JPWO2016010119A1 - 分化細胞の抽出方法 - Google Patents
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Abstract
多能性幹細胞から分化誘導後の未分化細胞が混在する細胞集団から、分化細胞を抽出する方法。以下の工程を含む、分化細胞を抽出する方法；（１）多能性幹細胞に特異的に発現するmiRNAの標的配列と機能的に連結したマーカー遺伝子を含むmRNAを細胞集団に導入する工程、および（２）当該マーカー遺伝子が翻訳された細胞を抽出する工程。
Description
本発明は、多能性幹細胞に特異的に発現するmiRNAを指標として分化細胞を抽出する方法に関する。
iPS細胞やES細胞など多能性幹細胞を所望の細胞へと分化誘導し、当該細胞を体内に投与することによって行われる細胞治療が注目されている。しかし、分化誘導を行った後であっても、未分化の細胞が残存する可能性があり、当該未分化の細胞を含んでなる細胞集団を投与した場合、癌化のおそれが指摘されている（非特許文献１）。
そこで、このような残存する未分化細胞として、多能性幹細胞に高発現する細胞表面マーカーを指標として未分化細胞を除く方法が検討されている。しかし、多能性幹細胞に高発現する細胞表面マーカーが分化細胞に発現しないとは限らず、多能性幹細胞に高発現する細胞表面マーカーが陰性である細胞を抽出しても、完全に未分化細胞を除去することができない可能性がある。また、このような細胞表面マーカーの種類には限りがあり、より特異的なマーカーを見つけることは困難である。
Miura K, et al., Nat Biotechnol. 2009 27:743-745
多能性幹細胞から分化誘導した未分化細胞を含んでなる細胞集団より、分化細胞を抽出する方法が望まれている。
本発明者らは、多能性幹細胞に特異的に発現するmiRNAを利用して、当該miRNAの発現によってマーカー遺伝子の発現が抑制されるmRNAを用いて、分化細胞のみを抽出できることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の特徴を有する：[１]以下の工程を含む、多能性幹細胞から分化誘導後の細胞集団から、分化細胞を抽出する方法；（１）多能性幹細胞に特異的に発現するmiRNAの標的配列と機能的に連結したマーカー遺伝子を含むmRNAを細胞集団に導入する工程、および（２）当該マーカー遺伝子が翻訳された細胞を抽出する工程。
[２]前記多能性幹細胞が、ヒト多能性幹細胞である、[１]に記載の方法。
[３]前記ヒト多能性幹細胞に特異的に発現するmiRNAが、hsa-miR-302b、hsa-miR-302ａ、またはhsa-miR-367である、[２]に記載の方法。
[４]前記抽出する工程が、フローサイトメーターを用いて行われる、[１]から[３]のいずれか一項に記載の方法。
[５]多能性幹細胞に特異的に発現するmiRNAの標的配列と機能的に連結したマーカー遺伝子を含むmRNAを含んでなる、分化細胞抽出キット。
[６]前記多能性幹細胞が、ヒト多能性幹細胞である、[５]に記載のキット。
[７]前記ヒト多能性幹細胞に特異的に発現するmiRNAが、hsa-miR-302b、hsa-miR-302ａ、またはhsa-miR-367である、[６]に記載のキット。
本発明によれば、多能性幹細胞に特異的なmiRNAと機能的に連結したマーカー遺伝子を有するmRNAを利用することで、分化細胞を選択的に抽出することができる。本発明による方法は、マーカーの陽性である細胞を選択することによって成し得るため、当該mRNAの導入効率に影響を受けない点で特に有利である。また、本発明の方法は、細胞にmRNAを導入することにより実施することができ、このmRNAは約１日程度の半減期で分解されて、細胞内から速やかに除去されるため、細胞内におけるウイルス感染やＤＮＡの残存により、ゲノムに損傷を与えるといった問題を生ずることがない。また、サイトメーターを利用した簡便な検出の方法や薬剤耐性遺伝子の導入による薬剤選択によって分化細胞を選択できる点においても有利である。
以下に、本発明を、実施形態を挙げて詳細に説明する。以下の実施形態は本発明を限定するものではない。
本発明は、実施の形態によれば、以下の工程を含む、多能性幹細胞から分化誘導後の未分化細胞が混在し得る細胞集団から、分化細胞を抽出する方法に関する； （１）多能性幹細胞に特異的に発現するmiRNAの標的配列と機能的に連結したマーカー遺伝子を含むmRNAを細胞集団に導入する工程、および（２）当該マーカー遺伝子が翻訳された細胞を抽出する工程。
本発明において多能性幹細胞とは、生体に存在する全ての細胞に分化可能である多能性を有し、かつ、増殖能をも併せもつ幹細胞であり、それには、例えば胚性幹(ES)細胞(J.A. Thomson et al. (1998), Science 282:1145-1147; J.A. Thomson et al. (1995), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:7844-7848;J.A. Thomson et al. (1996), Biol. Reprod., 55:254-259; J.A. Thomson and V.S. Marshall (1998), Curr. Top. Dev. Biol., 38:133-165)、核移植により得られるクローン胚由来の胚性幹(ntES)細胞（T. Wakayama et al. (2001), Science, 292:740-743; S. Wakayama et al. (2005), Biol. Reprod., 72:932-936; J. Byrne et al. (2007), Nature, 450:497-502）、精子幹細胞（「GS細胞」）(M. Kanatsu-Shinohara et al. (2003) Biol. Reprod., 69:612-616; K. Shinohara et al. (2004), Cell, 119:1001-1012)、胚性生殖細胞（「EG細胞」）(Y. Matsui et al. (1992), Cell, 70:841-847; J.L. Resnick et al. (1992), Nature, 359:550-551)、人工多能性幹(iPS)細胞（K. Takahashi and S. Yamanaka (2006) Cell, 126:663-676; K. Takahashi et al. (2007), Cell, 131:861-872; J. Yu et al. (2007), Science, 318:1917-1920; Nakagawa, M.ら,Nat. Biotechnol. 26:101-106 (2008)；WO2007/069666）、培養線維芽細胞や骨髄幹細胞由来の多能性細胞（Muse細胞）（WO2011/007900）などが含まれる。より好ましくは、多能性幹細胞はヒト多能性幹細胞である。
本発明において分化誘導とは、特定の組織細胞やその前駆細胞への分化だけでなく、内胚葉細胞、中胚葉細胞および外胚葉細胞などの多種類の細胞を含む細胞集団への分化も含む。また、本発明が対象とする組織は、皮膚、血管、角膜、腎臓、心臓、肝臓、臍帯、腸、神経、肺、胎盤、膵臓、脳、軟骨、四肢末梢、網膜などが挙げられるがそれらに限定されない。この分化誘導方法は、当業者に周知の方法を用いることができ、特に限定されないが、神経幹細胞は、特開2002-291469へ、膵幹様細胞は、特開2004-121165、造血細胞は、特表2003-505006などが例示される。この他にも、胚葉体の形成による分化誘導法は、特表2003-523766が例示される。
本明細書において、多能性幹細胞から分化誘導後の細胞集団とは、上記多能性幹細胞に対して、分化誘導のための方法を実施した後の細胞集団をいうものとする。分化誘導後の細胞集団には、未分化細胞が混在する場合が存在するが、本発明の方法は、細胞集団が、未分化細胞を含むか否かが未知の場合であっても、同様に実施することができる。好ましくは、多能性幹細胞から分化誘導後の細胞集団とは、多能性幹細胞から分化誘導後の未分化細胞が混在する細胞集団である。
本発明においてmiRNAとは、micro-RNAとも称し、細胞内に存在する長さ１８から２５塩基ほどのRNAである。miRNAは、ＤＮＡから転写された一本鎖ＲＮＡであるpri-mRNAをDroshaと呼ばれる核内酵素により部分切断することによって生じるpre-miRNAを、Dicerによって切断することによって生じる二本鎖RNAのいずれかの一方の鎖を意味する。miRNAの塩基数は、例えば18〜25、好ましくは20〜25、さらに好ましくは21〜23である。約1,000個程度のmiRNA情報を格納したデータベースを利用することができる（例えば、miRBase、http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/ index.shtml）。当業者はこのデータベースから任意のmiRNA情報を引き出すことができ、多能性幹細胞に特異的に発現しているmiRNAを、容易に抽出することが可能である。例えば、miRNAマイクロアレイやリアルタイムPCRなど当業者に利用可能な手法を用いて多能性幹細胞と分化誘導後の細胞との間でmiRNAの発現の違いを確認することができる。これにより、多能性幹細胞において分化誘導後の細胞よりも高度に発現しているmiRNAを多能性幹細胞に特異的に発現しているmiRNAとして、容易に特定することが可能である。なお、多能性幹細胞において発現するmiRNAとは、多能性幹細胞において、上記Dicerによって切断された二本鎖RNAのいずれか一方の鎖が、所定の複数の蛋白質と相互作用して、RNA-induced silencing complex（RISC）を形成した状態にあるmiRNAをいうものとする。
本発明において、多能性幹細胞に特異的に発現しているmiRNAは、文献等により多能性幹細胞に特異的に発現していることが知られているmiRNAであれば特に限定されないが、例えば、hsa-mir-302a、hsa-mir-302b、hsa-mir-302c、hsa-mir-302d、hsa-mir-367、hsa-5201、hsa-mir-92b、hsa-mir-106a、hsa-mir-18b、hsa-mir-20b、hsa-mir-19b-2、hsa-mir-92a-2、hsa-mir-363、hsa-mir-20a、hsa-mir-17、hsa-mir-18a、hsa-mir-19a、hsa-mir-19b-1、hsa-mir-373、hsa-mir-330、hsa-mir-520c、hsa-mir-182、hsa-mir-183、hsa-mir-96、hsa-mir-92a-1、hsa-mir-92a-2、hsa-mir-141、hsa-mir-200c、hsa-mir-27a、hsa-mir-7-1、hsa-mir-7-2、hsa-mir-7-3、hsa-mir-374a、hsa-mir-106b、hsa-mir-93、hsa-mir-25、hsa-mir-584、hsa-mir-374b、hsa-mir-21、hsa-mir-212、hsa-mir-371a、hsa-mir-371b、hsa-mir-372、hsa-mir-200b、hsa-mir-200a、hsa-mir-429のいずれか一方の鎖が挙げられる。この他にも、例えば、Tobias S. Greve,et al., Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 2013.29:213-239に記載されているmiRNAから適宜選択されたmiRNAが例示される。好ましいmiRNAは、hsa-mir-302a、hsa-mir-302b、またはhsa-mir-367であり、さらに好ましくは、hsa-miR-302b-3p、hsa-mir-302a-5p、hsa-mir-367-3pである。
