CN104399120A - 一种胶原膜的制备方法及胶原膜 - Google Patents
一种胶原膜的制备方法及胶原膜 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及生物领域,尤其涉及一种胶原膜的制备方法及胶原膜。所得胶原膜比较致密,且具有合适的降解性,能够有效保护真皮基质层和避免创面感染。克服了现有技术胶原膜比较稀松,不适合用于作为组织工程皮肤的真皮层的保护层的缺陷。本发明实施例提供的胶原膜的制备方法,包括:配置胶原蛋白溶液,所述胶原蛋白溶液的pH值为6-8;将所述胶原蛋白溶液凝胶,得到胶块;将所述胶块在交联剂作用下震荡交联并清洗;将所述震荡交联并清洗后的胶块进行压膜,得到胶原膜。
Description
技术领域
本发明涉及生物领域,尤其涉及一种胶原膜的制备方法及胶原膜。
背景技术
皮肤是人体最大的器官,它具有屏障、感觉、调节体温、分泌与排泄、参与免疫反应、维持内外环境稳定等功能。随着经济、科技和社会的发展及人类平均寿命的延长,各种外伤特别是烧伤、老年性疾病等引起的皮肤缺损越来越多。自体皮肤移植作为这类皮肤缺损治疗的金标准,在临床应用中取得很大的成效。但是,自体皮肤移植需要把患者身上完好的皮肤通过手术切割下来,再覆盖到患者的皮肤缺损区,相应加大了对患者的打击,且在供皮区有可能形成疤痕及色素沉淀等,对患者造成二次伤害。
为了克服自体皮肤移植的缺陷,出现了多种替代自体皮肤的组织工程皮肤。例如,一种为包含双层活细胞的组织工程皮肤,该组织工程皮肤由表皮活细胞和真皮活细胞构成,虽然非常接近人体皮肤,但是由于活细胞生长及保存条件苛刻,使得该组织工程皮肤保质期短,且生产和保存成本较高,极大的限制了各种皮肤疾病治疗的应用;另一种为只包含真皮层的组织工程皮肤,其中真皮层由成纤维细胞和支架构成,例如可以通过将成纤维细胞接种于支架上培养,成纤维细胞在支架内增殖而形成。该组织工程皮肤虽然成分接近人体真皮,但是在使用时非常容易导致创面感染,也极大的限制了各种皮肤疾病治疗的应用。
所以,为组织工程皮肤的真皮层设置一层有效的保护层,对于组织工程皮肤的应用非常重要。
胶原(Collagen)是细胞外最重要的水不溶性纤维蛋白,是构成细胞外基质的骨架。胶原在哺乳动物体内含量丰富,约占人体或其他动物蛋白的20%-30%。主要存在于软骨、皮肤及肌腱等组织中,在动物体内起支持、保护及连接等多种作用。由于胶原具有良好的生物相溶性、无毒、弱抗原性、可降解性及安全性等优点,因此可以作为天然生物材料。例如,根据其止血功能,可以制作成海绵状用于止血,或者用于敷裹伤口;根据其可降解性可以用作手术缝线;进一步的可作为支架材料用于组织工程医学领域,引导组织再生,促进伤口修复愈合。
例如,公告号为CN 103071189 A的专利提供了一种组织引导再生用胶原膜的制备方法,该方法具体包括如下步骤:将胶原溶于酸性溶液中;将所得溶液的pH值调至5-9;继续将所得溶液快速剪切搅拌,获得胶原乳液;将所得胶原乳液离心,收集溶液上面的胶原膜;所得胶原膜经模具成型,冷冻干燥,采用物理或/和化学方法交联,即可。
现有技术中公开的胶原膜直接通过离心成膜,所得胶原膜比较稀松,适合用于引导组织再生,但是并不适合用于作为组织工程皮肤的真皮层的保护层。
发明内容
本发明的主要目的在于,提供一种胶原膜的制备方法及胶原膜,所得胶原膜比较致密,且具有合适的降解性,能够有效保护真皮基质层和避免创面感染。
为达到上述目的,本发明采用如下技术方案:
第一方面,本发明实施例提供一种胶原膜的制备方法,包括:
配置胶原蛋白溶液,所述胶原蛋白溶液的pH值为6-8;
将所述胶原蛋白溶液凝胶,得到胶块;
将所述胶块在交联剂作用下震荡交联并清洗;
将所述震荡交联并清洗后的胶块进行压膜,得到胶原膜。
优选的,所述配置胶原蛋白溶液,包括;
将胶原蛋白和0.05%-0.5%的乙酸混合,静置溶解;
在冰浴条件下,将溶解后的胶原蛋白溶液中加入酚红溶液,并调节pH值至6-8。
优选的,所述将所述胶原蛋白溶液凝胶,得到胶块,包括:
