CN100479867C - 一种胶联羊膜的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明是一种胶联羊膜，其特征在于：它是由羊膜与纤维蛋白胶粘合的双层或多层胶联羊膜。它的制备方法是将去上皮新鲜羊膜与未去上皮新鲜羊膜直接用纤维蛋白胶粘合；或者将浸泡在甘油中的保存羊膜经过复水后，再将去上皮羊膜与未去上皮羊膜用纤维蛋白胶粘合；或者将未去上皮羊膜之间用纤维蛋白胶粘合；最后将粘合的胶联羊膜置于纯甘油中在0～6℃密封无菌保存。它不仅保持了羊膜的生物学性状及各种生物学活性，而且临床治疗效果显著提高。它的制备过程简便、经济，保存期长达一年且生物安全性高，利于临床推广使用。因此，它可以广泛应用于组织工程重建与修复、外科创伤、溃疡组织修复，烧伤、烫伤生物敷料，整形外科眼表重建手术等。

Description

一种胶联羊膜的制备方法

一、技术领域

本发明属於医疗器械敷料，具体涉及人类细胞组织的培养或维持中的一种胶联羊膜及其制备方法。

二、背景技术

羊膜是一种天然的优良生物学材料，正常羊膜薄而透明，无血管及神经生长，厚度约为0.02mm-0.05mm。它在临床上可作为基底膜促进上皮形成，可促进上皮细胞移性分化、增强基底上皮细胞黏附、防止上皮细胞凋亡，促进上皮的增殖分化；能抑制炎症和新生血管；能抑制纤维化，达到抗瘢痕化的作用，同时还可以抑制由上皮细胞诱导的肌成纤维细胞分化，减少瘢痕形成；它可以作为细胞移行生长的良好支架，用于组织工程重建修复；它无抗原性，临床应用不会发生排斥反应，安全性高。

由于羊膜具有上述优良的生物学特性，目前已被广泛的应用于细胞培养支架、组织工程重建修复，外科创伤、烧伤、烫伤敷贴，眼表重建(治疗持续性角膜上皮缺损、眼表化学和热烧伤、修复结膜缺损等)，减轻难治性青光眼术后过滤口粘连，减轻准分子激光术后角膜浑浊，构件人工角膜，作为药物缓释系统等领域。

目前临床上使用的多为单层羊膜，但单层羊膜具有一个最大的缺点：即羊膜移植后，羊膜一般只能在创面保持几天至两周，最后完全溶解脱落，在较短的时间内很难完全发挥其多种生物学活性，因此也就不能持久的产生生物治疗的作用。此外，单层羊膜薄而柔软，使用时极易卷曲、折皱、撕裂，手术操作中剪切缝合均有难度。

在现有技术中，有一件发明名称为“一种可常温保存的生物羊膜的制备方法”，公开号为CN1644047A的中国发明专利申请于2005年7月27日公开，其制备方法为：将洗净的羊用膜经用0.1％～30％的甘油处理，置冷冻干燥机工作室经0℃～—56℃预冻1～10小时，开启冷凝室制冷，使冷阱温度达到—10℃～—56℃，开启真空泵，真空冷冻干燥，使羊膜水份含量达到1％～20％，再包装、灭菌。该方法的优点是可长期在室温下保存，便于运输。但该方法制备的羊膜为单层羊膜，因此它存在所有单层羊膜所具有的缺点，例如：薄、机械抗力差、易撕裂、易卷曲，手术操作中剪切缝合难，术后在创面保持时间短、易溶解脱落；其次，采用真空干燥制备的羊膜脆性较大，柔韧性差，不便于临床使用；另外，该方法制备过程复杂且需要真空低温干燥设备，羊膜造价高而不利于临床推广使用；况且，对于一些角膜、皮肤的深层溃疡，单层羊膜因太薄很难达到治疗作用。还有一件发明名称为“生物衍生羊膜、复合生物衍生羊膜及其制备方法”，公开号为CN1618954A的中国发明专利申请于2005年5月25日公开，生物衍生羊膜的具体制备方法为脱脂、去垢、消化，其脱脂剂为氯仿、甲醛混合液，去垢剂为SDS或TritonK100，消化剂是蛋白酶；复合衍生羊膜交联的方法为：羊膜低温干燥后紫外光照射，重度脱水后与胶原溶液进行胶连或用戊二醛、己异二氰酸酯、碳化二亚胺、叠氮二苯基磷、京尼平中任意一种进行交联。处理后的生物衍生羊膜和复合生物衍生羊膜完全去除了细胞层结构，仅保留致密层和基底层，因此可以避免免役反应，同时复合衍生羊膜可以增加机械强度，利于手术操作。但此方法制备的复合衍生羊膜采用有机化学物质对羊膜进行脱脂、去垢、消化，完全破坏了羊膜的正常结构和生物学特性，仅留下支架结构，使存在于羊膜细胞层结构中的EGF、BFGF等大量生物活性因子大大丧失，因此在很大程度上影响了羊膜的各种生物学治疗作用；其次，由该方法制备的复合衍生羊膜仍为单层羊膜，它同样存在所有单层羊膜具有的各种缺点；另外，该方法制备的复合衍生羊膜虽然增加了羊膜的机械强度，但破坏了其柔韧的物理学特性，由胶原和羊膜进行交联并用真空干燥保存后质地较硬，不方便临床使用，特别不利于眼表重建。

