CN105833357B - 一种易保存生物羊膜的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种易保存生物羊膜的制备方法，属于生物羊膜制备领域。本发明将羊膜清洗酶解，过滤后加入甘油浸泡，并用生理盐水冲洗，得粗生物羊膜，之后取壳聚糖和无菌水，混合加入磷酸溶液，茶多酚、酪蛋白以及过硫酸铵，再次混合加热并加入甲壳素，得混合液，随后将得到的粗生物羊膜浸泡混合液中，通过微波反应，冲洗过滤，置于无菌净化间自然晾干，从而得到易保存生物羊膜的制备方法。实例证明，本发明操作工艺简便，无需特殊仪器，不仅克服了现有羊膜材料较薄，机械强度较差，易撕裂的缺陷，而且制得的生物羊膜无生物学毒性，具有较好的相容组织性，可在常温下长期保存，保存时间延长至3～5年，使用方便，可规模化生产。
Description
技术领域
本发明公开了一种易保存生物羊膜的制备方法，属于生物羊膜制备领域。
背景技术
羊膜由于自身独有的特性受到国内外学者关注，羊膜是指人类胎盘的基底膜层，是无血管、无细胞结构的胶原组织层，富含IV、V型胶原、碱性成纤维细胞生长因子(BFGF)、干细胞生长因子(HGF)，易使上皮细胞移行长入、促进上皮的分化、增殖，在上皮创伤愈合中起重要作用。羊膜含各种蛋白抑制因子，通过抑制相应蛋白酶而发挥抗炎作用。同时还含有抑制细胞因子表达和调节细胞凋亡成分TGF-β1，可避免胶原纤维过度增生，预防粘连。作为一种新的生物材料，近年来国内外临床上广泛用于烧伤创面及眼科疾病的辅助治疗，其疗效非常显著。
目前，人羊膜主要用于外科手术中，其中包括：1、眼睛表面疾病如角膜修复、先天性青光眼、角膜溃疡等；2、修补鼓膜损伤；3、用于疝修补；4、外科手术后预防粘连；5、烧伤后表面覆盖，用作生物敷料。
传统制备得到的羊膜材料比较薄、易卷曲、黏附性较差、使用时易滑动脱落。为了克服上述缺点，目前采用交联技术制备复合生物衍生羊膜以改善其可操作性，但处理时使用了氯仿、甲醇、戊二醛等多种有机试剂，处理强度大，经过脱脂等多个步骤后对羊膜的天然结构破坏很大，造成胶原束排列不规则，胶原纤维断裂，同时大量的生物活性因子失活试剂残留风险高。
目前临床上采用的羊膜主要为临时剥离处理的新鲜羊膜，或者经过预处理的深低温保存羊膜。两者均不能做到随取随用。目前还有一种技术是将羊膜预处理后真空冷冻干燥，灭菌包装储存，该种方式能够做到随取随用，延长保存期到1～3年。但这种羊膜材料极少能完全取出细胞等抗原成分，因此仍具有一定的抗原性，有可能在使用时引发炎症。单层的羊膜或羊膜材料较薄，机械强度较差，易撕裂，手术中操作困难，不利于临床使用和研究。
发明内容
本发明主要解决的技术问题：针对目前普遍使用的新鲜羊膜，不利于保存，使用时不方便，且羊膜材料较薄，机械强度较差，易撕裂，导致手术中操作困难的现状，提供了一种将羊膜清洗酶解，过滤后加入甘油浸泡，并用生理盐水冲洗，得粗生物羊膜，之后取壳聚糖和无菌水，混合加入磷酸缓冲溶液，茶多酚、酪蛋白以及过硫酸铵，再次混合加热并加入甲壳素， 得混合液，随后将得到的粗生物羊膜浸泡混合液中，通过微波反应，冲洗过滤，置于无菌净化间自然晾干，从而得到易保存生物羊膜的制备方法。该方法操作工艺简便，无需特殊仪器，不仅克服了现有羊膜材料较薄，机械强度较差，易撕裂的缺陷，而且制得的生物羊膜无生物学毒性，具有较好的相容组织性，可在常温下长期保存，保存时间延长至3～5年，使用方便，可规模化生产，广泛应用于各种外科手术中。
为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：