将所述胶原蛋白溶液移至凝胶模具中,在37℃下恒温凝胶30min-80min,得到胶块。
优选的,将所述胶块在交联剂作用下震荡交联,包括:
将所述胶块在EDC作用下,室温震荡交联14-40h。
优选的,所述EDC的浓度为10mM-50mM。
优选的,所述将所述震荡交联并清洗后的胶块进行压膜,包括:
一次压膜:按照0.5kg/胶块-1.5kg/胶块的压力对所述胶块施压5min-15min,然后按照2kg/胶块-5kg/胶块的压力对所述胶块施压40min-70min;
清洗:用纯化水对所述一次压膜后的胶块清洗至少一次;
二次压膜:按照2kg/胶块-5kg/胶块的压力对所述清洗后的胶块再次施压20min-40min。
优选的,所述将所述震荡交联并清洗后的胶块进行压膜,包括:
一次压膜:按照0.5kg/胶块-1.5kg/胶块的压力对所述胶块施压5min-15min,然后按照2kg/胶块-5kg/胶块的压力对所述胶块施压40min-70min。
优选的,所述胶原膜为牛源性胶原膜。
第二方面,本发明实施例提供一种胶原膜,所述胶原膜由第一方面任一所述的胶原膜的制备方法制备而得。
第三方面,本发明实施例提供一种重组人脱细胞真皮,包含如第二方面所述的胶原膜,以及与所述胶原膜粘合的真皮基质层,所述胶原膜用于保护所述真皮基质层,所述真皮基质层包含生物活性因子和失活的人源成纤维细胞。
本发明实施例提供的一种胶原膜的制备方法,通过将胶原蛋白溶液先凝胶,得到胶块;再对胶块进行交联,增加其强度,然后对交联后的胶块进行压膜,所得胶原膜比较致密,且具有合适的降解性,能够有效保护真皮基质层和避免创面感染。克服了现有技术胶原膜比较稀松,不适合用于作为组织工程皮肤的真皮层的保护层的缺陷。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1为本发明实施例提供的一种胶原膜的制备方法的流程图;
图2为本发明实施例中一种组织工程真皮的结构示意图;
图3为本发明实施例中另一种组织工程真皮的结构示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
在本发明的描述中,需要理解的是,术语“中心”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系,仅是为了便于描述本发明和简化描述,而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作,因此不能理解为对本发明的限制。在本发明的描述中,除非另有说明,“多个”的含义是两个或两个以上。
本发明实施例提供的一种胶原膜的制备方法,参见图1,包括:
步骤1、配置胶原蛋白溶液,所述胶原蛋白溶液的pH值为6-8;
步骤2、将所述胶原蛋白溶液凝胶,得到胶块;
步骤3、将所述胶块在交联剂作用下震荡交联并清洗;
步骤4、将所述震荡交联并清洗后的胶块进行压膜,得到胶原膜。
通过上述步骤1和步骤4,所得胶原膜比较致密,且具有合适的降解性,能够有效保护真皮基质层和避免创面感染。
下面对本发明实施例的具体实现方式进行说明。
优选的,步骤1可以包括:
步骤11、将胶原蛋白和0.05%-0.5%的乙酸混合,在静置溶解。
其中,静置溶解时,优选的,可以在2-10℃条件下进行,以避免胶原的热变性,防止胶原氢键的破坏,一般的,溶解36-72h即可。优选的,所述胶原蛋白为牛源性胶原蛋白。
步骤12、在冰浴条件下,将溶解后的胶原蛋白溶液加入酚红溶液,并调节pH值至6-8。
其中,可以选择常规的碱性试剂调节pH值,本发明实施例对此不进行限制,例如,碱性试剂可以为NaOH。酚红溶液具有指示pH值的作用,可以通过颜色变化指示pH值,从而节省了配置胶原蛋白溶液的时间。优选的,胶原蛋白溶液与酚红溶液的比例可以为100:0.5-2。
并且,在冰浴条件下调解pH值,可以避免胶原的热变性,防止胶原氢键的破坏。
优选的,步骤2可以包括:
将所述胶原蛋白溶液移至凝胶模具中,在37℃下恒温凝胶30min-80min,得到胶块。
