MX2011005047A

MX2011005047A - Regeneracion de isletas pancreaticas e inversion de diabetes por genes de factor de transcripcion de isletas suministrados in vivo.

Info

Publication number: MX2011005047A
Application number: MX2011005047A
Authority: MX
Inventors: Paul A Grayburn; Shuyuan Chen; Jiahuan Ding
Original assignee: Baylor Res Inst
Priority date: 2008-11-13
Filing date: 2009-11-13
Publication date: 2011-07-29
Also published as: EP2350297A4; WO2010057045A8; CN102282263A; NZ592821A; KR20110086594A; BRPI0922030A2; AR076445A1; NZ602474A; US20140294924A1; JP2014168463A; AU2009313875B2; US20110287086A1; JP5813161B2; NZ595273A; JP2012508585A; CN102282263B; IL212881A0; AU2009313875A1; CA2743668A1; KR101305931B1

Abstract

La presente invención incluye composiciones y métodos para regenerar células que responden a glucosa por destrucción de micro burbujas dirigida-por-ultrasonido en el páncreas, en donde la composición comprende un complejo de ácido nucleico-liposoma pre-ensarnblado, en contacto con, dentro y alrededor de una micro burbuja, en donde el complejo de ácido nucleico-liposoma pre-ensarnblado comprende un gen NeuroD bajo el control del promotor, en donde la ruptura de la micro burbuja en el páncreas en un sitio objetivo, suministra el ácido nucleico en las células de páncreas en el sitio de la ruptura con ultrasonido, en donde células que incorporan el ácido nucleico expresan insulina en respuesta a altos niveles de glucosa en la sangre.

Description

REGENERACIÓN DE ISLETAS PANCREÁTICAS E INVERSIÓN DE DIABETES POR GENES DE FACTOR DE TRANSCRIPCIÓN DE ISLETAS SUMINISTRADOS IN VIVO CAMPO TÉCNICO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a tratamientos para diabetes, y más particularmente, a composiciones y métodos para la regeneración de células que responden a glucosa, células productoras de insulina.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Sin limitar el alcance de la invención, sus antecedentes se describen con respecto a diabetes .

La diabetes afecta aproximadamente 200 a millones de personas en todo el mundo y es creciente en proporción. Se estima que es la quinta causa principal de muerte en el mundo y resulta en serias complicaciones, incluyendo enfermedad cardiovascular, enfermedad crónica de riñones, ceguera y neuropatía.

A pesar de una amplia variedad de tratamientos f rmacológicos para diabetes, incluyendo terapia de insulina, a menudo es difícil un adecuado control de azúcar de la sangre, en parte debido a que estos agentes no son capaces de duplicar la función regulatoria de glucosa de las isletas normales. De acuerdo con esto, se han enfocado nuevas estrategias de tratamiento en reabastecer la deficiencia de masa de células beta común a ambas formas principales de diabetes ya sea por trasplante de isletas o regeneración de células beta.

Una oportunidad promisoria en el área de terapia de diabetes se ilustra por la Patente de los E.U.A. Número 6,232,288, otorgada a Kojima, para composición para mejorar función pancreática. Kojima muestra el uso de la propia proteína betacelulina, o un fragmento de la misma, para promover la diferenciación de células pancreáticas no diferenciadas en células beta productoras de insulina o células F productoras de polipéptido pancreático. La composición de proteína BTC mejora la tolerancia a glucosa en pacientes e inhibe el crecimiento de células pancreáticas no diferenciadas. Métodos para tratar mamíferos, incluyendo humanos, también se proporcionaron, sin embargo, tratamiento a largo plazo de la condición diabética no se logró al proporcionar intravenosamente al paciente con proteína betacelulina.

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN En una modalidad, la presente invención incluye composiciones y métodos para destrucción de micro burbujas dirigida con ultrasonido en el páncreas, que comprende un complejo de ácido nucleico-liposoma pre-ensamblado, en contacto con, dentro y respecto a una micro burbuja, en donde el complejo de ácido nucleico-liposoma pre-ensamblado comprende un gen NeuroD bajo el control del promotor, en donde la ruptura de las micro burbujas en el páncreas en un sitio objetivo, suministra el ácido nucleico en las células de páncreas en la ubicación de la ruptura con ultrasonido, en donde las células que incorporan el ácido nucleico expresan insulina, en respuesta a altos niveles de glucosa en la sangre. En un aspecto, la composición además comprende uno o más genes reguladores que responden a insulina, ligados operativamente con una región promotora de insulina regulable de alta expresión, que comprende: 50 bases contiguas de SEQ ID NO.: 1 en la región corriente arriba del sitio de inicio de transcripción de NeuroD. En otro aspecto, la composición además comprende uno o más genes seleccionado de uno o más genes reguladores de respuesta a insulina enlazados operativamente con una región promotora de insulina seleccionada de ngn3 , GLPl, PDXl, Mafa, betacelulina, Nkx2.2 , Nkx6.1, PAX4, Isll, Ciclina D2 (y otros miembros de la familia ciclina) , CDK4 (y otros miembros de la familia quinasa dependiente de ciclina), y ARNpis (siRNAs) contra inhibidores de quinasa dependientes de ciclina, tales como pl6 y otros miembros de la familia INK4 o p27 y otros miembros de la familia CIP/KIP) . En otro aspecto, la composición además comprende un agente que es co-administrado con la composición, en donde el agente se elige del agente anti-apoptótico , un agente anti-inflamatorio, un inhibidor JNK, un GLP-1, un tacrolimus, un sirolimus, una anakinra, un derivado de poliamida Dervin o combinaciones de los mismos.

En otra modalidad, la presente invención incluye una composición y método para regenerar células beta pancreáticas, utilizando destrucción de micro burbujas dirigidas por ultrasonido en el páncreas, de micro burbujas que comprenden NeuroD en el páncreas. En un aspecto, NeuroD es un NeuroD recombinante . En otro aspecto, la composición además comprende un gen NeuroD bajo el control de un promotor CUBI, RIP2.1, RIP3.1 o HIP3.1, y el NeuroD se expresa en células que han sido dirigidas para expresión por la destrucción de micro burbujas dirigida por ultrasonido.

Todavía otra modalidad de la presente invención es un método para regenerar células que responden a insulina in vivo e in situ, en un paciente diabético que comprende: suministrar una cantidad efectiva al páncreas, en donde las células en el páncreas provocan que la célula secrete insulina en respuesta a altos niveles de glucosa en la sangre. En un aspecto, cantidades efectivas de NeuroD en las células pancreáticas comprenden suministrar un segmento de ácido nucleico exógeno que expresa un gen NeuroD. En otro aspecto, el NeuroD se suministra al páncreas por destrucción de micro burbujas dirigida por ultrasonido. Todavía en otro aspecto, la cantidad efectiva de NeuroD en las células pancreáticas comprende suministrar un segmento de ácido nucleico exógeno que expresa un gen NeuroD bajo el control de un promotor CUBI, RIP2.1, RIP3.1 o HIP3.1.

Otra modalidad de la presente invención es un método para producir una célula objetivo que responde a insulina que comprende: hacer un segmento de ácido nucleico que comprende un gen NeuroD bajo el control de un promotor que responde a insulina seleccionado de promotor CUBI, RIP2.1, RIP3.1 o HIP3.1; cargar el segmento de ácido nucleico en una micro burbuja; inyectar a un paciente con las micro burbujas; suministrar el segmento de ácido nucleico en una célula pancreática; y mantener la célula objetivo bajo condiciones efectivas para expresar el gen regulatorio de respuesta a insulina; en donde la expresión del NeuroD en la célula objetivo provoca que la célula responda a alto contenido de glucosa en la sangre. En un aspecto, el método además comprende suministrar al páncreas uno o más genes seleccionados de PDXl, Nkx2.2, Nkx 6.1, PAX4, MafA, ngn3 y sus combinaciones bajo el control del promotor. En otro aspecto, el método además comprende suministrar un agente que es co-administrado con la composición, en donde el agente se elige de un agente anti-apoptótico, un agente antiinflamatorio, un inhibidor J K, un GLP-1, un tacrolimus, un sirolimus, una anakinra, una poliamida Dervin o combinaciones de los mismos. En un aspecto, la micro burbuja comprende liposomas complejos de ácido nucleico-liposoma pre-ensamblados. En otro aspecto, la micro burbuja comprende liposomas complejo de ácido nucleico-liposoma pre-ensamblados que comprende 1 , 2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina y 1, 2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfatidiletanolamina glicerol en mezcla con un plásmido.

Todavía en otra modalidad, la presente invención incluye un método para restaurar la respuesta a insulina que comprende las etapas de: obtener . un segmento de ácido nucleico aislado que comprende uno o más genes reguladores que responden a insulina, enlazados operativamente con una región promotora de insulina de alta expresión, un fragmento geonómico del promotor de insulina comprende una región sin traducción 5', exónl, intrónl y exón2 del gen de insulina; transferir el segmento de ácido nucleico en una célula objetivo; y mantener la célula objetivo bajo condiciones efectivas para expresar el gen regulatorio de respuesta a insulina; en donde la expresión del gen regulatorio de respuesta a insulina en la célula objetivo provoca que la célula responda a alto contenido de glucosa en la sangre. En un aspecto, la célula que responde a insulina esta en un animal. En otro aspecto, el uno o más genes reguladores de respuesta a insulina se enlazan operativamente con una región promotora de insulina están en un vector plásmido o viral. En otro aspecto, uno o más genes reguladores de respuesta a insulina enlazados operativamente con una región promotora de insulina se eligen de NeuroD, ngn3 , GLPl , PDXl, Mafa, betacelulina, Nkx2.2, Nkx6.1, PAX4 , Isll, Ciclina D2 (y otros miembros de la familia ciclina) , CDK4 (y otros miembros de la familia quinasa dependiente de ciclina) , y siRNAs contra inhibidores de quinasa dependientes de ciclina, tales como pl6 y otros miembros de la familia I 4 o p27 y otros miembros de la familia CIP/KIP) .

Otra modalidad de la presente invención es un método para restaurar respuesta a insulina que comprende las etapas de: obtener un segmento de ácido nucleico aislado que comprende uno o más genes reguladores de respuesta a insulina enlazados operativamente con una región promotora de insulina que comprende un. fragmento geonómico del promotor de insulina que comprende una región sin traducción 5', exónl, intrónl y exón2 del gen de insulina; transferir el segmento de ácido nucleico en una célula pancreática; y mantener la célula objetivo bajo condiciones efectivas para expresar el gen regulatorio de respuesta a insulina; en donde la expresión del gen regulatorio de respuesta a insulina en la célula objetivo provoca que la célula responda a alto contenido de glucosa en la sangre. En un aspecto, la región promotora de insulina comprende 100 a 500 bases contiguas de SEQ ID NO.: 1 en la región corriente arriba del sitio de inicio de transcripción. En una modalidad, la región promotora de insulina comprende toda la región corriente arriba del sitio de inicio de transcripción en SEQ ID NO. : 1, o incluso 100 a 500 bases contiguas de SEQ ID NO.: 1 en la región corriente arriba del sitio de inicio de transcripción. Otro aspecto es un ácido nucleico aislado que comprende una región promotora de insulina de ata expresión que comprende: 50 bases contiguas de SEQ ID NO.: 1 en la región corriente arriba del sitio de inicio de transcripción para uno o más genes de respuesta a insulina.

En otra modalidad, la presente invención es una composición para destrucción de micro burbujas dirigida por ultrasonido en el páncreas, que comprende: un complejo de ácido nucleico-liposoma pre-ensamblado en contacto con una micro burbuja, en donde el complejo de ácido nucleico-liposoma pre-ensamblado comprende uno o más genes reguladores de respuesta a insulina ligados operativamente con una región promotora de insulina regulable de alta expresión, que comprende: un fragmento genómico de promotor de insulina que comprende una región sin traducción 5', exónl , intrónl y exón2 del gen de insulina, en donde la ruptura de ultrasonido de la micro burbuja en el páncreas en un sitio objetivo, suministra el ácido nucleico en las células de páncreas en el sitio de la ruptura de ultrasonido. En un aspecto, el complejo de ácido nucleico-liposoma pre-ensamblado comprende lipidos catiónicos, l pidos aniónicos o mezclas y sus combinaciones. En otro aspecto, las micro burbujas se colocan en un vehiculo farmacéutico aceptable. En otro aspecto, ácido nucleico agente activo comprende un gen de insulina. En un aspecto, el ácido nucleico agente activo comprende un vector de ácido nucleico que comprende un gen hexoquinasa bajo el control del promotor. En otro aspecto, el ácido nucleico agente activo comprende un vector ácido nucleico que comprende un gen NeuroD bajo el control del promotor. Los liposomas complejo de ácido nucleico-liposoma pre-ensamblado pueden por ejemplo ser 1 , 2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina y 1 , 2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfatidiletanolamina glicerol en mezcla con un plásmido. En otro aspecto, la composición además puede comprender un revestimiento. En otro aspecto, la composición además puede comprender uno o más genes reguladores de respuesta a insulina enlazados operativamente a una región promotora de insulina, se eligen de NeuroD, ngn3 , GLPl, PDXl, Mafa, betacelulina, Nkx2.2, Nkx6.1, PAX4, Isll, Ciclina D2 (y otros miembros de la familia ciclina) , CDK4 (y otros miembros de la familia quinasa dependiente de ciclina) , y siR As contra inhibidores quinasa dependientes de ciclina, tales como pl6 y otros miembros de la familia I K4 o p27 y otros miembros de la familia CIP/KIP) .

