CN107002031B - 选择分化细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

一种用于在诱导多能干细胞分化后从包含未分化细胞的细胞群中提取分化细胞的方法。一种用于从细胞群中提取分化细胞的方法，包括以下步骤：(1)将包含与在多能干细胞中特异性表达的miRNA的靶序列可操作地连接的标记基因的mRNA引入到细胞群中的步骤；和(2)提取标记基因已经被翻译的细胞的步骤。

Description

选择分化细胞的方法
技术领域
本发明涉及使用在多能干细胞中特异性表达的miRNA作为指示剂提取分化细胞的方法。
背景技术
细胞疗法已经受到关注，在细胞疗法中，多能干细胞如iPS细胞或ES细胞被诱导以分化成期望的细胞，然后将分化细胞施用到体内。然而，即使在分化诱导完成后，未分化细胞仍可能残留，因此已经有人指出，如果施用包含这种未分化细胞的细胞群，则会导致癌变(非专利文献1)。
因此，已经研究了使用在多能干细胞中高度表达的细胞表面标记物作为指示剂来去除这种残留的未分化细胞的方法。然而，在多能干细胞中高度表达的细胞表面标记物在分化的细胞中不表达的情况并不总是发生。即使在多能干细胞中高度表达的细胞表面标记物为阴性的细胞被提取，也存在未分化细胞不能被完全去除的情况。此外，这种细胞表面标记物的类型有限，并且难以找到更特异的标记物。
引用文献列表
非专利文献
非专利文献1：Miura K，等人，Nat Biotechnol.2009 27：743-745
发明内容
发明要解决的问题
期望开发出一种在诱导多能干细胞分化后从包含未分化细胞的细胞群中提取分化细胞的方法。
用于解决问题的方案
本发明人发现，利用在多能干细胞中特异性表达的miRNA，并且通过使用mRNA可以仅提取分化细胞，其中标记基因的表达被 miRNA的表达抑制，从而完成本发明。
具体地，本发明具有以下特征：
[1]一种用于在诱导多能干细胞分化后从细胞群中提取分化细胞的方法，包括以下步骤：(1)将包含与在多能干细胞中特异性表达的miRNA的靶序列可操作地连接的标记基因的mRNA引入到细胞群中的步骤；和(2)提取标记基因已经被翻译的细胞的步骤。
[2]根据[1]所述的方法，其中所述多能干细胞是人类多能干细胞。
[3]根据[2]所述的方法，其中在所述人类多能干细胞中特异性表达的所述miRNA是hsa-miR-302b、hsa-miR-302a或hsa-miR-367。
[4]根据[1]～[3]中任一项所述的方法，其中使用流式细胞仪进行所述提取步骤。
[5]一种分化细胞提取试剂盒，其包括含有与在多能干细胞中特异性表达的miRNA的靶序列可操作地连接的标记基因的mRNA。
[6]根据[5]所述的试剂盒，其中所述多能干细胞是人类多能干细胞。
[7]根据[6]所述的试剂盒，其中在所述人类多能干细胞中特异性表达的所述miRNA是hsa-miR-302b、hsa-miR-302a或hsa-miR-367。
发明的有益效果
根据本发明，通过利用具有与对多能干细胞特异的miRNA可操作地连接的标记基因的mRNA，可以选择性提取分化细胞。由于根据本发明的方法可以通过选择标记物已经转变为阳性的细胞来实现，所以本方法的特别有利之处在于其不受mRNA的引入效率的影响。另外，本发明的方法可以通过将mRNA引入细胞中来进行，该mRNA在约1天的半寿期(half-life)内分解，然后迅速从细胞中排出。因此，本方法不会引起问题，如由于细胞中的病毒感染或DNA的残留而对基因组造成的损害。此外，本方法的优点还在于，其可以通过使用细胞仪的简单检测方法或通过引入抗药性基因的药物选择来选择分化细胞。
附图说明
图1示出通过将EGFP、1×T302b-EGFP和EGFP-4×T302b引入iPS 细胞中，然后在以不同浓度添加了mirVana miRNA抑制剂的培养基中培养所述iPS细胞，然后测量所培养的iPS细胞中EGFP的荧光强度而获得的结果。在该图中，误差条表示平均值±标准偏差(n＝3)。
图2示出通过测量iPS细胞中EGFP的荧光强度相对mCherry的荧光强度而获得的结果，所述iPS细胞中已经共同引入了mCherry和 EGFP或mCherry和1×T302b-EGFP，并且所述iPS细胞已经培养在已经以不同浓度添加了mirVana miRNA抑制剂的培养基中。在该图中，误差条表示平均值±标准偏差(n＝3)。
图3示出通过流式细胞术测量在视黄酸培养基中培养并且未引入或已引入1×T302b-EGFP的iPS细胞中EGFP的荧光强度的结果(上部视图)，通过流式细胞术测量iPS细胞中或在视黄酸培养基中培养的 iPS细胞中的Tra-1-60的表达水平的结果(中间视图)以及通过流式细胞术测量iPS细胞中或在视黄酸培养基中培养的iPS细胞中的 SSEA5的表达水平的结果(下部视图)。该图中所示的数字表示所描述部分中相对于全部细胞的含量比。
图4示出在视黄酸培养基中培养后引入了1×T302b-EGFP的iPS细胞中的EGFP阳性细胞(+)或EGFP阴性细胞(-)中OCT3/4的表达水平(左视图)，在视黄酸培养基中培养的iPS细胞中Tra-1-60阴性细胞(-)或Tra-1-60阳性细胞(+)中OCT3/4的表达水平(中间视图) 以及在视黄酸培养基中培养的iPS细胞中的SSEA5阴性细胞(-)或 SSEA5阳性细胞(+)中OCT3/4的表达水平(右视图)。
图5示出通过在视黄酸培养基中培养iPS细胞后将1×T302b-EGFP 引入所培养的细胞中，然后将所得到的细胞中的EGFP阳性细胞或 Tra-1-60阴性细胞在mTeSR1中(上图)或视黄酸培养基(下图)中培养5天而获得的细胞的碱性磷酸酶染色图像。
图6A示出通过流式细胞术测量在视黄酸培养基中培养并且引入了1×T302b-EGFP的iPS细胞中EGFP的表达水平而获得的结果。图6B 示出通过在视黄酸培养基中培养iPS细胞，然后将1×T302b-EGFP引入所培养的细胞中，然后将所获得的细胞中的上(top)10％EGFP阳性细胞或上20％EGFP阳性的细胞在mTeSR1(上图)或视黄酸培养基(下图)中培养5天而获得的细胞的碱性磷酸酶染色图像。
图7a是示出通过将Ctrl-hmAG1、302a-5p-hmAG1或 367-3p-hmAG1共同引入无饲养层的人类iPS细胞系(201B7、1231A3 和1383D7)和HeLa细胞后使用BD FACS aria-II分析hmAG1的翻译而获得的结果的描点图。图7b是示出302a-5p响应性(responsive)mRNA 和367-3p响应性mRNA的翻译在人类iPS细胞中被特异性抑制并且在 Hela细胞(右端条)恒定的视图。图7c是示出在将302a-5p响应性 mRNA和添加量已经改变的302a-5p抑制剂共同引入Ff-201B7后， hmAG1的荧光强度与tagBFP的荧光强度的比率的图(左视图)和来自0.003nM抑制剂浓度的青色、橙色、绿色、蓝色和红色的描点图(从图的下侧到上侧)(右视图)。图7d是示出在将302a-5p响应性mRNA 和添加量已改变的302a-5p模拟物共同引入Hela细胞后，hmAG1的荧光强度与tagBFP的荧光强度的比率的图(左视图)和来自0.003nM模拟物浓度的橙色、青色、紫色、蓝色和红色的描点图(从图的上侧到下侧)(右视图)。误差条表示试验重复三次时的标准误差。
图8是示出通过使用302a-5p响应性mRNA和367-3p响应性mRNA 追踪Ff-人类iPS细胞分化成中脑多巴胺能细胞而得到的结果的视图。图8a从左依次示出引入了302a-5p响应性mRNA的Ff-201B7细胞在第 0天，第5天，第7天和第14天时的代表性描点图。在第0天，蓝色描点图(该图表中的下部点集)示出由302a-5p响应性mRNA导致的高翻译抑制，并且发现随着分化进行，点集的重叠增加，因此翻译抑制作用降低。图8b示出在Ff人类iPS细胞分化期间302a-5p响应性细胞或367-3p响应性细胞的分布(蓝色区域)和302a-5p-非响应性细胞或367-3p-非响应性细胞的分布(红色区域)。图8c示出在分化过程中发生的响应于302a-5p响应性mRNA的细胞百分比随时间推移的变化 (左视图)和分化过程中发生的响应于367-3p响应性mRNA的细胞百分比随时间推移的变化(右视图)。误差条表示试验重复三次时的标准误差。
图9是示出从第0天至第21天人类iPS细胞分化成mDA细胞(中脑多巴胺神经元细胞)、HeLa细胞和肝细胞期间个体细胞中 hsa-miR-302a-5p的表达水平(图9a)和hsa-miR-367-3的表达水平(图9b)之间的比率的图，其中该比率已经用RNU6B归一化，然后以log10标度示出。HeLa细胞和肝细胞二者都被用作阴性对照，其中几乎没有miRNA被表达，并且该图示出随着从人类iPS细胞已向mDA分化的进展，hsa-miR-302a-5p和hsa-miR-367-3二者的表达水平已下调。误差条表示试验重复三次时的标准误差。
图10是示出通过将Ff-人类iPS细胞添加到完全分化的mDA细胞系而获得的细胞能够以高灵敏度检测到的视图。将至少100个 Ff-201B7人类iPS细胞添加到24孔板中的mDA细胞中。总细胞量被设定为200000。将tagBFP和hmAG1 mRNA或302a-5p-hmAG1 mRNA引入到这些细胞中。当302a-5p响应性mRNA只被引入到mDA细胞中时，建立302pos(miR-302a-5p阳性)闸门(重复1)和P5闸门(重复2)。结果，确认没有miR-302a-5p阳性细胞(左侧图中的描点图)。在重复 1和重复2二者的情况下，由302a-5p响应性mRNA鉴定的人类iPS细胞与mDA细胞的比率的测量值非常接近估计值。
图11a示出通过添加嘌呤霉素去除残留的iPS细胞的方案。图11b示出单个培养系统的实验时间轴(上视图)和细胞毒性测定的结果 (下视图，图)。左侧两个图示出通过将PuroR mRNA(Ctrl-PuroR) 或302a-5p响应性puroR mRNA(302-PuroR)引入Ff-201B7人类iPS细胞后通过添加嘌呤霉素进行细胞毒性测定而获得的结果，右侧两个图示出组通过将PuroR mRNA(Ctrl-PuroR)或302a-5p响应性puroR mRNA(302-PuroR)引入到从Ff-201B7人类iPS细胞诱导的mDA细胞中后通过添加嘌呤霉素进行细胞毒性测定而获得的结果。图11c示出：通过将PuroR mRNA(Ctrl-PuroR)或302a-5p响应性puroR mRNA 引入到人类iPS细胞(左上图)，人类iPS细胞与mDA细胞的混合细胞 (中上图)和mDA细胞(右上图)，然后向这些细胞中添加嘌呤霉素，然后用Alexa-488缀合的抗人类TRA-1-60抗体(BD laboratories)将这些细胞染色，然后用BD Accuri测量细胞而获得的结果；以及示出在不同条件下TRA-1-60阳性细胞的绝对数目的柱状图(下图)。
具体实施方式
在下文中，将通过以下实施例详细描述本发明。然而，这些实施例不旨在限制本发明的范围。
根据一个实施例，本发明涉及一种用于在诱导多能干细胞分化后从可能存在未分化细胞的细胞群中提取分化细胞的方法，其中该方法包括以下步骤：(1)将包含与在多能干细胞中特异性表达的 miRNA的靶序列可操作地连接的标记基因的mRNA引入到细胞群中的步骤；和(2)提取标记基因已经被翻译的细胞的步骤。
在本发明中，多能干细胞是指具有多能性并且还具有增殖能力的干细胞，细胞能够通过这种多能性分化为存在于活体内的所有细胞。这种多能干细胞的例子包括胚胎干(ES)细胞(J.A.Thomson 等人(1998)，Science 282：1145-1147；J.A.Thomson等人(1995)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，92：7844-7848；J.A.Thomson等人(1996)， Biol.Reprod.，55：254-259；J.A.Thomson和V.S.Marshall(1998)， Curr.Top.Dev.Biol.，38：133-165)、从通过核移植(ntES)获得的克隆胚胎衍生出的胚胎干细胞(T.Wakayama等人(2001)，Science，292：740-743；S.Wakayama等人(2005)，Biol.Reprod.，72：932-936； J.Byrne等人(2007)，Nature，450：497-502)、精原干细胞(“GS 细胞”)(M.Kanatsu-Shinohara等人(2003)Biol.Reprod.，69： 612-616；K.Shinohara等人(2004)，Cell，119：1001-1012)、胚胎生殖细胞(“EG细胞”)(Y.Matsui等人(1992)，Cell，70：841-847； J.L.Resnick等人(1992)，Nature，359：550-551)、诱导的多能性干 (induced pluripotent stem，iPS)细胞(K.Takahashi和S.Yamanaka (2006)Cell，126：663-676；K.Takahashi等人(2007)，Cell，131： 861-872；J.Yu等人(2007)，Science，318：1917-1920；Nakagawa， M.等人，Nat.Biotechnol.26：101-106(2008)；WO2007/069666)、培养的成纤维细胞或骨髓干细胞衍生的多能细胞(Muse细胞) (WO2011/007900)。更优选地，该多能干细胞是人类多能干细胞。
在本发明中，分化的诱导不仅意味着将细胞分化成特异性组织细胞或其祖细胞，而且还意味着将细胞分化成包含诸如内胚层细胞、中胚层细胞和外胚层细胞的许多类型细胞的细胞群。另外，作为本发明的目标的组织的例子包括但不限于皮肤、血管、角膜、肾、心脏、肝脏、脐带、肠、神经、肺、胎盘、胰腺、脑、软骨、四肢和视网膜。对于该分化诱导方法，可以应用本领域技术人员公知的方法，并且该方法没有特别限制。关于神经干细胞的分化诱导，可参考日本特开2002-291469号公报，关于胰脏干细胞的分化诱导，可参照日本特开2004-121165号公报，关于造血细胞的分化诱导，可参考 PCT国际申请2003-505006的日译文等。除此之外，在PCT国际申请 2003-523766号的日译文中描述了涉及形成类胚体的分化诱导方法的例子。
在本说明书中，多能干细胞分化诱导后的细胞群是指在对上述多能干细胞进行了诱导分化方法后获得的细胞群。可能存在诱导分化后的细胞群包括未分化细胞的情况。即使不知道该细胞群是否包括未分化细胞，也可以应用本发明的方法。优选地，多能干细胞分化诱导后的细胞群是在诱导多能干细胞分化后其中也存在未分化细胞的细胞群。
