TW202415764A - 改質幹細胞、其製備方法、以及其用途 - Google Patents
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Abstract
本發明關於一種改質幹細胞的製備方法，其係包含以下步驟：細胞培養步驟：將幹細胞以一預定細胞密度在一培養皿的第一培養基中進行培養，經過一第一培養時間後移除該第一培養基而得到第一細胞中間體；活性刺激步驟：將該第一細胞中間體保存在具有一細胞凍存液的冷凍容器中進行一恆溫刺激處理或一變溫刺激處理歷時至少1天以上；產物採集步驟：完成該活性刺激步驟後，將該冷凍容器放置於一解凍溫度的環境中靜置進行解凍，再移除該細胞凍存液即可獲得該改質幹細胞；其中該改質幹細胞能夠釋放出IL-4、IL-5、IL-13、G-CSF、Fractalkine、及EGF中之至少一種或多種。
Description
本發明係關於治療糖尿病的技術領域，特別是關於一種能夠同時釋放出特定的生長因子(Growth factor)、細胞激素(Cytokine)、介白素(Interleukin)的改質幹細胞、其培養方法、及其用途。
糖尿病(Diabetes mellitus)是一種因胰島素分泌不足或作用不良導致醣類代謝異常，致使血糖升高的代謝性疾病。根據國際糖尿病聯盟(International Diabetes Federation, IDF)統計資料顯示，2021年全世界糖尿病人口已達到5.37億人，而台灣糖尿病人口更於2020年突破220萬大關，這代表每10人就有1人是糖尿病患者，且比例有逐年提高趨勢。糖尿病也是導致心臟病、中風、下肢截肢、失明以及腎衰竭等併發症的主要原因之一，顯見糖尿病已對全球人口造成嚴重的健康及經濟負擔。
糖尿病病人因為胰臟細胞不能產生足夠的胰島素 (胰島素缺乏)，或胰島素功能變差 (胰島素阻抗性)，造成葡萄糖無法進入細胞，血糖濃度就會升高，最終形成糖尿病。現行糖尿病的主流治療方式最多僅能控制病情狀況，並且需要終身用藥或使用胰島素，無法根治糖尿病，此外，雖然目前台灣已經有胰臟移植成功案例，然而器官移植之過程繁瑣，除了須要進行器官等待與比對等流程外，不一定能成功等到移植，使得開發出一種方便且不需等待比對皆可以直接適用之治療方式，顯得相當的重要。
目前有研究指出某些特定的生長因子(Growth factor)、細胞激素(Cytokine)、介白素(Interleukin)，例如G-CSF、Fractalkine、EGF、IL-4、IL-5、IL-13等物質能夠對糖尿病及其併發症起到很好的治療效果，若細胞製劑能夠分泌這些有效成份將有機會大幅提升糖尿病及其併發症的治療效益。根據實驗結果發現G-CSF 能夠預防糖尿病腎病的進展，而給予Fractalkine則能促進胰島細胞增加胰島素分泌來改善葡萄糖耐受性、減少胰島β細胞凋亡，以及降低神經發炎進而減少糖尿病視網膜病變，此外， EGF在動物實驗中也被發現能夠增加胰島素分泌並降低糖尿病小鼠的血糖，而IL-4、IL-5、IL-13三種Interleukin更被指出能夠預防胰島炎的發生並減少糖尿病發病率。
然而，現今技術無法同時讓細胞製劑產生上述6種有效物質，只能透過化學物質誘導或基因轉殖的方式單一生產，因此製備出能夠同時產生上述6種有效物質的細胞製劑以節省生產成本成為了細胞製劑用於治療糖尿病的關鍵。
有鑑於此，本發明利用特殊溫度編程製程即可同時增加6種特定Growth factor、Cytokine、Interleukin的產生，相較目前技術利用小分子誘導或基因轉殖來的更有效率且安全，具有新穎性，此外經本發明製程處理後的細胞製劑，其6種有效物質分泌量遠優於未經處理的對照組，具有進步性。透過此發明可用於糖尿病及其併發症治療外，本發明可將生產完的細胞進行凍存及運送，對於產品未來的應用及發展提供廣大的效益，具有產業利用性。
意即，本發明可以提供一種改質幹細胞的製備方法，其係包含以下步驟：細胞培養步驟：將幹細胞以一預定細胞密度在一培養皿的第一培養基中進行培養，經過一第一培養時間後移除該第一培養基而得到第一細胞中間體；活性刺激步驟：將該第一細胞中間體保存在具有一細胞凍存液的冷凍容器中進行一恆溫刺激處理或一變溫刺激處理歷時至少1天以上；產物採集步驟：完成該活性刺激步驟後，將該冷凍容器放置於一解凍溫度的環境中靜置進行解凍，再移除該細胞凍存液即可獲得該改質幹細胞；其中該預定細胞密度為6,000~15,000個細胞/cm
2；該培養皿為帶有含氧官能基團、表面帶負電且具有親水性；該改質幹細胞能夠釋放出G-CSF、Fractalkine、EGF、IL-4、IL-5、及IL-13中之至少一種或多種。
在本發明之一實施例中，該幹細胞為選自脂肪幹細胞、骨髓幹細胞、周邊血幹細胞、及臍帶血幹細胞中之任一種；較佳地，該幹細胞為選自脂肪幹細胞、骨髓幹細胞、及周邊血幹細胞中之任一種；更佳地，該幹細胞為選自脂肪幹細胞、或骨髓幹細胞。
在本發明之一實施例中，其中該培養皿為至少帶有20％以上的含氧官能基團。
在本發明之一實施例中，該恆溫刺激處理為在介於-100℃至-200℃的溫度範圍內之一恆溫環境中進行凍存歷時1~1,825天。
在本發明之一實施例中，該變溫刺激處理為包括：對於該第一細胞中間體，先在一第一冷凍溫度的環境中進行凍存歷時1~1,825天，接著，在一第二冷凍溫度的環境中進行凍存歷時1~7天，然後，在第三冷凍溫度的環境中進行凍存歷時1~365天；其中該第一冷凍溫度、該第二冷凍溫度、及該第三冷凍溫度皆在-50℃以下，該第一冷凍溫度為低於該第二冷凍溫度，並且該第二冷凍溫度高於該第三冷凍溫度。
在本發明之一實施例中，該第一冷凍溫度與該第三冷凍溫度分別為在-100℃至-200℃之間；該第二冷凍溫度為高於該第一冷凍溫度至少30℃以上；該第二冷凍溫度為高於該第三冷凍溫度至少30℃以上。
