CN104826166B - 一种用于青光眼治疗的生物膜及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种用于青光眼治疗的生物膜及其制备方法。用于青光眼治疗的生物膜，由羊膜浸泡于浓度为1～5％高分子多糖水溶液进行增厚后，在‑16～‑4℃下辐照灭菌制成，其厚度为0.2～0.5mm。用于青光眼治疗的生物膜的制备方法，是以脐带周围较厚羊膜为原料，经快速取材、冲压裁剪、复合增厚、辐照灭菌等步骤。本发明的有益技术效果是：(1)可有效保留羊膜各种天然活性成分，包括胶原、生长因子、抗炎因子等；(2)具有与新鲜羊膜同等的生物活性；(3)极大地提高了临床使用的安全性；(4)厚度及降解性能可完全满足青光眼治疗巩膜瓣下填充的材料需求，生物膜可有效发挥术后早期预防黏连，后期预防瘢痕形成的治疗功效。

Description

一种用于青光眼治疗的生物膜及其制备方法

【技术领域】

本发明涉及医用器具领域，具体涉及一种组织工程学中医用生物材料技术领域，具体为一种用于青光眼治疗的生物膜及其制备方法。

【背景技术】

青光眼是目前世界第二大致盲原因，最常用的手术治疗方法是滤过性手术，但术后滤过道瘢痕往往是导致手术失败的主要原因。针对这个国际性难题，目前尚无稳定良好的解决方法。目前有采用聚乙烯、聚丙烯、聚四氟乙烯等高分子聚合材料或金属磁性材料制备得到的片状带孔的青光眼引流器(如公开号为中国专利CN1337212A中国专利申请，中国专利公开号为CN103732182A的中国专利申请，中国专利公开号为CN103919643A的中国专利申请)；也有采用乳胶管植入片制备得到的输送管(如中国专利公开号为CN1477982A的中国专利申请)；也还有采用天然高分子透明质酸或壳聚糖等复合药物制备得到的可降解膜片(如中国专利公开号为CN101077347A的中国专利申请)。但上述各类高分子材料或金属材料通常需多针缝合固定，生物相容性不佳，炎症反应较强，后期瘢痕化致使引流渠道封堵，引流作用无法起效；而天然高分子材料透明质酸等虽然能够在术后早期起到防黏连的作用，但其降解速率较快无法有效抑制后期瘢痕形成。另外也有采用同种异体虹膜制作成植入片(如公开号为CN101099695A的中国专利申请)，但活体取材往往造成供区部位的不必要的损伤，从废弃眼球摘取往往无法保证及时性，且国内外治疗青光眼尚无采用虹膜代替自体结膜或巩膜瓣的报道，治疗效果有待考证。

羊膜，从细胞滋养层衍化而来，是胚胎双层膜的内层，由上皮细胞层，基底膜和无血管基质组成，羊膜中包含多种胶原蛋白以及层粘连蛋白、纤连蛋白、糖胺聚糖、透明质酸等。正是这些活性物质的存在，可以促进上皮细胞的黏附移行，诱导上皮分化，防止上皮凋亡，使得羊膜充当一种“可移植的基底膜”来促进上皮化。此外，羊膜细胞及基质中还包含有很多生长因子，比如神经生长因子(NGF)，肝细胞生长因子(HGF)，角质细胞生长因子(KGF)，转化生长因子-α(TGF-α)，转化生长因子-β1(TGF-β1)，表皮生长因子(EGF)，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)(Koizumi,N.J,et al,Growth factor mRNA and protein inpreserved human amniotic membrane.Curr Eye Res,2000.20(3):p.173-7)，抑制血管生成、抗炎的蛋白(Hao,Y.et,al,Identification of antiangiogenic andantiinflammatory proteins in human amniotic membrane.Cornea,2000.19(3):p.348-52)以及一些天然蛋白酶抑制因子(BK,N,et al,Analysis of human amniotic membranecomponents as proteinase inhibitors for development of therapeutic agent ofrecalcitrant keratitis.Trophoblast Res,1999(13):p.459-466.)，它们能够促进眼表上皮化、减轻炎性反应、抑制纤维组织增生和新生血管形成。正是由于羊膜具有良好的抑制纤维组织增生，抑制瘢痕形成，抗炎症，抗血管化的能力，因此，近年来羊膜在青光眼治疗中的应用备受瞩目，已有国内外学者将新鲜或冷藏或冻干辐照灭菌单层羊膜作为青光眼滤过术后的导流生物支架材料应用，并取得一定效果(Donald L.Budenz,Keith Barton,Scheffer C.G.Tseng,Amniotic Membrane Transplantation for Repair of LeakingGlaucoma Filtering Blebs.American Journal of Ophthalmology,130(5):580-588),但目前尚无多中心大病例数双盲对照临床试验对此应用方法的稳定性及效果进行验证。目前美国仅有一项对厚度达300微米以上的羊膜产品作为青光眼导流器的覆盖物的临床研究(ClinicalTrials.govIdentifier:NCT01551550)，该羊膜产品是用来预防导流器的戳出，前期临床结果较为理想(Anand A,Sheha H,Teng CC.Use of amniotic membrane graftin glaucoma shunt surgery.Ophthalmic Surg Lasers Imaging.2011 May-Jun；42(3):184-9)，但该临床试验也仍处于招募入组阶段尚未完成。