在本发明中，miRNA也称为“微RNA”，并且是指存在于细胞内的长度为18～25个左右的核苷酸的RNA。miRNA是指通过用Dicer 裂解pre-miRNA产生的双链RNA的任一条链，pre-miRNA是通过用称为Drosha的核内酶部分地裂解从DNA转录成为单链RNA的pri-mRNA而产生的。miRNA中的核苷酸的数目例如为18～25个，优选为20～ 25个，更优选为21～23个。可以利用存储有约1000个miRNA的信息的数据库(例如，miRBase，http：//microrna.sanger.ac.uk/sequences/ index.shtml)。本领域技术人员可以从该数据库取得任何给定的 miRNA信息，并且可以容易地提取在多能干细胞中特异性表达的 miRNA。例如，通过应用本领域技术人员可获得的手段，如miRNA 微阵列或实时PCR，可以在多能干细胞和多能干细胞诱导分化后的细胞之间确认miRNA表达的差异。由此，能够容易地指定在多能干细胞中的表达水平高于在分化诱导后的细胞中的表达水平的miRNA为在多能干细胞中特异性表达的miRNA。应当注意，在多能干细胞中表达的miRNA是指处于如下状态miRNA，在该状态中，用Dicer裂解的上述双链RNA的任一条链与多个预定蛋白相互作用，以在多能干细胞中形成RNA诱导沉默复合物(RNA-induced silencing complex， RISC)。
在本发明中，在多能干细胞中特异性表达的miRNA没有特别限制，只要它是根据出版物等已知的在多能干细胞中特异性表达的 miRNA即可。这种miRNA的例子包括从hsa-mir-302a、hsa-mir-302b、 hsa-mir-302c、hsa-mir-302d、hsa-mir-367、hsa-5201、hsa-mir-92b、 hsa-mir-106a、hsa-mir-18b、hsa-mir-20b、hsa-mir-19b-2、hsa-mir-92a-2、hsa-mir-363、hsa-mir-20a、hsa-17、hsa-mir-18a、hsa-mir-19a、 hsa-mir-19b-1、hsa-mir-373、hsa-mir-330、hsa-mir-520c、hsa-mir-182、 hsa-183、hsa-mir-96、hsa-mir-92a-1、hsa-mir-92a-2、hsa-mir-141、 hsa-mir-200c、hsa-mir-27a、hsa-mir-7-1、hsa-mir-7-2、hsa-mir-7-3、 hsa-mir-374a、hsa-mir-106b、hsa-mir-93、hsa-mir-25、hsa-mir-584、hsa-374b、hsa-mir-21、hsa-mir-212、hsa-mir-371a、hsa-mir-371b、 hsa-mir-372、hsa-mir-200b、hsa-mir-200a和hsa-mir-429中选择的任一条链。除了这些例子以外，还可以使用从在Tobias S.Greve，等人， Annu.Rev.Cell Dev.Biol.2013.29：213-239中描述的miRNA中适当地选择的miRNA。miRNA的优选例子包括hsa-mir-302a、hsa-mir-302b 和hsa-mir-367，更优选的例子包括hsa-miR-302b-3p、hsa-mir-302a-5p 和hsa-mir-367-3p。
在本发明中，在多能干细胞中特异性表达的miRNA的靶序列是指能够与所述miRNA特异性结合的序列。miRNA靶序列优选是与例如在多能干细胞中特异性表达的miRNA互补的序列。或者，只要 miRNA靶序列可被miRNA识别，它可具有与完全互补序列的错配。与完全互补于miRNA的序列的错配通常可以是可被期望细胞中的 miRNA识别的错配。并且对于活体中的细胞的原始功能，可能存在约40％至50％的错配。这种错配没有特别限制，例如它可以是1个核苷酸、2个核苷酸、3个核苷酸、4个核苷酸、5个核苷酸、6个核苷酸、 7个核苷酸、8个核苷酸、9个核苷酸、10个核苷酸或整个识别序列的 1％、5％、10％、20％、30％或40％的错配。另外，特别地，靶序列可以包含大量的与包含在细胞中的mRNA的miRNA靶序列的错配，特别是在种子(seed)区域以外的部分中，即，与miRNA的3'末端侧的约 16个核苷酸相对应的靶序列中的5'末端侧的区域中。该种子区域可以不包括这样的错配，或者可以包括1个核苷酸、2个核苷酸或3个核苷酸的错配。
标记基因是编码任何给定标记蛋白的RNA序列，其在细胞中被翻译，用作标记物，并且使得能够提取分化的细胞，并且该标记基因也可以被称为对应于标记蛋白的序列。在细胞中被翻译并且能够用作标记物的蛋白的例子可以包括但不限于荧光蛋白、光蛋白、有色蛋白、能够被可视化并且能够通过支持荧光、发光或显色而被量化的蛋白、膜定位的蛋白和抗药性蛋白。
荧光蛋白的例子包括：蓝色荧光蛋白，如Sirius或EBFP；青色荧光蛋白，如mTurquoise、TagCFP、AmCyan、mTFP1、MidorishiCyan 或CFP；绿色荧光蛋白，如TurboGFP、AcGFP、TagGFP、Azami-Green (例如hmAG1)、ZsGreen，EmGFP、EGFP、GFP2或HyPer；黄色荧光蛋白，如TagYFP、EYFP、Venus、YFP、PhiYFP、PhiYFP-m、 TurboYFP、ZsYellow或mBanana；橙色荧光蛋白，如KusabiraOrange (例如hmKO2)或mOrange；红色荧光蛋白，如TurboRFP、DsRed-Express、DsRed2、TagRFP、DsRed-Monomer、AsRed2或 mStrawberry；和近红外荧光蛋白，如TurboFP602、mRFP1、JRed、 KillerRed、mCherry、HcRed、KeimaRed(例如hdKeimaRed)、mRasberry 或mPlum，但荧光蛋白的例子不限于此。
发光蛋白的例子是水母发光蛋白，但例子不限于此。另外，支持荧光，发光或显色的蛋白的例子包括分解荧光、发光或显色前体的酶，如荧光素酶、磷酸酶、过氧化物酶或β内酰胺酶，但是该蛋白的例子不限于此。在本发明中，当使用支持荧光、发光或显色的物质作为标记物时，可以通过使细胞与相应的前体接触或通过将这样的相应前体引入细胞来进行分化细胞的提取。
膜定位蛋白没有特别限制，只要它是不在多能干细胞中内源表达的膜定位蛋白即可。这种膜定位蛋白的例子包括P-gp、MRP1、 MRP2(cMOAT)、MRP3、MRP4、MRP5、MRP6、MDR2和MDR3 蛋白。在本发明中，由于使用从引入的mRNA翻译的膜定位蛋白作为指示剂，所以不在目标分化细胞中内源性表达的膜定位蛋白是更优选的。耐药性蛋白质的例子包括抗生素抗性蛋白，如抗卡那霉素蛋白、抗氨苄青霉素蛋白、抗嘌呤霉素蛋白、抗杀稻瘟菌素蛋白、抗庆大霉素蛋白、抗卡那霉素蛋白、抗四环素蛋白和抗氯霉素蛋白，但例子不限于此。
通过本发明的方法用于引入到细胞群中的mRNA包括与在多能干细胞中特异性表达的miRNA的靶序列可操作地连接的标记基因。在本发明的解释中，这种mRNA也称为“miRNA响应性报告mRNA”。在本发明中，短语“标记基因与miRNA的靶序列可操作地连接”是指至少一个miRNA靶序列包括在编码标记基因的开放阅读框的 5'UTR和3'UTR中(包括起始密码子)，和/或在该开放阅读框中。mRNA 在从5'末端到3'末端的方向上优选包括Cap结构(7-甲基鸟苷5'-磷酸)、编码标记基因的开放阅读框和poly(A)尾，并且还包括在5'UTR 中，在3'UTR中和/或在开放阅读框中的至少一个miRNA靶序列。 miRNA靶序列在mRNA中的位置可以在5'UTR中或在3'UTR中，或者也可以在开放阅读框中(在起始密码子的3'-末端侧)。另外，mRNA 可以包括所有这些位置中的miRNA靶序列。因此，miRNA靶序列的数目可以是1、2、3、4、5、6、7、8或更多。
优选地，一个miRNA靶序列存在于5'UTR中。这是因为它可以实现有效的转移抑制。此时，Cap结构和miRNA靶序列之间的核苷酸数目和核苷酸类型可以自由确定，只要它们不包含作为起始密码子的 AUG并且不构成茎(stem)结构或空间结构即可。例如，可以设计Cap结构和miRNA靶序列，使得Cap结构和miRNA靶序列之间的核苷酸数目可以是0至50个核苷酸，优选10至30个核苷酸。此外，miRNA 靶序列和起始密码子之间的核苷酸数目和核苷酸类型可以自由确定，只要它们不构成茎结构或空间结构即可。可以设计miRNA靶序列和起始密码子，使得miRNA靶序列和起始密码子之间的核苷酸数目为0至50个核苷酸，优选10至30个核苷酸。已经证实，即使四种 miRNA靶序列存在于3'UTR中，也可以实现翻译抑制。
miRNA响应性报告mRNA优选包括修饰的核苷酸，如假尿苷和5- 甲基胞苷，而不是普通的尿苷和胞苷。这是因为细胞毒性降低。在尿苷和胞苷的两种情况下，这种修饰的核苷酸可以独立地或作为 mRNA的整体或一部分被定位。在包括为一部分的情况下，所述核苷酸能够以任何给定的比例随机定位。
在如上所述确定miRNA响应性报告mRNA的序列后，本领域技术人员能够根据任何给定的已知遗传工程方法合成miRNA响应性报告 mRNA。具体地，可以根据体外合成方法，使用包含启动子序列作为模板的模板DNA，获得miRNA响应性报告mRNA。
在本发明的一个实施例中，存在仅使用一种类型的miRNA响应性报告mRNA的情况，或者还存在使用两种或更多种类型，例如三种类型、四种类型、五种类型、六种类型、七种类型或八种类型或更多种miRNA响应性报告mRNA的情况。当使用在多能干细胞中特异性表达的两种或更多种类型的不同miRNA作为指示剂提取分化细胞时，优选使用对应于这两种或更多种类型的miRNA的两种或更多种类型的miRNA响应性报告mRNA。例如，在使用两种或更多种类型的 miRNA响应性报告mRNA的情况下，就miRNA靶序列和标记基因而言，期望miRNA响应性报告mRNA彼此不同。此外，在使用两种或更多种类型的miRNA响应性报告mRNA的情况下，包括在miRNA响应性报告mRNA中的miRNA靶序列的数目、miRNA靶序列距5'-末端的距离以及miRNA响应性报告mRNA的其他结构特征可能在各个 miRNA响应性报告mRNA之间不同。
在本发明的一个实施例中，在将miRNA响应性报告mRNA引入细胞群的步骤(以下称为“引入步骤”)中，通过应用脂质转染法、脂质体法、电穿孔法、磷酸钙共沉淀法、DEAE葡聚糖法、微注射法、基因枪法等，将一种或多种类型的miRNA响应性报告mRNA直接引入包括在细胞群中的细胞中。在引入两种或更多种不同类型的miRNA 响应性报告mRNA的情况下，优选将多个mRNA共同引入细胞群中。这是因为从由此共同引入的两种或更多种mRNA表达的标记蛋白的活性的比率在细胞群中是恒定的。此时，引入的miRNA响应性报告 mRNA的量可以根据要引入mRNA的细胞群的类型、引入的mRNA的类型、引入mRNA的方法和引入试剂的类型而不同。为了实现期望的翻译水平，本领域技术人员可以适当地选择这些条件。
在本发明的一个实施例中，当本发明的miRNA响应性报告mRNA 在诱导多能干细胞分化后被引入包含未分化细胞的细胞群中时，由于某些miRNA在分化细胞中不以RISC的形式存在，所以由miRNA响应性报告mRNA编码的标记基因的翻译水平不被抑制。也就是说，仅在分化的细胞中进行标记基因的翻译。因此，在本发明的一个实施例中，通过提取其中标记基因已被翻译的细胞，可以在诱导多能干细胞分化后，从还包含未分化细胞的细胞群中选择性地只提取分化的细胞。
进行提取其中标记基因已被翻译的细胞的步骤(以下称为“提取步骤”)。在提取步骤中，提取其中标记基因已被翻译并且标记蛋白的表达已被证实的上述细胞作为分化细胞。也就是说，可以通过将其中已经引入包含与miRNA的靶序列可操作地连接的标记基因的mRNA的细胞群与其中未引入包含与miRNA的靶序列可操作地连接的标记基因的这种mRNA的细胞群进行比较，然后从其中引入了包含与miRNA的靶序列可操作地连接的标记基因的mRNA的细胞群中提取其中标记蛋白已被表达的细胞来执行该提取步骤。
具体地，可以通过使用某种检测设备检测来自标记蛋白的信号来进行提取步骤。为了检测来自标记蛋白的信号，可以将信号数字化和量化，或者可以仅检测信号的存在或不存在。检测设备的例子包括流式细胞仪、成像细胞计数器、荧光显微镜、发光显微镜和CCD相机，但是例子不限于此。作为这样的检测设备，本领域技术人员可以根据标记蛋白使用合适的设备。例如，当标记蛋白是荧光蛋白或发光蛋白时，可以使用诸如流式细胞仪、成像细胞计数器、荧光显微镜或CCD照相机等检测设备来确认标记蛋白的表达的存在或不存在和/或量化标记蛋白。当标记蛋白是支持荧光、发光或显色的蛋白时，可以使用诸如发光显微镜、CCD照相机或发光计等检测设备来确认标记蛋白的表达的存在或不存在或量化标记蛋白。当标记蛋白是膜定位蛋白时，可以使用对细胞表面蛋白具有特异性的检测试剂，如抗体，和上述检测设备来确认标记蛋白的表达的存在或不存在和/或量化标记蛋白。此外，还可以应用分离细胞而不进行量化标记蛋白的工艺的方法，例如磁性细胞分离装置(MACS)。当标记蛋白是抗药性蛋白时，可以应用包括通过施用药物来检测标记蛋白的表达，然后分离活细胞的方法。
在应用本发明的方法之前，还可以进行将对照mRNA以及miRNA 响应性报告mRNA共同引入未分化细胞和/或分化细胞，然后确认细胞中miRNA响应性报告mRNA的翻译效率的任选步骤。通过确认和计算翻译效率，可以比较研究是否mRNA已经被引入靶细胞中并且翻译已经被miRNA的表达抑制，或者是否mRNA已经以低水平引入细胞中。通过进行这样的比较研究，可以适当地选择本发明中使用的 mRNA。对照mRNA是指不具有miRNA靶位点并编码与由miRNA响应性报告mRNA编码的标记基因不同的标记基因的mRNA。对照mRNA 表达标记蛋白，而不管miRNA的表达。这是因为，由于对照mRNA 不具有miRNA靶序列，所以即使将其引入细胞中，其翻译也不受 miRNA的表达水平的调节。
本发明还涉及一种分化细胞提取试剂盒，其包括含有与在多能干细胞中特异性表达的前述miRNA的靶序列可操作地连接的标记基因的mRNA。本发明的试剂盒可以进一步包括对照mRNA。另外，本发明的试剂盒还可以包括判别分析装置，例如描述用于提取分化细胞的步骤的纸张或说明书、用于使计算机执行用于提取分化细胞的步骤的程序、程序列表、其中记录有所述程序的计算机可读记录介质(例如，软盘、光盘、CD-ROM、CD-R、CD-RW等)以及用于执行分化细胞的提取的装置或系统(计算机等)。
[实施例]
在下文中，将在以下例子中更详细地描述本发明。然而，这些例子不旨在限制本发明的范围。
[实施例1]