在本發明之一實施例中，對於該第一細胞中間體，在該第一冷凍溫度、第二冷凍溫度、第三冷凍溫度下進行凍存之變溫刺激處理的總處理天數為至少3天以上。
在本發明之一實施例中，該培養基為包含有1-100mM之N-乙醯半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine, Sigma)、0.05-50mM之抗壞血酸磷酸酯鎂 (L-ascorbic acid 2-phosphate, Sigma)的Keratinocyte-SFM培養基。
另外，本發明還可以提供一種改質幹細胞，其係經由上述的製備方法對於幹細胞進行細胞培養、活性刺激處理所製得，且該改質幹細胞能夠釋放出G-CSF、Fractalkine、EGF、IL-4、IL-5、及IL-13中之至少一種或多種，可以作為用於治療糖尿病及其併發症的細胞製劑。
在本發明之一實施例中，該改質幹細胞除了用於糖尿病治療外，還可用於治療心血管疾病、創傷疾病、肺部疾病、神經系統疾病、免疫疾病、肝臟疾病、內分泌疾病、皮膚疾病、腸胃道疾病、腎臟疾病、血液性疾病、癌症腫瘤疾病、婦科疾病、精神疾病、泌尿系統疾病、眼科疾病、牙科疾病中之任一種疾病。
以下，針對本發明的實施態樣列舉不同的具體實施例而更加詳盡地敘述與說明，以便使本發明的精神與內容更為完備而易於瞭解；然而，本項技藝中具有通常知識者應當明瞭本發明當然不受限於此等實例而已，亦可利用其他相同或均等的功能與步驟順序來達成本發明。
在本文中，本文所用之所有技術及科學術語均具有與本發明所屬領域中之普通技藝人士通常理解之含義相同的含義。另外，除非上下文另外無疑地矛盾，否則本文所用之單數術語應包括複數，且複數術語應包括單數。
除非本文另外定義，否則術語「治療(treat/treating/treatment)」意謂向患有特定疾病或病症的患者投予的動作，其中該動作可以減輕患者之疾病或病症、或降低一或多種症狀之嚴重性、或減慢或延遲疾病或病症之進展。
在本文中，術語「個體」或「患者」可以彼此互換使用。術語「個體」或「患者」係指分別可藉由化合物及/或方法治療之動物，包括但不限於例如狗、貓、馬、綿羊、豬、牛及其類似動物以及人類、非人類靈長類動物。除非另外指定，否則「個體」或「患者」可包括男性及女性。另外，其亦包括適合接受本發明之醫藥組合物及/或方法治療的個體或患者，較佳為人類。
儘管闡述本發明之廣泛範疇的數值範圍及參數為近似值，但在特定實例中所闡述之數值盡可能精確地加以報告。然而，任何數值本身均含有由其各自測試量測中存在之標準偏差必然引起的某些誤差。在本文中，術語「約」通常意謂實際值在特定值或範圍以上或以下10％、5％、1％或0.5％之內。替代地，術語「約」指示當由本領域中之普通技藝人士考慮時，實際值落在平均值之可接受的標準誤差內。除在實例中或另外有明確指示的以外，本文所用之所有範圍、量、值及百分比(例如，用於描述材料之量、時間、溫度、操作條件、量比率及其類似者)應理解為藉由詞「約」進行修飾。因此，除非有相反的明確說明，否則本說明書及所附申請專利範圍中所揭示之數值參數全部為近似值，並且如果需要，可以改變。無論如何，各數值參數應至少依照報告之有效數位之數值且藉由應用普通的捨入技術來解釋。
首先，說明本發明之改質幹細胞的製備方法，包含有以下步驟：
細胞培養步驟：將幹細胞以一預定細胞密度在一培養皿的第一培養基中進行培養，經過一第一培養時間後移除該第一培養基而得到第一細胞中間體。
細胞活性刺激步驟：將該細胞中間體保存在具有一細胞凍存液的冷凍容器中進行一恆溫刺激處理或一變溫刺激處理歷時至少1天以上。
產物採集步驟：完成該活性刺激步驟後，將該冷凍容器放置於一解凍溫度的環境中靜置進行解凍，再移除該細胞凍存液即可獲得該改質幹細胞。
在本發明所指之幹細胞為間質幹細胞(mesenchymal stem cells, MSC)，可以從可自骨髓、脂肪、牙齒、周邊血、臍帶、臍帶血、羊膜、胎盤等人體組織分離而得；一般來說，該幹細胞為選自脂肪幹細胞、骨髓幹細胞、周邊血幹細胞、及臍帶血幹細胞中之任一種；較佳地，該幹細胞為選自脂肪幹細胞、骨髓幹細胞、及周邊血幹細胞中之任一種；更佳地，該幹細胞為選自脂肪幹細胞、或骨髓幹細胞。
前述細胞培養步驟主要是將幹細胞的數量進行擴增，擴增前幹細胞的預定細胞密度一般為6,000~15,000個細胞/cm
2；該第一培養基為包含有1-100mM之N-乙醯半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine, Sigma)、0.05-50 mM之抗壞血酸磷酸酯鎂 (L-ascorbic acid 2-phosphate, Sigma)的Keratinocyte-SFM培養基；而含氧官能基團的培養皿具有帶負電且親水的性質，與一般標準TC(Tissue culture treated)處理的培養皿相比具有更強的親水性及潤濕性，能夠促進細胞附著和擴散。
接著，在活性刺激步驟中主要是將細胞中間體移至低溫環境中，利用恆溫刺激處理或變溫刺激處理來刺激細胞的活性。
在本發明之一實施例中，該恆溫刺激處理為將該細胞中間體移入介於-100℃至-200℃的溫度範圍內之一恆溫環境中進行凍存歷時1~1,825天，較佳為1~1,460天，更佳為1~1,095天，最佳為1~875天。
承上，該恆溫環境中的溫度一般為在-100℃至-200℃之間；較佳為在-140℃至-200℃之間；更佳為在-180℃至-200℃之間。
又，在本發明之另一實施例中，該變溫刺激處理係包含以下步驟：
第一冷凍步驟：對於該細胞中間體，先在一第一冷凍溫度的環境中進行凍存歷時1~1,825天，較佳為靜置1~1,460天，更佳為靜置1~1,095天，最佳為靜置1~887天。