近年，国内外也有采用双层或多层羊膜治疗角膜深层溃疡、眼表重度烧伤等，其治疗效果较单层羊膜显著提高。但所有的方法都是将羊膜重叠起来，采用逢线法将其缝合固定于眼表或填塞于创面，这种方法在术后，患者须较长时间的加压包扎或戴亲水性角膜接触镜，即便如此，现有的双层或多层羊膜也极易分层，形成层间积液，表层羊膜很快脱落，继而全部羊膜溶解脱落，而且羊膜重叠后增加了手术难度，大量的缝合增加了新的损伤，过多的缝线易诱发炎症和新生血管。

三、发明内容：

本发明的目的在于：针对现有技术存在的上述诸多缺陷和不足，拟提供一种胶联羊膜及其制备方法，使它应用于临床能保持羊膜的生物学特性和羊膜的柔韧等物理学特性；使羊膜的厚度增加，更利于手术操作；能将纤维蛋白胶与羊膜结合起来，发挥二者的协同治疗作用，使治疗作用更好；同时能长期保存，制备简便，造价低。

采用以下技术方案来实现本发明的目的。

一种胶联羊膜，包括新鲜羊膜或保存羊膜，其特征在于：它是由单层新鲜羊膜或保存羊膜与纤维蛋白胶粘合的双层或多层胶联羊膜。

一种制备上述胶联羊膜的方法，其特征是将去上皮新鲜羊膜与未去上皮新鲜羊膜直接用纤维蛋白胶粘合；或者将浸泡在甘油中的保存羊膜经过复水后，再将去上皮羊膜与未去上皮羊膜用纤维蛋白胶粘合；或者将未去上皮羊膜之间用纤维蛋白胶粘合；最后将粘合的胶联羊膜置于纯甘油中在0～6℃密封无菌保存。

上述胶联羊膜制备方法，所说的未去上皮新鲜羊膜是用新鲜胎盘经羊膜与绒毛膜潜在间隙钝性分离，获得光滑、透明和无血管的羊膜，再浸泡于抗生素生理盐水混合液中灭菌20～30分钟；所说的去上皮新鲜羊膜最好是将上述羊膜用0.25wt％胰蛋白酶和0.02wt％EDTA混合液消化而获得。

上述胶联羊膜制备方法，最好是先将纤维蛋白胶均匀喷涂于新鲜羊膜的去上皮面或基底面，或者保存羊膜的去上皮面或基底面，再将另一未去皮的新鲜羊膜或保存羊膜按基底面向下的方式平整贴合其上，室温下干燥，待紧密粘连后用纯甘油浸泡处理24小时，再在纯甘油中密封无菌保存，获得双层胶联羊膜。

上述胶联羊膜制备方法，最好是采用一羊膜的去上皮面与另一羊膜的基底面用纤维蛋白胶依次相粘合的方式，制得仅表层羊膜保留上皮面的多层胶联羊膜。

本发明的胶联羊膜，选择纤维蛋白胶作为胶联粘合剂，是因为医用纤维蛋白胶是从血液中提取相关成分(纤维蛋白原、凝血酶等)，模拟人体凝血机制的最后阶段，最终形成的乳白色凝胶物，无任何组织毒性，安全性高。纤维蛋白胶具有良好的生物相溶性，在常温常压下可实现快速粘合，且粘合强度持久、粘合部分具有弹性和韧性；纤维蛋白胶在体外干燥环境下不降解，只有在体内遇到纤溶酶，达到效果后才逐渐降解、代谢和吸收；此外，纤维蛋白胶可以抑制新生血管和瘢痕生长，适于粘接粘膜、肌肉、血管、神经等软组织。纤维蛋白胶由于具有止血、促进组织生长修复、防止组织粘连的作用而被广泛应用于外科手术。