[miR-302b响应性报告mRNA的设计]
修饰EGFP mRNA(SEQ ID NO:1)，EGFP mRNA编码荧光报告基因EGFP并且包括α球蛋白的5'非翻译区(5'UTR)和3'非翻译区 (3'UTR)，并且设计在5'UTR中包含miR-302b的靶序列的1个拷贝的 miR-302b响应性报告mRNA(1×T302b-EGFP)(SEQ ID NO：2)和在3'UTR中包含miR-302b的靶序列的4个拷贝的miR-302b响应性报告 mRNA(EGFP-4×T302b)(SEQ IDNO：3)的每一个。此外，还设计了包含被用作对照的α球蛋白的5'UTR和3'UTR的mCherrymRNA (SEQ ID NO：4)。这些基因序列如下所示。
EGFP-mRNA的基因序列(SEQ ID NO：1)
GGGCGAAUUAAGAGAGAAAAGAAGAGUAAGAAGAAAUAUAAGACACCGGUCGCCACCAUGGGAUCCGUGAGCAAGGGCGAGGAGC UGUUCACCGGGGUGGUGCCCAUCCUGGUCGAGCUGGACGGCGA CGUAAACGGCCACAAGUUCAGCGUGUCCGGCGAGGGCGAGGGC GAUGCCACCUACGGCAAGCUGACCCUGAAGUUCAUCUGCACCA CCGGCAAGCUGCCCGUGCCCUGGCCCACCCUCGUGACCACCCU GACCUACGGCGUGCAGUGCUUCAGCCGCUACCCCGACCACAUG AAGCAGCACGACUUCUUCAAGUCCGCCAUGCCCGAAGGCUACG UCCAGGAGCGCACCAUCUUCUUCAAGGACGACGGCAACUACAA GACCCGCGCCGAGGUGAAGUUCGAGGGCGACACCCUGGUGAAC CGCAUCGAGCUGAAGGGCAUCGACUUCAAGGAGGACGGCAACA UCCUGGGGCACAAGCUGGAGUACAACUACAACAGCCACAACGUCUAUAUCAUGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCAUCAAGGUGAAC UUCAAGAUCCGCCACAACAUCGAGGACGGCAGCGUGCAGCUCG CCGACCACUACCAGCAGAACACCCCCAUCGGCGACGGCCCCGU GCUGCUGCCCGACAACCACUACCUGAGCACCCAGUCCGCCCUG AGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGAUCACAUGGUCCUGCUGGAGUUCGUGACCGCCGCCGGGAUCACUCUCGGCAUGGACGAGCU GUACAAGAGAUCUCAUAUGCAUCUCGAGUGAUAGUCUAGAC CUUCUGCGGGGCUUGCCUUCUGGCCAUGCCCUUCUUCUCUCCCUUGCACCUGUACCUCUUGGUCUUUGAAUAAAGCC UGAGUAGGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
加下划线部分表示5'UTR或3'UTR。
1×T302b-EGFP的基因序列(SEQ ID NO:2)
GGUCAGAUCCGCUAGGAUCctactaaaacatggaagcacttaCACCGGUCGCCACCAUGGGAUCCGUGAGCAAGGGCGAGGAGCUGUUCACCGG GGUGGUGCCCAUCCUGGUCGAGCUGGACGGCGACGUAAACGGC CACAAGUUCAGCGUGUCCGGCGAGGGCGAGGGCGAUGCCACCU ACGGCAAGCUGACCCUGAAGUUCAUCUGCACCACCGGCAAGCU GCCCGUGCCCUGGCCCACCCUCGUGACCACCCUGACCUACGGC GUGCAGUGCUUCAGCCGCUACCCCGACCACAUGAAGCAGCACG ACUUCUUCAAGUCCGCCAUGCCCGAAGGCUACGUCCAGGAGCG CACCAUCUUCUUCAAGGACGACGGCAACUACAAGACCCGCGCC GAGGUGAAGUUCGAGGGCGACACCCUGGUGAACCGCAUCGAGC UGAAGGGCAUCGACUUCAAGGAGGACGGCAACAUCCUGGGGCA CAAGCUGGAGUACAACUACAACAGCCACAACGUCUAUAUCAUG GCCGACAAGCAGAAGAACGGCAUCAAGGUGAACUUCAAGAUCC GCCACAACAUCGAGGACGGCAGCGUGCAGCUCGCCGACCACUA CCAGCAGAACACCCCCAUCGGCGACGGCCCCGUGCUGCUGCCC GACAACCACUACCUGAGCACCCAGUCCGCCCUGAGCAAAGACC CCAACGAGAAGCGCGAUCACAUGGUCCUGCUGGAGUUCGUGAC CGCCGCCGGGAUCACUCUCGGCAUGGACGAGCUGUACAAGAGA UCUCAUAUGCAUCUCGAGUGAUAGUCUAG ACCUUCUGCGGGGCUUGCCUUCUGGCCAUGCCCUUCUUCUCUCCCUUGCACCUGUACCUCUUGGUCUUUGAAUAAAG CCUGAGUAGGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
加下划线部分表示5'UTR或3'UTR，小写字母表示miR-302b靶序列的1个拷贝。
EGFP-4×T302b的基因序列(SEQ ID NO:3)
GGGCGAAUUAAGAGAGAAAAGAAGAGUAAGAAGAAAUAUAAGACACCGGUCGCCACCAUGGGAUCCGUGAGCAAGGGCGAGGAGC UGUUCACCGGGGUGGUGCCCAUCCUGGUCGAGCUGGACGGCGA CGUAAACGGCCACAAGUUCAGCGUGUCCGGCGAGGGCGAGGGC GAUGCCACCUACGGCAAGCUGACCCUGAAGUUCAUCUGCACCA CCGGCAAGCUGCCCGUGCCCUGGCCCACCCUCGUGACCACCCU GACCUACGGCGUGCAGUGCUUCAGCCGCUACCCCGACCACAUG AAGCAGCACGACUUCUUCAAGUCCGCCAUGCCCGAAGGCUACG UCCAGGAGCGCACCAUCUUCUUCAAGGACGACGGCAACUACAA GACCCGCGCCGAGGUGAAGUUCGAGGGCGACACCCUGGUGAAC CGCAUCGAGCUGAAGGGCAUCGACUUCAAGGAGGACGGCAACA UCCUGGGGCACAAGCUGGAGUACAACUACAACAGCCACAACGUCUAUAUCAUGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCAUCAAGGUGAAC UUCAAGAUCCGCCACAACAUCGAGGACGGCAGCGUGCAGCUCG CCGACCACUACCAGCAGAACACCCCCAUCGGCGACGGCCCCGU GCUGCUGCCCGACAACCACUACCUGAGCACCCAGUCCGCCCUG AGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGAUCACAUGGUCCUGCUGG AGUUCGUGACCGCCGCCGGGAUCACUCUCGGCAUGGACGAGCU GUACAAGAGAUCUCAUAUGCAUCUCGAGUGAUAGUCUAGA CCUUCUGCGGGGCcuacuaaaacauggaagcacuuacuacuaaaacauggaagcacuuacuacuaaaacauggaag cacuuacuacuaaaacauggaagcacuuaUGAAUAAAGCCUGAGUAGGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAAAA
加下划线部分表示5'UUR或3'UTR，小写字母表示miR-302b靶序列的4个拷贝。
mCherry-mRNA的基因序列(SEQ ID NO:4)
GGGCGAAUUAAGAGAGAAAAGAAGAGUAAGAAGAAAUAUAAGACACCGGUCGCCACCAUGGUGAGCAAGGGCGAGGAGGAUAACA UGGCCAUCAUCAAGGAGUUCAUGCGCUUCAAGGUGCACAUGGA GGGCUCCGUGAACGGCCACGAGUUCGAGAUCGAGGGCGAGGGC GAGGGCCGCCCCUACGAGGGCACCCAGACCGCCAAGCUGAAGG UGACCAAGGGUGGCCCCCUGCCCUUCGCCUGGGACAUCCUGUC CCCUCAGUUCAUGUACGGCUCCAAGGCCUACGUGAAGCACCCC GCCGACAUCCCCGACUACUUGAAGCUGUCCUUCCCCGAGGGCU UCAAGUGGGAGCGCGUGAUGAACUUCGAGGACGGCGGCGUGG UGACCGUGACCCAGGACUCCUCCCUGCAGGACGGCGAGUUCAU CUACAAGGUGAAGCUGCGCGGCACCAACUUCCCCUCCGACGGC CCCGUAAUGCAGAAGAAGACCAUGGGCUGGGAGGCCUCCUCCGAGCGGAUGUACCCCGAGGACGGCGCCCUGAAGGGCGAGAUCAA GCAGAGGCUGAAGCUGAAGGACGGCGGCCACUACGACGCUGAG GUCAAGACCACCUACAAGGCCAAGAAGCCCGUGCAGCUGCCCG GCGCCUACAACGUCAACAUCAAGUUGGACAUCACCUCCCACAA CGAGGACUACACCAUCGUGGAACAGUACGAACGCGCCGAGGGC CGCCACUCCACCGGCGGCAUGGACGAGCUGUACAAGUAAAUCUAGACCUUCUGCGGGGCUUGCCUUCUGGCCAUGCCCUUCUUCU CUCCCUUGCACCUGUACCUCUUGGUCUUUGAAUAAAGCCUGAGUAGGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAA
加下划线部分表示5'UTR或3'UTR。
[IVT(体外翻译)模板DNA的构建]
通过混合5'UTR片段、标记基因的ORF区片段和3'UTR片段，然后通过PCR(融合PCR)链接它们来制备IVT模板DNA。这些片段通过PCR扩增产生，或作为寡DNA购买，然后使用。下文中，描述生产EGFP mRNA、mCherry mRNA、1×T302b-EGFP和EGFP-4×T302b 这四种IVT模板DNA的方法的细节。
在EGFP和mCherry基因ORF区域上进行以下PCR扩增。使用 pCTp-EGFP(Saito H等人等人，Nat.Commun.2：1602011)作为模板，用TAPEGFP_IVTfwd(KEC-67)(SEQ ID NO：5)和TAP_IVTrev ((KEC-23))(SEQ ID NO：6)进行PCR扩增来制备EGFP_ORF片段。类似地，使用pCR2.1-mCherry(Tanaka A等人，PLoS One.2013Apr 23；8(4))：e61540.)作为模板，用mCherry_IVTfwd(KEC-888)(SEQ ID NO:7)和mCherry_IVTrev(KEC-889)(SEQ ID NO：8)进行PCR 扩增来制备mCherry_ORF片段。
此外，在不含有靶序列的5'UTR片段和3'UTR片段上进行以下 PCR扩增。使用IVT5primeUTR(KEC-62)(SEQ ID NO：9)作为模板，使用TAP_T7_1G(KEC-876)(SEQ ID NO：10)和Rev5UTR (KEC-1)(SEQ ID NO：11)作为引物进行PCR扩增，来制备5'UTR 片段。使用IVT3primeUTR(KEC-63)(SEQ ID NO：12)作为模板，使用Fwd3UTR(KEC-4)(SEQ ID NO：13)和Rev3UTR2T20(KEC-65) (SEQ ID NO：14)作为引物进行PCR扩增，来制备3'UTR片段。
通过混合上述5'UTR片段、3'UTR片段和EGFP_ORF片段或 mCherry_ORF片段，然后使用TAP_T7_1G和3UTR120A(KEC-308) (SEQ ID NO：15)作为引物进行融合PCR来产生EGFPmRNA和 mCherry mRNA的IVT模板DNA。
通过混合5UTR-T302b-3p(KTC-004)(SEQ ID NO：16)、 EGFP_ORF片段和3'UTR片段，然后使用GCT7CMV_del4(KEC-97) (SEQ ID NO：17)和3UTR120A作为引物进行融合PCR来制备 1×T302b-EGFP的IVT模板DNA。
通过使用TAP_T7_1G和3UTR120A作为引物，在5'UTR片段、 EGFP_ORF片段和3UTRtemp_4×T302b-3p(KTC-001)寡DNA(SEQ ID NO：18)上进行融合PCR来制备EGFP-4×T302b的IVT模板DNA。
可以酌情将上述引物和模板等寡DNA的制备委托给其他方，然后使用如此生产的寡DNA。其序列示于表1。
使用MinElute PCR纯化试剂盒(QIAGEN)按照制造商的说明书纯化如上所述通过PCR扩增获得的IVT模板DNA。
表1
Figure BDA0001246459300000191
Figure BDA0001246459300000201
[mRNA的IVT合成]
使用通过修改Warren L.等人，Cell Stem Cell，7(5)：618-30，2010中描述的方法而准备的方案，通过IVT合成mRNA。具体地，使用MegaScript T7试剂盒(Ambion)从上述IVT模板制备mRNA。此时，使用假尿苷-5'-三磷酸和5-甲基胞苷-5'-三磷酸(TriLinkBioTechnologies)代替使用尿苷三磷酸和胞苷三磷酸。在反应之前，用Anti Reverse CapAnalog(New England Biolabs)将鸟苷-5'-三磷酸稀释5倍，然后使用。将反应混合物在37℃温育4小时。然后，向所得物中加入TURBO DNase(Ambion)，并将所得混合物在37℃进一步温育30分钟。使用FavorPrep血/培养细胞(Blood/Cultured Cells) 总RNA提取柱(Favorgen Biotech)纯化所获得的mRNA，然后使用 Antarctic Phosphatase(New EnglandBiolabs)在37℃温育所得物30 分钟。此后，使用RNeasy MiniElute Cleanup Kit(QIAGEN)进一步纯化反应混合物。