（1）取新鲜羊膜，使用水将其表面清洗干净，将清洗后的羊膜浸泡于质量分数为4～6％乳酸溶液中，并置于超声振荡器中，在23～25KHz下振荡50～70min后进行过滤，使用蒸馏水淋洗羊膜表面，直至淋洗液pH为7.0，将淋洗后羊膜与羊膜质量3～5％胰蛋白酶，搅拌均匀，在30～35℃下酶解5～7h；
（2）待上述酶解结束后进行过滤，收集酶解后的羊膜，将笛膜平铺于冰块表面，将酶解后的羊膜平铺于笛膜表面，羊膜下皮面朝下，使用细胞刮子将羊膜上的表面杂质去除，随后将去除杂质后的羊膜浸泡于甘油中，于4～6℃下，静置脱水过夜，再进行过滤，使用生理盐水将过滤后的羊膜冲洗5～7次，得粗生物羊膜，备用；
（3）按固液比1:3，取壳聚糖与无菌水搅拌均匀，放入玻璃容器中，再向玻璃容器中加入pH为4.5的磷酸缓冲溶液，加入量为无菌水体积的30～40％，搅拌均匀并静置10～15min，分别向玻璃容器中加入壳聚糖质量50～60％茶多酚、壳聚糖质量1～3％酪蛋白及酪蛋白质量10～15％的过硫酸铵；
（4）在上述物质加入后，对玻璃容器进行加热至50～60℃，以150r/min搅拌4～7h后，向其中加入上述壳聚糖质量2～4％甲壳素，搅拌均匀，将步骤（3）所得的粗生物羊膜放入玻璃容器中，使其完全浸泡于玻璃容器中的混合物中，随后将玻璃容器移至微波反应器中10～12h，再进行过滤，使用生理盐水冲洗过滤后的羊膜5～7次，将冲洗后的羊膜置于无菌净化间内，自然晾干，即可得到易保存生物羊膜。
本发明的应用方法是：选取3～5只健康小老鼠，消毒后经乙醚麻醉，切开背部皮肤2～3cm，植入长（cm）×宽（cm）为0.5×1.0～0.8×1.0本发明制得的生物羊膜，缝合，消毒，术后观察7～14天，可发现伤口无任何感染，创面愈合良好，植入物周围物任何积液、化脓现状，具有显著的组织相容性，可作为医用材料广泛用于各种外科手术中。 本发明的有益效果是：
（1）本发明操作工艺简便，在制备的过程中无需特殊仪器，反应温和，制得的生物羊膜无生物学毒性，具有较好的相容组织性，且机械强度大，不易撕裂；
（2）本发明制得的生物羊膜可在常温下长期保存，保存时间延长至3～5年，使用方便，可规模化生产，广泛应用于各种外科手术中。
具体实施方式
首先取新鲜羊膜，使用水将其表面清洗干净，将清洗后的羊膜浸泡于质量分数为4～6％乳酸溶液中，并置于超声振荡器中，在23～25KHz下振荡50～70min后进行过滤，使用蒸馏水淋洗羊膜表面，直至淋洗液pH为7.0，将淋洗后羊膜与羊膜质量3～5％胰蛋白酶，搅拌均匀，在30～35℃下酶解5～7h；待上述酶解结束后进行过滤，收集酶解后的羊膜，将笛膜平铺于冰块表面，将酶解后的羊膜平铺于笛膜表面，羊膜下皮面朝下，使用细胞刮子将羊膜上的表面杂质去除，随后将去除杂质后的羊膜浸泡于甘油中，于4～6℃下，静置脱水过夜，再进行过滤，使用生理盐水将过滤后的羊膜冲洗5～7次，得粗生物羊膜，备用；随后按固液比1:3，取壳聚糖与无菌水搅拌均匀，放入玻璃容器中，再向玻璃容器中加入pH为4.5的磷酸缓冲溶液，加入量为无菌水体积的30～40％，搅拌均匀并静置10～15min，分别向玻璃容器中加入壳聚糖质量50～60％的茶多酚、壳聚糖质量1～3％的酪蛋白及酪蛋白质量10～15％的过硫酸铵；最后在上述物质加入后，对玻璃容器进行加热至50～60℃，以150r/min搅拌4～7h后，向其中加入上述壳聚糖质量2～4％的甲壳素，搅拌均匀，将上述所得的粗生物羊膜放入玻璃容器中，使其完全浸泡于玻璃容器中的混合物中，随后将玻璃容器移至微波反应器中10～12h，再进行过滤，使用生理盐水冲洗过滤后的羊膜5～7次，将冲洗后的羊膜置于无菌净化间内，自然晾干，即可得到易保存生物羊膜。