Una célula hecha para responder a insulina por un método, comprende inyectar en una célula un complejo de micro burbuja ácido nucleico-liposoma pre-ensamblado, en donde el complejo ácido nucleico-liposoma pre-ensamblado comprende un gen NeuroD bajo el control de un promotor de insulina que comprende uno o más de genes reguladores de respuesta a insulina enlazados operativamente con una región promotora de insulina que comprende: un fragmento genómico del promotor de insulina que comprende una región sin traducción 5', exónl, intrónl y exón2 del gen de insulina, en donde la ruptura de la micro burbuja en el páncreas en un sitio objetivo suministra el ácido nucleico en las células de páncreas en el sitio de la ruptura con ultrasonido, en donde las células que incorporan el ácido nucleico expresan insulina en respuesta a altos niveles de glucosa en la sangre. En un aspecto, la célula además comprende uno o más de genes reguladores de respuesta a insulina enlazados operativamente con una región promotora de insulina regulable que comprende 50 bases contiguas de región corriente arriba del sitio de inicio de insulina, corriente arriba de un gen NeuroD. En otro aspecto, la célula además comprende uno o más genes seleccionados de uno o . más genes reguladores de respuesta a insulina enlazados operativamente con una región promotora de insulina seleccionada de ngn3 , GLPl, PDXl, afa, betacelulina, Nkx2.2, Nkx6.1, PAX4, Isll, Ciclina D2 (y otros miembros de la familia ciclina) , CDK4 (y otros miembros de la familia quinasa dependiente de ciclina) y siRNAs contra inhibidores de quinasa dependientes de ciclina, tales como pl6 y otros miembros de la familia INK4 o p27 y otros miembros de la familia CIP/KIP) .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Las figuras acompañantes, en donde números de referencia semejantes se refieren a elementos idénticos o de funcionalidad similar a través de las vistas separadas y que se incorporan en y forman parte de la especificación, ilustran además la presente invención y, en conjunto con la descripción detallada de la invención, sirven para explicar los principios de la presente invención.

La FIGURA 1 es una representación esquemática de un área de promotor de insulina de rata y .exónl, intrónl y exón2. El promotor de insulina de rata se muestra con elementos de secuencia conocidos y exónl y exón2 de fusión; La FIGURA 2 : Panel superior son actividad de luciferasa de lisis de células INS-1 48 horas después de transfectar con rips-luc bajo tres diferentes concentraciones de glucosa. Panel inferior son actividad de luciferasa de solución de medio de cultivo en diferente tiempo de cultivo después de transfeccion con rips-luc bajo alta concentración de glucosa, sin actividad de luciferasa en concentración sin glucosa y en glucosa normal (datos no mostrados); La FIGURA 3: (3A) : Porta objetos RIP3.1-DsRed, superior izquierdo: verde como anti-insulina; rojo medio superior como anti-dsred; y derecho superior como su imagen confocal. Un fondo como sección secuencial y estructura de isletas similar, inferior izquierdo :verde como anti-glucagón; medio inferior: rojo como anti-dsred. Inferior derecho como su imagen confocal . (3B) : RIP-4.1-dsred; (3C) : porta objetos RIP-l.l-dsred; (3D) : RIP-1.1-dsred, (3E) : pCMV-dsred; F: control normal; FIGURA 4: (4A) : imágenes como ratas pRIP3.1-DsRed con alimentación de glucosa al 10%, un Verde superior derecho como anti-insulina; Un rojo superior medio como anti-dsred, Un superior izquierdo como su imagen confocal; Un inferior derecho verde como anti-glucagón; Un inferior medio rojo como anti-dsred; Un izquierdo inferior: su imagen confocal; (4B) imágenes como ratas pRIP3.1-DsRed de ayuno durante la noche; La FIGURA 5 : Paneles superiores . Las Secciones microscópicas (400X) de una rata de control (izquierda) y una rata tratada con UTMD (medio como rata con alimentación y derecho como rata en ayuno) . PCR in-situ se empleó para teñir el ADN plásmido de DsRed, que se ve a través del páncreas tratado. Se ve claramente una isleta (flechas) . Paneles de fondo o inferiores. Secciones (400X) de una rata de control (izquierda) y una rata tratada con UTMD utilizando RIP6.1-DsRed (medio como rata con alimentación y derecho como rata con ayuno) . RT-PCR in-situ se emplea para teñir AR m DsRed, que se localiza al centro de la isleta (medio/alimentación) . Teñido como bordes de isletas (derecha/rata en ayuno) ; La FIGURA 6 muestra los resultados de microscopía inmunofluorescente. Los paneles superiores muestran ejemplos representativos de isletas de los experimentos de 30-días. Anti-insulina etiquetada con FITC (verde) demuestra células beta, mientras que anti-glucagón etiquetado DsRed demuestra células alfa. Terapia de genes dirigida con ultrasonido con Nkx2.2, Nkx6.1, Pax4, Ngn3 , y MafA, resultó en formación de isletas dominantes en células alfa. En contraste, ratas tratadas con NeuroDl tuvieron una arquitectura de isleta casi normal con células beta centrales circundadas por células alfa periféricas. El panel izquierdo inferior muestra el conteo de isletas por porta objetos para los diferentes grupos . Tanto controles normales como ratas tratadas con NeuroDl tuvieron significativamente más isletas por porta objetos que todos los otros grupos (*p<0 . 0001 por ANOVA) . El panel derecho inferior muestra el número de células beta por isleta. Tanto ratas de controles normales como tratadas con NeuroDl tuvieron un porcentaje significativamente superior de células beta por isleta que todos los otros grupos (*p<0 . 0001 por ANOVA) ; La FIGURA 7 muestra los resultados de glucosa en la sangre (panel superior derecho) , insulina en sangre (panel inferior derecho) , y péptido C (panel superior derecho) en el experimento de 30 días. En el día 3 , todas las ratas tratadas con STZ tuvieron glucosa en la sangre marcadamente elevada y disminuida insulina y péptido C respecto a los controles normales (p<0.0001). Sin embargo, al día 30, solo las ratas tratadas con NeuroDl tuvieron restauración de glucosa en la sangre, insulina, y péptido C a niveles normales o casi normales. El panel derecho inferior mostró los resultados de pruebas de tolerancia a glucosa en un grupo separado de 6 ratas tratadas con NeuroDl (n=6) comparado con controles normales (n=3) y ratas tratadas con DsRed (n=3). Terapia de genes con NeuroDl después de diabetes inducida con STZ, resultó en restauración de tolerancia a glucosa a lo normal ; La FIGURA 8 muestra marcadores de proliferación celular. Los paneles superior izquierdo y medio muestran isletas teñidas en forma conjunta con anti-insulina etiquetada con FICT (verde), y anti-BrdU etiquetada con DsRed (izquierdo) y anti-Ki67 (medio) . El panel superior derecho muestra el número de células positivas Ki67, células positivas de insulina, que es estadísticamente superior en forma significante en ratas STZ tratadas con NeuroDl que en controles normales, ratas de control tratadas con STZ o ratas tratados con STZ, tratadas con DsRed por UTMD (p<0.0001). Los paneles inferiores muestran una isleta de una rata STZ tratada con NeuroDl teñida con anti-Ckl9 (izquierdo, verde), anti-insulina (centro izquierdo, rojo), anti-ngn3 (azul, centro derecho) , y su imagen confocal (derecho) . Células beta positivas de insulina teñidas en forma conjunta con ngn3 , pero no con Ckl9, indicando que las isletas regeneradas no son de origen celular ductal; La FIGURA 9 muestra imágenes de isletas representativas de un experimento en donde se trataron ratas con diversos genes y combinaciones de genes por UTMD. Tinsión triple con DAPI (tinsión azul para núcleo) , antiinsulina (verde), y anti-glucagón (rojo). CiclinaD2, CDK4, y GLPl (isletas fueron estables hasta 180 días) cuando se tratan con la combinación. El panel izquierdo superior muestra una isleta representativa de una rata de control normal no tratada con UTMD. Un gran núcleo de isletas denso de células beta que expresan insulina está presente (verde) secundado por una pequeña cápsula de células alfa periféricas que expresan glucagón (rojo) . El panel derecho superior muestra un remanente de isleta representativo después de diabetes inducida por STZ. Solo hay presentes unas cuantas células beta. El panel izquierdo inferior muestra un ejemplo de regeneración de isletas después UTMD con el gen GLPl. Una isleta menor que lo normal está presente con algunas células beta (verde) y células alfa (rojo) , pero la arquitectura no es normal. Hallazgos similares estuvieron presentes (no mostrado) para ratas tratadas con UTMD utilizando los genes sencillos CiclinaD2, CDK4, y CDK6. El panel derecho inferior muestra una isleta casi normal después de UTMD con la combinación de CiclinaD2, CDK4, y GLPl (estas isletas fueron estables hasta por 180 días y estuvieron acompañadas por inversión de diabetes con niveles normales en sangre de glucosa, insulina y péptido C); La FIGURA 10 es una gráfica que muestra niveles de glucosa en sangre con el tiempo, de isletas en diversos grupos de ratas tratadas con terapia de genes UTMD, así como controles normales, y ratas diabéticas STZ sin tratamiento UTMD. Como puede verse, terapia de un solo gen con CiclinaD2, CDK4, CDK6 o GLPl no resulta en normalización de glucosa en la sangre. Sin embargo, la composición que comprende una combinación de CiclinaD2, CDK4, y GLPl o CiclinaD2, CDK4, CDK6, y GLPl, restauró los niveles de glucosa en la sangre a normales por 4 semanas en este experimento particular. Estudios a más largo plazo en otro grupo de animales confirmaron una duración del efecto de hasta 180 días; La FIGURA 11 es un mapa del plásmido HIP-hNeuroDl ,- La FIGURA 12 es un mapa del plásmido RIP3.1-DsRed; La FIGURA 13 es un mapa del plásmido RIP-DsRed 4.1; La FIGURA 14 es un mapa del plásmido RIP-DsRed 5.1; y La FIGURA 15 es un mapa del RIP-DsRed 2.1. plásmido .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Las características novedosas de la presente invención serán aparentes para aquellos con destreza en la técnica ante examen de la siguiente descripción detallada de la invención. Habrá de entenderse, sin embargo, que la descripción detallada de la invención . y los ejemplos específicos presentados, mientras que indican ciertas modalidades de la presente invención, se proporcionan para propósitos de ilustración solamente, debido a que diversos cambios y modificaciones dentro del espíritu y alcance de la invención serán aparentes para aquellos con destreza en la técnica a partir de la descripción detallada de la invención y las reivindicaciones siguientes.

La presente invención puede incluir modificaciones y variaciones de cada uno como sea posible a la luz de las enseñanzas aquí descritas, sin apartarse del espíritu y alcance de las siguientes reivindicaciones. Se contempla que el uso de la presente invención puede involucrar componentes que tienen diferentes características. Se pretende que el alcance de la presente invención se defina por las reivindicaciones anexas, dando completo conocimiento a equivalentes en todos los aspectos .

Como se emplea aquí, los términos "una secuencia esencialmente como se establece en SEQ ID NO. (#)", "una secuencia similar a", "secuencia de nucleótidos" y términos similares, con respecto a nucleótidos, se refieren a secuencias que corresponden substancialmente a cualquier porción de la secuencia aquí identificada como SEQ ID NO.: 1. Estos términos se refieren a moléculas sintéticas así como derivadas de origen natural, e incluyen secuencias que poseen actividad biológica, inmunológica, experimental o de otra manera funcionalmente equivalente, por ejemplo respecto a hibridización por segmentos de ácido nucleico, o la capacidad para codificar todo o porciones de actividad NeuroD. Naturalmente, estos términos se pretende que incluyan información en esta secuencia como se específica por su orden lineal.

Como se emplea aquí, el término "gen" se refiere a una proteína funcional, polipéptido o unidad que codifica péptido. Como se comprenderá por aquellos con destreza en la técnica, este término funcional incluye tanto secuencias genómicas, secuencias de ADNc, o fragmentos o combinaciones de las mismas, así como productos de genes, incluyendo aquellas que puedan haber sido alteradas por humanos. Genes purificados, ácidos nucleicos, proteínas y semejantes, se emplean para referirse a estas entidades, cuando se identifican y separan de al menos un ácido nucleico o proteína contaminante con el cual se asocia ordinariamente.

Como se emplea aquí, el término "vector" se refiere a moléculas de ácido nucleico que transfieren uno o varios segmentos de ADN de una célula a otra. El vector además puede definirse como uno diseñado para propagar secuencias específicas o como un vector de expresión que incluye un promotor enlazado operativamente con la secuencia específica, o uno diseñado para provocar que este promotor se introduzca. El vector puede existir en un estado independiente del cromosoma de célula hospedera, o puede integrarse en el cromosoma de la célula hospedera.

Como se emplea aquí, el término "célula hospedera" se refiere a células que se han sometido a ingeniería para contener segmentos de ácido nucleico o segmentos alterados, ya sea archaea, procarióticos o eucarióticos . De esta manera, células de ingeniería o recombinantes , son distinguibles de células de origen natural en que no contienen genes introducidos en forma recombinante a través de los humanos .

Como se emplea aquí, la expresión "secuencias de control" se refiere a secuencias de ADN necesarias para la expresión de* una secuencia de codificación enlazada operativamente en un organismo hospedero particular. Las secuencias de control que son adecuadas para procariotas, por ejemplo, incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia de operador, una secuencia de enlace de ribosoma, y terminadores de transcripción. Pueden emplearse promotores inducibles altamente regulados que suprimen síntesis de polipéptido Fab' a niveles inferiores a cantidades inhibitorias de crecimiento, mientras que el cultivo celular crece y madura, por ejemplo durante la fase log.

Como se emplea aquí, la expresión "enlazado operativamente" se refiere a una relación funcional entre una primera y una segunda secuencias de ácido nucleico. Por ejemplo, ADN para una pre-secuencia o líder secretorio se enlaza operativamente con ADN para un polipéptido si se expresa como una pre-proteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o mejorador se enlaza operativamente como una secuencia de codificación, si efectúa la transcripción de la secuencia; o un sitio de enlace de ribosoma se enlaza operativamente a una secuencia de codificación e si se ubica para facilitar la traducción. En general, "enlazado operativamente" significa que las secuencias de ADN enlazadas son contiguas y en el caso de un líder secretorio, contiguas y en el mismo cuadro de lectura. Mejoradores no tienen que ser contiguos. El enlace se logra por ligación en sitios de restricción convenientes. Si estos sitios no existen, entonces se utilizan enlazadores o adaptadores oligonucleótidos sintéticos de acuerdo con la práctica convencional .

Como se emplea aquí, el término "célula" y "cultivo celular" se utiliza en forma intercambiable y todas las designaciones incluyen progenie. De esta manera, las expresiones "transformantes" y "células transformadas" incluyen la célula objeto primaria y cultivos de ahí derivados, sin consideración al número de transferencias. También se entiende que toda la progenie no precisamente puede ser idéntica en contenido de ADN, debido a mutaciones deliberadas o accidentales . La progenie mutante que tiene la misma función o actividad biológica como se detecta en la célula originalmente trasformada, se incluye. Diferentes designaciones serán claras del contexto.

Como se emplea aquí, "Plásmidos" se designan con una p precedida y/o seguida por letras en mayúsculas y/o números. Plásmidos de inicio pueden estar comercialmente disponibles, están disponibles al público en una base sin restricción, o pueden construirse a partir de los plásmidos disponibles de acuerdo con procedimientos publicados. Además, otros plásmidos equivalentes se conocen en la técnica y serán aparentes a la persona con destreza ordinaria.

