CN105214129B - 一种生物敷料的制备方法及生物敷料 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及组织工程技术领域，尤其涉及一种生物敷料的制备方法及生物敷料。该方法工艺简单，所获得的生物敷料含有活性因子，在应用于创面修复时，活性因子能够迁移至创面参与创面修复，缩短愈合时间，减轻患者痛苦。本发明实施例提供一种生物敷料的制备方法，包括：步骤1)将人成纤维细胞接种到覆盖有胶原的尼龙网膜上，培养，获得真皮层；步骤2)将所获得的真皮层进行冷冻干燥，获得含有失活的人成纤维细胞和细胞外基质的真皮层；步骤3)在含有失活的人成纤维细胞和细胞外基质的真皮层的上表面涂覆硅胶溶液，静置、凝固，获得生物敷料。
Description
技术领域
本发明涉及组织工程技术领域，尤其涉及一种生物敷料的制备方法及生物敷料。
背景技术
近年来，随着组织工程皮肤的发展，越来越多的真皮替代物被研发出来，并被作为一种临时性敷料应用于临床上来覆盖皮肤缺损，加快创面修复。
目前，在这些临时性敷料中，Integra是通过将牛I型胶原与6-硫酸软骨素交联，构成海绵状网格作为真皮层，在所述真皮层的一表面上外覆一层硅胶膜而获得的一种临时性敷料，其中，所述6-硫酸软骨素是共价连接在蛋白质上形成蛋白聚糖的一类糖胺聚糖，6-硫酸软骨素被广泛应用于动物组织的细胞外基质及细胞表面，用于改善炎症等，该临时性敷料利用外来营养物质交联用于覆盖创面，从而为创面修复提供外来营养物质，仅能够作为临时敷料来覆盖皮肤缺损，随着组织工程皮肤的不断发展，含有活细胞的真皮层作为一种生物敷料用于创面修复时，由于活细胞分泌的细胞外基质具有活性因子，能够参与创面修复，缩短愈合时间，因此，寻求一种具有活性因子的生物敷料成为目前的紧要任务。
发明内容
本发明的主要目的在于，提供一种生物敷料的制备方法及生物敷料。该方法工艺简单，所获得的生物敷料含有活性因子，在应用于创面修复时，活性因子能够迁移至创面参与创面修复，从而能够加快创面修复，缩短愈合时间，减轻患者痛苦。
为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
一方面，本发明实施例提供一种生物敷料的制备方法，包括：
步骤1)将人成纤维细胞接种到覆盖有胶原的尼龙网膜上，培养，获得真皮层；
步骤2)将所获得的真皮层进行冷冻干燥，获得含有失活的人成纤维细胞和细胞外基质的真皮层；
步骤3)在含有失活的人成纤维细胞和细胞外基质的真皮层的上表面涂覆硅胶溶液，静置、凝固，获得生物敷料。
优选的，所述将所获得的真皮层进行冷冻干燥包括：
预冻结段：将真皮层在-30--40℃冻结1.5-3h，真皮层中的水分冻结为冰；
升华阶段：在真空度为10-30Pa下，在1h内升温至-10℃，保温8-10h；在1h内升温至0℃，保温8-10h，在1min内升温至10℃，保温2-3h，将预冻结段形成的冰升华除去真皮层中大部分水分；
再干燥阶段：在真空度为10-30Pa下，在1min内升温至20℃，保温3-5h，除去真皮层中的结合水分。
可选的，步骤1)之前还包括：制备覆盖有胶原的尼龙网膜；
具体为：取尼龙网膜除菌，将除菌后的尼龙网膜沾上胶原溶液置于容器中，静置、凝固。
优选的，所述容器为皮片发生器。
可选的，将人成纤维细胞接种到覆盖有胶原的尼龙网膜上具体为：将人成纤维细胞与胶原溶液的混合液加入到覆盖有胶原的尼龙网膜上，其中，所述混合液中人成纤维细胞的浓度为1-10×106个/ml。
优选的，步骤1)中培养的具体方法为：在36-38℃、5％-10％的二氧化碳培养箱中培养8-12天，每天更换培养液一次。
进一步地，所述细胞外基质至少包括：表皮生长因子EGF、血管内皮生长因子VEGF、碱性成纤维细胞生长因子bFGF、转化生长因子-β1TGF-β1、转化生长因子-β2TGF-β2、转化生长因子-β3TGF-β3、类胰岛素一号增长因子IGF-1、类胰岛素二号增长因子IGF-2。
