CN103314108B - 短rna分子 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种能够上调人细胞中MafA表达的短RNA，其中所述短RNA包括长度为9到25个核苷酸且包括序列为AUCUGUACUGGAUGAGCGG或UUUCCCGCAGGAGAUUGAC的第一链。本发明还提供了其的用途，特别是医学用途，以及所诱导的细胞及其用途。

Description

短RNA分子

技术领域

本发明涉及生成能够生产胰岛素的细胞的方法。该方法包括使用能够增加MafA的表达的短RNA分子。本发明还涉及到这种短RNA分子和它们在治疗中的应用。

背景技术

糖尿病影响全球至少2亿人。当身体无法生产足够量的胰岛素（调节血液中葡萄糖水平的激素）时就会出现糖尿病。在健康个体中，胰岛素是由胰腺，更具体是由胰腺β细胞生成的。I型糖尿病通常是由免疫系统的T-细胞破坏胰腺的β-细胞造成的，因此自身免疫紊乱通常是根本原因，虽然感染、尤其是病毒感染，或者伤害也能够引起胰腺β-细胞的破坏或紊乱。这将导致胰岛素产量的严重匮乏。

目前的治疗选择主要依靠施用外源性胰岛素。其缺点包括对病人的不便，并且该种方法难以微调，通常会导致在某些情况下胰岛素过量，在其他时候胰岛素过少。

世界各地的I型糖尿病的发病率逐渐增加，相伴的，在这些患者中维持活性胰岛素分泌的稳定来源的临床挑战，使得向寻找实现这一目的的其他机制中投入了相当多的努力。然而，目前尝试的再生胰岛细胞或移植胰岛细胞并不完全有效，因此对于产生胰岛素生成细胞仍然存有需要。

能够从增加胰岛素产量中获益的其他疾病包括II型糖尿病、脂肪肝、肥胖症（尤其是病态肥胖症）以及与葡萄糖和/或胰岛素生成、摄取和/或利用缺陷相关的任何其他疾病。

胰腺由两个隔室，外分泌及内分泌隔室组成，每一个具有不同的功能。内分泌隔室由朗格汉斯小岛组成，所述朗格汉斯小岛由合成肽激素胰岛素(β-细胞)、胰高血糖素（α-细胞）、促生长素抑制素（δ-细胞）和胰多肽（γ-细胞）的四种细胞类型簇组成。这些细胞已被证明在胚胎发育过程中从导管上皮干细胞通过连续分化而进行分化。胰腺源于前肠内胚层的背侧及腹侧区域的不同的胚胎分支，这些分支生成了内分泌及外分泌细胞（13）。最早已知的胰腺标志物的表达包括Hlxb9和PDX1同源异型框蛋白。这些转录因子对胰腺特异性的主信号发生响应并在形态发生前指示胰腺干细胞。PDX1对于胰腺上皮的形态发生和分化是必要的。胰高血糖素和胰岛素表达开始于下游的蕾状期。PDX1还会生成神经原素3(Ngn3)阳性细胞作为内分泌世系的起源。随后Ngn3的激活启动了其他转录因子包括NeuroD1、Rfx6和MafA的表达，继而引导细胞分化成为成熟的胰岛细胞（20，21）。乙胞素过表达已被证明会诱导胰岛素分泌。

胰岛素原在内质网中合成，在内质网中其被折叠并且其二硫键被氧化。胰岛素原继而被运送至高尔基体，在该处被包装进入分泌囊泡，在分泌囊泡中经过一系列蛋白酶的处理，形成成熟的胰岛素。成熟的胰岛素少了35个氨基酸；4个被完全切除，剩余的31个形成了C-肽。C-肽从胰岛素原序列的中心分离出来；两个其他端部（B链和A链）通过二硫键保持连接。因此，胰岛素原和胰岛素是由相同基因编码的，所以本说明书中“胰岛素”基因的任何引用都应该被理解为指的是编码胰岛素原的基因，以及对“胰岛素原”基因的任何引用均应该理解为指的是编码最终成为胰岛素的蛋白的基因。

本发明的发明人已经着手开发一种优选以葡萄糖响应的方式上调靶基因以生成能够生产胰岛素的细胞的方法。这些细胞，即生产或能够生产胰岛素的细胞在本说明书中有时会被称为“特化的”细胞。本说明书中对于“特化的细胞”的任何引用优选为“生产/能够生产胰岛素的细胞”。

目前上调感兴趣的基因表达的方法要求向细胞中引入额外拷贝的基因，可以通过使用病毒以将额外拷贝的基因引入到宿主基因组，也可以通过引入表达额外拷贝靶基因的质粒。因此，为了上调，目前需要将表达载体侵入性瞬时转染或稳定的病毒转导进入细胞中，这引起了安全上的问题。目前的方法通常涉及非瞬时应用上调试剂。这些方法的限制是效果是相类似地非瞬时的。

RNA干扰(RNAi)是一种重要的基因调节机制，会引起靶mRNA的序列特异性下调。RNAi通过“干扰RNA”(iRNA)介导；这是一个总称，包括多种在RNAi过程中发挥作用的短的双链RNA(dsRNA)分子。

外源性dsRNA可以通过核糖核酸酶蛋白Dicer处理成19-25个碱基对，优选为21-23个碱基对的双链片段，在每个3'末端有几个未配对的碱基形成3'突出。优选地，每个3'突出为1-3个，更优选为2个核苷酸长度。这些短的双链片段称为小干扰RNA(siRNA)，这些分子使得靶基因的表达下调。

根据对它们功能的阐述，siRNA已经被用作下调特定基因的工具。它们可以进行瞬时抑制，或者当它们以短发夹RNA(shRNA)稳定结合时，进行稳定的抑制。siRNA和shRNA已经被广泛用于“敲除”或“功能丧失”实验，在这些实验中通过观察感兴趣基因表达降低的影响而研究该基因的功能。RNAi被认为作为基因组绘图和注释的技术有潜在益处。也有尝试将RNA干扰开发用于治疗。

称为RNA-诱导沉默复合物(RISC)的蛋白复合物结合一个siRNA链，并将该链用于识别靶mRNA的指导。根据指导RNA和mRNA之间的互补性，RISC继而破坏或抑制mRNA的翻译。完全的互补性导致mRNA裂解和破坏，并且mRNA由于裂解而无法再翻译成蛋白。部分互补性——特别是在mRNA的3’非翻译区(UTR)的位点处——会导致翻译抑制。RNAi在大多数真核生物中是保守的，并且通过引入外源性siRNA而可被用作下调特定基因的工具。

最近经研究发现，虽然RISC首先调节转录后基因，但RNAi也能调节基因转录本身。在裂殖酵母中，小RNA通过RISC复合物的同系物而调节染色质。显然装载有RNA的RISC复合物与非编码RNA(ncRNA)结合，从而将组蛋白修饰蛋白吸引到ncRNA的基因位点处。植物、蝇类、线虫、纤毛虫和真菌也有类似的机制。在哺乳动物中，大部分确切的机制仍不清楚，但据认为短RNA通过靶向于破坏转录物而调节转录，所述转录物与被调节的RNA正义或反义并被认为是非编码转录物。通过RNA靶向而破坏这些非编码转录物对于依赖RNA靶点的特性的表观遗传调控模式具有不同的影响。破坏对于给定的mRNA正义的ncRNA靶点使得该mRNA转录被抑制，而破坏对于给定的mRNA反义的ncRNA靶点则会激活该mRNA的转录。因此，通过靶向于这些反义转录物，RNAi便能够被用于上调特定基因。

发明内容

本发明的发明人惊讶地发现，细胞可以通过使用短RNA分子上调MafA表达而诱导生成胰岛素。本发明的发明人已经开发出了新型短RNA(saRNA)分子，其可以实现MafA基因的上调并得到生产胰岛素的细胞，并且克服了与现有技术的方法有关的问题。具体地，本发明的分子并不会引起与施用可能整合到宿主细胞的基因组中的遗传元素相关的安全问题。

发明人使用了一种有利的方法/算法以鉴定合适的RNA靶转录物和以设计这些短RNA分子。因此发明人提供了新型的短RNA分子，靶向于寄主细胞中的RNA转录物以调节MafA的表达。本发明的短RNA为比现有技术的表达载体更小的分子，因此侵略性较低。本发明的分子采用宿主自身的调节系统以调控基因的事实可能比向宿主引入额外基因复本的侵略性更低。

本发明的短RNA能够上调MafA的mRNA和蛋白水平，导致下游靶点的上调。本发明的短RNA在本说明书中也被称之为“特化诱导”RNA。本发明的MafA-激活RNA对于生产胰岛素生成细胞以用于再生医学中是有效、非侵略性和安全的选择。

本发明的一个主要优势是涉及基因激活小RNA的瞬时应用，其影响也是瞬时的。这使得生成了被诱导的细胞（即采用本说明书中公开的方法被诱导特化的细胞），能够对刺激做出反应，特别是响应葡萄糖而生产胰岛素。

因此在一方面，本发明提供了一种能够上调细胞中MafA表达的短RNA，其中所述短RNA包括长度为19-25个核苷酸且包括序列为AUCUGUACUGGAUGAGCGG(SEQ ID NO:1)或UUUCCCGCAGGAGAUUGAC(SEQ ID NO:2)的第一链。所述RNA优选包括长度为19-25个核苷酸的第二链，并与所述第一链形成双链。优选地，所述RNA的每一条链在其3'末端具有1-3个未配对的核苷酸形成突出。优选地，所述的3'突出包含一个或多个尿嘧啶核苷酸或由一个或多个尿嘧啶核苷酸组成。

在一个实施方案中，所述短RNA包括含SEQ ID NO:1或由SEQ ID NO:1组成的第一链，以及含SEQ ID NO:2或由SEQ ID NO:2组成的第二链。在另一个实施方案中，所述短RNA包括含SEQ ID NO:3或由SEQ ID NO:3组成的第一链，以及含SEQ ID NO:4或由SEQ ID NO:4组成的第二链。

在进一步方面，本发明提供了将本说明书中限定的短RNA用于诱导通过细胞生成胰岛素的用途。该用途可以是体外或体内的。

优选地，在本说明书中公开的用途和方法中，包含序列AUCUGUACUGGAUGAGCGG(SEQ ID NO:1)的短RNA和包含序列UUUCCCGCAGGAGAUUGAC(SEQ ID NO:2)的短RNA组合使用。

在进一步方面，本发明提供了一种诱导由细胞生成胰岛素的方法，所述方法包括用本说明书中限定的短RNA接触所述细胞。所述方法可以是在体内或体外或来自体内的。

优选地，在本说明书中公开的用途和方法中，所述胰岛素生成为葡萄糖响应的。

在进一步方面，本发明提供了一种含在本说明书中限定的一种或多种短RNA的来自体内或体外的细胞。此外，本发明提供了一种被诱导生产胰岛素的可以通过本说明书中限定的方法获得的来自体内或体外的细胞。

“诱导胰岛素生成”可以涉及分化，即推动细胞向特定的（胰腺）世系分化并降低细胞的潜能。因此，多能（multipotent）或多潜能（pluripotent）细胞可被诱导分化成属于特定世系的特化细胞，例如β细胞。诱导胰岛素生成可以涉及转分化，即属于特定世系的细胞可被诱导为具有属于不同世系的特定功能特性。例如，分化细胞，例如上皮细胞、肝细胞，如肝细胞（hepatocyte），或者成纤维细胞可被诱导生产另一种细胞类型特有的靶蛋白，例如胰岛素。可选地，诱导胰岛素生成有可能会将细胞诱导获得特化的特性（胰岛素生成）而保留多潜能或多能性的表型。因此，诱导干细胞生产胰岛素可以导致生成能够生产胰岛素的胰腺β细胞，但或者会导致生成能够生产胰岛素的多潜能细胞，或能够生产胰岛素的非胰腺体细胞，例如肝细胞。