其中,凝胶模具本发明实施例不做具体限定,可以为各种形式的培养皿,例如,可以为直径5cm的玻璃培养皿。
优选的,步骤3可以包括:
将所述胶块在EDC作用下,室温震荡交联14-40h。
示例性的,交联剂可以为EDC,EDC的浓度可以为10mM-50mM,优选的,EDC的浓度为30mM或者50mM。
经过交联,所得胶块更致密,强度更高。可以延缓其降解速度。
优选的,在步骤3之后,可以对步骤3所得交联的胶块进行清洗,以去除胶块中残存的交联剂。
通过步骤4对步骤3所得胶块进行压膜,可以去除胶块中多余的水分,得到致密的胶原膜,所述胶原膜的厚度小于或等于3mm。
需要说明的是,可以对步骤3所得胶块进行一次压膜得到所述胶原膜,也可以进行两次及两次以上压膜,得到所述胶原膜,本实施例对此不进行具体限制。本发明实施例仅以通过两次压膜得到胶原膜和和通过一次压膜得到胶原膜为例进行说明。
1、通过两次压膜得到胶原膜的过程为:
一次压膜:按照0.5kg/胶块-1.5kg/胶块的压力对所述胶块施压5min-15min,然后按照2kg/胶块-5kg/胶块的压力对所述胶块施压40min-70min。
示例性,一次压膜的方式可以为:在洁净的玻璃板上平铺一层尼龙膜,然后将步骤3所得胶块放在所述尼龙膜上,然后在该胶块上表面再平铺一层尼龙膜,然后在尼龙膜上表面放置一层玻璃,玻璃上再缓慢增加重物,加至0.5kg/胶块-1.5kg/胶块的压力时,静置5min-15min;然后继续增加重物,加至2kg/胶块-5kg/胶块的压力后,静置40min-70min即可。
清洗:用纯化水对所述一次压膜后的胶块清洗至少一次。
二次压膜:按照2kg/胶块-5kg/胶块的压力对所述清洗后的胶块再次施压20min-40min。
示例性,二次压膜的方式可以为:在洁净的玻璃板上平铺一层尼龙膜,然后将清洗后的胶块放在所述尼龙膜上,然后在该胶块上表面再平铺一层尼龙膜,然后在尼龙膜上表面放置一层玻璃,玻璃上再缓慢增加重物,加至2kg/胶块-5kg/胶块的压力后,静置20min-40min即可。
2、通过一次压膜得到胶原膜的过程为:
一次压膜:按照0.5kg/胶块-1.5kg/胶块的压力对所述胶块施压5min-15min,然后按照2kg/胶块-5kg/胶块的压力对所述胶块施压40min-70min;
该一次压膜方式与上述一次压膜方式相同,在此不再详述。
下面通过具体实施例对该胶原膜的制备方法进行说明。
实施例1
配置胶原蛋白溶液:将胶原蛋白和0.05%的乙酸混合;放入4℃冰箱静置48小时,溶解完全;在冰浴条件下,将溶解后的胶原蛋白溶液中加入酚红溶液,其中,胶原蛋白溶液与酚红溶液的体积比为100∶1,用NaOH调节pH值至6.5;
凝胶:将配置的胶原蛋白溶液至凝胶模具中,在37℃下恒温凝胶60min,得到胶块;
交联:将凝胶所得胶块在浓度为50mM的EDC作用下,室温震荡交联16h。
压膜:按照1.0kg/胶块的压力对所述胶块施压10min,然后按照2.5kg/胶块的压力对所述胶块施压60min;用纯化水对所述胶块清洗5次;然后按照3kg/胶块的压力对所述清洗后的胶块再次施压30min即可。
本实施例所得胶原膜厚度为3mm以下,致密且均匀,具有良好的生物相容性,能够应用于组织工程皮肤,可临时性封闭、保护创面,阻挡异物和病原体的侵入,防止组织液的丢失,同时可以延缓降解,保护组织工程皮肤的真皮基质层,为组织的再生修复提供了保障。
实施例2
配置胶原蛋白溶液:将胶原蛋白和0.1%的乙酸混合;放入6℃冰箱静置72h,溶解完全;在冰浴条件下,将溶解后的胶原蛋白溶液中加入酚红溶液,其中,胶原蛋白溶液与酚红溶液的体积比为100∶2,用NaOH调节pH值至7;
凝胶:将配置的胶原蛋白溶液至凝胶模具中,在37℃下恒温凝胶50min,得到胶块;
交联:将凝胶所得胶块在浓度为30mM的EDC作用下,室温震荡交联36h。
压膜:按照1.2kg/胶块的压力对所述胶块施压12min,然后按照3kg/胶块的压力对所述胶块施压60min;用纯化水对所述胶块清洗4次;然后按照5kg/胶块的压力对所述清洗后的胶块再次施压20min即可。