Como se emplea aquí, los términos "proteína", "polipéptido" o "péptido" se refieren a compuestos que comprenden aminoácidos unidos mediante enlace péptido y se emplean en forma intercambiable.

Como se emplea aquí, el término "endógena" se refiere a una sustancia, la fuente de la cual está dentro de la célula. Sustancias endógenas se producen por la actividad metabólica de una célula. Sustancias endógenas sin embargo pueden ser producidas como resultado de manipulación de metabolismo celular por ejemplo, para producir la célula que exprese el gen que codifica la sustancia.

Como se emplea aquí, el término "exógena" se refiere a una sustancia, la fuente de la cual es externa a una célula. Cuando se refiere a ácidos nucleicos, "exógena" se refiere a una secuencia de ácido nucleico que es ajena a la célula, u homologa a la célula pero en una posición dentro del ácido nucleico de la célula huésped en donde ordinariamente no se encuentra el elemento. Una sustancia exógena sin embargo puede internalizarse por una célula por cualquiera de una variedad de medios metabolicos o inducidos conocidos por aquellos con destreza en la técnica.

Una forma genómica o clon de un gen contiene la región de codificación interrumpida con secuencias no codificadoras denominadas "intrones" o "regiones de intervención" o "secuencias de intervención". Los intrones son segmentos de un gen que se transcriben en ARN nuclear (hnRNA = ARNheterogéneo nuclear (ARNhn) ) ; los intrones pueden contener elementos regulatorios tales como mejoradores. Los intrones se retiran, "cortan y empalman" de la transcripción nuclear o primaria; los intrones por lo tanto están ausentes en la transcripción de ARN mensajero (mRNA) . El ARNm funciona durante traducción para especificar la secuencia u orden de aminoácidos en un polipéptido naciente.

Además de contener intrones , las formas genómicas de un gen también pueden incluir secuencias localizadas tanto en el extremo 5' como 3' de las secuencias que están presentes en la transcripción de AR . Estas secuencias se refieren como regiones o secuencias de "flanqueo" (estas secuencias de flanqueo se ubican 5' o 3' a las secuencias no traducidas presentes en la transcripción ARNm) . La región de flanqueo 5 ' puede contener secuencias regulatorias tales como promotores y mej oradores que controlan o influencian la transcripción del gen.. La región de flanqueo 3' puede contener secuencias que dirigen la terminación de transcripción, rompimiento post-transcripción y poliadenilación .

Moléculas de ADN se dice que tienen "extremos 5'" y "extremos 3 ' " , debido a que los mononucleótidos se reaccionan para producir oligonucleótidos en una forma tal que el fosfato 5' de un anillo mononucleótido pentosa se conecta al oxigeno 3 ' de su vecino en una dirección mediante un enlace fosfodiéster . Por lo tanto, un extremo de un oligonucleótido se refiere como el "extremo 5'" si su fosfato 5' no está enlazado al oxígeno 3 ' de un anillo mononucleótido pentosa y como el "extremo 3'" si su oxígeno 3' no está enlazado a un fosfato 5' de un anillo mononucleótido pentosa subsecuente. Como se emplea aquí, una secuencia de ácido nucleico, incluso si es interna a un oligonucleótido más grande, también puede decirse que tiene extremo 5 ' y 3 ' . En cualquiera de una molécula de ADN lineal o circular, elementos discretos son referidos como "corriente arriba" o 5' de los elementos "corriente abajo" o 3'. Esta terminología refleja el hecho de que la transcripción procede en una forma 5' a 3' sobre la hebra de ADN.

Como se emplea aquí, el término "transformación", se refiere a un proceso por el cual ADN exógeno entra y cambia a una célula recipiente, por ejemplo, uno o más plásmidos que incluyen promotores y secuencias de codificación para expresar NeuroD, ngn3, GLP1, PDXl , Mafa, betacelulina, Nkx2.2, Nkx6.1, PAX4, Isll, Ciclina D2 (y otros miembros de la familia ciclina) . CDK4 (y otros miembros de la familia quinasa dependiente de ciclina) , y siR As contra inhibidores de quinasa dependiente de ciclina, tales como pl6 y otros miembros de la familia INK4 o p27 y otros miembros de la familia CIP/KIP) . Puede ocurrir bajo condiciones naturales o artificiales utilizando diversos métodos bien conocidos en la técnica. La transformación se puede basar en cualquier método conocido para la inserción de secuencias de ácido nucleico ajenas en una célula hospedera procariotica o eucariótica. El método se elige con base en la célula hospedera que se transforma y puede incluir, pero no está limitado a, infección viral, electroporación, lipofección y bombardeo de partículas. Estas células "transformadas" incluyen células transformadas en forma estable, en donde el ADN insertado es capaz de replicar ya sea como un plásmido de replicación autónoma o como parte del cromosoma hospedero.

Como se emplea aquí, el término "transfección" se refiere a la introducción de ADN extraño en células eucarióticas . La transfección puede lograrse por una variedad de medios conocidos en la especialidad, incluyendo por ejemplo co-precipitación de ADN-fosfato de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano, transfección mediada por polibreno, electroporación, microinyección, fusión de liposoma, lipofección, fusión de protoplastos , infección retroviral, y biolística. De esta manera, la expresión "transfección estable" o "transfectado en forma estable" se refiere a la introducción e integración de ADN extraño en el genoma de la célula transfectada. El término "transfectante estable" se refiere a una célula que tiene ADN extraño o ajeno integrado en forma estable en el ADN genómico. La expresión también abarca células que expresan en forma transitoria el ADN o ARN insertado por periodos de tiempo limitados. De esta manera, la expresión "transfección transitoria" o "transfectado en forma transitoria" se refiere a la introducción de ADN extraño en una célula, en donde el ADN extraño falla en integrar en el genoma de la célula transfectada. El ADN extraño persiste en el núcleo de la célula transfectada por varios días. Durante este tiempo, el ADN extraño se somete a los controles regulatorios que regulan la expresión de genes endógenos en los cromosomas. La expresión "transíectante transitorio" se refiere a células que han tomado ADN extraño pero han fallado en integrar este ADN.

Como se emplea aquí, el término "vector" se emplea para referirse a moléculas de ácido nucleico que transfieren uno o varios segmentos de ADN de una célula a otra. El término "vehículo" en ocasiones se emplea en forma intercambiable con "vector". El término "vector" como se emplea aquí, también incluye vectores de expresión con referencia a una molécula de ADN recombinante que contiene una secuencia de codificación deseada y secuencias de ácido nucleico apropiadas, necesarias para la expresión de la secuencia de codificación enlazada operativamente en un organismo hospedero particular. Secuencias de ácido nucleico necesarias para expresión en procariotas, usualmente incluyen un promotor, un operador (opcional), y un sitio de enlace de ribosoma, a menudo junto con otras secuencias. Células eucarióticas se conoce que utilizan promotores, mejoradores y señales de terminación y poliadenilación.

Como se emplea aquí, el término "amplificar" cuando se utiliza con referencia a ácidos nucleicos, se refiere a la producción de una gran cantidad de copias de una secuencia de ácido nucleico por cualquier método conocido en la técnica. La amplificación es un caso especial de replicación de ácido nucleico que involucra especificidad de plantilla. La especificidad de plantilla frecuentemente se describe en términos de especificidad "objetivo". Secuencias objetivo son "objetivos" en el sentido de que se buscan clasificados de otro ácido nucleico. Técnicas de amplificación se han diseñado primordialmente para esta clasificación.

Como se emplea aquí, el término "cebador" se refiere a un oligonucleótido, ya sea que ocurre en forma natural como en una digestión de restricción purificada o producido en forma sintética, que es capaz de actuar como un punto de inicio de síntesis cuando se coloca bajo condiciones en donde la síntesis de un producto de extensión de cebador que es complementario a una hebra de ácido nucleico, se induce, (es decir, en la presencia de nucleótidos y un agente de inducción tal como ADN polimerasa, a temperatura y pH convenientes) . El cebador puede ser de una sola hebra para máxima eficiencia en amplificación pero en forma alterna puede ser de doble hebra. Si es de doble hebra, el cebador primero se trata para separar sus hebras antes de utilizarse para preparar productos de extensión. El cebador debe ser suficientemente largo para cebar la síntesis de productos de extensión en la presencia del agente inductor. Las longitudes exactas de los cebadores dependerán de muchos factores, incluyendo temperatura, fuente de cebador y el uso del método .

Como se emplea aquí, el término "sonda" se refiere a un oligonucleótido (es decir, una secuencia de nucleótidos) , ya sea de origen natural como en digestión de restricción purificada o producidos en forma sintética, en forma recombinante o por amplificación de PCR, que es capaz de hibridizar a otro oligonucleótido de interés. Una sonda puede ser de una sola hebra o de doble hebra. Sondas son útiles en la detección, identificación y aislamiento de secuencias de genes particulares . Se contempla que cualquier sonda empleada en la presente invención, será etiquetada con cualquier "molécula reportera", de manera tal que es detectable en cualquier sistema de detección, incluyendo, pero no limitada a enzima (por ejemplo ELISA, así como ensayos histoquímicos basados en enzima) , sistemas fluorescentes, radioactivos y luminiscentes. No se pretende que la presente invención se limite a cualquier sistema de detección particular o etiqueta.

Como se emplea aquí, el término "objetivo" cuando se utiliza con referencia a la reacción de cadena polimerasa, se refiere a la región de ácido nucleico limitada por los cebadores empleados para la reacción de cadena polimerasa. De esta manera, el "objetivo" se busca que sea clasificado de otras secuencias de ácido nucleico. Un "segmento" se define como una región de ácido nucleico dentro de la secuencia objetivo. Un objetivo cuando se utiliza con referencia a una célula o tejido, se refiere a hacer blanco utilizando un vector (por ejemplo, un virus, un liposoma o incluso ácidos nucleicos desnudos) que son exógenos a una célula para suministrar el ácido nucleico en la célula de manera tal que cambia la función de la célula, por ejemplo, expresa uno o más genes BTC o PDXl .

Como se emplea aquí, el término "reacción de cadena polimerasa ("PCR" = "Polymerase Chain Reaction" ) se refiere al método de K.B. Mullis en las patentes de los E.U.A. Nos. 4 , 683 , 195 , 4 , 683 , 202 , y 4 , 965 , 188 , aquí incorporadas por referencia, que describen un método para incrementar la concentración de un segmento de una secuencia objetivo en una mezcla de ADN genómico sin clonación o purificación. Este proceso para amplificar la secuencia objetivo incluye un gran exceso de dos cebadores oligonucleótido a la mezcla de ADN que contiene la secuencia objetivo deseada, seguido por una secuencia precisa de ciclado térmico en la presencia de una ADN polimerasa. Los dos cebadores son complementarios a sus hebras respectivas de la secuencia objetivo de doble hebra. Para efectuar la amplificación, la mezcla se desnaturaliza y los cebadores son entonces hibridizados a sus secuencias complementarias dentro de la molécula objetivo. Después de hibridizado, los cebadores se extienden con una polimerasa para formar un nuevo par de hebras complementarias . Las etapas de desnaturalización, hibridización de cebador y extensión de polimerasa pueden repetirse muchas veces (es decir, desnaturalización, hibridización y extensión constituyen un "ciclo"; puede haber numerosos "ciclos") para obtener una alta concentración de un segmento amplificado de la secuencia objetivo deseada. La longitud del segmento amplificado de la secuencia objetivo deseada, se determina por las posiciones relativas de los cebadores entre sí y por lo tanto esta longitud es un parámetro controlable. En virtud del aspecto repetitivo del proceso, el método se refiere como la "reacción de cadena polimerasa" (a continuación "PCR"). Debido a que los segmentos amplificados de la secuencia objetivo se vuelven las secuencias predominantes (en términos de concentración) en la mezcla, se dice que son "amplificados PCR". Con PCR, es posible amplificar una sola copia de una secuencia objetivo específica en ADN genómico a un nivel detectable por varias metodologías diferentes (por ejemplo, hibridización con una sonda etiquetada; incorporación de cebadores biotinilados seguido por detección conjugado de enzima-avidina; incorporación de deoxinucleótido trifosfatos etiquetados con 32P, tales como DCTP o DATP, en el segmento amplificado) . Además de ADN genómico, cualquier secuencia oligonucleótido puede ser amplificada con el conjunto apropiado de moléculas cebadoras. En particular, los segmentos amplificados creados por el proceso PCR mismo son por sí mismos, plantillas eficientes para subsecuentes amplificaciones PCR.

Como se emplea aquí, la expresión "reactivo de tinción" se refiere al patrón de hibridización total de las secuencias de- ácido nucleico que comprenden el reactivo. Un reactivo de tinción que es especifico para una porción de un genoma, proporciona un contraste entre el material cromosomal objetivo y no objetivo. Una cantidad de diferentes aberraciones puede detectarse con cualquier patrón de tinción deseado en las porciones del genoma detectado con uno o más colores (un patrón de tinción de múltiples-colores) y/u otros métodos indicadores .

Como se emplea aquí, el término "transgen" se refiere a material genético que puede ser insertado en forma artificial en un genoma de mamífero, por ejemplo, una célula de mamífero de un animal vivo. La expresión "animal transgénico" se emplea aquí para describir un animal no humano, usualmente un mamífero, que tiene una secuencia de ácido nucleico no endógena (es decir, heteróloga) presente como un elemento extracromosomal en una porción de sus células o integrado en forma estable en su ADN de línea germinal (es decir, en la secuencia genómica de la mayoría o la totalidad de sus células) . Ácido nucleico heterólogo se introduce en la línea germinal de estos animales transgénicos por manipulación genética, por ejemplo de embriones o células madre embriónicas del animal hospedero de acuerdo con los métodos bien conocidos en la técnica.

Como se emplea aquí, el término "transgen" se refiere al ácido nucleico heterólogo, por ejemplo, ácido nucleico heterólogo en forma por ejemplo de una construcción de expresión (por ejemplo, para la producción de un animal transgénico "sobre-expresado") o un ácido nucleico heterólogo que al insertar dentro o adyacente a un gen objetivo, resulta en un decremento en la expresión del gen objetivo (por ejemplo, para la producción de ' un animal transgénico "inoperativo" ) . Un " inoperativo" de un gen significa una alteración en la secuencia del gen que resulta en una disminución de función del gen objetivo, de preferencia de manera tal que la expresión del gen objetivo es indetectable o insignificante. Animales inoperativos transgénicos incluyen un inoperativo heterozigoto de un gen objetivo, o un inoperativo homozigoto de un gen objetivo.