第二冷凍步驟：在一第二冷凍溫度的環境中進行凍存歷時1~7天，較佳為靜置1~5天，更佳為靜置1~4天，最佳為靜置1~3天。
第三冷凍步驟：在第三冷凍溫度的環境中進行凍存歷時1~365天，較佳為靜置1~180天，更佳為靜置1~90天，最佳為靜置1~33天。
根據本發明的技術思想，該第一冷凍溫度、該第二冷凍溫度、及該第三冷凍溫度皆在-50℃以下，且該第一冷凍溫度為低於該第二冷凍溫度，並且該第二冷凍溫度高於該第三冷凍溫度。此外，該第一冷凍溫度與該第三冷凍溫度可以是相同或不相同，該第一冷凍溫度也可以大於、小於、等於該第三冷凍溫度，但兩者溫度相差小於等於100℃以內。
又，該第二冷凍溫度為高於該第一冷凍溫度至少30℃以上，較佳為在50℃以上，更佳為在80℃以上，最佳為在120℃以上；該第二冷凍溫度為高於該第三冷凍溫度至少30℃以上，較佳為在50℃以上，更佳為在80℃以上，最佳為在120℃以上。
更進一步而言，該第一冷凍溫度一般為在-100℃至-200℃之間；較佳為在-140℃至-200℃之間；更佳為在-180℃至-200℃之間。
又，該第二冷凍溫度一般為在-60℃至-90℃之間；較佳為在-65℃至-85℃之間；更佳為在-67℃至-83℃之間。
另外，該第三冷凍溫度一般為在-100℃至-200℃之間；較佳為在-140℃至-200℃之間；更佳為在-180℃至-200℃之間。
另外，根據本發明的技術思想，在實施例中所使用的細胞凍存液並未特別加以限制，一般細胞凍存液為在第一培養基中加入5wt％~15wt％的二甲基亞碸（Dimethyl sulfoxide，DMSO）配製而成，也可以是含有5wt％~15wt％之DMSO的市售細胞凍存液產品。
該產物採集步驟主要是將經過該活性刺激步驟後的細胞進行解凍，並可經過離心將改質幹細胞與細胞凍存液分離取出，該步驟通常是在準備將改質幹細胞用於治療病患時進行，該解凍溫度一般為在30℃至40℃之間。
經由上述方法所獲得的改質幹細胞能夠同時釋放出細胞激素G-CSF、生長因子Fractalkine和EGF、以及白介素IL-4、IL-5、及IL-13，能夠應用於作為治療糖尿病及其併發症的細胞製劑。
另外，該改質幹細胞除了用於糖尿病治療外，還可用於治療心血管疾病、創傷疾病、肺部疾病、神經系統疾病、免疫疾病、肝臟疾病、內分泌疾病、皮膚疾病、腸胃道疾病、腎臟疾病、血液性疾病、癌症腫瘤疾病、婦科疾病、精神疾病、泌尿系統疾病、眼科疾病、牙科疾病中之任一種疾病。
為了更全面且完整地描述本發明，以下對本發明之實施方案態樣及具體實例進行說明性的描述；然而，此等並無代表本發明的具體實例中可實踐或可利用之唯一形式的意圖。實施例中涵蓋了多個具體實例之特徵和構造；以及操作這些具體實例之過程步驟及順序。然而，在其他實例中，亦可藉由相同或等效的功能及步驟順序來完成。
《比較例1》
藉由在腹部外科手術期間從受試者腹部採集約5g的脂肪組織，該研究案已獲得醫院倫理委員會批准，並獲得了受試者的知情同意。首先利用剪刀和手術刀將脂肪組織切成小於3毫米的碎片並透過以下步驟進行人類幹細胞分離純化。
將切碎的脂肪組織與等量體積磷酸鹽緩衝液(PBS)均勻且溫和的混合均勻後短暫放置使混合液分成兩層，抽取上層溶液(含幹細胞、脂肪細胞和血液)以PBS清洗2次後，在36.5-38.5℃ 的溫度環境中用0.075％ 膠原酶(I 型)將組織解離60分鐘。之後將該解離組織與等體積含有10％胎牛血清(FBS)的DMEM培養基(GIBCO-BRL)進行均勻混合並在室溫下培養10分鐘，此時該混合液分成兩層。將下層溶液在 20℃溫度下以1,500rpm 轉速離心5分鐘。將上清液去除，留下底層細胞以160mM NH
4Cl 打散用以消除紅血球，該溶液通過40mm的篩網進行過濾，並將過濾液收進新管。該溶液加入等體積含有10％胎牛血清(FBS)的DMEM培養基(GIBCO-BRL)進行均勻混合在 20℃溫度下以1,500rpm 轉速離心5分鐘進行清洗，之後移除上清液，底層細胞即為初代幹細胞。
將初代幹細胞以含有10％胎牛血清(FBS)的DMEM培養基(GIBCO-BRL)在TC(Tissue culture treated)處理的培養皿進行培養。
培養至第7天後，取出幹細胞，並將幹細胞放入DMSO濃度為10wt％的細胞凍存液中進行分裝，每支冷凍管的細胞數量為3x10^7±20％個/mL，然後將冷凍管放置溫度為-196±10℃的環境中冷凍保存。
凍存一個月後取出裝有冷凍細胞的冷凍管，立即放入溫度為37℃培養箱中3分鐘，接著將冷凍管轉移到生物安全櫃(BSC)中，並在打開冷凍管前用75％的乙醇擦拭冷凍管的外部。將1mL的細胞懸浮液轉移到裝有9mL生理鹽水的離心管中，並以300×g離心5分鐘。
接著，去除上清液並輕輕地將細胞顆粒放置於在10mL鹽水中重懸，然後在22℃下以300×g離心細胞懸液5分鐘並去除上清液，重複此步驟三次後，將細胞顆粒重新懸浮在10mL鹽水中，獲得幹細胞S1。
《實施例1》
由在腹部外科手術期間從健康的捐贈者進行脂肪抽吸，從腹壁之皮下脂肪採集2-5g的脂肪組織，取脂手術時間大約1小時以內，傷口小於1公分。所有捐贈者均提供書面同意書。將人脂肪組織置於無Ca
2+/Mg
2+之磷酸鹽緩衝液(PBS)中且立即轉移至實驗室。
將人類脂肪組織從運送培養基移出並放置於培養皿中，使用不含 Ca
2+/Mg
2+的磷酸鹽緩衝鹽水(PBS) 將脂肪組織洗滌3至4次，並切成小塊(體積約為1-3 mm
3)，在36.5-38.5℃的溫度環境中用0.1-0.3％的膠原蛋白酶將組織解離60分鐘。在膠原蛋白酶消化之後，在溫度20-25℃、500g的離心條件下進行離心5-15分鐘，將細胞和未消化的組織碎片從基質血管細胞(stromal vascular fraction, SVF)的顆粒中分離出來，收集解離的細胞並在36.5-38.5℃下在提供5％CO