本発明において、多能性幹細胞に特異的に発現するmiRNAの標的配列とは、当該miRNAに特異的に結合可能な配列をいう。miRNA標的配列は、例えば、多能性幹細胞に特異的に発現するmiRNAに相補的な配列であることが好ましい。あるいは、当該miRNA標的配列は、miRNAにおいて認識され得る限り、完全に相補的な配列との不一致（ミスマッチ）を有していても良い。当該miRNAに完全に相補的な配列からの不一致は、所望の細胞において、通常にmiRNAが認識し得る不一致であれば良く、生体内における細胞内の本来の機能では、４０〜５０％ 程度の不一致があっても良いとされている。このような不一致は、特に限定されないが、１塩基、２塩基、３塩基、４塩基、５塩基、６塩基、７塩基、８塩基、９塩基、若しくは１０塩基又は全認識配列の１％、５％、１０％、２０％、３０％、若しくは４０％の不一致が例示される。また、特には、細胞が備えているmRNAのmiRNA標的配列のように、特に、シード領域以外の部分に、すなわちmiRNAの3’側の16 塩基程度に対応する、標的配列内の5’側の領域に、多数の不一致を含んでもよく、シード領域の部分は、不一致を含まないか、１塩基、２塩基、若しくは３塩基の不一致を含んでもよい。
マーカー遺伝子は、細胞内で翻訳されて、マーカーとして機能し、分化細胞の抽出を可能にする任意のマーカー蛋白質をコードするRNA配列であり、マーカー蛋白質に対応する配列ともいうことができる。細胞内で翻訳されてマーカーとして機能しうる蛋白質としては、一例としては、蛍光、発光、呈色、若しくは蛍光、発行又は呈色を補助することなどにより、視覚化し、定量化することができる蛋白質、膜局在蛋白質、薬剤耐性蛋白質等であってよいが、これらには限定されない。
蛍光蛋白質としては、Sirius、EBFPなどの青色蛍光蛋白質；mTurquoise、TagCFP、AmCyan、mTFP1、MidoriishiCyan、CFPなどのシアン蛍光蛋白質；TurboGFP、AcGFP、TagGFP、Azami-Green (例えば、hmAG1)、ZsGreen、EmGFP、EGFP、GFP2、HyPer、などの緑色蛍光蛋白質；TagYFP、EYFP、Venus、YFP、PhiYFP、PhiYFP-m、TurboYFP、ZsYellow、mBananaなどの黄色蛍光蛋白質；KusabiraOrange (例えば、hmKO2)、mOrangeなどの橙色蛍光蛋白質；TurboRFP、DsRed-Express、DsRed2、TagRFP、DsRed-Monomer、AsRed2、mStrawberry、などの赤色蛍光蛋白質；TurboFP602、mRFP1、JRed、KillerRed、mCherry、HcRed、KeimaRed（例えば、hdKeimaRed）、mRasberry、mPlumなどの近赤外蛍光蛋白質が挙げられるが、これらには限定されない。
発光蛋白質としては、イクオリンを例示することができるが、これに限定されない。また、蛍光、発光又は呈色を補助する蛋白質として、ルシフェラーゼ、ホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、βラクタマーゼなどの蛍光、発光又は呈色前駆物質を分解する酵素を例示することができるが、これらには限定されない。ここで本発明において、蛍光、発光又は呈色を補助する物質をマーカーとして使用する場合、分化細胞の抽出において、対応する前駆物質と細胞を接触させること、又は細胞内に対応する前駆物質を導入することによって行われ得る。
膜局在蛋白質としては、多能性幹細胞で内在的に発現していない膜局在蛋白質であれば特に限定されないが、例えば、Ｐ−ｇｐ、ＭＲＰ１、ＭＲＰ２（ｃＭＯＡＴ）、ＭＲＰ３、ＭＲＰ４、ＭＲＰ５，ＭＲＰ６、ＭＤＲ２，およびＭＤＲ３蛋白質を例示することができる。本発明では、導入したmRNAから翻訳された膜局在蛋白質が指標となることから、対象となる分化細胞において内在的に発現していない膜局在蛋白質がより好ましい。薬剤耐性蛋白質としては、例えば、カナマイシン耐性蛋白質、アンピシリン耐性蛋白質、ピューロマイシン耐性蛋白質、ブラストサイジン耐性蛋白質、ゲンタマイシン耐性蛋白質、カナマイシン耐性蛋白質、テトラサイクリン耐性蛋白質、クロラムフェニコール耐性蛋白質などの抗生物質耐性蛋白質を例示することができるが、これらには限定されない。
本発明の方法で細胞集団に導入するために用いるmRNAは、多能性幹細胞に特異的に発現するmiRNAの標的配列と機能的に連結したマーカー遺伝子を含む。本発明の説明において、かかるmRNAを、miRNA応答性レポーターmRNAとも指称する。本発明においてmiRNAの標的配列とマーカー遺伝子が機能的に連結するとは、マーカー蛋白質をコードするオープンリーディングフレーム（ただし、開始コドンを含む。）の５’ＵＴＲ内、３’ＵＴＲ内、及び／または当該オープンリーディングフレーム内に、少なくとも１つのmiRNA標的配列を備えることを意味する。mRNAは、好ましくは、５’末端から、５’から３’の向きに、Cap構造（７メチルグアノシン５’リン酸）、マーカー蛋白質をコードするオープンリーディングフレーム並びに、ポリＡテイルを備え、５’ＵＴＲ内、３’ＵＴＲ内、及び／またはオープンリーディングフレーム内に少なくとも１つのmiRNA標的配列を備える。mRNAにおけるmiRNA標的配列の位置は、５’ＵＴＲであっても、３’ＵＴＲであってもよく、オープンリーディングフレーム内（開始コドンの３’側）であってもよく、これらのすべてにmiRNA標的配列を備えていてもよい。したがって、miRNA標的配列の数は、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つあるいはそれ以上であっても良い。
好ましくは、miRNA標的配列は、５’ＵＴＲに１つ存在する。効率的な翻訳抑制を達成することができるためである。このとき、Cap構造とmiRNA標的配列と間の塩基数及び塩基の種類は、開始コドンとなるAUGを含まず、かつステム構造や立体構造を構成しない限り、任意であってよい。例えば、Cap構造とmiRNA標的配列と間の塩基数は、０〜５０塩基、好ましくは、１０〜３０塩基となるように設計することができる。また、miRNA標的配列と開始コドンと間の塩基数及び塩基の種類は、ステム構造や立体構造を構成しない限り、任意であってよく、miRNA標的配列と開始コドンと間の塩基数は、０〜５０塩基、好ましくは、１０〜３０塩基となるように設計することができる。なお、miRNA標的配列が３’ＵＴＲに４つ存在する場合であっても、翻訳抑制を達成することは可能であることが確認されている。
miRNA応答性レポーターmRNAは、通常のウリジン、シチジンに替えて、シュードウリジン、５−メチルシチジンなどの修飾塩基を含んでいることが好ましい。細胞毒性を低減させるためである。修飾塩基の位置は、ウリジン、シチジンいずれの場合も、独立に、全てあるいは一部とすることができ、一部である場合には、任意の割合でランダムな位置とすることができる。
miRNA応答性レポーターmRNAは、上記に従って配列が決定されれば、遺伝子工学的に既知の任意の方法により当業者が合成することができる。特には、プロモーター配列を含むテンプレートDNAを鋳型として用いたin vitro合成法により、得ることができる。
本発明の一実施態様において、miRNA応答性レポーターmRNAは、１種のみ用いる場合もあり、２種以上、例えば、３種、４種、５種、６種、７種、または８種以上用いる場合もある。多能性幹細胞に特異的に発現する２種以上の異なるmiRNAを指標として分化細胞を抽出する場合には、２種以上のmiRNAにそれぞれ対応する２種以上のmiRNA応答性レポーターmRNAを用いることが好ましい。例えば、２種以上のmiRNA応答性レポーターmRNAを用いる場合、それぞれのmiRNA応答性レポーターmRNAは、miRNA標的配列、マーカー遺伝子ともに、異なることが望ましい。また、２種以上のmiRNA応答性レポーターmRNAを用いる場合、miRNA応答性レポーターmRNAに含まれるmiRNA標的配列の数、miRNA標的配列の５’末端からの距離、並びにmiRNA応答性レポーターmRNAにおけるその他の構造的特徴は、各miRNA応答性レポーターmRNAにおいて異なっていても良い。
本発明の一実施態様においてmiRNA応答性レポーターmRNAを細胞集団に導入する工程（以下、導入工程と指称する）は、リポフェクション法、リポソーム法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム共沈殿法、DEAEデキストラン法、マイクロインジェクション法、遺伝子銃法などを用いて、１種以上のmiRNA応答性レポーターmRNAを直接、細胞集団に含まれる細胞に導入する。異なる２種以上のmiRNA応答性レポーターmRNAを導入する場合には、複数のmRNAを細胞集団に共導入することが好ましい。共導入した２以上のmRNAから発現するマーカー蛋白質の活性比は、細胞集団内において一定であるためである。この時の導入量は、導入される細胞集団、導入するmRNA、導入方法および導入試薬の種類により異なり、所望の翻訳量を得るために当業者は適宜これらを選択することができる。
本発明の一実施態様において、多能性幹細胞から分化誘導後の未分化細胞が混在する細胞集団に本発明のmiRNA応答性レポーターmRNAが導入されると、分化細胞内では、細胞に所定のmiRNAがRISCとして存在しないので、miRNA応答性レポーターmRNAがコードするマーカー遺伝子の翻訳量が抑制されない。つまり、当該マーカー遺伝子の翻訳は、分化細胞内のみにおいて行われる。従って、本願発明の一実施態様において、当該マーカー遺伝子が翻訳された細胞を抽出することで、多能性幹細胞から分化誘導後の未分化細胞が混在する細胞集団から分化細胞のみを選択的に抽出することが可能となる。
当該マーカー遺伝子が翻訳された細胞を抽出する工程を実施する（以下、抽出工程と指称する）。抽出工程では、上記のような、マーカー遺伝子が翻訳され、マーカー蛋白質の発現が確認された細胞を分化細胞として抽出する。すなわち、miRNAの標的配列と機能的に連結したマーカー遺伝子を含むmRNAを導入した細胞集団と、miRNAの標的配列と機能的に連結したマーカー遺伝子を含むmRNAを導入しない細胞集団を比較し、miRNAの標的配列と機能的に連結したマーカー遺伝子を含むmRNAを導入した細胞集団のうち、マーカー蛋白質が発現している細胞を抽出することによって成し得る。