通过本说明书中公开的方法制造的特化的，即生产胰岛素的细胞已经通过诱导胰岛素生成而生成，因此其可以被称之为“诱导细胞”。

在本发明的方法中，上调靶基因MafA可能会间接影响到胰岛素的生成。MafA可能立即或最终调控胰岛素的生成（间接效应）。生产的调控可尤其包括编码靶蛋白胰岛素的基因的转录的激活，或者编码靶蛋白胰岛素的基因的转录阻抑物的抑制。MafA也可通过调节级联事件而影响靶蛋白胰岛素的生成，这可被称之为“下游”调控。下游调控可以包括通过使用可调控第二基因的靶基因MafA的短RNA而上调，所述第二基因可调控靶蛋白胰岛素，或者所述第二基因可以调控第三基因，该级联最终会导致靶蛋白胰岛素生成的上调。

可影响胰岛素生成（间接效应）的基因包括PDX1、神经原素3(Ngn3)、Rfx6、MafA、Hlxb9、Hnf6、Ptf1a、NeuroD、乙胞素和Nkx6-1。

可以在本发明的任何方法中同时使用两种或更多种不同的saRNA分子。它们可以下调相同的靶RNA转录物或每个saRNA分子可下调不同的RNA转录物。

本发明的发明人已经通过诱导细胞而不仅仅实现了胰岛素的表达。正如在实施例中显示的，发明人的方法也导致分泌胰岛素，这对很多应用是合乎需要的。如果细胞是用于体外生成胰岛素，则胰岛素的分泌避免了耗时的提取胰岛素的程序。如果细胞是用于移植，或者如果所述方法被用在体内，则所诱导的细胞能够分泌胰岛素是非常重要的。

本发明的方法也实现了以葡萄糖响应的方式生产胰岛素。如在实施例中所显示的，被诱导的细胞在含葡萄糖的情况下比不含葡萄糖的情况下生产明显更多的胰岛素。这对于体内应用明显是高度有利的。

就我们所知，这是第一份关于以葡萄糖响应的方式诱导细胞生成和分泌胰岛素的方法的报告。并非希望受限于理论，可以相信，以葡萄糖响应的方式生成和分泌胰岛素可以通过使用saRNA技术，以及特别通过使用saRNA技术上调MafA而实现。

本发明的方法/用途优选获得可以以葡萄糖响应的方式生成/能够生成胰岛素的细胞。表述“葡萄糖响应”是本领域所熟知的，因此本领域技术人员知道“葡萄糖响应”意味着在存在葡萄糖的情况下比在缺乏葡萄糖的情况下胰岛素的生成和/或分泌更多。应当理解，至少在体内的部分中，“存在葡萄糖”指的是生理学意义浓度的葡萄糖，“缺乏葡萄糖”指的是葡萄糖的浓度过低，达不到生理学意义，以及完全缺乏葡萄糖。优选地，葡萄糖响应的细胞在存在葡萄糖的情况下比在缺乏葡萄糖的情况下多生产至少20、30、40、50、60、70、80、90、95或100%的胰岛素。优选地，胰岛素生成与葡萄糖浓度正相关，即当接触到高葡萄糖浓度时，细胞会比在接触到低葡萄糖浓度时生成更多的胰岛素。优选地，在细胞外环境中增加葡萄糖浓度会相伴地增加胰岛素的产量。优选地，细胞表现出模拟健康的胰腺β细胞的葡萄糖响应。

因此，优选地，细胞以葡萄糖响应的方式被诱导生成胰岛素。同样优选地，细胞被诱导分泌胰岛素。

可以采用标准方案例如免疫荧光、ELISA或蛋白质印迹法对胰岛素的生成进行分析。在实施例中描述了适当的分析。例如，样品可以接触抗胰岛素抗体，并且所结合的抗体可以通过被标记的第二抗体进行检测。胰岛素生成也可在RNA水平进行分析，例如使用（逆转录酶）PCR，优选为半定量或定量PCR。本领域技术人员知道ELISA可被用于分析胰岛素分泌。可以通过比较接触葡萄糖的细胞与不接触葡萄糖的细胞的胰岛素产量来测定葡萄糖响应性。

本发明的方法可以使用全能细胞、多潜能细胞或体细胞进行，即任何这些细胞均可被用作被诱导特化为生产胰岛素的起始细胞。本说明书中公开的方法从起始细胞生成了特化的生成胰岛素的细胞。通过这些方法生成的特化细胞至少在靶蛋白胰岛素的表达上不同于起始细胞。

合适的起始细胞会在下面更详细地讨论到。全能细胞具有分化成在有机体中发现的，以及形成完整有机体的每一种细胞的能力。多潜能细胞是有可能分化成三种胚层中的任一种的细胞，这三种胚层为：内胚层（内部胃粘膜、胃肠道、肺）、中胚层（肌肉、骨、血液、泌尿生殖）或外胚层（表皮组织和神经系统）。分化潜力是指细胞可以分化成不同类型细胞的程度。多潜能细胞的分化潜能大于多能细胞的分化潜能。在一个细胞群内，单个细胞可以具有不同的分化潜能。多能细胞群在一定时间后，可以包括一些已经分化成体细胞的细胞，以及一些未分化并仍具有多能性的细胞。类似地，多潜能细胞群在一定时间后可以包含多能细胞和体细胞以及多潜能细胞。因此，本发明的方法可被用于相关的全能细胞、多潜能细胞、多能细胞或体细胞群。细胞可以为成熟或胚胎细胞，例如成熟干细胞，胚胎干细胞或癌源干细胞，成熟干细胞是优选的。

细胞优选为人细胞。

多潜能细胞可以为被诱导的多潜能干细胞（简写为iPSC或iPS细胞），即人工从非多潜能细胞（通常为成熟体细胞），通过诱导某些基因的“受迫”表达而派生的一种多潜能干细胞。

WO2005/059113公开了一种特别有利的类型的多潜能干细胞。这种干细胞可直接分离自骨髓和/或血液，例如外周血，或分离自取自脐带或胎盘的材料，并且具有特殊的能力分化成外胚层、中胚层和内胚层细胞。如果非全能的话，这些细胞因此很清楚地为多能的或多潜能的。因此，在WO2005/059113中描述的干细胞提供了可以以自身（自对自）方式使用的用于组织移植的有用来源的细胞。

在WO2005/059113中公开的细胞在本领域被称之为“OmniCytes”。WO2005/059113的教导以其全部内容被结合到本说明书中作为参考。OmniCytes为CD34^＋干细胞，能够自我再生并且能够分化成外胚层、中胚层和内胚层细胞，包括造血细胞。如上所述，它们可以被直接分离自骨髓和/或血。它们的进一步特征为能够在培养期间粘附到塑料上（例如标准组织培养皿的塑料）。合适的培养皿为由美国纽约的康宁公司所生产的培养皿。

OmniCytes的进一步特征为它们并不需要滋养层，即支持干细胞生长的细胞（通常通过γ照射被钝化，可提供重要的代谢产物，而其自身不会进一步生长或分裂）。

OmniCytes的进一步特征为可通过如下获得：

a)富集CD34⁺细胞的组织或血液样品；

b)将样品与固相支持体接触，收集粘附至所述固相支持体上的细胞。

合适的组织或血液样品包括骨髓、外周血、脐带血或组织、胎盘和从脂肪去除法获得的样品。

更具体地，它们可以通过如下获得：

对组织或血液样品（优选为造血组织例如血液或骨髓样品）进行密度梯度分离；

使低密度细胞接触CD34的亲和配体（优选附着于顺磁珠）；

恢复附着于所述CD34配体上的细胞；

将CD34⁺亚群接触组织培养级塑料；以及

恢复附着于所述塑料上的CD34⁺细胞。

Omnicytes优选为成熟细胞，因此不是胎细胞。

OmniCytes的一份样品于2004年9月24日保藏在索尔兹伯里，波登当SP40JG的ECACC，收录号为04092401。该保藏物由英国伯克郡，宾菲尔德，手纺车路，柳树屋RG42 5QH的默特尔·戈登教授制作，该细胞系被命名为“干细胞OmniCyte”。

本发明的方法优选在选自OmniCytes、造血干细胞（HSC）和间充质干细胞（MSC）的细胞上进行，OmniCytes是特别优选的。

多能细胞是一种具有使细胞分化成多种但有限数量的世系的潜能的细胞。多能细胞的一个例子为造血细胞，其能够发展成多种血细胞，但不能发展成脑细胞或其他类型细胞的血液干细胞。间充质干细胞或MSCs为发展成多种细胞类型包括成骨细胞（骨细胞）、软骨细胞（chondrocytes）(软骨细胞（cartilagecells））和脂肪细胞（脂细胞）的多能干细胞。

体细胞为构成有机体的躯体的任何类型的细胞，除种系细胞（配子）——该细胞构成配子（配子母细胞）、多能细胞和多潜能细胞以外。体细胞可源自任何动物，但优选为哺乳动物细胞，最优选为人细胞。合适的例子包括肝的细胞（liver cells）如肝细胞（hepatocytes）、胰腺细胞例如β细胞、上皮细胞和成纤维细胞，肝细胞和胰腺细胞是优选的。

应该明白，本发明的方法可以不，并且的确不必实现对与本发明的短RNA接触的细胞群内的所有细胞的诱导。因此，在接受本发明的方法，即接触本发明的短RNA的细胞群中，优选至少10、20、30、35、38、40、42或45%，例如大约25-55%、30-50%、35-45%可以被诱导生产胰岛素，虽然在一些实施方案中至少50、60、70、80或90%的细胞被诱导生产胰岛素。

在本说明书中使用时，术语“RNA”指的是包含至少一个核苷酸残基的分子。“核苷酸”指的是在β-D-呋喃核糖部分的2'位置含羟基的核苷酸。该术语包括双链RNA、单链RNA、分离的RNA例如部分纯化的RNA、基本上纯化的RNA、合成的RNA、重组生产的RNA，以及通过添加、缺失、取代和/或改变一种或多种核苷酸而不同于天然存在RNA的改变的RNA。这种改变可以包括例如向RNA的端部或内部，例如在RNA的一个或多个核苷酸处添加非核苷酸物质。本发明的RNA分子的核苷酸也可包括非标准核苷酸，例如非天然存在核苷酸或化学合成的核苷酸或脱氧核苷酸。这些改变的RNA可被称为天然存在RNA的同型物或类似物。

本说明书中使用的术语“双链RNA”或“dsRNA”指的是核糖核酸双螺旋，包括但不局限于内源和人造siRNA、短发夹RNA(shRNA)和微RNA(miRNA)。

本说明书中使用的术语“小干扰RNA”或“siRNA”指的是能够通过RNAi，由序列特定介导的裂解对一种或多种靶RNA转录物调节基因表达的核酸分子。通常在RNAi中，RNA转录物为mRNA，因此该靶点的裂解会导致基因表达的下调。然而在本发明中，可以分别通过裂解所感兴趣的靶基因反义或正义的RNA转录物而实现对靶基因的上调或下调。

siRNA是长度为19-25个碱基对的双链RNA分子，在每个3'末端具有几个未配对的碱基，形成3'突出。优选地，每个3'突出的长度为1-3个，更优选为2个核苷酸。siRNA包括含对靶RNA转录物的区域完全或近乎完全互补的序列的一条链。称为RNA诱导的沉默复合体(RISC)的蛋白复合体，结合了siRNA双螺旋的这条链（引导链），将其作为模板以识别靶RNA转录物。RISC随后便涉及到对所结合的链具有完全或近乎完全互补性的靶RNA转录物的裂解中。siRNA分子的另一条链并不具有对靶RNA转录物的区域的互补性，被称为过客链。