2的培養箱中培養。培養1-2天後，從培養物中除去上清液和碎片，獲得初代幹細胞。
將初代幹細胞進行擴增培養，所使用的培養基及培養條件如下：
將0.5×10
5個初代幹細胞置於含氧官能基團比例在20％以上之材質的培養皿中，以包含有1-100mM之N-乙醯半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine, Sigma)、0.05-50mM之抗壞血酸磷酸酯鎂 (L-ascorbic acid 2-phosphate, Sigma)的Keratinocyte-SFM培養基(Gibco)進行細胞培養7天，培養環境為溫度控制在 36.5-38.5℃，且含有 5％二氧化碳之細胞培養箱中。
培養至第7天後，取出幹細胞，並將幹細胞放入DMSO濃度為10wt％的細胞凍存液中進行分裝，每支冷凍管的細胞數量為3x10^7±20％個/mL，然後將冷凍管放置溫度為-196±10℃的環境中冷凍保存。
凍存一個月後取出裝有冷凍細胞的冷凍管，立即放入溫度為37℃培養箱中3分鐘，接著將冷凍管轉移到生物安全櫃(BSC)中，並在打開冷凍管前用75％的乙醇擦拭冷凍管的外部。將1mL的細胞懸浮液轉移到裝有9mL生理鹽水的離心管中，並以300×g離心5分鐘。
接著，去除上清液並輕輕地將細胞顆粒放置於在10mL鹽水中重懸，然後在22℃下以300×g離心細胞懸浮液5分鐘並去除上清液，重複此步驟三次後，將細胞顆粒重新懸浮在10mL鹽水中，獲得改質幹細胞W1。
《實施例2》
利用與實施例1相同的方法獲得初代幹細胞，並將初代幹細胞進行擴增培養，所使用的培養基及培養條件如下：
將0.5×10
5個初代幹細胞置於含氧官能基團比例在20％以上之材質的培養皿中，以包含有1-100mM之N-乙醯半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine, Sigma)、0.05-50mM之抗壞血酸磷酸酯鎂 (L-ascorbic acid 2-phosphate, Sigma)的Keratinocyte-SFM培養基(Gibco)進行細胞培養7天，培養環境為溫度控制在 36.5-38.5℃，且含有 5％二氧化碳之細胞培養箱中。
培養至第7天後，取出幹細胞，並將幹細胞放入DMSO濃度為10wt％的細胞凍存液中進行分裝，每支冷凍管的細胞數量為3x10^7±20％個/mL，然後將冷凍管放置於溫度為-196±10℃的環境中冷凍保存30天，再將冷凍管放置於溫度為-70±10℃的環境中冷凍保存2天，最後再將冷凍管放置於溫度為-196±10℃的環境中冷凍保存7天。
完成凍存後取出裝有冷凍細胞的冷凍管，立即放入溫度為37℃培養箱中3分鐘，接著將冷凍管轉移到生物安全櫃(BSC)中，並在打開冷凍管前用75％的乙醇擦拭冷凍管的外部。將1mL的細胞懸浮液轉移到裝有9mL生理鹽水的離心管中，並以300×g離心5分鐘。
接著，去除上清液並輕輕地將細胞顆粒放置於在10mL鹽水中重懸，然後在22℃下以300×g離心細胞懸浮液5分鐘並去除上清液，重複此步驟三次後，將細胞顆粒重新懸浮在10mL鹽水中，獲得改質幹細胞W2。
《細胞因子和生長因子含量分析》
將上述比較例1、實施例1、實施例2所得的幹細胞S1、改質幹細胞W1、改質幹細胞W2進行細胞因子和生長因子含量分析。
將取4x10
5個細胞與0.5mL生理食鹽水(saline)混合，在2-10℃ 的環境中靜置24 小時，過後以300×g 離心 5分鐘，收取上清液體，並以MILLIPLEX® MAP MULIPLEX DETECTION (Merck Milliplex, 儀器型號：Luminex Magpix分析儀)分析G-CSF、Fractalkine、EGF、IL-4、IL-5和IL-13的含量，相關數值記錄於表1中並繪製成圖1A至圖1F。
表1
| Factor | 比較例1 (N=3) | 實施例1 (N=6) | 實施例2 (N=6) | |||
| Mean | SD | Mean | SD | Mean | SD | |
| G-CSF(pg/ml) | 16.33 | 8.86 | 88.19 | 73.59 | 713.45 | 239.85 |
| Fractalkine(pg/ml) | 5.98 | 0.21 | 20.1 | 10.85 | 49.72 | 15.43 |
| EGF(pg/ml) | 0.57 | 0.16 | 2.71 | 0.98 | 106.89 | 25.39 |
| IL-4(pg/ml) | N.D. | 0 | 5.02 | 2.51 | 7.21 | 1.65 |
| IL-5(pg/ml) | N.D. | 0 | 0.29 | 0.03 | 0.75 | 0.02 |
| IL-13(pg/ml) | N.D. | 0 | 0.73 | 0.44 | 2.99 | 0.55 |
根據上述表1及圖1A至圖1F的結果可知，比較例1所得的幹細胞S1僅釋放出少量的G-CSF、Fractalkine、和EGF，而改質幹細胞W1和改質幹細胞W2能夠釋放出相對多量的G-CSF、Fractalkine、和EGF。以G-CSF的釋放量來看，改質幹細胞W1為幹細胞S1的5.4倍，改質幹細胞W2為幹細胞S1的43.69倍；以Fractalkine的釋放量來看，改質幹細胞W1為幹細胞S1的3.36倍，改質幹細胞W2為幹細胞S1的8.31倍；以EGF的釋放量來看，改質幹細胞W1為幹細胞S1的4.75倍，改質幹細胞W2為幹細胞S1的187.53倍。
