CN104888279A - 胶原/丝素蛋白复合支架、制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种胶原/丝素蛋白复合支架、制备方法及其应用，包括胶原基多孔支架和丝素无纺布，所述丝素无纺布紧密地整合于胶原基多孔支架中，所述的胶原基多孔支架具有30—500μm的孔径结构；丝素无纺布具有良好的三维多孔结构和通透性，孔径范围在20—3000μm之间，单根熟丝的直径在10μm左右，一般为8-12μm。通过本发明所述制备方法得到的一种胶原/丝素蛋白复合支架，具有生物相容性良好，机械性能优良，并具有一定可降解性的无纺布结构，能够完好地满足组织工程皮肤构建，进而促进皮肤创面愈合并提高愈合质量。

Description

胶原 / 丝素蛋白复合支架、制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种组织工程支架，尤其涉及一种胶原/丝素蛋白复合支架、制备方法及其应用。

背景技术

真皮组织一旦损伤则无法完全再生，临床上大面积的深度皮肤损伤通常采用自体、异体或异种皮片移植修复治疗，但这些治疗手段一方面会对供体造成新的创伤，供皮区疤痕增生或难以自愈；另一方面可供用于移植的皮片来源有限，并且存在感染和排异等不良反应的可能，有时难以达到理想的修复效果。皮肤组织工程的基本思路是重建受损的真皮组织使真皮再生成为可能。

丝素蛋白是天然生物材料的杰出代表之一，安全无毒，无刺激性，且具有独特的机械性能和良好的生物学活性，不但可以单独用于组织工程支架的构建，还可以与其他生物材料联合构建各种支架。

胶原蛋白是构成结缔组织蛋白质量最大的实质性组织，是细胞外基质的主要成分，其超微结构及稳定性在细胞-细胞，细胞-基质交互作用中起着极其重要的作用；它具有广泛的活性和良好的生物相容性，是构建组织工程的理想材料，但单纯以胶原蛋白构建的组织工程支架其降解速度较快，强大也比较差，难以达到皮肤组织工程支架的要求。

有鉴于此，本发明人对此进行研究，专门开发出一种胶原/丝素蛋白复合支架、制备方法及其应用，本案由此产生。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种生物相容性良好，机械性能优良，并具有一定可降解性的无纺布结构，能够完好地满足组织工程皮肤构建，进而促进皮肤创面愈合并提高愈合质量的胶原/丝素蛋白复合型组织工程支架。

为了实现上述目的，本发明的解决方案是：

一种胶原/丝素蛋白复合支架，包括胶原基多孔支架和丝素无纺布，所述丝素无纺布紧密地整合于胶原基多孔支架中，所述的胶原基多孔支架具有30—500μm的孔径结构；丝素无纺布具有良好的三维多孔结构和通透性，孔径范围在20—3000μm之间，单根熟丝的直径在10μm左右，一般为8-12μm。

本发明的目的之二是提供上述胶原/丝素蛋白复合支架的制备方法，将丝素无纺布引入胶原基多孔支架，得到具有良好机械性能和良好生物相容性的复合型组织工程支架，具体包括如下步骤：

1） 丝素无纺布制备：先将柞蚕或家蚕蚕茧于沸水中煮沸3h，然后置于常温的0.02M Na₂CO₃溶液中3h，重复上述步骤三次直至蚕茧呈松散状，将蚕茧层层剥开并撑附晾干，得到蚕丝纤维无纺布；再将上述蚕丝纤维无纺布于沸水中煮沸3h，然后依次置于90℃和100℃的0.02M Na₂CO₃溶液，各孵育1h，将蚕丝纤维无纺布重复上述步骤三次后，用磷酸盐缓冲液（PBS）溶液洗净得到纯化的丝素蛋白无纺布并晾干；

2）分别配制5 g/L胶原溶液，以及用于制备胶原基支架所需的天然生物材料溶液，并将其按照设定体积比例与已配制胶原溶液完全混合；

3）将步骤1）制备得到的丝素无纺布裁剪成设定的尺寸并平展铺在模具底部，注入适量5 g/L的胶原溶液，采用冷冻-冻干法，在−10℃至−100℃下冷冻0.5至10小时后，在冻干机中冻干得到初始的胶原/丝素蛋白复合型支架；