具体的には、抽出工程は、所定の検出装置を用いて、マーカー蛋白質からの信号を検出することにより実施することができる。マーカー蛋白質からの信号の検出は、信号を数値化して定量してもよいし、信号の有無のみの検出でもよい。検出装置としては、フローサイトメーター、イメージングサイトメーター、蛍光顕微鏡、発光顕微鏡、CCDカメラ等が挙げられるが、これらには限定されない。このような検出装置は、マーカー蛋白質により、当業者が適したものを用いることができる。例えば、マーカー蛋白質が、蛍光蛋白質又は発光蛋白質の場合には、フローサイトメーター、イメージングサイトメーター、蛍光顕微鏡、CCDカメラといった検出装置を用いてマーカー蛋白質の発現の有無の確認、及び／または定量が可能である。マーカー蛋白質が、蛍光、発光又は呈色を補助する蛋白質の場合には、発光顕微鏡、CCDカメラ、ルミノメーターといった検出装置を用いたマーカー蛋白質の発現の有無の確認、及び／または定量方法が可能である。マーカー蛋白質が、膜局在蛋白質の場合には、抗体などの細胞表面蛋白質特異的な検出試薬と、上記の検出装置を用いたマーカー蛋白質の発現の有無の確認、及び／または定量方法が可能である他、磁気細胞分離装置(MACS)といった、マーカー蛋白質の定量過程を経ない細胞の単離方法が可能である。マーカー蛋白質が薬剤耐性蛋白質の場合、薬剤投与によりマーカー蛋白質の発現を検出して、生細胞を単離する方法が可能である。
本発明の方法に先立って、任意選択的な工程として、miRNA応答性レポーターmRNAとともにコントロールmRNAを、未分化細胞及び／または分化細胞に共導入して、当該細胞におけるmiRNA応答性レポーターmRNAの翻訳効率を確認する工程を実施することもできる。翻訳効率を確認し、算出することで、標的細胞にmRNAが導入され、miRNA発現により翻訳抑制がおきているか、細胞にmRNAそのものが導入されにくいのか比較検討することができる。このような比較検討により、本発明に用いるmRNAを適宜選択することができる。コントロールmRNAとは、miRNA標的部位を有さず、miRNA応答性レポーターmRNAがコードするマーカー遺伝子と異なるマーカー遺伝子をコードするmRNAをいう。コントロールmRNAは、miRNAの発現に関係なくマーカー蛋白質を発現する。miRNA標的配列が存在しないため、細胞に導入されても、miRNA発現量に応じて翻訳制御されることがないためである。
本発明は、さらには、上述した多能性幹細胞に特異的に発現するmiRNAの標的配列と機能的に連結したマーカー遺伝子を含むmRNAを含んでなる分化細胞抽出キットに関する。本発明のキットには、コントロールmRNAをさらに含んでもよい。また、本発明のキットは、その他に、判別分析手段、例えば、分化細胞の抽出の手順を記載した書面や説明書、分化細胞抽出の手順をコンピューターに実行させるためのプログラム、当該プログラムリスト、当該プログラムを記録した、コンピューターに読み取り可能な記録媒体（例えば、フレキシブルディスク、光ディスク、CD-ROM、CD-R、及びCD-RWなど）、分化細胞の抽出を実行する装置又はシステム（コンピューターなど）を含んでもよい。
以下に、本発明を、実施例を用いてより詳細に説明する。以下の実施例は本発明を限定するものではない。
［miR-302b応答性レポーターmRNAの設計］
蛍光レポーター遺伝子のEGFPをコードし、αグロビンの5’末端側（5’UTR）および3’末端側非翻訳領域（3’UTR）を含むEGFP mRNA（配列番号１）を改変し、5’UTRに１コピーのmiR-302bの標的配列を含むmiR-302b応答性レポーターmRNA（1xT302b-EGFP）（配列番号２）、3’UTRに４コピーのmiR-302bの標的配列を含むmiR-302b応答性レポーターmRNA（EGFP-4xT302b）（配列番号３）をそれぞれ設計した。さらに、コントロールで使用したαグロビンの5’UTRおよび3’UTRを含むmCherry mRNA（配列番号４）を設計した。これらの遺伝子配列を以下に示す。
EGFP-mRNAの遺伝子配列（配列番号１）GGGCGAAUUAAGAGAGAAAAGAAGAGUAAGAAGAAAUAUAAGACACCGGUCGCCACCAUGGGAUCCGUGAGCAAGGGCGAGGAGCUGUUCACCGGGGUGGUGCCCAUCCUGGUCGAGCUGGACGGCGACGUAAACGGCCACAAGUUCAGCGUGUCCGGCGAGGGCGAGGGCGAUGCCACCUACGGCAAGCUGACCCUGAAGUUCAUCUGCACCACCGGCAAGCUGCCCGUGCCCUGGCCCACCCUCGUGACCACCCUGACCUACGGCGUGCAGUGCUUCAGCCGCUACCCCGACCACAUGAAGCAGCACGACUUCUUCAAGUCCGCCAUGCCCGAAGGCUACGUCCAGGAGCGCACCAUCUUCUUCAAGGACGACGGCAACUACAAGACCCGCGCCGAGGUGAAGUUCGAGGGCGACACCCUGGUGAACCGCAUCGAGCUGAAGGGCAUCGACUUCAAGGAGGACGGCAACAUCCUGGGGCACAAGCUGGAGUACAACUACAACAGCCACAACGUCUAUAUCAUGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCAUCAAGGUGAACUUCAAGAUCCGCCACAACAUCGAGGACGGCAGCGUGCAGCUCGCCGACCACUACCAGCAGAACACCCCCAUCGGCGACGGCCCCGUGCUGCUGCCCGACAACCACUACCUGAGCACCCAGUCCGCCCUGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGAUCACAUGGUCCUGCUGGAGUUCGUGACCGCCGCCGGGAUCACUCUCGGCAUGGACGAGCUGUACAAGAGAUCUCAUAUGCAUCUCGAGUGAUAGUCUAGACCUUCUGCGGGGCUUGCCUUCUGGCCAUGCCCUUCUUCUCUCCCUUGCACCUGUACCUCUUGGUCUUUGAAUAAAGCCUGAGUAGGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA下線部は、5’UTRまたは3’UTRを示す。
1xT302b-EGFPの遺伝子配列（配列番号２）GGUCAGAUCCGCUAGGAUCctactaaaacatggaagcacttaCACCGGUCGCCACCAUGGGAUCCGUGAGCAAGGGCGAGGAGCUGUUCACCGGGGUGGUGCCCAUCCUGGUCGAGCUGGACGGCGACGUAAACGGCCACAAGUUCAGCGUGUCCGGCGAGGGCGAGGGCGAUGCCACCUACGGCAAGCUGACCCUGAAGUUCAUCUGCACCACCGGCAAGCUGCCCGUGCCCUGGCCCACCCUCGUGACCACCCUGACCUACGGCGUGCAGUGCUUCAGCCGCUACCCCGACCACAUGAAGCAGCACGACUUCUUCAAGUCCGCCAUGCCCGAAGGCUACGUCCAGGAGCGCACCAUCUUCUUCAAGGACGACGGCAACUACAAGACCCGCGCCGAGGUGAAGUUCGAGGGCGACACCCUGGUGAACCGCAUCGAGCUGAAGGGCAUCGACUUCAAGGAGGACGGCAACAUCCUGGGGCACAAGCUGGAGUACAACUACAACAGCCACAACGUCUAUAUCAUGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCAUCAAGGUGAACUUCAAGAUCCGCCACAACAUCGAGGACGGCAGCGUGCAGCUCGCCGACCACUACCAGCAGAACACCCCCAUCGGCGACGGCCCCGUGCUGCUGCCCGACAACCACUACCUGAGCACCCAGUCCGCCCUGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGAUCACAUGGUCCUGCUGGAGUUCGUGACCGCCGCCGGGAUCACUCUCGGCAUGGACGAGCUGUACAAGAGAUCUCAUAUGCAUCUCGAGUGAUAGUCUAGACCUUCUGCGGGGCUUGCCUUCUGGCCAUGCCCUUCUUCUCUCCCUUGCACCUGUACCUCUUGGUCUUUGAAUAAAGCCUGAGUAGGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA下線部は、5’UTRまたは3’UTRを示し、小文字部は、１コピーのmiR-302bの標的配列を示す。
EGFP-4xT302bの遺伝子配列（配列番号３）GGGCGAAUUAAGAGAGAAAAGAAGAGUAAGAAGAAAUAUAAGACACCGGUCGCCACCAUGGGAUCCGUGAGCAAGGGCGAGGAGCUGUUCACCGGGGUGGUGCCCAUCCUGGUCGAGCUGGACGGCGACGUAAACGGCCACAAGUUCAGCGUGUCCGGCGAGGGCGAGGGCGAUGCCACCUACGGCAAGCUGACCCUGAAGUUCAUCUGCACCACCGGCAAGCUGCCCGUGCCCUGGCCCACCCUCGUGACCACCCUGACCUACGGCGUGCAGUGCUUCAGCCGCUACCCCGACCACAUGAAGCAGCACGACUUCUUCAAGUCCGCCAUGCCCGAAGGCUACGUCCAGGAGCGCACCAUCUUCUUCAAGGACGACGGCAACUACAAGACCCGCGCCGAGGUGAAGUUCGAGGGCGACACCCUGGUGAACCGCAUCGAGCUGAAGGGCAUCGACUUCAAGGAGGACGGCAACAUCCUGGGGCACAAGCUGGAGUACAACUACAACAGCCACAACGUCUAUAUCAUGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCAUCAAGGUGAACUUCAAGAUCCGCCACAACAUCGAGGACGGCAGCGUGCAGCUCGCCGACCACUACCAGCAGAACACCCCCAUCGGCGACGGCCCCGUGCUGCUGCCCGACAACCACUACCUGAGCACCCAGUCCGCCCUGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGAUCACAUGGUCCUGCUGGAGUUCGUGACCGCCGCCGGGAUCACUCUCGGCAUGGACGAGCUGUACAAGAGAUCUCAUAUGCAUCUCGAGUGAUAGUCUAGACCUUCUGCGGGGCcuacuaaaacauggaagcacuuacuacuaaaacauggaagcacuuacuacuaaaacauggaagcacuuacuacuaaaacauggaagcacuuaUGAAUAAAGCCUGAGUAGGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA下線部は、5’ UURまたは3’UTRを示し、小文字部は、４コピーのmiR-302bの標的配列を示す。
