JP2019513514A - 複合細胞外マトリックス成分生体材料 - Google Patents

Abstract

本発明は、無細胞小腸粘膜下組織ＳＩＳを中間層とし、無細胞膀胱マトリックスＵＢＭを上下表層とし、前記上下表層が中間層を完全に被覆してサンドイッチ構造を形成している複合細胞外マトリックス成分生体材料に関する。本発明は、ＵＢＭが、ＳＩＳの免疫原性及びその宿主組織との直接接触を遮断し、移植後の宿主−材料境界領域での炎症応答の基本的なタイプが単純なＵＢＭとは同じであり、組織適合性が高いという利点と、ＳＩＳが、ＵＢＭの機械的強度が低いという欠点を補うことができるとともに、製造しやすく、接ぎ合わせ後の厚さが可変であるという利点とを統合し、筋膜、脳膜、胸膜、骨盤底、真皮、実質臓器などの様々な軟組織の欠損に対する充填、補強、修復又は再建に適用され、臨床的実用性が高い。【選択図】図１

Description

本発明は、組織修復材料の分野に属し、特に複合細胞外マトリックス成分生体材料に関する。

無細胞組織マトリックス生体材料（Ａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｉｓｓｕｅ Ｍａｔｒｉｘ、ＡＣＴＭ）は、２０年以来、軟組織修復材料の研究における重要な進歩である。即ち、物理的又は化学的方法によって、組織中の全ての細胞、抗原、脂質、可溶性タンパク質などの物質を取り除き、残りの完全な外観形態、組織学的特性及び超微細構造を有する不溶性細胞外マトリックス（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｍａｔｒｉｘ、ＥＣＭ）を生体足場とする。ＥＣＭは、生物進化過程で高度に保存されている部分であり、異種間の同じ組織内のＥＣＭの差が小さく、免疫学的拒絶反応を引き起こす細胞成分及び抗原を脱細胞化技術によって除去したＡＣＴＭは、安全に異種移植及び同種移植できる。合成材料が慢性炎症性刺激を引き起こして線維芽細胞に包み込まれて瘢痕を修復する機構とは異なり、ＡＣＴＭは、移植後に、それに含まれる生体信号又は分解産物が修復領域周辺のマクロファージ及び幹細胞の能動的かつ迅速な浸潤を誘導し、成長し、増殖し、かつ自己細胞外マトリックスを分泌してインプラントを置換できるという「内因性組織再生」を誘導することができる。宿主組織の成長に伴って、ＡＣＴＭが徐々に分解し、両者が基本的に同期し、最後にＡＣＴＭが宿主組織で完全に置き換えられる。したがって、ＡＣＴＭは、組織修復材料として、以下の多くの利点を有する。（１）構造と成分が自然組織に近く、主要成分がコラーゲン繊維などの構造タンパク質、少量の糖タンパク質、フィブロネクチン、グリコサミノグリカン及びプロテオグリカン、成長因子及び酵素などであり、（２）ＡＣＴＭが高い分解性及び分解速度制御性を有し、分解が再生規則に適合し、（３）ＡＣＴＭが組織間の栄養と物質の空気の交換を容易にする一定の空隙率を有し、（４）ＡＣＴＭが組織の成長を支える一定の機械的強度を有し、（５）食細胞の早期侵入、早期局所急速血管再生を実現でき、細菌生体被膜が形成しにくいため、感染に耐えるある程度の能力を有し、汚染又は潜伏感染が伴う組織欠損に使用できる。