并非siRNA分子但能够通过RISC相关的裂解下调对其具有完全或近乎完全的互补性的靶RNA转录物的单链或双链RNA分子据说具有siRNA样活性。本发明的短RNA分子具有这种活性。

“互补性”和“互补的”指的是第一核酸能够与第二核酸例如通过沃森-克里克碱基配对形成氢键。能够与另一种核酸通过非沃森-克里克碱基配对形成氢键的核酸也落入具有互补性的定义之内。互补性百分率指的是核酸分子中能够与第二核酸序列形成氢键（例如，沃森-克里克碱基配对）的残基的百分率（例如，10个中有5、6、7、8、9、10个为50%、60%、70%、80%、90%和100%的互补性）。

“完全互补”或“完全的互补性”指的是第一核酸的所有连续残基都会与第二核酸序列中的相同数量的连续残基形成氢键。“近乎完全的”互补指的是第一核酸序列中的基本上所有的连续残基均会与第二核酸序列中的相同数量的连续残基形成氢键，然而，由于第一核酸是通过不完美的方法例如转录或涉及使用生物学分子的分子生物学方法所制备的这一事实，第一序列可能对第二序列不是100%互补的。然而，在第一序列中不能与第二序列中相应的残基形成氢键的残基的数量足够低，两个核酸序列仍通过氢键结合到所需要的程度以实现希望的目的。通常，“近乎完全的互补性”指的是第一核酸序列与第二核酸序列具有至少95%的互补性。

“同一”、“相同”或“序列同一”指的是第一核酸在序列上与第二核酸序列相同。同一百分率指的是在第一核酸分子中与第二核酸序列相同的残基的百分率（例如，10个中有5、6、7、8、9、10个为50%、60%、70%、80%、90%和100%的相同）。

“完全同一”或“完全相同”指的是第一核酸序列的所有连续残基与第二核酸序列中相同数量的连续残基相同。“近乎完全的”同一指的是第一核酸序列中的基本上所有的连续残基与第二核酸序列中的相同数量的连续残基相同，然而，由于第一核酸是通过不完美的的方法例如转录或涉及使用生物学分子的分子生物学方法所制备的这一事实，第一序列可能与第二序列不是100%相同。然而，第一序列中与在第二序列中相应的残基不相同的残基的数量足够低，这两个核酸序列仍足够相同以实现设定的目的。通常，“近乎完全的同一”指的是第一核酸序列与第二核酸序列具有至少95%的同一性。

除非明确另外声明，否则在本说明书中使用的对序列互补性或同一性的所有基准均是指短RNA分子的全长。

短RNA可以包括与靶RNA转录物不互补的非常短的3'或5'序列。优选地，这种序列为3'。所述序列长度可以是1-5个，优选为2-3个，例如2或3个核苷酸。所述序列优选包括尿嘧啶或由尿嘧啶组成，因此最优选地为2或3个尿嘧啶的3'延伸。这种非互补的序列可以称为“末尾”。因此，短RNA优选由如下组成：(i)与靶RNA的区域具有至少95%互补性的序列；以及(ii)1-5个核苷酸的3'末尾，其优选包括尿嘧啶残基或由尿嘧啶残基组成。短RNA会因此通常在除3'末尾（如果有的话）外的其全长上具有与靶RNA转录物的区域的互补性。

在本说明书中公开的任何短RNA序列均可选地包括这种3'末尾。因此，在表中公开的任何序列均可选地包括这种3'末尾。

序列比对和同一百分率或互补性百分率计算可以使用本领域中已知的任何方法或工具进行测定，包括但不限于LASARGENE生物信息学计算组（computing suite）的Megalign程序（DNASTAR股份有限公司，麦迪逊，WI）、Clustal V比对法（Higgins和Sharp(1989)CABIOS.5:151-153）和BLAST2.0程序组（BLAST 2.0suite of programs）。进行BLAST分析的软件是公开可得的，例如通过国家生物技术信息中心得到。本领域技术人员能够设定这些工具的参数以实现他所希望的目的。

在评定第一和第二核酸序列，其中一个序列为DNA序列而另外一个为RNA序列的同一性或互补性时，必须记住，RNA序列包括尿嘧啶，而DNA序列包括胸腺嘧啶。因此，在评定序列同一性的这些情况下，尿嘧啶残基被认为与胸腺嘧啶残基相同，当评定互补性时，尿嘧啶残基被认为与腺嘌呤残基互补/能够与其形成氢键。

基因的“抑制”或“下调”指的是基因的表达水平、或由基因编码的多肽的水平或其活性、或由基因转录的RNA分子的水平下降到低于在缺乏本发明的短RNA分子时观察到的水平。如果RNA分子被说成被“下调”，这指的是RNA分子的水平被降低到低于在缺乏本发明的短RNA分子时观察到的水平。

基因的“激活”或“上调”指在是基因的表达水平、或由基因编码的多肽的水平或其活性、或由基因转录的RNA分子的水平升高到高于在缺乏本发明的短RNA分子时观察到的水平。

优选的，本发明的所有方法均在体外或间接体内进行，当然体内方法也是可以的。因此，它们可以在先前被从受试者上分离出来的细胞或组织样品上进行。它们可以在确立细胞株的细胞上进行。

优选地，在上述方法中使用的“短”RNA分子长度为13个核苷酸到30个核苷酸，更优选长度为16到25个核苷酸，进一步更优选长度为17到21个核苷酸，最优选长度为19、20、21、22、23个核苷酸。

短RNA分子可以是单链或优选为双链。如果为双链，优选双螺旋的每条链的长度至少为14，更优选为至少18，例如19个核苷酸。优选地，双螺旋在长度为至少12，更优选至少15，更优选至少17，进一步更优选至少19个核苷酸上杂交。每条链的长度可以为精确的19个核苷酸，或者为19个核苷酸加3'末尾，因此长度为20、21、22、23、或25个核苷酸。优选地，双螺旋的长度不到30个核苷酸，因为双螺旋超过这一长度可能会增加诱导干扰素反应的风险。形成dsRNA双螺旋的链可以具有相同或不同的长度。

最优选地，短RNA分子为短干扰RNA(siRNA)分子。

可选地，短RNA分子为dsRNA分子，由两条稳定的碱基配对在一起的链组成，在每条链的3'末端含多个未配对的核苷酸形成3'突出。形成每条链的3'突出的未配对的核苷酸的数量优选的范围是1到5个核苷酸，更优选1到3个核苷酸以及最优选2个核苷酸。3'突出可以由上述3'末尾形成，因此3'末尾可以是3'突出。

短RNA分子必须有效及明确地下调靶RNA转录物。如上所述，这可通过与靶RNA转录物内的序列具有高度互补性的短RNA而实现。短RNA与靶RNA转录物的区域具有不多于5个，优选不多于4或3个，更优选不多于2个，进一步更优选不多于1个的错配，最优选无错配。

测定两个或更多个序列的互补性的程度可以通过本领域已知的任何方法进行。优选地，所使用的方法为在Hossbach等（同上）中给出的。根据该方法，使用了可在http://www.mpibpc.mpg.de/groups/luehrmann/siRNA得到的Perl脚本（Perl script）。

另外，用于设计和分析短RNA分子的各种工具都是熟知的，本领域普通技术人员可以确定能够实现有效和特定下调靶RNA转录物的RNA分子。确定的方法包括，例如GPboost和Reynolds算法(PMIDs:15201190，14758366)。另外，短RNA引起靶RNA的有效下调的能力可以采用测量细胞中RNA或蛋白水平的标准技术进行评价。例如，本发明的短RNA可被递送给培养的细胞，靶RNA的水平可通过技术包括但不限于RNA印迹或斑点印迹技术，或通过定量RT-PCR进行测量。

优选地，短RNA没有aaaa、cccc、gggg或uuuu的基序。优选地，短RNA的GC百分率为至少20%，不超过75%，即在20%和75%之间，优选在20%和55%之间。上述方法的短RNA理想地为热力学稳定的双螺旋，在该情况下，每条链的GC百分率至少为25%且不超过75%，即在25%和75%之间，优选在20%和55%之间。

测定RNA是否具有基序aaaa、cccc、gggg或uuuu以及测定分子/链的GC含量百分率的工具和算法是本领域技术人员所熟知的。这些工具包括在Saetrom和Snove,(2004)Biochem Biophys Res Commun321：247-253和Vert等,(2006)BMC Bioinformatics7∶520(17页)中描述和引用的。

短RNA能够诱导与结合进RISC蛋白复合体的短RNA链具有有限数量的错配的非靶向转录物的下调。这降低了短RNA分子的效力，因此是不希望的。因此，短RNA分子应该与转录物而不是所希望的靶点具有有限的互补性，以防止不希望的脱靶影响。具有基于裂解的脱靶影响的短RNA候选的概率是其互补性与非靶向RNA序列的函数，并且能够通过本领域任何已知的方法进行测定。可选地，无缺口Smith-Waterman法（TF Smith&MS Waterman(1981)Journal of molecular biology147∶195-197）可被用于针对Ensembl(Flicek,P.,等(2008)Ensembl2008.Nucleic Acids Res36∶D707-714)人类转录物组数据库（O.,Jr.,等(2004)Biochem Biophys Res Commun，325:769-773）筛选候选短RNA以识别短RNA的可能的脱靶转录物。可选地，短RNA可针对所选择的RNA序列群进行筛选，例如GenBank序列的选择，其不包括完整的Ensembl人类转录物组数据库。可选地，可以使用汉明间距测定。

优选地，短RNA分子对所识别的脱靶转录物具有多于两个错配。或者认为，优选短RNA分子对所有可能的脱靶转录物具有2或更大的汉明间距。如果短RNA为双链，则优选两条链均满足这一要求。

可选地，短RNA分子与已知的高度有效的标准siRNA具有相同的特性。优选地，短RNA，或者如果是双链的话则短RNA的一条或两条链的GPboost得分多于0.1。GPboost是一种已知的siRNA效力的基于遗传编程的预测系统，用于确定siRNA链的GPboost得分的方法在“通过提高的遗传编程在反义和RNAi实验中预测短的寡核苷酸的效力（Predicting the efficacy of shortoligonucleotides in antisense and RNAi experiments with boosted geneticprogramming）”， Saetrom(2004)Bioinformatics20(17)：3055-3063中公开，该文献的内容被结合到本文中作为参考。可选地或另外，短RNA分子具有与高度有效的siRNA相关的特殊的序列特征。由雷诺兹[Reynolds等(2004)Naturebiotechnology22(3):326-330]所描述的算法，该篇文献被结合到本文中作为参考，可以进行测定短RNA是否具有这种类型的足够特征。本领域普通技术人员能够确定和提炼为其具体目的的阈值。

可选地，短RNA分子包括与高度有效的siRNA有关的位置特异性的序列基序。siRNA效力预测算法是本领域所熟知的，与高度有效的siRNA相关的基序在Saetrom和Snove，(2004)Biochem Biophys Res Commun321：247-253中讨论过，该篇文献的内容被结合到本文中作为参考。

优选地，短RNA分子能够直接进入细胞的RNAi机器或能够在进入细胞的RNAi机器之前由Dicer进行加工。确定短RNA分子是否能够在进入细胞的RNAi机器之前由Dicer加工的方法是本领域所熟知的，例如体外Dicer试验如在Tiemann等,(2010)RNA16(6):1275-1284和Rose等(2005)Nucleic AcidResearch33(13)∶4140-4156中所公开的。