[人类iPS细胞的扩增培养]
人类iPS细胞(201B7、409B2和427F1)得自京都大学Shinya YAMANAKA博士。将该人类iPS细胞在含有5ng/ml的bFGF (Reprocell)和0.5％青霉素-链霉素(Invitrogen)的Primate ES细胞培养基(Reprocell)中的MMC处理的SNL饲养细胞上培养。当iPS细胞的集落增加到一定程度时，对它们进行传代培养。在传代培养中，除去培养溶液，然后用D-PBS(Nacalai tesq)洗涤细胞，然后将CTK (2型胶原酶(Invitrogen)、2.5％胰蛋白酶-EDTA(Nacalai tesq)和 KSR(Invitrogen))添加到所得细胞。将该混合物用D-PBS洗涤两次，然后除去饲养细胞。将培养液加入去除了饲养细胞的培养皿中，使用细胞刮刀收集iPS细胞。此后，通过吹吸(pipet)解离iPS细胞的集落。将解离的iPS细胞集落在新培养皿中以1:3的比例传代培养。对于无饲养层培养，使用Matrigel(BD)包被的平板或皿，并且使用mTeSR1(Stem cell technologies)作为培养基。按照制造商的说明书应用该培养方法。
[转染miR-302b响应性报告mRNA]
将人类iPS细胞接种在Matrigel(BD)包被的24孔板上。在第二天，按照制造商的说明书，使用1μl的StemFect(Stemgent)将200ng 的EGFP mRNA或每个miR-302b响应性报告mRNA引入iPS细胞。引入完成后，为了检查miRNA的作用，在2pmol、0.5pmol或0pmol的mirVana miRNA抑制剂(Applied Biosciences)的存在下培养细胞。
[使用miR-302b响应性报告mRNA检测人类iPS细胞]
将EGFP mRNA和每个miR-302b响应性报告mRNA转染到人类 iPS细胞中，然后在mirVana miRNA抑制剂的存在下培养该混合物。然后，通过流式细胞术分析反应混合物。在1×T302b-EGFP和 EGFP-4×T302b中EGFP的荧光水平都根据mirVana miRNA抑制剂的浓度而改变(图1)。也就是说，这些结果表明，在具有多能性的人类iPS细胞中高度表达的miR-302b的活性使1×T302b-EGFP和EGFP-4×T302b中EGFP的翻译水平降低。因此，结果证明了通过使用 miR-302b响应性报告mRNA可以特异性识别在诱导分化后包含在细胞群中的丧失其多能性的细胞的可能性。
[miR-302b-应答报告mRNA的翻译效率]
将mCherry mRNA和EGFP或1×T302b-EGFP共同引入人类iPS细胞(201B7)中，然后在mirVana miRNA抑制剂的存在下培养它们。然后，通过流式细胞术测量EGFP和mCherry各自的荧光强度，然后计算EGFP的荧光强度与mCherry的荧光强度的比率。结果，确认了当通过mirVana miRNA抑制剂抑制了miRNA的活性时，通过EGFP中的mCherry的荧光强度校正的EGFP的荧光强度和1×T302b-EGFP中的 EGFP的荧光强度彼此为相同水平，但是当miRNA的活性未被抑制时，1×T302b-EGFP中EGFP的荧光强度显著降低(图2)。由这些结果可以确认，iPS细胞中EGFP的荧光强度降低，不是因为1×T302b-EGFP 的引入效率低，而是因为miRNA的活性。即使使用其它iPS细胞系 (409B2和427F1)，也获得了与上述相同的结果。
[实施例2]
[分化诱导细胞的分选]
将人类iPS细胞接种在Matrigel(BD)包被的10cm培养皿上，然后在视黄酸培养基(含有0.5μM视黄酸(Sigma)、10％FBS(GIBCO)、 0.5％青霉素-链霉素(Invitrogen)、1％Glutamax(Invitrogen)和 1％NEAA(Invitrogen)的DMEM-F12(Invitrogen))中培养3天(Tang C等人，Nature Biotechnology，29(9)：829-34，2011)。培养完成后，将细胞从培养皿中分离，然后再次接种在含有mTeSR1培养基 (Stem cell technologies)或上述相同培养基的Matrigel包被的10cm 培养皿上。第二天，将1×T302b-EGFP转染到细胞中。按照制造商的说明书，使用24μl的stemfect(Stemgent)进行转染。转染后24小时，从培养皿中分离所得的细胞，然后通过流式细胞术分析EGFP的荧光强度。此时，也使用抗-Tra-1-60抗体(Alexa647，BD)或抗-SSEA5 抗体(8e11，GeneTex)测量RA处理的细胞或未RA处理的细胞，并且还分析了各表面标记物。结果，一些RA处理的细胞对Tra-1-60是阴性的。对于SSEA5也获得与上述相同的结果(图3)。另一方面，在已经用RA处理并且已经引入了1×T302b-EGFP的细胞中，确认了一些 EGFP阳性细胞。此外，通过量化的PCR测量在EGFP阳性或阴性细胞、Tra-1-60阳性或阴性细胞和SSEA5阳性或阴性细胞每个中OCT3/4的表达水平。结果，证实当与EGFP阴性细胞相比时，EGFP阳性细胞中 OCT3/4的表达水平降低(图4)。因此，表明已经引入了1×T302b-EGFP 并且对EGFP呈阳性的细胞是分化细胞。此外，EGFP阳性细胞与EGFP 阴性细胞的表达的比率低于Tra-1-60阴性细胞与Tra-1-60阳性细胞的表达的比率，或SSEA5阴性细胞与SSEA5阳性细胞的表达的比率。这些结果证明了，利用涉及使用1×T302b-EGFP的EGFP可以提取分化细胞的可能性，与使用抗-Tra-1-60抗体或抗抗-SSEA5抗体的情况相比，具有更高的灵敏度。
随后，根据流式细胞术，将分离的EGFP阳性细胞或Tra-1-60阴性细胞接种在Matrigel包被的6孔板上，然后在mTeSR1培养基中或视黄酸培养基中培养5天。此时，每隔一天将培养基更换为新鲜培养基。使用碱性磷酸酶染色试剂盒(Sigma)对获得的细胞染色。在转染了 1×T302b-EGFP的EGFP阳性细胞的情况下，碱性磷酸酶染色的阳性细胞(未分化细胞)的剩余量显著降低(图5)。因此，证明了通过使用1×T302b-EGFP，可以从包含未分化细胞和分化细胞的细胞群中选择性分选出分化细胞，而不混有未分化细胞。另一方面，确认了分选出的Tra-1-60阴性细胞可能包含未分化细胞。
随后，为了实现未分化细胞的完全去除，通过流式细胞术分选出上10％的EGFP阳性细胞和上20％的EGFP阳性细胞(图6A)。通过上述方法将分选的样品培养5天，然后用碱性磷酸酶染色。结果，在上10％的EGFP阳性细胞和上20％的EGFP细胞中均发现完全没有被碱性磷酸酶染色的未分化细胞(图6B)。因此，证实了甚至在上20％的 EGFP阳性细胞中也不包含未分化细胞。
[实施例3]
[302a-5p和367-3p应答报告mRNA的设计]
修饰hmAG1-mRNA(SEQ ID NO：19)，其编码荧光报告基因 hmAG1并且包括α球蛋白的5'末端非翻译区(5'UTR)和3'末端非翻译区(3'UTR)，并且分别设计了在5'UTR中包含miR-302a-5p的靶序列的1个拷贝的miR-302a-5p响应性报告mRNA(SEQ ID NO：20)和在 5'UTR中包含miR-367-3p的靶序列的1个拷贝的miR-367-3p响应性报告mRNA(SEQ ID NO：21)。此外，为了将转染归一化，还设计了用作对照的包含α球蛋白的5'UTR和3'UTR的tagBFPmRNA(SEQ ID NO：22)。此外，作为抗药性基因，修饰了包含嘌呤霉素抗性基因的嘌呤霉素R-mRNA(SEQ ID NO：23)，并且设计了在5'UTR中包含 miR-302a-5p的靶序列的1个拷贝的302a-5p响应性嘌呤霉素R-mRNA (SEQ ID NO：24)。这些mRNA的基因序列如下所示。
hmAG1-mRNA的基因序列(SEQ ID NO：19)
GGGCGAATTAAGAGAGAAAAGAAGAGTAAGAAGAAATATAAGACACCGGTCGCCACCatgGTGAGCGTGATCAAGCCCGAGATGAAGAT CAAGCTGTGCATGAGGGGCACCGTGAACGGCCACAACTTCGTGA TCGAGGGCGAGGGCAAGGGCAACCCCTACGAGGGCACCCAGATCCTGGACCTGAACGTGACCGAGGGCGCCCCCCTGCCCTTCGCCT ACGACATCCTGACCACCGTGTTCCAGTACGGCAACAGGGCCTTC ACCAAGTACCCCGCCGACATCCAGGACTACTTCAAGCAGACCTT CCCCGAGGGCTACCACTGGGAGAGGAGCATGACCTACGAGGACC AGGGCATCTGCACCGCCACCAGCAACATCAGCATGAGGGGCGAC TGCTTCTTCTACGACATCAGGTTCGACGGCACCAACTTCCCCCCCAACGGCCCCGTGATGCAGAAGAAGACCCTGAAGTGGGAGCCCA GCACCGAGAAGATGTACGTGGAGGACGGCGTGCTGAAGGGCGA CGTGAACATGAGGCTGCTGCTGGAGGGCGGCGGCCACTACAGGT GCGACTTCAAGACCACCTACAAGGCCAAGAAGGAGGTGAGGCT GCCCGACGCCCACAAGATCGACCACAGGATCGAGATCCTGAAGC ACGACAAGGACTACAACAAGGTGAAGCTGTACGAGAACGCCGT GGCCAGGTACTCCATGCTGCCCAGCCAGGCCAAGtgaA TCTAGACCTTCTGCGGGGCTTGCCTTCTGGCCATGCCCTTCTTCTCTCCCTTGCACCTGTACCTCTTGGTCTTTGAA TAAAGCCTGAGTAGGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
起始密码子和终止密码子用小写字母表示。加下划线部分表示 5'UTR或3'UTR。
302a-5p响应性hmAG1-mRNA的基因序列(SEQ ID NO：20)
GGTTCCGCGATCGCGGATCCagcaagtacatccacgtttaagtAGATCCACCGGTCGCCACCatgGTGAGCGTGATCAAGCCCGAGATGAAGATCAAG CTGTGCATGAGGGGCACCGTGAACGGCCACAACTTCGTGATCGAGGGCGAGGGCAAGGGCAACCCCTACGAGGGCACCCAGATCCTG GACCTGAACGTGACCGAGGGCGCCCCCCTGCCCTTCGCCTACGA CATCCTGACCACCGTGTTCCAGTACGGCAACAGGGCCTTCACCA AGTACCCCGCCGACATCCAGGACTACTTCAAGCAGACCTTCCCC GAGGGCTACCACTGGGAGAGGAGCATGACCTACGAGGACCAGG GCATCTGCACCGCCACCAGCAACATCAGCATGAGGGGCGACTGCTTCTTCTACGACATCAGGTTCGACGGCACCAACTTCCCCCCCAAC GGCCCCGTGATGCAGAAGAAGACCCTGAAGTGGGAGCCCAGCA CCGAGAAGATGTACGTGGAGGACGGCGTGCTGAAGGGCGACGT GAACATGAGGCTGCTGCTGGAGGGCGGCGGCCACTACAGGTGCG ACTTCAAGACCACCTACAAGGCCAAGAAGGAGGTGAGGCTGCCC GACGCCCACAAGATCGACCACAGGATCGAGATCCTGAAGCACGA CAAGGACTACAACAAGGTGAAGCTGTACGAGAACGCCGTGGCCA GGTACTCCATGCTGCCCAGCCAGGCCAAGtgaATCTAGACCTTCTGCGGGGCTTGCCTTCTGGCCATGCCCTTCTTCTCTCCCTTGCACCTGTACCTCTTGGT CTTTGAATAAAGCCTGAGTAGGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
起始密码子和终止密码子用小写字母表示，miRNA靶序列用小写字母表示。加下划线部分表示5'UTR或3'UTR。
367-3p响应性hmAG1-mRNA的基因序列(SEQ ID NO：21)
GGTTCCGCGATCGCGGATCCtcaccattgctaaagtgcaattAGATCACACCGGTCGCCACCatgGTGAGCGTGATCAAGCCCGAGATGAAGATCAAG CTGTGCATGAGGGGCACCGTGAACGGCCACAACTTCGTGATCGAGGGCGAGGGCAAGGGCAACCCCTACGAGGGCACCCAGATCCTG GACCTGAACGTGACCGAGGGCGCCCCCCTGCCCTTCGCCTACGA CATCCTGACCACCGTGTTCCAGTACGGCAACAGGGCCTTCACCA AGTACCCCGCCGACATCCAGGACTACTTCAAGCAGACCTTCCCC GAGGGCTACCACTGGGAGAGGAGCATGACCTACGAGGACCAGG GCATCTGCACCGCCACCAGCAACATCAGCATGAGGGGCGACTGC TTCTTCTACGACATCAGGTTCGACGGCACCAACTTCCCCCCCAAC GGCCCCGTGATGCAGAAGAAGACCCTGAAGTGGGAGCCCAGCA CCGAGAAGATGTACGTGGAGGACGGCGTGCTGAAGGGCGACGT GAACATGAGGCTGCTGCTGGAGGGCGGCGGCCACTACAGGTGCG ACTTCAAGACCACCTACAAGGCCAAGAAGGAGGTGAGGCTGCCCGACGCCCACAAGATCGACCACAGGATCGAGATCCTGAAGCACGA CAAGGACTACAACAAGGTGAAGCTGTACGAGAACGCCGTGGCCA GGTACTCCATGCTGCCCAGCCAGGCCAAGtgaATCTAGACCTTCTGCGGGGCTTGCCTTCTGGCCATGCCCTTCTTCTCTCCCTTGCACCTGTACCTCTTGGT CTTTGAATAAAGCCTGAGTAGGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