新鲜羊膜和冷藏羊膜具有多种胶原及活性因子成分，因此临床使用于眼表上皮缺损，烧伤等效果较好。但这两种羊膜未经终端灭菌及病毒灭活处理，无法达到植入性医疗器械无菌的标准且可能存在病毒隐患。故近年来国内外也有多种终端灭菌羊膜产品成功开发，但经过较多工艺步骤处理的羊膜因子含量损失较大，羊膜生物活性降低，无法起到新鲜羊膜或冷藏羊膜等效的作用；且目前的羊膜产品型式均为单层羊膜，产品厚度均较薄(0.005～0.05mm)，应用于青光眼滤过手术时，无法起到合适的支撑空间作用，降解较快，维持作用的时间有限。

公开号为US006152142A和US006326019B1的美国专利申请公开的羊膜产品是剖腹产胎盘经清洗干净后钝性分离去除绒毛膜，上皮向上平铺在硝酸纤维滤纸上，之后保存于1︰1比例的DMEM︰甘油中，于-80℃冰箱中冻存，所制备的羊膜未经脱细胞、干燥和灭菌处理，因此最大程度地保留了羊膜成分与结构的完整性；但存在的问题有：①保存成本太高，且不方便运输；②在保存时经过了低温冷冻，使用时又需室温解冻，这两个过程都会造成羊膜胶原蛋白结构的破坏，变得易碎；③制备中采用硝酸纤维素滤纸为衬底，在使用中需要将羊膜撕下来，使得本来就易碎的羊膜更容易发生撕裂或卷曲，给临床操作带来诸多不便；④对羊膜未进行病毒灭活处理，具有病毒传播隐患。

专利申请号为CN03150838.3、CN200480023933.7和200410075361.9中国专利申请都公开了一种可常温保存的生物羊膜的制备方法，是将胎盘的绒毛膜钝性分离，清洗后铺在硝酸纤维素滤纸上，经冷冻干燥后包装，钴60辐照灭菌。所制备的羊膜，与上述美国专利类似，经过了低温冷冻，同样在一定程度上对羊膜造成了破坏，使其变脆，在临床使用中容易撕裂；其也采用硝酸纤维素滤纸作为衬底，使用时羊膜不易取下，且容易发生卷曲，给手术带来不必要的麻烦，耗费手术时间，耽误病情。

公开号为CN100479867C的中国专利申请公开了一种胶联羊膜的制备方法，其采用纤维蛋白胶将羊膜粘合以制备多层羊膜，增加羊膜厚度及可操作性。该技术缺点为胶联羊膜储存条件为0～6℃，羊膜活性很难较长时间保持，国外冷藏羊膜产品AmnioGraft在此类温度下的保存时间仅为3个月。另外该技术制备的胶联羊膜未经终端灭菌，无法确保产品的无菌水平及病毒灭活效果，具有安全性隐患。

公开号为CN1088118A的中国专利申请公开了一种医用创面保护覆膜的制备方法，其将羊膜进行多步骤处理后，再将多层羊膜复合、烘干制备得到多层羊膜，该技术缺点为多步骤处理造成羊膜活性成分大大降低，烘干步骤也使羊膜因子活性进一步降低，无法保证最终产品仍然能够发挥羊膜天然的生物活性。

综上所述，如何使羊膜材料既保留新鲜羊膜的抗炎症抗瘢痕化的生物活性，还能确保羊膜材料的无菌水平及病毒灭活，最终制备成能长时间保存随取随用的羊膜医疗器械产品，使其具有青光眼滤过性手术中巩膜瓣下填充的生物支架材料的厚度及降解性能，成为羊膜用于青光眼治疗亟待解决的问题。