另一方面，本发明实施例提供一种生物敷料，包括：
真皮层以及涂覆在所述真皮层上表面的硅胶膜；其中，所述真皮层含有经冷冻干燥失活的人成纤维细胞和细胞外基质。
优选的，所述生物敷料为膜片状。
可选的，所述细胞外基质至少包括：表皮生长因子EGF、血管内皮生长因子VEGF、碱性成纤维细胞生长因子bFGF、转化生长因子-β1TGF-β1、转化生长因子-β2TGF-β2、转化生长因子-β3TGF-β3、类胰岛素一号增长因子IGF-1、类胰岛素二号增长因子IGF-2。
本发明实施例提供的一种有活性的生物敷料的制备方法及有活性的生物敷料。该方法工艺简单，通过将人成纤维细胞接种在覆盖有胶原的尼龙网膜进行三维培养，使得人成纤维细胞分泌人源性胶原、氨基多糖等多种生物活性因子，并通过冷冻干燥使得所述人成纤维细胞失活，获得含有活性因子的生物敷料，该含有活性因子的生物敷料在应用于创面修复时，活性因子能够迁移至创面及其创面周围，促进机体创周及创面的细胞增殖与血管新生，从而能够加快创面修复，缩短愈合时间，减轻患者痛苦，进一步地，由于冷冻干燥后的真皮层为多孔的海绵状，在冷冻干燥后的真皮层上涂覆硅胶溶液，操作更加方便，不易对真皮层造成损伤，且涂覆所形成的硅胶膜作为表皮层更加均匀平整，在用于创面修复时，能够保护真皮层以及创面免受外界异物以及病原体的入侵，为真皮层参与创面修复提供保障。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1为本发明实施例提供的一种生物敷料的制备方法；
图2为本发明实施例提供的另一种生物敷料的制备方法；
图3为本发明实施例提供的另一种生物敷料的制备方法；
图4为本发明实施例提供的另一种生物敷料的制备方法。
具体实施方式
现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。因此，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例所涉及的材料均可以通过商业途径或通过申请人获取。
一方面，本发明实施例提供一种生物敷料的制备方法，包括：
步骤1)将人成纤维细胞接种到覆盖有胶原的尼龙网膜上，培养，获得真皮层；
步骤2)将所获得的真皮层进行冷冻干燥，获得含有失活的人成纤维细胞和细胞外基质的真皮层；
步骤3)在含有失活的人成纤维细胞和细胞外基质的真皮层的上表面涂覆硅胶溶液，静置、凝固，获得生物敷料。
其中，所述冷冻干燥是指将物料冷冻到冰点以下从而使水转变为冰，在真空下冰直接转变为蒸汽而除去的干燥方法，冷冻干燥适用于热敏物质，在真空和低温下进行操作，使得物料中酶的活性受到抑制，将物料中的生物活性因子的损伤降至最低限度，能够保持物料的稳定性与生物活性，并且冷冻干燥后的成品物理结构与分子结构变化极小，能够较好地保持原有的组织结构和外观形态，成品呈多孔状，具有优异的复溶性，能够迅速恢复物料的组织结构。
本发明实施例提供的一种有活性的生物敷料的制备方法。该方法工艺简单，通过将人成纤维细胞接种在覆盖有胶原的尼龙网膜进行三维培养，使得人成纤维细胞分泌人源性胶原、氨基多糖等多种生物活性因子，并通过冷冻干燥使得所述人成纤维细胞失活，获得含有活性因子的生物敷料，该含有活性因子的生物敷料在应用于创面修复时，活性因子能够迁移至创面及其创面周围，促进机体创周及创面的细胞增殖与血管新生，从而能够加快创面修复，缩短愈合时间，减轻患者痛苦，进一步地，由于冷冻干燥后的真皮层为多孔的海绵状，在冷冻干燥后的真皮层上涂覆硅胶溶液，操作更加方便，不易对真皮层造成损伤，且涂覆所形成的硅胶膜作为表皮层更加均匀平整，能够保护真皮层以及创面免受外界感染。