本实施例所得胶原膜厚度为3mm以下,致密且均匀,具有良好的生物相容性,能够应用于组织工程皮肤,可临时性封闭、保护创面,阻挡异物和病原体的侵入,防止组织液的丢失,同时可以延缓降解,保护组织工程皮肤的真皮基质层,为组织的再生修复提供了保障。
实施例3
配置胶原蛋白溶液:将胶原蛋白和0.3%的乙酸混合;放入8℃冰箱静置55h,溶解完全;在冰浴条件下,将溶解后的胶原蛋白溶液中加入酚红溶液,其中,胶原蛋白溶液与酚红溶液的体积比为100∶1.5,用NaOH调节pH值至8;
凝胶:将配置的胶原蛋白溶液至凝胶模具中,在37℃下恒温凝胶70min,得到胶块;
交联:将凝胶所得胶块在浓度为30mM的EDC作用下,室温震荡交联24h。
压膜:按照1kg/胶块的压力对所述胶块施压10min,然后按照4kg/胶块的压力对所述胶块施压55min即可。
本实施例所得胶原膜厚度为3mm以下,致密且均匀,具有良好的生物相容性,能够应用于组织工程皮肤,可临时性封闭、保护创面,阻挡异物和病原体的侵入,防止组织液的丢失,同时可以延缓降解,保护组织工程皮肤的真皮基质层,为组织的再生修复提供了保障。
实施例4
配置胶原蛋白溶液:将胶原蛋白和0.5%的乙酸混合;放入2℃冰箱静置36h,溶解完全;在冰浴条件下,将溶解后的胶原蛋白溶液中加入酚红溶液,其中,胶原蛋白溶液与酚红溶液的体积比为100∶0.5,用NaOH调节pH值至6;
凝胶:将配置的胶原蛋白溶液至凝胶模具中,在37℃下恒温凝胶30min,得到胶块;
交联:将凝胶所得胶块在浓度为30mM的EDC作用下,室温震荡交联14h。
压膜:按照0.5kg/胶块的压力对所述胶块施压15min,然后按照2kg/胶块的压力对所述胶块施压70min;用纯化水对所述胶块清洗3次;然后按照2kg/胶块的压力对所述清洗后的胶块再次施压40min即可。
本实施例所得胶原膜厚度为3mm以下,致密且均匀,具有良好的生物相容性,能够应用于组织工程皮肤,可临时性封闭、保护创面,阻挡异物和病原体的侵入,防止组织液的丢失,同时可以延缓降解,保护组织工程皮肤的真皮基质层,为组织的再生修复提供了保障。
实施例5
配置胶原蛋白溶液:将胶原蛋白和0.15%的乙酸混合;放入10℃冰箱静置70h,溶解完全;在冰浴条件下,将溶解后的胶原蛋白溶液中加入酚红溶液,其中,胶原蛋白溶液与酚红溶液的体积比为100∶1.2,用NaOH调节pH值至7.5;
凝胶:将配置的胶原蛋白溶液至凝胶模具中,在37℃下恒温凝胶80min,得到胶块;
交联:将凝胶所得胶块在浓度为10mM的EDC作用下,室温震荡交联40h。
压膜:按照1.5kg/胶块的压力对所述胶块施压5min,然后按照5kg/胶块的压力对所述胶块施压40min即可。
本实施例所得胶原膜厚度为3mm以下,致密且均匀,具有良好的生物相容性,能够应用于组织工程皮肤,可临时性封闭、保护创面,阻挡异物和病原体的侵入,防止组织液的丢失,同时可以延缓降解,保护组织工程皮肤的真皮基质层,为组织的再生修复提供了保障。
本发明另一实施例提供一种胶原膜,所述胶原膜由上述实施例所述的胶原膜的制备方法制备而得。
本发明实施例所得胶原膜致密且均匀,具有良好的生物相容性,能够应用于组织工程皮肤,可临时性封闭、保护创面,阻挡异物和病原体的侵入,防止组织液的丢失,同时可以延缓降解,保护组织工程皮肤的真皮基质层,为组织的再生修复提供了保障。
本发明再一实施例提供一种组织工程皮肤,参见图2,该组织工程皮肤包含所述胶原膜21,以及与所述胶原膜21粘合的真皮基质层22,所述胶原膜21用于保护所述真皮基质层22,所述真皮基质层22包含生物活性因子和失活的人源成纤维细胞。
其中,真皮基质层22和胶原膜21均为片状结构,优选的,真皮基质层22和胶原膜21的大小和形状相同,两者之间呈粘接状态,但真皮基质层和胶原膜的具体形状在此不限定,例如,可以为方形,圆形,或其他任意形状,可根据实际需要设定。