【发明内容】

本发明的目的在于针对以上所述现有技术存在的不足，提供一种用于青光眼治疗的生物膜，所述生物膜能保留新鲜羊膜有效成分及治疗效果，并确保无任何病毒隐患，具有合适的厚度及降解性能，适用于青光眼滤过性手术如小梁切除术的巩膜瓣下填充应用。

本发明的另一目的是提供一种用于青光眼治疗的生物膜的制备方法。

为了实现上述目的，本发明是这样实现的：用于青光眼治疗的生物膜，由羊膜浸泡于质量百分比浓度为1～5％的高分子多糖水溶液进行增厚后，然后在在-16～-4℃下辐照灭菌制成，其厚度为0.2～0.5mm。

本发明所述的用于青光眼治疗的生物膜，保留了羊膜主要成分如胶原及各类活性因子，复合天然生物高分子材料如透明质酸或羧甲基纤维素，厚度为0.2～0.5mm，具有防黏连，抑制瘢痕，降低炎症的作用，应用于青光眼小梁切除术巩膜瓣下填充时具有合适的降解速率及支撑效果，有效稳定控制房水流出速率，使眼压可得到长时间稳定控制。

一种用于青光眼治疗的生物膜的制备方法，是以脐带周围较厚羊膜为原料，经快速取材、冲压裁剪、复合增厚、辐照灭菌步骤，最终得到生物膜产品；具体步骤包括：

(1)取材

在1～3分钟内将脐带周围附着于胎盘之上的羊膜快速取下，并迅速2～10℃冷藏，1小时内运输至洁净车间进行后续处理。

(2)冲压裁剪

将羊膜上皮面向上迅速铺展于硝酸纤维素滤膜上，在1～3分钟内将羊膜裁剪为长度为3～10mm，宽度为3～10mm的矩形或者正方形羊膜膜片，也可裁剪为类似大小的梯形、圆形、三角形羊膜膜片。

(3)复合增厚

将羊膜膜片浸泡于质量百分比浓度为1～5％的医药级别高分子多糖水溶液1～3分钟，使羊膜膜片厚度增厚至0.2～0.5mm，然后迅速置于含有少量医用级甘油的包装袋中，封口密封，在-16～-4℃下冷藏并立即送辐照灭菌。

(4)辐照灭菌

将增厚的羊膜膜片在-16～-4℃的低温保护条件下，采用电离辐射灭菌处理。

所述(1)步骤中所取羊膜厚度在0.1～0.2mm。

所述(1)步骤中采用羊膜快速取材装置进行取材，所述羊膜快速取材装置包括中空的漏斗状壳体和粗端大切刀，所述漏斗状壳体的粗端设置粗端大切刀；所述粗端大切刀上设置可拆卸的保护罩，保护套可将粗端大切刀完全嵌套覆盖；可避免羊膜长时间暴露于常温条件造成羊膜活性降低，保证羊膜植入后抑制瘢痕降低炎症的功效；也可有效避免剥离时对羊膜造成的损伤及破坏。

所述(2)步骤中，羊膜裁剪采用冲压裁剪装置来进行，所述冲压裁剪装置包括平板载体和裁刀，若干所述裁刀排列固定在所述平板载体一侧表面上；可以在极短时间内将所取羊膜迅速裁剪为所需大小形状，进一步有效避免羊膜长时间暴露于常温条件造成羊膜活性降低，保证羊膜植入后抗瘢痕抗炎症的能力。

所述医药级别高分子多糖为分子量100～150万的医用级透明质酸或高粘度医用级羧甲基纤维素钠中一种。采用天然高分子材料增加羊膜厚度，既能使制备得到的生物膜在巩膜瓣下植入初期起到良好的引流作用及防黏连作用，也能同时在一定程度上保护羊膜的生物活性，进一步保证羊膜在巩膜瓣下发挥其天然的抗瘢痕抗炎症功能。

所述电离辐射灭菌可以用伽马射线辐照或是高能电子束辐照，剂量为20～30kGy；辐照后立即将生物膜产品置于-90～-10℃下冷藏保存。采用低温保护进行辐照灭菌，既能达到无菌医疗器械产品的无菌水平要求，又能同时灭活各种病毒，也能最大程度保护生物羊膜活性，尽可能维持其天然的抗炎症抗瘢痕能力，使其最终得以有效应用于青光眼滤过道手术。