其中，对所述冷冻干燥的具体方法不做限定。冷冻干燥过程具体分为三个阶段：预冻结段、升华阶段与再干燥阶段，在预冻结段要严格控制预冻温度(通常比预冻物质的共熔点低几度)。如果预冻温度不够低，则可能会发生不能被完全冻结，在抽真空升华时会膨胀起泡；若预冻温度太低，不仅会增加不必要的能量消耗，而且对于某些生物活性物质，会降低其冻干后的活性保持率。在真空下升华的阶段，为保证冰的升华，应开启加热系统，不断供给冰升华所需的热量；再干燥阶段所除去的水分为结合水分，此时固体表面的水蒸气压呈不同程度的降低，干燥速度明显下降。在保证产品质量的前提下，在此阶段内应适当提高温度，以利于水分的蒸发。
具体的，所述将所获得的真皮层进行冷冻干燥包括：
预冻结段：将真皮层在-30--40℃冻结1.5-3h，真皮层中的水分冻结为冰；
升华阶段：在真空度为10-30Pa下，在1h内升温至-10℃，保温8-10h；在1h内升温至0℃，保温8-10h，在1min内升温至10℃，保温2-3h，将预冻结段形成的冰升华除去真皮层中大部分水分；
再干燥阶段：在真空度为10-30Pa下，在1min内升温至20℃，保温3-5h，除去真皮层中的结合水分。
其中，需要说明的是，在对所获得的真皮层进行冷冻干燥时，可以根据工艺条件对各个阶段的温度与真空度进行适当调整，在此仅为举例说明，并不对本发明目的的实现造成限制。
其中，对覆盖有胶原的尼龙网膜的获取不做限定，例如，可以将胶原溶液涂覆在所述尼龙网膜上进行凝固获得。
优选的，步骤1)之前还包括：制备覆盖有胶原的尼龙网膜；
具体为：取尼龙网膜除菌，将除菌后的尼龙网膜沾上胶原溶液置于容器中，静置、凝固。
其中，对所述容器不做限定，所述容器可以为培养皿等。
优选的，所述容器为皮片发生器。采用皮片发生器，使得凝固后所获得的尼龙网膜更加平整，从而使得最终所获得的生物敷料更接近于天然皮肤。
其中，对所述人成纤维细胞的接种过程不做限定，本发明的一实施例中，将人成纤维细胞接种到覆盖有胶原的尼龙网膜上具体为：将人成纤维细胞与胶原溶液的混合液加入到覆盖有胶原的尼龙网膜上，其中，在所述混合液中所述人成纤维细胞的浓度为1-10×106个/ml。采用该方法，通过将人成纤维细胞与胶原溶液混合，使得人成纤维细胞能够均匀分散于所述胶原溶液中，在将所述人成纤维细胞接种到所述覆盖有胶原的尼龙网膜上时，能够提高所述人成纤维细胞接种的均匀性，从而提高成品质量。
其中，对所述胶原溶液的获取不做限定，所述胶原溶液可以为通过商业手段获得，也可以通过自制获得。
本发明的一实施例中，在步骤1)之前还包括：制备胶原溶液；
具体的，
将胶原蛋白溶于乙酸溶液中；
将新生牛血清和DMEM培养液加入到上述溶液中混匀，调节pH值至6.8-7.5。
采用该方法制备的胶原溶液中含有人成纤维细胞生长所需的各类营养物质，并且，所述胶原溶液的pH值接近中性，当将所述人成纤维细胞与所述胶原溶液混合时，能够保持人成纤维细胞的活性，避免所述胶原溶液为酸性或者碱性使得所述人成纤维细胞的活性降低的情况发生。
本发明的又一实施例中，步骤1)中培养的具体方法为：在36-38℃、5％-10％的二氧化碳培养箱中培养8-12天，每天更换培养液一次。
本发明的一实施例中，细胞外基质至少包括：表皮生长因子EGF、血管内皮生长因子VEGF、碱性成纤维细胞生长因子bFGF、转化生长因子-β1TGF-β1、转化生长因子-β2TGF-β2、转化生长因子-β3TGF-β3、类胰岛素一号增长因子IGF-1、类胰岛素二号增长因子IGF-2。
另一方面，本发明实施例提供一种生物敷料，包括：
真皮层以及涂覆在所述真皮层上表面的硅胶膜；其中，所述真皮层包括经冷冻干燥失活的人成纤维细胞和细胞外基质。
本发明实施例提供的一种生物敷料。该生物敷料含有人成纤维细胞分泌的活性因子，该含有活性因子的生物敷料在应用于创面修复时，活性因子能够迁移至创面及其创面周围，促进机体创周及创面的细胞增殖与血管新生，从而能够加快创面修复，缩短愈合时间，减轻患者痛苦，进一步地，由于冷冻干燥后的真皮层为多孔的海绵状，在冷冻干燥后的真皮层上涂覆硅胶溶液，操作更加方便，不易对真皮层造成损伤，且涂覆所形成的硅胶膜作为表皮层更加均匀平整，在用于创面修复时，能够保护真皮层以及创面免受外界异物以及病原体的入侵，为真皮层参与创面修复提供保障。