Como se emplea aquí, la expresión "célula madre" se refiere a células madre totipotentes o pluripotentes , por ejemplo, células madre embriónicas, y a estas células pluripotentes en las etapas más tempranas de desarrollo embriónico, incluyendo pero no limitadas a células en la etapa de desarrollo blastocisto. En un ejemplo específico para utilizar con la presente invención, la célula madre puede ser un precursor de célula pancreática que no se ha diferenciado en una célula beta o acinar y se utiliza como un objetivo para expresar NeuroD, ngn3 , GLP1, PDXl, Mafa, betacelulina, Nkx2.2, Nkx6.1, PAX4 , Isll, Ciclina D2 (y otros miembros de la familia ciclina) . CDK4 (y otros miembros de la familia quinasa dependiente de ciclina) , y siRAs contra inhibidores de quinasa dependiente de ciclina, tales como pl6 y otros miembros de la familia INK4 o p27 y otros miembros de la familia CIP/KIP) .

En una solicitud de patente previa, los presentes inventores demostraron que la terapia de genes puede ser dirigida a isletas pancreáticas en ratas normales, utilizando Destrucción de Micro burbujas dirigida por Ultrasonido (UTMD = Ultrasound Targeted Microbubble Destruction) . Micro burbujas intravenosas que transportan ADN plásmido se destruyen selectivamente dentro de la microcirculación pancreática por ultra-sonido, de esta manera suministrando localmente los plásmidos . La especificidad de isletas se logra al incorporar el promotor insulina-I de rata dentro del ADN de plásmido. Ahora se ha encontrado que utilizando UTMD puede emplearse para suministrar betacelulina (BTC) , sola y en combinación con PDXl en diabetes inducida por estreptozotocina (STZ) en ratas. La transformación de las células objetivo llevó a enjambres tipo isleta primitivos de células que tiñen glucagón, se vió en las ratas tratadas con BTC y PDXl. En este estudio, los enjambres desaparecen en 30 días después de tratamiento. Aunque la regeneración de las isletas normales no se ve, se invirtió la diabetes por hasta 15 días después de UTMD por transformación de células acinares pancreáticas en células que producen insulina con marcadores de células beta.

La diabetes mellitus está creciendo en frecuencia o proporción, afectando más de 5% de la población de todo el mundo. Estrategias terapéuticas novedosas, incluyendo nuevos medicamentos, trasplantes de isletas, y terapia de genes, se buscan vigorosamente para tratar la diabetes. Suministro de genes pancreáticos directo in vivo que hace blanco en las isletas, es un enfoque clave para terapia de genes diabéticos. Hasta la fecha, los estudios han mostrado que adenovirus, virus adeno asociados, lentivirus, y vectores de virus de herpes simplex-1, hacen eficiente transferencia de genes a las isletas in vivo, pero sufre o adolece de respuestas inmune de huésped y citotoxicidad de vector. Sistemas de suministro de genes no virales, incluyendo ADN desnudos y complejos de ADN, también han demostrado transfeccion de células de isleta a niveles mucho menores que la expresión de transgenes transitoria. Sin embargo, parece probable que sistemas de vectores no virales satisfarán más fácilmente las consideraciones de bioseguridad en pruebas clínicas .

La Destrucción de Micro burbujas Dirigidas por Ultrasonido (UTMD) se ha empleado para suministrar genes o drogas a isletas pancreáticas in vivo. Brevemente, se incorporan genes en liposomas catiónicos y después sé conectan a la cubierta de fosfolípido de micro burbujas llenas con gas, que después se inyectan en forma intravenosa y destruyen dentro de la microcirculación de isletas intactas por ultrasonido. El enfoque UTMD permite transfección de todo el núcleo de isletas, en donde residen la mayoría de las células beta. UTMD se ha combinado con un promotor de insulina de rata (RIP = Rat Insulin Promoter) para mejorar la especificidad de células beta. La presente invención mejora enormemente la eficiencia diferencial de expresión de genes al variar la longitud de segmentos RIP. Regiones sin codificación en exónl y exón2 de gen de insulina se fusionaron para proporcionar función de genes corriente abajo mejorada en plásmidos . Al nivel de transcripción, la fusión de la expresión de genes corriente abajo regulada por incremento de ARNm de insulina a tan alto nivel, que imitan el nivel de . ARNm de insulina normal en células beta ' de isletas normales. UTMD después se utiliza para suministrar el plásmido de fusión de gen de insulina bajo control del promotor de insulina de rata dirigiendo a isletas intactas de adultos, animales vivos, de esta manera proporcionando una expresión de genes segura, específica de tejido, altamente eficiente y regulada para terapia de genes diabéticos.

Nuevos Promotores .

Materiales y Métodos . Promotores de insulina de rata y construcciones de plásmidos . Fragmentos de promotor de gen de insulina de rata 1 (RIP2.1 (-412 a -303); RIP1.1 (-412 a -1); RIP4. K-412 a +43); RIP3.1 (-412 a + 165 ) , No. de Acceso GenBank J00747, que se define aquí como SEQ ID NO.: 1, y No. de Acceso GenBank NC_000011 para el promotor de insulina humana - definido como SEQ ID NO. : 2) ambos incorporados aquí por referencia) , se amplificaron de ADN de rata Sprague-Dawley (SD) utilizando PCR. Cebadores directos RIP ( 5 ' - G CTG AGC TAA GAA TCC A -3') (SEQ ID NO.: 3); cebador inverso RIP2.1 ( 5 ' - C GAGC ATTTTCCACC -3') (SEQ ID NO.: 4); cebador inverso RIP1.1 (5'- GGGAGTTACTGGGTCTCCA -3') (SEQ ID NO.: 5 ) ; cebador inverso RIP4.1 ( 5 ' -GCAGAATTCCTGCTTGCTGATGGTCTA-3 ' ) (SEQ ID NO.: 6 ) cebador inverso RIP3.1 ( 5 ' - GTTGGAACAATGACCTGGA -3') (SEQ ID NO.: 7); y cebador inverso ( 5-GGCAGAAGGACAGTGATCT-3 ) (SEQ ID NO. : 8) que contienen un sitio de restricción Kpnl y xhol, respectivamente. Las secuencias de estos cebadores se citan en la Tabla 1 . El fragmento ADN resultante se subclona en plásmido reportero de luciérnaga básico pGL2 y vector reportero pDsRedl-1. Plásmido reportero de luciferasa de luciérnaga promotor SV40, Control-pGL2 de Promega, pDsRedl-1 y pCMV-DsRed-express-1 de Clonetech. ADN genómico de rata se extrae de sangre periférica de rata con un equipo QIAamp Blood (Qiagen Inc, Valencia, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los productos PCR correspondientes se verificaron por electroforesis en gel de agarosa y purificaron por el equipo QIAguick Gel Extracción kit (QIAGEN) . Para confirmar las secuencias, secuenciado directo de productos PCR se realiza con el Equipo dRhodamine Terminator Cycle Sequencing Kit (PE Applied Biosystems, Foster City, CA) en un Analizador Genómico ABI 3100. La digestión, ligación, subclonación, aislamiento y purificación de plásmidos se realizaron por procedimientos estándar, y de nuevo secuenciaron para confirmar que no hubiera presentes mutaciones hechas por humanos .

Tabla 1: Secuencias de Cebador (promotores de gen de insulina de rata utilizando el mismo cebador directo) .

Cebador Secuencia No . de Acceso GenBank Cebadores 5'-g CTg AgC TAA gAA TCC A J00747 directos RIP ( SEQ ID NO . : 3 ) cebador inverso 5 '-CTg AgC ATT TTC CAC C RIP2.1 ( SEQ ID NO . : ) cebador inverso 5'-ggg AgT TAC Tgg gTC TCC RIP1.1 A ( SEQ ID NO . : 5 ) cebador inverso 5 ' -CTg CTT gCT gAT ggT CTA RIP4.1 (SEQ ID NO. : 6) cebador inverso 5'-gAC CTg gAA gAT Agg RIP3.1 CAg ggT (SEQ ID NO.: 7) ADNc de Rata 5'-AAC Atg ACC AAA TCA NM_019218 Neurodl directo TAC AgC (SEQ ID NO.: 9) ADNc de Rata 5'-TgA AAC TgA AAC TgA Neurodl inverso CgT gCC (SEQ ID NO.: 10) ADNc de Rata 5'-ATg gCg CCT CAT CCC NM_021700 Neurogenina3 TTg gAT (SEQ ID NO . : 11) directo ADNc de Rata 5 '-ACA CAA gAA gTC TgA Neurogenina3 gAA CAC (SEQ ID NO.: 12) inverso ADNc de Rata 5 '-AgC ATg CAg CAg gAC NM_031799 PAX4 directo ggT CTCA (SEQ ID NO.: 13) ADNc de Rata 5 ' -TTA Tgg CCA gTg TAA PAX4 inverso gTA ATA (SEQ ID NO.: 14) ADNc de Rata 5 '-ATg TCg CTg ACC AAC XM_345446 NKX2.2 directo ACA AAg AC (SEQ ID NO.: 15) ADNc de Rata 5' -TCA CCA AgT CCA CTg NKX2.2 inverso CTg ggC CT (SEQ ID NO.: 16) ADNc de Rata 5'-gCC ACC Atg AAT AgT NMi_022852 PDX1 directo gAg gAg (SEQ ID NO. : 17) ADNc de Rata 5'-TCA gCC TgC ggT CCT PDXl inverso CAC Cgg ggT (SEQ ID NO.: 18) ADNc de hámster 5'-CTg Tgg gA gTT AgC X81409 dorado NKX6.1 TgT (SEQ ID NO. : 19) directo ADNc de hámster 5 ' -TCA ggA CgA gCC gTg dorado NKX6.1 ggC CT (SEQ ID NO.: 20) inverso ADNc de Humano 5'-ATg gCC gCg gAg CTg NM_201589 MafA directo gCg AT (SEQ ID NO. : 21) ADNc de Humano 5'-CTA CAg gAA gAA gTC MafA inverso ggC CgT (SEQ ID NO.: 22) Protocolo UT D de Rata. Ratas Sprague-Dawley (250- 350 g) fueron anestesiadas con quetamina intraperitoneal (100 mg/kg) y xilazina (5 mg/kg) . Un tubo de polietileno (PE 50, Becton Dickinson, MD) se inserta en la vena yugular interna derecha por corte. El abdomen anterior se rasuró y se colocó una sonda S3 (Sonos 5500, Philips Ultrasound, Andover, MA) para formar en imagen el riñon izquierdo y bazo, que se identifican fácilmente. El páncreas se encuentra entre ellos, de manera tal que la sonda se ajusta para hacer blanco al páncreas y se sujeta en sitio. Un mi de solución de micro burbujas se somete a infusión a velocidad constante de 3 ml/h por 20 minutos utilizando una bomba de infusión. Por la duración de la infusión, se logró destrucción de micro burbujas utilizando modo ultra armónico (transmisión 1.3 MHz / recepción 3.6 MHz) con un índice mecánico de 1.2-1.4 y una profundidad de 4 cm. Los pulsos de ultrasonido fueron disparados con ECG (a 80 ms después del pico de la onda R) para suministrar una ráfaga de 4 cuadros de ultrasonido cada 4 ciclos cardiacos. Estos ajustes se han mostrado previamente como los parámetros, óptimos de ultrasonido para suministro de genes utilizando UTMD. Al final de cada suministro, la vena yugular se amarró y la piel se cerró. Todas las ratas se supervisaron después de suministro por comportamiento normal. Las ratas fueron sacrificadas 4 días después y se recolectaron los páncreas .

Fabricación de Micro burbujas Estabilizadas con Lípidos que Contienen Plásmido. Se prepararon micro burbujas estabilizadas con lípidos5,6. Brevemente, una solución de DPPC (1 , 2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina, Sigma, St. Louis, MO) 2.5 mg/ml; DPPE (1 , 2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfatidiletanolamina, Sigma, St. Louis, MO) 0.5 mg/ml; y glicerol al 10% se mezcló con 2 mg de solución de plásmido en una proporción 2:1. Alícuotas de 0.5 mi de esta solución de fosfolípido-plásmido se colocaron en ampolletas claras de 1.5 mi; el espacio superior restante se llenó con gas perfluoropropano (Air Products, Inc, Allentown, PA) . Cada ampolleta se incubó a 40 grados C por 30 min y después se agitó mecánicamente por 20 segundos por un amalgamador dental (VialmixTM, Bristol-Myers Squibb Medical Imaging, N. Billerica, MA) . Las micro burbujas estabilizadas con l pidos aparecen como una suspensión blanca lechosa que flota en la parte superior de una capa de líquido que contiene ADN plásmido sin ligar. El sub-nadante se descarta y las micro burbujas se lavan tres veces con PBS a ADN plásmido sin ligar retirado . El diámetro promedio y concentración de las micro burbujas en la capa superior se midieron por un contador de partículas (Beckman Coulter Multisizer III) .

PCR In Situ para Detección de ADN DsRed. Cebadores DsRed. Un solo par de cebadores DsRed se emplean directamente contra el ADN DsRed; son DsRed 125+ (5'-GAGTTCATGCGCTTCAAGGTG-3 ' ) y DsRed 690" (5'- TTGGAGTCCACGTAGTAGTAG-3 ' ) . Inmediatamente después de sacrificio, se retira sangre de las ratas con 200 mi de salino enfriado intra-arterial, seguido por fijación perfusión con 100 mi de de paraformaldehído al 2% y glutaraldehído al 0.4%. El páncreas se corta en trozos de 0.5 cm y coloca en solución de sacarosa al 20% durante la noche a 4 grados C y después se coloca en moldes OTC a -86 grados C. Secciones congeladas 5 um en espesor se colocan en porta-objetos revestidos con silano y fijan en paraformaldehído al 4% por 15 minutos a 4 grados C, neutralizan con glicina 10 mM en PBS por 5 minutos, enjuagan con PBS, permeabilizan con Tritón X-100 al 0.5% en PBS por 10 min, y enjuagan con PBS por 10 min. Un cubre-objetos se ancla con una gota de barniz de uñas en un lado. El porta-objetos después se coloca en un "bote" de aluminio directamente en el bloque del termociclador) . 50 µ? de solución de reacción PCR (0.8 unidades de Taq DNA polimerasa, 2µ1 de cebadores DsRed, 3 µ? de DIG-dNTP, 5 µ? de amortiguador 10x y 40 µ? de agua) se agregan a cada porta objetos y cubren por el Disco AmpliCover y Sujetadores utilizando el Assembly Tool (Perkin Elmer) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se realizó PCR in situ utilizando el sistema Perkin-Elmer GeneAmp 1000 como sigue: después de retención inicial a 94 grados C (1 min), PCR se lleva a cabo por 11 ciclos (94 grados C por 1 min, 54 grados C por 1 min, y 72 grados C por 2 min) . Después de amplificación, el portaobjetos se sumerge 2xSSC por 10 minutos y paraformaldehxdo al 0.5% por 5 minutos y PBS por 5 minutos 2 veces . El fragmento de ADN incorporado con digoxigenina se detecta utilizando un equipo mejorador de anticuerpo fluorescente para detección DIG (Roche) seguido por tinción histoquímica (PCR DIG Prob Synth'esis Kit (Roche Co . ; Cat . NO: 1636090). Primero, las secciones se incubaron con solución bloqueadora por 30 minutos para disminuir el enlace no específico del anticuerpo a tejido de páncreas.