ＡＣＴＭは、現在、髄膜、胸膜、腹壁筋膜などの置き換え、吻合部の補強、骨盤底の再建、膀胱の吊り下げ、肝脾臓などの実質臓器の損傷のガーゼ圧迫留置止血、様々な複雑ヘルニア及び腹壁欠損の治療、例えば、汚染が伴う腹壁欠損、合成パッチの移植後の感染、腸瘻の二次手術治療などに臨床的に使用されている。統計によると、米国でＡＣＴＭの使用量は、既に、軟組織修復材料の５〜１０％を占める。組織供給源に従って、生物学的パッチは、以下の二種類に分けられている。（１）ヒト死体/ブタの真皮、ウシ/ブタ/ウマの心膜、ウシ/ブタの腹膜などを代表とする惰性組織（Ｉｎｅｒｔ ｔｉｓｓｕｅ、ＩＴ）由来製品である。由来組織が体内の生物学的惰性組織に属し、成分がほとんど構造タンパク質（コラーゲン繊維及び弾性繊維）であり、フィブロネクチン、成長因子及びプロテオグリカンなどの生理活性成分がない。（２）生体組織の細胞外マトリックスの完全な３次元超微細構造、フィブロネクチン類、成長因子類及びグリコサミノグリカン類などの生理活性成分を有するＥＣＭ由来生体材料である。このような製品が小腸粘膜下組織（Ｓｍａｌｌ Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ Ｓｕｂｍｕｃｏｓａ、ＳＩＳ）、ヒト羊膜、膀胱マトリックス（Ｕｒｉｎａｒｙ Ｂｌａｄｄｅｒ Ｍａｔｒｉｘ、ＵＢＭ）などを代表とする。ＥＣＭ生体材料の製造技術（脱細胞化処理及び成形プロセス）は、ＩＴ由来製品に比べて、より複雑であるが、ＥＣＭ生体材料は、ＩＴ由来製品に比べて、組織欠損を修復するより多くの優位性を有する。即ち、（１）ＩＴ由来製品は、組織欠損を充填し、解剖学的修復を達成するために血管新生結合組織再生を誘導することしかできないが、ＥＣＭ生体材料は、移植後に宿主領域と効果的に整合し、自家幹細胞を主動的に誘引して損傷部に移動させ、かつ増殖及び分化を促進して、ある程度の特異性かつ機能的修復を達成し、例えば、筋肉筋膜などの組織の再生と神経支配の部分的な回復を実現して、障害の四肢の機能及び指先の再建を改善することができる。（２）ＩＴ由来製品は、構造が緻密であり、分解が緩やかで、ヒトの２５歳後に再生できない大量の弾性繊維を含有するため、修復領域が長期間に安定せず、弾性が失いやすいことになる。（３）ＥＣＭ生体材料は、ＩＴ由来製品より感染に耐え、組織再生速度が速い。

ＳＩＳは、哺乳動物の小腸に由来し、小腸の筋層及び漿膜層を機械的に除去して脱細胞化することにより得られる。ＳＩＳは、主にＩ型、ＩＩＩ型コラーゲンで構成され、少量のＩＶ型、Ｖ型コラーゲン、グリコサミノグリカン、成長因子、フィブロネクチンなどを含有し、体内に移植した後に完全に分解でき、組織工学の優れた足場材料である。ＳＩＳは、優れた機械的強度を有し、原料源が広く、前処理しやすく、又は機械によって自動化処理を実現することができる。しかしながら、ＳＩＳの生理活性は比較的低く、かつ生体環境で食品中の様々な抗原にさらされる可能性があるため、高い初期バイオバーデンを有し、厳格な脱細胞化、滅菌などの処理が行われたが、依然として一定の免疫原性（エンドトキシン、Ｇａｌ抗原エピトープなどの可能な残留）を有して、宿主免疫応答を引き起こす。

中国特許ＣＮ２６０８０１４には、ヒト羊膜層に小腸粘膜下組織を結合し、人体硬膜の機械的引張性能及びくも膜下癒着防止の二重の機能を有する、硬膜及びくも膜の機能を併せ持つ人工硬膜が開示されている。しかしながら、この製造方法では、ＳＩＳの免疫原性を完全に遮断することがない。

