CN1232233C - 一种组织工程真皮的制备方法 - Google Patents
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本发明属于生物医学的组织工程技术领域，涉及一种组织工程真皮及其制备方法。方法特征包括皮肤成纤维细胞的获取和扩大培养、细胞外基质复合物的制备、生物支架材料的准备、培养基的配制、组织工程真皮的制备和三维培养。所制备的组织工程真皮由皮肤成纤维细胞复合于生物支架材料表面构建而成。本发明所制备的组织工程真皮，不仅有一定的弹性、韧性，而且培养时间短、无明显免疫排斥反应，与天然真皮结构类似。在临床治疗中将可发挥多方面的作用。
Description
技术领域
本发明属于生物材料的组织工程技术领域，涉及一种组织工程真皮及其制备方法。
背景技术
近年来，在医学美容、创伤、烧伤外科等领域中，随着对功能性恢复的要求及美观的考虑，对于某些深部的皮肤缺损仅仅达到创面上皮化已远远不够，必须努力探索应用更合理的方法，使植皮区最终取得与全厚皮移植相同或相近的结果。真皮替代物在皮肤重建过程中具有重要作用，可增强创面愈合后的皮肤弹性、柔韧性及机械耐磨性，减少瘢痕增生，控制挛缩，可提高表皮移植成功率和改善愈合质量。含成纤维细胞的活真皮替代物可促进角朊细胞生长、真表皮连接形成，改善移植物的机械性能和美容效果，使其柔软度更接近正常皮肤。
真皮替代物基本分为二大类，即天然真皮与人工合成真皮。天然真皮具有完整的胶原三维结构，生物相容性好，在组织成份上与自体皮肤最相近，因此在皮肤重建中具有较高的应用价值。但异体/异种皮可引起排斥反应，表皮层及真皮中的细胞成份是引起免疫反应的主要原因。目前常采用去除异体/异种皮表皮层或所有细胞成份及可溶性蛋白的方法解决免疫排斥的问题。研究表明，经处理的天然真皮可作为永久性的真皮替代物。目前，来源于人尸体皮的无细胞真皮已由美国Lifecell公司开发为产品，商品名为Alloderm，临床应用效果良好。将Alloderm植入深度烧伤创面，再覆盖3∶1的网状断层皮片，术后16天创面全部表皮化，异体真皮基质底部有受体成纤维细胞浸入，新生血管形成，而无明显炎性细胞浸润。电镜观察到异体真皮基质表面形成完整基底膜，并生成大量弹性蛋白，免疫学检查证实术后60天机体对异体真皮无免疫排斥反应。Alloderm在三度和深二度烧伤中起永久性真皮替代物作用。主要缺点有：缺乏活的成纤维细胞，这可能延缓真皮重建；无细胞异种真皮基质的胶原可能引起免疫反应；市售产品只达到真皮替代，没有达到表皮重建，必须覆盖自体皮或培养的表皮细胞片；Alloderm来源于尸体皮，来源有限，并且存在传播病毒性疾病的危险(尤其是爱滋病)。
人工真皮系采用各种材料利用组织工程原理及方法制成的真皮基质，与天然真皮替代物相比，其组成成份及交联物质可改变，以增加对胶原酶的耐受性，且可大量生产，长期贮存。因此人工真皮的开发亦成为皮肤组织学中的热点。制备人工真皮的关键在于寻找合适的生物材料或高分子化学材料，这些材料必需符合以下基本条件：(1)生物相容性好，不引起明显排斥反应及异物反应；(2)可允许成纤维细胞、内皮细胞浸润生长，易于血管化；(3)植入体内后不易降解。目前，人工合成真皮主要采用胶原一GAG(glycosaminoglycan，氨基葡聚糖，主要成份为硫酸软骨素)、胶原凝胶、PGA/PLA(聚羟基乙酸/聚乳酸)网、尼龙网等作为真皮支架，结合成纤维细胞，并初步试用于临床取得一定效果。Biobrane是合成的双层创面敷料，外层为硅膜，内层为部分埋入其中的尼龙纤维网，网孔中充满化学交联的胶原，主要用于供皮区创面和浅度烧伤创面。Advanced Tissue Science公司生产的Dermagraft TC就是把新生儿成纤维细胞培养在该合成敷料的尼龙网中，临床应用表明优于或等同于异体皮。2000年已获美国食品与药物管理局批准用于临床。生物膜和Dermagraft TC为不可降解性的合成复合膜，在人体烧伤创面中起暂时性创面覆盖物作用。该公司生产的另一种人真皮替代物Dermagraft TM，由新生儿成纤维细胞种植在可降解的聚乳酸纤维网上组成，移植后3～4周聚乳酸纤维网因生物降解而消失。临床已成功用于治疗糖尿病性溃疡。生物可吸收网膜的主要优点有：高度抵抗创面胶原酶消化，允许移植于污染的烧伤创面；允许烧伤清创后立即移植；无病毒传染风险。但也有缺点：生产合成网膜真皮替代物需要大量成纤维细胞；难改变网膜的厚度，且成本高。