如果短RNA分子为双链，并且如果分子内仅有一条链能够有效和明确地下调靶RNA转录物，则优选该链优先装载入RISC中。设计其中一条链优先装载入RISC中的双链RNA分子属于本领域普通技术人员的能力范围。例如，靶向于靶RNA转录物的短RNA分子的链的5’末端可被制造或选择为比另一条链的5'末端的热力学稳定性差。优选地，双螺旋的热力学末端稳定性差别较大，因此靶向于靶RNA转录物的短RNA分子的链的5'末端比另一条链的5'末端热力学稳定性差。双螺旋热力学末端稳定性中的差的绝对值（ΔΔG）可以根据本领域中的任何方法标准进行计算。可选地，通过考虑双螺旋末端的5个末端核苷酸，由RNAfold（Hofacker等，(2003)Nucleic Acid Research，第31卷第13期，3429-3431页）计算双螺旋热力学末端稳定性中的差的绝对值。优选地，由RNAfold计算的双螺旋热力学末端稳定性中的差的绝对值大于0kcal/mol，更优选大于1kcal/mol，更优选大于3kcal/mol。

许多短RNA设计的标准工具，例如如上所述的那些，为评定分子的这一特性提供了方法。例如，如果双链分子具有的热力学性质相对于一条链更有利于另一条链结合进RNAi机器中，则可以选择双链分子。可选地，可以通过使用包含通过添加、缺失、取代和/或改变一个或多个核苷酸而不同于天然存在的RNA的dsRNA而实现优先装载一条链。这些修饰对本领域技术人员是熟知的，并会在下面进一步讨论。

Dicer是一种核糖核酸酶蛋白，可将外源性dsRNA裂解成19-25个碱基对的双链片段，在每个3'末端具有几个未配对的碱基形成3'突出。在上述方法中使用的短RNA可以为Dicer-酶底物（Dicer-substrate）siRNA(D-siRNA)。被设计为Dicer酶底物的siRNA具有与标准长度的siRNA和shRNA相比增加的效力。

D-siRNA为不对称的siRNA-双螺旋，其中链的长度为22-30个核苷酸。通常，一条链（过客链）长22-28个核苷酸，优选长25个核苷酸，并且另一条链（引导链）长24-30个核苷酸，优选长27个核苷酸，因此双螺旋在过客链的3'末端为平端，双螺旋在引导链的3'末端具有突出。该突出长度为1-3个核苷酸，优选为2个核苷酸。过客链也可含有5'磷酸。

通常在D-siRNA中，过客链的3'末端的两个核苷酸为脱氧核糖核酸(DNA)而不是核糖核酸(RNA)。DNA和平端双螺旋保证了酶Dicer将双螺旋处理成分别在原始D-siRNA的过客链和引导链的5'和3'末端由21个核苷酸组成的21mer双螺旋。

将标准19mer siRNA分子延伸成D-siRNA的方法在本领域是熟知的，例如在Hefner等(2008)J.Biomol.Tech.19(4):231-237中描述过。

当延伸至27mer/25mer D-siRNA时，许多siRNA分子的末端结构中所预测的在过客链的3'末端未配对的碱基数量小于或等于引导链的5'末端所预测的未配对碱基的数量。根据已知的miRNA的结构以及Dicer PAZ-域的结合要求，该结构很可能为次最优地用于Dicer处理，因此，虽然可用作siRNA分子，在延伸到Dicer-酶底物siRNA分子时这种双螺旋较少使用。因此，优选地，本发明的短RNA并不具有这种结构，相反，过客链的3'末端的所预测的未配对碱基数大于引导链的5'末端的所预测的未配对碱基数。

可选地，在上述方法中使用的短RNA分子也可包括修饰，即通过添加、缺失、取代和/或改变一个或多个核苷酸而区别于天然存在RNA的RNA。例如，如果短RNA为双链，则dsRNA分子的两条链可以通过连接部分例如化学连接基团或寡核苷酸连接子连接，因此dsRNA生成的结构为发夹结构。连接部分切不可阻断（block），否则会负面影响dsRNA的活性，例如通过阻断链向RISC复合物的装载或与Dicer联合。许多合适的化学连接基团是本领域所知的。如果使用的是寡核苷酸连接子，则其可以为任意序列或长度，条件是dsRNA的全部功能均被保留。优选地，连接子序列包含比其他核苷酸碱基更高量的尿苷和鸟嘌呤，并且优选长度为大约4-9，更优选为8或9个残基。

短RNA中可以包括修饰，前提是该修饰不会防止RNA成分被用作Dicer的酶底物。可以进行一种或多种修饰，提高dsRNA的Dicer处理，生成更有效的RNAi世系，支持更大的RNAi作用，导致要被递送至细胞的每个dsRNA分子的更大的效力和/或有助于保证治疗背景下的dsRNA的稳定性。

可以3'-末端区域、5'-末端区域、在3'-末端和5'-末端区域或一些情况下在序列内的各个位置处结合有修饰。考虑到上述的限制后，RNA中可以结合有各种数量及各种结合的修饰。如果有多处修饰，这些修饰可以相同或不同。包括了对碱基、糖部分、磷酸骨架以及其组合的修饰。5'末端可以被磷酸化。

短dsRNA分子可通过位于过客链的3'端部的合适的修饰子进行修饰利于Dicer处理，即dsRNA被设计为引导Dicer结合和处理的定向。合适的修饰子包括核苷酸例如脱氧核苷酸、双脱氧核苷酸、无环核苷酸等等以及空间位阻分子，例如荧光分子等等。无环核苷酸用通常存在于dNMP中的2'-脱氧呋喃核糖取代了2-羟基乙氧甲基。其他的核苷酸修饰子可包括3'-脱氧腺苷(虫草素)、3'-叠氮基-3'-脱氧胸苷(AZT)、2',3'-双脱氧肌苷(ddl)、2',3'-双脱氧-3'-硫代胞嘧啶（3TC）、2',3'-双脱氢-2',3'-双脱氧胸苷(d4T)和3'-叠氮基-3'-脱氧胸苷(AZT)、2',3'-双脱氧-3'-硫代胞嘧啶（3TC）和2',3'-双脱氢-2',3'-双脱氧胸苷(d4T)的磷酸核苷酸。脱氧核苷酸可被用作修饰子。当使用核苷酸修饰子时，1-3个核苷酸修饰子，或2个核苷酸修饰子被取代为过客链的3'末端上的核糖核苷酸。当使用空间位阻分子时，它们被固定至过客链的3'端部的核糖核苷酸处。因此，链的长度并不会随修饰子的加入而改变。可选地，dsRNA中的两个DNA碱基被取代以引导Dicer处理的定向。可选地，两个端部DNA碱基位于过客链的3'末端代替引导链的5'末端及在过客链的3’末端上的形成双螺旋平端的两个核糖核苷酸，两个核苷酸的RNA突出位于引导链的3'末端。这是不对称的组合物，DNA位于平端上，而RNA位于突出端上。

所包括的对于磷酸骨架的修饰的例子包括磷酸酯，包括甲基磷酸、硫代磷酸酯和磷酸三酯修饰如烷基磷酸三酯，等等。所包括的对于糖部分的修饰的例子包括2'-烷基嘧啶，如2'-O-甲基，2'-氟代，氨基，以及脱氧修饰等等（例如参见Amarzguioui等,2003）。所包括的对于碱基基团的修饰的例子包括脱碱基糖、2-O-烷基修饰的嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-碘尿嘧啶和5-(3-氨丙烯基)-尿嘧啶等等。锁核酸，或LNA's，也可被包括在内。许多其他修饰是已知的，并且只要满足上述标准就可被使用。

本发明的短RNA也可部分包括纯化的RNA、基本上纯的RNA、合成的RNA，或重组生产的RNA。对于短RNA来说其他可能的改变包括将非核苷酸材料添加到短RNA的端部或短RNA的一个或多个内部核苷酸处；使得短RNA耐受核酸酶消化的修饰（例如，使用2'-取代的核糖核苷酸或对糖-磷酸骨架进行修饰）；或对短RNA中的一个或多个核苷酸用脱氧核糖核苷酸取代。

如果短RNA为双链，则优选两条链能够有效和明确地下调上文所限定的靶RNA转录物。设计这些多功能siRNA分子的方法在Hossbach等,(2006)RNABiology3(2):82-89中公开过，该文献的内容被结合到本说明书中作为参考。

如果短RNA为双链并且两条链都能够有效和明确地下调上文所限定的靶RNA转录物，则优选双螺旋热力学端部稳定性上没有大的差别。双螺旋热力学末端稳定性中的差的绝对值（ΔΔG）可以根据本领域中的任何方法标准进行计算。可选地，通过考虑双螺旋末端的5个末端核苷酸，由RNAfold（Hofacker等，(2003)Nucleic Acid Research，第31卷第13期，3429-3431页）计算双螺旋热力学末端稳定性中的差的绝对值。优选地，由RNAfold计算的双螺旋热力学末端稳定性中的差的绝对值小于3kcal/mol，更优选小于1kcal/mol。

在本发明的方法中，通过上调即激活靶点特化诱导基因MafA而实现对胰岛素生成的诱导。上调即“顺式”上调。在本文中，“顺式”上调指的是靶RNA转录物从与靶基因MafA的位点相关的位点处被转录。

靶RNA转录物从靶基因的转录起点的上游最多500个核苷酸或下游最多500个核苷酸的位点上开始转录。

在本发明的靶RNA转录物的内容中术语“从[具体的位点]转录”指的是“靶RNA转录物的转录起点被发现在[具体的位点]”。靶RNA转录物的转录起点可以被发现于包含靶基因的染色体的任一条链上，条件是含有靶RNA转录物的其他基本特征。

靶RNA转录物包括对位于靶基因的转录起点的500、250或100个上游核苷酸和靶基因的转录终点的末端500、250或100个下游核苷酸之间的基因组序列反义的序列。可选地，靶RNA转录物包括对含靶基因的编码区的基因组序列反义的序列。

当用于描述本发明的内容中的核酸序列时使用的术语“正义”指的是序列与在靶基因的编码链上的序列具有同一性。当用于描述本发明的内容中的核酸序列时使用的术语“反义“指的是序列与在靶基因的编码链上的序列是互补的。

基因的“编码链”是包括基因的mRNA的编码序列的链。基因的“模板链”是不包括基因的mRNA的编码序列的链。

术语“互补”和“互补性”在上文中进行了限定。优选地，靶RNA转录物包括沿其全长与靶基因的编码链上的序列具有至少75%、优选至少85%，更优选至少90%，进一步更优选至少95%互补的序列。优选地，靶RNA转录物包括沿其全长与靶基因的编码链上的序列具有完全或近乎完全互补性的序列。

可选地，靶RNA转录物包括一个或多个，通常为几个（例如至少3或至少6个）不-缺口的序列，这些序列对在靶基因的编码链上的序列具有完全或近乎完全的互补性，所述不-缺口的序列的长度至少为16个核苷酸，更优选至少25个核苷酸，更优选至少50个核苷酸，进一步更优选至少75个核苷酸，最优选至少100个核苷酸。

在评定RNA转录物和上述基因组序列之间的同一性/互补性时，编码/模板链被认为是向基因的转录区域的上游和下游延伸，即术语“编码链”和“模板链”仅标记实际的链，并不含对长度的任何限制。

靶RNA转录物可以是编码RNA分子，即编码氨基酸序列的RNA分子，或是非编码RNA分子，即不编码氨基酸序列的RNA分子。优选地，靶RNA转录物为非编码RNA。

靶RNA转录物的长度优选为至少16个核苷酸。然而优选地，靶RNA转录物的长度为至少100个，更优选至少200个核苷酸，最优选长度为至少1000个核苷酸，也许长度至少为4000个核苷酸。

靶RNA转录物包括对靶基因的编码链上的基因组序列互补的序列。

可选地，对靶RNA转录物反义的基因组序列包括靶基因的部分启动子区。另一种描述该特征的方式为反义靶RNA转录物与靶基因的启动子区“重叠”。基因可以包括多个启动子区，此时靶RNA转录物可以与一个、两个或多个启动子区重叠。可以使用评注基因座位（annotated gene loci）的在线数据库识别基因的启动子区。