起始密码子和终止密码子用小写字母表示，miRNA靶序列用小写字母表示。加下划线部分表示5'UTR或3'UTR。
tagBFP-mRNA的基因序列(SEQ ID NO：22)
GGGCGAATTAAGAGAGAAAAGAAGAGTAAGAAGAAATATAAGACACCGGTCGCCACCatgGGATCCAGCGAGCTGATTAAGGAGAACAT GCACATGAAGCTGTACATGGAGGGCACCGTGGACAACCATCACT TCAAGTGCACATCCGAGGGCGAAGGCAAGCCCTACGAGGGCACC CAGACCATGAGAATCAAGGTGGTCGAGGGCGGCCCTCTCCCCTT CGCCTTCGACATCCTGGCTACTAGCTTCCTCTACGGCAGCAAGAC CTTCATCAACCACACCCAGGGCATCCCCGACTTCTTCAAGCAGTC CTTCCCTGAGGGCTTCACATGGGAGAGAGTCACCACATACGAAG ACGGGGGCGTGCTGACCGCTACCCAGGACACCAGCCTCCAGGAC GGCTGCCTCATCTACAACGTCAAGATCAGAGGGGTGAACTTCAC ATCCAACGGCCCTGTGATGCAGAAGAAAACACTCGGCTGGGAGG CCTTCACCGAGACGCTGTACCCCGCTGACGGCGGCCTGGAAGGC AGAAACGACATGGCCCTGAAGCTCGTGGGCGGGAGCCATCTGAT CGCAAACATCAAGACCACATATAGATCCAAGAAACCCGCTAAGA ACCTCAAGATGCCTGGCGTCTACTATGTGGACTACAGACTGGAAAGAATCAAGGAGGCCAACAACGAGACCTACGTCGAGCAGCACGA GGTGGCAGTGGCCAGATACTGCGACCTCCCTAGCAAACTGGGGC ACAGATCTCATATGCATCTCGAGtgaTCTAGACCTTCTGCGGGGCTTGCCTTCTGGCCATGCC CTTCTTCTCTCCCTTGCACCTGTACCTCTTGGTCTTTGAATAAAGCCTGAGTAGGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
起始密码子和终止密码子用小写字母表示，加下划线部分表示 5'UTR或3'UTR。
嘌呤霉素R-mRNA的基因序列(SEQ ID NO：23)
GGGCGAATTAAGAGAGAAAAGAAGAGTAAGAAGAAATATAAGACACCGGTCGCCACCatgACCGAGTACAAGCCCACGGTGCGCCTCGC CACCCGCGACGACGTCCCCAGGGCCGTACGCACCCTCGCCGCCG CGTTCGCCGACTACCCCGCCACGCGCCACACCGTCGATCCGGAC CGCCACATCGAGCGGGTCACCGAGCTGCAAGAACTCTTCCTCAC GCGCGTCGGGCTCGACATCGGCAAGGTGTGGGTCGCGGACGACG GCGCCGCGGTGGCGGTCTGGACCACGCCGGAGAGCGTCGAAGC GGGGGCGGTGTTCGCCGAGATCGGCCCGCGCATGGCCGAGTTGA GCGGTTCCCGGCTGGCCGCGCAGCAACAGATGGAAGGCCTCCTG GCGCCGCACCGGCCCAAGGAGCCCGCGTGGTTCCTGGCCACCGTCGGCGTCTCGCCCGACCACCAGGGCAAGGGTCTGGGCAGCGCCG TCGTGCTCCCCGGAGTGGAGGCGGCCGAGCGCGCCGGGGTGCCC GCCTTCCTGGAGACCTCCGCGCCCCGCAACCTCCCCTTCTACGAG CGGCTCGGCTTCACCGTCACCGCCGACGTCGAGGTGCCCGAAGG ACCGCGCACCTGGTGCATGACCCGCAAGCCCGGTGCCtgaTCTAGAC CTTCTGCGGGGCTTGCCTTCTGGCCATGCCCTTCTTCTCTCCCTTGCACCTGTACCTCTTGGTCTTTGAATAAAGCC TGAGTAGGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
起始密码子和终止密码子用小写字母表示。加下划线部分表示 5'UTR或3'UTR。
302a-5p响应性嘌呤霉素R-mRNA的基因序列(SEQ ID NO：24) GGTTCCGCGATCGCGG ATCCagcaagtacatccacgtttaagtAGATCCACCGGTCGCCACCatgACCGAGTACAAGCCCACGGTGCGCCTCGCCACC CGCGACGACGTCCCCAGGGCCGTACGCACCCTCGCCGCCGCGTT CGCCGACTACCCCGCCACGCGCCACACCGTCGATCCGGACCGCC ACATCGAGCGGGTCACCGAGCTGCAAGAACTCTTCCTCACGCGC GTCGGGCTCGACATCGGCAAGGTGTGGGTCGCGGACGACGGCGC CGCGGTGGCGGTCTGGACCACGCCGGAGAGCGTCGAAGCGGGG GCGGTGTTCGCCGAGATCGGCCCGCGCATGGCCGAGTTGAGCGG TTCCCGGCTGGCCGCGCAGCAACAGATGGAAGGCCTCCTGGCGC CGCACCGGCCCAAGGAGCCCGCGTGGTTCCTGGCCACCGTCGGC GTCTCGCCCGACCACCAGGGCAAGGGTCTGGGCAGCGCCGTCGT GCTCCCCGGAGTGGAGGCGGCCGAGCGCGCCGGGGTGCCCGCCTTCCTGGAGACCTCCGCGCCCCGCAACCTCCCCTTCTACGAGCGG CTCGGCTTCACCGTCACCGCCGACGTCGAGGTGCCCGAAGGACC GCGCACCTGGTGCATGACCCGCAAGCCCGGTGCCtgaTCTAGACCTTCTGCGGGGCTTGCCT TCTGGCCATGCCCTTCTTCTCTCCCTTGCACCTGTACCTCTTGGTCTTTGAATAAAGCCTGAGTAGGAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
起始密码子和终止密码子用小写字母表示，miRNA靶序列用小写字母表示。加下划线部分表示5'UTR或3'UTR。
[制备模板和体外转录(IVT)]
通过混合5'UTR片段、标记基因的ORF区片段和3'UTR片段，然后以与实施例1相同的方式通过PCR(融合PCR)将它们链接而制备 IVT模板DNA。通过PCR扩增制备这些片段。在下文中，描述制备 hmAG1、302a-5p响应性hmAG1、367-3p响应性hmAG1、tagBFP、嘌呤霉素R和302a-5p响应性嘌呤霉素R这六种IVT模板DNA的方法的细节。
在hmAG1、tagBFP和嘌呤霉素R基因的ORF区域上进行以下PCR 扩增。使用质粒模板：S/G2/M Green(Amalgam MBL)作为模板，用hmAG1_IVTfwd(KEC-330)(SEQ ID NO：25)和hmAG1_IVTrev (KEC-331)(SEQ ID NO：26)进行PCR扩增来制备hmAG1_ORF片段。类似地，使用质粒模板：pTAP_tagBFP(Miki等人，Cell Stem Cell，卷16，期6，4，6月，2015，页699-711)作为模板，用tagBFP_fwd (KED-90)(SEQ ID NO：33)和TAP_IVTrev(KEC-23)进行PCR 扩增来制备tagBFP_ORF片段。类似地，使用质粒模板： pPyCAG-Nanog-IP(Plasmid13838，Addgene)作为模板，用 ORF_PuroR_fwd(STC-035)(SEQ ID NO：31)和ORF_PuroR_rev (STC-036)(SEQ ID NO：32)进行PCR扩增来制备tagBFP_ORF片段。
此外，在不含有靶序列的5'UTR片段和3'UTR片段上进行以下 PCR扩增。使用IVT5primeUTR(KEC-62)作为模板，使用TAP_T73GC (SKC-111)(SEQ ID NO：30)和Rev5UTR(KEC-1)(SEQ ID NO： 11)作为引物进行PCR扩增来制备5'UTR片段。使用IVT 3primeUTR (KEC-63)作为模板，使用Fwd3UTR(KEC-4)和Rev3UTR2T20 (KEC-65)作为引物进行PCR扩增来制备3'UTR片段。
此外，在含有302a-5p靶序列的5'UTR和含有367-3p靶序列的 5'UTR上进行以下PCR扩增。使用5UTRtemp_T302a-5p(KEC-653) (SEQ ID NO：27)作为模板，使用GCT7pro_5UTR2(KEC-948)(SEQ ID NO：29)和Rev5UTR(KEC-1)作为引物进行PCR扩增，来制备 302a-5p-5'UTR片段。使用5UTRtemp_T367-3p(KEC-845)(SEQ ID NO：28)作为模板，使用GCT7pro_5UTR2(KEC-948)和Rev5UTR (KEC-1)作为引物进行PCR扩增，来制备367-3p-5'UTR片段。
通过混合上述5'UTR片段和3'UTR片段、hmAG1_ORF片段、 tagBFP_ORF片段或嘌呤霉素R_ORF片段，然后使用TAP_T73GC (SKC-111)和3UTR120A(KEC-308)作为引物进行融合PCR，来制备hmAG1mRNA、tagBFP mRNA和嘌呤霉素R mRNA的IVT模板 DNA。
通过混合上述302a-5p-5'UTR片段或367-3p-5'UTR片段、3'UTR 片段和hmAG1_ORF片段，然后使用GCT7pro_5UTR2(KEC-948)和 3UTR120A(KEC-308)作为引物进行融合PCR来制备302a-5p响应性 hmAG1和367-3p响应性hmAG1的IVT模板DNA。通过混合上述 302a-5p-5'UTR片段、3'UTR片段和嘌呤霉素R_ORF片段，然后使用 GCT7pro_5UTR2(KEC-948)和3UTR120A(KEC-308)作为引物进行融合PCR来制备302a-5p响应性嘌呤霉素R的IVT模板DNA。
可以酌情将寡DNA，如上述引物和模板的制备委托给其他方，然后使用如此制备的寡DNA。其序列示于表1和表2中。
如上所述，按照制造商的说明书，使用MinElute PCR纯化试剂盒(QIAGEN)纯化通过PCR扩增获得的IVT模板DNA。以与实施例1 相同的方式通过IVT合成mRNA。
表2
Figure BDA0001246459300000301
[无饲养层的人类iPS细胞的维持]
根据2014年Nakagawa等的方案，将无饲养层的人类iPS细胞 (Ff-hiPSC)保持在StemFit(+bGF)培养基中的iMatrix-511(E8) (Nippi,Inc.)上。每8天传代培养该人类iPS细胞。在这样的传代培养之前，在37℃用已经用无菌PBS稀释至0.5μg/cm2的浓度的iMatrix-511(E8)包被6孔板至少1小时。包被完成后，吸出PBS，并立即将其更换为1.5ml的含有10μM的ROCK抑制剂(Y-26732)的 StemFit。为了收获人类iPS细胞，旧培养基被吸走，然后用1ml的PBS 洗涤细胞。抽吸PBS后，将0.3ml的TrypSELECT溶液倒入每个孔中，然后将板转移到培养箱中。一分钟后，除去不必要的溶液(移去细胞上的体积)，并将残余物进一步温育3分钟。随后，从培养箱中取出反应混合物，然后吸出TrypSELECT溶液，然后用1ml的PBS洗涤所得物。此后，吸出PBS，并将1.5ml的StemFit与ROCK抑制剂一起添加到每个孔中。使用橡胶刮刀收获细胞，然后使用P1000移液管吹吸 10次以获得单细胞溶液。使用台盼蓝染色和Cell Countess (Invitrogen)计算细胞密度，然后以1.3×104/孔的细胞数接种该细胞，使得细胞均匀分布。24小时后，将StemFit更换为不含ROCK抑制剂的 StemFit，然后每隔一天将StemFit更换为新鲜培养基。
[无饲养层人类iPS细胞分化为中脑多巴胺神经元细胞]
按照Doi,D.等人，Stem Cells 30，935-945(2012)中描述的方法进行将无饲养层的人类iPS细胞分化成中脑多巴胺神经元细胞的诱导。以与上述相同的方式用人类iPS细胞包被6孔板，然后向每个孔中加入4ml的第0天分化培养基。通过将其中单一类型的人类iPS细胞已经悬浮在不含ROCK抑制剂的第0天分化培养基中的细胞溶液以 5×106/孔的细胞密度接种在6孔板上来开始分化。在将该板放回培养箱之前，将将板轻轻搅动(stir)。24小时后，用第1天培养基更换全部培养基。类似地，每天更换培养基。在从第0天分化培养基到第2天分化培养基的培养基更换中，向每个孔中加入4ml的培养基；在从第3天分化培养基到第6天分化培养基的培养基更换中，向每个孔中加入6ml的培养基；在从第7天分化培养基到第8天分化培养基的培养基更换中，向每个孔中加入8ml的培养基；并且在从第9天分化培养基到第11天分化培养基的培养基更换中，向每个孔中加入10ml的培养基。在培养完成后的11天内，细胞数增加2倍，细胞密度变为约 10×106/孔。将细胞在第12天、第20天和第29天传代培养，并以5×106/ 孔的细胞密度接种在6孔板上。第12天后，细胞都保持在NeurobasalB27培养基中。每天将培养基更换为新鲜培养基，并且每次加入5ml/ 孔的新鲜培养基。
[分化效率的评价]