除此之外，比較例1所得的幹細胞S1並不釋放IL-4、IL-5、和IL-13，而實施例1和2所得的改質幹細胞W1和改質幹細胞W2除了能夠釋放出G-CSF、Fractalkine、EGF以外，同時還可以釋放出IL-4、IL-5、和IL-13。
經由上述結果可知，本發明的製備方法能夠將幹細胞改質，使改質幹細胞能夠同時分泌出G-CSF、Fractalkine、EGF、IL-4、IL-5、和IL-13，具有作為治療糖尿病及其併發症之細胞製劑的潛力，其中改質幹細胞W2相較於改質幹細胞W1含有較高濃度的G-CSF、Fractalkine、EGF、IL-4、IL-5、和IL-13。
《實施例3至5》
利用與實施例1相同的方法獲得初代幹細胞，並將初代幹細胞進行擴增培養，所使用的培養基及培養條件如下：
將0.5×10
5個初代幹細胞置於含氧官能基團比例在20％以上之材質的培養皿中，以包含有1-100mM之N-乙醯半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine, Sigma)、0.05-50 mM之抗壞血酸磷酸酯鎂 (L-ascorbic acid 2-phosphate, Sigma)的Keratinocyte-SFM培養基(Gibco)進行細胞培養7天，培養環境為溫度控制在36.5-38.5℃，且含有 5％二氧化碳之細胞培養箱中。
培養至第7天後，取出幹細胞，並將幹細胞放入DMSO濃度為10wt％的細胞凍存液中進行分裝，每支冷凍管的細胞數量為3x10^7±20％個/mL，然後將冷凍管放置溫度為-196±10℃的環境中冷凍保存，並且分別凍存14天(實施例3)、875天(實施例4)、以及136天(實施例5)。
結束凍存後取出裝有冷凍細胞的冷凍管，立即放入溫度為37℃培養箱中3分鐘，接著將冷凍管轉移到生物安全櫃(BSC)中，並在打開冷凍管前用75％的乙醇擦拭冷凍管的外部。將1mL的細胞懸浮液轉移到裝有9mL生理鹽水的離心管中，並以300×g離心5分鐘。
接著，去除上清液並輕輕地將細胞顆粒放置於在10mL鹽水中重懸，然後在22℃下以300×g離心細胞懸液5分鐘並去除上清液，重複此步驟三次後，將細胞顆粒重新懸浮在10mL鹽水中，分別獲得經歷不同凍存時間的幹細胞W3、W4、W5。
《實施例6至8》
利用與實施例1相同的方法獲得初代幹細胞，並將初代幹細胞進行擴增培養，所使用的培養基及培養條件如下：
將0.5×10
5個初代幹細胞置於含氧官能基團比例在20％以上之材質的培養皿中，以包含有1-100 mM之N-乙醯半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine, Sigma)、0.05-50 mM之抗壞血酸磷酸酯鎂 (L-ascorbic acid 2-phosphate, Sigma)的Keratinocyte-SFM培養基(Gibco)進行細胞培養7天，培養環境為溫度控制在 36.5-38.5℃，且含有 5％二氧化碳之細胞培養箱中。
培養至第7天後，取出幹細胞，並將幹細胞放入DMSO濃度為10wt％的細胞凍存液中進行分裝，每支冷凍管的細胞數量為3x10^7±20％個/mL，然後將冷凍管進行凍存，凍存條件如下：
實施例6：首先，將冷凍管放置於溫度為-196±10℃的環境中冷凍保存17天，再將冷凍管放置於溫度為-70±10℃的環境中冷凍保存2天，最後再將冷凍管放置於溫度為-196±10℃的環境中冷凍保存33天。
實施例7：首先，將冷凍管放置於溫度為-196±10℃的環境中冷凍保存887天，再將冷凍管放置於溫度為-70±10℃的環境中冷凍保存2天，最後再將冷凍管放置於溫度為-196±10℃的環境中冷凍保存7天。
實施例8：首先，將冷凍管放置於溫度為-196±10℃的環境中冷凍保存18天，再將冷凍管放置於溫度為-70±10℃的環境中冷凍保存2天，最後再將冷凍管放置於溫度為-196±10℃的環境中冷凍保存3天。
完成凍存後取出裝有冷凍細胞的冷凍管，立即放入溫度為37℃培養箱中3分鐘，接著將冷凍管轉移到生物安全櫃(BSC)中，並在打開冷凍管前用75％的乙醇擦拭冷凍管的外部。將1mL的細胞懸浮液轉移到裝有9mL生理鹽水的離心管中，並以300×g離心5分鐘。
接著，去除上清液並輕輕地將細胞顆粒放置於在10mL鹽水中重懸，然後在22℃下以300×g離心細胞懸液5分鐘並去除上清液，重複此步驟三次後，將細胞顆粒重新懸浮在10mL鹽水中，分別獲得改質幹細胞W6、W7、W8。
接著，將上述實施例3至8所得的改質幹細胞W3至W8進行細胞檢測實驗，實驗內容包含細胞表面標誌(Cell surface marker)、細胞存活率(Cell viability)、內毒素(Endotoxin)、黴漿菌(Mycoplasma)、無菌試驗(Sterility testing)以及細胞因子和生長因子含量分析。
《細胞檢測實驗-細胞表面標誌》
改質幹細胞W3至W8經解凍後將1×10
6個/mL的幹細胞取100μL至微量離心管中，以1:100比例加入帶有螢光標記之CD73、CD90、CD105、CD14、CD19、CD34、CD45以及HLA-DR(Becton Dickinson)抗體混合均勻，避光靜置，然後使用BD AccuriC6流式細胞儀(Becton Dickinson)分析細胞標誌物，分析完成後將所得結果記錄於表2-細胞表面標誌欄位中。
《細胞檢測實驗-細胞存活率》
改質幹細胞W3至W8經解凍後以ADAM-MC™ Automatic Cell計數器(Digital Bio，NanoEnTek Inc.)進行細胞存活率評估，分析完成後將所得結果記錄於表2-細胞存活率欄位中。
《細胞檢測實驗-內毒素》