对于任何给定的启动子区，不需要整个启动子区被重叠，启动子区内的子序列与靶RNA转录物重叠就足够了，即重叠可以是部分重叠。类似地，整个靶RNA转录物不必对启动子区内的序列反义，仅需要靶RNA转录物包括对启动子区反义的序列。

靶RNA转录物与靶基因的启动子区之间的重叠区可以短至长度为单个核苷酸，虽然优选长度至少为15个核苷酸，更优选长度为至少25个核苷酸，更优选长度为至少50个核苷酸，更优选长度为至少75个核苷酸，最优选长度为至少100个核苷酸。下列具体安排中的每一个均用于落入术语“重叠”的范围内：

a)靶RNA转录物与靶基因的启动子区长度相同，它们在其全部长度上重叠（及它们互补）。

b)靶RNA转录物比靶基因的启动子区短，在其全部长度上与靶基因的启动子区重叠（即在其全部长度上与靶基因的启动子区内的一个序列互补）。

c)靶RNA转录物比靶基因的启动子区长，靶基因的启动子区与其完全重叠（即靶基因的启动子区在其全部长度上与靶RNA转录物内的一个序列互补）。

d)靶RNA转录物和靶基因的启动子区具有相同或不同的长度，重叠区域比靶RNA转录物的长度及靶基因的启动子区的长度都要短。

上述对“重叠”的限定加上必要的变更也适用于整个说明书中对其他重叠序列的描述。显然，如果反义RNA转录物被描述为与除启动子区外的靶基因的区域重叠，则转录物的序列与除启动子区内以外的该区域内的序列互补。

优选地，RNA转录物包括对含靶基因的转录起点的基因组序列反义的序列。换句话说，优选地，靶RNA转录物包括与靶基因的转录起点重叠的序列。

并非希望受到理论的限制，可以相信，本发明的短RNA可以通过诱导对靶基因MafA的区域反义的靶RNA转录物的siRNA样裂解而实现对靶基因MafA的调节。本发明的短RNA也有可能与Argonaute蛋白形成复合物，作为锚用于调节染色质-修饰蛋白。确切的机制尚不明确，然而，比较清楚的是靶RNA转录物必须存在于细胞中以达到所观察到的作用。

测定细胞中含有的靶RNA转录物的方法是本领域所熟知的。然而，为了实现本发明的目的，实际上不需要对靶基因反义的任何RNA转录物进行阳性鉴定。因此，不需要确定存在所述非编码RNA转录物（即待下调的靶转录物）。本发明的发明人发现，如果获得了，即通过测序进行测定或在数据库中发现了在基因的转录起点附近区域的基因的编码链的核苷酸序列，并且测定了与该区域反义互补的RNA序列，则与后者的序列互补的短RNA分子便能够被用于上调靶基因。互补性要求会在本说明中的其他处被讨论。在基因的转录起点周围的区域为位于转录起点的上游和下游100、200、300、400、500、800、1000或2000个核苷酸之间的区域。

并非希望受到理论的限制，可以相信，saRNA作用机制可以包括染色质重构，例如通过多梳家族蛋白（Polycomb group proteins）进行染色质重构。多梳家族蛋白表面上能与ncRNA，包括启动子-联合RNA直接作用，从而被招募到启动子中并且起沉默作用。saRNA便因此可通过干扰这种多梳-招募的ncRNA，降低启动子中的多梳水平并使得“阳性”染色质重构复合物例如Trithorax家族蛋白形成阳性组蛋白标记。

“靶基因”或“感兴趣的基因”是指其表达需要被调节的基因，本说明书中对于靶基因的任何提及都应该被理解为优选为MafA。如上面所阐述的，靶基因不同于编码靶蛋白的基因（靶蛋白为胰岛素）。因此，对“靶蛋白”的任何提及均应该被理解为优选指的是胰岛素。含靶基因的细胞优选为人。“靶mRNA”序列为源自靶基因的mRNA序列。

特化诱导基因为在上调后将细胞诱导为特化细胞的基因。本说明书中对特化基因的任何提及均优选为指的是MafA。

上面讨论的方法要求使用短RNA以上调靶基因MafA，即至少一种靶特化诱导基因。该方法因此允许通过使用其他短RNA或通过本领域已知的其他方法激活其他特化（胰岛素生成）诱导基因。优选地，上述方法包括通过使用短RNA上调选自由如下组成的组中的2、3、4、5、6、7或8种靶基因：PDX1、神经原素3(Ngn3)、Rfx6、MafA、Hlxb9、Hnf6、Ptf1a、NeuroD、Nkx6-1和（原）胰岛素，更优选为PDX1、Ngn3、Rfx6和MafA，所述短RNA优选与本说明书中给出的原则相符。这些靶基因的任何组合都包括在内。

本发明的方法可另外包括将细胞接触合适的因子。合适的因子可优选地选自葡萄糖、活化素、艾塞那肽（优选为艾塞那肽-4）、头蛋白、FGF、烟酰胺、甲苯胺丁脲、IGF-II、HGF和/或EGF。在一个实施方案中，细胞接触葡萄糖，优选大约2.5mM或2.5nM，和/或活化素A，优选大约10ng，至少1天，优选2-4天，例如3天。在一个实施方案中，细胞接触葡萄糖，优选大约11mM或11nM，艾塞那肽，优选大约5ng，头蛋白，优选50ng，FGF，优选5ng和/或EGF,优选5ng,大约6天，例如4-8天。所述接触可在合适的间隔，例如每3天重复。在一个实施方案中，细胞首先与葡萄糖和活化素A接触大约3天，随后在第3天和第6天接触葡萄糖、艾塞那肽、头蛋白、FGF和EGF。在一个实施方案中，细胞优选在第9天接触烟酰胺，优选大约10mM，IGF-II，优选大约50ng，HGF，优选大约10ng，艾塞那肽-4，优选大约25ng，以及活化素A，优选大约10ng。优选地，在这些步骤期间及在这些步骤红不含青霉素、链霉素和谷氨酰胺。示例性流程在图7和9中示出。在这些图中显示的流程的每一步骤均表示独立的实施方案。

在本发明的方法中，细胞或细胞群与本发明的短RNA分子接触。可通过使用任何合适的递送试剂与本发明的短RNA一起将短RNA分子施用到体外或体内的所述细胞上。这种合适的递送试剂包括Mirus Transit TKO亲脂性试剂；脂转染物（lipofectin）；脂质体（lipofectamine）；cellfectin；或聚阳离子（例如聚赖氨酸），基于病毒的微粒，电穿孔或微脂粒（liposomes）。优选的递送试剂为微脂粒。已知有多种方法用于制备微脂粒，例如在Szoka等(1980),Ann.Rev.Biophys.Bioeng.，9:467；以及美国专利号4,235,871和5,019,369中描述过，这些文献的全部内容被结合到本说明书中作为参考。将细胞与saRNA接触的步骤也被称之为“转染”。

特别优选地，封装本发明的短RNA的微脂粒被修饰以便避免被单核巨噬细胞和网状内皮系统所清除，例如通过调理素作用-抑制部分结合到其结构的表面而清除。在一个实施方案中，本发明的微脂粒可以包括调理素作用-抑制部分和配体。

表达短RNA的重组质粒也可直接或联合合适的递送试剂进行施用，合适的递送试剂包括Mirus Transit LT1亲脂性试剂；脂转染物；脂质体；cellfectin；聚阳离子（例如聚赖氨酸)或微脂粒。表达短RNA的重组病毒载体和向细胞递送这些载体的方法是本领域已知的。

优选地，所述接触步骤进行不止一次，优选每3天一次，当然也可每日一次，或每2、4或5天一次。接触优选进行至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15天，进行大约6或9天是优选的。

在上述方法中，如果多于一个靶基因被上调，则用于上调不同的靶基因的短RNA可以不同的频率以及不同的时间进行施用。待使用的具体施用方案可通过本领域普通技术人员很容易地确定以实现其所希望的目的，特别是起始的细胞类型和递送方法。举例来说，可以使用本发明的短RNA分子的皮摩尔浓度。

本发明的短RNA可以单独提供或与已知的在所包括的具体方法中起作用的其他活性试剂联合提供。其他活性试剂可与本发明的短RNA同时、分别或顺序施用。因此，单独使用本发明的短RNA、两种或多种本发明的短RNA联合使用，或者如果可以的话，所述短RNA与其他活性物质联合使用都是可以的。

本发明的所有方面的一个关键特征为用本发明的短RNA靶向于反义RNA转录物导致靶基因的上调。

本发明的短RNA分子能够通过任何合适的方法生产，例如合成或通过采用对本领域技术人员来说熟知的标准分子生物学技术在细胞中表达。例如，短RNA可以化学合成或采用本领域已知的方法重组生产，所述方法例如在Tuschl等人的美国公开的申请2002/0086356中描述的果蝇体外系统，或者在Verma和Eckstein(1998)Annu Rev Biochem67：99-134中描述的合成RNA分子的方法，这些文献的全部内容被结合到本说明书中作为参考。本发明的短RNA可通过采用合适的被保护的核糖核苷亚磷酰胺和常规的DNA/RNA合成仪进行化学合成。如果短RNA为双链RNA，则它们可被合成为两个分开、互补的RNA分子，或者被合成为含两个互补域的单个RNA分子。合成的RNA分子或合成试剂的商业供应商包括Proligo(德国汉堡)，Dharmacon Research(美国科罗拉多，拉斐特），皮尔斯化学（美国伊利诺伊，罗克福德III，Perbio科学的部分），Glen Research（美国弗吉尼亚Sterling），ChemGenes（美国马萨诸塞安士兰）以及Cruachem(英国格拉斯哥）。

也可使用任何合适的启动子从重组的环状或线性DNA质粒表达短RNA。从质粒表达本发明的短RNA的合适的启动子包括，例如，U6或H1RNA pol III启动子序列和巨细胞病毒启动子。选择其他合适的启动子属于本领域内的技术。本发明的重组质粒也可包括用于在特定的组织或在特定的细胞环境下表达短RNA的可诱导的或可调控的启动子。

从重组质粒表达的短RNA可通过标准技术从培养细胞表达系统分离出来。本发明的双链短RNA可从重组质粒表达为两个分开、互补的RNA分子，或者含两个互补域的单个RNA分子。

选择适合于表达本发明的短RNA的质粒，插入核酸序列用于向质粒中表达短RNA的方法，以及向感兴趣的细胞中递送重组质粒的方法属于本领域内的技术。例如参见Tuschl,T.(2002),Nat.Biotechnol.20∶446-448和Brummelkamp T R等(2002),Science296∶550-553，这些文献的全部内容被结合到本说明书中作为参考。

本发明的短RNA也可在体内的细胞内从重组病毒载体进行表达。本发明的重组病毒载体包括编码本发明的短RNA以及任何用于表达短RNA序列的合适的启动子的序列。合适的启动子包括，例如，U6或H1RNA pol III启动子序列和巨细胞病毒启动子。选择其他合适的启动子属于本领域内的技术。本发明的双链短RNA可从重组病毒载体表达为两个分开、互补的RNA分子，或者含两个互补域的单个RNA分子。可以使用任何能够接受编码待表达的dsRNA分子的编码序列的病毒载体，例如源自腺病毒(AV)；腺伴随病毒(AAV)；逆转录酶病毒(例如，慢病毒(LV)、弹状病毒、鼠白血病病毒)；疱疹病毒等等。病毒载体的向性可通过用包膜蛋白或源自其他病毒的其他表面抗原伪装（pseudotyping）载体而改变，或通过酌情取代不同的病毒壳体蛋白而改变。