本发明制备的用于青光眼治疗的生物膜，在确保生物膜的生物安全性的同时，有效保留及发挥羊膜的天然活性功能，应用于青光眼滤过手术巩膜瓣下植入具有前期防黏连，后期抑制瘢痕形成的能力，可有效长期维持术眼眼压的稳定，具有极好的临床应用前景。

本发明实用羊膜快速取材装置，通过粗端及细端先后裁切分离，可使胎盘之上羊膜迅速从胎盘剥离，减少羊膜取材所需操作时间。经本发明人验证，在操作人员经过较长时间培训及实际操作的条件下，仅用手工操作将胎盘之上羊膜从胎盘完整剥离，至少需要20～30分钟。本发明之羊膜裁切装置，通过多个均匀排列的微型裁刀冲压裁切羊膜，可迅速将羊膜裁切为所需规格及大小，大大减少羊膜裁切所需操作时间。经本发明人验证，在操作人员经过较长时间培训及实际操作的条件下，采用手工操作利用普通刀具对所取得的一张羊膜进行裁切，至少需要1～2小时才能裁切完成，而且较难保证所裁切羊膜的大小均一满足要求。

与现有产品相比，本发明的有益技术效果是：

(1)整体工艺最小化处理，可有效保留羊膜各种天然活性成分，包括胶原、生长因子、抗炎因子等；对本发明制备的生物膜进行上述成分检测，结果表明本发明制备的生物膜产品与新鲜羊膜的各种天然活性成分含量相差较小，说明本发明制备方法能够有效保留羊膜的各种天然成分；

(2)采用羊膜快速取材装置可在最短的时间内完成羊膜从取材到灭菌的整个过程处理(灭菌前操作时间最短可为1～2小时)，并采用天然高分子材料及低温保护辐照灭菌有效保留羊膜各种天然活性成分的抗炎症抗瘢痕的天然功效。对本发明制备的生物膜进行相关体外体内实验检测，结果表明本发明制备的生物膜产品具有与新鲜羊膜同等的生物活性；

(3)在保留羊膜天然活性成分及这些成分活性功效的同时，还能保证最终制备得到的生物膜的无菌水平及病毒灭活效果，保证了生物膜作为医疗器械使用的基本要求得以满足，确保了生物膜的生物安全性。本发明中的低温保护辐照灭菌方法经辐照灭菌病毒灭活工艺验证，可完全保证各类病毒(如HIV、HBV、HCV、梅毒等)灭活，极大地提高了临床使用的安全性；

(4)厚度及降解性能可完全满足青光眼治疗巩膜瓣下填充的材料需求，生物膜可有效发挥术后早期预防黏连，后期预防瘢痕形成的治疗功效。

【附图说明】

图1为羊膜快速取材装置的立体结构示意图；

图2羊膜冲压裁剪装置的立体结构示意图；

图3是本发明制备得到的生物膜与新鲜羊膜主要成分定量检测对比结果图；

图4是本发明制备得到的生物膜体外细胞毒性检测结果图；

图5是本发明制备得到的生物膜体外淋巴细胞增殖检测结果图；

图6是本发明制备得到的生物膜应用于犬青光眼治疗的眼压监测结果图。

【具体实施方式】

以下结合附图和具体实施例对本发明进行详细的描述说明。

实施例1

用于青光眼治疗的生物膜的制备方法，其步骤如下：

(1)快速取材

采用羊膜快速取材装置，在1分钟内将脐带周围附着于胎盘之上的羊膜快速取下，并迅速2℃冷藏，1小时内运输至洁净车间进行后续处理；

(2)冲压裁剪

将(1)步骤取得的羊膜上皮面向上迅速铺展于硝酸纤维素滤膜上，采用冲压羊膜裁剪装置在1分钟内将步骤一所取的羊膜材料裁剪为长度为3mm，宽度为3mm的正方形羊膜膜片；

(3)复合增厚

将(2)步骤制备得到的羊膜膜片浸泡于质量百分比浓度为1％的分子量100万医药级透明质酸水溶液1分钟，使羊膜膜片厚度增厚至0.25mm，然后迅速置于含有少量医用级甘油的包装袋中，封口密封，-4℃下冷藏并立即送辐照灭菌；

(4)辐照灭菌

将(3)步骤处理后的羊膜，在-4℃下的低温保护条件下，采用伽马射线20kGy辐照灭菌处理。辐照后立即将生物膜产品置于-90℃下冷藏保存。

通过上述方法制备得到的生物膜具有良好的生物相容性，体外细胞毒性及体外淋巴细胞增殖实验检测结果显示如图4和图5所示，生物膜无体外细胞毒性，无刺激或抑制淋巴细胞的免疫原性，作为青光眼治疗的引流支架具有良好的安全性保证。

