 siRNA와 결합된 모티프가 문헌[Saetrom and Snove, (2004) Biochem Biophys Res Commun 321: 247-253]에 기술되어 있으며, 이의 내용이 본원에 참고로서 혼입된다.
바람직하게, 짧은 RNA 분자는 세포의 RNAi 기구(machinery)에 직접 도입될 수 있거나, 세포의 RNAi 기구에 도입되기 전에 다이서에 의해 가공될 수 있다. 짧은 RNA가 세포의 RNAi 기구에 도입되기 전에 다이서에 의해 가공될 수 있는지 아닌지를 측정할 수 있는 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있으며, 예컨대 시험관내 다이서 분석 예컨대 문헌[Tiemann et al. (2010) RNA 16(6): 1275-1284] 및 문헌[Rose et al. (2005) Nucleic Acid Reaserch 33(13):4140-4156]에 개시되어 있다.
짧은 RNA 분자가 이중 가닥인 경우, 그리고 이 분자의 오직 하나의 가닥만이 효과적이고 특이적으로 표적 RNA 전사물을 하향 조절하는 경우, 바람직하게 그 가닥은 RISC 안으로 우선적으로 로딩된다. 하나의 가닥이 우선적으로 RISC로 로딩되는 이중 가닥 RNA 분자의 디자인은 당해 분야의 숙련자의 능력 이내이다. 예컨대, 표적 RNA 전사물을 표적화하는 짧은 RNA 분자 가닥의 5' 말단은 다른 가닥의 5' 말단보다 열역학적으로 덜 안정하게 만들어지거나 선택될 수 있다. 바람직하게, 이중 가닥 열역학적 말단 안정성은 크게 다를 수 있으며, 이에 따라 표적 RNA 전사물을 표적화하는 짧은 RNA 분자의 가닥의 5' 말단은 다른 가닥의 5' 말단보다 열역학적으로 덜 안정하다. 이중 가닥의 열역학적 말단 안전성(ΔΔG)의 차이의 절대값은 당해 분야의 임의의 방법 표준에 따라 계산될 수 있다. 선택적으로, 이중 가닥의 열역학적 말단 안전성(ΔΔG)의 차이의 절대값은 RNA폴드(RNAfold)(문헌[Hofacker et al., (2003) Nucleic Acid Research Vol. 31, No.13, pp 3429-3431])에 의해 이중 가닥의 말단에서 5 종결 뉴클레오타이드를 고려하여 계산된다. 바람직하게, RNA폴드에 의해 계산된 이중 가닥의 열역학적 말단 안전성(ΔΔG)의 차이의 절대값은 0kcal/mol 초과, 보다 바람직하게는 1kcal/mol 초과, 보다 바람직하게는 3kcal/mol 초과이다.
상기 언급된 바와 같이 짧은 RNA 디자인을 위한 많은 표준 도구는 분자의 이러한 특성을 평가하기 위한 수단을 제공한다. 예컨대, 하나의 가닥이 다른 가닥을 넘어 RNAi 기구로의 혼입을 선호하는 열역학적 특성을 갖는다면, 이중 가닥 분자가 선택될 수 있다. 선택적으로, 하나의 가닥의 우선적인 로딩은 하나 이상의 뉴클레오타이드의 추가, 결실, 치환 및/또는 변경에 의해 자연 발생적 RNA와 다른 RNA를 함유하는 dsRNA를 이용함으로써 달성될 수 있다. 이와 같은 변형은 당해 분야의 숙련자에게 널리 공지되어 있으며, 하기에 추가로 논의된다.
다이서는 외래의 dsRNA를 3' 오버행을 형성하는 각각의 3' 말단에서 몇몇 짝을 이루지 않는 염기를 갖는 19 내지 25개의 염기쌍으로 이루어진 이중 가닥 단편으로 절단하는 리보핵산가수분해효소 단백질이다. 상기 방법에서 사용된 짧은 RNA는 다이서-기질 siRNA(D-siRNA)일 수 있다. 다이서 기질로서 디자인된 siRNA는 표준 길이의 siRNA 및 shRNA에 비해 증가된 효력을 가질 수 있다.
D-siRNA는 가닥이 22 내지 30개의 뉴클레오타이드 길이인 비대칭 siRNA-이중 가닥이다. 전형적으로, 하나의 가닥(패신저 가닥)은 22 내지 28개의 뉴클레오타이드 길이, 바람직하게는 25개의 뉴클레오타이드 길이이고, 다른 가닥(가이드 가닥)은 24 내지 30개의 뉴클레오타이드 길이, 바람직하게는 27개의 뉴클레오타이드 길이이고, 이에 따라 상기 패신저 가닥의 3' 말단에서의 이중 가닥은 평활-말단(blunt-end)이고, 이중 가닥은 가이드 가닥의 3' 말단에 오버행을 갖는다. 오버행은 1 내지 3개의 뉴클레오타이드 길이이고, 바람직하게는 2개의 뉴클레오타이드 길이이다. 패신저 가닥은 또한 5' 포스페이트를 가질 수 있다.
전형적으로, D-siRNA에서, 패신저 가닥의 3' 말단에서의 2개의 뉴클레오타이드는 리보핵산(RNA)이기 보다는 데옥시리보핵산(DNA)이다. DNA 및 평활-말단 이중 가닥은 효소 다이서가 이중 가닥을, 본래 D-siRNA 패신저 및 가이드 가닥의 5' 및 3' 말단에 각각 21개의 뉴클레오타이드로 이루어진 21량체 이중 가닥으로 처리하는 것을 보장해 준다.
표준 19량체 siRNA 분자를 D-siRNA로 확장시키는 방법은 당해 분야에 공지되어 있으며, 예컨대 문헌[Hefner et al. (2008) J.Biomo. Tech. 19(4): 231-237]에 기술되어 있다.
27량체/25량체 D-siRNA로 확장되었을 때, 많은 siRNA 분자는 패신저 가닥의 3' 말단에서의 짝을 이루지 않은 염기의 예상되는 숫자가 가이드 가닥의 5' 말단에서의 짝을 이루지 않은 염기의 예상되는 숫자보다 적거나 같은 말단 구조를 갖는다. 공지된 miRNA의 구조 및 다이서 PAZ-도메인의 결합 요건을 기준으로, siRNA 분자가 유용하고, 이와 같은 이중 가닥이 다이서-기질 siRNA 분자로 확장되었을 때 덜 유용한 반면, 이 구조는 다이서 처리 등을 위한 차선이다. 그러므로, 바람직하게 본 발명의 짧은 RNA는 상기와 같은 구조를 포함하지 않고 오히려 패신저 가닥의 3' 말단에서의 짝을 이루지 않은 염기의 예상되는 숫자는 가이드 가닥의 5' 말단에서의 짝을 이루지 않은 염기의 예상되는 숫자보다 크다.
선택적으로, 상기 방법에서 사용된 짧은 RNA 분자는 변형, 즉, 하나 이상의 뉴클레오타이드의 추가, 결실, 치환 및/또는 변형에 의해 자연 발생적 RNA와 상이한 RNA를 포함할 수 있다. 예컨대, 짧은 RNA가 이중 가닥인 경우, dsRNA 분자의 두 가닥은 연결 성분, 예컨대 화학적 연결기 또는 올리고뉴클레오타이드 연결기에 의해 연결될 수 있으며, 이 연결은 dsRNA의 생성된 구조에 헤어핀 구조를 야기한다. 연결 성분은 dsRNA 활성을 차단하지 않거나 다르게는 dsRNA 활성에 부정적인 영향(예컨대 RISC 복합체로의 가닥의 로딩 또는 다이서와의 결합의 차단에 의함)을 미치지 않아야 한다. 많은 적합한 화학적 연결기가 당해 분야에 공지되어 있다. 올리고뉴클레오타이드 연결기가 이용된 경우, dsRNA의 온전한 작용이 유지되는 한 임의의 서열 또는 길이일 수 있다. 바람직하게, 연결기 서열은 다른 뉴클레오타이드 염기보다 많은 양의 우리딘 및 구아닌을 함유하며, 4 내지 9개, 보다 바람직하게는 8 또는 9개 잔기의 바람직한 길이를 갖는다.
변형이 다이서 기질로서의 작용으로부터의 RNA 조성을 방해하지 않는다면, 변형은 짧은 RNA에 포함될 수 있다. 하나 이상의 변형은 dsRNA의 다이서 처리를 향상시킬 수 있으며, 이는 보다 큰 RNAi 효과를 지지하는 보다 효과적인 RNAi의 생산을 야기하며, 이는 세포로 전달되기 위한 각각의 dsRNA 분자당 보다 큰 효능을 야기하고/하거나 치료적 설정에서 dsRNA의 안정성 보장에 도움을 준다.
변형은 3'-말단 영역, 5'-말단 영역, 3'-말단 및 5'-말단 둘 다의 영역 또는 일부의 경우 서열 내의 다양한 위치에서 혼입될 수 있다. 상기 언급된 제한을 염두해 두고, 변형의 수 및 조합은 RNA로 혼입될 수 있다. 다수의 변형이 존재하는 경우, 이들은 같거나 다를 수 있다. 염기, 당 잔기, 포스페이트 골격 및 이들의 조합의 변형이 고려된다. 5'-말단이 인산화될 수 있다.
짧은 dsRNA 분자는 패신저 가닥의 3' 말단에 위치한 적절한 변경유전자에 의해 다이서 처리를 위해 변형될 수 있다. 즉, dsRNA는 다이서 결합 및 처리의 방향을 향하도록 디자인된다. 적절한 변경유전자는 뉴클레오타이드, 예컨대 데옥시리보뉴클레오타이드, 다이데옥시리보뉴클레오타이드, 비환형뉴클레오타이드 등, 및 입체 장애 분자, 예컨대 형광 분자 등을 포함한다. 비환형뉴클레오타이드는 정상적으로 dNMP에 존재하는 2'-데옥시리보퓨라노실 당을 2-하이드록시에톡시메틸 기로 치환한다. 다른 뉴클레오타이드 변경유전자는 3'-데옥시아데노신(코디세핀), 3'-아지도-3'-데옥시티미딘(AZT), 2',3'-다이데옥시노신(ddl), 2',3'-다이데옥시-3'-티아시티딘(3TC), 2',3'-다이데하이드로-2',3'-다이데옥시티미딘(d4T) 및 3'-아지도-3'-데옥시티미딘(AZT), 2',3'-다이데옥시-3'-티아시티딘(3TC) 및 2',3'-다이데하이드로-2',3'-다이데옥시티미딘(d4T)의 모노포스페이트 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 데옥시뉴클레오타이드는 변경유전자로서 사용될 수 있다. 뉴클레오타이드 변경유전자가 이용되는 경우, 1,3-뉴클레오타이드 변경유전자 또는 2 뉴클레오타이드 변경유전자는 패신저 가닥의 3' 말단에서 리보뉴클레오타이드를 치환한다. 입체 장애 분자가 사용되는 경우, 패신저 가닥의 3' 말단에서 리보뉴클레오타이드에 부착된다. 따라서, 가닥의 길이는 변경유전자가 혼입되어도 변형되지 않는다. 선택적으로, 2개의 DNA 염기는 다이서 처리의 방향을 향하도록 dsRNA에서 치환된다. 선택적으로, 2개의 말단 DNA 염기는 가이드 가닥의 5' 말단 및 패신저 가닥의 3' 말단에서 이중 가닥의 평활-말단을 형성하는 2개의 리보뉴클레오타이드 대신에 패신저 가닥의 3' 말단에 위치하고, 2개의 뉴클레오타이드 RNA 오버행은 가이드 가닥의 3' 말단에 위치한다. 이는 평활 말단의 DNA 및 오버행 말단의 RNA 염기와의 비대칭적인 조성이다.