选择适合用于本发明的重组病毒载体，插入核酸序列用于向载体中表达短RNA的方法，以及向感兴趣的细胞中递送病毒载体的方法属于本领域内的技术。例如参见Dornburg R(1995),Gene Therap.2:301-310，该篇文献的全部内容被结合到本说明书中作为参考。

正如在实施例中讨论的，采用本说明书中公开的方法，本发明的发明人已经设计了具体的可有效调节多种特化基因的活性短RNA分子。优选的特化基因在上文中讨论过。因此，本发明的进一步方面提供了短RNA分子，可以为单链或双链，具有在表1-6中示出的特殊序列。可选地，这些序列中任一种均可包括3'末尾。

本发明同样提供了单链或双链的RNA分子，其包括上述单个链序列或由上述单个链序列组成。

本发明同样提供了对应上述RNA分子的DNA分子。

本发明的短RNA分子可被直接用在治疗方法中，包括再生或修复的方法。

在进一步方面，本发明提供了用于治疗的本发明的短RNA。优选地，在上调本说明书中公开的短RNA两个特异性MafA-联合使用。

在进一步方面，本发明提供了基因治疗的方法，包括向有需要的病人施用本发明的短RNA。

本发明提供了本发明的短RNA用于治疗在病人中与缺乏特化细胞，优选为胰岛素生成细胞有关的疾病。

在进一步方面，本发明提供了包含本发明的短RNA的细胞或细胞系。

在进一步方面，本发明提供了由本发明的任一种方法制备的特化细胞。

正如在实施例中给出的，本发明的方法使得细胞世系能够分泌胰岛素。因此，在进一步方面，提供了一种能够生成胰岛素的细胞，可通过在本说明书中公开的方法获得。优选地，所述细胞通过诱导CD34⁺干细胞例如OmniCyte进行分化而获得。

所述细胞优选来自体内，即不是活体的一部分。可选地，所述细胞可被称之为“体外”或“分离的”。

这些细胞在治疗上的用途是本发明的进一步方面。可选地，本发明的特化细胞以及本发明的短RNA可联合用于本说明书中公开的治疗适用中。“联合”包括分开、同时或连续的施用。

或者认为，本发明提供了一种治疗方法，包括向有需要的受试者中施用本说明书中限定的治疗有效量的特化细胞和/或治疗有效量的短RNA。

治疗适用可以是能够受益于施用本发明的特化细胞和/或短RNA分子的任何症状、伤害或紊乱的治疗。这可以是与缺乏特化细胞有关或以缺乏特化细胞为特征的症状。

优选地，治疗适用为再生或修复。可选地，所述再生或修复是对损伤的器官，优选为胰腺或肝脏的再生或修复。可选地，所述再生或修复可以是对并没有同样“损伤”而是没有以正常的方式发展的器官的再生或修复。因此“再生”应该被宽泛地解释为包括器官生长或改善的所有方法。

糖尿病，例如I型或II型糖尿病的治疗是优选的。可被治疗的其他疾病为肥胖症，特别是病态肥胖症；脂肪肝，特别是与脂质和糖原堆积有关时的脂肪肝；以及与葡萄糖和/或胰岛素摄取和/或利用的缺陷为特征或有关的任何紊乱。这些紊乱可被称之为与异常胰岛素生成、摄取或利用有关的症状。

可选地，本发明提供了本发明的短RNA和/或本发明的特化细胞用于在胰腺细胞，特别是β-细胞有缺陷的病人的胰腺的至少部分的再生。任何胰腺不生成足够的胰岛素，或确实不生成任何胰岛素的病人均有可能受益于这种治疗。胰岛素生成不足包括与正常（健康）受试者相比胰岛素生成的水平更低，但也包括受试者生成的胰岛素水平与正常（健康）受试者的相当，但需要更高的胰岛素水平，例如因为胰岛素抵抗、过量食物消耗、病态肥胖症等等。

并非靶向于胰腺或除靶向于胰腺外，本发明的短RNA和/或细胞可被用于靶向于肝脏，以便肝细胞，或本发明的细胞居于肝脏上，生成胰岛素。

短RNA分子或细胞可通过注射，例如静脉注射、皮下注射、肌肉注射或注入靶器官中而被施用。因此，注射可以是系统注射或在靶位置处注射或注入靶位置处，例如靶器官，优选为胰腺或肝脏。可选地，可以口服或pr（经直肠）施用。将细胞注射进胰腺中是优选的。

本发明的短RNA和/或细胞可通过本领域已知的任何方式或递送工具而被施用到有需要的病人中，例如通过毫微粒、阳离子脂质、脂质例如胆固醇或α-生育酚，微脂粒，例如带正电荷的阳离子微脂粒，聚合物，例如聚乙烯亚胺、树形分子（dendrimers）、适体，或例如抗体偶联物。短RNA也可以病毒载体表达的shRNA或miRNA拟态进行施用。

优选地，saRNA或细胞与将saRNA或细胞靶向于特殊的组织或细胞类型，例如胰腺细胞或肝细胞，例如肝细胞或β细胞的部分联合，例如复合、连接或包含在内。所述部分可以是上述提及的方法/递送工具中的一种。

适体为具有高选择性、亲和性和稳定性的寡核苷酸或肽。它们具有特殊及稳定的三维形状，从而提供了对靶分子的非常特殊、牢固的结合。对于任何具体的分子靶点，核酸适体可从核酸的组合信息库中被识别出来，例如通过指数富集的配体系统进化技术（SELEX）（例如参见Tuerk C和Gold L:Systematicevolution of ligands by exponential enrichment:RNA ligands to bacteriophage T4DNA polymerase.Science1990，249:505-510）本领域技术人员因此能够设计合适的适体用于将本发明的saRNA或细胞递送至靶细胞例如肝或胰腺细胞，例如β细胞。肽适体可例如通过使用酵母双杂交系统而被识别。采用胰腺特异性适体将本发明的短RNA施用到胰腺中是特别优选的。DNA适体、RNA适体和肽适体也包括在内。

本发明还提供了适体与本发明的短RNA的偶联物。所述偶联物可通过使用任何已知的连接两个部分的方法形成，例如直接化学键形成，通过连接子例如链霉亲和素连接等等。

生成针对靶细胞表面受体的抗体的方法是熟知的。本发明的saRNA分子可被依附至这些抗体上，例如通过使用RNA载体蛋白。生成的复合物然后便可施用到受试者上并通过受体介导的内吞作用而被靶细胞所摄取。本发明的细胞可通过使用已知的方法连接至这种抗体上。

saRNA或细胞可通过使用本领域已知的方法被包裹在微脂粒中。微脂粒可选地可与靶细胞特异的部分例如抗体或肽连接。

在整个本发明中引用了各种文件，包括，例如出版物和专利。所有这些文件，在相关的部分，被因此结合作为参考。任何给定文件的引用不应该被解释为是承认对于本发明是现有技术。如果在该书面文件中的术语的任何含义或定义与所结合作为参考的文件中的术语的任何含义或定义发生矛盾，则以在该书面文件中的术语所给出的含义或定义为准。

本说明书中引用的组分的商品名包括了在本发明中使用的各种成分。本发明人并不意味着受限于某种商品名下的材料。通过商品名所引用的物质的等效物质（例如，从不同来源获得以不同名称或引用编号下物质）可以在本说明书中替换及利用。

明确计划的是，上文中公开的本发明的可选及优选的特征及实施方案可以被单独采用，或除特征或实施方案相互排斥而无法这样做或这样做会与本发明的目的相反外，以任何次数和任何组合共同采用。

下列实施例被用于对本发明进行说明，教导本领域普通技术人员制造和使用这些发明。这些实施例并非意味着以任何方式限制本发明。本发明现在会通过下列实施例和表及附图作进一步描述，其中：

表1示出了设计用于激活PDX1表达的短RNA分子。反义（引导）序列在右侧示出，正义（过客）序列在左侧示出。RNA序列包含尿嘧啶（U）替代胸腺嘧啶（T），而这两种残基在表中提供的序列中是等效的。

表2示出了设计用于激活神经原素表达的短RNA分子。反义（引导）序列在右侧示出，正义（过客）序列在左侧示出。

表3示出了设计用于激活Rfx6表达的短RNA分子。反义（引导）序列在右侧示出，正义（过客）序列在左侧示出。

表4示出了设计用于激活MafA表达的短RNA分子。反义（引导）序列在右侧示出，正义（过客）序列在左侧示出。

表5示出了设计用于激活胰岛素表达的短RNA分子。反义（引导）序列在右侧示出，正义（过客）序列在左侧示出。

表6示出了设计用于激活胰岛素表达的短RNA分子。

这些表中示出了短RNA序列。当短RNA为单链时，其优选包括在反义栏中列出的序列或由在反义栏中列出的序列组成。双链短RNA由包含在正义栏中示出的序列或由在正义栏中示出的序列组成的链与包含在反义栏中相同行中示出的序列或由在反义栏中相同行中示出的序列组成的链配对所形成。换句话说，表中的每一行示出了可以配对形成双链RNA的序列。因此，双链短RNA可以包括SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2，或SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4等等。

附图说明

图1为示出了PDX1位点和可能的反义靶候选的示意图。该图示出了PDX1的基因组位置、PDX1转录物的结构，以及从周围区域的剪接ESTs（改编自UCSC基因组阅读器的影像）。方框标出了PDX1启动子区以及PDX1的最近的反义EST上游（CR593175）。EST开始于PDX1的转录起点（TSS）的1.4kb处，终止于90kb处。注意，EST通过并重叠PDX1的TSS进行转录。箭头指示了小RNA候选的可能的靶点位置。

图2为示出了Ngn3位点和可能的反义靶候选的示意图。该图示出了Ngn3的基因组位置、Ngn3转录物的结构，以及从周围区域的剪接ESTs（改编自UCSC基因组阅读器的影像）。方框标出了Ngn3启动子区以及Ngn3最近的反义转录物上游（Al744512）。EST开始于Ngn3的TSS的2.4kb处，终止于3.7kb处。箭头指示了小RNA候选的可能的靶点位置。

图3为示出了Rfx6位点和可能的反义靶候选的示意图。该图示出了Rfx6的基因组位置、Rfx6转录物的结构，以及从周围区域的剪接ESTs（改编自UCSC基因组阅读器的影像）。方框标出了Rfx6启动子区和Rfx6的最近的反义转录物上游。EST被称为GPRC6A，其开始于Rfx6的TSS的48kb处，终止于85kb处。箭头指示了小RNA候选的可能的靶点位置。

图4为示出了MafA位点和可能的反义靶候选的示意图。该图示出了MafA的基因组位置、MafA转录物的结构，以及从周围区域的剪接ESTs（改编自UCSC基因组阅读器的影像）。箭头指示了小RNA候选的可能的靶点位置。

图5A.显示RNA的凝胶的照片。分离自新鲜分离的omnicytes（第0天）以及培养3天后的细胞（第3天）的总RNA被反转录用于mRNA筛选。对肌动蛋白的RNA表达进行测量作为对照。第0天的细胞表达了中胚层的标记物例如SOX17，但这些细胞也表达特化成胰岛素生成的β-细胞所需要的转录因子NeuroD、PDX1和Rfx6。第3天结果显示，这些因子在第一个3天的扩张中被下调了。

B.显示RNA的凝胶的照片。Omnicytes被培养3天，随后用靶向于PDX1的saRNA进行转染。对四套可能的退火寡核苷酸(CR1、CR2、PR1和PR2)进行了检测。9天（d9）后分析RNA。在第9天CR2和PR1增强了PDX1、Rfx6和胰岛素的表达。