Después, las secciones se incubaron con 50 µ? de solución anti-DIG (1:25) por 1 h a 37 grados C en una cámara humectadora. A continuación, los portaobjetos se lavaron con PBS tres veces con agitación, cada uno por 5 minutos de nuevo los portaobjetos se incubaron con 50 µ? de solución de anticuerpo anti-ratón-IgG-digoxigenina (1:25) por 1 hr a 37 grados C. Los porta-objetos se lavaron con PBS tres veces con agitación, de nuevo cada uno por 5 minutos. Los portaobjetos se incubaron con 50 µ? de solución anti-DIG-fluorescencia (1:25) por 1 hr a 37 grados C. Los portaobjetos después se lavaron con PBS tres veces con agitación, cada uno por 5 minutos de nuevo. Finalmente, las secciones se deshidrataron en EtOH al 70%, EtOH al 95% y EtOH al 100%, cada uno por 2 minutos, liberaron en xileno y taparon con cubre-objetos.

RT-PCR In Situ para Detección de DsRed mRNA. Cebadores DsRed. Un solo par de cebadores DsRed se emplearon directamente contra el DsRed cDNA, son DsRed 125+ (5'-GAGTTCATGCGCTTCAAGGTG-3 ' ) y DsRed 690" (5' -TTGGAGTCCACGTAGTAGTAG-3 ' ) . Secciones congeladas o fijas por perfusión se prepararon como se describió anteriormente. Tratamiento con DNasa se realizó con 50 µ 1 de solución cocktail (Invitrogen) (5 µ? de DNasa I, 5 µ? de amortiguador lOxDNasa, y 40 µ 1 de agua) en cada porta objetos, tapan con cubre objetos, incubado a 25 grados C durante la noche, y después lavado con PBS 5 minutos 2 veces .

Transcripción inversa: Síntesis ADNc de primer hebra se realiza en cada porta objetos en un volumen total de 50 µ? con 50 µ 1 de solución cocktail (sistema de síntesis de primer hebra Superscript para RT-PCR, Invitrogen kit # 11904-018) (1 //l de cebadores DsRed727" ( 5 ' -GATGGTGATGTCCTCGTTGTG-3'), 5 µ? de DTT solución, 2.5 µ? de dNTP, 5 µ? de amortiguador 10x, 5 µ 1 de MgCl25 mM, 29 µ 1 de agua y 2.5 µ 1 de SuperScript II RT) . Un cubre objetos se coloca y los porta objetos se incuban a 42 grados C por 2 horas; lavan con PBS 5 minutos 2 veces, enjuagan con ETOH 100% por 1 minuto y secan.

Inmunohistoquímica para Detección de proteína DsRed, Insulina y Glucagón. Secciones de criostato de 5-8 µt? en espesor se fijaron en paraformaldehído al 4% por 15 minutos a 4 grados C y neutralizaron por 5 minutos con glicina 10 mM en PBS. Secciones después se enjuagaron en PBS 3 veces, y permeabilizaron con 0.5% Tritón X-100 en PBS por 10 minutos . Las secciones se bloquearon con suero de cabra al 10% a 37 grados C por 1 hora y lavaron con PBS 3 veces. El anticuerpo primario (Sigma Co.) (dilución 1:10000 en solución block) se agregan" e incuban a 4 grados C durante la noche. Después de lavar con PBS tres veces por 5 minutos, el anticuerpo secundario (Sigma Co., anti-ratón lgG conjuga con FITC) (1:500 dilución en solución block) se agregan e incuban por 1 hora a 37 grados C. Se enjuagaron secciones con PBS por 10 minutos, 5 veces y después montaron.

Cultivo celular y ensayos de transfección transitoria. Líneas celulares INS-1 (insulinoma de rata cortesía de Newgard lab, Duke University) se mantuvieron en medio apropiado celular. Células INS-1 se- transfectaron con 1 µg de plásmido reportero 'luciferasa y 0.02 //g de pTS-RL Renilla luciferasa, como un plásmido de control interno y 3 µ de Lipofectamina 2000 en 100 µ? de DMEM libre de suero cada pozo. Las actividades de recolección celular y luciferasa de luciérnaga y Renilla se midieron 48 horas después de transfección utilizando el sistema de ensayo Luciferasa Dual (Promega) y un luminometro Turner TD 20/20.

Análisis Estadístico. Diferencias en actividad de luciferasa entre grupos de estudio se compararon por ANOVA de dos días. Un valor p <0.05 se considera estadísticamente significante. Pruebas Scheffe Post-hoc se realizaron solo cuando los valores de ANOVA F fueron estadísticamente significantes.

La FIGURA 1 es una representación esquemática del área de promotor de insulina de rata y exónl, intrónl y exón2. El promotor de insulina de rata se muestra con elementos dé secuencia conocidos y exónl y exón2 de fusión.

La FIGURA 2 : panel superior son actividades de luciferasa de lisados de células INS-1, 48 horas después transfectadas con rips-luc bajo tres concentraciones de glucosa diferentes. El panel inferior son actividades luciferasa de solución de medio de cultivo en diferente tiempo de cultivo después de transfección con rips-luc bajo alta concentración de glucosa, sin actividad de luciferasa sin concentración de glucosa y en glucosa normal (datos no mostrados) .

La FIGURA 3. A: Porta objetos RIP3.1-DsRed, superior izquierdo :verde como anti-insulina; medio superior rojo como anti-dsred; y derecho superior como su imagen confocal. Un fondo como sección secuencial y estructura de isletas similar, fondo izquierdo: verde como anti-glucagón; medio inferior : roj o como anti-dsred. derecho inferior como su imagen confocal. B: RIP-4.1-dsred; C: RIP-1.1-dsred; D: porta objetos RIP-1.1-dsred, E: pCMV-dsred; F: control norm l.

La FIGURA 4: Imágenes A como ratas pRIP3.1-DsRed con alimentación al 10% de glucosa, un Verde derecho superior como anti-insulina; un rojo medio superior como anti-dsred, un izquierdo superior como su imagen confocal; un verde derecho inferior como anti-glucagón; un rojo medio inferior como anti-dsred; un izquierdo inferior: su imagen confocal; imágenes B como ratas pRIP3.1-DsRed de ayuno durante la noche .

La FIGURA 5 : Paneles superiores . Secciones microscópicas (400X) de una rata de control (izquierdo) y una rata sin tratar UT D (medio como rata con alimentación y derecho como rata de ayuno) . PCR in-situ se emplea parta teñir el ADN plásmido DsRed, que se ve a través del páncreas tratado. Se ve claramente una isleta (flechas) . Paneles de fondo o inferiores. Secciones (400X) de una rata de control (izquierda) y una rata tratada con UTMD utilizando RIP6.1-DsRed (medio como rata con alimentación y derecho como rata con ayuno) . RT-PCR in-situ se emplea para teñir DsRed mRNA, que se localiza al centro de la isleta (medio/alimentación) . Teñido en borde de isletas (derecho/rata de ayuno) .

Se encontró que, los promotores de insulina de rata impulsan la transfección de gen luciferasa en línea celular de insulinoma de rata (INS-1) . Promotores de insulina de rata tradicionales impulsan la expresión en plásmidós muestran baja eficiencia de expresión de tejido y no son muy altamente específicos de tejido en sistema de suministro ín vivo. La presente invención incluye un promotor de insulina que incluye insulina 1 gen exónl e intrónl y parte de exón2 no previamente empleado para regulación de gen de insulina. En ciertas modalidades, el promotor de insulina es un promotor de insulina de rata, un promotor de insulina humano o sus combinaciones. La FIGURA 2 muestra que bajo nivel de glucosa normal, la actividad de luciferasa de RIP3.1 mostró un aumento de 4726 veces frente a RIP2.1 (un promotor RIP truncado), un aumento de 20 veces sobre RIPl .1 (longitud completa del RIP tradicional), e incluso 3.1 veces de CMV-luciferasa. Bajo condiciones sin glucosa, la expresión de gen de INS-1 para todas las construcciones se inhibió significativamente, la actividad de luciferasa de RIP3.1 todavía fue 6.6 veces de RIPl.l, 2.6 veces de C V. Con alto nivel de glucosa, las actividades de luciferasa de RIP3.1 fue 3515 veces de RIP2.1, 6.9 veces de RIPl.l, y 0.6 veces de CMV. De manera sorprendente bajo condiciones de alto contenido de glucosa, la actividad de luciferasa puede ser detectada de la solución de medio de plato de RIP3.1 a 8, 16, 24, 32 y 48 horas después de transíección. No se encontró secreción en condiciones de cultivo sin glucosa y con glucosa normal (datos no mostrados). El RIP3.1 que impulsa luciferasa no solo tiene alta eficiencia y demostrada respuesta a glucosa, también secreta la proteína expresada en la solución de medio en la línea celular INS-1.

Plásmidos DsRed que impulsan RIP suministrados a isletas pancreáticas de ratas vivas con UTMD. Para comprender mejor la expresión de genes y regulación de estos promotores RIP en isletas de animales vivos bajo condiciones reales, no solo en línea celular, estos promotores RIP que impulsan plásmidos DsRed se suministraron al páncreas de ratas vivas con destrucción de micro burbujas dirigida por Ultrasonido (UTMD) , con sacrificio 4 días después de UTMD. La FIGURA 3 muestra que la proteína DsRed de RIP3.1 y RIP4.1 se detecta en isletas intactas incluye núcleos de isletas y borde, no visto en áreas sin isletas. De manera sorprendente, imágenes confocales mostraron que se detectó proteína de DsRed en células beta y células alfa en isletas . Señal de proteína DsRed fue mucho más baja en RIP1.1 de longitud íntegra y casi no se ve en RIP2.1 truncado. La señal de proteína DsRed se vió en todas partes del porta objetos pancreático en una rata tratada con plásmido CMV-DsRed. Pero en el porta objetos de páncreas de control de rata normal, no se pudo detectar señal DsRed.

A continuación, se determinó si la expresión de genes de plásmidos RIP suministrados es regulable en isletas de rata por el nivel de glucosa, como se encontró con la línea celular INS-1 in vitro. RIP3.1 DsRed se elige y utiliza para tratar ratas, que se dividen en grupos: ayuno (12 horas) y alimentación (con 10% de glucosa) y después sacrificio. La FIGURA 4 muestra en el panel superior (con alimentación del 10% de glucosa) señal de DsRed que se ve en células beta y células alfa de isletas. En el panel inferior (ayuno por 12 horas) la señal de DsRed solo se ve en células alfa, pero no en células beta de isletas. Esto indica que la alimentación con glucosa induce regulación por incremento o regulación positiva de expresión de genes RIP3.1-DsRed en células de isletas enteras y el ayuno induce regulación por decremento de expresión de gen RIP3.1-DsRed en células beta y se mantiene el gen Rip3.1-DsRed operando en células alfa.

PCR In Situ para ADN Plásmido y RT-PCR in Situ para DsRed ARNm: FIGURA 5 (superior y medio alimentación con 10% de glucosa, panel izquierdo fue de ayuno) muestra los resultados de PCR in situ dirigido contra ADN plásmido RIP3.1-DsRed. El ADN plásmido se ve a través del páncreas en un patrón nuclear incluyendo las isletas. Patrones Similares de localización de tejido nuclear homogéneo del plásmido se observan en el riñon izquierdo, bazo y porciones del hígado que están dentro del haz de ultrasonido. El plásmido no estuvo presente en el riñon derecho o músculo esquelético, órganos que se encuentran fuera del haz de ultrasonido. Controles (panel superior derecho) (micro túbulos sin plásmido o micro burbujas-plásmido sin ultrasonido) no muestran evidencia alguna de plásmido dentro del páncreas. Estos resultados demuestran que el tratamiento con ultrasonido liberó el plásmido dentro del páncreas y su vecindad inmediata.

La FIGURA 5 (panel inferior medio (alimentación con 10% de glucosa) muestra un ejemplo representativo de RT-PCR in situ dirigido contra el mRNA que corresponde a la transcripción de DsRed expresada bajo el control del promotor RIP3.1. DsRed mRNA se ve través de las isletas, pero no en el parénquima pancreático, indicando que la transcripción dirigida por el promotor RIP del ADNc DsRed suministrado por UTMD solo en el páncreas endocrino . El panel inferior izquierdo (ayuno) muestra distribución de DsRed mRNA en área borde de isletas, pero no en el núcleo de isletas. No hubo señal detectada en los controles. Construcciones adicionales se ilustran en las FIGURAS 11-15.

Regeneración de isletas pancreáticas e inversión de diabetes inducida por estreptozotocina por genes de factor de transcripción de isletas suministrados in vivo.

El control de glucosa en la sangre a menudo es inadecuado en diabetes debido a la terapia de drogas, incluyendo reemplazo de insulina, no es capaz de replicar la función regulatoria de glucosa de las isletas normales . De acuerdo con esto, se han enfocado nuevas estrategias de tratamiento en reabastecimiento de la deficiencia de la masa de células beta común a ambas formas principales de diabetes por trasplante de isletas o regeneración de células beta1,2. Trasplante de isletas se ha limitado por el suministro de isletas donadoras y la necesidad por terapia inmunosupresora3. La regeneración de isletas ha sido exitosa en modelos de animales, primordialmente en hacer blanco a tejido de hígado utilizando vectores virales4-7, que probablemente no se utilizarán en humanos por razones de seguridad. Los inventores han demostrado previamente que la terapia de genes puede ser dirigida a isletas pancreáticas utilizando destrucción de micro burbujas dirigida por ultrasonido (UTMD) . Micro burbujas intravenosas que transportan ADN plásmido se destruyen dentro de la micro circulación pancreática por el ultrasonido, logrando expresión de gen local que puede ser adicionalmente dirigida a células beta al utilizar el promotor insulina de rata-I. UTMD se ha empleado para suministrar betacelulina y PDXl en diabetes inducida por estreptozotocina (STZ) en ratas con inversión de diabetes por hasta 15 días al reprogramar células acinares pancreáticas en células productoras de insulina9. La presente invención utiliza UTMD para regenerar isletas pancreáticas utilizando plásmidos que codifican NeuroDl, con normalización de glucosa en la sangre, insulina y C-péptido por hasta 30 días.