实施例2

用于青光眼治疗的生物膜的制备方法，其步骤如下：

(1)快速取材

采用羊膜快速取材装置，在3分钟内将脐带周围附着于胎盘之上的羊膜快速取下，并迅速8℃冷藏，1小时内运输至洁净车间进行后续处理。

(2)冲压裁剪

将(1)步骤取得的羊膜上皮面向上迅速铺展于硝酸纤维素滤膜上，采用冲压羊膜裁剪装置，在3分钟内将步骤一所取的羊膜材料裁剪为长度为10mm，宽度为3mm的矩形羊膜膜片。

(3)复合增厚

将(2)步骤制备得到的羊膜膜片浸泡于质量百分比浓度为5％的医药级高粘度羧甲基纤维素钠水溶液3分钟，使羊膜膜片厚度增厚至0.5mm，然后迅速置于含有少量医用级甘油的包装袋中，封口密封，-16℃下冷藏并立即送辐照灭菌。

(4)辐照灭菌

将(3)步骤处理后的羊膜，在-16℃下低温保护条件下，采用高能电子束辐照，剂量为30kGy，即得到生物膜产品。辐照后立即将生物膜产品置于-10℃下冷藏保存。

本实施例制备得到的生物膜，可有效保留羊膜各类天然有效成分，经试剂盒定量检测，结果显示生物膜所保留的各类活性成分，如图3所示，与新鲜羊膜相比无明显差异，作为青光眼治疗引流支架具有良好的临床应用前景。

实施例3

用于青光眼治疗的生物膜的制备方法，其步骤如下：

(1)快速取材

采用羊膜快速取材装置，在2分钟内将脐带周围附着于胎盘之上的羊膜快速取下，并迅速4℃冷藏，1小时内运输至洁净车间进行后续处理。

(2)冲压裁剪

将(1)步骤取得的羊膜上皮面向上迅速铺展于硝酸纤维素滤膜上，采用冲压羊膜裁剪装置，在2分钟内将步骤一所取的羊膜材料裁剪为直径为6mm的圆形羊膜膜片。

(3)复合增厚

将(2)步骤制备得到的羊膜膜片浸泡于质量百分比浓度为3％的医药级分子量150万透明质酸水溶液2分钟，使羊膜膜片厚度增厚至0.35mm，然后迅速置于含有少量医用级甘油的包装袋中，封口密封，-10℃下冷藏并立即送辐照灭菌。

(4)辐照灭菌

将(3)步骤处理后的羊膜，在-10℃下低温保护条件下，采用剂量为25kGy伽马射线辐照灭菌处理，即得到生物膜产品。辐照后立即将生物膜产品置于-80℃下冷藏保存。

本实施例制备得到的生物膜，可有效保留羊膜天然生物活性，具有青光眼小梁切除术巩膜瓣下填充支架所需的良好降解性能以及厚度，经犬青光眼模型动物实验检测生物膜的有效性，结果显示术后长期效果稳定，使用生物膜的犬眼压与健康组相比，术后2年内眼压保持稳定，无青光眼复发(图6)。

实施例4

用于青光眼治疗的生物膜的制备方法，其步骤如下：

(1)快速取材

采用羊膜快速取材装置，在1分钟内将脐带周围附着于胎盘之上的羊膜快速取下，并迅速8℃冷藏，1小时内运输至洁净车间进行后续处理。

(2)冲压裁剪

将(1)步骤取得的羊膜上皮面向上迅速铺展于硝酸纤维素滤膜上，采用本公司发明的冲压羊膜裁剪装置，在3分钟内将步骤一所取的羊膜材料裁剪为长度为8mm，宽度为4mm，高度为5mm的梯形羊膜膜片。

(3)复合增厚

将(2)步骤制备得到的羊膜膜片浸泡于质量百分比浓度为5％的医药级高粘度羧甲基纤维素钠水溶液2分钟，使羊膜膜片厚度增厚至0.45mm，然后迅速置于含有少量医用级甘油的包装袋中，封口密封，-8℃下冷藏并立即送辐照灭菌。

(4)辐照灭菌

将(3)步骤处理后的羊膜，在-8℃下低温保护条件下，采用剂量为22.5kGy伽马射线辐照灭菌处理，即得到生物膜产品，辐照后立即将生物膜产品置于-24℃下冷藏保存。