其中，对所述生物敷料的形状不做限定。优选的，所述生物敷料为膜片状。膜片状的生物敷料更接近于天然皮肤，能够提高对创面的修复能力。
优选的，所述细胞外基质至少包括：表皮生长因子EGF、血管内皮生长因子VEGF、碱性成纤维细胞生长因子bFGF、转化生长因子-β1TGF-β1、转化生长因子-β2TGF-β2、转化生长因子-β3TGF-β3、类胰岛素一号增长因子IGF-1、类胰岛素二号增长因子IGF-2。
实施例
下面的实施例用来说明本发明，并不是想限制本发明的范围。以下实施例仅以具体实施过程中各组分的实际添加浓度为例进行说明，实际使用时，各组分的浓度并不对本发明目的的实现构成影响。
其中，需要说明的是，在通过下面的实施例来制备生物敷料时，还包括制备胶原溶液、获取人成纤维细胞等步骤。
其中，对胶原溶液的制备方法不做限定，在本发明实施例中，制备胶原溶液具体为：将胶原蛋白溶于乙酸溶液中；将新生牛血清和DMEM培养液加入到上述溶液中混匀，调节pH值至6.8-7.5。
其中，对人成纤维细胞的获取也不做限定，在本发明实施例中，所述人成纤维细胞为经过传代的人成纤维细胞，所述人成纤维细胞可通过如下步骤获得：
取人真皮层皮肤通过胶原酶消化，离心分离后获得原代人成纤维细胞；
将所获得的原代人成纤维细胞经传代培养获得足够数量的人成纤维细胞。
实施例1
步骤1)将所获得的人成纤维细胞接种到覆盖有胶原的尼龙网膜上，在36℃、5％的二氧化碳培养箱中培养8天，每天更换培养液一次，获得真皮层；
具体的，覆盖有胶原的尼龙网膜通过如下步骤获取：
取直径为5cm的尼龙膜除菌，将除菌后的尼龙膜沾上制备好的胶原溶液置于皮片发生器中，在36℃凝固45min。
将人成纤维细胞接种到覆盖有胶原的尼龙网膜上具体为：
取胶原溶液与人成纤维细胞混合均匀，获得人成纤维细胞的浓度为1×106个/ml，取10ml人成纤维细胞的胶原溶液加入凝固好的尼龙网膜上。
步骤2)将所获得的真皮层进行冷冻干燥，获得含有失活的人成纤维细胞和细胞外基质的真皮层；
其中，冷冻干燥过程具体为：
预冻结段：将真皮层在-30℃冻结3h，真皮层中的水分冻结为冰；
升华阶段：在真空度为10Pa下，在1h内升温至-10℃，保温8h；在1h内升温至0℃，保温8h，在1min内升温至10℃，保温2h将预冻结段形成的冰升华除去真皮层中大部分水分；
再干燥阶段：在真空度为10Pa下，在1min内升温至20℃，保温3h，除去真皮层中的结合水分。
步骤3)在含有失活的人成纤维细胞和细胞外基质的真皮层的上表面涂覆硅胶溶液，室温下静置3h、凝固，获得生物敷料。
结论：所获得的生物敷料的真皮层中含有经冷冻干燥失活的人成纤维细胞以及细胞外基质，其中，所述细胞外基质主要包括EGF、BFGF、VEGF、IGF1、IGF2、TGF-B1、TGF-B2、PDGF和KGF，在将所述生物敷料用于创面修复时，细胞外基质中的活性因子能够迁移至创面及其创面周围，促进机体创周及创基的细胞增殖与血管新生，从而能够加快创面修复，缩短愈合时间，减轻患者痛苦，进一步地，由于冷冻干燥后的真皮层为多孔的海绵状，在冷冻干燥后的真皮层上涂覆硅胶溶液时，操作更加方便，不易对真皮层造成损伤，且涂覆所形成的硅胶膜作为表皮层更加均匀平整，在用于创面修复时，能够保护真皮层以及创面免受外界异物以及病原体的入侵，为真皮层参与创面修复提供保障。
实施例2
步骤1)将所获得的人成纤维细胞接种到覆盖有胶原的尼龙网膜上，在38℃、10％的二氧化碳培养箱中培养12天，每天更换培养液一次，获得真皮层；
具体的，覆盖有胶原的尼龙网膜通过如下步骤获取：