Promotores de insulina de rata y construcciones de plásmidos. ADN genómico de ratas Sprague-Dawley se extrajo de sangre periférica de ratas con un equipo QIAamp Blood (Qiagen Inc, Valencia, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Fragmentos promotores de gen de insulina de rata 1 (-412 a +165), se amplifican a partir de ADN genómico de rata SD utilizando PCR. Los fragmentos de ADN resultantes se subclonaron en el vector reportero pDsRedl-1 (Clonetech, CA) . hMafA cDNA y Nkx6.1 cDNA de hámster fueron regalos donados cordialmente de Olson lab en Michigan State University y Newgard lab en Duke University Medical Center. Rat Ngn3 , NeuroDl, Pax4, y Nkx2.2 cDNAs fueron productos PCR de reserva ADNc de páncreas de rata recién nacidas Sprague-Dawley que se invirtieron de su ARN total de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Muestras pancreáticas de rata recién nacida se congelaron en forma instantánea en nitrógeno líquido y almacenaron a -86 grados C. Las muestras congeladas se . descongelaron en 1 mi de solución ARN-STAT y homogeneizaron inmediatamente utilizando un homogeneizador politron a 10,000 rpm por 30s. ARN total (30 ng) fue sometido a transcripción inversa en 20 µ? al utilizar un Sensiscript RT kit (Qiagen Inc, Valencia, CA) con oligo(dT)16. La mezcla de reacción se incubó a 42 grados C por 50 min, seguido por una incubación adicional a 70 grados C por 15 min. PCR se realizó para todas las muestras utilizando un GeneAmp PCR System 9700 (PE ABI , Foster City, CA, USA) en un volumen de 50 ul que contiene 2 ul de ADNc, 25 ul de Mezcla Maestra HotStarTaq (Qiagen Inc, Valencia, CA) , y 20 pmoles de cada cebador. Los productos PCR correspondientes se verificaron por electroforesis en gel de agarosa y purificaron por el equipo QIAquick Gel Extraction (Qiagen Inc, Valencia, CA) . Para confirmar las secuencias, secuenciado directo de productos PCR se realizó con el Rhodamine Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA) en un Analizador Genómico ABI 3100. Todo ADNcs de gen de factor de transcripción se subclonó al vector impulsor RIP3.1. La digestión, ligado, subclonación, aislamiento y purificación de los plásmidos se realizaron por procedimientos estándar, y de nuevo se secuenciaron para confirmar que no estuvieron presentes mutaciones hechas por humanos .

Protocolos de Animales y UTMD. Todos los" estudios de animales se realizaron de acuerdo con las recomendaciones del Instituto Nacional de Salud (NIH = National Institute of Health) y la aprobación del comité de investigación en animales institucional. Ratas macho Sprague-Dawley (230-270g) anestesiadas con cetamina intraperitoneal (60 mg/kg) y xilazina (5 mg/kg) se rasuraron del abdomen izquierdo y cuello, y un tubo de polietileno (PE 50, Becton Dickinson, Franklin Lakes, TN, USA) se insertó en la vena yugular interna derecha por corte.

Un total de 45 ratas recibieron uno de nueve tratamientos: (1) sin tratamiento (ratas de control normal, n=3); (2) STZ (60 mg/kg/i.p., Sigma, St Louis, MO, USA) solo sin UTMD (N=3); (3) STZ y UTMD con DsRed (n=3); ( 4 ) STZ y UTMD con ngn3 (n=6) ; (5) STZ y UTMD con NeuroD (n=6); (6) STZ y UTMD con Pax4 (n=6) . (7) STZ y UTMD con Nkx2.2 (n=6) ; (8) STZ y UTMD con Nkx6.1 (n=6) ; (9) STZ y UTMD con MafA (n=6). Todos los genes se suministraron como ADNc de plásmido bajo el control del promotor RIP3.1. Glucosa en la sangre se midió 12 horas después de inyección STZ . Los animales con ayuno de glucosa en la sangre sobre 250 mg/dl se consideraron como modelo de tipo diabetes 1 exitoso y subsecuentemente se sometieron a UTMD dentro de 48 horas de tratamiento con STZ. Soluciones de control o micro burbujas (0.5 mi diluidas con 0.5 mi de solución amortiguada con fosfato (PBS)) se sometieron a infusión durante 10 minutos por bomba (Genie, Kent Scientific, Torrington, CT, USA) . Durante la infusión, se dirigió ultrasonido al páncreas utilizando un transductor de ultrasonido comercialmente disponible (S3, Sonos 5500, Philips Ultrasound, Bothell, WA, USA) . La sonda se sujetó en sitio. Ultrasonido después se aplicó en modo ultraharmónico (transmisión 1.3 MHz/recepción 3.6 MHz) a un índice mecánico de 1.4. Cuatro ráfagas de ultrasonido se dispararon a cada cuarta sístole final por electrocardiograma utilizando un retardo de 45-70 ms después del pico de la onda R. Estos ajustes han mostrado que son óptimos para suministro de plásmido por UTMD utilizando este instrumento8. Destrucción con burbujas fue aparentemente visual en todas las ratas. Después de UTMD, la vena yugular se amarró, la piel se cerró, y se dejó que los animales se recuperaran. Muestras de sangre se tomaron después de un ayuno de 12-horas durante la noche en línea base, y a diferentes días después de tratamiento. El protocolo se repitió 3 veces con ratas sacrificadas en los días 10, 20, y 30 utilizando una sobre-dosis de pentobarbital sodio (120 mg/kg) . Páncreas, hígado, bazo, y riñon se recolectaron para histología. Se midió el nivel de glucosa en la sangre con tiras de prueba de glucosa en la sangre (Precisión, Abbott, Abbott Park, IL, USA) ; insulina en la sangre, C-péptido, se midieron con el equipo RIA (Lineo Research, Radioimmunoassay, Billerica, MA, USA) .

Fabricación de Micro burbujas Estabilizadas con Lípido que Contiene Plásmido. Micro burbujas estabilizadas con lípido se prepararon como se describió previamente en nuestro laboratorio. Brevemente, una solución de DPPC (1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina, Sigma, St. Louis, MO) 2.5 mg/ml; DPPE (1 , 2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfatidiletanolamina, Sigma, St. Louis, MO) 0.5 mg/ml; y glicerol al 10% se mezclaron con 2 mg de solución de plásmido en una proporción de 2:1. Alícuotas de 0.5 mi de esta solución de fosfolípido-plásmido se colocaron en ampolletas transparentes de 1.5 mi; el espacio superior restante se llenó con el gas perfluoropropano (Air Products, Inc, Allentown, PA) . Cada ampolleta se incubó a 4 grados C por 30 min y después agitó mecánicamente por 30 segundos por un amalgamador dental (VialmixTM, Bristol-Myers Squibb Medical Imaging, N. Billerica, MA) . Las micro burbujas estabilizadas con lípido aparecen como una suspensión blanca lechosa que flota en la parte superior de una capa de líquido que contiene ADN de plásmido sin ligar o sin enlazar. El diámetro promedio y la concentración de las micro burbujas en la capa superior, se midieron por un contador de partículas (Beckman Coulter Multisizer III) . inmunohistoquimica. Secciones de Criostato 5-8 µp? en espesor se fijaron en paraformaldehído al 4% por 15 minutos a 4 grados C, neutralizaron por 5 minutos con glicina 10 mM en PBS. Después se enjuagaron secciones en PBS 3 veces, y permeabilizaron con Tritón X-100 al 0.5% en PBS por 10 min. Las secciones se bloquearon con suero de cabra al 10% a 37 grados C por 1 hora y lavaron con PBS 3 veces. El anticuerpo primario (anticuerpo anti-insulina de ratón, dilución 1:500; anti-glucagón de conejo, 1:500; anti-somatostatina de conejo, 1:500; polipéptido anti-pancreático de conejo, 1:500, anti-NeuroDl de conejo, 1:500, anti- Ki-67 de conejo, anti-BrDu de conejo, 1:500 (Sigma, St. Louis, MO) , anti-ckl9 de ratón, dilución 1:2000 (Chemicon, Temecula, CA) se agregaron e incubaron por 2 horas a RT. Después de lavar con PBS tres veces por 5 minutos, el anticuerpo secundario (Sigma, St; Louis, MO) IgG anti-ratón conjugado con FITC; IgG anti-conejo conjugado con Cy5) (1:500 dilución en solución de bloque) se agregaron e incubaron por 1 hr a RT. Las secciones se enjuagaron con PBS por 10 min, 5 veces y después montaron.

Análisis de Datos. Datos se analizaron con el programa Statview (SAS, Cary, NC, USA) . Los resultados se expresan como una desviación estándar promedio. Diferencias se analizaron por medidas repetidas ANOVA con prueba post hoc de Fisher y consideraron significantes a P<0.05.

El desarrollo embriológico del páncreas endocrino se asocia con activación de una cantidad de genes, que codifican diversos factores de transcripción y otras proteínas10-11. Reconociendo que puede haber diferencias importantes entre desarrollo endrócrino neonatal y regeneración de isletas en un animal adulto con diabetes, buscamos evaluar si esto último pudiera lograrse por terapia de genes dirigidas al páncreas por UTMD. Plásmidos que codifican cDNA para Ngn3 , NeuroDl, Pax4, Nkx2.2, Nkx6.1, y MafA, se construyeron bajo control de una versión truncada del promotor de insulina de rata (RIP3.1). Micro burbujas que contienen estos genes se sometieron a infusión intravenosamente sobre un periodo de 20-minutos mientras que se empleó ultrasonido para destruir las micro burbujas dentro de la microcirculación pancreática. UTMD se realizó 48 horas después de inducción de diabetes por STZ intraperitoneal (60 mg/kg) . Controles incluyen UTMD con un gen marcador (RIP3.1-DsRed) , STZ solo sin terapia de genes, y controles normales que no recibieron STZ. Tres diferentes repeticiones de los experimentos se llevaron a cabo, con sacrificio a 10 días, 20 días, y 30 días para evaluar la morfología de isletas y expresión de genes. Resultados de los estudios a 30-días se discuten aquí y resumen en las Figuras 6-8.

La Figura 6 ilustra muestras histológicas representativas teñidas con anticuerpos de anti-insulina etiquetados con FITC (verde) y anticuerpos de anti-glucagón etiquetados con CY5 (rojo) . Estas secciones se obtuvieron de un grupo de ratas sacrificadas 30 días después de UTMD. Isletas normales que contienen un núcleo central de células beta (verde) circundadas por un número menor de células alfa (rojo) en la periferia .de la isleta. Después de STZ, la arquitectura de isleta normal virtualmente es suprimida con células beta aisladas ocasionales o pequeños enjambres de células beta restantes. Terapia de genes con Ngn3 , Pax4, Nkx2.2, Nkx6.1 , y MafA resultó en algo de regeneración de isletas, pero con arquitectura de isletas anormal, en donde fueron predominantes las células alfa. En contraste, terapia de genes con NeuroDl resultó en regeneración de isletas con morfología casi normal. De manera interesante, hubo unas cuantas células que co-tiñen con anti-insulina y anti-glucagón en los grupos de terapia de genes UTMD, pero no en isletas normales. Este hallazgo se ha reportado previamente como un marcador para proliferación endocrina12. En ratas normales, hubo 61 ± 6 isletas por porta-ob etos, en comparación con solo 3 ± 2 después de tratamiento STZ solo . NeuroDl resultó en 37 ± 4 isletas por porta-objetos, un número que fue significante estadísticamente superior que todos los otros grupos excepto los controles normales (p<0.0001). El por ciento de células beta por isleta promedió 77 ± 10% en controles normales, y fue 60 ± 6% en ratas tratadas con terapia de genes NeuroDl . Todos los otros grupos tuvieron números marcadamente reducidos de células beta por isletas. El porcentaje de células beta fue estadísticamente superior de manera significante para ratas tratadas con NeuroDl que para todos los otros genes y controles (p<0.0001), pero menos que los controles normales (p=0.0006) . Además, secciones adyacentes a aquellas mostradas en las figuras se tiñeron con anti-somatostatina y anti-polipéptido para estimar la presencia de células delta y células polipéptido, respectivamente (datos no mostrados) . NeuroDl resultó en cantidades sustanciales de células polipéptido y delta en el núcleo central de isleta, similares a los controles normales. Los otros factores de transcripción no resultan en números sustanciales de células polipéptido o delta dentro de las isletas.

La Figura 7 muestra niveles de glucosa en sangre (panel izquierdo superior) , insulina (panel izquierdo inferior) , y C-péptido (panel derecho superior) en línea base, 3 días después de STZ, y 30 días después de STZ. La glucosa en la sangre aumentó dramáticamente al día 3 en todas las ratas tratadas con STZ (aproximadamente 400 mg/dl) , y permaneció elevada al día 30 excepto en las ratas tratadas con NeuroDl. Al día 30, la glucosa en la sangre fue 101 ± 11 mg/dl en las ratas tratadas con NeuroDl, lo que fue menor estadísticamente significante que todos los otro grupos tratados con STZ (p<0.0001), pero no de los controles normales. En los experimentos a más corto plazo, la glucosa en la sangre también fue normal los días 10 y 20 en las ratas tratadas con NeuroDl . Los paneles medio e inferior de la Figura 7 muestran que los niveles de insulina y C-péptido fueron oprimidos marcadamente el día 3 en todas las ratas tratadas con STZ . El día 30, los niveles de insulina y C-péptido fueron casi normales en las ratas tratadas con NeuroDl, siendo estadísticamente superiores de manera significante que el día 3 o que todos los otros grupos tratados con STZ (p<0.0001). Para determinar si estos niveles de insulina y C-péptido respondieron a glucosa, un grupo separado de ratas tratadas con 6 NeuroDl y controles (3 normal, 3 STZ-DsRed) se sometieron a una prueba de tolerancia de glucosa 30 días después de UTMD. Como se ilustra en el panel derecho inferior de la Figura 7, las ratas tratadas con NeuroDl tuvieron una prueba de tolerancia de glucosa que fue casi idéntica a los controles normales.