mCherry-mRNAの遺伝子配列（配列番号４）GGGCGAAUUAAGAGAGAAAAGAAGAGUAAGAAGAAAUAUAAGACACCGGUCGCCACCAUGGUGAGCAAGGGCGAGGAGGAUAACAUGGCCAUCAUCAAGGAGUUCAUGCGCUUCAAGGUGCACAUGGAGGGCUCCGUGAACGGCCACGAGUUCGAGAUCGAGGGCGAGGGCGAGGGCCGCCCCUACGAGGGCACCCAGACCGCCAAGCUGAAGGUGACCAAGGGUGGCCCCCUGCCCUUCGCCUGGGACAUCCUGUCCCCUCAGUUCAUGUACGGCUCCAAGGCCUACGUGAAGCACCCCGCCGACAUCCCCGACUACUUGAAGCUGUCCUUCCCCGAGGGCUUCAAGUGGGAGCGCGUGAUGAACUUCGAGGACGGCGGCGUGGUGACCGUGACCCAGGACUCCUCCCUGCAGGACGGCGAGUUCAUCUACAAGGUGAAGCUGCGCGGCACCAACUUCCCCUCCGACGGCCCCGUAAUGCAGAAGAAGACCAUGGGCUGGGAGGCCUCCUCCGAGCGGAUGUACCCCGAGGACGGCGCCCUGAAGGGCGAGAUCAAGCAGAGGCUGAAGCUGAAGGACGGCGGCCACUACGACGCUGAGGUCAAGACCACCUACAAGGCCAAGAAGCCCGUGCAGCUGCCCGGCGCCUACAACGUCAACAUCAAGUUGGACAUCACCUCCCACAACGAGGACUACACCAUCGUGGAACAGUACGAACGCGCCGAGGGCCGCCACUCCACCGGCGGCAUGGACGAGCUGUACAAGUAAAUCUAGACCUUCUGCGGGGCUUGCCUUCUGGCCAUGCCCUUCUUCUCUCCCUUGCACCUGUACCUCUUGGUCUUUGAAUAAAGCCUGAGUAGGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA下線部は、5’UTRまたは3’UTRを示す。
［IVT（in vitro translation）テンプレートDNAの構築］
IVTテンプレートDNAは、5’UTR断片、マーカー遺伝子のORF領域の断片、3’UTR断片を混合し、PCRによって連結（融合PCR）することで作製した。これらの断片は、PCR増幅によって作製、またはオリゴDNAとして購入して用いた。以下に、EGFP mRNA、mCherry mRNA、1xT302b-EGFP及びEGFP-4xT302bの４つのIVTテンプレートDNAの作製法の詳細を記す。
EGFP及びmCherry遺伝子ORF領域のPCR増幅を以下のように行った。pCTp-EGFP（Saito H ,et al., Nat Commun. 2:160 2011）をテンプレートに、TAPEGFP_IVTfwd (KEC-67) （配列番号５）及びTAP_IVTrev (KEC-23) （配列番号６）を用いてPCR増幅を行い、EGFP_ORF断片を作製した。同様にpCR2.1-mCherry（Tanaka A, et al., PLoS One. 2013 Apr 23;8(4):e61540.）をテンプレートに、mCherry_IVTfwd (KEC-888) （配列番号７）およびmCherry_IVTrev (KEC-889) （配列番号８）を用いてPCR増幅を行い、mCherry_ORF断片を作製した。
さらに、標的配列を含まない5’UTR断片及び3’UTR断片のPCR増幅を以下のように行った。5’UTR断片は、 IVT 5primeUTR (KEC-62) （配列番号９）をテンプレートに、TAP_T7_1G (KEC-876) （配列番号１０）及びRev5UTR (KEC-1) （配列番号１１）をプライマーとして用いてPCR増幅し作製した。3’UTR断片は、IVT 3primeUTR (KEC-63) （配列番号１２）をテンプレートに、Fwd3UTR (KEC-4) （配列番号１３）及びRev3UTR2T20 (KEC-65) （配列番号１４）をプライマーとして用いてPCR増幅し作製した。
EGFP mRNA及びmCherry mRNA のIVTテンプレートDNAは、上述した5’UTR断片、3’UTR断片及びEGFP_ORF断片またはmCherry _ORF断片を混合し、TAP_T7_1G 及び3UTR120A (KEC-308)（配列番号１５）をプライマーに用いて融合PCRを行い作製した。
1xT302b-EGFPのIVTテンプレートDNAは、5UTR-T302b-3p (KTC-004) （配列番号１６）、EGFP_ORF断片、3’UTR断片を混合し、GCT7CMV_del4 (KEC-97)（配列番号１７）及び3UTR120Aをプライマーに用いて融合PCRを行い作製した。
EGFP-4xT302bのIVTテンプレートDNAは、5’UTR断片、EGFP_ORF断片、及び3UTRtemp_4xT302b-3p (KTC-001)オリゴDNA（配列番号１８）を、TAP_T7_1G及び3UTR120Aをプライマーに用いて融合PCRを行い作製した。
上述したプライマーおよびテンプレートなどのオリゴDNAは、適宜製造委託して用いた。その配列は、表１に示す。
上述のとおりＰＣＲ増幅によって得られたIVTテンプレートDNAは、MinElute PCR purification kit (QIAGEN)を用い、製造者の指示に従って精製した。
［mRNAのIVT合成］
mRNAのIVT合成は、Warren L., et al., Cell Stem Cell, 7(5):618-30, 2010の方法を改良したプロトコルを用いて行った。詳細には、上述したIVTテンプレートからMegaScript T7 kit (Ambion)を用いて調製した。このとき、ウリジン三リン酸及びシチジン三リン酸に替えて、シュードウリジン-5’-三リン酸及び5-メチルシチジン-5’-三リン酸(TriLink BioTechnologies)を用いた。反応の前に、グアノシン-5’-三リン酸は、Anti Reverse Cap Analog (New England Biolabs)で５倍希釈して用いた。反応混合液を３７度で４時間インキュベートして、TURBO DNase (Ambion)を添加した後、３７度でさらに３０分インキュベートした。得られたmRNAは、FavorPrep Blood / Cultured Cells total RNA extraction column (Favorgen Biotech)で精製し、Antarctic Phosphatase (New England Biolabs)を用いて、３７度で３０分インキュベートした。その後、RNeasy MiniElute Cleanup Kit (QIAGEN)により、さらに精製した。
［ヒトiPS細胞の拡大培養］
ヒトiPS細胞（201B7、409B2および427F1）は、京都大学山中伸弥氏より譲り受けた。ヒトiPS細胞は、MMC-treated SNL feeder細胞上でPrimate ES cell medium (Reprocell), 5ng/ml bFGF(Reprocell), 0.5% penicilin-streptomysisn (Invitrogen)で培養した。iPS細胞のコロニーがある程度大きくなった時点で継代を行った。継代は、培養液を除去し、D-PBS(Nacalai tesq)でwashし、CTK (Collagenase type 2 (Invitrogen), 2.5% trypsin-EDTA (nacalai tesq), KSR(Invitrogen))を加えD-PBSで２回washし、feeder細胞を除去した。Feeder細胞を除去した培養皿に培養液を加え、セルスクレイパーでiPS細胞をはがし、ピペッティングでiPS細胞のコロニーを解離させた。解離したiPS細胞のコロニーを1:3の割合で新たな培養皿に継代した。フィーダーフリーでの培養はMatrigel (BD) coatしたplateもしくはdishを用い、培地はmTeSR1 (Stem cell technologies)を用いた。培養方法は製造者の指示に従った。
［miR-302b応答性レポーターmRNAによるトランスフェクション］
ヒトiPS細胞をMatrigel (BD)-coated ２４ウェルプレートに播種し、翌日に、１μＬのStemFect (Stemgent)を用いて、製造者の指示に従って、２００ｎgのEGFP mRNAまたは各miR-302b応答性レポーターmRNAをそれぞれiPS細胞へ導入した。導入後、miRNAの効果を検証するため、2pmol,0.5pmol,0pmolのmirVana miRNA inhibitor (Applied Biosciences)の存在下で培養した。
［miR-302b応答性レポーターmRNAを用いたヒトiPS細胞の検出］
EGFP mRNA、および各miR-302b応答性レポーターmRNAをヒトiPS細胞へトランスフェクションし、mirVana miRNA inhibitorの存在下で培養後、フローサイトメトリーにて解析した。1xT302b-EGFPおよびEGFP-4xT302bは、共にmirVana miRNA inhibitorの濃度に応じてEGFPの蛍光量が変化した（図１）。つまり、1xT302b-EGFPとEGFP-4xT302bは多能性を有するヒトiPS細胞内で高発現しているmiR-302bの活性によってEGFPの翻訳量が減少することを示唆している。従って、miR-302b応答性レポーターmRNAを用いることで細胞集団中の、分化誘導し多能性を失った細胞を特異的に認識できる可能性が示された。
［miR-302b応答性レポーターmRNAの翻訳効率］
mCherry mRNAとEGFPまたは1xT302b-EGFPとをヒトiPS細胞（201B7）へ共導入し、mirVana miRNA inhibitorの存在下で培養後、フローサイトメトリーでEGFPおよびmCherryの蛍光強度を測定し、mCherryの蛍光強度に対するEGFPの蛍光強度の割合を算出した。その結果、mirVana miRNA inhibitorによりmiRNAの活性を抑制した場合、mCherryの蛍光強度で補正されたEGFPおよび1xT302b-EGFPのEGFPの蛍光強度は同程度であったが、miRNAの活性を抑制しなかった場合、有意に1xT302b-EGFPの蛍光強度が下がることが確認された（図２）。このことより、1xT302b-EGFPの導入効率が劣るために、iPS細胞でのEGFPの蛍光強度が下がるのではなく、miRNAの活性によってEGFPの蛍光強度が下がることが確認された。この結果は、他のiPS細胞株（409B2および427F1）を用いても同様の結果だった。