针对在第12天、第20天和第29天进行的每个传代培养，利用在标记神经谱系中使用的CORIN抗体(Kan Research)、底板标记物和 PSA-NCAM抗体将大量的细胞染色，然后评价细胞的分化效率。同时，使用1/200的小鼠抗人类CORIN抗体(Kan Research)或1/100的小鼠单克隆抗人类PSA-NCAM抗体(MAB5324，Millipore)，使已添加了ROCK抑制剂的200μl的染色缓冲液(HBSS：Hanks平衡盐溶液 /2％敲除血清，50微克/ml青霉素/链霉素，10μM的Y-26732)中的约 5×105个细胞进行染色的抗原-抗体反应。对于该CORIN抗体和 PSA-NCAM，以1/400的比率使用Alexa 488缀合的抗小鼠IgG抗体或 IgM二次染色。该细胞在4℃染色30分钟。该细胞在HBSS培养基中染色两次。死细胞用7-AAD染色10分钟，然后进行FACS分析。
使用FITC标准过滤器和7-AAD信号，通过BD FACS aria-II或BD Accuri测量该细胞。为了去除死细胞，基于SSC-A强度(P1)建立闸门，从FSC-W vs FSC-H(P2)和SSC-W vsSSC-H(P3)重复地去除死细胞。最后，去除高的7-AAD细胞，并保留活细胞闸门(P4/LIVE)。分析20,000个P4门控细胞。建立CORIN阳性和PSA-NCAM阳性闸门，并且在Alexa 488-IgG或IgG同种型对照二次抗体中保留0.2％或更少的细胞。
[在诱导细胞分化为中脑多巴胺神经元细胞中使用的培养基的组成]
第0天
8GMK、10μM的Y-26732(Wako)、100nM的LDN-193189(Stemgent)、 500nM的A83-01(Wako)
第1-2天
8GMK、100nM的LDN-193189、500nM的A83-01、2μM的嘌吗啡胺 (Purmorphamine)(Calbiochem)、100ng/ml的人类重组FGF-8(Wako)
第3-7天
8GMK、100nM的LDN-193189、500nM的A83-01、2μM的嘌吗啡胺、 100ng/ml的人类重组FGF-8、30μM的CHIR99021(Stemgent)
第7-11天
8GMK、100nM的LDN-193189、30μM的CHIR99021
第12天及之后
Neurobasal B27、200μM的抗坏血酸(Sigma Aldrich)、400μM的 dbcAMP(cAMP)、20ng/ml的人类重组BDNF、10ng/ml的人类重组 GDNF
8GMK：Glasgow's MEM/8％敲除血清/100μM丙酮酸钠、100μMβ-巯基乙醇
Neurobasal B27：神经基础培养基/2％B27添加/2mM谷氨酰胺
[转染]
在转染之前，如上所述对细胞进行传代培养，然后将传代培养的细胞以1～2×105/孔的细胞密度接种在用iMatrix-511(E8)包被的 24孔板上包含ROCK抑制剂的分化培养基中。在第二天，不用新鲜培养基替换培养基，按照制造商的方案，使用StemFect试剂(Stemgent) 将上述IVT合成的mRNA转染到细胞中。对于每次转染，将已被加入到12.5μl的StemFect缓冲液中的lμl的试剂混合到管(管A)中，然后将混合物在室温温育5分钟。在另一管(管B)中，将mRNA(最多 400ng)与12.5μl的StemFect缓冲液混合。将管B中的内容物滴加到管 A中用于轻微混合，然后将所得混合物在室温温育10分钟。将该转染复合物滴加到细胞中，然后将所得混合物搅动，然后置于培养箱中。 4小时后，吸出含有转染复合物的旧培养基，然后加入不含ROCK抑制剂的新鲜分化培养基。在第二天，使用标准过滤器，根据BDFACS aria-II，或者如上所述通过BD Accuri，根据FACS分析来分析细胞。基于模拟转染的细胞评价转染效率。
[302a-5p和367-3p响应性hmAG1 mRNA的特异性翻译抑制]
已经引入到人类iPS细胞中的302a-5p和367-3p响应性hmAG1 mRNA的翻译均被特异性抑制(图7)。将50ng的hmAG1 mRNA (ctrl-hmAG1)、302a-5p响应性hmAG1 mRNA(302a-5p-hmAG1)或 367-3p响应性hmAG1 mRNA(367-3p-hmAG1)与100ng的tagBFP一起引入到无饲养层的人类iPS细胞系(201B7、1231A3和1383D7)中和 HeLa细胞中。24小时后，收集细胞，然后使用BD FACS aria-II进行分析。结果以点图的形式显示在图7a中。即使在使用这些miRNA响应性mRNA的情况下，通过流式细胞术分析也发现人类iPS细胞201B7 中的特异性翻译抑制。此外，将来自人类iPS细胞系的结果与来自 HeLa细胞的结果进行比较。结果发现，不论细胞系201B7、1231A3 和1383D7，在人类iPS细胞中302a-5p响应性mRNA和367-3p响应性 mRNA的翻译都被特异性抑制(图7b)。通过将hmAG1信号归一化为 tagBFP来计算翻译效率，并且将其表示为添加了hmAG1 mRNA/tagBFP mRNA的细胞的比率。
将302a-5p响应性mRNA和302a-5p抑制剂(其添加量改变)共同引入到201B7中(图7c)。302a-5p抑制剂的浓度在0.003nM至30nM的范围内变化，然后，从0.003nM的抑制剂浓度开始，将其指示为青色、橙色、绿色、蓝色和红色的点图(图7c，右图)。当以3nM和30nM的浓度添加抑制剂时，这两种抑制剂通过302a-5p响应性mRNA分别部分地和完全地阻止翻译抑制。另一方面，将302a-5p响应性mRNA和 302a-5p模拟物(以不同的添加量)共同引入到HeLa细胞中，其对 302a-5p响应性mRNA不响应(图7d)。302a-5p模拟物的浓度在 0.003nM至6nM的范围内变化，然后，从0.003nM的浓度开始，将其指示为橙色、青色、紫色、蓝色和红色的点图(图7d，右图)。这些结果表明302a-5p模拟物抑制302a-5p响应性mRNA的翻译。如上所述，302a-5p响应性mRNA对靶miRNA具有特异性。
[Ff-人类iPS细胞分化为mDA细胞和miRNA响应性细胞的细胞数的变化]
使用302a-5p响应性mRNA和367-3p响应性mRNA跟踪Ff-人类iPS 细胞分化为中脑多巴胺能细胞(mDA细胞)(图8)。根据流式细胞术分析引入302a-5p响应性mRNA的在第0天、第5天、第7天和第14天的 Ff-201B7细胞获得的结果证明，随着分化的进展，hmAG1的翻译抑制作用降低(图8a)。此外，即使在引入302a-5p响应性mRNA和367-3p 响应性mRNA中的任一种的情况下，随着分化的进展，302a-5p响应性细胞或367-3p响应性细胞(蓝色区域)的分布也减少(图8b)。此外，在Ff-人类iPS细胞的所有细胞系中，确认了与上述几乎相同的结果。此外，证明了可以使用302a-5p响应性mRNA或367-3p响应性 mRNA跟踪分化的进展，并且分化的容易性随细胞系而不同。
[将Ff-人类iPS细胞分化为mDA细胞和hsa-miR的量化]
在Ff-人类iPS细胞分化为mDA细胞的第0、3、5、7、12和21天，通过三唑提取和异丙醇沉淀从冷冻的细胞团中提取总RNA。用DNase 处理RNA，然后使用miRNA逆转录酶和靶特异性RT引物(Applied Biosystems)进行逆转录，然后使用TaqMan miRNA探针进行扩增。分别用RNU6B标准化了的分化期间miR-302a-5p的比率(图9a)和hsa-miR-367-3p的比率(图9b)以log10标度示出。作为在第0天的阴性对照，还示出了HeLa细胞和肝细胞。显示出在将人类iPS细胞分化为mDA细胞期间，各个细胞中hsa-miR-302a-5p和hsa-miR-367-3p的表达水平被下调。
[分化细胞中Ff-人类iPS细胞的量化]
对于添加了已知量的Ff-人类iPS细胞的完全分化的mDA细胞系，使用miRNA响应性mRNA测量添加量(刺突试验)(图10)。在24孔板中，向mDA细胞中加入Ff-201B7人类iPS细胞(细胞数：0、100和500)。总细胞数设定为200,000。将50ng的hmAG1 mRNA或302a-5p响应性mRNA和100ng的tagBFP共同引入到这些细胞中。当将302a-5p响应性 mRNA引入到不含有iPS细胞的mDA细胞中时，即使建立302pos (miR-302a-5p阳性)闸门(重复1)和P5闸门(重复2)，也没有确认表现出翻译抑制的细胞(在最左侧图中的点图)。如重复1和重复2的结果所示，由302a-5p响应性mRNA鉴定的人类iPS细胞与mDA细胞的比率的测量值非常接近其估计值。
[使用miRNA响应性puroR mRNA提取分化细胞]
使用抗嘌呤霉素基因作为报告子，尝试从共培养系统中除去剩余的iPS细胞(图11)。图11a示出通过加入嘌呤霉素除去剩余的iPS 细胞的方案。该图显示，当将302a-5p响应性puroR mRNA引入201B7 细胞系和mDA细胞的共培养系中时，未引入的细胞和 hsa-miR-302a-5p高度表达的细胞由于不具有嘌呤霉素抗性基因，或者由于抗性基因的表达被抑制，而发生细胞死亡。图11b示出单一培养系统的实验时间轴。在此，将2×104个细胞接种在用iMatrix-511(E8) 包被的96孔板中。在该实验时间轴中，在含有不同量的puroR mRNA (0至50ng)或嘌呤霉素(0至10μg)的培养基中处理待诱导的mDA 细胞和Ff-201B7人类iPS细胞。图(图11b的柱状图)中示出通过加入 WST-1底物(Roche)2至4小时，然后测定细胞毒性所获得的结果。在Ff-201B7人类iPS细胞的情况下，当将302a-5p响应性puroR mRNA (302-PuroR)引入细胞时，与引入对miRNA不响应的puroR mRNA (Contl-PurpR)的情况相比，活细胞的比率显著降低(图11b，最左边的图和左边的第二个图)。相比之下，在mDA细胞的情况下，即使将puroR mRNA(Cont1-PurpR)引入细胞中，或者即使将302a-5p响应性puroR mRNA引入细胞中，也几乎未发现活细胞的比率变化。
将待诱导的mDA细胞或Ff-201B7人类iPS细胞的单独培养物或其共培养物接种在24孔板中，然后将它们在iPS细胞相应的培养基或 mDA细胞相应的培养基中培养，或者在包含两种类型培养基(与 ROCK抑制剂一起)的相应混合培养基中培养。第二天，将培养基更换为不含有ROCK抑制剂的培养基，然后将50ng的puroR mRNA或 302a-5p响应性puroR mRNA引入细胞。表达后4小时，将培养基更换为新鲜培养基，然后向其中加入2μg/ml的嘌呤霉素。二十小时后，用 PBS洗涤细胞两次，然后轻轻搅动，从而收获附着的剩余细胞。将收获的细胞用Alexa-488-缀合的抗人类TRA-1-60抗体(BD laboratories) 染色。图11c的上部视图示出通过用BD Accuri测量和门控活细胞获得的结果。在Ff-201B7人类iPS细胞的单独培养系统的情况下，如预期的，当将302a-5p响应性puroR mRNA引入细胞时，FL-1(TRA-1-60) 的直方图相对于几乎所有背景大大减少，而当将puroR mRNA引入细胞时没有观察到这种影响。在从其中已经引入了302a-5p响应性puroR mRNA的共培养系统获得的柱状图中，TRA-1-60阳性峰显著降低。下部视图示出在所有条件下TRA-1-60阳性细胞的绝对数目。
序列表
<110> 京都大学
<120> 选择分化细胞的方法
<130> 2653-PCT
<150> JP2014-146070
<151> 2014-07-16
<160> 33
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1019
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 报告子
<400> 1
gggcgaauua agagagaaaa gaagaguaag aagaaauaua agacaccggu cgccaccaug 60
ggauccguga gcaagggcga ggagcuguuc accggggugg ugcccauccu ggucgagcug 120
gacggcgacg uaaacggcca caaguucagc guguccggcg agggcgaggg cgaugccacc 180
uacggcaagc ugacccugaa guucaucugc accaccggca agcugcccgu gcccuggccc 240
acccucguga ccacccugac cuacggcgug cagugcuuca gccgcuaccc cgaccacaug 300
aagcagcacg acuucuucaa guccgccaug cccgaaggcu acguccagga gcgcaccauc 360
uucuucaagg acgacggcaa cuacaagacc cgcgccgagg ugaaguucga gggcgacacc 420
cuggugaacc gcaucgagcu gaagggcauc gacuucaagg aggacggcaa cauccugggg 480
cacaagcugg aguacaacua caacagccac aacgucuaua ucauggccga caagcagaag 540
aacggcauca aggugaacuu caagauccgc cacaacaucg aggacggcag cgugcagcuc 600
gccgaccacu accagcagaa cacccccauc ggcgacggcc ccgugcugcu gcccgacaac 660
cacuaccuga gcacccaguc cgcccugagc aaagacccca acgagaagcg cgaucacaug 720
guccugcugg aguucgugac cgccgccggg aucacucucg gcauggacga gcuguacaag 780
agaucucaua ugcaucucga gugauagucu agaccuucug cggggcuugc cuucuggcca 840
ugcccuucuu cucucccuug caccuguacc ucuuggucuu ugaauaaagc cugaguagga 900
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 960
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 1019
<210> 2
<211> 1018
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 报告子
<400> 2
ggucagaucc gcuaggaucc uacuaaaaca uggaagcacu uacaccgguc gccaccaugg 60