改質幹細胞W3至W8經解凍清洗後，將細胞顆粒重新懸浮在10mL鹽水中，然後在22℃下以300×g離心細胞懸液5分鐘，之後取上清液進行內毒素試驗，該試驗是以動力呈色法進行，以LAL-Endotoxin反應為基礎，在反應中加入無色的人工多肽基質，當此基質(pNA)被酵素裂解時將呈現黃色，並偵測OD405 nm吸光值，藉此定量不同濃度標準品及待測件在反應過程中的內毒素含量，分析完成後將所得結果記錄於表2-內毒素欄位中。
《細胞檢測實驗-黴漿菌》
改質幹細胞W3至W8經解凍清洗後，將細胞顆粒重新懸浮在10mL鹽水中，然後在22℃下以300×g離心細胞懸液5分鐘，之後取上清液進行黴漿菌試驗，該試驗是依據核酸擴增技術(NAT)檢驗方法進行，利用核酸萃取技術分離DNA，並使用定量即時聚合酶連鎖反應(quantitative real-time PCR)技術進行偵測，原理為利用具有螢光探針(fluorescent probe)的專一性引子(primer)在短時間內大量複製特定基因片段，並放大核酸訊號，再利用光學系統偵測其螢光數值，再通過計算聚合酶連鎖反應循環次數(Cq, quantification cycle)與螢光強度進行分析，透過該方法檢視樣品是否遭受黴漿菌汙染，分析完成後將所得結果記錄於表2-黴漿菌欄位中。
《細胞檢測實驗-無菌試驗》
改質幹細胞W3至W8經解凍清洗後，將細胞顆粒重新懸浮在10mL鹽水中，然後在22℃下以300×g離心細胞懸液5分鐘，之後取上清液進行無菌試驗，該試驗參照無菌試驗之直接接種法(Direct inoculation)，將待測件分別接種至硫醇乙酸鹽培養基I(Fluid thioglycolate medium)培養厭氧菌(anaerobic bacteria)或好氧菌(aerobic bacteria)，以及接種至大豆分解蛋白質-乾酪素培養基(Soybean-casein digest medium)培養微量好氧菌或黴菌(Fungi)，再將兩種培養基分別培養於30~35℃與20~25℃中。觀察至少14天，之後檢視培養基中是否有微生物生長，並將所得結果記錄於表2-無菌試驗欄位中。
《細胞檢測實驗-細胞因子和生長因子含量分析》
改質幹細胞W3至W8經解凍清洗後，取4x10
5個細胞與0.5 mL生理食鹽水(saline)混合，在2-10℃的環境中靜置24 小時，過後以300 × g離心5分鐘，收取上清液體，並以MILLIPLEX® MAP MULIPLEX DETECTION (Merck Milliplex, 儀器型號：Luminex Magpix分析儀)分析G-CSF、Fractalkine、EGF、IL-4、IL-5和IL-13的含量，並將所得結果記錄於表2-細胞因子和生長因子含量分析欄位中。
表2
| 實施例 | 實施例3 | 實施例4 | 實施例5 | 實施例6 | 實施例7 | 實施例8 | ||
| 改質幹細胞 | W3 | W4 | W5 | W6 | W7 | W8 | ||
| 恆溫刺激處 理 | 恆溫(-196±10℃)刺激處理靜置時間(天) | 14 | 875 | 136 | N/A | N/A | N/A | |
| 變溫刺激處理 | 第一溫度(-196±10℃)環境靜置時間(天) | N/A | N/A | N/A | 17 | 887 | 18 | |
| 第二溫度(-70±10℃)環境靜置時間(天) | N/A | N/A | N/A | 2 | 2 | 2 | ||
| 第三溫度(-196±10℃)環境靜置時間(天) | N/A | N/A | N/A | 33 | 7 | 3 | ||
| 細胞檢測數據 | 細胞表面標誌(Cell surface marker) (％) | CD73 | 98.78 | 99.39 | 95.91 | 99.3 | 99.88 | 99.63 |
| CD90 | 99.95 | 100 | 99.96 | 99.8 | 99.79 | 98.8 | ||
| CD105 | 97.86 | 98.95 | 99.4 | 95.6 | 95.48 | 95.23 | ||
| CD14 | ≦2 | ≦2 | ≦2 | ≦2 | ≦2 | ≦2 | ||
| CD19 | ≦2 | ≦2 | ≦2 | ≦2 | ≦2 | ≦2 | ||
| CD34 | ≦2 | ≦2 | ≦2 | ≦2 | ≦2 | ≦2 | ||
| CD45 | ≦2 | ≦2 | ≦2 | ≦2 | ≦2 | ≦2 | ||
| HLA-DR | ≦2 | ≦2 | ≦2 | ≦2 | ≦2 | ≦2 | ||
| 細胞存活率(Cell viability) (％) | ≧70 | ≧70 | ≧70 | ≧70 | ≧70 | ≧70 | ||
| 內毒素(Endotoxin) (EU/mL) | ＜0.05 | ＜0.05 | ＜0.05 | ＜0.05 | ＜0.05 | ＜0.05 | ||
| 黴漿菌(Mycoplasma) | 陰性 | 陰性 | 陰性 | 陰性 | 陰性 | 陰性 | ||
| 無菌試驗(Sterility testing) | 陰性 | 陰性 | 陰性 | 陰性 | 陰性 | 陰性 | ||
| 細胞因子和生長因子含量分析(pg/ml) | G-CSF | 43.56 | 38.43 | 40.26 | 989.65 | 763.78 | 764.4 | |
| Fractalkine | 14.74 | 11.72 | 11.75 | 69.78 | 25.66 | 44.22 | ||
| EGF | 1.86 | 2.31 | 3.87 | 118.30 | 132.25 | 74.48 | ||