［分化誘導細胞の選別］
ヒトiPS細胞をMatrigel (BD)-coated 10cm dishに播種し、レチノイン酸培地（0.5uMレチノイン酸(sigma)、10%FBS(GIBCO)、0.5% Penicilin-streptomycin(Invitrogen)、1%Glutamax(Invitrogen)、1%NEAA(invitrogen)を含んだDMEM-F12 (Invitrogen)）で３日間培養した（Tang C, et al., Nature biotechnology, 29(9):829-34, 2011）。培養後の細胞を培養皿から分離し、Matrigel-coated 10cm dishにmTeSR1 medium(Stem cell technologies)または同培地にて再播種した。さらに、翌日に1xT302b-EGFPをトランスフェクションした。トランスフェクションには24μlのstemfect (stemgent)を用いて、製造者の指示に従って実施した。トランスフェクションの２４時間後に細胞を培養皿から分離し、フローサイトメトリーによりEGFPの蛍光強度を分析した。このとき、抗Tra-1-60抗体（Alexa647, BD）または抗SSEA5抗体（8e11, GeneTex）を用いてRA処理した細胞または処理しなかった細胞も測定し、各表面マーカーについても解析を行った。その結果、RAを処理した細胞の一部は、Tra-1-60陰性であった。SSEA5についても同様であった（図３）。一方、RA処理し、1xT302b-EGFPを導入した細胞において、EGFP陽性の細胞も確認された。さらに、EGFP陽性または陰性、Tra-1-60陽性または陰性、およびSSEA5陽性または陰性の各細胞におけるOCT3/4の発現量を定量PCRで測定したところ、EGFP陽性細胞は陰性細胞に比較して、OCT3/4の発現量が低下していることが確認された（図４）。従って、1xT302b-EGFPを導入し、EGFPが陽性の細胞は、分化した細胞であることが示唆された。さらに、Tra-1-60陽性細胞に対する陰性細胞の発現比または、SSEA5陽性細胞に対する陰性細胞の発現比よりも、EGFPの陰性細胞に対する陽性細胞の発現比はより低かった。このことより、1xT302b-EGFPを用いたEGFPによる分化細胞の抽出は、抗Tra-1-60抗体または抗SSEA5抗体よりも感度が高く抽出できる可能性が示された。
続いて、フローサイトメトリーによって、分離したEGFP陽性細胞またはTra-1-60陰性細胞を、matrigel-coatした6well-plateに播種し、mTeSR1培地もしくはレチノイン酸培地で５日間培養した。このとき培地は、２日に一度交換した。得られた細胞を、アルカリフォスファターゼ染色キット(sigma)を用いて染色した。1xT302b-EGFPをトランスフェクションしたEGFP positiveの細胞においては、アルカリフォスファターゼ染色陽性細胞（未分化細胞）の残存量が顕著に減少した（図５）。従って、1xT302b-EGFPを用いることで、未分化細胞と分化細胞が混在した細胞集団から、未分化細胞の混入なく選択的に分化細胞を選別できることが示された。一方、ソートしたTra-1-60陰性細胞では、未分化細胞が混入するおそれがあることが確認された。
続いて、未分化細胞の完全な除去を実現するために、上位10%EGFP陽性、上位20%EGFP陽性の細胞をフローサイトメトリーにてソートした（図６Ａ）。ソートサンプルを上述の方法で５日間培養し、アルカリフォスファターゼ染色した。その結果、上位10%EGFP陽性細胞および上位20%EGFP細胞のいずれにおいてもアルカリフォスファターゼ染色される未分化細胞は全く見られなかった（図６Ｂ）。従って、上位20％EGFP陽性の細胞であっても未分化細胞が混入しないことが示された。
［302a-5p、367-3p応答性レポーターmRNAの設計］
蛍光レポーター遺伝子のhmAG1をコードし、αグロビンの5’末端側（5’UTR）および3’末端側非翻訳領域（3’UTR）を含むhmAG1-mRNA（配列番号１９）を改変し、5’UTRに１コピーのmiR-302a-5pの標的配列を含むmiR-302a-5p応答性レポーターmRNA（配列番号２０）、5’UTRに１コピーのmiR-367-3pの標的配列を含むmiR-367-3p応答性レポーターmRNA（配列番号２１）をそれぞれ設計した。さらに、トランスフェクションの標準化のために、コントロールとして使用する、αグロビンの5’UTRおよび3’UTRを含むtagBFP mRNA（配列番号２２）を設計した。さらに、薬物耐性遺伝子としてピューロマイシン耐性遺伝子を含むPuromycinR-mRNA（配列番号２３）を改変し、5’UTRに１コピーのmiR-302a-5pの標的配列を含む302a-5p 応答性 PuromycinR-mRNA（配列番号２４）を設計した。mRNAは、これらの遺伝子配列を以下に示す。
hmAG1-mRNAの遺伝子配列（配列番号１９）
GGGCGAATTAAGAGAGAAAAGAAGAGTAAGAAGAAATATAAGACACCGGTCGCCACCatgGTGAGCGTGATCAAGCCCGAGATGAAGATCAAGCTGTGCATGAGGGGCACCGTGAACGGCCACAACTTCGTGATCGAGGGCGAGGGCAAGGGCAACCCCTACGAGGGCACCCAGATCCTGGACCTGAACGTGACCGAGGGCGCCCCCCTGCCCTTCGCCTACGACATCCTGACCACCGTGTTCCAGTACGGCAACAGGGCCTTCACCAAGTACCCCGCCGACATCCAGGACTACTTCAAGCAGACCTTCCCCGAGGGCTACCACTGGGAGAGGAGCATGACCTACGAGGACCAGGGCATCTGCACCGCCACCAGCAACATCAGCATGAGGGGCGACTGCTTCTTCTACGACATCAGGTTCGACGGCACCAACTTCCCCCCCAACGGCCCCGTGATGCAGAAGAAGACCCTGAAGTGGGAGCCCAGCACCGAGAAGATGTACGTGGAGGACGGCGTGCTGAAGGGCGACGTGAACATGAGGCTGCTGCTGGAGGGCGGCGGCCACTACAGGTGCGACTTCAAGACCACCTACAAGGCCAAGAAGGAGGTGAGGCTGCCCGACGCCCACAAGATCGACCACAGGATCGAGATCCTGAAGCACGACAAGGACTACAACAAGGTGAAGCTGTACGAGAACGCCGTGGCCAGGTACTCCATGCTGCCCAGCCAGGCCAAGtgaATCTAGACCTTCTGCGGGGCTTGCCTTCTGGCCATGCCCTTCTTCTCTCCCTTGCACCTGTACCTCTTGGTCTTTGAATAAAGCCTGAGTAGGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
開始コドン及び終止コドンは小文字で示した。下線部は、5’UTRまたは3’UTRを示す。
302a-5p 応答性hmAG1- mRNAの遺伝子配列（配列番号２０）
GGTTCCGCGATCGCGGATCCagcaagtacatccacgtttaagtAGATCCACCGGTCGCCACCatgGTGAGCGTGATCAAGCCCGAGATGAAGATCAAGCTGTGCATGAGGGGCACCGTGAACGGCCACAACTTCGTGATCGAGGGCGAGGGCAAGGGCAACCCCTACGAGGGCACCCAGATCCTGGACCTGAACGTGACCGAGGGCGCCCCCCTGCCCTTCGCCTACGACATCCTGACCACCGTGTTCCAGTACGGCAACAGGGCCTTCACCAAGTACCCCGCCGACATCCAGGACTACTTCAAGCAGACCTTCCCCGAGGGCTACCACTGGGAGAGGAGCATGACCTACGAGGACCAGGGCATCTGCACCGCCACCAGCAACATCAGCATGAGGGGCGACTGCTTCTTCTACGACATCAGGTTCGACGGCACCAACTTCCCCCCCAACGGCCCCGTGATGCAGAAGAAGACCCTGAAGTGGGAGCCCAGCACCGAGAAGATGTACGTGGAGGACGGCGTGCTGAAGGGCGACGTGAACATGAGGCTGCTGCTGGAGGGCGGCGGCCACTACAGGTGCGACTTCAAGACCACCTACAAGGCCAAGAAGGAGGTGAGGCTGCCCGACGCCCACAAGATCGACCACAGGATCGAGATCCTGAAGCACGACAAGGACTACAACAAGGTGAAGCTGTACGAGAACGCCGTGGCCAGGTACTCCATGCTGCCCAGCCAGGCCAAGtgaATCTAGACCTTCTGCGGGGCTTGCCTTCTGGCCATGCCCTTCTTCTCTCCCTTGCACCTGTACCTCTTGGTCTTTGAATAAAGCCTGAGTAGGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
開始コドン及び終止コドンは小文字で示し、miRNA標的配列は小文字で示した。下線部は、5’UTRまたは3’UTRを示す。
GGTTCCGCGATCGCGGATCCagcaagtacatccacgtttaagtAGATCCACCGGTCGCCACCatgGTGAGCGTGATCAAGCCCGAGATGAAGATCAAGCTGTGCATGAGGGGCACCGTGAACGGCCACAACTTCGTGATCGAGGGCGAGGGCAAGGGCAACCCCTACGAGGGCACCCAGATCCTGGACCTGAACGTGACCGAGGGCGCCCCCCTGCCCTTCGCCTACGACATCCTGACCACCGTGTTCCAGTACGGCAACAGGGCCTTCACCAAGTACCCCGCCGACATCCAGGACTACTTCAAGCAGACCTTCCCCGAGGGCTACCACTGGGAGAGGAGCATGACCTACGAGGACCAGGGCATCTGCACCGCCACCAGCAACATCAGCATGAGGGGCGACTGCTTCTTCTACGACATCAGGTTCGACGGCACCAACTTCCCCCCCAACGGCCCCGTGATGCAGAAGAAGACCCTGAAGTGGGAGCCCAGCACCGAGAAGATGTACGTGGAGGACGGCGTGCTGAAGGGCGACGTGAACATGAGGCTGCTGCTGGAGGGCGGCGGCCACTACAGGTGCGACTTCAAGACCACCTACAAGGCCAAGAAGGAGGTGAGGCTGCCCGACGCCCACAAGATCGACCACAGGATCGAGATCCTGAAGCACGACAAGGACTACAACAAGGTGAAGCTGTACGAGAACGCCGTGGCCAGGTACTCCATGCTGCCCAGCCAGGCCAAGtgaATCTAGACCTTCTGCGGGGCTTGCCTTCTGGCCATGCCCTTCTTCTCTCCCTTGCACCTGTACCTCTTGGTCTTTGAATAAAGCCTGAGTAGGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