C.被PDX1（CR2和PR1）转染的细胞在第9天表现出令人想到胰岛细胞集群形成的形态学变化。采用针对胰岛素第一抗体的与Alexa-488偶联的第二抗体的荧光染色显示，这些细胞集群表达了胰岛素。第二抗体单独染色并不表现出自发荧光或非特异结合（数据未示出）。

图6A.显示RNA的凝胶的照片。在培养的第3天及第6天进行靶向于胰岛细胞的晚期特化中所涉及的转录因子的退火saRNA寡核苷酸的瞬时转染。神经原素3(AL2)、MafA(PR1和PR2)上调了胰岛素原的表达，同时神经原素3(PR1和PR2)、Rfx6(PR1和NM1)上调了前胰岛素原的表达。

B.对接触葡萄糖梯度后的胰岛素表达进行了检测。细胞被saRNA寡核苷酸的结合瞬时转染。在培养的第3天和第6天，对Rfx6(PR1)、Ngn3(PR1)和MafA(PR2)进行单独转染或与PDX1(CR2)转染。在第9天，将细胞用含10mM烟酰胺、50ngIGF-II、10ng HGF、25ng艾塞那肽-4和10ng活化素A的αMEM预处理16小时，随后加入2.8mM的葡萄糖处理3小时，以及20mM的葡萄糖再处理3小时。分离培养基并处理进行胰岛素原ELISA。结果以相对于由试剂盒提供的阳性对照（7.9pM的胰岛素）的百分率表示。

图7显示了胰岛素生成细胞的诱导的流程图。

图8为示出了(原)胰岛素位点和可能的反义靶候选的示意图。该图示出了(原)胰岛素的基因组位置、(原)胰岛素转录物的结构，以及从周围区域的剪接ESTs（改编自UCSC基因组阅读器的影像）。方框标出了（原）胰岛素启动子区。箭头指示了小RNA候选的可能的靶点位置。

图9显示了用于胰岛素生成细胞的诱导的一个优化方案的流程图。PSG表示青霉素、氯霉素和谷氨酰胺。

图10未处理的细胞（对照）及saRNA处理过的细胞的肌动蛋白和胰岛素表达的蛋白质印迹。

图11β-细胞发育中涉及的关键转录因子的定量PCR图。在未转染的（对照）细胞、用上调MafA表达的saRNA转染的细胞，以及总的正常胰腺RNA转染的细胞上进行定量PCR。

图12电子显微镜影像

图13显示胰岛素和C肽的ELISA结果的图。

图14显示了在转染的肝脏上皮细胞相对于未转染的细胞的MafA的相对定量并根据肌动蛋白归一化的图。将细胞接种在活性炭除去的不含酚红的RPMI中进行同步。在16小时后，将细胞用靶向于MafA的saRNA（PR1、PR2和二者的结合）转染。

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具体实施方式

实施例

实施例1

设计用于激活PDX1表达的短RNA

saRNA的设计采用如上所述的方法进行。更具体的细节在下文中给出。

PDX1位于染色体13（参见图1），条带q12.2上。PDX1的完整基因名称为“人类胰腺和十二指肠同源框1”。mRNA收录号为NM_000209。PDX1参考序列mRNA(NM_000209)有两个外显子，从正链转录而来。

为了识别从PDX1位点的可能的反义转录物，对PDX1周围的基因组区域寻找映射到合适的链（负链）的剪接的已表达序列标志(ESTs)。

虽然通常难以确定ESTs的转录方向，但可通过利用剪接的ESTs的剪接位点而确定方向。EST CR593175被选作靶候选。

随着近年来深度测序实验显示反义RNA通常被发现于TSS周围的区域，因此决定从PDX1的启动子区设计靶向于可能的反义转录物的短激活RNA。更具体地，从PDX1的TSS上游和下游的反义序列500nts（简称PDX1_AS_TSS+/-500）被用作第二靶候选。

目的是设计用于下调这两个候选序列的短RNA。候选短RNA应该给予靶序列有效的抑制，并且比较理想地应该越特异性越好，从而可能的脱靶效应被最小化。因此，GPboost siRNA设计算法被用作识别用于下调这两个候选序列的可能的短RNA。从所预测的siRNA候选的列表中，选择了在EST CR593175的外显子1和2中的两个最有希望的非重叠siRNA靶位点，以及在启动子序列（PDX1_AS_TSS+/-500）内的PDX1TSS的每一侧上的siRNA靶位点。基于从GPboost所预测的效力得分；序列基序aaaa、cccc、gggg和uuuu的缺失、20%和55%之间的中等GC含量；以及至少两种到所有可能的脱靶转录物的汉明间距来选择候选siRNA。表1显示了用于激活PDX1表达的得到的候选短RNA。该表示出了单链的序列，但激活RNA也可作为双链分子进行施用。

实施例2

设计用于激活神经原素3表达的短RNA

进行的设计同实施例1，但有如下差别。

神经原素位于染色体10（参见图2），条带q21.3上。神经原素3的全称为“人类神经原素3”。mRNA收录号为NM_020999。神经原素3参考序列mRNA(NM_020999)有两个外显子，从负链转录而来。

EST Al744512被选作靶候选。NEUROG3_AS_TSS+/-500)被用作第二靶候选。

表2显示了用于激活神经原素3表达的得到的候选短RNA。该表示出了单链的序列，但激活RNA也可作为双链分子进行施用。

实施例3

设计用于激活Rfx6表达的短RNA

进行的设计同实施例1，但有如下差别。

Rfx6位于染色体6（参见图3），条带q22.2上。Rfx6基因的全称为“人类调节因子X，6”。mRNA收录号为NM_173560。Rfx6参考序列mRNA(NM_173560)有19个外显子，从正链转录而来。

EST NM_148963被选作靶候选。RFX6_AS_TSS+/-500)被用作第二靶候选。

表3显示了用于激活Rfx6表达的得到的候选短RNA。该表示出了单链的序列，但激活RNA也可作为双链分子进行施用。

实施例4

设计用于激活MafA表达的短RNA

进行的设计同实施例1，但有如下差别。

MafA位于染色体8（参见图4）条带q24.3上。MAFA基因的全称为“人类v-maf肌腱膜纤维肉瘤癌基因同源物A（禽）”。mRNA收录号为NM_201589。MafA参考序列mRNA(NM_201589)有1个外显子，从负链转录而来。

MAFA_AS_TSS+/-500)被用作靶候选。

表4显示了用于激活MafA表达的得到的候选短RNA。该表示出了单链的序列，但激活RNA也可作为双链分子进行施用。

实施例5

特化的诱导-胰岛素生成细胞的产生

材料和方法

多潜能细胞(omnicytes)按照如下获得：以超过临床的要求，通过哈默史密斯医院干细胞实验室进行的白细胞去除术获得粒细胞集落刺激因子(G-CSF)动员的外周血细胞。在所有情况下均获得了知情同意和地方研究伦理委员会的批准。将CD34⁺细胞以1:4稀释于Hanks’缓冲盐溶液（英国佩兹利，Gibco，HBSS）中，随后将单核细胞（MNCs）在Lymphoprep（英国剑桥郡，金博尔顿，Axis-Shield）密度梯度上1,800rpm进行离心分离30分钟（德国哈诺Heraeus）。收集MNC部分并首先在HBSS中洗涤，随后用加入0.5%人血清白蛋白和5mMEDTA的MACS(磁珠细胞分选）缓冲液(磷酸盐缓冲液），pH7.2进行洗涤。采用CD34⁺阳性细胞选择试剂盒（德国贝尔吉施格拉德巴赫，美天旎生物科技公司，LargeMacs）将CD34⁺细胞从MNCs中分离出来。将分离到的CD34⁺细胞接种在24孔培养皿（美国康宁）上，密度为每孔2.5x10⁵个细胞，加入500μl最低必需培养基(α-MEM)，在37℃和5%CO₂下孵育30分钟。在该次孵育后，通过用PBS洗涤培养板4次，将非附着的细胞群去除。

按照如图7所示进行特化的诱导。将Omnicytes（CD34⁺，附着）培养在加以2.5mM葡萄糖和10ng活化素A的不含血清的扩增培养基（Omnicyte有限公司）中三天。

在第3和6天，将细胞用saRNA分子转染。采用50mM Tris-HCl，pH8.0，100mM NaCl和5mM EDTA将配对的saRNA寡核苷酸进行退火。在90℃下进行变性步骤，然后是逐渐退火的步骤至室温。采用Nanofectamin(PAA)，按照制造商的方案进行退火的saRNA寡核苷酸(0.15μg/孔)的转染。

在第3天和第6天，加入11mM葡萄糖、5ng艾塞那肽、50ng人头蛋白、5ng FGF、5ng EGF。

RNA分析

为了进行RNA分析，在第9天收集细胞并通过离心法制粒（pelleted）。采用RNAqueous-微试剂盒(Ambion)，按照制造商的指示回收总RNA。采用Nanodrop1000微样品定量器对RNA进行定量。采用Qiagen的一步RT-PCR试剂盒，按照制造商的推荐方案，对每份样品的1μg的总RNA进行反转录。PDX1、Rfx6、MafA和胰岛素的表达通过PCR进行半定量测量。肌动蛋白被用作上样对照。

免疫荧光

将细胞用4%多聚甲醛在1cm玻璃盖片上固定20分钟，然后用0.2%的Triton X100进行透化20分钟。将盖玻片洗涤3次，随后用10%兔血清封闭45分钟。向10%血清的细胞中加入兔源抗人胰岛素(1:200)（Sigma）1小时。将细胞在PBS中洗涤3次，随后加入10%血清作用另外15分钟，然后用Alexa-488偶联的抗兔第二抗体（1:600）（Cell Signalling Technology公司）孵育1小时。在PBS中洗涤5次后，用含4’6’-联脒-2-苯基吲哚(DAPI)的Vectashield(Vectorlabs公司)将盖玻片封固在载玻片上。在Leica DM4000上，以60倍放大观察载玻片。平均采集5张影像，并与单独用第二偶联抗体染色的影像进行比较，以证实不含自身荧光。

胰岛素原ELISA

在第9天，将细胞转移到添加有10mM烟酰胺、50ng IGF-II、10ng HGF、25ng艾塞那肽-4和10ng活化素A的预处理α-MEM培养基（Appendix E）中。将细胞在37℃和5%CO2下孵育16小时，随后加入葡萄糖梯度中。加入2.8mM的葡萄糖3小时，随后加入20mM葡萄糖另外3小时。分离培养基，并按照制造商的指示处理用于进行总人类胰岛素原ELISA(Millipore)。由试剂盒提供的阳性对照含有7.9pM的胰岛素。

结果

Omnicytes表达对于胰腺β细胞特化所必要的因子

塑料附着的骨髓源干细胞的基本特性已经由Gordon MY等,(1987)和Gordon MY(1994)（8，9）中确定。我们证明了从新鲜分离的omnicytes中存在对于特化成胰腺β细胞所必要的转录因子包括神经D、PDX1和Rfx6。这些因子的表达在三天的培养内被自然下调（图5A）。

退火saRNA寡核苷酸的转染上调了靶基因

为了维持或增加对特化成胰岛素生成细胞所必要的转录因子的表达，利用在材料和方法中提及的生物信息学和软件算法生成小激活RNA(saRNA)寡核苷酸。这些寡核苷酸在第3和6天进行退火和转染，然后在第9天收集细胞。mRNA分析显示，PDX1的上调(图1)足以驱动对胰岛形成和胰岛素表达必需的下游转录因子Rfx6.1的连续激活（图5B）。在第9天用PDX1转染的细胞的形态表征为胰岛细胞集群形成，其中荧光免疫染色显示有胰岛素表达所特有（图5C）。然而这些细胞在接触葡萄糖梯度后并不分泌胰岛素，说明胰岛细胞未成熟。