取直径为5cm的尼龙膜除菌，将除菌后的尼龙膜沾上制备好的胶原溶液置于皮片发生器中，在37℃凝固50min。
将人成纤维细胞接种到覆盖有胶原的尼龙网膜上具体为：
取胶原溶液与人成纤维细胞混合均匀，获得人成纤维细胞的浓度为5×106个/ml，取10ml人成纤维细胞的胶原溶液加入凝固好的尼龙网膜上。
步骤2)将所获得的真皮层进行冷冻干燥，获得含有失活的人成纤维细胞和细胞外基质的真皮层；
其中，冷冻干燥过程具体为：
预冻结段：将真皮层在-40℃冻结3h，真皮层中的水分冻结为冰；
升华阶段：在真空度为30Pa下，在1h内升温至-10℃，保温10h；在1h内升温至0℃，保温10h，在1min内升温至10℃，保温3h将预冻结段形成的冰升华除去真皮层中大部分水分；
再干燥阶段：在真空度为30Pa下，在1min内升温至20℃，保温5h，除去真皮层中的结合水分。
步骤3)在含有失活的人成纤维细胞和细胞外基质的真皮层的上表面涂覆硅胶溶液，37℃下静置48h、凝固，获得生物敷料。
结论：所获得的生物敷料的真皮层中含有经冷冻干燥失活的人成纤维细胞以及细胞外基质，其中，所述细胞外基质主要包括EGF、BFGF、VEGF、IGF1、IGF2、TGF-B1、TGF-B2、PDGF和KGF，在将所述生物敷料用于创面修复时，细胞外基质中的活性因子能够迁移至创面及其创面周围，促进机体创周及创基的细胞增殖与血管新生，从而能够加快创面修复，缩短愈合时间，减轻患者痛苦，进一步地，由于冷冻干燥后的真皮层为多孔的海绵状，在冷冻干燥后的真皮层上涂覆硅胶溶液时，操作更加方便，不易对真皮层造成损伤，且涂覆所形成的硅胶膜作为表皮层更加均匀平整，在用于创面修复时，能够保护真皮层以及创面免受外界异物以及病原体的入侵，为真皮层参与创面修复提供保障。
实施例3
步骤1)将所获得的人成纤维细胞接种到覆盖有胶原的尼龙网膜上，在37℃、8％的二氧化碳培养箱中培养10天，每天更换培养液一次，获得真皮层；
具体的，覆盖有胶原的尼龙网膜通过如下步骤获取：
取直径为5cm的尼龙膜除菌，将除菌后的尼龙膜沾上制备好的胶原溶液置于皮片发生器中，在38℃凝固60min。
将人成纤维细胞接种到覆盖有胶原的尼龙网膜上具体为：
取胶原溶液与人成纤维细胞混合均匀，获得人成纤维细胞的浓度为1×107个/ml，取10ml人成纤维细胞的胶原溶液加入凝固好的尼龙网膜上。
步骤2)将所获得的真皮层进行冷冻干燥，获得含有失活的人成纤维细胞和细胞外基质的真皮层；
其中，冷冻干燥过程具体为：
预冻结段：将真皮层在-35℃冻结2h，真皮层中的水分冻结为冰；
升华阶段：在真空度为20Pa下，在1h内升温至-10℃，保温9h；在1h内升温至0℃，保温9h，在1min内升温至10℃，保温2.5h将预冻结段形成的冰升华除去真皮层中大部分水分；
再干燥阶段：在真空度为20Pa下，在1min内升温至20℃，保温5h，除去真皮层中的结合水分。
步骤3)在含有失活的人成纤维细胞和细胞外基质的真皮层的上表面涂覆硅胶溶液，30℃下静置3h、凝固，获得生物敷料。
结论：所获得的生物敷料的真皮层中含有经冷冻干燥失活的人成纤维细胞以及细胞外基质，其中，所述细胞外基质主要包括EGF、BFGF、VEGF、IGF1、IGF2、TGF-B1、TGF-B2、PDGF和KGF，在将所述生物敷料用于创面修复时，细胞外基质中的活性因子能够迁移至创面及其创面周围，促进机体创周及创基的细胞增殖与血管新生，从而能够加快创面修复，缩短愈合时间，减轻患者痛苦，进一步地，由于冷冻干燥后的真皮层为多孔的海绵状，在冷冻干燥后的真皮层上涂覆硅胶溶液时，操作更加方便，不易对真皮层造成损伤，且涂覆所形成的硅胶膜作为表皮层更加均匀平整，在用于创面修复时，能够保护真皮层以及创面免受外界异物以及病原体的入侵，为真皮层参与创面修复提供保障。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
Claims (10)