4）将步骤3）所得到的支架经物理干热方法交联，交联温度为80℃至150℃，交联时间为1-72小时，然后置于醛类化合物、碳化二亚胺类化合物或京尼平溶液中交联1-48小时；

5）清洗、再次冷冻-冻干；经钴60辐照灭菌后制得胶原/丝素蛋白复合型支架。

上述步骤（3）中的模具可为任意形状，优选圆形、方形等，可根据具体用途而异。

复合支架中胶原材料和丝素蛋白材料的比例可根据构建不同的组织工程材料而异。

本发明的目的之三是提供上述胶原/丝素蛋白复合支架的应用，所述胶原/丝素蛋白复合支架主要应用于构建组织工程皮肤、骨、软骨、血管、硬脑膜、韧带和肌腱等。

本发明制备的胶原/丝素蛋白复合型组织工程支架因含有天然结构的无纺布丝素蛋白而具有较好的机械性能，有利于支架结构的维系，有利于细胞、血管及组织的长入，而其本身具有优良的生物相容性，有利于机体细胞的粘附、增值和分红，另外，丝素蛋白具有一定的可降解性，有利于机体组织的再生。因此，本发明制备的胶原/丝素蛋白复合型组织工程支架是一种适用于组织工程皮肤皮肤、骨、软骨、血管、硬脑膜、韧带和肌腱等构建的优良的再生材料。

以下结合附图及具体实施例对本发明做进一步详细描述。

附图说明

图1是本发明胶原/丝素蛋白复合型组织工程支架横断面的扫描电镜照片；

图2是本发明胶原/丝素蛋白复合型组织工程支架在SD大鼠体内埋植的手术照片，A为埋植前，B为埋植后大体观。

具体实施方式

一种胶原/丝素蛋白复合支架，包括胶原基多孔支架和丝素无纺布，所述丝素无纺布较为紧密地整合于胶原基多孔支架中，所述的胶原基多孔支架具有30—500μm的孔径结构；丝素无纺布具有良好的三维多孔结构和通透性，孔径范围在20—3000μm之间，单根熟丝的直径在10μm左右，如图1所示。

丝素无纺布与胶原基支架的数量关系可以根据支架的不同用途及构建目标组织/器官的性质进行调整。用于制备胶原基多孔支架的材料除胶原之外，还可以采用壳聚糖、透明质酸、丝素蛋白、硫酸软骨素、糖胺聚糖、弹性蛋白及其水解物、层黏连蛋白、骨形成蛋白、纤维素等。

上述胶原/丝素蛋白复合支架的制备方法，具体包括如下步骤：

1 、Ⅰ型胶原蛋白的提取和纯化

（1）取新鲜的牛腱，剔除肌肉、脂肪和筋膜，用三蒸水反复冲洗；

（2）取适量处理的牛腱剪成碎块，用0.1%的Na₂CO₃浸泡2h，再用三蒸水冲洗5次；

（3）将牛腱碎块移入研钵，倒入适量液氮充分冷冻，然后用组织打碎机将其打成粉末，-20℃下保存备用；

（4）取适量牛腱粉末，加入0.5%乙酸溶液加1%胃蛋白酶溶液4℃下充分溶胀、消化24h以上，然后加入几滴H₂O₂，充分混匀后静置10-15min；

（5）加入3%乙酸1000ml，充分混匀后，用组织匀浆机匀浆，布氏漏斗过滤，将未溶胀的牛腱颗粒过滤掉。溶胀物于离心机中离心（2000r/min，15min），以除去不溶物；