本实施例制备的生物膜在低温下处理，裁切，冷藏保存，可有效保证生物膜所含有的羊膜天然有效成分及活性，在眼科青光眼的临床应用具有良好的应用前景。

实施例5

用于青光眼治疗的生物膜的制备方法，其步骤如下：

(1)快速取材

采用羊膜快速取材装置，在1分钟内将脐带周围附着于胎盘之上的羊膜快速取下，并迅速2℃冷藏，1小时内运输至洁净车间进行后续处理；

(2)冲压裁剪

将(1)步骤取得的羊膜上皮面向上迅速铺展于硝酸纤维素滤膜上，采用冲压羊膜裁剪装置在1分钟内将步骤一所取的羊膜材料裁剪为长度为3mm，宽度为3mm的正方形羊膜膜片；

(3)复合增厚

将(2)步骤制备得到的羊膜膜片浸泡于质量百分比浓度为4％的分子量120万医药级透明质酸水溶液2分钟，使羊膜膜片厚度增厚至0.35mm，然后迅速置于含有少量医用级甘油的包装袋中，封口密封，-4℃下冷藏并立即送辐照灭菌；

(4)辐照灭菌

将(3)步骤处理后的羊膜，采用伽马射线20kGy辐照灭菌处理”改为“采用伽马射线28kGy辐照灭菌处理。辐照后立即将生物膜产品置于-90℃下冷藏保存。

通过上述方法制备得到的生物膜具有良好的生物相容性，体外细胞毒性及体外淋巴细胞增殖实验检测结果显示如图4和图5所示，生物膜无体外细胞毒性，无刺激或抑制淋巴细胞的免疫原性，作为青光眼治疗的引流支架具有良好的安全性保证。

实施例6

用于青光眼治疗的生物膜的制备方法，其步骤如下：

(1)快速取材

采用羊膜快速取材装置，在1分钟内将脐带周围附着于胎盘之上的羊膜快速取下，并迅速10℃冷藏，1小时内运输至洁净车间进行后续处理。

(2)冲压裁剪

将(1)步骤取得的羊膜上皮面向上迅速铺展于硝酸纤维素滤膜上，采用本公司发明的冲压羊膜裁剪装置，在3分钟内将步骤一所取的羊膜材料裁剪为长度为8mm，宽度为4mm，高度为5mm的梯形羊膜膜片。

(3)复合增厚

将(2)步骤制备得到的羊膜膜片浸泡于质量百分比浓度为2％的医药级高粘度羧甲基纤维素钠水溶液3分钟，使羊膜膜片厚度增厚至0.30mm，然后迅速置于含有少量医用级甘油的包装袋中，封口密封，-8℃下冷藏并立即送辐照灭菌。

(4)辐照灭菌

将(3)步骤处理后的羊膜，在-8℃下低温保护条件下，采用剂量为22.5kGy伽马射线辐照灭菌处理，即得到生物膜产品，辐照后立即将生物膜产品置于-24℃下冷藏保存。

本实施例制备的生物膜在低温下处理，裁切，冷藏保存，可有效保证生物膜所含有的羊膜天然有效成分及活性，在眼科青光眼的临床应用具有良好的应用前景。

以下各实例中羊膜是产妇签署知情同意书后，从废弃剖腹产胎盘裁切剥离取得的，为脱离活体的废弃品。

所述羊膜快速取材装置，如图1所示，包括中空的漏斗状壳体1、细端小切刀2和粗端大切刀5，所述漏斗状壳体1的粗端端部安装粗端大切刀5，所述漏斗状壳体1的细端设置细端小切刀2，所述细端小切刀2的侧壁设置开口4；当下压时可使细端小切刀2呈中心辐射状散开，通过旋转漏斗状壳体1即可利用辐射状细端小切刀2将胎盘上的羊膜与胎盘分离。在所述细端小切刀2外侧设置可拆卸的固定带3，用于固定所述细端小切刀2。所述细端小切刀2为若干刀片单元可拆卸的安装于漏斗状壳体1细端的端部。相邻刀片单元之间设置开口4。所述粗端大切刀5上设置可拆卸的保护罩6，所述保护套6可将粗端大切刀完全嵌套覆盖，作为下压旋转细端小切刀时人员手握部位。其中，所述漏斗状壳体1的长度为15～25cm；壁厚度为2～5mm。所述细端小切刀2直径2～5cm，长度15～30cm，厚度0.2～0.5mm，用于供环切脐带周围羊膜之用。所述开口4长度为15～30cm，用于下压旋转漏斗状壳体对脐带周围羊膜环切。所述粗端大切刀5的直径15～30cm、长度1～2cm、厚度2～5mm，用于迅速裁切胎盘边缘之羊膜。所述漏斗状壳体1、粗端大切刀5和细端小切刀2材质均为不锈钢；保护罩6材质为医用级PMMA塑料或高密度聚四氟乙烯塑料；固定带4材质为医用硅橡胶。