포스페이트 골격을 위해 고려되는 변형의 예는 포스포네이트, 예컨대 메틸포스포네이트, 포스포로티오에이트, 및 포스포트라이에스터 변형, 예컨대 알킬포스포트라이에스터 등을 포함한다. 당 잔기를 위해 고려되는 변형의 예는 2'-알킬 피리미딘, 예컨대 2'-O-메틸, 2'-플루오로, 아미노 및 데옥시 변형 등을 포함한다(예컨대 아마즈구이오우이(Amarzguioui) 등의 문헌(2003) 참고). 염기 기를 위해 고려되는 변형의 예는 아바식(abasic) 당, 2-O-알킬 변형된 피리미딘, 4-티오우라실, 5-브로모우라실, 5-요오도우라실 및 5-(3-아미노알릴)-우라실 등을 포함한다. 잠금 핵산(LNA)이 또한 혼입될 수 있다. 많은 다른 변형이 공지되어 있고 상기 기준을 만족하는 한 사용될 수 있다.
본 발명의 짧은 RNA 분자는 또한 부분적으로 정제된 RNA, 실질적으로 순수한 RNA, 합성 RNA 또는 재조합적으로 생산된 RNA를 포함한다. 짧은 RNA의 다른 가능한 변경은, 비뉴클레오타이드 물질의 짧은 RNA 말단 또는 짧은 RNA의 하나 이상의 내부 뉴클레오타이드로의 첨가; 핵산가수분해효소의 소화에 대해 내성이 있는 짧은 RNA를 만들기 위한 변형(예컨대 2'-치환된 리보뉴클레오타이드의 사용 또는 당-포스페이트 골격에 대한 변형), 또는 짧은 RNA의 하나 이상의 뉴클레오타이드의 데옥시리보뉴클레오타이드로의 치환을 포함한다.
짧은 RNA가 이중 가닥인 경우, 바람직하게 두 가닥은 상기 언급된 바와 같이 표적 RNA 전사물을 효과적이고 특이적으로 하향 조절할 수 있다. 이와 같은 다기능 siRNA 분자의 디자인 방법이 문헌[Hossbach et al., (2006) RNA Biology 3(2): 82-89]에 개시되어 있으며, 이의 내용은 참고로서 본원에 혼입된다.
짧은 RNA가 이중 가닥이고, 두 가닥이 상기 언급된 바와 같이 표적 RNA 전사물을 효과적이고 특이적으로 하향 조절할 수 있는 경우, 바람직하게는 이중 가닥의 열역학적 말단 안정성은 큰 차이가 없다.
이중 가닥의 열역학적 말단 안정성(ΔΔG)의 차이의 절대값은 당해 분야의 임의의 방법 표준에 따라 계산될 수 있다. 선택적으로, 이중 가닥의 열역학적 말단 안정성(ΔΔG)의 차이의 절대값은 RNA폴드(문헌[Hofacker et al., (2003) Nucleic Acid Research Vol. 31, No.13, pp 3429-3431])에 의해 이중 가닥의 말단에서 5 종결 뉴클레오타이드를 고려하여 계산될 수 있다. 바람직하게, RNA폴드에 의해 계산된 이중 가닥의 열역학적 말단 안전성의 차이의 절대값은 3kcal/mol 미만, 보다 바람직하게는 1kcal/mol 미만이다.
본 발명의 방법에서, 인슐린 생산의 유도는 상향 조절, 즉, 표적 특수화된 유도 유전자 MafA를 활성화시킴으로써 달성된다. 상향 조절은 "시스(cis)" 상향 조절이다. 이 맥락에서 "시스" 상향 조절은 표적 RNA 전사물이 표적 유전자 MafA의 좌위와 결합된 좌위에서부터 전사된다는 것을 의미한다.
표적 RNA 전사물은 표적 유전자의 전사 시작 부위의 500 뉴클레오타이드 상류까지 또는 500 뉴클레오타이드 하류까지의 좌위로부터 전사된다.
본 발명의 표적 RNA 전사물의 맥락에서, 용어 "[특정 좌위]로부터 전사된다"는 "표적 RNA 전사물의 전사 시작 부위가 [특정 좌위]에서 발견되는 것"을 의미한다. 표적 RNA 전사물의 전사 시작 부위는, 표적 RNA 전사물의 다른 필수적인 특징이 존재한다면, 표적 유전자를 함유하는 염색체의 모든 가닥에서 발견될 수 있다.
표적 RNA 전사물은 표적 유전자 전사 시작 부위의 500, 250 또는 100 뉴클레오타이드 상류와 표적 유전자 전사 종결 부위의 500, 250 또는 100 뉴클레오타이드 하류 사이에 위치하는 게놈 서열에 대한 안티센스인 서열을 포함한다. 선택적으로, 표적 RNA 전사물은 표적 유전자의 암호화 영역을 포함하는 게놈 서열에 대한 안티센스인 서열을 포함한다.
본 발명의 문맥에서 핵산 서열을 기술할 때 사용된 용어 "센스"는 서열이 표적 유전자의 암호화 가닥상의 서열에 대해 동일성을 갖는다는 것을 의미한다. 본 발명의 문맥에서 핵산 서열을 기술할 때 사용된 용어 "안티센스"는 서열이 표적 유전자의 암호화 가닥상의 서열에 대해 상보적이라는 것을 의미한다.
유전자의 "암호화 가닥"은 유전자의 mRNA를 위한 암호화 서열을 함유하는 가닥이다. 유전자의 "주형 가닥"은 유전자의 mRNA를 위한 암호화 서열을 함유하지 않은 가닥이다.
용어 "상보적인" 및 "상보성"은 상기에 정의되어 있다. 바람직하게, 표적 RNA 전사물은 표적 유전자의 암호화 가닥상의 서열에 대한 전장에 따라, 75% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 보다 더 바람직하게는 95% 이상의 상보적 서열을 포함한다. 바람직하게 표적 RNA 전사물은 표적 유전자의 암호화 가닥상의 서열에 대한 전장에 따라, 완전한 또는 거의 완전한 상보성을 갖는 서열을 포함한다.
선택적으로, 표적 RNA 전사물은 하나 이상, 통상적으로 몇몇개(예컨대 3개 이상 또는 6개 이상)의 표적 유전자의 암호화 가닥상의 서열에 대해 완전한 또는 거의 완전한 상보성을 갖는 비간극 서열을 포함하며, 상기 비간극 서열은 16개 이상의 뉴클레오타이드, 보다 바람직하게는 25개 이상의 뉴클레오타이드, 보다 바람직하게는 50개 이상의 뉴클레오타이드, 보다 더 바람직하게는 75개 이상의 뉴클레오타이드, 가장 바람직하게는 100개 이상의 뉴클레오타이드 길이이다.
RNA 전사물과 상기 언급된 게놈 서열 사이의 동일성/상보성을 평가할 때, 암호화/주형 가닥은 유전자의 전사된 영역의 상류 및 하류의 신장이 고려된다. 즉, 용어 "암호화 가닥" 및 "주형 가닥"은 단지 실제 가닥에 대한 표지이고, 어떠한 길이의 제한도 지칭하지 않는다.
표적 RNA 전사물은 암호화 RNA 분자 즉, 아미노산 서열을 암호화하는 RNA 분자, 또는 비암호화 RNA 분자, 즉 아미노산 서열을 암호화하지 않는 RNA 분자이다. 바람직하게 표적 RNA 전사물은 비암호화 RNA이다.
표적 RNA 전사물은 바람직하게는 16개 이상의 뉴클레오타이드 길이이다. 그러나, 바람직하게 표적 RNA 전사물은 100개 이상, 보다 바람직하게는 200개 이상의 뉴클레오타이드 길이이며, 가장 바람직하게는 1,000개 이상의 뉴클레오타이드 길이이고, 4,000개 이상의 뉴클레오타이드 길이일 수 있다.
표적 RNA 전사물은 표적 유전자의 암호화 가닥상의 게놈 서열에 대해 상보적인 서열을 포함한다.
선택적으로, 표적 RNA 전사물이 안티센스인 게놈 서열은 표적 유전자의 프로모터 영역의 부분을 포함한다. 이 특성을 기술하는 또다른 방법은 안티센스 표적 RNA 전사물이 표적 유전자의 프로모터 영역에 "오버랩(overlap)"된다는 것이다. 유전자는 다수의 프로모터 영역을 가질 수 있고, 이 경우 표적 RNA 전사물은 1, 2 또는 그 이상의 프로모터 영역과 오버랩될 수 있다. 주석이 달린 유전자 자리의 온라인 데이타베이스가 유전자의 프로모터 영역을 확인하기 위해 사용될 수 있다.
임의의 주어진 프로모터 영역에서, 전체 프로모터 영역이 오버랩될 필요는 없으며, 프로모터 영역 이내의 하위 서열이 표적 RNA 전사물에 의해 오버랩되는 것으로 충분하다(즉, 오버랩은 부분적인 오버랩일 수 있다). 마찬가지로, 전체 표적 RNA 전사물이 프로모터 영역 이내의 서열에 대해 안티센스일 필요는 없으며, 표적 유전자의 RNA 전사물이 프로모터 영역에 대해 안티센스인 서열을 포함하는 것만이 필요하다.