Burke和Yannas等研制的双层人工皮肤商品名为Integra TM，现由美国Integra Life Sciences公司制造。由戊二醛交联的牛I型胶原与硫酸软骨素构成“真皮”，“表皮”为硅橡胶薄膜。应用于创面后“真皮”可逐渐自行降解，而患者自己的内皮细胞和成纤维细胞长入形成新的真皮结构，几周后用薄层网状自体皮代替硅膜。Integra TM是异种来源的永久性真皮替代物。缺点是血管化较慢、抗感染能力差，价格昂贵。目前，国内由于种种原因尚未见有理想的人工真皮问世。
发明内容
针对现有技术状况，本发明的目的之一是提供一种具有止血、抗炎、防止体液流失和保护创面功能的、可用于修复较小皮肤缺损或颌面部软组织大量缺损造成的颜面凹陷畸形的组织工程真皮产品的制备方法，其获得的产品具有可立即应用、允许移植超薄自体皮、产生的瘢痕少、形状大小和厚度易于改变的优点。
本发明所提供的组织工程真皮产品的特征在于：其包括皮肤成纤维细胞、细胞外基质复合物、生物支架材料；是由皮肤成纤维细胞复合于生物支架材料表面来构建具有活性的组织工程真皮。所述的生物支架材料指尼龙膜、或脱细胞异种真皮基质、或混合胶原膜、或壳聚糖、或硫酸软骨素、或是其中的任意组合。所述的皮肤成纤维细胞为自体或同种异体来源的包皮成纤维细胞，或可向成纤维细胞分化的干细胞，包括胚胎干细胞和成体干细胞，如骨髓间充质干细胞，造血干细胞、皮肤干细胞、间充质干细胞、肌肉干细胞，肝脏干细胞、神经干细胞中的一种或几种；所述的细胞外基质复合物，包含有I、III型胶原、层粘连蛋白、纤维粘连蛋白等成分，与人体真皮成分接近；所述组织工程真皮中成纤维细胞有数层排列，与天然真皮结构有高度的一致性，同时具有一定的弹性与韧性。
本发明所提出组织工程真皮的制备方法，包括皮肤成纤维细胞的获取和扩大培养、细胞外基质复合物的制备、生物支架材料的准备、培养基的配制，其特征在于：组织真皮的三维培养包括以下步骤：
步骤1：在无菌条件下，将细胞外基质复合物、壳聚糖、透明质酸、硫酸软骨素等胶原物质溶于0.1％醋酸中，配制成0.5％-10％(m/v)的溶液，冰浴下紫外线照射10-60分钟，再加入10％(m/v)的DMEM培养液、10％(v/v)的胎牛血清，调节pH值为7.2-7.4，成为凝胶溶液。
步骤2：将准备好的生物支架材料(尼龙膜或混合胶原膜)浸透该凝胶溶液后，置于37℃环境下固化10-60分钟。
步骤3：将体外培养的皮肤成纤维细胞按104-106个/ml的浓度混合于上述凝胶溶液中，滴加到预固化的生物支架材料上，置于5％CO2环境中37℃条件下10-60分钟，待其凝固后，加入组织工程真皮培养基，每天换液，六天后组织工程真皮即可使用。
具体实施方式
现结合实验将本发明作进一步详细说明：
1、成纤维细胞的获得和扩大培养：取新生儿包皮切除术后皮肤组织，已证实此来源的成纤维细胞免疫反应较低，不会引起明显的排斥反应。获取的包皮使用新洁尔灭或酒精消毒后，使用酶分离法或组织块法进行成纤维细胞培养，细胞汇合后用酶消化传代，扩大培养。具体过程为：
将消毒后的材料用含1％青/链霉素的0.1M的磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗，去除皮下脂肪及肌肉层，将皮肤剪成条状，加入蛋白酶(Dispase)4U/ml，在37℃下消化60-120分钟。去除表皮层，将真皮组织剪碎，加入625U/ml的胶原酶37℃消化90-160分钟，将收获的成纤维细胞种至培养瓶培养；将原代培养的成纤维细胞使用细胞工厂、旋转瓶培养系统或生物反应器等方法进行扩大培养。
2、细胞外基质复合物的制备：本发明使用牛皮中提取的细胞外基质复合物，包含I、III型胶原、层粘连蛋白、纤维粘连蛋白等成分，与人体真皮成分接近。其制备方法为：取新鲜胎牛皮剪碎绞成肉泥，2.5倍体积中性液搅拌过夜，离心取上清，1g/L冰醋酸反复抽提，用1mol/L NaCl沉淀，将沉淀物溶解于0.1mol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris-Hcl)，用2.5mol/LNaCl盐析，再用1g/L冰醋酸溶解后透析纯化。真空冻干，环氧乙烷消毒。
3、生物支架材料的准备：本发明所涉及的支架材料有不可降解的合成材料，如尼龙膜；或可降解的高分子材料，如细胞外基质复合物、壳聚糖、透明质酸、硫酸软骨素，将其混合物称为混合胶原膜。经真空冻干后，还氧乙烷熏蒸消毒。