对成熟的β细胞特化所必要的转录因子的上调

为补充对成熟的β细胞特化所必要的全套基因，将靶向神经原素3（图2）、Rfx6（图3）和MafA（图4）的saRNA转染进细胞中。mRNA分析显示，在细胞培养第9天，前胰岛素原和胰岛素原的表达被显著上调。

靶向于PDX1的saRNA和对β细胞特化的晚期转录因子的组合

由于PDX1、Rfx6神经原素3(Ngn3)和MafA的靶向上调已得到saRNA寡核苷酸的转染后的mRNA分析的证实，我们试图向omnicytes中加入这些寡核苷酸的组合以评估这些细胞是否会表现出发展成更成熟的胰岛素分泌β细胞的迹象。在第3天和第6天单独转染Rfx6、Ngn3和MafA或PDX1＋Rfx6；PDX1＋Ngn3或PDX1＋MafA后，将细胞准备按照材料和方法中所描写的在第9天进行葡萄糖反应测试，随后进行ELISA测定总的胰岛素原的分泌。所显示的值为相对于由ELISA试剂盒(Millipore)提供的7.9pM胰岛素的阳性对照的百分比，代表了在24孔板的单个孔中的细胞（图6B）。

讨论

在过去的十年中对于干细胞的理解和操作上的发展已经使得研究人员能够将这些细胞用于再生治疗。由于胚细胞具有致肿瘤性的风险，对将其用于临床应用的伦理束缚意味着更集中于使用成人祖细胞。在这一领域的研究以前受到对不可翻译用于临床用途的基因修饰的组分的依赖的限制。然而Omnicytes满足了在治疗中作为替代干细胞应用的所有必要的安全标准（22）。它们可以被自身分离；它们在不含血清的环境下具有强健的扩张能力并表现出显著的发育可塑性，因为它们已经表达了对于定型为不同的世系包括肝、胰腺、心血管和神经细胞所必要的转录因子。在本说明书中示出的数据显示，可通过使用新型的小激活RNA分子将omnicytes诱导成胰岛素分泌细胞。当与使用依赖含病毒基的骨架的载体的标准技术相比，这些分子确实是一种更为安全的方法。我们已经显示，激活仅仅一些靶转录因子便足以引起调控对于诱导胰岛素生成所必要的下游基因的级联效应。

实施例6

设计用于激活(原)胰岛素表达的短RNA

进行的设计同实施例1，但有如下差别。

(原)胰岛素位于染色体11（参见图8），条带p15.5上。胰岛素基因的全称为“人类胰岛素”。mRNA收录号为NM_000207。(原)胰岛素参考序列mRNA(NM_000207)有3个外显子，从负链转录而来。

INS(NM001185098)_AS_TSS+/-500被用作靶候选。

表5和6显示了用于激活(原)胰岛素表达的得到的候选短RNA。

实施例7

采用saRNA上调MafA而诱导胰岛素生成

a)将CD34⁺细胞诱导成胰岛素分泌表型的优化方案

诱导方案一开始涉及在第0天向CD34^＋细胞(Omnicytes)的附着群落补充10ng/ml的活化素A(英国Sigma)和2.5nM葡萄糖(美国Sigma)进含无血清CellGro培养基（英国CellGenix）72小时，所述无血清CellGro培养基包含溶于0.5%青霉素/链霉素抗生素中的干细胞因子（美国Inivitrogen）、250ng/ml白细胞介素-3和白细胞介素-6(美国Invitrogen)。细胞得以扩张至80%融合，然后在72小时间隔时加入11nM葡萄糖、5ng艾塞那肽-4(美国Sigma)、50ng头蛋白(美国Sigma)、5ng bFGF(美国Sigma)和5ng EGF(美国Sigma)，同时利用含α-MEM培养基（无抗生素）的Nanofectamine(英国PAA)，按照制造商的指示用所设计的上调MafA的150ng的双链saRNA进行转染。这一处理在第2/3、5/6和8/9天重复三次（取决于确定合适的细胞密度）。为实现最大转染率，通过每24小时进行温和地移液而阻止细胞聚集。

在图9中示出了优化方案的流程。

两种能够上调MafA的具体的saRNA进行联合应用。它们被称为Pr-1和Pr-2。

用这些saRNA处理的细胞在该实施例中被称之为“被转染的”细胞。

b)肌动蛋白和胰岛素的蛋白质印迹

在SDS-PAGE（4-12%Tris甘氨酸变性丙烯酰胺凝胶，购自Invitrogen）上分离从未分化的CD34⁺细胞(对照)和被转染的CD34⁺细胞(按照上述方案制备)提取出的10μg的总蛋白。在转移到硝酸纤维膜上后，将斑点用抗-肌动蛋白(Sigma)(1:8000)和抗胰岛素(Abcam)孵育，然后用HRP偶联的第二抗体(1:10000)(Dako)孵育。胰岛素是一种小肽，分子量大约为6kDa(千道尔顿)，包括一个小α亚基和一个较大的β亚基。结果在图10中示出。

c)β-细胞发育中涉及的关键转录因子的定量PCR(qPCR)

对来自分化后的（未转染的）CD34⁺细胞(对照)与被转染的CD34⁺细胞（按照上面的方案制备）的转录物的比较的相对量（RQ）以及总的人成熟正常胰腺RNA进行了测定。结果在图11中示出。

PDX1为转录因子胰腺和十二指肠同源框1。它对在调节胰岛素表达中涉及的各种基因的下游激活至关重要。这些因子包括促生长素抑制素、葡萄糖激酶和GLUT2。NGN3为碱性螺旋-环-螺旋转录因子神经原素3，其与NEUROD(神经原分化因子)共同调节胰岛素的表达。NKX6.1为β-细胞发育所需要的NK6同源框1转录因子。GCK为己糖激酶酶(葡萄糖激酶)，其在葡萄糖代谢的初期将葡萄糖磷酸化。ABBC8（ATP-结合盒-子家族C，第8个）属于ATP结合盒转运蛋白超家族的一员。ABBC8在ATP敏感的钾通道中起到胰岛素释放的作用。GLP1是调节胰岛素分泌的胰高血糖素样肽1。MAFA(v-maf肌腱膜纤维肉瘤癌基因同源物A)为一种β-细胞特异性的转录因子，与RIPE3b——一种在β-细胞的成熟期间调节胰岛素基因（INS）表达的保守的增强子元件结合。靶基因的引物为购自Qiagen的经定量确认的引物。

d)对（A）未分化或（B）被转染的CD34⁺细胞进行电子显微镜分析。按照上面的方案制备被转染的细胞（B）。结果在图12中示出。与（A）相比，颗粒囊泡在（B）中很明显，其中在（B）中细胞已经开始向PDX1和胰岛素表达方向分化（参见qPCR数据）。可以看到颗粒聚集在一起的迹象（绿色箭头）。观察到显著且聚集的囊泡向被转染的细胞中的细胞膜方向极化。

e)胰岛素和C肽的酶联免疫吸附试验(ELISA)。在将未分化的CD34⁺细胞和被转染的细胞接触到低浓度葡萄糖（2.8nM）随后接触高浓度葡萄糖（16nM）脉冲后，回收未分化的CD34⁺细胞和被转染的细胞的培养基。然后按照制造商的方案，将培养基转移到对人胰岛素和人C肽特异性的免疫吸附ELISA板（Millipore）上。在图13中示出的数据显示，被转染的细胞能够通过分泌胰岛素对葡萄糖梯度进行响应。

实施例8

在肝细胞中也可以实现利用本发明的短RNA上调MafA。采用以Pr-1和PR-2表示的saRNA对肝上皮细胞进行转染（参见表4，并且表7显示Pr-1为与SEQ ID NO:49配对的SEQ ID NO:5，Pr-2为与SEQ ID NO:50配对的SEQ IDNO:6，每个可选地具有3'UU末尾）。结果显示，单独每一种saRNA能够上调MafA表达，并且两种sRNA结合可以实现比单独每种saRNA更大的上调。参见图14。

表

在这些表中，Loc表示位置，E表示外显子

表1

表2

表3

表4

表5

表6

Claims (13)

1.一种能够上调人细胞中MafA表达的短RNA，其特征在于，所述短RNA包括长度为19到22个核苷酸且包括序列为AUCUGUACUGGAUGAGCGG(SEQ ID NO:1)的第一链，并且其中所述RNA包括第二链，所述第二链的长度为19到22个核苷酸并与所述第一链形成双螺旋，所述RNA的每一条链可选的在其3'末端具有1-3个未配对的核苷酸形成突出。

2.根据权利要求1所述的短RNA，其特征在于，所述3'突出包括一个或多个尿嘧啶核苷酸。

3.根据权利要求1所述的短RNA，其特征在于，所述3'突出由一个或多个尿嘧啶核苷酸组成。

4.根据权利要求1到3中任一项所述的短RNA用于诱导在体外人细胞以葡萄糖响应的方式生成并分泌胰岛素的用途。

5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述短RNA与另一种能够上调人细胞中MafA表达的短RNA联合使用，所述另一种短RNA包括长度为19到25个核苷酸且包括序列为UUUCCCGCAGGAGAUUGAC(SEQ ID NO:2)的第一链，且所述另一种短RNA包括第二链，所述第二链的长度为19到25个核苷酸并与所述第一链形成双螺旋。

6.一种诱导人细胞以葡萄糖响应的方式生成并分泌胰岛素的体外方法，所述方法包括将所述细胞与在权利要求1到3中任一项所述的短RNA进行接触。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述短RNA与另一种能够上调人细胞中MafA表达的短RNA联合使用，所述另一种短RNA包括长度为19到25个核苷酸且包括序列为UUUCCCGCAGGAGAUUGAC(SEQ ID NO:2)的第一链，且所述另一种短RNA包括第二链，所述第二链的长度为19到25个核苷酸并与所述第一链形成双螺旋。

8.根据权利要求6-7中任一项所述的方法，其特征在于，所述人细胞为干细胞、肝细胞或胰腺细胞。

9.一种来自体内的或体外的人细胞，包括在权利要求1到3中任一项所述的短RNA。

10.一种根据权利要求9所述的细胞，还包括另一种能够上调人细胞中MafA表达的短RNA，其中所述另一种短RNA包括长度为19到25个核苷酸且包括序列为UUUCCCGCAGGAGAUUGAC(SEQ ID NO:2)的第一链，且所述另一种短RNA包括第二链，所述第二链的长度为19到25个核苷酸并与所述第一链形成双螺旋。

11.一种药物组合物，所述药物组合物包括在权利要求1-3中任一项所述的短RNA和/或在权利要求9中所述的细胞以及药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂。

12.根据权利要求11所述的药物组合物，还包括另一种能够上调人细胞中MafA表达的短RNA，其中所述另一种短RNA包括长度为19到25个核苷酸且包括序列为UUUCCCGCAGGAGAUUGAC(SEQ ID NO:2)的第一链，且所述另一种短RNA包括第二链，所述第二链的长度为19到25个核苷酸并与所述第一链形成双螺旋。

13.一种试剂盒，包括

(i)一种能够上调人细胞中MafA表达的短RNA，其中所述短RNA包括长度为19到22个核苷酸且包括序列为AUCUGUACUGGAUGAGCGG(SEQ ID NO:1)的第一链，并且其中所述RNA包括第二链，所述第二链的长度为19到22个核苷酸并与所述第一链形成双螺旋,所述RNA的每一条链可选的在其3'末端具有1-3个未配对的核苷酸形成突出；和

(ii)一种能够上调人细胞中MafA表达的短RNA，其中所述短RNA包括长度为19到25个核苷酸且包括序列为UUUCCCGCAGGAGAUUGAC(SEQ ID NO:2)的第一链，并且其中所述RNA包括第二链，所述第二链的长度为19到25个核苷酸并与所述第一链形成双螺旋。