本发明采用纤维蛋白胶将羊膜相胶联，形成一种新型复合羊膜片，呈半透明薄片状，不仅保持了羊膜的生物学性状及各种生物学活性，克服了单层羊膜薄而柔软易撕裂、手术操作难等问题，而且由于加入了纤维蛋白胶，发挥了纤维蛋白胶与羊膜的协同作用，临床治疗效果显著提高。本发明可以根据需要制成不同厚度的多层胶联羊膜，而且很容易剪切缝合，羊膜移植后羊膜内无层间积液，不分层。它的制备过程简便、经济，保存期长达一年且生物安全性高，利于临床推广使用。因此，它可以广泛应用于组织工程重建与修复、外科创伤、溃疡组织修复，烧伤、烫伤生物敷料，整形外科眼表重建手术等。在本发明的胶联羊膜基础上，还可以制备各种组织工程材料，构建药物缓释系统，大大拓展了胶联羊膜的应用前景。在“再生医学”成为竞争热点的今天，本发明的胶联羊膜将以简便、高效、经济的方式引导组织的修复重建，使羊膜能更好的服务于人类。

四、附图说明

图1是制备好的胶联羊膜照片；

图2是镊子提起胶联羊膜能保持形状而不卷曲的状态照片；

图3是胶联羊膜组织切片，HE染色100倍，双层羊膜之间为纤维蛋白胶的照片；

图4是角膜病灶清除后用胶联羊膜覆盖时的状态照片；

图5是胶联羊膜完全将角膜表面覆盖的状态照片；

图6是翼状胬肉切除后胶联羊膜覆盖状态照片。

五、具体实施方式

下面用多个制备实施例来具体实施本发明胶联羊膜的技术方案，但本发明绝不局限于所列举的实施例；同时，通过体外动物实验、毒理实验、临床试验来验证本发明胶联羊膜的有益效果。

(一)制备实施例

实施例1双层胶联羊膜的制备

1)取健康剖宫产胎盘，用含2000U/ML庆大霉素、2.5UG/ML两性霉素B的医用生理盐水冲洗后，通过羊膜与绒毛膜的潜在间隙钝性分离，获得光滑、透明、无血管的羊膜，并浸泡于抗生物生理盐水混合液中灭菌20分钟。

2)制备去上皮羊膜：将羊膜上皮面向上平铺于硝酸纤维滤纸上(微孔为0.45um)；用0.25％胰蛋白酶和0.06％EDTA混合液，37℃温箱消化羊膜30分钟后，用细胞刷子刮除残留上皮，并随机取少量去上皮羊膜，在光镜下验证上皮细胞已刮除干净。

3)双层羊膜胶联方法：

A、将步骤2)所述制备好的去上皮羊膜基底面贴于硝酸纤维素滤纸，将未去上皮的羊膜上皮面贴于硝酸纤维素滤纸；

B、将纤维蛋白胶均匀喷涂于羊膜的去上皮面(即双层之底层羊膜)；将另一含上皮的羊膜(即双层之表层羊膜)平整贴在其上，此时硝酸纤维滤纸将两层羊膜夹在中间，用平底器皿轻轻加压3分钟，使羊膜粘合紧密后揭去硝酸纤维滤纸(两层羊膜间为去上皮面与基底膜面相粘合)；

实施例2双层胶联羊膜的制备

羊膜的获取和处理方法同实施例1之步骤1)；将处理好的新鲜羊膜上皮面平整地贴于硝酸纤维素滤纸上后，再将纤维蛋白胶均匀的喷涂于羊膜的基底膜面，并将另一羊膜平整的贴于其上，此时硝酸纤维素滤纸将两层羊膜夹于中间，用平底器皿轻压3分钟，使羊膜粘合紧密后揭去硝酸纤维素滤纸(两层羊膜间为基底膜面与基底膜面相贴合)。