在将该组织工程皮肤移植至皮肤创面处后,真皮基质层22的生物活性因子能够持续释放于创面处及其周围,促进机体创周及创基的细胞增殖与血管新生,缩短愈合时间。而胶原膜21具有良好的生物相容性,应用后可临时性封闭、保护创面,阻挡异物和病原体的侵入,防止组织液的丢失,同时可以延缓降解,保护真皮基质层22的生物活性因子,为组织的再生修复提供了保障,并且在这个过程中胶原膜21进行缓慢降解,最后在创面愈合后自行脱落。
进一步优选的,参见图3,所述胶原膜21以及真皮基质层22上均匀分布有通孔23。通孔23的设置,能够保证气液面交换,并且有利于创面愈合过程中的组织废液,通过该通孔渗出。
本发明实施例提供的一种组织工程皮肤,包含胶原膜21,以及与所述胶原膜21粘合的真皮基质层22,真皮基质层22包含生物活性因子和失活的人源成纤维细胞,能够有效修复皮肤缺损,而胶原膜21能够保护真皮基质层22,使其充分发挥修复作用;并且可以保护伤口免受感染,而且,因为真皮基质层31不含成纤维活细胞,降低了保存条件以及保存成本,延长了保存时间。克服了现有技术组织工程皮肤保质期短,且生产和保存成本较高,以及使用时容易导致创面感染的缺陷。
以上所述,仅为本发明的具体实施方式,但本发明的保护范围并不局限于此,任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内,可轻易想到变化或替换,都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此,本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
Claims (10)
1.一种胶原膜的制备方法,其特征在于,包括:
配置胶原蛋白溶液,所述胶原蛋白溶液的pH值为6-8;
将所述胶原蛋白溶液凝胶,得到胶块;
将所述胶块在交联剂作用下震荡交联并清洗;
将所述震荡交联并清洗后的胶块进行压膜,得到胶原膜。
2.根据权利要求1所述胶原膜的制备方法,其特征在于,所述配置胶原蛋白溶液,包括:
将胶原蛋白和0.05%-0.5%的乙酸混合,静置溶解;
在冰浴条件下,将溶解后的胶原蛋白溶液中加入酚红溶液,并调节pH值至6-8。
3.根据权利要求1或2所述胶原膜的制备方法,其特征在于,所述将所述胶原蛋白溶液凝胶,得到胶块,包括:
将所述胶原蛋白溶液移至凝胶模具中,在37℃下恒温凝胶30min-80min,得到胶块。
4.根据权利要求1所述胶原膜的制备方法,其特征在于,将所述胶块在交联剂作用下震荡交联,包括:
将所述胶块在EDC作用下,室温震荡交联14-40h。
5.根据权利要求4所述胶原膜的制备方法,其特征在于,所述EDC的浓度为10mM-50mM。
6.根据权利要求1所述胶原膜的制备方法,其特征在于,所述将所述震荡交联并清洗后的胶块进行压膜,包括:
一次压膜:按照0.5kg/胶块-1.5kg/胶块的压力对所述胶块施压5min-15min,然后按照2kg/胶块-5kg/胶块的压力对所述胶块施压40min-70min;
清洗:用纯化水对所述一次压膜后的胶块清洗至少一次;
二次压膜:按照2kg/胶块-5kg/胶块的压力对所述清洗后的胶块再次施压20min-40min。
7.根据权利要求1所述胶原膜的制备方法,其特征在于,所述将所述震荡交联并清洗后的胶块进行压膜,包括:
一次压膜:按照0.5kg/胶块-1.5kg/胶块的压力对所述胶块施压5min-15min,然后按照2kg/胶块-5kg/胶块的压力对所述胶块施压40min-70min。
8.根据权利要求1-7任一项所述胶原膜的制备方法,其特征在于,所述胶原膜为牛源性胶原膜。
9.一种胶原膜,其特征在于,所述胶原膜由所述权利要求1-8任一项所述胶原膜的制备方法制备而得。
10.一种组织工程皮肤,其特征在于,包含如权利要求9所述的胶原膜,以及与所述胶原膜粘合的真皮基质层,所述胶原膜用于保护所述真皮基质层,所述真皮基质层包含生物活性因子和失活的人源成纤维细胞。
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