中国特許ＣＮ１０１３６６９７９には、無細胞小腸粘膜下組織を内層とし、両側が無細胞羊膜で被覆されてなる組織パッチ及びその製造方法が開示されている。無細胞羊膜で無細胞小腸粘膜下組織の免疫毒性を遮断し、また、無細胞粘膜下組織は、無細胞羊膜の機械的強度の不足を補い、高い生理活性及び組織適合性を有し、顕著な免疫学的拒絶反応がなく、細胞に毒性がない。しかし、羊膜はヒト由来材料であり、その供給源を制御しにくく、未知のウイルス又は病気を伝播する危険性がある。

ＵＢＭは、哺乳動物の膀胱に由来し、機械的方法で漿膜層、筋層、粘膜下組織、粘膜筋板を除去して、脱細胞化処理を行うことにより製造される。ＳＩＳに比べて、ＵＢＭは、以下の優位性を有する。（１）免疫原性が非常に低く、組織適合性が高く、即ち、ＵＢＭは、生体内に細菌などのバイオバーデンと接触せず、レベルが簡単であり、材料選択プロセスでエンドトキシン汚染がないことを達成できる。（２）生理活性が高く、即ち、ＵＢＭは、完全な基底膜構造及び成分を含有し、血管、皮膚などの上皮組織細胞の増殖のための支持層を構成することができ、組織特異性細胞が連続的なシートを形成して瘢痕組織の形成を抑制し、組織修復及び創傷治癒を補強して欠損組織特異性の再生を達成することに役立つ。Ｍａｔｒｉｓｔｅｍ（Ａｃｅｌｌ会社のＵＢＭ製品）で治療された患者は、創傷治癒時間が２５．５週間から９．８週間に短縮する。分解産物は、神経栄養、血管新生の促進、腫瘍活性又は他の組織再建、創傷修復の阻害に関連する成分を含み、組織治癒に関連する４１種のタンパク質又はポリペプチドを有すると確認できる５０００種以上の活性成分を含有する（表１）。しかしながら、実際の製造プロセスでは、ＵＢＭの剥離に要する人件費が高く、かつ機械的強度が不足し、表面が平滑で一定の厚さの製品を製造しにくい。

本発明が解決しようとする技術的課題は、ＵＢＭがＳＩＳの免疫原性及びそれと宿主組織との直接接触を遮断し、移植後の宿主−材料の境界領域での炎症応答の基本的なタイプが単純なＵＢＭと同じであり、組織適合性が高いという利点と、ＳＩＳがＵＢＭの機械的強度が低いという欠点を補うことができ、また、ＳＩＳが製造しやすく、接ぎ合わせ後の厚さが可変であるという利点とを統合し、筋膜、脳膜、胸膜、骨盤底、真皮、実質臓器などの様々な軟組織の欠損に対する充填、補強、修復又は再建に適用され、臨床的実用性が高い複合細胞外マトリックス成分生体材料を提供することである。

本発明に係る複合細胞外マトリックス成分生体材料は、無細胞小腸粘膜下組織ＳＩＳを中間層とし、無細胞膀胱マトリックスＵＢＭを上下表層とし、前記上下表層で中間層を完全に被覆してサンドイッチ構造を形成する。

前記ＳＩＳは、機械的方法で哺乳動物の小腸の漿膜層及び筋層を除去して脱細胞化処理を行うことにより製造され、膜状材料である。

前記ＵＢＭは、機械的方法で哺乳動物の膀胱の漿膜層、筋層、粘膜下組織、粘膜筋板を除去して脱細胞化処理を行うことにより製造され、膜状材料である。
前記中間層の層数は１〜２０層である。
前記上下表層の層数はそれぞれ１〜１０層である。
前記中間層と上下表層との間、中間層と上下表層内（即ち、多層ＵＢＭ間、多層ＳＩＳ間）は、医療用接着剤、縫合結紮、真空積層のうちの１種以上の方式で固定される。

前記上下表層は、高い生理活性を有し、かつ中間層の免疫原性を効果的に遮断し、外層ＵＢＭの宿主−材料の境界領域での炎症応答のタイプを変えない。前記中間層は、材料の機械的強度と材料の厚さを顕著に向上させることができる。