（6）5%NaCl溶液盐析、离心（2000r/min,5min），收集沉淀；

（7）沉淀物于3%乙酸中充分溶胀，未溶胀牛腱颗粒再溶胀后重复5，6步骤；

（8）4℃下三蒸水中透析72h，每12h换水一次；

（9）透析后的胶原，经冷冻冻干后于4℃下保存备用。

、丝素蛋白无纺布的制备

（1）配制0.02M Na₂CO₃溶液各500mL，至于两只烧杯中，其中一只加热煮沸，另一只保持室温；取柞蚕蚕茧10个，于沸水中煮沸3h，之后取出并至于另一只常温下的烧杯中3h，重复上述步骤三次直至蚕茧呈松散状，小心地将蚕茧层层剥开，并层层撑附在架子上晾干，得到蚕丝纤维无纺布。

（2）重新配制0.02M Na₂CO₃溶液各500mL，分别加热至90℃和100℃，再将上述蚕丝纤维无纺布于沸水中煮沸3h，任何依次放入90℃和100℃的Na₂CO₃溶液各孵育1h，重复上述步骤三次，以便于将丝胶脱干净，得到丝素蛋白无纺布。

、胶原 / 丝素蛋白复合组织工程支架构建

称取一定量的牛Ⅰ型胶原粉末溶于0.5%的乙酸溶液，得到5 g/L的胶原溶液。将丝素无纺布裁剪成直径为2.0cm的圆片并平展铺在模具底部，然后注入适量5 g/L的胶原溶液，经冷冻-冻干处理得到厚度约为0.2cm的复合支架。再经乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺（EDAC）交联及二次冷冻-冻干，经钴60辐照灭菌于4℃下保存备用。

本实施例所述的胶原/丝素蛋白复合支架主要应用于构建组织工程皮肤、骨、软骨、血管、硬脑膜、韧带和肌腱等。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的具体实施例子。显然，本发明不限于以上实施例子，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种胶原/丝素蛋白复合支架，其特征在于：包括胶原基多孔支架和丝素无纺布，所述丝素无纺布紧密地整合于胶原基多孔支架中，所述的胶原基多孔支架具有30—500μm的孔径结构；丝素无纺布孔径范围在20—3000μm，单根熟丝的直径在8-12μm。

2.一种胶原/丝素蛋白复合支架的制备方法，其特征在于具体包括如下步骤：

1）丝素无纺布制备：先将柞蚕或家蚕蚕茧于沸水中煮沸3h，然后置于常温的0.02M Na₂CO₃溶液中3h，重复上述步骤三次直至蚕茧呈松散状，将蚕茧层层剥开并撑附晾干，得到蚕丝纤维无纺布；再将上述蚕丝纤维无纺布于沸水中煮沸3h，然后依次置于90℃和100℃的0.02M Na₂CO₃溶液，各孵育1h，将蚕丝纤维无纺布重复上述步骤三次后，用磷酸盐缓冲液溶液洗净得到纯化的丝素蛋白无纺布并晾干；

2）分别配制5 g/L胶原溶液，以及用于制备胶原基支架所需的天然生物材料溶液，并将其按照设定体积比例与已配制胶原溶液完全混合；

3）将步骤1）制备得到的丝素无纺布裁剪成设定的尺寸并平展铺在模具底部，注入适量5 g/L的胶原溶液，采用冷冻-冻干法，在−10℃至−100℃下冷冻0.5至10小时后，在冻干机中冻干得到初始的胶原/丝素蛋白复合型支架；

4）将步骤3）所得到的支架经物理干热方法交联，交联温度为80℃至150℃，交联时间为1-72小时，然后置于醛类化合物、碳化二亚胺类化合物或京尼平溶液中交联1-48小时；

5）清洗、再次冷冻-冻干；经钴60辐照灭菌后制得胶原/丝素蛋白复合型支架。

3.如权利要求2所述的一种胶原/丝素蛋白复合支架的制备方法，其特征在于：所述步骤（3）中的模具可为任意形状。

4.如权利要求2所述的一种胶原/丝素蛋白复合支架的制备方法，其特征在于：所述步骤（3）中的模具为圆形、方形。

5.一种胶原/丝素蛋白复合支架的应用，其特征在于：所述胶原/丝素蛋白复合支架主要应用于构建组织工程皮肤、骨、软骨、血管、硬脑膜、韧带和肌腱。