| IL-4 | 3.53 | 4.84 | 2.18 | 6.54 | 10.58 | 6.53 | ||
| IL-5 | 0.26 | 0.28 | 0.27 | 0.74 | 0.77 | 0.77 | ||
| IL-13 | 0.50 | 0.44 | 0.56 | 4.00 | 2.39 | 2.73 |
根據上述表2結果可知，經過恆溫刺激處理的改質幹細胞W3至W5，不管是在恆溫溫度環境下(-196±10℃)靜置14天甚至到875天，其細胞檢測數據無太大差異，細胞表面標誌CD73、CD90以及CD105皆保持在95％以上，CD14、CD19、CD34、CD45以及HLA-DR低於等於2％，並且細胞存活率皆保持在70％以上、內毒素保持低於0.05EU/mL、黴漿菌及無菌試驗皆為陰性，且從細胞因子和生長因子含量分析試驗結果顯示可穩定分泌G-CSF、Fractalkine、EGF、IL-4、IL-5和IL-13，代表利用恆溫刺激處理製造的改質幹細胞品質穩定。
此外，經過變溫刺激處理所得的改質幹細胞W6至W8，不管是在第一冷凍溫度環境下(-196±10℃)靜置17天甚至到887天、第二冷凍溫度環境下(-70±10℃)靜置2天、第三冷凍溫度環境下(-196±10℃)靜置3天甚至到33天，其細胞檢測數據無太大差異，細胞表面標誌CD73、CD90以及CD105皆保持在95％以上，CD14、CD19、CD34、CD45以及HLA-DR低於等於2％並且細胞存活率皆保持在70％以上、內毒素保持低於0.05EU/mL、黴漿菌及無菌試驗皆為陰性，且細胞因子和生長因子含量分析試驗顯示可穩定分泌G-CSF、Fractalkine、EGF、IL-4、IL-5和IL-13，代表利用變溫刺激處理製造的改質幹細胞品質穩定。
從上述結果可知，改質幹細胞W3至W8的細胞檢測數據呈現穩定，代表不論是以恆溫刺激處理或是以變溫刺激處理製造的改質幹細胞皆具備優異品質；更重要的是，從細胞因子和生長因子含量分析試驗結果可知，相較於恆溫刺激處理(實施例3至5)，以變溫刺激處理(實施例6至8)所製造的改質幹細胞W6至W8更能具有較高濃度的G-CSF、Fractalkine、EGF、IL-4、IL-5、和IL-13的分泌能力，突顯以變溫刺激處理製造的改質幹細胞更具有作為治療糖尿病及其併發症之細胞製劑的潛力。
《應用例》
在本應用例中，將上述實施例2所得到的改質幹細胞W2用於糖尿病患者的臨床治療。本應用例是根據赫爾辛基宣言(Declaration of Helsinki)的倫理原則以及當地法律法規進行，遵循現行的藥品優良臨床試驗件業指引。
受試過程說明如下
A.受試開始前2周(week-2)-標準準備階段(criteria preparatory stage)
受試者須符合以下條件才能在受試開始前2周納入標準準備階段(criteria preparatory stage)：
(1) 被診斷為第一型糖尿病(T1D)的患者。
(2) 年紀在5歲以上。
(3) 在篩選訪視期，被診斷為第一型糖尿病(T1D)後的12個月內。
(4)發病時的血液檢測結果符合以下資料：
1. 空腹血糖 ≥ 7 mmol / L
2. 糖化血紅蛋白(HbA1C)≥ 6.5％
3. 至少有一種與T1D相關的抗體，例如ICA、GAD、ZnT8、或 IAA。
(5) 在篩選參加研究的受試者時，患者正在使用胰島素控制血糖。
(6) 患者無其他需要治療的嚴重急性疾病。
(7) 在醫生解釋幹細胞移植的好處、風險和可能的風險後，患者同意使用幹細胞移植進行治療。
(8) 患者的父母（父母或法定監護人）能夠閱讀、書寫、理解ICF表格並同意簽署參與研究的同意書。
排除條件
(1) 患者具有腎功能不全相關證據：男性血液中肌酐濃度＞1.5mg/dl（或＞133mmol/L），女性血液中肌酐濃度＞1.4mg/dl（或＞124mmol/L）。
(2) 患者處於腎功能衰竭狀態。腎病綜合徵範圍內的蛋白尿含量＞3.5 g/天或尿蛋白/肌酐比值＞2.7
(3) 嚴重感染或感染乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、HIV病毒或肺結核。
(4) 具有心血管疾病、呼吸系統疾病（肺部、纖維化、慢性呼吸衰竭）、肝病、癌症或神經系統疾病
(5) 具有凝血障礙（INR＞1,5，PTT＞40，PT＞15）。
(6) 服用任何抗凝劑。
(7) 服用全身性類固醇。
(8) 參與另一項涉及試驗藥物和/或醫療設備的臨床研究。
(9) 對麻醉劑和/或抗生素有過敏反應史。
B.受試開始階段(week 0)
受試者在week-2期間仍持續正常用藥。在第0周時，利用實施例2的方法將幹細胞進行改質，獲得改質幹細胞W2，然後以 1x10
6cell/患者體重(Kg)的劑量進行靜脈輸注，輸注時間約30分鐘。
在完成輸注後，記錄受試者於輸注前以及輸注後6個月後的胰島素使用量，並在第6個月檢測受試者的C-Peptide、空腹血糖，與輸注前的數值進行比較，結果如表3所示。
表3
| 檢驗項目 | 治療前 | 治療後(6個月) | 變化 |
| C-Peptide (ng/mL) | 0.16 | 0.94 | 增加0.78 |
| 空腹血糖(mmol/L) | 19 | 4.5 | 降低14.5 |
| 胰島素使用量( IU/day) | 35 | 24 | 降低11 |
從C-Peptide 的數值來看，C-peptide是胰臟 β-cell以胰島素原(proinsulin)生產胰島素(insulin)時切出來的一段沒有活性的胜肽，代表內因性胰島的產量，正常數值範圍為0.81-3.85 ng/mL，第一型糖尿病病人通常很低，經治療後若胰臟恢復胰島素分泌量，則數值會增加，因此由表3的結果可知，利用本發明之方法所得到的改質幹細胞W2作為細胞製劑能夠有效恢復胰島素分泌量。