按上述实施例1和实施2制备好的胶联羊膜，即为双层新鲜胶联羊膜，可以直接应用于临床。如要保存，室温放置2小时，再用上述抗生素液中浸泡20分钟，取出用纯甘油浸泡24小时使其脱水，再转移至另一装有纯甘油的无菌小瓶中4℃密封保存。

实施例3用甘油保存的单层羊膜制备双层胶联羊膜

羊膜的获取及处理方法同实施例1之步骤1)，将处理好的新鲜单层羊膜用纯甘油浸泡脱水处理24小时后，转移至另一装有纯甘油的无菌小瓶中4℃密封保存待用。制备胶联羊膜时先将甘油保存的单层羊膜取出后用无菌生理盐水或平衡液复水30分钟后，并充分洗去羊膜面上的甘油，按实施例1中步骤2)所述的方法制备去上皮羊膜。具体的胶联方式同实施例1中步骤3)或者实施例2中所述。制备好的胶联羊膜可以继续保存，用纯甘油脱水处理24小时后，再转至另一纯干油瓶中密封4℃保存。

实施例4多层胶联羊膜的制备

羊膜的获取及处理方法同上述实施例1中步骤1)，制备去上皮羊膜的方法同施例1之步骤2)，具体的胶联方式仍采用将纤维蛋白胶喷涂于去上皮羊膜的去上皮面后与另一张去上皮羊膜的基底膜面相粘合牢固后，再在双层胶联羊膜的表层(去上皮羊膜的去上皮面)继续喷涂纤维蛋白胶后，将第三张去上皮羊膜的基底膜面与之相粘合。粘合多层胶联羊膜的过程中始终保持两两去上皮面羊膜的去上皮面与基底膜面相贴合，最表层羊膜仍为不去上皮羊膜。制备好的多层羊膜室温放置2小时后，用纯甘油浸泡24小时脱水处理。其保存方法同上述实施例1中双层胶联羊膜的保存方法。

(二)效果证明实验

实验例1  本发明胶联羊膜免疫源性及组织相溶性实验研究

实验方法：建立BALB/C小鼠皮下埋植实验模型。按不同的埋植物分为胶联双层羊膜组、未胶联双层羊膜组、绒毛膜组(阳性对照)和单纯手术组(阴性对照)；各组又随机分为5个亚组，每组6只小鼠，分别对应术后1周、2周、4周、8周、12周共5个取材时间点。在各检测时相，大体观察各组小鼠的活动、创面等情况，用流式细胞仪检测各亚组的外周血CD3⁺CD25⁺表达，免疫组化法半定量检测各亚组组织切片中CD3⁺、CD4⁺、CD8⁺、MHC II⁺的表达，HE染色光镜下观察植片及其周围组织的变化、并作炎性细胞计数。

实验结果：大体观察移植术后各组小鼠的饮食、活动正常，创面均I期愈合，埋植物周围软组织均未见明显坏死征象。术后2周内有一定量CD3⁺、CD4⁺、CD8⁺、MHC II⁺的表达，但均比对照组显著低，此后逐渐减少，4周后完全消失。胶联羊膜免疫原性很低，与未胶联羊膜几无差别，可看作免疫赦免组织。胶联羊膜有良好的组织相容性，植入机体后能迅速以生物性愈合的方式与机体相容。

实验例2  胶联羊膜治疗角膜重度碱烧伤的实验研究

实验方法：建立兔重度角膜碱烧伤模型，将36只新西兰大白兔随机分为3组：胶联双层羊膜移植组，单层新鲜羊膜移植组和碱烧伤未治疗对照组。每组12只，并编号。术后第3天开始每日裂斜灯显微镜观察兔眼表角膜混浊度，新生血管生长情况并进行评分，同时观察羊膜植片的贴合及溶解脱落情况。羊膜脱落后用荧光素染色观察角膜上皮的修复情况。术后10d、15d、1m、2m时各组取3只标本进行HE染色免疫组化检查。