표적 RNA 전사물과 표적 유전자의 프로모터 영역 사이의 오버랩 영역은, 바람직하게는 15개 이상의 뉴클레오타이드 길이, 보다 바람직하게는 25개 이상의 뉴클레오타이드 길이, 보다 바람직하게는 50개 이상의 뉴클레오타이드 길이, 보다 바람직하게는 75개 이상의 뉴클레오타이드 길이, 가장 바람직하게는 100개 이상의 뉴클레오타이드 길이일지라도, 단일 뉴클레오타이드 길이 정도로 짧을 수 있다. 하기 각각의 특이적인 배열이 용어 "오버랩"의 범위안에 속하는 것으로 의도된다:
(a) 표적 RNA 전사물 및 표적 유전자의 프로모터 영역은 길이가 동일하며, 이들은 이들 전체 길이에 걸쳐 오버랩된다(즉, 이들은 상보적이다);
(b) 표적 RNA 전사물은 표적 유전자의 프로모터 영역보다 짧으며, 표적 유전자의 프로모터 영역과 이의 전체 길이에 걸쳐 오버랩된다(즉, 표적 RNA 전사물은 이의 전체 길이에 걸쳐 표적 유전자의 프로모터 영역 이내의 서열에 대해 상보적이다);
(c) 표적 RNA 전사물은 표적 유전자의 프로모터 영역보다 길고, 표적 유전자의 프로모터 영역은 표적 RNA 전사물에 의해 완전히 오버랩된다(즉, 표적 유전자의 프로모터 영역은 이의 전체 길이에 걸쳐 표적 RNA 전사물 이내의 서열에 대해 상보적이다);
(d) 표적 RNA 전사물 및 표적 유전자의 프로모터 영역은 길이가 동일하거나 상이하고, 오버랩 영역은 표적 유전자 전사물의 길이 및 표적 유전자의 프로모터 영역의 길이 둘 다보다 짧다.
상기 정의된 "오버랩"은 명세서에서 필요한 부분만 약간 수정하여 다른 오버랩 서열의 설명에 적용할 수 있다. 명확하게, 안티센스 RNA 전사물이 프로모터 영역이 아닌 표적 유전자 영역과 오버랩되었다고 기술되어 있는 경우, 전사물의 서열은 프로모터 영역 이내가 아닌 영역 이내의 서열에 대해 상보적이다.
바람직하게, RNA 전사물은 표적 유전자의 전사 시작 부위를 포함하는 유전자 서열에 대해 안티센스인 서열을 포함한다. 달리 말해, 바람직하게 표적 RNA 전사물은 표적 유전자의 전사 시작 부위와 오버랩되는 서열을 포함한다.
이론에 얽매이려는 것은 아니지만, 본 발명의 짧은 RNA가, 표적 유전자 MafA 영역에 대해 안티센스인 표적 RNA 전사물의 siRNA-유사 절단 유도에 의해, 표적 유전자 MafA의 조절이 달성할 수 있는 것으로 여겨진다. 본 발명의 짧은 RNA는 아고너트(Argonaute) 단백질과 함께 복합체 형태로, 염색질-변형 단백질의 조절을 위한 앵커(anchor)로서 작용할 수 있다. 정확한 기전은 공지되지 않았지만, 표적 RNA 전사물이 관찰되어야 하는 효과를 위해 세포에 반드시 존재해야 한다는 것은 분명하다.
세포에 존재하는 표적 RNA 전사물을 측정하는 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 그러나 본 발명의 목적을 위해, 표적 유전자에 대해 안티센스인 임의의 RNA 전사물의 확실한 확인은 사실 요구되지 않는다. 따라서, 상기 비암호화 RNA 전사물(즉, 하향 조절될 표적 전사물)의 존재는 측정될 필요가 없다. 본원의 발명자는, 유전자의 전사 시작 부위를 둘러싸고 있는 영역에서 유전자의 암호화 가닥의 뉴클레오타이드 서열이 얻어진 경우, 즉, 서열 분석에 의해 측정되거나 데이타베이스에서 발견되고, 이 영역에 대해 역으로 상보적인 RNA 서열이 결정된 경우, 후자의 서열에 대해 상보적인 짧은 RNA 분자가 표적 유전자를 상향 조절하기 위해 사용될 수 있음을 발견하였다. 상보성 요건은 본원의 도처에 논의되어 있다. 유전자의 전사 시작 부위를 둘러싸고 있는 영역은 전사 시작 부위의 100, 200, 300, 400, 500, 800, 1,000 또는 2,000개의 뉴클레오타이드 상류와 하류 사이에 위치한 영역이다.
이론에 얽매이려는 것은 아니지만, 작용의 saRNA 기전이 예컨대 폴리콤(Polycomb) 군 단백질을 통한 염색질 개조(remodeling)를 수반할 수 있는 것으로 여겨진다. 폴리콤 군 단백질은 프로모터-결합된 RNA를 포함하는 ncRNA와 분명하고 직접적으로 상호작용할 수 있고, 프로모터를 보충하고, 침묵화에 영향을 미친다. 따라서 saRNA는, 상기 폴리콤-보충 ncRNA와 간섭함으로써 프로모터에서 폴리콤 수준을 감소시키고 "확실한" 염색질 개조 복합체 예컨대 트리토렉스(Trithorax) 군 단백질이 확실한 히스톤 표시를 확립할 수 있도록 한다.
"표적 유전자" 또는 "관심 유전자"는 유전자의 발현이 조절되기를 바라는 유전자이며, 본원의 표적 유전자에 대한 임의의 언급은 바람직하게는 MafA로 이해되어야 한다. 상기 설명된 바와 같이, 표적 유전자는 인슐린인 표적 단백질을 암호화하고 있는 유전자와 구별된다. 따라서 "표적 단백질"에 대한 임의의 언급은 바람직하게는 인슐린을 의미하는 것이 이해되어야 한다. 표적 유전자를 함유하는 세포는 바람직하게는 인간 세포이다. "표적 mRNA" 서열은 표적 유전자로부터 유도된 mRNA 서열이다.
특수화-유도 유전자는 상향 조절되었을 때, 세포가 특수화되는 유전자이다. 본원의 특수화 유전자에 대한 임의의 언급은 바람직하게는 MafA에 대한 언급이다.
상기 언급된 방법은 표적 유전자 MafA(즉, 하나 이상의 표적 특수화-유도 유전자)를 상향 조절하기 위한 짧은 RNA의 사용을 요구한다. 따라서 이 방법은 추가의 특수화(인슐린-생산) 유도 유전자가 추가의 짧은 RNA의 사용에 의해, 또는 당해 분야에 공지된 다른 수단에 의해 활성화되는 것을 가능하게 해 준다. 바람직하게, 상기 방법은 PDX1, 뉴로제닌 3(Ngn3), Rfx6, MafA, Hlxb9, Hnf6, Ptf1a, 뉴로D, Nkx6-1 및 (프로)인슐린, 보다 바람직하게는 PDX1, Ngn3, Rfx6 및 MafA로 이루어진 군으로부터 선택된 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개 표적 유전자의 상향 조절을 포함하고, 상기 짧은 RNA는 바람직하게는 본원에 설명된 원리를 확인한다. 이들 표적 유전자의 임의의 조합이 고려된다.
본 발명의 방법은 추가로 세포를 적절한 인자에 접촉시키는 것을 포함한다. 적절한 인자는 바람직하게는 글루코스, 액티빈(activin), 엑센딘(exendin)(바람직하게는 엑센딘-4), 노긴(noggin), FGF, 니코틴아마이드, 톨부트아민, IGF-II, HGF 및/또는 EGF로부터 선택될 수 있다. 하나의 실시양태에서, 세포는 글루코스(바람직하게는 약 2.5mM 또는 2.5nM) 및/또는 액티빈 A(바람직하게는 약 10ng)와 1일 이상, 바람직하게는 2 내지 4일, 예컨대 3일 동안 접촉된다. 하나의 실시양태에서, 세포는 글루코스(바람직하게는 약 11mM 또는 11nM), 엑센딘(바람직하게는 약 5ng), 노긴(바람직하게는 50ng), FGF(바람직하게는 5ng) 및/또는 EGF(바람직하게는 5ng)와 약 6일, 예컨대 4 내지 8일 동안 접촉된다. 상기 접촉은 적절한 간격, 예컨대 매 3일 마다 반복될 수 있다. 하나의 실시양태에서, 세포는 먼저 글루코스 및 액티빈 A와 약 3일 동안 접촉되고, 이후 3 및 6일에 글루코스, 엑센딘, 노긴, FGF 및 EGF와 접촉된다. 하나의 실시양태에서, 세포는 바람직하게는 9일에, 니코틴아마이드(바람직하게는 약 10mM), IGF-II(바람직하게는 약 50ng), HGF(바람직하게는 약 10ng), 엑센딘-4(바람직하게는 약 25ng) 및 액티빈 A(바람직하게는 10ng)와 접촉된다. 바람직하게는, 페니실린, 스트렙토마이신 및 글루타민이 이 기간과 단계에 존재하지 않는다. 예시적인 작업 흐름이 도 7 및 9에 나타나 있다. 이 도에 나타나 있는 작업 절차의 각각의 단계는 독립된 실시양태를 나타낸다.
본 발명의 방법에서, 세포 또는 세포 집단은 본 발명의 짧은 RNA 분자와 접촉된다. 짧은 RNA 분자는 본원의 짧은 RNA와 결합한 임의의 적절한 전달 시약에 의해 시험관내 또는 생체내에서 상기 세포에 투여될 수 있다. 상기의 적절한 전달 시약은 미루스 트랜짓(Mirus Transit) TKO 친유성 시약, 리포펙틴, 리포펙타민; 셀펙틴을 포함하며, 또는 다가 양이온(예컨대 폴리리신), 바이러스계 입자, 전기천공법 또는 리포좀을 포함한다. 바람직한 전달 시약은 리포좀이다. 리포좀을 제조하기 위한 많은 방법이 공지되어 있으며, 예컨대 문헌[Szoka et al. (1980), Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9:467] 및 미국특허 제 4,235,871 호 및 제 5,019,369 호에 개시되어 있으며, 이의 전체의 개시 내용이 참고로서 본원에 혼입된다. 세포를 saRNA에 접촉시키는 단계는 또한 "형질감염"이라고 일컬어질 수 있다.
특히 바람직하게, 본원의 짧은 RNA를 캡슐화하는 리포좀은 단핵세포인 대식세포 및 세망내피계에 의해 제거되는 것을 피하기 위하여 (예컨대, 구조의 표면에 결합되어 있는 식균작용-억제 잔기를 갖도록) 변형된다. 하나의 실시양태에서, 본 발명의 리포좀은 식균작용 억제 잔기 및 리간드 둘 다를 포함할 수 있다.