本发明在使用时先手持漏斗状壳体1，卸掉所述粗端大切刀5上的保护罩6，下压粗端大切刀5裁切胎盘边缘羊膜交界处，去除胎盘之外所有羊膜，装好粗端保护罩6。然后用固定带3固定细端，将脐带从细端小切刀2穿入，从粗端大切刀5穿出，手持粗端保护罩6及部分漏斗状壳体1，下压旋转漏斗状壳体1对脐带周围羊膜环切，完成后卸除固定带3，再手持粗端保护罩6及部分壳体1，将细端小切刀2对准羊膜环切切口下压漏斗状壳体1，使细端小切刀2呈中心辐射状散开，再旋转漏斗状壳体1即可利用辐射状细端小切刀2将胎盘上的羊膜与胎盘分离，得到胎盘之上羊膜。

采用本发明可大大缩短剥离取材胎盘之上羊膜的操作时间，平均1～3分钟内即可完成操作。相比之前在操作人员经过较长时间培训及实际操作的条件下，仅用手工操作将胎盘之上羊膜从胎盘完整剥离，至少需要20～30分钟；使用本发明可大大提高操作效率，有效缩短羊膜取材时间。

如图2所示，所述冲压羊膜裁剪装置包括平板载体7和裁刀8，若干所述裁刀8排列固定在所述平板载体7一侧表面上。所述平板载体7的边长尺寸为20～30cm，厚度为2～10mm。相邻所述裁刀8之间的最小间距为0.1～0.5mm。所述裁刀8的边长为3～10mm，厚度为0.1～0.5mm。所述平板载体7和裁刀8材质均为不锈钢。优选的，所述平板载体7的边长尺寸为23～28cm，厚度为4～6mm。相邻所述裁刀8之间的最小间距为0.2～0.4mm。所述裁刀8的边长为25～45mm，厚度为0.2～0.4mm。最优的，所述平板载体7的边长尺寸为25cm，厚度为5mm。相邻所述裁刀8之间的最小间距为0.3mm。所述裁刀8的边长为30mm，厚度为0.3mm。上述尺寸在裁切时最节省，且能符合手术的各种要求。所述裁刀的刀口形状可为正方形、三角形、圆形、梯形或矩形。使用本装置时，先将羊膜及滤纸平铺于低温操作台，然后手持平板7将裁刀8面向羊膜，迅速向下冲压即可将羊膜裁切为所需规格及形状。

本发明的使用方法是通过多个均匀排列的小型裁刀冲压裁切羊膜，可迅速将羊膜批量裁切为所需规格及大小，大大减少羊膜裁切所需操作时间，在1～3分钟内将一张羊膜裁切为临床适用规格及大小的羊膜，操作快速，裁切得到羊膜也适用于临床手术需求，满足产业化规模化生产的需求。

以下针对上述实施例，结合实验数据和图片资料进行分析：

图3是本发明制备得到的生物膜与新鲜羊膜主要成分定量检测对比结果图。图中COLⅠ为Ⅰ型胶原，COLⅢ为Ⅲ型胶原，COLⅣ为Ⅳ型胶原，bFGF为碱性成纤维细胞生长因子，EGF为表皮生长因子，TIMP为金属蛋白酶组织抑制因子，HGF为肝细胞生长因子，KGF为角质生长因子。BA代表本发明制备的生物膜，FAM代表新鲜羊膜。通过观察图片显示，可以看出生物膜所包含的各类天然胶原及因子成分含量与天然新鲜羊膜无明显差异。

图4是本发明制备得到的生物膜体外细胞毒性检测结果图，图中BA代表本发明制备的生物膜，CK代表空白对照组，PE代表高密度聚乙烯阴性对照组，DMSO代表二乙烯基砜阳性对照组。纵坐标百分率表示L929细胞的体外培养增殖率。通过观察图片显示，可以看出生物膜与空白对照组及阴性对照组的体外细胞增殖率无显著差异，均在100％左右。而阳性对照组细胞增殖率低于20％，表明生物膜具有良好的体外细胞相容性。