实验结果：术后10天新鲜羊膜组脱落1眼，其余眼新鲜羊膜已出现不同程度的溶解；但胶联羊膜组植片无溃疡、溶解、排斥、无层间积液，周边未见卷起，羊膜片平整贴于角膜，其下隐约可见角膜混浊。术后30天，新鲜羊膜组大部分羊膜已完全溶解，少数残留周边羊膜，胶联羊膜组虽然表层羊膜有溶解，但底层仍完整的平贴于角膜上，术后60天，胶联羊膜之底层似与角膜长为一体。术后观察各组临床发展、角膜混浊度、溃疡修复及新生血管情况，胶联羊膜组无一例角膜穿孔，新鲜羊膜组有1例穿孔，对照组5例穿孔，在眼表上皮化、角膜混浊度、新生血管生长等方面，胶联羊膜组显著好于单层新鲜羊膜组，三组间比较均有显著性差异。我们认为羊膜移植具有抑制新生血管和促进上皮增殖和移行的作用，它能导致眼表面快速的上皮化和维持眼表面的长期稳定。胶联羊膜由于可以较长时间贴附于角膜表面不溶解脱落，可以使羊膜的生物活性作用发恢更为持久，因而在抑制炎性细胞浸润，减轻炎症反应、促进组织修复上有着更强的作用，同时胶联羊膜中的纤维蛋白胶有止血及促进组织修复的作用，与羊膜产生了协同治疗效果。

临床治疗实例1    胶联羊膜治疗非化脓性角膜溃疡

非化脓性角膜溃疡临床药物治疗比较困难，常反复发作经久不愈，严重者甚至可引起角膜穿孔等严重后果。发明人于2004年4月—2005年9月对15例15眼无菌性角膜溃疡进行了本发明胶联羊膜的移植治疗，取得了较好的疗效。现报告如下：

非化脓性角膜溃疡15例15眼，其中男9例，女6例，年龄20-40岁。术前情况：神经麻痹性角膜溃疡3例，单疱病毒角膜炎神经营养性角膜溃疡5例，眼表面热烧伤2例，眼表面化学性烧伤5例。这15例病人术前均无细菌、真菌感染征象；视力为手动-0.08，角膜溃疡直径约3-6mm，溃疡面较干净，无前房积脓，溃疡深度1/3-1/2角膜厚度，眼压TN。本组病例中10例采用保存胶联羊膜移植，5例采用新鲜胶联羊膜移植。

具体的手术方式为：剪开结膜囊并刮除已坏死的角膜上皮和浅层组织，用虹膜恢复器轻烧灼溃疡面后，剪取溃疡面大小的胶联羊膜(厚度视溃疡的深度而定)，用纤维蛋白胶将胶联羊膜紧密粘合于溃疡面，待粘连牢固后，再在角膜表面贴另一张双层胶联羊膜将全角膜覆盖后，将结膜拉拢整齐缝合于羊膜之面上。术后加压包扎3-5天，以后用眼表润滑剂眼液。

其疗效的判断标准为：治愈：溃疡面完全愈合，上皮面光滑，无眼部刺激症状；有效：溃疡面大部分愈合；无效：溃疡面积无减少或加重。

治疗结果：分别于术后一周、二周、四周、三月、半年随访。早期新鲜及保存胶联羊膜植片均未见溃烂、溶解或脱落，羊膜贴和良好。术后14-20天胶联羊膜植片表面出现溶解，但可见溃疡面缩小逐渐愈合，一月后角膜溃疡面完全修复，15例全部治愈。术后2-3月，其中10例病人(保存6，新鲜4)角膜溃疡处浑浊角膜开始变为透明或半透明。15例病人术后视力均有不同程度的提高，且术后半年至一年内无一例复发。

临床治疗实例2    胶联羊膜用于结膜囊成形术

由于各种原因所导致的结膜囊畸形不能安装义眼而需要作结膜囊成形术，传统的方法是用全层皮片或口腔黏膜填补创面，虽可达到治疗目的，但因增加了新的创伤和瘢痕，又影响美观，有时难于被患者接受。发明人从2004年4月起，用本发明的胶联羊膜代替口腔或皮肤治疗结膜囊畸形，获得满意效果。

本组共9例9眼，其中男7例，女2例，病程最短1月，最长12年。均因眼球摘除术后结膜囊畸形不能装入义眼或义眼滑脱，3眼合并下睑外翻，结膜囊狭窄程度：本组中I度2例，II度4例，III度3例。狭窄原因主要为烧伤或外伤后瘢痕形成6眼，眼球摘除术后未及时放入眼片或眼模3眼。