La Figura 8 muestra los resultados de tinción de BrdU (superior izquierdo) y Ki67 (medio superior), que indican proliferación celular. Estas son imágenes de alta amplificación de isletas sencillas de ratas tratadas con NeuroDl. Tinción nuclear con BrdU (rojo, panel izquierdo superior) y Ki67 (rojo, panel medio superior) se presentan en células positivas a insulina (verde) . Comparado con los normales, y grupos de control tratados con STZ, tanto células positivas BrdU como i67 fueron más numerosas en forma estadísticamente significante a -30 ± 2% y 10 ± 2% de células positivas de .insulina, respectivamente (p<0.0001). Controles normales no tuvieron evidencia de tinción con BrdU, y solo raras células fueron positivas para Ki67. Los paneles inferiores muestran tinción inmunofluorescente para CK19 (verde, panel izquierdo remoto), insulina (rojo, panel medio izquierdo), neurogenina 3 (azul, panel medio derecho), y la imagen combinada (panel derecho lejano) . No hay colocalización de CK19, un marcador de célula ductal, con insulina o neurogenina 3 ; mientras que conforme los últimos dos marcadores se co-localizan dentro de células beta en el centro de la isleta. Esto indica que la regeneración de isleta no es probable que sea de origen de célula ductal.

Este estudio muestra que el suministro in vivo de NeuroDl dirigido al páncreas de ratas tratadas con STZ, resulta en regeneración de isletas que aparecen casi normales con restauración de niveles de sangre normal de glucosa, insulina y C-péptido. El método UTMD permite hacer blanco no invasivo de suministro de genes al páncreas, que es el ambiente normal para las isletas. La expresión pico de genes reporteros suministrados como plásmidos por UTMD es de 4 días, con rápida degradación posterior8. De esta manera, la expresión de gen transitoria por este método, es capaz de inducir regeneración de isletas, mientras que teóricamente reduce al mínimo el riesgo de oncogénesis que puede estar asociado con expresión prolongada de terapia de genes exógena .

NeuroDl es un factor de transcripción básico de hélice-bucle-hélice que se encuentra en el páncreas, intestino y sistema nervioso central13. NeuroDl está presente en desarrollo de gérmen pancreático y permanece detectable en todos los tipos de células de isletas maduras. En ratones inoperativos NeuroDl, se desarrollan todos los tipos de células endocrinas, pero hay números disminuidos de isletas e incrementada apoptosis de células beta14. Se considera que NeuroDl no es esencial para la diferenciación temprana, pero juega un papel importante en la diferenciación de etapa tardía y mantenimiento de células beta, y en determinación del destino de la célula15,16. En vista del papel de NeuroDl en el desarrollo endocrino, aunque se basa primordialmente en estudios de ratones transgénicos, es consistente con el hallazgo observado de regeneración de isletas, de isletas que contienen múltiples tipos de células en el presente estudio.

Otros factores de transcripción, específicamente Ngn3, Pax4, Nkx2.2, Nkx6.1, y MafA, también resultaron en regeneración de isletas, pero las isletas comprendieron predominantemente células alfa, y glucosa, insulina y C- péptido en la sangre no se normalizaron. De manera interesante, ratones transgénicos que expresan Ngn3 bajo regulación de un promotor Pdxl muestran primordialmente células positivas de glucagón17, similar a nuestros hallazgos después de suministro in vivo de Ngn3. Cuando Ngn3 se sobre-expresa en intestino de pollo en desarrollo, también produce predominantemente células alfa18. El papel de estos factores de transcripción cuando se suministran exógenamente a animales adultos con diabetes, puede diferir de su papel en desarrollo embriológico. También es posible que diversas combinaciones de genes de factor de transcripción u otros genes implicados en el desarrollo pancreático o ciclo celular, resulten en una regeneración de isletas aún más robusta que la observada en este estudio. Por ejemplo, Chen, et al, mostró que la producción de insulina por células acinares puede ser inducida en ratas tratadas con STZ por la combinación de plásmidos Pdxl y betacelulina suministrados in vivo con restauración de glucosa en la sangre normal e insulina por hasta 15 días9' Más recientemente, Zhou, et al, reportó que la combinación de Ngn3 , MafA, y Pdxl, suministrado por la inyección directa de adenovirus en el páncreas de ratones inmuno-deficientes, resultó en reprogramación de células exócrinas a un fenotipo de células beta19' Estas nuevas células beta se aislaron en células sencillas o pequeños enjambres de solo unas cuantas células, en vez de agregarse en isletas. Glucosa, insulina y C-péptido en la sangre se mejoraron pero no restauraron a niveles normales. Cuando se suministraron factores de transcripción sencillos, nuevas células beta no se vieron en números significantes. El presente estudio difiere al menos en dos aspectos potencialmente importantes. Primero, un método de suministro de gen no-viral se empleó, que a diferencia de inyección directa, hace blanco a todo el páncreas. En segundo, un promotor específico de células beta se empleó para hacer blanco al páncreas endocrino. El promotor CMV comúnmente empleado es altamente eficiente en páncreas exócrino, pero no endocrino20. Similarmente, adenovirus es más robusto en páncreas exócrino que endocrino21.

La Figura 9 muestra imágenes de isletas estables tratadas con una composición UTMD, que comprende una combinación de CiclinaD2, CDK4, y GLPl (isletas fueron estables hasta 180 días) cuando se tratan con la combinación. El panel izquierdo superior muestra una isleta representativa de una rata de control normal no tratada por UTMD. Un núcleo de isletas denso grande de células beta que expresa insulina está presente (verde) , circundado por una pequeña cápsula de células alfa periféricas que expresan glucagón (rojo) . El panel derecho superior muestra un resto de isletas representativo después de diabetes inducida por STZ . Solo se presentan unas cuantas células beta. El panel izquierdo inferior muestra un ejemplo de regeneración de isletas después de UTMD con el gen GLPl . Está presente un número menor que lo normal de isletas con algunas células beta (verde) y células alfa (rojo) , pero la arquitectura no es normal. Estuvieron presentes hallazgos similares (no mostrado) , para ratas tratadas con UTMD utilizando los genes sencillos CiclinaD2, CDK4, y CDK6. El panel derecho inferior muestra una isleta casi normal después de UTMD con la combinación de CiclinaD2, CDK4, y GLPl (estas isletas fueron estables hasta 180 días y se acompañaron por inversión de diabetes con niveles normales de glucosa, insulina y C-péptido en la sangre) .

La Figura 10 es una gráfica que muestra niveles de glucosa en la sangre con el tiempo, de isletas en diversos grupos de ratas tratadas con terapia de genes UTMD, así como controles normales, y ratas diabéticas STZ sin tratamiento UTMD. Como puede verse, terapia de genes sencilla con CiclinaD2, CDK4, CDK6 , o GLPl no resulta en normalización de glucosa en la sangre. Sin embargo, la composición que comprende una combinación de CiclinaD2, CDK4, y GLPl, o CiclinaD2, CDK4, CDK6, y GLPl restauró los niveles de glucosa en la sangre a los normales por 4 semanas en este experimento particular. Estudios de más largo plazo en otro grupo de animales confirmaron una duración de efecto de hasta 180 días .

Regeneración de isletas se ha logrado en diabetes mediada por STZ al utilizar adenovirus para suministrar diversos genes al hígado, con restauración resultante de glucosa en la sangre normal4"6. Sin embargo, no son adecuados los adenovirus para uso en humanos debido á consideraciones de seguridad. Aunque el hígado es un órgano conveniente para regeneración de isletas y trasplante de isletas, la presente invención utiliza destrucción de micro burbujas mediada por ultrasonido para suministrar ADNc plásmido a todo el páncreas con una especificidad de órgano relativamente potente8,9. El hacer blanco al páncreas ofrece una ventaja para regeneración y mantenimiento de isletas ya que el páncreas es el medio fisiológico normal para las isletas.

Las isletas regeneradas pueden representar replicación de células beta dispersas que sobreviven al tratamiento STZ . Tinción inmunohistoquímica con Ckl9, un marcador de células ductales, no muestra ninguna absorción significante en las isletas regeneradas. La regeneración de isletas solo se vio que ocurre cuando suministro de genes fue administrado inmediatamente después de tratamiento STZ o dentro de 48 horas posteriores. Cuando los experimentos se repitieron con suministro de genes 7 días después de STZ, un periodo de tiempo en donde virtualmente no hubo células de tinción de insulina en ratas de control STZ, la regeneración de isletas no se ve y hubo avance de severa hiperglicemia y pérdida de peso. Se empleó una modificación del promotor de insulina de rata I, que es fuertemente específico de células beta8 y no se espera que tenga actividad substancial en páncreas exocrino. Estas consideraciones son consistentes con la visión predominante que la replicación de células beta es el mecanismo predominante para incrementar la masa de células beta12,22,23. Es interesante que el estímulo de células beta supervivientes con diversos factores de transcripción bajo control de un promotor específico de células beta, resultará en números substanciales de células alfa, células delta y células de polipéptido. Esto sugiere que estos factores de transcripción, especialmente NeuroDl, no solo inducen a proliferar y agregar las células beta en isletas, sino a formar otros tipos de células de isleta por igual. El mecanismo por el cual esto ocurre queda por elucidar.

La Figura 11 es una representación esquemática de un mapa del plásmido HIP-hNeuroDl que muestra el área de promotor de insulina humana y regiones exónl, intrónl y exón2. La Figura 12 es una representación esquemática de un mapa del plásmido RIP3.1-DsRed que muestra las regiones exónl, intrónl y exón2. La Figura 13 es una representación esquemática de un mapa del plásmido RIP-DsRed 4.1 que muestra la insulina de rata 1 y exónl, intrónl y exón2. La Figura 14 es una representación esquemática de un mapa del plásmido RIP-DsRed 5.1 que muestra el área de insulina de rata y exónl y exón2. La Figura 15 es una representación esquemática de un mapa del plásmido RIP-DsRed 2.1 que muestra el área de promotor de insulina de rata y exónl y exón2.

El concepto de utilizar terapia de genes para promover regeneración de isletas en pacientes diabéticos, es plausible. Meier, et al, mostró que 88% de especímenes de autopsia de humanos adultos con diabetes Tipo I prolongada tuvieron números substanciales de células beta, así como apoptosis de células beta e infiltración de linfocitos T24. De esta manera, células beta existentes son un blanco potencial para terapia de genes regenerativa con NeuroDl, solo o en combinación con otros factores de transcripción. Sin embargo, cualquier estrategia para regenerar isletas tendrá que también tomar en cuenta destrucción potencial de las nuevas isletas por apoptosis, inflamación o autoinmunidad. Es posible combinar genes regenerativos con genes o drogas que inhiben apoptosis25"28 y/o la respuesta autoinmune. Con respeto a este último, evidencia reciente sugiere que tacrolimus y sirolimus pueden tener efectos tóxicos directos en células beta12. El régimen inmunosupresor óptimo se establece con base en las necesidades del paciente y respuesta inmune (de haber) . Finalmente, hay diferencias importantes entre la biología de las isletas de roedores y de humanos2, de manera tal que estos hallazgos requieren ser confirmados en animales de orden superior antes de que puedan contemplarse pruebas en humanos .

Se contempla que cualquier modalidad discutida en esta especificación puede ser implementada con respecto a cualquier método, equipo, reactivo o composición de la invención y vice versa. Además, composiciones de la invención pueden utilizarse para lograr los métodos de la invención .

Se entenderá que modalidades particulares aquí descritas se muestran a manera de ilustración y no como limitaciones de la invención. Las características principales de esta invención pueden ser empleadas en diversas modalidades sin apartarse del alcance de la invención. Aquellos con destreza en la técnica reconocerán, o serán capaces de evaluar, utilizando no más que experimentación rutinaria, numerosos equivalentes a los procedimientos específicos aquí descritos. Estos equivalentes se consideran dentro del alcance de esta invención y se cubren por las reivindicaciones .

Todas las publicaciones y solicitudes de patentes mencionadas en la especificación, son indicativas del nivel de aquellos con destreza en la especialidad a la cual pertenece esta invención. Todas las publicaciones y solicitudes de patentes aquí se incorporan por referencia en la misma proporción como si cada publicación o solicitud de patente individual se indicara en forma específica e individual. incorporada por referencia.

El uso de la palabra "un" o "una" cuando se utiliza en conjunto con el término "comprende" en las reivindicaciones y/o la especificación, puede significar "uno/a" , pero también es consistente con el significado de "uno o más", "al menos uno", y "uno o más de uno". El uso del término "o" en las reivindicaciones, se utiliza para significar "y/o" a menos que se indique explícitamente que se refiere a alternativas solamente o las alternativas son mutuamente excluyentes, aunque la descripción soporta una definición que se refiere a solo alternativas y "y/o" . A través de esta solicitud, el término "aproximadamente" se emplea para indicar que un valor incluye la variación inherente de error para el dispositivo, el método que se emplea para determinar el valor, o la variación que existe entre los sujetos de estudio.

Como se emplea en esta especificación y reivindicaciones, las palabras "comprende" (y cualquier forma de comprende, tal como "comprender" y "que comprende"), "tener" (y cualquier forma de tener, tal como "tiene" y "que tiene"), "incluyendo" (y cualquier forma de incluyendo, tal como "incluye" y "que incluye") o "que contiene" (y cualquier forma de contiene, tal como "que contiene" y "contener") son inclusive o de . extremo abierto y no excluyen elementos o etapas de método adicionales no descritos .

La expresión "o sus combinaciones" como se emplea aquí, se refieren a todas las permutaciones y combinaciones de los ítems citados precedentes al término. Por ejemplo, "A, B, C, o sus combinaciones" se pretende que incluya al menos uno de: A, B, C, AB, AC, BC, o ABC, y si el orden es importante en un contexto particular, también BA, CA, CB, CBA, BCA, ACB, BAC , o CAB. Continuando con este ejemplo, se incluyen expresamente combinaciones que contienen repeticiones de uno o más ítems o términos, tales como BB, AAA, MB, BBC, AAABCCCC, CBBAAA, CABABB, y así en adelante. La persona con destreza en la especialidad comprenderá que típicamente no hay límite en la cantidad de ítems o términos en cualquier combinación, a menos que de otra forma sea aparente del contexto.