gauccgugag caagggcgag gagcuguuca ccgggguggu gcccauccug gucgagcugg 120
acggcgacgu aaacggccac aaguucagcg uguccggcga gggcgagggc gaugccaccu 180
acggcaagcu gacccugaag uucaucugca ccaccggcaa gcugcccgug cccuggccca 240
cccucgugac cacccugacc uacggcgugc agugcuucag ccgcuacccc gaccacauga 300
agcagcacga cuucuucaag uccgccaugc ccgaaggcua cguccaggag cgcaccaucu 360
ucuucaagga cgacggcaac uacaagaccc gcgccgaggu gaaguucgag ggcgacaccc 420
uggugaaccg caucgagcug aagggcaucg acuucaagga ggacggcaac auccuggggc 480
acaagcugga guacaacuac aacagccaca acgucuauau cauggccgac aagcagaaga 540
acggcaucaa ggugaacuuc aagauccgcc acaacaucga ggacggcagc gugcagcucg 600
ccgaccacua ccagcagaac acccccaucg gcgacggccc cgugcugcug cccgacaacc 660
acuaccugag cacccagucc gcccugagca aagaccccaa cgagaagcgc gaucacaugg 720
uccugcugga guucgugacc gccgccggga ucacucucgg cauggacgag cuguacaaga 780
gaucucauau gcaucucgag ugauagucua gaccuucugc ggggcuugcc uucuggccau 840
gcccuucuuc ucucccuugc accuguaccu cuuggucuuu gaauaaagcc ugaguaggaa 900
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 960
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaa 1018
<210> 3
<211> 1057
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 报告子
<400> 3
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ggauccguga gcaagggcga ggagcuguuc accggggugg ugcccauccu ggucgagcug 120
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acccucguga ccacccugac cuacggcgug cagugcuuca gccgcuaccc cgaccacaug 300
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cuggugaacc gcaucgagcu gaagggcauc gacuucaagg aggacggcaa cauccugggg 480
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guccugcugg aguucgugac cgccgccggg aucacucucg gcauggacga gcuguacaag 780
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<210> 4
<211> 981
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 报告子
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gaguucaucu acaaggugaa gcugcgcggc accaacuucc ccuccgacgg ccccguaaug 480
cagaagaaga ccaugggcug ggaggccucc uccgagcgga uguaccccga ggacggcgcc 540
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uuugaauaaa gccugaguag gaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 900
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 960
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa a 981
<210> 5
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
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caccggtcgc caccatggga tccgtgagca agggc 35
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<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 6
gccccgcaga aggtctagac tatcactcga gatgcatatg agatc 45
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 7
caccggtcgc caccatggtg agcaagggcg aggaggat 38
<210> 8
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 8
gccccgcaga aggtctagat ttacttgtac agctcgtcca tgccg 45
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<223> 模板
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cagtgaattg taatacgact cactataggg cgaattaaga gagaaaagaa gagtaagaag 60
aaatataaga caccggtcgc caccatg 87
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 10
cagtgaattg taatacgact cactatag 28
<210> 11
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 11
catggtggcg accggtgtct tatatttctt cttactc 37
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<211> 92
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 模板
<400> 12
tctagacctt ctgcggggct tgccttctgg ccatgccctt cttctctccc ttgcacctgt 60
acctcttggt ctttgaataa agcctgagta gg 92
<210> 13
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 13
tctagacctt ctgcggggc 19
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
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tttttttttt tttttttttt cctactcagg ctttattcaa agaccaag 48
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<212> DNA
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<223> 引物
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tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 60
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 120
cctactcagg ctttattca 139
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
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ctcactatag gtcagatccg ctaggatcct actaaaacat ggaagcactt acaccggtcg 60
ccaccatg 68
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<223> 引物
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gctaatacga ctcactatag gtcagatccg ctaggatc 38
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 18
tctagacctt ctgcggggcc tactaaaaca tggaagcact tactactaaa acatggaagc 60
acttactact aaaacatgga agcacttact actaaaacat ggaagcactt atgaataaag 120
cctgagtagg aaaaaaaaaa aaaaaaaa 148
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 报告子
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gggcgaatta agagagaaaa gaagagtaag aagaaatata agacaccggt cgccaccatg 60
gtgagcgtga tcaagcccga gatgaagatc aagctgtgca tgaggggcac cgtgaacggc 120
cacaacttcg tgatcgaggg cgagggcaag ggcaacccct acgagggcac ccagatcctg 180
gacctgaacg tgaccgaggg cgcccccctg cccttcgcct acgacatcct gaccaccgtg 240
ttccagtacg gcaacagggc cttcaccaag taccccgccg acatccagga ctacttcaag 300
cagaccttcc ccgagggcta ccactgggag aggagcatga cctacgagga ccagggcatc 360
tgcaccgcca ccagcaacat cagcatgagg ggcgactgct tcttctacga catcaggttc 420
gacggcacca acttcccccc caacggcccc gtgatgcaga agaagaccct gaagtgggag 480
cccagcaccg agaagatgta cgtggaggac ggcgtgctga agggcgacgt gaacatgagg 540
ctgctgctgg agggcggcgg ccactacagg tgcgacttca agaccaccta caaggccaag 600
aaggaggtga ggctgcccga cgcccacaag atcgaccaca ggatcgagat cctgaagcac 660
gacaaggact acaacaaggt gaagctgtac gagaacgccg tggccaggta ctccatgctg 720
cccagccagg ccaagtgaat ctagaccttc tgcggggctt gccttctggc catgcccttc 780
ttctctccct tgcacctgta cctcttggtc tttgaataaa gcctgagtag gaaaaaaaaa 840
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 900
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa a 951
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<211> 956
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 报告子
<400> 20
ggttccgcga tcgcggatcc agcaagtaca tccacgttta agtagatcca ccggtcgcca 60
ccatggtgag cgtgatcaag cccgagatga agatcaagct gtgcatgagg ggcaccgtga 120
acggccacaa cttcgtgatc gagggcgagg gcaagggcaa cccctacgag ggcacccaga 180
tcctggacct gaacgtgacc gagggcgccc ccctgccctt cgcctacgac atcctgacca 240
ccgtgttcca gtacggcaac agggccttca ccaagtaccc cgccgacatc caggactact 300
tcaagcagac cttccccgag ggctaccact gggagaggag catgacctac gaggaccagg 360