짧은 RNA를 발현하는 재조합 플라스미드는 직접, 또는 미루스 트랜짓 LT1 친유성 시약, 리포펙틴, 리포펙타민; 셀펙틴을 포함하며, 또는 다가 양이온(예컨대 폴리리신) 또는 리포좀을 포함하는 적절한 전달 시약과 결합하여 투여될 수 있다. 짧은 RNA를 발현하는 재조합 바이러스 벡터 및 상기 벡터를 세포에 전달하기 위한 방법이 당해 분야에 공지되어 있다.
바람직하게, 상기의 접촉 단계는, 매일 또는 매 2, 4, 또는 5일일 수도 있지만, 한번 초과, 바람직하게는 매 3일 동안 수행된다. 접촉은 바람직하게는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15일 동안 수행되고, 약 6 또는 9일이 바람직하다.
상기 방법에서, 하나 초과의 표적 유전자가 상향 조절된 경우, 다른 표적 유전자를 상향 조절하기 위해 사용된 짧은 RNA는 상이한 빈도 및 상이한 시간의 길이동안 투여될 수 있다. 사용되는 특정 투여 체제는 당해 분야의 숙련자에 의해 그의 원하는 목적, 특정 출발 세포 유형 및 전달 방법에 알맞도록 손쉽게 결정될 수 있다. 예를 들어, 피코몰 농도의 본 발명의 짧은 RNA 분자가 사용될 수 있다.
본 발명의 짧은 RNA는 단독으로 또는 고려되는 특정 방법에 영향을 미친다고 공지되어 있는 다른 활성화제와 결합하여 제공될 수 있다. 다른 활성화제가 본 발명의 짧은 RNA와 동시에, 독립적으로 또는 연속적으로 투여될 수 있다. 따라서, 단일의 본 발명의 짧은 RNA, 본 발명의 짧은 RNA의 2개 이상의 조합, 또는 가능하다면 상기 짧은 RNA와 다른 활성 물질의 조합을 사용하는 것이 가능하다.
본 발명의 모든 양상의 중요한 특징은 본 발명의 짧은 RNA를 갖는 표적화 안티센스 RNA 전사물이 표적 유전자의 상향 조절을 야기한다는 것이다.
본 발명의 짧은 RNA 분자는 적절한 방법, 예컨대 합성적으로, 또는 당해 분야의 숙련자에게 널리 공지된 표준 분자 생물학 기술을 이용한 세포에서의 발현을 통해 생산될 수 있다. 예컨대 짧은 RNA는 화학적으로 합성될 수 있거나 당해 분야에 공지된 방법, 예컨대 투슐(Tuschl) 등의 미국특허공개 제 2002/0086356 호에 기술되어 있는 드로소필라(Drosophila) 시험관내 시스템 또는 문헌[Verma and Eckstein et al. (1998) Annu Rev Biochem 67: 99-134]에 기술되어 있는 RNA 분자 합성 방법을 이용하여 재조합적으로 합성될 수 있으며, 이들의 전체 개시 내용은 참고로서 본원에 혼입된다. 본 발명의 짧은 RNA는 적절하게 보호된 리보뉴클레오사이드 포스포라미디트 및 전통적인 DNA/RNA 합성기를 사용하여 화학적으로 합성될 수 있다. 짧은 RNA 분자가 이중 가닥이라면, 이들은 2개의 독립된 상보적인 RNA 또는 2개의 상보적인 영역을 갖는 단일 RNA로 합성될 수 있다. 합성 RNA 분자 또는 합성 시약의 상업적인 공급자는 프롤리고(Proligo, 독일 함부르크 소재), 다르마콘 리서치(Dharmacon Research, 미국 콜로라도주 라파이에트 소재), 피어스 케미칼(Pierce Chemical, 미국 일리노이주 락포드 소재의 퍼비오 사이언스(Perbio Science) 지점), 글렌 리서치(Glen Research, 미국 버지니아주 스털링 소재), 켐진스(ChemGenes, 미국 메사추세스주 애쉬랜드 소재) 및 크루아켐(영국 글래스고 소재)을 포함한다.
짧은 RNA는 또한 임의의 적절한 프로모터를 이용하여 재조합 환형 또는 선형 DNA 플라스미드로부터 발현될 수 있다. 플라스미드로부터 본 발명의 짧은 RNA를 발현시키기 위한 적절한 프로모터는 예컨대 U6 또는 H1 RNA pol III 프로모터 서열 및 거대세포 바이러스 프로모터를 포함한다. 다른 적절한 프로모터의 선택은 당해 분야의 기술에 속한다. 본 발명의 재조합 플라스미드는 또한 특정 조직 또는 특정 세포내 환경에서 짧은 RNA의 발현을 위해 유도 또는 조절가능한 프로모터를 포함할 수 있다.
재조합 플라스미드로부터 발현되는 짧은 RNA는 표준 기술에 의해 배양된 세포 발현 시스템으로부터 단리될 수 있다. 본 발명의 이중 가닥 짧은 RNA는 2개의 독립된 상보적인 RNA 분자 또는 2개의 상보적 영역을 갖는 단일 RNA 분자로서 재조합 플라스미드로부터 발현될 수 있다.
본 발명의 짧은 RNA의 발현을 위한 적절한 플라스미드, 짧은 RNA의 발현을 위한 핵산 서열을 플라스미드에 삽입하는 방법, 및 재조합 플라스미드를 관심있는 세포로 전달하는 방법의 선택은 당해 분야의 기술에 속한다. 예컨대, 문헌[Tuschl, T. (2002), Nat. Biotechnol. 20: 446-448] 및 문헌[Brummelkamp T R et al. (2002), Science 296: 550-553]을 참고하며, 이의 전체 개시 내용은 참고로서 본원에 혼입되어 있다.
본 발명의 짧은 RNA는 또한 생체내 세포내의 재조합 바이러스 벡터로부터 발현될 수 있다. 본 발명의 재조합 바이러스 벡터는 본 발명의 짧은 RNA를 암호화하는 서열 및 짧은 RNA 서열의 발현을 위한 임의의 적절한 프로모터를 포함한다. 적절한 프로모터는 예컨대 U6 또는 H1 RNA pol III 프로모터 서열 및 거대 세포바이러스 프로모터를 포함한다. 다른 적절한 프로모터의 선택은 당해 분야의 기술에 속한다. 본 발명의 이중 가닥 짧은 RNA는 2개의 독립된 상보적인 RNA 분자 또는 2개의 상보적 영역을 갖는 단일 RNA 분자로서 재조합 바이러스 벡터로부터 발현될 수 있다. 발현되어야 할 dsRNA 분자를 위한 암호화 서열을 허용할 수 있는 임의의 바이러스 벡터, 예컨대 아데노바이러스(AV); 아데노-결합 바이러스(AAV); 레트로바이러스(예컨대 렌티바이러스(LV), 랩도바이러스, 뮤린 백혈병 바이러스); 헤르페스 바이러스 등으로부터 유도된 벡터가 사용될 수 있다. 바이러스 벡터의 향성은 외피 단백질 또는 다른 바이러스로부터의 다른 표면 항원으로 벡터를 슈도타이핑하거나, 다른 바이러스 캡시드 단백질로 적절하게 치환하여 변형시킬 수 있다.
본 발명의 사용에 적합한 재조합 바이러스 벡터, 짧은 RNA의 발현을 위한 핵산 서열을 벡터에 삽입하는 방법, 및 바이러스 벡터를 관심있는 세포로 전달하는 방법의 선택은 당해 분야의 기술에 속한다. 예컨대 문헌[Dornburg R (1995), Gene Therap. 2: 301-310]을 참고하며, 이의 전체 개시 내용은 참고로서 본원에 혼입되어 있다.
실시예에서 논의되는 바와 같이, 본원에 개시된 방법을 이용하여, 본 발명의 발명자는 수많은 특수화 유전자의 활성을 효과적으로 조절하는 특이적인 짧은 RNA분자를 디자인했다. 바람직한 특수화 유전자는 상기 논의되어 있다. 따라서, 본 발명의 추가의 양상은 단일 또는 이중 가닥일 수 있고 표 1 내지 6에서 보여지는 특정 서열을 갖는 짧은 RNA 분자를 제공한다. 선택적으로, 이들의 임의의 서열은 3' 테일을 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 각각의 가닥의 서열을 포함하거나 이로 이루어진 단일 가닥 또는 이중 가닥 RNA 분자를 제공한다.
본 발명은 또한 상기 언급된 RNA 분자에 상응하는 DNA 분자를 제공한다.
본 발명의 짧은 RNA 분자는 재생 또는 회복의 방법을 포함하는 치료 방법에서 직접 이용될 수 있다.
본 발명의 추가의 양상은 치료에서 사용하기 위한 본 발명의 짧은 RNA를 제공한다. 바람직하게, 본원에 개시되어 있는 2개의 특정 MafA-상향 조절 짧은 RNA가 조합되어 사용된다.
추가의 양상에서, 본 발명은 환자에게 본 발명의 짧은 RNA를 투여하는 것을 포함하는 유전자 치료 방법을 제공한다.
본 발명은 환자의 특수화된 세포, 바람직하게는 인슐린 생산 세포의 결핍과 관련된 질병의 치료에 사용하기 위한 본 발명의 짧은 RNA를 제공한다.
추가의 양상에서, 본 발명은 본 발명의 짧은 RNA를 포함하는 세포 또는 세포주를 제공한다.
추가의 양상에서, 본 발명은 본 발명의 방법중 어느 하나에 의해 제조된 특수화된 세포를 제공한다.
실시예에 설명된 바와 같이, 본 발명의 방법은 인슐린을 분비할 수 있는 세포의 생산을 가능하게 한다. 따라서, 추가의 양상에서, 본원에 개시된 방법에 의해 수득된 인슐린을 생산할 수 있는 세포가 제공된다. 바람직하게, CD34+ 줄기 세포 예컨대 옴니사이트를 유도하여 특수화함으로써 세포가 얻어진다.
세포는 바람직하게는 생체외 세포이다(즉, 살아있는 유기체의 일부가 아니다). 선택적으로 상기 세포는 "시험관내" 또는 "단리된"이라고 일컬어질 수 있다.
치료에서 이와 같은 세포의 사용은 본 발명의 추가의 양상을 나타낸다. 선택적으로, 본 발명의 특수화된 세포 및 본 발명의 짧은 RNA는 본원에 개시된 치료 적용에서 조합되어 사용될 수 있다. "조합되어"는 독립된, 동시의 또는 연속적인 투여를 포함한다.