实例1
首先取新鲜羊膜，使用水将其表面清洗干净，将清洗后的羊膜浸泡于质量分数为4％乳酸溶液中，并置于超声振荡器中，在23KHz下振荡50min后进行过滤，使用蒸馏水淋洗羊膜表面，直至淋洗液pH为7.0，将淋洗后羊膜与羊膜质量3％胰蛋白酶，搅拌均匀，在30℃下酶解5h；待上述酶解结束后进行过滤，收集酶解后的羊膜，将笛膜平铺于冰块表面，将酶解后的羊膜平铺于笛膜表面，羊膜下皮面朝下，使用细胞刮子将羊膜上的表面杂质去除，随后将去除杂质后的羊膜浸泡于甘油中，于4℃下，静置脱水过夜，再进行过滤，使用生理盐水将过滤后的羊膜冲洗5次，得粗生物羊膜，备用；随后按固液比1:3，取壳聚糖与无菌水搅拌均匀，放入玻璃容器中，再向玻璃容器中加入pH为4.5的磷酸缓冲溶液，加入量为无菌水体积的30％，搅拌均匀并静置10min，分别向玻璃容器中加入壳聚糖质量50％的茶多酚、壳聚糖质量1％的酪蛋白及酪蛋白质量1％的过硫酸铵；最后在上述物质加入后，对玻璃容器进行加热至50℃，以150r/min搅拌4h后，向其中加入上述壳聚糖质量2％的甲壳素，搅拌均匀，将上述所得的粗生物羊膜放入玻璃容器中，使其完全浸泡于玻璃容器中的混合物中，随后将玻璃容器移至微波反应器中10h，再进行过滤，使用生理盐水冲洗过滤后的羊膜5次，将冲洗后的羊膜置于无菌净化间内，自然晾干，即可得到易保存生物羊膜。
本实例方法独特新颖，测试时，选取3只健康小老鼠，消毒后经乙醚麻醉，切开背部皮肤2cm，植入长（cm）×宽（cm）为0.5×1.0本发明制得的生物羊膜，缝合，消毒，术后观察7天，可发现伤口无任何感染，创面愈合良好，植入物周围物任何积液、化脓现状，具有显著的组织相容性，可作为医用材料广泛用于各种外科手术中。
实例2
首先取新鲜羊膜，使用水将其表面清洗干净，将清洗后的羊膜浸泡于质量分数为5％乳酸溶液中，并置于超声振荡器中，在24KHz下振荡60min后进行过滤，使用蒸馏水淋洗羊膜表面，直至淋洗液pH为7.0，将淋洗后羊膜与羊膜质量4％胰蛋白酶，搅拌均匀，在33℃下酶解6h；待上述酶解结束后进行过滤，收集酶解后的羊膜，将笛膜平铺于冰块表面，将酶解后的羊膜平铺于笛膜表面，羊膜下皮面朝下，使用细胞刮子将羊膜上的表面杂质去除，随后将去除杂质后的羊膜浸泡于甘油中，于5℃下，静置脱水过夜，再进行过滤，使用生理盐水将过滤后的羊膜冲洗6次，得粗生物羊膜，备用；随后按固液比1:3，取壳聚糖与无菌水搅拌均匀，放入玻璃容器中，再向玻璃容器中加入pH为4.5的磷酸缓冲溶液，加入量为无菌水体积的40％，搅拌均匀并静置13min，分别向玻璃容器中加入壳聚糖质量55％的茶多酚、壳聚糖质量2％的酪蛋白及酪蛋白质量13％的过硫酸铵；最后在上述物质加入后，对玻璃容器进行加热至55℃，以150r/min搅拌6h后，向其中加入上述壳聚糖质量3％的甲壳素，搅拌均匀，将上述所得的粗生物羊膜放入玻璃容器中，使其完全浸泡于玻璃容器中的混合物中，随后将玻璃容器移至微波反应器中11h，再进行过滤，使用生理盐水冲洗过滤后的羊膜6次，将冲洗后的羊膜置于无菌净化间内，自然晾干，即可得到易保存生物羊膜。
本实例方法独特新颖，测试时，选取4只健康小老鼠，消毒后经乙醚麻醉，切开背部皮肤2.5cm，植入长（cm）×宽（cm）为0.7×1.0本发明制得的生物羊膜，缝合，消毒，术后观察12天，可发现伤口无任何感染，创面愈合良好，植入物周围物任何积液、化脓现状，具有显著的组织相容性，可作为医用材料广泛用于各种外科手术中。