前記医療用接着剤は、キトサン、コラーゲン、フィブリン糊、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、ヒドロゲル、骨膠、ゼラチン又はペクチンなどの成分のうちの１種以上である。医療用接着剤、縫合線は、好ましくは吸収性の成分である。

前記真空積層のプロセスパラメータは、真空圧力が−５０〜−７６０ｍｍＨｇであり、作用時間が０．５〜７２ｈである。
前記生体材料は、材料を貫通する孔をさらに含む。
前記孔の直径は１〜５ｍｍであり、孔間距離は、０．５〜５ｍｍである。

（１）生理活性が高く、組織接着が軽く、過剰な瘢痕がない。表層ＵＢＭ基底膜組織成分は、細胞増殖及び分化などの生理活動を支持及び調節する大量の活性因子、例えば、塩基性線維芽細胞増殖因子、上皮成長因子、肝細胞増殖因子、ケラチノサイト成長因子などの成分を放出し、細胞の接着及び移動を促進し、分化を誘導し、アポトーシスを減少させることができ、上皮細胞が線維芽細胞に優先して侵入するように調節し制御し、かつ過剰なフィブリノゲンの漏出を抑制し、線維芽細胞が優勢となる前に上皮組織を形成し、材料の表面が滑らかな基質膜構造と組み合わせ、接着を軽減し、瘢痕組織の形成を抑制する。
（２）組織適合性が高く、免疫原性が低く、ＵＢＭ宿主−材料境界領域での炎症応答の基本的なタイプを変えない。移植の初期段階で周囲の組織と直接接触できず、免疫応答を引き起こす可能性のある成分の放出を遅延させるように、ＳＩＳは、免疫原性が非常に低いＵＢＭに被覆され、免疫応答のタイプ及び程度が単純なＵＢＭ移植とは同じである。ＵＢＭの分解とともに、組織は、同期して増殖し、移植の後期にＳＩＳを徐々に露出しても組織修復の結果を変えない。材料全体を貫通する孔は、周囲の組織細胞の増殖を加速させ、組織液の流れに役立つため、血清腫などの局所合併症の発生率が低い。
（３）機械的強度が良好で、厚さが可変であり、異なる創傷修復のニーズに適応する。中間層は、材料全体の機械的強度を高めることができ、かつＳＩＳの層数は、異なる機械的需要がある組織修復に適応するように適切に増減することができる。医療用接着剤と真空積層との併用は、材料の剥離強度を高め、多層材料の水和又は切断後の完全性を保証し、緩めにくい。
（４）原材料の前処理の難しさを低減し、価格がひくい。本発明は、ＵＢＭとＳＩＳの利点を考慮するとともに、収量と生産サイクルの制限要因、即ち、ＵＢＭの使用量を大幅に減少させることができる。材料コストを低減し、生産サイクルを短縮し、人件費を低減する。

図１は、本発明の構造概略図である。１は、無細胞小腸粘膜下組織ＳＩＳであり、２は、無細胞膀胱マトリックスＵＢＭである。

以下、具体的な実施例を参照しながら本発明をさらに説明する。なお、これらの実施例は、本発明のみを説明する目的であり、本発明を限定するものではない。また、本発明に記載の内容を読むことで、当業者であれば、本発明に様々な変更又は修正を行うことができ、これらの等価の形式は、同様に本願の添付の特許請求の範囲によって限定される範囲内に入る。

Ａｂｒａｈａｍ法によりブタ由来無細胞膀胱マトリックス（ＵＢＭ）及び無細胞小腸粘膜下組織（ＳＩＳ）を製造する。１層のＵＢＭを平らに広げ（滑らかな面を下にする）、１つの膜状ＳＩＳを５０％の層間転位で、独立した層として接ぎ合わせ、ＵＢＭの表面に平らに広げ、９０°の層間転位で４層積層する。その上に１層のＵＢＭ（滑らかな面を上にする）をさらに敷く。気泡を除去し、医療用キトサン接着剤で各層を接着して、−２５０ｍｍＨｇの圧力で、２４ｈを経て一体にプレスする。材料の全層で孔を開設し、孔間距離が５ｍｍであり、直径が１ｍｍである。