Todas las composiciones y/o métodos descritos y reivindicados aquí, pueden elaborarse y ejecutarse sin indebida experimentación a la luz de la presente descripción. Mientras que las composiciones y métodos de esta invención se han descrito en términos de modalidades preferidas, será aparente para aquellos con destreza en la técnica que pueden aplicarse variaciones a las composiciones y/o métodos y en las etapas o en la secuencia de etapas del método aquí descrito, sin apartarse del concepto, espíritu y alcance de la invención. Todos estos sustitutos similares y modificaciones aparentes para aquellos con destreza en la técnica, se consideran dentro del espíritu, alcance y concepto de la invención como se define por las reivindicaciones anexas .

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Claims

REIVINDICACIONES

1. Una composición para destrucción de micro burbujas dirigida por ultrasonido en el páncreas, caracterizada porgue' comprende: un complejo de micro burbujas ácido nucleico-liposoma pre-ensamblado en donde el complejo de ácido nucleico liposoma pre-ensamblado comprende un gen NeuroD bajo el control de un promotor de insulina que comprende uno o más genes reguladores de respuesta a insulina enlazados operativamente a una región promotora de insulina que comprende: un fragmento genómico del promotor de insulina que comprende una región sin traducción 5', exónl, intrónl y exón2 del gen de insulina, en donde la ruptura de las micro burbujas en el páncreas en un sitio objetivo suministra el ácido nucleico a las células de páncreas en el sitio de la ruptura de ultrasonido, en donde las células que incorporan el ácido nucleico expresan insulina en respuesta a altos niveles de glucosa en la sangre.

2. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque además comprende uno o más genes reguladores de respuesta a insulina enlazados operativamente con una región promotora de insulina regulable, que comprende 50 bases contiguas de región corriente arriba del sitio de inicio de insulina, corriente arriba de un gen NeuroD.

3. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque además comprende uno o más genes seleccionados de uno o más genes reguladores de respuesta a insulina enlazados operativamente a una región promotora de insulina seleccionada de ngn3, GLPl, PDXl, Mafa, betacelulina, Nkx2.2, Nkx6.1, PAX4, Isll, Ciclina D2 (y otros miembros de la familia ciclina) , CDK4 (y otros miembros de la familia quinasa dependiente de ciclina) , y siRNAs contra inhibidores de quinasa dependiente de ciclina, tales como pl6 y otros miembros de la familia INK4 o p27 y otros miembros de la familia CIP/KIP) .

4. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque además comprende un agente que es co-administrado con la composición, en donde el agente se elige de un agente anti-apoptótico, un agente anti-inflamatorio, un inhibidor J K, un GLP-1, un tacrolimus, un sirolimus, una anakinra, una Dervin poliamida o combinaciones de los mismos .

5. Una composición para regenerar células beta pancreáticas, utilizando destrucción de micro burbujas dirigida por ultrasonido en el páncreas, caracterizada porque comprende: micro burbujas que comprenden NeuroD, en donde las micro burbujas comprenden lípidos que liberan NeuroD por ruptura de ultrasonido en el páncreas .

6. La composición de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque NeuroD es un Neuro D recombinante .

7. La composición de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque el NeuroD comprendes un gen NeuroD bajo el control de un promotor CUBI , RIP2.1, RIP3.1 o HIP3.1, y NeuroD se expresa en células que se han dirigido para expresión por la destrucción de micro burbujas dirigida por ultrasonido .

8. Método para regenerar células que responden a insulina in vivo y in situ en un paciente diabético, caracterizado porque comprende la etapa de: suministrar una cantidad efectiva de un Neuro D al páncreas, en donde las células en el páncreas provocan que la célula secrete insulina en respuesta a altos contenidos de glucosa en la sangre.

9. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque la cantidad efectiva del NeuroD en las células pancreáticas comprende suministrar un segmento de ácido nucleico exógeno que expresa un gen NeuroD.

10. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el Neuro D se suministra al páncreas por destrucción de micro burbujas dirigida por ultrasonido.

11. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque la cantidad efectiva de NeuroD en las células pancreáticas comprende suministrar un segmento de ácido nucleico exógeno que expresa un gen NeuroD bajo el control de un promotor CUBl , RIP2.1, RIP3.1 o HIP3.1.

12. Un método para producir una célula objetivo que responde a insulina, caracterizado porque comprende: hacer un segmento de ácido nucleico que comprende un gen NeuroD bajo el control de un promotor de respuesta a insulina seleccionado de promotor CUBl , RIP2.1, RIP3.1 o HIP3.1; cargar el segmento de ácido nucleico en una micro burbuja; inyectar a un paciente con la micro burbuja; suministrar el segmento de ácido nucleico en una célula pancreática; y mantener la célula objetivo bajo condiciones efectivas para expresar el gen regulatorio de respuesta a insulina; en donde la expresión del NeuroD en la célula objetivo provoca que la célula responda a alto contenido de glucosa en la sangre.

13. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque además comprende uno o más» genes seleccionados de PDX1, Nkx2.2, Nkx 6.1, PAX4 , MafA, ngn3 , GLP1, Ciclina D2, CDK4 y sus combinaciones bajo el control del promotor.

14. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque además comprende un agente que es co-administrado con la composición, en donde el agente se elige de un agente anti-apoptótico, un agente antiinflamatorio, un inhibidor JNK, un GLP-1, un tacrolimus, un sirolimus, una anakinra, una Dervin poliamida o sus combinaciones .

15. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque las micro burbujas comprenden liposomas complejo de ácido nucleico-liposoma pre-ensa blado .

16. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque las micro burbujas comprenden liposomas complejo de ácido nucleico-liposoma pre-ensamblado que comprenden 1 , 2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina y 1 , 2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfatidiletanolamina glicerol en mezcla con un plásmido.

17. Un método para restaurar la respuesta a insulina, caracterizado porque comprende las etapas de: obtener un segmento de ácido nucleico aislado que comprende uno o más genes reguladores de respuesta a insulina enlazados operativamente con una región promotora de alta expresión de insulina que comprende un fragmento genómico del promotor de insulina que comprende una región sin traducción 5', exónl, intrónl y exón2 del gen de insulina; transferir el segmento de ácido nucleico en una célula objetivo; y mantener la célula objetivo bajo condiciones efectivas para expresar el gen regulador de respuesta a insulina; en donde la expresión del gen regulador de respuesta a insulina en la célula objetivo, provoca que la célula responda a alto contenido de glucosa en la sangre.

18. El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque la célula de respuesta a insulina está en un animal .

19. El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque uno o más genes reguladores de respuesta a insulina enlazados operativamente con una región promotora de insulina están en un vector plásmido o viral.

20. El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque uno o más genes reguladores de respuesta a insulina enlazados operativamente a una región promotora a insulina se eligen de NeuroD, ngn3 , GLPl, PDX1, Mafa, betacelulina, Nkx2.2, Nkx6.1, PAX4, Isll, Ciclina D2 (y otros miembros de la familia ciclina) , CDK4 (y otros miembros de la familia quinasa dependiente de ciclina) , y siRNAs contra inhibidores de quinasa dependiente de ciclina, tales como pl6 y otros miembros de la Familia I 4 o p27 y otros miembros de la familia CIP/KIP) .

21. Un método para restaurar respuesta a insulina, caracterizado porque comprende las etapas de: obtener un segmento de ácido nucleico aislado que comprende uno o más genes reguladores de respuesta a insulina enlazados operativamente a una región promotora de insulina que comprende: un fragmento genómico del promotor de insulina que comprende una región sin traducción 5', exónl , intrónl y exón2 del gen de insulina; transferir el segmento de ácido nucleico en una célula pancreática; y mantener la célula objetivo bajo condiciones efectivas para expresar el gen regulador de respuesta a insulina; en donde la expresión del gen regulador de respuesta a insulina en la célula objetivo provoca que la célula responda a alto contenido de glucosa en la sangre.

22. El método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porqué la región promotora a insulina comprende 100 a 500 bases contiguas de SEQ ID NO. : 1 en la región corriente arriba del sitio de inicio de transcripción.

23. El método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque la región promotora de insulina comprende toda la región corriente arriba del sitio de inicio de transcripción en SEQ ID NO.: 1.

24. El método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque la región promotora de insulina comprende toda la región corriente arriba del sitio de inicio de transcripción en SEQ ID NO.: 2.

25. Un ácido nucleico aislado que comprende una región promotora de insulina que comprende: un fragmento genómico del promotor de insulina, que comprende una región sin traducción 5', exónl, . intrónl y exón2 del gene de insulina corriente arriba de uno o más genes de respuesta a insulina.

26. Una composición para destrucción de micro burbujas dirigida por ultrasonido en el páncreas, que comprende: un complejo de ácido nucleico-liposoma pre- ensamblado, en contacto con una micro burbuja, en donde el complejo de ácido nucleico-liposoma pre-ensamblado comprende uno o más genes reguladores de respuesta a insulina enlazados a una región promotora de insulina regulable, de alta expresión, que comprende: un fragmento genómico del promotor de insulina que comprende una región sin traducción 5 ' , exónl, intrónl y exón2 del gen de insulina, en donde la ruptura de las micro burbujas con ultrasonido en el páncreas en un sitio objetivo, suministra el ácido nucleico en células de páncreas en el sitio de la ruptura con ultrasonido.

27 . La composición de conformidad con la reivindicación 26, caracterizada porque el complejo de ácido nucleico-liposoma pre-ensamblado comprende lípidos catiónicos, lipidos aniónicos o mezclas y combinaciones de los mismos.

28 . La composición de conformidad con la reivindicación 26 , caracterizada porque las micro burbujas se colocan en un vehículo farmacéuticamente aceptable.

29 . La composición de conformidad con la reivindicación 26 , caracterizada porque el ácido nucleico agente activo comprende un gen de insulina.

30. La composición de conformidad con la reivindicación 26 , caracterizada porque el ácido nucleico agente activo comprende un vector de ácido nucleico que comprende un gen hexoquinasa bajo el control del promotor.

31. La composición de conformidad con la reivindicación 26,· caracterizada porque el ácido nucleico agente activo comprende un vector de ácido nucleico que comprende un gen NeuroD bajo el control del promotor.

32. La composición de conformidad con la reivindicación 26, caracterizada porque los liposomas de complejo de ácido nucleico-liposoma pre-ensamblado comprenden 1 , 2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina y 1, 2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfatidiletanolamina glicerol en mezcla con un plásmido.

33. La composición de conformidad con la reivindicación 26, caracterizada porque además comprende un revestimiento.

34. La composición de conformidad con la reivindicación 26, caracterizada porque además comprende uno o más genes reguladores de respuesta a insulina enlazados operativamente con una región promotora de insulina, se eligen de NeuroD, ngn3 , GLPl, PDXl, Mafa, betacelulina, Nkx2.2, Nkx6.1, PA 4 , Isll, Ciclina D2 (y otros miembros de la familia ciclina) , CD 4 (y otros miembros de la familia quinasa dependiente de ciclina) , y siRNAs contra inhibidores de quinasa dependiente de ciclina, tales como pl6 y otros miembros de la familia INK4 o p27 y otros miembros de la familia CIP/KIP) .

35. Un vector que comprende un gen hexoquinasa bajo el control de un promotor que comprende uno o más genes reguladores de respuesta a insulina, enlazados operativamente con una región promotora de insulina que comprende: un fragmento genómico del promotor de insulina comprende una región sin traducción 5', exónl , intrónl y exón2 del gen de insulina .

36. El vector de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque el gen hexoquinasa comprende un , vector de ácido nucleico que comprende un gen NeuroD bajo el control del promotor.

37. El vector de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque el gen hexoquinasa comprende un vector ácido nucleico que comprende un gen GLP-l(7-37) bajo el control del promotor.

38. El vector de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque el gen hexoquinasa comprende un vector de ácido nucleico que comprende un gen ciclina D2 bajo el control del promotor.

39. El vector de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque los liposomas de complejo de ácido nucleico-liposoma pre-ensamblado comprenden 1 , 2-dipalmitoil- sn-glicero-3-fosfatidilcolina y 1 , 2-dipalmitoil-sn-glicero-3- fosfatidiletanolamina glicerol se mezcla con un plásmi'do.

40. El vector de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque además comprende uno o más genes reguladores de respuesta a insulina enlazados operativamente con la región promotora seleccionada de NeuroD, ngn3 , GLPl, PDX1, Mafa, betacelulina, Nkx2.2, Nkx6.1, PAX4, Isll, Ciclina D2 (y otros miembros de la familia ciclina) , CDK4 (y otros miembros de la familia quinasa dependiente de ciclina) , y siRNAs contra inhibidores de quinasa dependiente de ciclina, tales como pl6 y otros miembros de la familia I K4 o p27 y otros miembros de la familia CIP/KIP) .

41. Una célula que se hace que responda a insulina por un método que comprende: inyectar en una célula un complejo de micro burbujas de ácido nucleico-liposoma pre-ensamblado, en donde el complejo de ácido nucleico-liposoma pre-ensamblado comprende un gen NeuroD bajo el control de un promotor de insulina que comprende uno o más genes reguladores de respuesta a insulina, enlazados operativamente con una región promotora de insulina que comprende: un fragmento genómico del promotor de insulina que comprende una región sin traducción 5', exónl, intrónl y exón2 del gen de insulina, en donde la ruptura de las micro burbujas en el páncreas en un sitio objetivo, suministra el ácido nucleico en células de páncreas en el sitio de ruptura de ultrasonido, en donde células que incorporan el ácido nucleico expresan insulina en respuesta a altos niveles de glucosa en la sangre.

42. La célula de conformidad con la reivindicación 41, caracterizada porque además comprende uno o más genes reguladores de respuesta a insulina enlazados operativamente con una región promotora de insulina regulable que comprende 50 bases contiguas de la región corriente arriba del sitio de inicio de insulina corriente arriba de un gen NeuroD.

43. La célula de conformidad con la reivindicación 41, caracterizada porque además comprende uno o más genes seleccionados de uno o más genes reguladores de respuesta a insulina enlazados operativamente a una región promotora de insulina seleccionada de ngn3 , GLPl, PDX1, Mafa, betacelulina, Nkx2.2, Nkx6.1, PAX4, Isll, Ciclina D2 (y otros miembros de la familia ciclina) , CDK4 (y otros miembros de la familia quinasa dependiente de ciclina) , y siRNAs contra inhibidores de quinasa dependiente de ciclina, tales como pl6 y otros miembros de la familia INK4 o p27 y otros miembros de la familia CIP/KIP) .