接著，從空腹血糖的數值來看，一般來說空腹血糖正常數值範圍是在4-7 mmol/L，超過7 mmol/L代表有糖尿病風險；在本應用例中，患者在輸注改質幹細胞W2後6個月，其空腹血糖從19 mmol/L降至4.5 mmol/L，因此由表3的結果可知，利用本發明之方法所得到的改質幹細胞W2作為細胞製劑能夠降低血糖。
另外，從患者的每日胰島素使用量來看，一型糖尿病通常無法自行產生胰島素，需要依靠每天注射外來胰島素來控制血糖，因此正常情況是不需要注射胰島素；患者在輸注改質幹細胞W2後6個月，其胰島素每天使用量降低11 IU，顯示利用本發明之方法所得到的改質幹細胞W2作為細胞製劑能夠有效減少外源性胰島素的注射量。
綜上所述，本發明之內容已以如上之實施例舉例說明了，然而本發明並非僅限定於此等實施方式而已。本發明所屬技術領域中具有通常知識者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可再進行各種之更動與修飾；例如，將前述實施例中所例示之各技術內容加以組合或變更而成為新的實施方式，此等實施方式亦當然視為本發明所屬內容之一。因此，本案所欲保護之範圍亦包括後述之申請專利範圍及其所界定之範圍。
圖1A為顯示在細胞因子和生長因子含量分析中，幹細胞S1、改質幹細胞W1、改質幹細胞W2所釋放出之G-CSF的含量比較圖。
圖1B為顯示在細胞因子和生長因子含量分析中，幹細胞S1、改質幹細胞W1、改質幹細胞W2所釋放出之Fractalkine的含量比較圖。
圖1C為顯示在細胞因子和生長因子含量分析中，幹細胞S1、改質幹細胞W1、改質幹細胞W2所釋放出之EGF的含量比較圖。
圖1D為顯示在細胞因子和生長因子含量分析中，幹細胞S1、改質幹細胞W1、改質幹細胞W2所釋放出之IL-4的含量比較圖。
圖1E為顯示在細胞因子和生長因子含量分析中，幹細胞S1、改質幹細胞W1、改質幹細胞W2所釋放出之IL-5的含量比較圖。
圖1F為顯示在細胞因子和生長因子含量分析中，幹細胞S1、改質幹細胞W1、改質幹細胞W2所釋放出之IL-13的含量比較圖。
Claims (10)
- 一種改質幹細胞的製備方法，其係包含以下步驟： 細胞培養步驟：將幹細胞以一預定細胞密度在一培養皿的第一培養基中進行培養，經過一第一培養時間後移除該第一培養基而得到第一細胞中間體； 活性刺激步驟：將該第一細胞中間體保存在具有一細胞凍存液的冷凍容器中進行一恆溫刺激處理或一變溫刺激處理歷時至少1天以上； 產物採集步驟：完成該活性刺激步驟後，將該冷凍容器放置於一解凍溫度的環境中靜置進行解凍，再移除該細胞凍存液而獲得該改質幹細胞；其中 該預定細胞密度為6,000~15,000個細胞/cm 2； 該培養皿為帶有含氧官能基團、表面帶負電且具有親水性； 該解凍溫度為在30℃至40℃之間； 該改質幹細胞能夠釋放出G-CSF、Fractalkine、EGF、IL-4、IL-5、及IL-13中之至少一種或多種。
- 如請求項1所述之改質幹細胞的製備方法，其中該培養皿為至少帶有20％以上的含氧官能基團。
- 如請求項1所述之改質幹細胞的製備方法，其中該恆溫刺激處理為在介於-100℃至-200℃的溫度範圍內之一恆溫環境中進行凍存歷時1~1,825天。
- 如請求項1所述之改質幹細胞的製備方法，其中該變溫刺激處理為包括：對於該第一細胞中間體，先在一第一冷凍溫度的環境中進行凍存歷時1~1,825天，接著，在一第二冷凍溫度的環境中進行凍存歷時1~7天，然後，在第三冷凍溫度的環境中進行凍存歷時1~365天；其中 該第一冷凍溫度、該第二冷凍溫度、及該第三冷凍溫度皆在-50℃以下，該第一冷凍溫度為低於該第二冷凍溫度，並且該第二冷凍溫度高於該第三冷凍溫度。
- 如請求項4所述之改質幹細胞的製備方法，其中該第一冷凍溫度與該第三冷凍溫度分別為在-100℃至-200℃之間； 該第二冷凍溫度為高於該第一冷凍溫度至少30℃以上； 該第二冷凍溫度為高於該第三冷凍溫度至少30℃以上。
- 如請求項4所述之改質幹細胞的製備方法，其中對於該第一細胞中間體，在該第一冷凍溫度、第二冷凍溫度、第三冷凍溫度下進行凍存之變溫刺激處理的總處理天數為至少3天以上。
- 如請求項1所述之改質幹細胞的製備方法，其中該第一培養基為包含有1-100 mM之N-乙醯半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine, Sigma)、0.05-50 mM之抗壞血酸磷酸酯鎂 (L-ascorbic acid 2-phosphate, Sigma)的Keratinocyte-SFM培養基。
- 一種改質幹細胞，其特徵在於，其係利用如請求項1至7中任一項所述的製備方法對於幹細胞進行細胞培養、活性刺激處理所製得，且該改質幹細胞能夠釋放出G-CSF、Fractalkine、EGF、IL-4、IL-5、及IL-13中之至少一種或多種。
- 一種改質幹細胞於用於製備治療糖尿病之藥物的用途，其特徵在於，該改質幹細胞是利用如請求項1至7中任一項所述的製備方法對於幹細胞進行細胞培養、活性刺激處理所製得，且該改質幹細胞能夠釋放出G-CSF、Fractalkine、EGF、IL-4、IL-5、及IL-13中之至少一種或多種。
- 一種用於治療糖尿病的細胞製劑，其係至少包含有利用如請求項1至7中任一項所述的製備方法所製備而得的改質幹細胞、或者是至少包含有如請求項8所述的改質幹細胞，該改質幹細胞能夠釋放出G-CSF、Fractalkine、EGF、IL-4、IL-5、及IL-13中之至少一種或多種。
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