Ａｂｒａｈａｍ法によりブタ由来無細胞膀胱マトリックス（ＵＢＭ）及び無細胞小腸粘膜下組織（ＳＩＳ）を製造する。２層のＵＢＭを平らに広げ（滑らかな面を下にする）、１つの膜状ＳＩＳを５０％の層間転位で、独立した層として接ぎ合わせ、ＵＢＭの表面に平らに広げ、９０°の層間転位で６層積層する。その上に２層のＵＢＭ（滑らかな面を上にする）をさらに敷く。気泡を除去し、医療用キトサン接着剤で各層を接着して、−３００ｍｍＨｇの圧力で、３６ｈを経て一体にプレスする。材料の全層で孔を開設し、孔間距離が８ｍｍであり、直径が２ｍｍである。

ＧＢ／Ｔ５２８−２００９によれば、３つのサンプルを４ｃｍ×１ｃｍのダンベル状に作成し、水和後にサンプルの両端を材料力学試験機で固定し、１０ｍｍ／ｍｉｎの速度で引き伸ばし、材料引張強度を３４±３Ｎ／ｃｍと測定する。

３つのサンプルを２ｃｍ×５ｃｍに作成し、両端を引張機の上、下部グリッパに固定し、サンプルの重なる部分が分離するまで１０ｍｍ／ｍｉｎの安定した速度で連続的に剥離する。分離時の負荷力を測定する。ＳＩＳ−ＳＩＳ間、ＵＢＭ−ＳＩＳ間の剥離強度を６±２Ｎ／ｃｍとし、剥離保持力を１．５±０．５Ｎ／ｃｍとする。

ＧＢ／Ｔ１６８８６．５に規定された方法に従って材料の細胞毒性を評価する。ＮＩＨ３Ｔ３及びＬ９２９をモデル細胞とする。細胞培地を浸出媒体とし、勾配濃度の浸出液を用いて培地に代えて細胞を培養し、ＭＴＴ法によって細胞生存率を測定する。材料の細胞毒性が０〜１レベルである。

細胞移動実験において、材料を低温で粉砕し、プロテアーゼで酵素分解し、酵素分解生成物の濃度を５０μｇ／ｍＬとする。細胞を２４ｈ飢餓培養した後、Ｂｏｙｄｅｎチャンバー法によって６ｈの細胞移動量を測定し、１０％のウシ胎児血清培地及び無血清培地をそれぞれ陽性対照及び陰性対照とする。修復材料の細胞移動量を２０５６±７２とし、陽性対照を２１０５±３５とし、陰性対照を１３２８±６５とする。材料群と陽性対照群との間に有意差がない（Ｐ＞０．０５）。

ＧＢ／Ｔ１４２３３．２に規定された方法に従って材料のエンドトキシン含有量を測定する。エンドトキシン検出用水を浸出媒体とし、３７℃で２４ｈ浸出する。動的比濁法によって材料のエンドトキシン含有量を決定し、希釈浸出液におけるエンドトキシン含有量を繰り返し測定して干渉を排除する。材料のエンドトキシン含有量≦５ＥＵ／装置である。

ＧＢ／Ｔ１４２３３．２に規定された方法に従って材料の血液適合性を測定する。接触群では、ラットの背部を脱毛し、濃度が５０μｇ／ｍＬの酵素分解生成物を１日１回、２０ｄ連続的に塗り、経口摂取群では、１ｍＬの浸出液を１日おきに、７ｄ経口摂取し、合計４回摂取し、筋肉内注射群及び静脈注射群では、濃度が０．１５ｍＬの浸出液を１日おきに、７ｄ注射し、合計４回注射する。感染する３０日目及び９０日目に動物を２つのバッチで殺し、試験のために静脈血を採取する。溶血率は、溶血率（％）＝（サンプル吸光度−陰性吸光度）／（陽性吸光度−陰性吸光度）×１００％の式に従って計算される。材料溶血率≦５％である。