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ggttcgacgg caccaacttc ccccccaacg gccccgtgat gcagaagaag accctgaagt 480
gggagcccag caccgagaag atgtacgtgg aggacggcgt gctgaagggc gacgtgaaca 540
tgaggctgct gctggagggc ggcggccact acaggtgcga cttcaagacc acctacaagg 600
ccaagaagga ggtgaggctg cccgacgccc acaagatcga ccacaggatc gagatcctga 660
agcacgacaa ggactacaac aaggtgaagc tgtacgagaa cgccgtggcc aggtactcca 720
tgctgcccag ccaggccaag tgaatctaga ccttctgcgg ggcttgcctt ctggccatgc 780
ccttcttctc tcccttgcac ctgtacctct tggtctttga ataaagcctg agtaggaaaa 840
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 900
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa 956
<210> 21
<211> 956
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 报告子
<400> 21
ggttccgcga tcgcggatcc tcaccattgc taaagtgcaa ttagatcaca ccggtcgcca 60
ccatggtgag cgtgatcaag cccgagatga agatcaagct gtgcatgagg ggcaccgtga 120
acggccacaa cttcgtgatc gagggcgagg gcaagggcaa cccctacgag ggcacccaga 180
tcctggacct gaacgtgacc gagggcgccc ccctgccctt cgcctacgac atcctgacca 240
ccgtgttcca gtacggcaac agggccttca ccaagtaccc cgccgacatc caggactact 300
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gggagcccag caccgagaag atgtacgtgg aggacggcgt gctgaagggc gacgtgaaca 540
tgaggctgct gctggagggc ggcggccact acaggtgcga cttcaagacc acctacaagg 600
ccaagaagga ggtgaggctg cccgacgccc acaagatcga ccacaggatc gagatcctga 660
agcacgacaa ggactacaac aaggtgaagc tgtacgagaa cgccgtggcc aggtactcca 720
tgctgcccag ccaggccaag tgaatctaga ccttctgcgg ggcttgcctt ctggccatgc 780
ccttcttctc tcccttgcac ctgtacctct tggtctttga ataaagcctg agtaggaaaa 840
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 900
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa 956
<210> 22
<211> 989
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 报告子
<400> 22
gggcgaatta agagagaaaa gaagagtaag aagaaatata agacaccggt cgccaccatg 60
ggatccagcg agctgattaa ggagaacatg cacatgaagc tgtacatgga gggcaccgtg 120
gacaaccatc acttcaagtg cacatccgag ggcgaaggca agccctacga gggcacccag 180
accatgagaa tcaaggtggt cgagggcggc cctctcccct tcgccttcga catcctggct 240
actagcttcc tctacggcag caagaccttc atcaaccaca cccagggcat ccccgacttc 300
ttcaagcagt ccttccctga gggcttcaca tgggagagag tcaccacata cgaagacggg 360
ggcgtgctga ccgctaccca ggacaccagc ctccaggacg gctgcctcat ctacaacgtc 420
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aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 989
<210> 23
<211> 869
<212> DNA
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<220>
<223> 报告子
<400> 23
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gtcgaagcgg gggcggtgtt cgccgagatc ggcccgcgca tggccgagtt gagcggttcc 360
cggctggccg cgcagcaaca gatggaaggc ctcctggcgc cgcaccggcc caaggagccc 420
gcgtggttcc tggccaccgt cggcgtctcg cccgaccacc agggcaaggg tctgggcagc 480
gccgtcgtgc tccccggagt ggaggcggcc gagcgcgccg gggtgcccgc cttcctggag 540
acctccgcgc cccgcaacct ccccttctac gagcggctcg gcttcaccgt caccgccgac 600
gtcgaggtgc ccgaaggacc gcgcacctgg tgcatgaccc gcaagcccgg tgcctgatct 660
agaccttctg cggggcttgc cttctggcca tgcccttctt ctctcccttg cacctgtacc 720
tcttggtctt tgaataaagc ctgagtagga aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 780
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 840
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 869
<210> 24
<211> 874
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 报告子
<400> 24
ggttccgcga tcgcggatcc agcaagtaca tccacgttta agtagatcca ccggtcgcca 60
ccatgaccga gtacaagccc acggtgcgcc tcgccacccg cgacgacgtc cccagggccg 120
tacgcaccct cgccgccgcg ttcgccgact accccgccac gcgccacacc gtcgatccgg 180
accgccacat cgagcgggtc accgagctgc aagaactctt cctcacgcgc gtcgggctcg 240
acatcggcaa ggtgtgggtc gcggacgacg gcgccgcggt ggcggtctgg accacgccgg 300
agagcgtcga agcgggggcg gtgttcgccg agatcggccc gcgcatggcc gagttgagcg 360
gttcccggct ggccgcgcag caacagatgg aaggcctcct ggcgccgcac cggcccaagg 420
agcccgcgtg gttcctggcc accgtcggcg tctcgcccga ccaccagggc aagggtctgg 480
gcagcgccgt cgtgctcccc ggagtggagg cggccgagcg cgccggggtg cccgccttcc 540
tggagacctc cgcgccccgc aacctcccct tctacgagcg gctcggcttc accgtcaccg 600
ccgacgtcga ggtgcccgaa ggaccgcgca cctggtgcat gacccgcaag cccggtgcct 660
gatctagacc ttctgcgggg cttgccttct ggccatgccc ttcttctctc ccttgcacct 720
gtacctcttg gtctttgaat aaagcctgag taggaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 780
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 840
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaa 874
<210> 25
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 25
caccggtcgc caccatggtg agcgtgatca agcccg 36
<210> 26
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 26
gccccgcaga aggtctagat tcacttggcc tggctgggc 39
<210> 27
<211> 77
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 模板
<400> 27
cgactcacta taggttccgc gatcgcggat ccagcaagta catccacgtt taagtagatc 60
caccggtcgc caccatg 77
<210> 28
<211> 77
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 模板
<400> 28
cgactcacta taggttccgc gatcgcggat cctcaccatt gctaaagtgc aattagatca 60
caccggtcgc caccatg 77
<210> 29
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 29
gctaatacga ctcactatag gttccttaat cgcggatcc 39
<210> 30
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 30
cagtgaattg taatacgact cactataggg c 31
<210> 31
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 31
caccggtcgc caccatgacc gagtacaagc ccacg 35
<210> 32
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 32
gccccgcaga aggtctagat caggcaccgg gcttgc 36
<210> 33
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 33
caccggtcgc caccatggga tccagcgag 29

Claims (7)

1.一种用于在诱导多能干细胞分化后从细胞群中提取分化细胞的方法，包括以下步骤：
(1)将以从5'到3'的顺序包含Cap结构或Anti Reverse Cap Analog、与在多能干细胞中特异性表达的miRNA的靶序列可操作地连接的编码标记蛋白的核酸序列以及poly(A)尾的mRNA引入到细胞群中的步骤，其中所述靶序列存在于编码所述标记蛋白的核酸序列的5'UTR；和
(2)提取所述标记基因已经被翻译的细胞的步骤。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述多能干细胞是人类多能干细胞。
3.根据权利要求2所述的方法，其中在所述人类多能干细胞中特异性表达的所述miRNA是hsa-miR-302b、hsa-miR-302a或hsa-miR-367。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中使用流式细胞仪进行所述提取步骤。
5.一种分化细胞提取试剂盒，其包括以从5'到3'的顺序包含Cap结构或Anti ReverseCap Analog、与在多能干细胞中特异性表达的miRNA的靶序列可操作地连接的编码标记蛋白的核酸序列以及poly(A)尾的mRNA，其中所述靶序列存在于编码所述标记蛋白的核酸序列的5'UTR。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其中所述多能干细胞是人类多能干细胞。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其中在所述人类多能干细胞中特异性表达的所述miRNA是hsa-miR-302b、hsa-miR-302a或hsa-miR-367。
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