4、培养基的配制。
组织工程真皮培养基：成份(及百分比) 500ml体积
商用最低必需培养液(DMEM)(65.7％) 337.5ml
商用培养液F12(22.5％) 112.5ml
胎牛血清(10％) 50ml
胰岛素 1-50ng
氢化可的松 10-500ng
表皮细胞生长因子 1-10μg
霍乱毒素 0.50～10×10-10M
腺嘌呤 0.2-0.25mM
抗生素 200-1000i.u
转铁蛋白 1-10mg
5、组织工程真皮的准备和三维培养包括以下步骤：
准备凝胶溶液：
1)在无菌条件下，将胶原物质溶于0.1％醋酸中，浓度为6mg-10mg/ml，4℃储存，以防止胶原降解。
2)使用前将上述溶液注入培养皿中，置于冰上，暴露于紫外线下30-60分钟，确保溶液处于冷却状态。
3)在该溶液中加入10％的胎牛血清和DMEM培养液，用1M的NaOH调节pH值至7.2-7.4成为凝胶溶液。
4)将消毒好的尼龙膜或混合胶原膜浸湿凝胶溶液后，置于37℃下固化30分钟。
5)组织工程真皮的三维培养：在凝胶溶液中加入成纤维细胞悬液，使终浓度为104-106个细胞/ml，将胶原-成纤维细胞混合物加至预处理的尼龙膜或混合胶原膜上，置于37℃，CO2孵箱中固化30分钟后，加入组织工程真皮培养基，每天换液，六天后组织工程真皮即可使用。
本发明所制备的组织工程真皮，不仅具有一定的弹性、韧性，而且具有培养时间短、无明显免疫排斥反应，与天然真皮结构类似的特点。在临床治疗中主要功能有：(1)结合自体表皮移植修复深度皮肤缺损；(2)作为组织充填材料而使局部丰满。(3)主要用于颜面部凹陷畸形的修复，如颞部、颊部凹陷；(4)充当组织加强物，替代筋膜，修复膜性缺损；修复营养不良和感染创面；不稳定瘢痕及难治性溃疡病灶清除后，真皮移植可促进愈合，防止复发；(5)构成复合组织移植。
本发明中来自新生儿的成纤维细胞生长于胶原凝胶中，呈三维方向生长，与天然真皮结构类似。在培养过程中，成纤维细胞仍然继续增殖，在增殖过程中，吸收胶原，分泌基质成分，最终形成真皮组织。通过形态学及组织学观察结果表明，组织工程真皮中成纤维细胞有数层排列，与天然真皮结构有高度的一致性。同时具有一定的弹性与韧性，有利于临床操作。
Claims (5)
1、一种组织工程真皮的制备方法，包括皮肤成纤维细胞的获取和扩大培养、细胞外基质复合物的制备、生物支架材料的准备、培养基的配制，其特征在于：组织工程真皮的三维培养包括以下步骤：
步骤1：在无菌条件下，将胶原物质溶于0.1％的醋酸中，配制成0.5-10％(m/v)溶液，冰浴下紫外线照射，再加入DMEM培养液和胎牛血清，调节pH值为7.2-7.4，成为凝胶溶液；
步骤2：将准备好的生物支架材料，浸透该凝胶溶液后，置于37℃环境下固化；
步骤3：将体外培养的皮肤成纤维细胞按104-106个/ml的浓度混合于上述凝胶溶液中，滴加到预固化的生物支架材料上，待其凝固后，加入组织工程真皮培养基，每天换液，六天后组织工程真皮可使用。
2、根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述的皮肤成纤维细胞的获取和扩大培养的方法为：取新生儿包皮切除术后皮肤组织，消毒后进行成纤维细胞培养，细胞汇合后用酶消化传代，扩大培养。
3、根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述的细胞外基质复合物的具体制备方法为：取新鲜胎牛皮剪碎，绞成肉泥，中性液搅拌浸泡，离心取上清，冰醋酸反复抽提，沉淀，将沉淀物溶解、盐析，再用冰醋酸溶解后透析纯化，真空冻干，环氧乙烷消毒。
4、根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述的生物支架材料可采用不可降解的合成材料，或可降解的高分子材料。
5、根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述的组织工程真皮培养基的成分如下：
商用最低必需培养液DMEM65.7％、商用培养液F12 22.5％、胎牛血清10％；此外，还有微量胰岛素、氢化可的松、表皮细胞生长因子、霍乱毒素、腺嘌呤、转铁蛋白。
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