ＧＢ／Ｔ１６８８６．１０に規定された方法に従って材料の皮内刺激性を評価する。ウサギに浸出液及び対照液をそれぞれ０．２ｍＬ皮内注射し、注射後１５ｍｉｎ、１ｈ、２ｄ、３ｄに実験領域の皮膚反応を観察し、紅斑及び浮腫情況に従ってスコア付けされる。材料は非刺激性である。

ＧＢ／Ｔ１６８８６．１０に規定された最大線量法に従って材料の感作性を評価する。純粋なデンプン溶液を陰性対照群とし、１週間経口投与し、中止後に１週間観察を続ける。ラットの体重を毎日記録し、臨床毒性徴候を観察し、毒性レベルを記録する。実験が終了した後、ラットの通常の組織病理学的切片を殺す。材料は遅延型過敏反応がない。

イヌ腹直筋鞘及び腹直筋欠損の動物モデルを構築し、欠損面積を１０×５ｃｍ^２とし、複合軟組織修復材料を一定の大きさに切断して、修復し、単純なＳＩＳ及び単純なＵＢＭを対照とする。単純なＳＩＳ対照群では、手術後の修復領域における血清腫の発生率が３３％であり、単純なＵＢＭ及び複合軟組織修復材料群に血清腫が発生しない。手術後２週間、１ヶ月、２ヶ月、４ヶ月で修復領域を取り出し、組織切片をＣＤ６８、ＣＣＲ７、ＣＤ１６３で染色し、浸潤細胞の種類と密度、Ｍ１／Ｍ２マクロファージの割合を観察する。材料がＵＢＭの宿主−材料炎症応答の基本的なタイプを変えず、かつ組織修復効果が単純なＵＢＭのものと類似することが確認される。

Claims (10)

1. 無細胞小腸粘膜下組織ＳＩＳを中間層とし、無細胞膀胱マトリックスＵＢＭを上下表層とし、前記上下表層で中間層を完全に被覆してサンドイッチ構造を形成していることを特徴とする複合細胞外マトリックス成分生体材料。
2. 前記ＳＩＳは、機械的方法で哺乳動物の小腸の漿膜層及び筋層を除去して脱細胞化処理を行うことにより製造されることを特徴とする請求項１に記載の複合細胞外マトリックス成分生体材料。
3. 前記ＵＢＭは、機械的方法で哺乳動物の膀胱の漿膜層、筋層、粘膜下組織、粘膜筋板を除去して脱細胞化処理を行うことにより製造されることを特徴とする請求項１に記載の複合細胞外マトリックス成分生体材料。
4. 前記中間層の層数は１〜２０層であることを特徴とする請求項１に記載の複合細胞外マトリックス成分生体材料。
5. 前記上下表層の層数はそれぞれ１〜１０層であることを特徴とする請求項１に記載の複合細胞外マトリックス成分生体材料。
6. 前記中間層と上下表層との間、中間層と上下表層内は、医療用接着剤、縫合結紮、真空積層のうちの１種以上の方式で固定されることを特徴とする請求項１に記載の複合細胞外マトリックス成分生体材料。
7. 前記医療用接着剤は、キトサン、コラーゲン、フィブリン糊、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、ヒドロゲル、骨膠、ゼラチン又はペクチンなどの成分のうちの１種以上であることを特徴とする請求項６に記載の複合細胞外マトリックス成分生体材料。
8. 前記真空積層のプロセスパラメータは、真空圧力が−５０〜−７６０ｍｍＨｇであり、作用時間が０．５〜７２ｈであることを特徴とする請求項６に記載の複合細胞外マトリックス成分生体材料。
9. 前記生体材料は、材料を貫通する孔をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の複合細胞外マトリックス成分生体材料。
10. 前記孔の直径は１〜５ｍｍであり、孔間距離は、０．５〜５ｍｍであることを特徴とする請求項１に記載の複合細胞外マトリックス成分生体材料。