開始コドン及び終止コドンは小文字で示し、miRNA標的配列は小文字で示した。下線部は、5’UTRまたは3’UTRを示す。
367-3p応答性hmAG1- mRNAの遺伝子配列（配列番号２１）
GGTTCCGCGATCGCGGATCCtcaccattgctaaagtgcaattAGATCACACCGGTCGCCACCatgGTGAGCGTGATCAAGCCCGAGATGAAGATCAAGCTGTGCATGAGGGGCACCGTGAACGGCCACAACTTCGTGATCGAGGGCGAGGGCAAGGGCAACCCCTACGAGGGCACCCAGATCCTGGACCTGAACGTGACCGAGGGCGCCCCCCTGCCCTTCGCCTACGACATCCTGACCACCGTGTTCCAGTACGGCAACAGGGCCTTCACCAAGTACCCCGCCGACATCCAGGACTACTTCAAGCAGACCTTCCCCGAGGGCTACCACTGGGAGAGGAGCATGACCTACGAGGACCAGGGCATCTGCACCGCCACCAGCAACATCAGCATGAGGGGCGACTGCTTCTTCTACGACATCAGGTTCGACGGCACCAACTTCCCCCCCAACGGCCCCGTGATGCAGAAGAAGACCCTGAAGTGGGAGCCCAGCACCGAGAAGATGTACGTGGAGGACGGCGTGCTGAAGGGCGACGTGAACATGAGGCTGCTGCTGGAGGGCGGCGGCCACTACAGGTGCGACTTCAAGACCACCTACAAGGCCAAGAAGGAGGTGAGGCTGCCCGACGCCCACAAGATCGACCACAGGATCGAGATCCTGAAGCACGACAAGGACTACAACAAGGTGAAGCTGTACGAGAACGCCGTGGCCAGGTACTCCATGCTGCCCAGCCAGGCCAAGtgaATCTAGACCTTCTGCGGGGCTTGCCTTCTGGCCATGCCCTTCTTCTCTCCCTTGCACCTGTACCTCTTGGTCTTTGAATAAAGCCTGAGTAGGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
開始コドン及び終止コドンは小文字で示し、miRNA標的配列は小文字で示した。下線部は、5’UTRまたは3’UTRを示す。
GGTTCCGCGATCGCGGATCCtcaccattgctaaagtgcaattAGATCACACCGGTCGCCACCatgGTGAGCGTGATCAAGCCCGAGATGAAGATCAAGCTGTGCATGAGGGGCACCGTGAACGGCCACAACTTCGTGATCGAGGGCGAGGGCAAGGGCAACCCCTACGAGGGCACCCAGATCCTGGACCTGAACGTGACCGAGGGCGCCCCCCTGCCCTTCGCCTACGACATCCTGACCACCGTGTTCCAGTACGGCAACAGGGCCTTCACCAAGTACCCCGCCGACATCCAGGACTACTTCAAGCAGACCTTCCCCGAGGGCTACCACTGGGAGAGGAGCATGACCTACGAGGACCAGGGCATCTGCACCGCCACCAGCAACATCAGCATGAGGGGCGACTGCTTCTTCTACGACATCAGGTTCGACGGCACCAACTTCCCCCCCAACGGCCCCGTGATGCAGAAGAAGACCCTGAAGTGGGAGCCCAGCACCGAGAAGATGTACGTGGAGGACGGCGTGCTGAAGGGCGACGTGAACATGAGGCTGCTGCTGGAGGGCGGCGGCCACTACAGGTGCGACTTCAAGACCACCTACAAGGCCAAGAAGGAGGTGAGGCTGCCCGACGCCCACAAGATCGACCACAGGATCGAGATCCTGAAGCACGACAAGGACTACAACAAGGTGAAGCTGTACGAGAACGCCGTGGCCAGGTACTCCATGCTGCCCAGCCAGGCCAAGtgaATCTAGACCTTCTGCGGGGCTTGCCTTCTGGCCATGCCCTTCTTCTCTCCCTTGCACCTGTACCTCTTGGTCTTTGAATAAAGCCTGAGTAGGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
開始コドン及び終止コドンは小文字で示し、miRNA標的配列は小文字で示した。下線部は、5’UTRまたは3’UTRを示す。
tagBFP-mRNAの遺伝子配列（配列番号２２）
GGGCGAATTAAGAGAGAAAAGAAGAGTAAGAAGAAATATAAGACACCGGTCGCCACCatgGGATCCAGCGAGCTGATTAAGGAGAACATGCACATGAAGCTGTACATGGAGGGCACCGTGGACAACCATCACTTCAAGTGCACATCCGAGGGCGAAGGCAAGCCCTACGAGGGCACCCAGACCATGAGAATCAAGGTGGTCGAGGGCGGCCCTCTCCCCTTCGCCTTCGACATCCTGGCTACTAGCTTCCTCTACGGCAGCAAGACCTTCATCAACCACACCCAGGGCATCCCCGACTTCTTCAAGCAGTCCTTCCCTGAGGGCTTCACATGGGAGAGAGTCACCACATACGAAGACGGGGGCGTGCTGACCGCTACCCAGGACACCAGCCTCCAGGACGGCTGCCTCATCTACAACGTCAAGATCAGAGGGGTGAACTTCACATCCAACGGCCCTGTGATGCAGAAGAAAACACTCGGCTGGGAGGCCTTCACCGAGACGCTGTACCCCGCTGACGGCGGCCTGGAAGGCAGAAACGACATGGCCCTGAAGCTCGTGGGCGGGAGCCATCTGATCGCAAACATCAAGACCACATATAGATCCAAGAAACCCGCTAAGAACCTCAAGATGCCTGGCGTCTACTATGTGGACTACAGACTGGAAAGAATCAAGGAGGCCAACAACGAGACCTACGTCGAGCAGCACGAGGTGGCAGTGGCCAGATACTGCGACCTCCCTAGCAAACTGGGGCACAGATCTCATATGCATCTCGAGtgaTCTAGACCTTCTGCGGGGCTTGCCTTCTGGCCATGCCCTTCTTCTCTCCCTTGCACCTGTACCTCTTGGTCTTTGAATAAAGCCTGAGTAGGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
開始コドン及び終止コドンは小文字で示し、下線部は、5’UTRまたは3’UTRを示す。
PuromycinR-mRNAの遺伝子配列（配列番号２３）
GGGCGAATTAAGAGAGAAAAGAAGAGTAAGAAGAAATATAAGACACCGGTCGCCACCatgACCGAGTACAAGCCCACGGTGCGCCTCGCCACCCGCGACGACGTCCCCAGGGCCGTACGCACCCTCGCCGCCGCGTTCGCCGACTACCCCGCCACGCGCCACACCGTCGATCCGGACCGCCACATCGAGCGGGTCACCGAGCTGCAAGAACTCTTCCTCACGCGCGTCGGGCTCGACATCGGCAAGGTGTGGGTCGCGGACGACGGCGCCGCGGTGGCGGTCTGGACCACGCCGGAGAGCGTCGAAGCGGGGGCGGTGTTCGCCGAGATCGGCCCGCGCATGGCCGAGTTGAGCGGTTCCCGGCTGGCCGCGCAGCAACAGATGGAAGGCCTCCTGGCGCCGCACCGGCCCAAGGAGCCCGCGTGGTTCCTGGCCACCGTCGGCGTCTCGCCCGACCACCAGGGCAAGGGTCTGGGCAGCGCCGTCGTGCTCCCCGGAGTGGAGGCGGCCGAGCGCGCCGGGGTGCCCGCCTTCCTGGAGACCTCCGCGCCCCGCAACCTCCCCTTCTACGAGCGGCTCGGCTTCACCGTCACCGCCGACGTCGAGGTGCCCGAAGGACCGCGCACCTGGTGCATGACCCGCAAGCCCGGTGCCtgaTCTAGACCTTCTGCGGGGCTTGCCTTCTGGCCATGCCCTTCTTCTCTCCCTTGCACCTGTACCTCTTGGTCTTTGAATAAAGCCTGAGTAGGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
開始コドン及び終止コドンは小文字で示した。下線部は、5’UTRまたは3’UTRを示す。
302a-5p 応答性 PuromycinR-mRNAの遺伝子配列（配列番号２４）
GGTTCCGCGATCGCGGATCCagcaagtacatccacgtttaagtAGATCCACCGGTCGCCACCatgACCGAGTACAAGCCCACGGTGCGCCTCGCCACCCGCGACGACGTCCCCAGGGCCGTACGCACCCTCGCCGCCGCGTTCGCCGACTACCCCGCCACGCGCCACACCGTCGATCCGGACCGCCACATCGAGCGGGTCACCGAGCTGCAAGAACTCTTCCTCACGCGCGTCGGGCTCGACATCGGCAAGGTGTGGGTCGCGGACGACGGCGCCGCGGTGGCGGTCTGGACCACGCCGGAGAGCGTCGAAGCGGGGGCGGTGTTCGCCGAGATCGGCCCGCGCATGGCCGAGTTGAGCGGTTCCCGGCTGGCCGCGCAGCAACAGATGGAAGGCCTCCTGGCGCCGCACCGGCCCAAGGAGCCCGCGTGGTTCCTGGCCACCGTCGGCGTCTCGCCCGACCACCAGGGCAAGGGTCTGGGCAGCGCCGTCGTGCTCCCCGGAGTGGAGGCGGCCGAGCGCGCCGGGGTGCCCGCCTTCCTGGAGACCTCCGCGCCCCGCAACCTCCCCTTCTACGAGCGGCTCGGCTTCACCGTCACCGCCGACGTCGAGGTGCCCGAAGGACCGCGCACCTGGTGCATGACCCGCAAGCCCGGTGCCtgaTCTAGACCTTCTGCGGGGCTTGCCTTCTGGCCATGCCCTTCTTCTCTCCCTTGCACCTGTACCTCTTGGTCTTTGAATAAAGCCTGAGTAGGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
開始コドン及び終止コドンは小文字で示し、miRNA標的配列は小文字で示した。下線部は、5’UTRまたは3’UTRを示す。