선택적인 관점에서, 본 발명은 치료 효과량의 특수화된 세포 및/또는 치료 효과량의 본 발명에 정의된 짧은 RNA를 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함하는 치료 방법을 제공한다.
치료 적용은 특수화된 세포 및/또는 본 발명의 짧은 RNA 분자의 투여로부터 이득을 얻을 수 있는 임의의 상태, 손상 또는 질환의 치료일 수 있다. 이는 특수화된 세포의 결핍과 관련되거나 이에 의해 특징지어지는 상태일 수 있다.
바람직하게, 치료적 적용은 재생 또는 회복이다. 선택적으로, 손상된 장기, 바람직하게는 췌장 또는 간의 재생 또는 회복이다. 선택적으로, 상기와 같이 "손상"되지는 않았지만 정상적인 방법으로 발달되지 않은 장기의 재생 또는 회복일 수 있다. 그러므로 "재생"은 장기의 성장 또는 개선의 모든 방법을 포함하도록 광범위하게 해석되어야 한다.
당뇨병 예컨대 전성 당뇨병 유형 I 또는 유형 II의 치료가 바람직하다. 치료될 수 있는 다른 질병은 비만, 특히 병적인 비만증, 지방간 특히 지질과 글라이코겐 침착과 관련된 지방간, 및 글루코스 및/또는 인슐린 흡수 및/또는 활용의 결함에 의해 특징지어지거나 이와 관련된 임의의 질환이다. 이와 같은 질환은 비정상적인 인슐린 생산, 흡수 또는 활용과 관련된 상태로 언급될 수 있다.
선택적으로, 본 발명은 췌장 세포, 특히 베타-세포가 결핍된 환자의 췌장의 적어도 일부의 재생에서 사용하기 위한 본 발명의 짧은 RNA 및 본 발명의 특수화된 세포를 제공한다. 췌장이 충분한 인슐린을 생산하지 않는, 또는 실제로 인슐린을 전혀 생산하지 않는 임의의 환자는 이와 같은 치료로부터 이득을 얻을 것이다. 불충분한 인슐린 생산은 정상적인(건강한) 대상에 비해 낮은 수준의 인슐린 생산을 포함하지만, 이는 또한 정상적인(건강한) 대상과 비슷한 수준의 인슐린을 생산하지만 예컨대 인슐린 내성, 과도한 음식 소비, 병적인 비만증 등에 의하여 보다 높은 인슐린 수준을 요구하는 대상을 포함한다.
췌장을 표적화하는 것 대신에, 또는 표적화하는 것과 더불어, 본 발명의 짧은 RNA 및/또는 세포는 간을 표적화하기 위해 사용될 수 있으며, 이에 따라 간 세포, 또는 본 발명의 세포는 간에 이주되어 인슐린을 생산한다.
짧은 RNA 분자 또는 세포는 예컨대 정맥내, 피하, 근육내 또는 표적 장기로의 주사를 통해 투여될 수 있다. 따라서, 주사는 전신 주사, 또는 표적 부위, 예컨대 표적 장기, 바람직하게는 췌장 또는 간에서 또는 췌장 또는 간으로의 주사일 수 있다. 선택적으로, 투여는 경구 또는 직장(pr) 투여일 수 있다. 췌장으로의 세포의 주사가 바람직하다.
본 발명의 짧은 RNA 및/또는 세포는 당해 분야에 공지된 임의의 수단 또는 전달 비히클, 예컨대 나노입자, 양이온 지질, 지질 예컨대 콜레스테롤 또는 알파-토코페롤, 리포좀 예컨대 양성적으로 하전된 리포좀, 중합체 예컨대 폴리에틸렌이민, 덴드리머, 압타머, 또는 항체 접합체를 통하여 환자에게 투여될 수 있다. 짧은 RNA는 또한 바이러스 벡터 발현된 shRNA 또는 miRNA 모방체로서 투여될 수 있다.
바람직하게, saRNA 또는 세포는 saRNA 또는 세포를 특이적인 조직 또는 세포 유형(예컨대 췌장 세포 또는 간세포, 예컨대 헤파토사이트 또는 베타-세포)으로 표적하는 잔기와 결합된다(예컨대, 복합체를 이루거나, 연결되거나, 함유된다). 상기 잔기는 상기 언급된 수단/전달 비히클 중 하나일 수 있다.
앱타머는 높은 선택성, 친화성 및 안정성을 갖는 올리고뉴클레오타이드 또는 펩티드이다. 이들은 특이적이고 안정한 3차원 형상이며, 이에 따라 표적 분자에 대해 매우 특이적이고 단단한 결합을 제공한다. 임의의 특이적 분자 표적에 대해, 핵산 앱타머는 예컨대 기하급수적인 풍부함에 의한 리간드의 체계적인 진화 (systematic evolution of ligands by exponential enrichment: SELEX)(예컨대 문헌[Tuerk C and Gold L: Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science 1990, 249:505-510] 참고)라 일컬어지는 기술을 통하여 핵산의 조합 라이브러리로부터 식별될 수 있다. 따라서 숙련자는 본 발명의 saRNA 또는 세포를 표적 세포 예컨대 간 또는 췌장 세포 예컨대 베타-세포로 전달하기 위한 적절한 앱타머를 디자인할 수 있다. 펩티드 앱타머는 예컨대 효모 이중 하이브리드 시스템을 이용하여 식별될 수 있다. 췌장-특이적 앱타머를 이용한 본 발명의 짧은 RNA의 췌장으로의 투여가 특히 바람직하다. DNA 앱타머, RNA 앱타머 및 펩티드 앱타머가 고려된다.
또한 제공되는 것은 앱타머와 본 발명의 짧은 RNA의 접합체이다. 접합체는 두 잔기의 연결 예컨대 직접적인 화학 결합 형성, 스트렙타비딘 등과 같은 연결기를 통한 연결을 위한 임의의 공지된 방법을 이용하여 형성될 수 있다.
표적 세포 표면 수용체에 대한 항체의 생산 방법이 널리 공지되어 있다. 본 발명의 saRNA 분자는 이와 같은 항체에 예컨대 RNA 담체 단백질을 이용하여 부착될 수 있다. 얻어지는 복합체는 이후 대상에게 투여되고 수용체-매개 엔도사이토시스를 통해 표적 세포에 흡수될 수 있다. 본 발명의 세포는 공지된 방법을 이용하여 이와 같은 항체에 연결될 수 있다.
saRNA 또는 세포는 당해 분야에 공지된 방법을 이용하여 리포좀 내에서 캡슐화될 수 있다. 리포좀은 선택적으로 표적-세포 특이적 잔기 예컨대 항체 또는 펩티드와 결합될 수 있다.
예컨대 출판물 및 특허를 포함하는 다양한 문헌이 본원 전반에 걸쳐 인용된다. 이와 같은 모든 문헌은, 관련 부분에서 본원에 참고로서 혼입된다. 임의의 주어진 문헌의 인용은 문헌이 본 발명에 대해 선행 기술이라는 것을 인정하는 것으로서 이해되는 것은 아니다. 이 기록된 문헌에 있는 용어의 임의의 의미 또는 정의가 참고로서 혼입되어 있는 문헌에 있는 용어의 임의의 의미 또는 정의와 상충될 때까지, 이 기록된 문헌의 용어에 할당된 의미 또는 정의가 적용될 것이다.
본 발명에서 활용되는 다양한 성분을 포함하는 구성요소의 상표명이 본원에 언급된다. 본원의 발명자는 특정 상표명하의 물질에 의해 제한하려고 의도하지 않는다. 상표명으로 연급된 것과 등가의 물질(예컨대, 상이한 명칭 또는 조회번호 하에 상이한 공급원으로부터 얻어지는 물질)로 치환될 수 있고 본 명세서에서 이용될 수 있다.
상기 개시된 본 발명의 선택적이고 바람직한 특징 및 실시양태가, 특징 또는 실시양태가 상호 배타적인 것, 그렇게 하는 것이 불가능한 것, 또는 그렇게 하는 것이 본 발명의 목표와 반대되는 것을 제외하고는, 단독으로 또는 임의의 개수 및 임의의 조합으로 함께 채택될 수 있다.
하기 실시예는 본 발명을 설명하고 당해 분야의 숙련자에게 본 발명을 만들고 사용하도록 교시하기 위해 의도된다. 이 실시예는 어떠한 방법으로도 본 발명을 제한하기 위해 의도되지는 않는다. 본 발명은 이제 하기의 실시예, 표 및 도면에 추가로 기술될 것이다.
표 1 은 PDX1 발현을 활성화시키기 위해 디자인된 짧은 RNA 분자를 나타낸다. 안티센스(가이드) 서열이 오른쪽에 나타나 있고, 센스(패신저) 서열이 왼쪽에 나타나 있다. RNA 서열은 티민(T) 대신 우라실(U)을 포함하고, 이들 2개의 잔기는 표에 제공되는 서열에서 등가이다.
표 2 는 뉴로제닌 발현을 활성화시키기 위해 디자인된 짧은 RNA 분자를 나타낸다. 안티센스(가이드) 서열이 오른쪽에 나타나 있고, 센스(패신저) 서열이 왼쪽에 나타나 있다.
표 3 은 Rfx6 발현을 활성화시키기 위해 디자인된 짧은 RNA 분자를 나타낸다. 안티센스(가이드) 서열이 오른쪽에 나타나 있고, 센스(패신저) 서열이 왼쪽에 나타나 있다.
표 4 는 MafA 발현을 활성화시키기 위해 디자인된 짧은 RNA 분자를 나타낸다. 안티센스(가이드) 서열이 오른쪽에 나타나 있고, 센스(패신저) 서열이 왼쪽에 나타나 있다.
표 5 는 인슐린 발현을 활성화시키기 위해 디자인된 짧은 RNA 분자를 나타낸다. 안티센스(가이드) 서열이 오른쪽에 나타나 있고, 센스(패신저) 서열이 왼쪽에 나타나 있다.
표 6 은 인슐린 발현을 활성화시키기 위해 디자인된 짧은 RNA 분자를 나타낸다.