1.一种生物敷料的制备方法，其特征在于，包括：
步骤1)将人成纤维细胞接种到覆盖有胶原的尼龙网膜上，培养，获得真皮层；
步骤2)将所获得的真皮层进行冷冻干燥，获得含有失活的人成纤维细胞和细胞外基质的真皮层；
步骤3)在含有失活的人成纤维细胞和细胞外基质的真皮层的上表面涂覆硅胶溶液，静置、凝固，获得生物敷料。
2.根据权利要求1所述的生物敷料的制备方法，其特征在于，所述将所获得的真皮层进行冷冻干燥包括：
预冻阶段：将真皮层在-30--40℃冻结1.5-3h，真皮层中的水分冻结为冰；
升华阶段：在真空度为10-30Pa下，在1h内升温至-10℃，保温8-10h；在1h内升温至0℃，保温8-10h，在1min内升温至10℃，保温2-3h，将预冻阶段形成的冰升华除去真皮层中大部分水分；
再干燥阶段：在真空度为10-30Pa下，在1min内升温至20℃，保温3-5h，除去真皮层中的结合水分。
3.根据权利要求1所述的生物敷料的制备方法，其特征在于，步骤1)之前还包括：制备覆盖有胶原的尼龙网膜；
具体为：取尼龙网膜除菌，将除菌后的尼龙网膜沾上胶原溶液置于容器中，静置、凝固。
4.根据权利要求3所述的生物敷料的制备方法，其特征在于，所述容器为皮片发生器。
5.根据权利要求1所述的生物敷料的制备方法，其特征在于，将人成纤维细胞接种到覆盖有胶原的尼龙网膜上具体为：将人成纤维细胞与胶原溶液的混合液加入到覆盖有胶原的尼龙网膜上，其中，所述混合液中人成纤维细胞的浓度为1-10×106个/ml。
6.根据权利要求1所述的生物敷料的制备方法，其特征在于，步骤1)中培养的具体方法为：在36-38℃、5％-10％的二氧化碳培养箱中培养8-12天，每天更换培养液一次。
7.根据权利要求1所述的生物敷料的制备方法，其特征在于，所述细胞外基质至少包括：表皮生长因子EGF、血管内皮生长因子VEGF、碱性成纤维细胞生长因子bFGF、转化生长因子-β1 TGF-β1、转化生长因子-β2 TGF-β2、转化生长因子-β3 TGF-β3、类胰岛素一号增长因子IGF-1和类胰岛素二号增长因子IGF-2。
8.一种生物敷料，其特征在于，包括：
真皮层以及涂覆在所述真皮层上表面的硅胶膜；其中，所述真皮层含有经冷冻干燥失活的人成纤维细胞和细胞外基质。
9.根据权利要求8所述的生物敷料，其特征在于，所述生物敷料为膜片状。
10.根据权利要求8或9所述的生物敷料，其特征在于，所述细胞外基质至少包括：表皮生长因子EGF、血管内皮生长因子VEGF、碱性成纤维细胞生长因子bFGF、转化生长因子-β1TGF-β1、转化生长因子-β2 TGF-β2、转化生长因子-β3 TGF-β3、类胰岛素一号增长因子IGF-1和类胰岛素二号增长因子IGF-2。
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Citations (3)
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| CN1493261A (zh) * | 2003-09-02 | 2004-05-05 | 中国人民解放军第四军医大学口腔医学 | 一种组织工程真皮及其制备方法 |
| CN104399120A (zh) * | 2014-10-31 | 2015-03-11 | 陕西艾尔肤组织工程有限公司 | 一种胶原膜的制备方法及胶原膜 |
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2015
- 2015-10-23 CN CN201510700273.1A patent/CN105214129B/zh active Active
Patent Citations (3)
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