图5是本发明制备得到的生物膜体外淋巴细胞增殖检测结果图。图中BA代表本发明制备的生物膜，CK代表空白对照组，FAM代表新鲜羊膜。纵坐标百分率表示人淋巴细胞体外培养增殖率。通过图片显示可以看出生物膜以及新鲜羊膜组与空白对照组相比，均未引起人淋巴细胞体外异常增殖或凋亡，表明生物膜具有良好的免疫原性。

图6是本发明制备得到的生物膜应用于犬青光眼治疗的眼压监测结果图。图中检测时间点为检测犬实验动物眼压的时间点，实验组为采用本发明制备的生物膜作为青光眼小梁切除术后填充支架的犬动物组，健康组则为无任何手术操作的犬动物组。每个时间点数据均表示为均值±偏差，每个时间点每个实验组均检测8只犬眼压，眼压数据的单位为mmHg。通过图片显示可以看出生物膜实验组在术后短期即表现出良好的治疗效果，实验组犬眼压得到大幅降低，随着愈合时间延长，生物膜也能够较好维持引流作用，未发生后期瘢痕生成堵塞引流通道的现象，犬眼压保持良好，与健康组犬眼压无显著性差异。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例，应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思做出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明构思在现有技术基础上通过逻辑分析、推理或者根据有限的实验可以得到的技术方案，均应该在由本权利要求书所确定的保护范围之中。

Claims (7)

1.一种用于青光眼治疗的生物膜，其特征在于，由羊膜浸泡于质量百分比为1～5％的高分子多糖水溶液进行增厚后，然后在-16～-4℃下辐照灭菌制成，其厚度为0.2～0.5mm；

制备步骤包括：

(1)、取材

在1～3分钟内将脐带周围附着于胎盘之上的羊膜取下，并在2～10℃冷藏，1小时内运输至洁净车间进行后续处理；

(2)、冲压裁剪

将羊膜上皮面向上迅速铺展于硝酸纤维素滤膜上，在1～3分钟内将羊膜裁剪；

(3)复合增厚

将羊膜膜片浸泡于质量百分比浓度为1～5％的医药级别高分子多糖水溶液1～3分钟，使羊膜膜片厚度增厚至0.2～0.5mm，然后置于含有医用级甘油的包装袋中，封口密封，-16～-4℃下冷藏并立即送辐照灭菌。

2.一种用于青光眼治疗的生物膜的制备方法，其特征在于，其步骤包括：

(1)、取材

在1～3分钟内将脐带周围附着于胎盘之上的羊膜取下，并在2～10℃冷藏，1小时内运输至洁净车间进行后续处理；

(2)、冲压裁剪

将羊膜上皮面向上迅速铺展于硝酸纤维素滤膜上，在1～3分钟内将羊膜裁剪；

(3)复合增厚

将羊膜膜片浸泡于质量百分比浓度为1～5％的医药级别高分子多糖水溶液1～3分钟，使羊膜膜片厚度增厚至0.2～0.5mm，然后置于含有医用级甘油的包装袋中，封口密封，-16～-4℃下冷藏并立即送辐照灭菌；

(4)辐照灭菌

将增厚的羊膜膜片在-16～-4℃的低温保护条件下，采用电离辐射灭菌处理。

3.按照权利要求2所述的一种用于青光眼治疗的生物膜的制备方法，其特征在于，所述(1)步骤中所取羊膜厚度在0.1～0.2mm。

4.按照权利要求2所述的一种用于青光眼治疗的生物膜的制备方法，其特征在于，所述(1)步骤中采用羊膜快速取材装置进行取材，所述羊膜快速取材装置包括中空的漏斗状壳体和粗端大切刀，所述漏斗状壳体的粗端设置所述粗端大切刀；所述粗端大切刀上设置可拆卸的保护罩。

5.按照权利要求2所述的一种用于青光眼治疗的生物膜的制备方法，其特征在于，所述(2)步骤中，羊膜裁剪采用冲压裁剪装置来进行，所述冲压裁剪装置包括平板载体和裁刀，若干所述裁刀排列固定在所述平板载体一侧表面上。

6.按照权利要求2所述的一种用于青光眼治疗的生物膜的制备方法，其特征在于，所述医药级别高分子多糖为分子量100～150万的透明质酸或羧甲基纤维素钠中一种。

7.按照权利要求2所述的一种用于青光眼治疗的生物膜的制备方法，其特征在于，所述电离辐射灭菌用伽马射线辐照或是高能电子束辐照，剂量为20～30kGy；辐照后立即将生物膜置于-90～-10℃下冷藏保存。