全部采用保存胶联羊膜。具体的手术方式为：按常规结膜囊畸形矫正手术，于结膜正中剪开结膜，向上下分离直达眶缘，露出缺损创面，如有瘢痕性睑外翻者，首先行睑外翻矫正。分离深部组织并找出眼外肌，按义眼座植入方法植入适当大小羟基磷灰石义眼座，并将筋膜组织盖到义眼座表面紧密缝合。此时可见结膜有较大的缺损，缺损范围为1×1.5cm至2.5×2.5cm大小，将胶联羊膜平铺于创面，其边缘超过创面3mm以上，用8-0可吸收缝线见断缝合，或用组织粘合剂粘结不缝合，对重度缩窄行全眼窝再造者，则将胶联羊膜包裹于眼模，植入眼窝，如同皮瓣包裹法。结膜囊放置支架，将大号PMMP眼片或自制的有机玻璃片放入结膜囊，上下两端应抵住上下穹隆。最后进行睑缘缝合，术毕加压包扎。术手加压包扎5-7天，半个月后拆除眼睑缝线，全身或局部应用抗生素和皮质类固醇，术后4-6个月剪开睑裂，装入合适的义眼。

治疗结果：共随访6-12个月，均未发现继发感染及明显排斥反应等并发症。术后早期见有少量分泌物自结膜溢出，术后半月—1月分泌物较多，2个月后分泌物逐渐减少。术后4-6个月剪开睑裂时发现9例结膜囊形成良好，表面红润光滑，义眼植入后外观满意，并有一定活动度，其中1例在6个月后发生眼片滑脱。结膜囊又变浅，经再次手术后至今眼片未见滑脱。

临床治疗实例3    胶联羊膜治疗眼球摘除术后义眼座暴露

羟基磷灰石义眼座植入术已成为矫正眼球摘除术后眼窝凹陷的首选方法，但义眼座暴露和感染是羟基磷灰石义眼座植入的最常见并发症。采用本发明的胶联羊膜治疗眼球摘除术后义眼座暴露取得了较满意的效果：

本组4例4眼，均为男性，年龄35-60岁。义眼座材料均为国产羟基磷灰石，均为I期植入。眼座暴露时间为术后7-22天，暴露面积约为10-18mm。

具体的手术方式为：表面麻醉和局部麻醉后，彻底分离球结膜及结膜下筋膜，将胶联羊膜上皮面朝上贴于暴露的义眼座上，将筋膜拉拢缝合盖于羊膜之上，再将球结膜对合缝合。术毕加压包扎术眼，常规使用抗生素。术后48小时放置临时PMMP眼片。治疗结果：术后4眼反应轻，均无排斥反应，无感染，两周后结膜愈合好，未见义眼暴露，表面光滑。2月后4例病人全部安装义眼成功。

临床治疗实例4   胶联羊膜治疗皮肤组织深层溃疡

本发明的胶联羊膜还可以用于治疗皮肤组织的的深层溃疡，举一临床病例说明其治疗效果。

患者，女，65岁，近6月由于右小腿皮肤溃疡，反复发作，溃疡面不断扩大加深约1.5×2.0CM，经久不愈。曾尝试过药物、理疗等各种治疗方法，均未使溃疡愈合。我们用胶联羊膜填平溃疡，并再在表面覆盖一层羊膜后，创面用纱布包扎。间日更换敷料。结果，1周后溃疡面开始缩小，未继发感染，1月时溃疡完全愈合，只留下一较淡的色素性疤痕，无疤痕挛缩，不影响下肢运动功能。

通过上述体外动物实验和临床试验说明本发明胶联羊膜生物安全性高，治疗效果好，它在促进组织生长修复、抑制新生血管和瘢痕生长等方面具有较大的优越性，可广泛应用与外科创伤修复、烧伤整形、组织工程修复、眼表重建及药物控释系统等领域。

Claims (1)

1、一种胶联羊膜的制备方法，将去上皮新鲜羊膜与未去上皮新鲜羊膜直接用纤维蛋白胶粘合；或者将浸泡在甘油中的保存羊膜经过复水后，再将去上皮羊膜与未去上皮羊膜用纤维蛋白胶粘合；或者将未去上皮羊膜之间用纤维蛋白胶粘合；再将粘合的胶联羊膜置于纯甘油中在0～6℃密封无菌保存；其特征是先将纤维蛋白胶均匀喷涂于新鲜羊膜的去上皮面或基底面，或者保存羊膜的去上皮面或基底面，再将另一未去皮的新鲜羊膜或保存羊膜按基底面向下的方式平整贴合其上，室温下干燥，待紧密粘连后用纯甘油浸泡处理24小时，再在纯甘油中密封无菌保存，获得双层胶联羊膜。

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