표는 짧은 RNA 서열을 나타낸다. 짧은 RNA가 단일 가닥인 경우, 안티센스 열에 나열된 서열을 포함하거나 이로 이루어진 것이 바람직하다. 이중 가닥의 짧은 RNA는 센스 열에 나타나 있는 서열을 포함하거나 이로 이루어진 가닥이 안티센스 열의 같은 행에 나타난 서열을 포함하거나 이로 이루어진 가닥과 함께 쌍을 이루어 형성된다. 달리 말하면, 표의 각각의 행은 이중 가닥 RNA를 형성하기 위해 서열이 쌍을 이룰 수 있다는 것을 나타낸다. 그러므로, 이중 가닥의 짧은 RNA는 서열번호 1과 서열번호 2, 또는 서열번호 3과 서열번호 4 등을 포함할 수 있다.
참고문헌
Figure pct00001
Figure pct00002

실시예
실시예 1
PDX1 발현을 활성화시키기 위한 짧은 RNA 의 디자인
saRNA 디자인을 상기 언급된 방법을 이용하여 수행하였다. 더욱 자세한 사항은 하기에서 제공된다.
PDX1은 13번 염색체(도 1 참고) q12.2 밴드에 위치해 있다. PDX1의 완전한 유전자 명칭은 "호모 사피엔스 판크레아틱 앤드 듀오데날 호메오박스 1(Homo sapiens pancreatic and duodenal homeobox 1)"이다. mRNA 수탁번호는 NM_000209이다. PDX1의 기준서열 mRNA(NM_000209)는 2개의 엑손을 갖고, 양성 가닥으로부터 전사된다.
PDX1 좌위로부터 잠재적 안티센스 전사물을 식별하기 위하여, 적절한 가닥(음성 가닥)으로 맵핑된, 스플라이싱된 발현 서열 태그(EST)를 찾기 위해 PDX1을 둘러싸는 게놈 영역을 검색하였다.
EST의 전사 방향을 측정하는 것은 통상적으로 어렵지만, 스플라이싱된 EST의 스플라이스 부위 서명을 이용하여 방향을 측정하였다. 표적 후보로 EST CR593175를 선택하였다.
최근의 깊은 서열 분석 실험을 통해 안티센스 RNA가 종종 TSS를 둘러싸는 영역에서 발견된다는 것이 밝혀짐에 따라, PDX1의 프로모터 영역으로부터 잠재적 안티센스 전사물을 표적화하는 짧은 활성화 RNA를 디자인하는 것이 결정되었다. 더욱 상세하게는, 제 2 표적 후보로 PDX1의 TSS로부터의 안티센스 서열 500nt의 상류 및 하류(PDX1_AS_TSS+/-500로 약칭됨)를 이용하였다.
2개의 후보 서열을 하향 조절하기 위한 짧은 RNA를 디자인하는 것이 목표이다. 후보 짧은 RNA는 표적 서열의 효과적인 억제를 제공해야 하며, 잠재적인 표적을 벗어난 효과를 최소화하도록 이상적으로 가능한한 특이적이어야 한다. 그러므로 2개 후보의 서열을 하향 조절하기 위한 잠재적인 짧은 RNA를 식별하기 위해 쥐피부스트 siRNA 디자인 알고리즘을 이용하였다. 예상되는 siRNA 후보의 목록으로부터, EST CR593175의 엑손 1 및 2에서 2개의 가장 유망하고 오버랩되지 않은 siRNA의 표적 부위, 및 프로모터 서열 이내의 PDX1 TSS의 각 측면(PDX1_AS_TSS+/-500)에서의 가장 유망한 siRNA 표적 부위를 선택하였다. 쥐피부스트로부터 예상되는 효능 스코어, 모티프 aaaa, cccc, gggg 및 uuuu의 부재, 20 내지 55%의 중간 GC 함량, 및 2개 이상의 모든 잠재적인 표적을 벗어난 전사물의 해밍 거리에 기초하여 후보 siRNA를 선택하였다. 표 1은 PDX1 발현을 활성화시키기 위한 생성된 후보 짧은 RNA를 제시한다. 표에는 단일 가닥의 서열이 나타나 있지만, 활성화 RNA는 이중 가닥 분자로서 또한 투여될 수 있다.
실시예 2
뉴로제닌 3의 발현을 활성화시키기 위한 짧은 RNA 의 디자인
실시예 1과 같이 디자인을 수행하였으며, 하기와 같은 차이점이 있다.
뉴로제닌은 10번 염색체(도 2 참고) q21.3 밴드에 위치해 있다. 뉴로제닌 3 유전자의 완전한 명칭은 "호모 사피엔스 뉴로제닌 3(Homo sapiens neurogenin 3)"이다. mRNA 수탁번호는 NM_020999이다. 뉴로제닌 3의 기준서열 mRNA(NM_020999)는 2개의 엑손을 가지며 음성 가닥으로부터 전사된다.
표적 후보로 EST Al744512를 선택하였다. 제 2 표적 후보로 NEUROG3_AS_TSS+/-500을 사용하였다.
표 2는 뉴로제닌 3 발현을 활성화시키기 위한 생성된 후보 짧은 RNA를 제시한다. 표에는 단일 가닥의 서열이 나타나 있지만, 활성화 RNA는 이중 가닥 분자로서 또한 투여될 수 있다.
실시예 3
Rfx6의 발현을 활성화시키기 위한 짧은 RNA의 디자인
실시예 1과 같이 디자인을 수행하였으며, 하기와 같은 차이점이 있다.
Rfx6은 6번 염색체(도 3 참고) q22.2 밴드에 위치해 있다. Rfx6 유전자의 완전한 명칭은 "호모 사피엔스 레귤러토리 팩터 X, 6(Homo sapiens regulatory factor X, 6)"이다. mRNA 수탁번호는 NM_173560이다. Rfx6의 기준서열 mRNA(NM_173560)는 19개의 엑손을 가지며 양성 가닥으로부터 전사된다.
표적 후보로 EST NM_148963을 선택하였다. 제 2 표적 후보로 RFX6_AS_TSS+/-500을 사용하였다.
표 3은 Rfx6 발현을 활성화시키기 위한 생성된 후보 짧은 RNA를 제시한다. 표에는 단일 가닥의 서열이 나타나 있지만, 활성화 RNA는 이중 가닥 분자로서 또한 투여될 수 있다.
실시예 4
MafA의 발현을 활성화시키기 위한 짧은 RNA의 디자인
실시예 1과 같이 디자인을 수행하였으며, 하기와 같은 차이점이 있다.
MafA는 8번 염색체(도 4 참고) q24.3 밴드에 위치해 있다. MafA 유전자의 완전한 명칭은 "호모 사피엔스 브이-마프 머스큘로아포뉴로틱 파이브로사르코마 온코진 호모로그 에이(에이비안)(Homo sapiens v-maf musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene homolog A(avian))"이다. mRNA 수탁번호는 NM_201589이다. MafA의 기준서열 mRNA(NM_201589)는 1개의 엑손을 가지며 음성 가닥으로부터 전사된다.
표적 후보로 MAFA_AS_TSS+/-500을 사용하였다.
표 4는 MafA 발현을 활성화시키기 위한 생성된 후보 짧은 RNA를 제시한다. 표에는 단일 가닥의 서열이 나타나 있지만, 활성화 RNA는 이중 가닥 분자로서 또한 투여될 수 있다.
실시예 5
특수화 유도 - 인슐린 생산 세포의 생성
물질 및 방법
다음과 같이 만능 세포(옴니사이트)를 수득하였다:
임상적 요건 이상으로 해머스미스(Hammersmith) 병원의 스템 셀 래보라토리 (Stem Cell Laboratory)에 의해 처리된 백혈구 분리 반출법으로부터 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF) 동원된 말초 혈액 세포를 얻었다. 모든 경우에 사전동의 및 지역 연구 윤리 위원회의 인가를 받았다. 단핵구 세포(MNC)를 림포프렙(Lymphoprep)(영국 캠브리지셔 킴벌턴 소재 액시스-쉴드(Axis-Shield)) 밀도 구배를 통해 1,800rpm에서 30분 동안 원심분리하여 분리시키기 전에(독일 하나우 소재 헤라에우스(Heraeus)), 1:4 한크스 완충 염수 용액(HBSS; 영국 페이즐리 소재 깁코(Gibco))에 CD34+ 세포를 희석하였다. MNC 분획을 모으고 먼저 HBSS에서 씻은 후, 0.5% 인간 혈청 알부민 및 5mM EDTA(pH7.2)가 보충된 MACS(자기 세포 분류) 완충액으로 세척하였다. CD34+ 양성 세포 선택 키트(독일 베르기슈 글라드바흐 소재 밀테니 바이오택(Miltenyi Biotec)의 라지맥스(LargeMacs)를 이용하여 MNC로부터 CD34+ 세포를 단리하였다. 단리된 CD34+ 세포를 500㎕의 α-최소 필수 배지(α-MEM)를 사용하여 웰 당 2.5x105의 세포 밀도로 24웰 배양 접시(미국 소재 코닝)에서 도말하고, 37℃에서 및 5%의 이산화탄소에서 30일 동안 항온처리하였다. 항온처리 후, 플레이트를 PBS로 4회 씻어내어 부착되지 않은 세포 집단을 제거하였다.
도 7에 나타난 방법에 의해 특수화 유도를 수행하였다. 옴니사이트(CD34+, 부착)를 2.5mM의 글루코스 및 10ng의 액티빈 A가 보충된 무혈청 확장 배지에서 3일 동안 배양하였다.
제 3 일 및 제 6 일에, 세포를 saRNA 분자로 형질감염하였다. 50mM 트리스-HCl(pH 8.0), 100mM NaCl 및 5mM EDTA를 이용하여 짝지어진 saRNA 올리고뉴클레오타이드를 어닐링하였다. 90℃에서 변성 단계에 이어서, 실온까지의 점진적인 어닐링 단계를 수행하였다. 나노펙타민(피에이에이(PAA))을 이용하여 어닐링된 saRNA 올리고뉴클레오타이드(0.15㎍/웰)의 형질감염을 수행하였다.
제 3 일 및 제 6 일에, 11mM 글루코스, 5ng 엑센딘, 50ng 인간 노긴, 5ng FGF 및 5ng EGF를 첨가하였다.
RNA 분석
RNA를 분석하기 위해, 제 9 일에 세포를 회수하고 원심분리하여 펠렛화시켰다. RNA퀴오스-마이크로 키트(RNAqueous-Micro kit)(앰비온(Ambion))를 이용하여 제조사의 지시 사항에 따라 전체 RNA를 회수하였다. 나노드롭 1000(Nanodrop 1000) 마이크로 샘플 정량기를 이용하여 RNA를 정량화하였다. 퀴아젠(Qiagen)의 1 단계 RT-PCR 키트를 이용하여 제조사의 권고에 따라 각 샘플로부터의 1㎍의 전체 RNA를 역전사시켰다. PDX1, Rfx6, MafA 및 인슐린의 발현을 PCR로 반-정량적으로 측정하였다. 로딩 대조군으로서 액틴을 이용하였다.