［テンプレート作成及びin vitro transcription (IVT)］ IVTテンプレートDNAは、実施例１と同様に、5’UTR断片、マーカー遺伝子のORF領域の断片、3’UTR断片を混合し、PCRによって連結（融合PCR）することで作製した。これらの断片は、PCR増幅によって作製hmAG1、302a-5p 応答性hmAG1、367-3p応答性hmAG1、tagBFP、PuromycinR、302a-5p 応答性 PuromycinRの６つのIVTテンプレートDNAの作製法の詳細を記す。
hmAG1、tagBFP及びPuromycinR遺伝子ORF領域のPCR増幅を以下のように行った。Plasmid template: S/G2/M Green（Amalgam MBL）をテンプレートに、hmAG1_IVTfwd(KEC-330) （配列番号２５）及びhmAG1_IVTrev(KEC-331) （配列番号２６）を用いてPCR増幅を行い、hmAG1_ORF断片を作製した。同様に、Plasmid template: pTAP_tagBFP (Miki et al., Cell Stem Cell, volume 16, Issue 6, 4 June 2015, Pages 699-711)をテンプレートに、tagBFP_fwd (KED-90) （配列番号３３）およびTAP_IVTrev (KEC-23)を用いてPCR増幅を行い、tagBFP _ORF断片を作製した。同様に、Plasmid template: pPyCAG-Nanog-IP (plasmid 13838, Addgene)をテンプレートに、ORF_PuroR_fwd (STC-035) （配列番号３１）およびORF_PuroR_rev (STC-036)（配列番号３２）を用いてPCR増幅を行い、tagBFP _ORF断片を作製した。
標的配列を含まない5’UTR断片及び3’UTR断片のPCR増幅を以下のように行った。5’UTR断片は、 IVT 5primeUTR (KEC-62)をテンプレートに、TAP_T73GC (SKC-111) （配列番号３０）及びRev5UTR (KEC-1) （配列番号１１）をプライマーとして用いてPCR増幅し作製した。3’UTR断片は、IVT 3primeUTR (KEC-63)をテンプレートに、Fwd3UTR (KEC-4)及びRev3UTR2T20 (KEC-65)をプライマーとして用いてPCR増幅し作製した。 302a-5p標的配列を含む5’UTR、及び367-3p標的配列を含む5’UTRのPCR増幅を以下のように行った。302a-5p-5’UTR断片は、5UTRtemp_T302a-5p(KEC-653) （配列番号２７)をテンプレートに、GCT7pro_5UTR2(KEC-948)（配列番号２９）及びRev5UTR (KEC-1)をプライマーとして用いてPCR増幅し作製した。367-3p-5’UTR断片は、5UTRtemp_T367-3p(KEC-845)（配列番号２８)をテンプレートに、GCT7pro_5UTR2(KEC-948)及びRev5UTR (KEC-1)をプライマーとして用いてPCR増幅し作製した。
hmAG1 mRNA、tagBFP mRNA、及びPuromycinR mRNA のIVTテンプレートDNAは、上述した5’UTR断片、3’UTR断片及びhmAG1_ORF断片、tagBFP_ORF断片またはPuromycinR _ORF断片を混合し、TAP_T73GC (SKC-111) 及び3UTR120A (KEC-308)をプライマーに用いて融合PCRを行い作製した。
302a-5p 応答性hmAG1、367-3p応答性hmAG1のIVTテンプレートDNAは、上述した302a-5p-5’UTR断片または367-3p-5’UTR断片、3’UTR断片及びhmAG1_ORF断片を混合し、GCT7pro_5UTR2(KEC-948) 及び3UTR120A (KEC-308)をプライマーに用いて融合PCRを行い作製した。302a-5p 応答性PuromycinRのIVTテンプレートDNAは、上述した302a-5p-5’UTR断片3’UTR断片及びPuromycinR _ORF断片を混合し、GCT7pro_5UTR2(KEC-948) 及び3UTR120A (KEC-308)をプライマーに用いて融合PCRを行い作製した。
上述したプライマーおよびテンプレートなどのオリゴDNAは、適宜製造委託して用いた。その配列は、表１、表２に示す。 上述のとおりＰＣＲ増幅によって得られたIVTテンプレートDNAは、MinElute PCR purification kit (QIAGEN)を用い、製造者の指示に従って精製した。mRNAのIVT合成は、実施例１と同様にして行った。
［フィーダーフリーヒトiPS細胞の維持]
フィーダーフリーヒトiPS細胞（Ff-hiPSC）は、Nakagawa et al., 2014のプロトコルに従って、StemFit (+bGF)培地中のiMatrix-511(E8) (株式会社ニッピ)上で維持した。ヒトiPS細胞は、8日ごとに継代した。継代前に、６ウェルプレートを少なくとも1時間にわたり、37°Cにおいて、滅菌PBSで0.5μg/cm2に希釈したiMatrix-511(E8)でコーティングした。コーティング後、PBSを吸引し、10 μM のROCK inhibitor (Y-26732)を含む1.5 mlのStemFitと迅速に交換した。ヒトiPS細胞を採取するために、古い培地を吸引し、細胞を、1 mlのPBSで洗浄した。PBSを吸引した後、0.3 mlのTrypSELECT溶液を各ウェルに注入し、プレートをインキュベータに移した。1分後に、余剰の溶液を除去し（move the volume over the cell）、さらに3分間インキュベートした。次いで、インキュベータから出して、TrypSELECT溶液を吸引し、1 ml のPBSで洗浄した。その後、PBSを吸引し、1.5 mlのStemFitをROCK inhibitorとともに各ウェルに加えた。ゴムスクレーパを用いて、細胞を集め、P1000ピペットを用いて１０回ピペティングすることで、単細胞溶液を得た。細胞密度を、トリパンブルー染色とCell Countess (Invitrogen)を用いて細胞密度を計算し、1.3x104/wellとなるように播種し、細胞を均一に分布させた。24時間後、ROCK inhibitorを加えないStemFitに取り換え、以降、1日おきに取り換えた。
［フィーダーフリーヒトiPS細胞からの中脳ドーパミンニューロン細胞への分化]
中脳ドーパミンニューロン細胞への分化誘導は、Doi, D. et al. Stem Cells 30, 935-945 (2012)に記載の方法に従って行った。６ウェルプレートを、ヒトiPS細胞中で上記と同様にしてコーティングし、day 0 分化培地を、1ウェルあたり４ｍｌ加えた。分化は、ROCK inhibitorを加えないday 0 分化培地にヒトiPS細胞の単細胞を懸濁させた細胞溶液を６ウェルプレートに、5x106/wellで播種することで開始した。プレートは、インキュベータに戻す前に穏やかに撹拌した。24時間後、全ての培地を、day 1培地に取り換えた。同様にして、培地の交換は毎日行った。day 0 分化培地からday 2分化培地は1ウェルあたり４ｍｌ、day ３ 分化培地からday ６分化培地は1ウェルあたり６ｍｌ、day 7 分化培地からday 8分化培地は1ウェルあたり８ｍｌ、day ９ 分化培地からday 11分化培地は1ウェルあたり１０ｍｌ添加した。培養後11日の間に、細胞数は2倍になり、おおよそ10x106/wellとなった。細胞は、day 12、 day 20、day 29に継代し、６ウェルプレートに、5x106/wellで播種した。day 12以降、細胞は常に、Neurobasal B27 培地で維持した。培地は毎日交換し、毎回、5 ml/wellを追加した。
［分化効率の評価]
day 12、 day 20、day 29の各継代について、バルクの細胞を、神経系列を標識するCORIN抗体（Kan Research）、フロアプレートマーカー、及びPSA-NCAM抗体で染色し分化効率を評価した。ROCK inhibitorを添加した200 μlの染色バッファ（HBSS：ハンクス液/2% ノックアウト血清、50 μg/ml ペニシリン/ストレプトマイシン、10 μM Y-26732）中の約5x105個の細胞を、1/200のマウス抗ヒトCORIN抗体(Kan Research)または1/100のマウスモノクローナル抗ヒトPSA-NCAM抗体 (MAB5324, Millipore)のいずれかを用いて、並行して染色抗原抗体反応を行った。Alexa 488をコンジュゲートした抗マウスIgG抗体またはIgMを、それぞれCORIN抗体及びPSA-NCAMに対して、1/400で用いて、2次染色した。細胞は、4°Cで30分間染色した。細胞をHBSS培地で二度染色した。死細胞は、7-AADで10分間染色し、FACS分析した。
細胞の測定は、BD FACS aria-IIまたはBD Accuriで、FITC標準フィルター及び7-AADシグナルを用いて行った。死細胞を除去するために、SSC-A intensity (P1)に基づいてゲートを設置し、FSC-W vs FSC-H (P2) 及びSSC-W vs SSC-H (P3)から、2重で除いた。最後に、高7-AADの細胞を除去し、生細胞ゲートを残した(P4/LIVE)。20,000のP4ゲートされた細胞を分析した。CORIN陽性 及び PSA-NCAM陽性ゲートを設置し、0.2%またはそれ未満の細胞を、Alexa 488-IgG または IgGアイソタイプコントロール二次抗体中に保持した。
［中脳ドーパミンニューロン細胞への分化誘導に使用した培地の組成］
Day 0
8GMK、10 μM Y-26732 (和光)、100nM LDN-193189 (Stemgent)、500nM A83-01 (和光)
Day 1-2
8GMK、100 nM LDN-193189 、500 nM A83-01 、2 μM Purmorphamine (Calbiochem)、100 ng/ml ヒト組み換え FGF-8 (和光)
Day 3-7
8GMK、100 nM LDN-193189、500 nM A83-01、2 μM Purmorphamine、100 ng/ml ヒト組み換え FGF-8、30 μM CHIR99021 (Stemgent)
Day 7-11
8GMK、100 nM LDN-193189、30 μM CHIR99021
Day 12 以降
Neurobasal B27、200 μM アスコルビン酸 (Sigma Aldrich)、400 μM dbcAMP (cAMP)、20 ng/ml ヒト組み換え BDNF、10ng/ml ヒト組み換えGDNF
8GMK：Glasgow’s MEM/8% ノックアウト血清/100 μM ピルビン酸ナトリウム 100 μM β-メルカプトエタノール
Neurobasal B27：Neurobasal 培地/2% B27 添加/ 2mM Lグルタミン
［トランスフェクション］