实例3
首先取新鲜羊膜，使用水将其表面清洗干净，将清洗后的羊膜浸泡于质量分数为6％乳酸溶液中，并置于超声振荡器中，在25KHz下振荡70min后进行过滤，使用蒸馏水淋洗羊膜表面，直至淋洗液pH为7.0，将淋洗后羊膜与羊膜质量5％胰蛋白酶，搅拌均匀，在35℃下酶解7h；待上述酶解结束后进行过滤，收集酶解后的羊膜，将笛膜平铺于冰块表面，将酶解后的羊膜平铺于笛膜表面，羊膜下皮面朝下，使用细胞刮子将羊膜上的表面杂质去除，随后将去除杂质后的羊膜浸泡于甘油中，于6℃下，静置脱水过夜，再进行过滤，使用生理盐水将过滤后的羊膜冲洗7次，得粗生物羊膜，备用；随后按固液比1:3，取壳聚糖与无菌水搅拌均匀，放入玻璃容器中，再向玻璃容器中加入pH为4.5的磷酸缓冲溶液，加入量为无菌水体积的35％，搅拌均匀并静置15min，分别向玻璃容器中加入壳聚糖质量60％的茶多酚、壳聚糖质量3％的酪蛋白及酪蛋白质量15％的过硫酸铵；最后在上述物质加入后，对玻璃容器进行加热至60℃，以150r/min搅拌7h后，向其中加入上述壳聚糖质量4％的甲壳素，搅拌均匀，将上述所得的粗生物羊膜放入玻璃容器中，使其完全浸泡于玻璃容器中的混合物中，随后将玻璃容器移至微波反应器中12h，再进行过滤，使用生理盐水冲洗过滤后的羊膜7次，将冲洗后的羊膜置于无菌净化间内，自然晾干，即可得到易保存生物羊膜。
本实例方法独特新颖，测试时，选取5只健康小老鼠，消毒后经乙醚麻醉，切开背部皮肤3cm，植入长（cm）×宽（cm）为0.8×1.0本发明制得的生物羊膜，缝合，消毒，术后观察14天，可发现伤口无任何感染，创面愈合良好，植入物周围物任何积液、化脓现状，具有显著的组织相容性，可作为医用材料广泛用于各种外科手术中。
Claims (1)
1.一种易保存生物羊膜的制备方法，其特征在于具体制备步骤为：
（1）取新鲜羊膜，使用水将其表面清洗干净，将清洗后的羊膜浸泡于质量分数为4～6％乳酸溶液中，并置于超声振荡器中，在23～25KHz下振荡50～70min后进行过滤，使用蒸馏水淋洗羊膜表面，直至淋洗液pH为7.0，将淋洗后羊膜与羊膜质量3～5％胰蛋白酶，搅拌均匀，在30～35℃下酶解5～7h；
（2）待上述酶解结束后进行过滤，收集酶解后的羊膜，将笛膜平铺于冰块表面，将酶解后的羊膜平铺于笛膜表面，羊膜下皮面朝下，使用细胞刮子将羊膜上的表面杂质去除，随后将去除杂质后的羊膜浸泡于甘油中，于4～6℃下，静置脱水过夜，再进行过滤，使用生理盐水将过滤后的羊膜冲洗5～7次，得粗生物羊膜，备用；
（3）按固液比1:3，取壳聚糖与无菌水搅拌均匀，放入玻璃容器中，再向玻璃容器中加入pH为4.5的磷酸缓冲溶液，加入量为无菌水体积的30～40％，搅拌均匀并静置10～15min，分别向玻璃容器中加入壳聚糖质量50～60％茶多酚、壳聚糖质量1～3％酪蛋白及酪蛋白质量10～15％的过硫酸铵；
（4）在上述物质加入后，对玻璃容器进行加热至50～60℃，以150r/min搅拌4～7h后，向其中加入上述壳聚糖质量2～4％甲壳素，搅拌均匀，将步骤（3）所得的粗生物羊膜放入玻璃容器中，使其完全浸泡于玻璃容器中的混合物中，随后将玻璃容器移至微波反应器中10～12h，再进行过滤，使用生理盐水冲洗过滤后的羊膜5～7次，将冲洗后的羊膜置于无菌净化间内，自然晾干，即可得到易保存生物羊膜。
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