면역형광법
세포를 1cm 유리 커버슬립 상에서 4% 파라포름알데하이드로 20분 동안 고정시키고, 0.2% 트라이톤엑스100(TritonX100)으로 20분 동안 침투성화시켰다. 커버슬립을 물로 3회 씻어내고, 10% 토끼 혈청으로 45분간 블럭킹(blocking)시켰다. 토끼로부터 생산된 항-인간 인슐린(1:200)(시그마)을 10% 혈청에 1시간 동안 놓아 둔 세포에 첨가하였다. 세포를 PBS에서 3회 세척하고, 추가의 15분 동안 10% 혈청을 첨가하고, 이어서 알렉사-488 접합된 항-토끼 2차 항체(1:600)(셀 시그날링 테크놀로지(Cell Signalling Technology))로 1시간 동안 항온처리하였다. PBS에서 5회 세척한 후, 커버슬립을 4'6'-다이아마이디노-2-페닐인돌(DAPI)을 함유하는 벡타쉴드(벡터 랩스(Vector labs))가 있는 유리 슬라이드에 올려놓았다. 레이카(Leica) DM4000을 이용하여 60배 배율로 슬라이드를 관찰하였다. 평균 5개 이미지를 캡쳐하여 자가형광이 존재하지 않음을 확인하기 위하여 2차 접합된 항체로만 염색한 것과 비교하였다.
프로-인슐린 ELISA
제 9 일에 세포를 10mM 니코틴아마이드, 50ng IGF-II, 10ng HGF, 25ng 엑센딘-4 및 10ng 액티빈 A(부록 E)가 보충된 전처치 α-MEM 배지로 옮겼다. 세포를 글루코스 구배를 첨가하기 전에 37℃에서 16시간 동안 5%의 이산화탄소와 함께 항온처리하였다. 2.8mM 글루코스를 3시간 동안 첨가한 후 20mM 글루코스를 추가의 3시간 동안 첨가하였다. 전체 인간 프로-인슐린 ELISA(밀리포어(Millipore))를 위해 제조사의 지시에 따라 배지를 단리하고 가공하였다. 키트에서 제공된 양성 대조군은 7.9pM의 인슐린을 함유한다.
결과
옴니사이트는 췌장 베타-세포의 특수화를 위한 필수 인자를 발현한다.
줄기 세포로부터 유도된 플라스틱 부착 골수의 초기 특성이 이미 고든 엠와이 등(1987) 및 고든 엠와이(1994)(8, 9)에 의해 확립되었다. 본 발명의 발명자는 신선하게 단리된 옴니사이트로부터 췌장 베타-세포로의 특수화에 필수적인 뉴로D, PDX1 및 Rfx6을 포함하는 전사 인자의 존재를 확인하였다. 이러한 인자들의 발현은 배양의 3일 이내에 자연적으로 하향 조절된다(도 5A).
어닐링된 saRNA 올리고뉴클레오타이드의 형질감염은 표적 유전자를 상향 조절한다.
인슐린 생산 세포로의 특수화에 필수적인 전사 인자의 발현을 유지하거나 증가시키기 위해, 물질 및 방법에서 언급된 바이오인포메틱스 및 소프트웨어 알고리즘을 이용하여 작은 활성화 RNA(saRNA) 올리고뉴클레오타이드가 생산되었다. 이 올리고뉴클레오타이드는 제 9 일에 세포를 회수하기 전에 제 3 일 및 제 6 일에 어닐링되고 형질감염된다. mRNA 분석은 PDX1의 상향 조절(도 1)이 섬 형성 및 인슐린 발현(21)(도 5B)을 위해 필수적인 하류 전사 인자 Rfx6.1의 서열 활성화를 추진하기에 충분하다는 것을 증명한다. 제 9 일에 PDX1로 형질감염된 세포의 형태는 면역형광법 염색이 인슐린 발현을 보여주는(도 5C) 섬 세포 군집 형성을 특징으로 한다. 그러나 이들 세포는 인슐린을 분비하지 않고, 이어서 글루코스 구배에 노출되고, 섬 세포의 미성숙을 시사한다.
성숙한 베타-세포 특수화를 위해 필수적인 전사 인자의 상향 조절
성숙한 베타-세포 특수화에 필수적인 유전자의 전체 집합을 보충하기 위하여, 뉴로제닌 3(도 2), Rfx6(도 3) 및 MafA(도 4)를 표적화하는 saRNA가 세포 안으로 형질감염되었다. mRNA의 분석은 세포 배양의 제 9 일까지 프리프로-인슐린 및 프로-인슐린이 유의하게 상향 조절되었음을 보여준다(도 6A).
베타-세포 특수화를 위한 PDX1을 표적하는 saRNA 및 늦은 전사 인자의 조합
PDX1, Rfx6, 뉴로제닌 3(Ngn3) 및 MafA의 표적화된 상향 조절이 saRNA 올리고뉴클레오타이드의 형질감염 후 mRNA 분석에 의해 확인되었기 때문에, 세포가 더욱 성숙된 인슐린 분비 베타-세포로 발달하는 신호를 보이는 경우, 평가하기 위해 이들 올리고뉴클레오타이드의 조합을 옴니사이트에 첨가하는 것을 시도하였다. 제 3 일 및 제 6 일에 형질감염된 Rfx6, Ngn3 및 MafA 단독, 또는 PDX1+Rfx6, PDX1+Ngn3 또는 PDX1+MafA의 조합에 따라서, 글루코스 반응 테스트를 하기 위해 물질 및 방법에 기술된 바에 따라 세포를 준비하고 전체 프로-인슐린 분비에 대한 ELISA를 수행하였다. 제시된 값은 ELISA 키트(밀리포어)에 의해 제공된 7.9pM 인슐린의 양성 대조군에 대한 백분율이고, 24-웰 플레이트의 단일 웰에서 배양된 세포를 나타낸다(도 6B).
논의
지난 10년 동안 이루어진 줄기 세포의 이해와 조작에 대한 진전은 연구자가 재생 치료를 위해 이러한 세포를 이용하는 것을 가능하게 해주었다. 배아 세포가 종양 형성의 위험성을 지니고 있기 때문에, 임상적 적용에서 이들의 사용에 대한 윤리적 제한은 성인 간세포를 이용하는 것에 더욱 초점을 맞추는 것을 의미해 왔다. 이 분야의 연구는 임상 용도로 변형될 수 없는 유전적으로 변형된 성분에 대한 의존에 의해 종전에 제한되어 왔다. 그러나 옴니사이트는 치료에 있어 줄기세포 대체물로서의 사용을 위한 필수적인 안전 기준을 모두 만족한다(22). 이들은 자가유래적으로 단리될 수 있고, 이들은 간, 췌장, 심혈관 및 신경 세포를 포함하는 상이한 계통에 헌신적인 필수적인 전사 요소를 이미 발현했기 때문에, 이들은 무혈청 환경에서 강한 확장 가능성을 갖으며, 놀라운 발달적 유연성을 보인다(22). 본원에 나타나 있는 데이타는 옴니사이트가 신규한 작은 활성화 RNA 분자의 사용에 의해 인슐린 분비 세포로 유도될 수 있다는 것을 보여준다. 바이러스계의 골격을 갖는 벡터에 의존하는 표준 기술을 이용하는 것과 비교해 볼 때, 이러한 분자들은 의심의 여지 없이 보다 안전한 접근을 가능하게 한다(22). 본원의 발명자들은 단지 소수의 표적 전사 인자의 활성화가 인슐린 생산의 유도를 위해 필수적인 하류 유전자를 조절하는 일련의 효과를 야기하기에 충분하다는 것을 제시한다.
실시예 6
(프로)인슐린의 발현을 활성화시키기 위한 짧은 RNA 의 디자인
실시예 1과 같이 디자인을 수행하였으며, 하기와 같은 차이점이 있다.
(프로)인슐린은 11번 염색체(도 8 참고) p15.5 밴드에 위치해 있다. (프로)인슐린 유전자의 완전한 명칭은 "호모 사피엔스 인슐린(Homo sapiens insulin)"이다. mRNA 수탁번호는 NM_000207이다. (프로)인슐린의 기준서열 mRNA(NM_000207)는 3개의 엑손을 가지며 음성 가닥으로부터 전사된다.
표적 후보로 INS(NM001185098)_AS_TSS+/-500을 사용하였다.
표 5 및 표 6은 (프로)인슐린 발현을 활성화시키기 위한 생성된 후보 짧은 RNA를 제시한다.
실시예 7
MafA 를 상향 조절하기 위한 saRNA 를 이용한 인슐린 생산의 유도
(a) CD34+ 세포를 인슐린 분비 표현형으로 유도하기 위한 최적화된 프로토콜
제 0 일에, 10ng/ml의 액티빈 A(영국 소재 시그마) 및 2.5nM 글루코스(미국 소재 시그마)를 갖는 CD34+ 세포(옴니사이트)의 부착 집단을 0.5% 페니실린/스트렙토마이신 항생제중 스템 셀 펙터(Stem Cell Factor)(미국 소재 인비트로젠(Invitrogen)), 250ng/ml의 인터루킨(Interleukin)-3 및 인터루킨-6(미국 소재 인비트로젠))을 함유하는 무혈청 셀그로(CellGro) 배지(영국 소재 셀제닉스(CellGenix))로 72시간 동안 보충함으로써 유도 프로토콜을 시작하였다. 세포를 80% 콘플루언시까지 확장하고, 제조사의 지시에 따라, 11nM 글루코스, 5ng 엑센딘-4(미국 소재 시그마), 50ng 노긴(미국 소재 시그마), 5ng bFGF(미국 소재 시그마) 및 5ng EGF(미국 소재 시그마)를 72시간의 간격으로, MafA를 상향 조절하기 위해 디자인된 150ng의 이중 가닥 saRNA를 α-MEM 배지(무항생제)에서 나노펙타민(영국 소재 피에이에이)을 이용하여 형질감염시키면서 첨가하였다. 이 과정을 제 2/3 일, 제 5/6 일, 제 8/9 일에 3번 반복하였다(적절한 세포 밀도의 확립에 의존함). 최대의 형질감염 효율을 달성하기 위하여, 24시간 마다 부드럽게 피페팅하여 세포가 뭉치는 것을 방지하였다.