トランスフェクションの前に、細胞は前述のように継代し、iMatrix-511(E8)でコーティングした24ウェルプレートの、ROCK inhibitorを加えた分化培地中に、1〜2x105/wellの密度で播種した。翌日、培地を交換することなく、上述したIVT合成mRNAを、StemFect試薬(Stemgent)を用いて、製造者プロトコルに従い、トランスフェクションした。各トランスフェクションについては、1つのチューブ（tube A）に12.5 μl のStemFect buffer を加えた1μLの試薬を混合し、室温で5分間インキュベートした。他のチューブ(tube B)で、400ngまでのmRNAを12.5 μl のStemFect buffer と混合した。tube Bを、tube Aに滴下し、flick-mixedし、室温で10分間インキュベートした。このトランスフェクション複合体を、細胞に滴下し、撹拌して、インキュベータに入れた。4時間後、トランスフェクション複合体を含有する古い培地を吸引し、ROCK inhibitorを添加していない新鮮な分化培地を加えた。翌日、細胞は、上記と同様に標準フィルターを用いたBD FACS aria-IIまたは、BD AccuriによるFACS分析により、分析した。トランスフェクション効率は、mock transfected cellsに対して評価した。
［302a-5p-、及び367-3p-応答性hmAG1 mRNAの特異的な翻訳抑制］
ヒトiPS細胞に導入した、302a-5p-、及び367-3p-応答性hmAG1 mRNAはいずれも、特異的に翻訳抑制された（図７）。フィーダーフリー ヒトiPS細胞ライン（201B7, 1231A3及び1383D7）並びにHeLa細胞に、50ngのhmAG1 mRNA（ctrl-hmAG1）、302a-5p-応答性hmAG1 mRNA （302a-5p-hmAG1） または367-3p-応答性hmAG1 mRNA（367-3p-hmAG1）を100ngのtagBFPと共に導入し、24時間後、細胞を採取し、BD FACS aria-IIを用いて分析した。結果をドットプロットとして図７ａに示した。これらのmiRNA応答性mRNAを用いた場合でも、ヒトiPS細胞 201B7における特異的な翻訳抑制が、フローサイトメトリー分析において識別された。また、HeLa細胞の結果と比較したところ、201B7, 1231A3, 1383D7のいずれのセルラインにおいても、302a-5p応答性mRNA及び367-3p 応答性mRNAが、 ヒトiPS細胞中で特異的に翻訳抑制された（図７ｂ）。翻訳効率は、tagBFP に対してhmAG1シグナルを標準化することにより計算し、hmAG1 mRNA/tagBFP mRNAを導入した細胞に対する比として示した。
201B7 に、302a-5p応答性mRNA 及び 添加量を変化させた 302a-5p inhibitor を共導入した（図７ｃ）。302a-5p inhibitor濃度は、0.003 nMから30 nMの範囲で変化させ、0.003 nMから順に、シアン、オレンジ、緑、青、赤のドットプロットで示した（図７ｃ右図）。inhibitorを3 nMおよび30 nM添加した場合、それぞれ部分的に及び完全に、302a-5p応答性mRNAによる翻訳抑制を阻害した。一方、302a-5p応答性mRNAには応答しないHeLa細胞に、302a-5p応答性mRNA及び各添加量の302a-5p mimicを共導入した（図７ｄ）。302a-5p mimic濃度を0.003 nMから6 nMの範囲で変化させ、0.003 nMから順に、オレンジ、シアン、紫、青、赤のドットプロットで示した（図７ｄ右図）。この結果から、302a-5p mimicが、302a-5p応答性mRNAの翻訳抑制をすることがしめされた。以上より、302a-5p応答性mRNAが、標的miRNAに特異的であることを示す。
［Ff-ヒトiPS細胞からmDA細胞への分化と、miRNA応答性細胞数の変化］
Ff-ヒトiPS細胞から中脳ドーパミン作動性細胞（mDA細胞）への分化を、302a-5p 応答性ｍRNA及び367-3p応答性ｍRNAを用いてトラッキングした（図８）。day0, day 5, day 7, day 14における、302a-5p応答性mRNAを導入したFf-201B7細胞のフローサイトメトリー分析結果から、分化が進むにつれて、hmAG1の翻訳抑制効果が低くなることが示された（図８ａ）。 また、302a-5p応答性mRNA、367-3p応答性mRNAのいずれを導入した場合でも、分化とともに、302a-5p応答性細胞または367-3p応答性細胞の分布 (青色領域)の減少が示された（図８ｂ）。またFf-ヒトiPS細胞のいずれのセルラインにおいても、同様の結果が確認された。さらに、302a-5p応答性mRNAまたは367-3p応答性mRNAにより、分化の進行が追跡可能であること、及びセルラインによる分化のしやすさの相違が示された。
［Ff-ヒトiPS細胞からmDA細胞への分化とhsa-miRの定量］
Ff-ヒトiPS細胞からmDA細胞への分化のday0、３、５、７、１２、２１において、全RNAを、凍結した細胞ペレットから、トリアゾール抽出及びイソプロパノール沈降により抽出した。RNAは、DNaseで処理した後、miRNA逆転写酵素、及び標的特異的RTプライマー（Applied Biosystems）を用いて逆転写し、TaqMan miRNA probeを用いて増幅した。分化の間のhsa-miR-302a-5p（図９ａ） 及びhsa-miR-367-3p（図９ｂ）のRNU6Bで標準化した比率として、log10スケールで示す。また、Hela細胞及び肝細胞については、day0へ陰性対照として示す。ヒトiPS細胞からmDA 細胞へと分化する間に、各細胞におけるhsa-miR-302a-5p及びhsa-miR-367-3pの発現量が、ダウンレギュレートされることを示す。
［分化細胞中のFf-ヒトiPS細胞の定量］
既知の量のFf-ヒトiPS細胞を添加した、完全に分化したmDA細胞株について、miRNA応答性mRNAを用いて添加した量を測定した（スパイクテスト）（図１０）。24-wellプレート中で、mDA細胞に、０個、100個、500個のFf-201B7 ヒトiPS細胞を添加した。総細胞数は、200,000個とした。これらの細胞に、50 ng のhmAG1 mRNAまたは302a-5p応答性mRNAを100 ngのtagBFPと共導入した。iPS細胞を含まないmDA 細胞に302a-5p応答性mRNAを導入した場合には、302pos （miR-302a-5p陽性）ゲート(repeat 1)及び P5ゲート (repeat 2)を設置しても、翻訳抑制を示す細胞は核にされなかった（最も左側パネルのドットプロット）。repeat 1、repeat 2のいずれの結果も、mDA細胞に対する302a-5p応答性mRNAにより識別したヒトiPS細胞の割合の測定値が、予測値に非常に近接していた。
［miRNA応答性puroR mRNAによる分化細胞抽出］
ピューロマイシン耐性遺伝子をレポーターとして用い、共培養系から残存iPS細胞の除去を試みた（図１１）。図１１aは、残存iPSをピューロマイシン添加による除去スキームを示し、201B7セルラインとmDA細胞の共培養株に、302a-5p-応答性puroR mRNAを導入すると、導入されなかった細胞、及びhsa-miR-302a-5p が高度に発現している細胞は、ピューロマイシン耐性遺伝子を持たない又は当該耐性遺伝子の発現が抑制されるため細胞死に至ることを示す。図１１ｂは、単培養系の実験タイムラインを示す。ここでは、iMatrix-511(E8)でコートされた96ウェルプレートに2x104細胞を播種した。この実験タイムラインにおいては、Ff-201B7 ヒトiPS細胞及びこれから誘導されるmDA細胞を、種々の量のpuroR mRNA(0 〜50 ng)や、ピューロマイシン（0〜10 μg）を含む培地で処理した。WST-1 基質 (Roche)を、２〜４時間加えて細胞毒性をアッセイした結果をグラフに示す（図１１ｂの棒グラフ）。Ff-201B7 ヒトiPS細胞については、miRNAに応答しない、puroR mRNA（Contl-PurpR）を導入した場合と比較して、302a-5p-応答性puroR mRNA（302-PuroR）を導入した場合、生細胞の割合が顕著に減少している（図１１ｂの、左及び左から2番目のグラフ）。これに対し、mDA細胞では、puroR mRNA（Contl-PurpR）を導入しても、302a-5p-応答性puroR mRNAを導入しても、生細胞の割合にほとんど変化はみられなかった。
24ウェルプレートに、Ff-201B7 ヒトiPS細胞もしくはこれから誘導されるmDA細胞の単培養、またはこれらの共培養を播種し、対応するiPS細胞用培地またはmDA細胞用培地で、もしくは二種の混合培地（ROCK inhibitorとともに）で培養した。翌日、培地をROCK inhibitoのないものに変更し、細胞に、50ngのpuroR mRNAまたは302a-5p-応答性 puroR mRNAを導入した。発現の4時間後に、培地を交換し、2 μg/mlのピューロマイシンを添加した。24時間後に、細胞をPBSで2回洗浄し、穏やかに撹拌し、付着して残存している細胞を採取し、Alexa-488コンジュゲート抗ヒトTRA-1-60抗体(BD laboratories)で染色した。図１１ｃの上図は、BD Accuriで測定し、生細胞をゲーティングした結果である。Ff-201B7 ヒトiPS細胞の単培養系では、予測通り、302a-5p 応答性puroR mRNA を導入した場合には、FL-1 (TRA-1-60)ヒストグラムが、ほぼすべてのバックグラウンドに対し大きく減少しているのに対し、puroR mRNAを導入した場合には影響がなかった。302a-5p 応答性puroR mRNAを導入した共培養系から得られたヒストグラムは、TRA-1-60陽性のピークが著しく減少していた。下図は、全てのコンディションにおけるTRA-1-60陽性細胞の絶対数を示す。
Claims (7)
- 以下の工程を含む、多能性幹細胞から分化誘導後の細胞集団から、分化細胞を抽出する方法；（１）多能性幹細胞に特異的に発現するmiRNAの標的配列と機能的に連結したマーカー遺伝子を含むmRNAを細胞集団に導入する工程、および（２）当該マーカー遺伝子が翻訳された細胞を抽出する工程。
- 前記多能性幹細胞が、ヒト多能性幹細胞である、請求項１に記載の方法。
- 前記ヒト多能性幹細胞に特異的に発現するmiRNAが、hsa-miR-302b、hsa-miR-302ａ、またはhsa-miR-367である、請求項２に記載の方法。
- 前記抽出する工程が、フローサイトメーターを用いて行われる、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
- 多能性幹細胞に特異的に発現するmiRNAの標的配列と機能的に連結したマーカー遺伝子を含むmRNAを含んでなる、分化細胞抽出キット。
- 前記多能性幹細胞が、ヒト多能性幹細胞である、請求項５に記載のキット。
- 前記ヒト多能性幹細胞に特異的に発現するmiRNAが、hsa-miR-302b、hsa-miR-302ａ、またはhsa-miR-367である、請求項６に記載のキット。
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