최적화된 프로토콜의 작업 절차가 도 9에 제시된다. MafA를 상향 조절할 수 있는 2개의 특이적인 saRNA가 조합되어 사용된다. 이들은 PR1 및 PR2로 지정된다. 이러한 saRNA로 처리된 세포는 실시예에서 "형질감염된" 세포라고 일컬어진다.
(b) 액틴 및 인슐린의 웨스턴 블랏
분화되지 않은 CD34+ 세포(대조군) 및 형질감염된 CD34+ 세포(상기 프로토콜에 따라 제조됨)로부터의 10㎍의 전체 단백질 추출물을 SDS-PAGE(인비트로젠으로부터의 4 내지 12% 트리스글라이신 변형 아크릴아마이드 젤)상에서 분리시켰다. 니트로셀룰로스 막에 옮긴 후, 블랏을 항-액틴(시그마)(1:8000) 및 항-인슐린(에이비캠(Abcam))으로 항온처리하고 이후 HRP가 접합된 2차 항체(다코(Dako))(1:1000)로 항온처리하였다. 인슐린은 작은 알파-아단위 및 보다 큰 베타-아단위로 이루어진 약 6kDa(킬로달톤)의 분자량을 갖는 작은 펩티드이다. 도 10에 결과를 나타내었다.
(c) 베타-세포 발달과 관련된 주요 전사 인자의 정량적 PCR(qPCR)
분화된(비형질감염된) CD34+ 세포(대조군)로부터의 전사물의 상대량(RQ)을 형질감염된 CD34+ 세포(상기 프로토콜에 따라 제조됨)와 비교하고, 전체 인간 성인의 정상적인 췌장 RNA를 분석하였다. 도 11에 결과를 나타내었다.
PDX1은 전사 인자 판크레아틱 및 듀오데날 호메오박스 1이다. 이는 인슐린 발현 조절과 관련된 다양한 유전자의 하류 활성화를 위해 중요하다. 이러한 인자는 소마토스타틴, 글루코키나아제 및 GLUT2를 포함한다. Ngn3은 뉴로드(NEUROD)(신경성 분화 인자)와 함께 인슐린의 발현을 조절하는 기본적인 나선-루프-나선 전사 인자 뉴로제닌 3이다. Nkx6.1은 베타-세포의 발달을 위해 요구되는 NK6 호메오박스 1 전사 인자이다. GCK는 글루코스 대사의 초기 단계에서 글루코스를 인산화하는 헥소키나아제 효소(글루코키나아제)이다. ABBC8(ATP-결합 카세트-아과 C 구성원 8)은 ATP 결합 카세트 운반자의 초과에 속한 구성원이다. ABBC8은 ATP 민감성 칼륨 통로에서 인슐린을 방출하기 위해 작용한다. GLP1은 인슐린 분비를 조절하는 글루칸-유사 펩티드 1이다. MafA(브이-마프 머스큘로아포뉴로틱 파이브로사르코마 온코진 호몰로그 에이)는 베타-세포가 성숙하는 동안 인슐린 유전자(INS)의 발현을 조절하는 보조된 인핸서 요소인 RIPE3b에 결합하는 베타-세포 특이적인 전사 인자이다. 표적 유전자의 프라이머는 퀴아젠으로부터의 입증된 퀀티텍트 프라이머(Quantitect Primer)이다.
(d) (A)분화되지 않은 또는 (B)형질감염된 CD34+ 세포의 전자 현미경 분석을 수행하였다. 상기 프로토콜에 따라 형질감염된 세포(B)를 제조하였다. 도 12에 결과를 나타내었다. (A)와 비교하여, 세포가 PDX1 및 인슐린 발현을 향해 분화하기 시작하는 (B)에서 과립형 소낭(vesicle)이 확인되었다(qPCR 데이타 참조). 과립이 함께 밀집하는 신호를 관찰할 수 있다(녹색 화살표). 분명하고 밀집된 소낭은 형질감염된 세포에서 세포막 쪽을 향하여 극성화하는 것으로 보여진다.
(e) 인슐린 및 C-펩티드의 효소 연결된 면역흡수 분석(ELISA).
저 농도(2.8nM)의 글루코스 및 이어서 고 농도의 글루코스(16nM) 펄스에 세포를 노출시킨 후, 분화되지 않은 CD34+ 세포 및 형질감염된 세포로부터의 배양 배지를 회수하였다. 이어서, 배지를 제조사의 프로토콜에 따라 인간 인슐린 및 인간 C-펩티드(밀리포어)에 특이적인 면역흡수 ELISA 판 위로 옮겼다. 도 13에 나타나 있는 데이타는 형질감염된 세포가 인슐린을 분비함으로써 글루코스 구배에 반응할 수 있다는 것을 보여준다.
실시예 8
본 발명의 짧은 RNA 분자를 이용하는 MafA 상향 조절을 간 세포에서 수행하였다. 간 상피 세포를 PR1 및 PR2로 나타내어진 saRNA로 형질감염시켰다(PR1이 서열번호 49와 짝지어진 서열번호 5이고, PR2가 서열번호 50과 짝지어진 서열번호 6이고, 각각이 선택적으로 3' UU 테일을 갖음을 나타내는 표 4와 표 7 참조). 결과는 각각의 saRNA가 단독으로 MafA 발현을 상향 조절할 수 있고, 두 saRNA의 조합이 각각의 saRNA 단독보다 더 큰 상향 조절을 달성함을 나타낸다(도 14 참조).
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
SEQUENCE LISTING <110> Mina Therapeutics Limited <120> Short RNA Molecules <130> 68.106155/03 <140> PCT/GB2011/051940 <141> 2011-10-10 <150> GB 1016989.4 <151> 2010-10-08 <150> GB 1103745.4 <151> 2011-03-07 <160> 58 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense <400> 1 aucuguacug gaugagcgg 19 <210> 2 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense <400> 2 uuucccgcag gagauugac 19 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Target <400> 3 ccgctcatcc agtacagat 19 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Target <400> 4 gtcaatctcc tgcgggaaa 19 <210> 5 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense <400> 5 uaaauuucug aguucuaga 19 <210> 6 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense <400> 6 aaucugagaa gcgaauucg 19 <210> 7 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense <400> 7 uuuacaagga cccaugcgc 19 <210> 8 <211> 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Claims (20)

19 내지 25개의 뉴클레오타이드 길이이고 서열 AUCUGUACUGGAUGAGCGG(서열번호 1) 또는 UUUCCCGCAGGAGAUUGAC(서열번호 2)를 포함하는 제 1 가닥을 포함하는, 인간 세포에서 MafA 발현을 상향 조절할 수 있는 짧은 RNA.
제 1 항에 있어서,
19 내지 25개의 뉴클레오타이드 길이이고 제 1 가닥과 함께 이중 가닥을 형성하는 제 2 가닥을 포함하는 짧은 RNA.
제 2 항에 있어서,
각각의 가닥이 3' 말단에 1 내지 3개의 짝을 이루지 않은 뉴클레오타이드를 갖고 오버행(overhang)을 형성하는 짧은 RNA.
제 3 항에 있어서,
3' 오버행이 하나 이상의 우라실 뉴클레오타이드를 포함하는 짧은 RNA.
제 3 항에 있어서,
3' 오버행이 하나 이상의 우라실 뉴클레오타이드로 이루어지는 짧은 RNA.
시험관내에서 인간 세포에 의해 인슐린 생산을 유도하기 위한, 제 1 항 내지 제 5 항중 어느 한 항에 따른 짧은 RNA의 용도.
제 6 항에 있어서,
서열 AUCUGUACUGGAUGAGCGG(서열번호 1)를 포함하는 짧은 RNA 및 서열 UUUCCCGCAGGAGAUUGAC(서열번호 2)를 포함하는 짧은 RNA가 조합되어 사용되는 용도.
인간 세포를 제 1 항 내지 제 5 항중 어느 한 항에 따른 짧은 RNA와 접촉시키는 것을 포함하는, 인간 세포에 의해 인슐린 생산을 유도하기 위한 시험관내 방법.
제 8 항에 있어서,
인슐린 생산이 글루코스-반응성인 시험관내 방법.
제 8 항 또는 제 9 항에 있어서,
서열 AUCUGUACUGGAUGAGCGG(서열번호 1)를 포함하는 짧은 RNA 및 서열 UUUCCCGCAGGAGAUUGAC(서열번호 2)를 포함하는 짧은 RNA가 조합되어 사용되는 시험관내 방법.
제 8 항 내지 제 10 항중 어느 한 항에 있어서,
인간 세포가 줄기 세포, 간 세포 또는 췌장 세포인 시험관내 방법.
제 1 항 내지 제 5 항중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 짧은 RNA를 포함하는 생체외 또는 시험관내 인간 세포.
제 8 항 내지 제 11 항중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득되는 인슐린 생산을 위해 유도된 생체외 또는 시험관내 인간 세포.
제 12 항 또는 제 13 항에 있어서,
치료에 사용하기 위한 생체외 또는 시험관내 인간 세포.
제 14 항에 있어서,
당뇨병 또는 병적 비만증의 치료에 사용하기 위한 생체외 또는 시험관내 인간 세포.
제 1 항 내지 제 5 항중 어느 한 항에 있어서,
치료에 사용하기 위한 짧은 RNA.
제 1 항 내지 제 5 항중 어느 한 항에 있어서,
당뇨병, 지방간 또는 병적 비만증의 치료에 사용하기 위한 짧은 RNA.
제 12 항 또는 제 13 항에 따른 생체외 또는 시험관내 인간 세포 및/또는 제 1 항 내지 제 5 항중 어느 한 항에 따른 짧은 RNA를 대상에게 약학적인 효과량으로 투여하는 것을 포함하는, 당뇨병 또는 병적 비만증의 치료 방법
제 1 항 내지 제 5 항중 어느 한 항에 따른 짧은 RNA 및/또는 제 12 항 또는 제 13 항에 따른 생체외 또는 시험관내 인간 세포, 및 약학적으로 허용되는 희석제, 담체 또는 부형제를 포함하는 약학 조성물.
(i) 19 내지 25개의 뉴클레오타이드 길이이고 서열 AUCUGUACUGGAUGAGCGG(서열번호 1)를 포함하는 제 1 가닥을 포함하는, 인간 세포에서 MafA 발현을 상향 조절할 수 있는 짧은 RNA; 및
(ii) 19 내지 25개의 뉴클레오타이드 길이이고 서열 UUUCCCGCAGGAGAUUGAC(서열번호 2)를 포함하는 제 1 가닥을 포함하는, 인간 세포에서 MafA 발현을 상향 조절할 수 있는 짧은 RNA
를 포함하는 키트.
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