CN106456837B

CN106456837B - 最终消毒的来自细胞外基质的水凝胶的制备方法

Info

Publication number: CN106456837B
Application number: CN201580025618.6A
Authority: CN
Inventors: S·F·巴迪拉克; C·L·德思; 提摩太·J·小基恩; N·J·特纳
Original assignee: University of Pittsburgh
Current assignee: University of Pittsburgh
Priority date: 2014-03-21
Filing date: 2015-03-20
Publication date: 2020-04-10
Anticipated expiration: 2035-03-20
Also published as: CN111265719B; US20190374683A1; EP3698815B1; AU2019203902A1; AU2015231110B2; US10213526B2; ES2806505T3; IL247878A0; EP3119448A4; KR20170003916A; US20220249742A1; AU2015231110A1; KR102624370B1; AU2019203902B2; CN111265719A; EP3698815A1; CN106456837A; CA2943182A1; EP3119448A1; KR102440051B1

Abstract

这里提供了用于制备消毒的、凝胶化的、溶液化的细胞外基质(ECM)组合物的方法，这种组合物可以有效用作细胞生长底物。这里还提供了使用本发明方法制备的组合物及其应用。在一个实施方案中，提供了一种装置，例如，假肢。所述装置包括一种无机基质，在此无机基质中分散着经过消毒、凝胶化、溶液化的ECM，从而促进细胞生长进入细胞外基质中并因此使病人适应该装置和/或将该装置附着到病人身上。

Description

最终消毒的来自细胞外基质的水凝胶的制备方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2014年3月21日递交的美国临时专利申请第61/968,716号的优先权，该申请通过引证在此全部并入本文。.

背景技术

这里描述了一种对ECM衍生的水凝胶进行消毒的方法。

细胞外基质-(ECM-)脚手架的最终消毒(例如，通过与环氧乙烷(EtO)气体相接触、暴露在γ射线照射中或者电子束辐射中)能够抑制细胞外基质-(ECM-)衍生的水凝胶的形成。临床前的研究结果已经显示并且持续表明细胞外基质-(ECM-)降解产物的显著效果，而细胞外基质-(ECM-)水凝胶中富集这种细胞外基质-(ECM-)降解产物。在临床转化并广泛的商业应用水凝胶产品之前，必须首选确定细胞外基质-(ECM-)水凝胶的消毒方法。

发明内容

这里描述了制备细胞外基质-(ECM-)凝胶剂及其相关组合物的方法。用一种酸性蛋白质消化最终消毒的细胞外基质-(ECM-)材料产生消化液，然后中和并将所得溶液温度升高到37℃时通常不会产生细胞外基质-(ECM-)水凝胶。而这里所描述的是一些溶液会遇到这种问题，即在最终消毒之后，仍然会产生可再生的凝胶化作用。通过环氧乙烷、电子束和γ射线对多剂量的实心板形式的细胞外基质-(ECM-)脚手架进行消毒不会形成水凝胶。但是，我们在这里显示，在消毒之前，所述材料从板型变成冷冻干燥的细胞外基质-(ECM-)消化液会导致水凝胶的形成。如下面实施例所示，举例并不做任何限制，冷冻干燥(冻干)细胞外基质-(ECM-)消化物，通过与环氧乙烷气体接触对干燥的消化物消毒，并在水中重新组成干燥的预-凝胶，产生另一种消化物，这种消化物经过中和并在37℃下培养克再生的成胶。根据这些结果，可以预计使用其他可接受的方法(例如电子束辐射、γ射线、X射线、超临界二氧化碳方法)对干燥的消化物进行最终消毒同样可以形成细胞外基质-(ECM-)水凝胶。

这里提供了用于制备消毒的、凝胶化的、溶液化的细胞外基质-(ECM-)组合物的方法，这种组合物可以有效用作细胞生长脚手架。在移植到病人中或者对病人施用之前，所述组合物处于非凝胶化形式，在凝胶化之前铸模并在此处原位成胶。这里还提供了使用本发明方法制备的组合物及其应用。在一个实施方案中，提供了一种装置，例如，假肢。所述装置包括一种无机基质，在此无机基质中分散着经过消毒、凝胶化、溶液化的ECM，从而促进细胞生长入细胞外基质中并因此使病人适应该装置和/或将该装置附着到病人身上。

附图说明

图1是示意图，显示了这里所描述的股骨移植物的实施方案。

图2是示意图，显示了这里所描述的义肢手的实施方案。

图3是膀胱壁横截面示意图(未按比例描绘)。显示了下列结构：上皮细胞层(A)、基膜(B)、固有膜(C)、粘膜肌层(D)、粘膜下层(E)、外肌膜(F)、浆膜层(G)、粘膜(H)和膀胱管(L)。

图4A是冷冻干燥的猪膀胱基质(UBM)层的照片。

图4B是冷冻干燥的猪膀胱基质(UBM)粉末的照片。

图4c是浓度为10毫克/毫升的膀胱基质(UBM)胃蛋白酶消化液照片。

图4D是4毫克/毫升膀胱基质(UBM)和8毫克/毫升膀胱基质(UBM)的照片，其中，显示4毫克/毫升的胶原蛋白I(Col I)水凝胶做对比(D)。

图5显示了膀胱基质(UBM)和胶原蛋白I水凝胶的凝胶电泳结果。

图6A是3毫克/毫升膀胱基质(UBM)凝胶在5,000X下的扫描电子显微照片(SEM)。

图6B是3毫克/毫升膀胱基质(UBM)凝胶在10,000X下的扫描电子显微照片(SEM)。

图6C是6毫克/毫升膀胱基质(UBM)凝胶在5,000X下的扫描电子显微照片(SEM)。

图6D是6毫克/毫升膀胱基质(UBM)凝胶在10,000X下的扫描电子显微照片(SEM)。

图7A是4毫克/毫升胶原蛋白I凝胶在5,000X下的扫描电子显微照片(SEM)

图7B是4毫克/毫升膀胱基质(UBM)凝胶在5,000X下的扫描电子显微照片(SEM)

图8A显示了比浊法测定的胶原蛋白I和膀胱基质(UBM)水凝胶的凝胶化动力学，通过在凝胶化期间使用分光光度计测定吸光度来确定。结果显示为测量的吸光度值。

图8B显示了比浊法测定的胶原蛋白I和膀胱基质(UBM)水凝胶的凝胶化动力学，通过在凝胶化期间使用分光光度计测定吸光度来确定。结果显示为规范化的吸光度值，这可以用于计算动力学参数，例如t1/2(达到50％最大浊度的时间)、tlag(凝胶化的滞后时间)和S(凝胶化速度)。

图9显示了比浊法测定的1毫克/毫升小肠粘膜下层(SIS)凝胶的凝胶化动力学。

图10显示了膀胱基质(UBM)凝胶在凝胶化期间的流变学测量值，其中，通过以固定的频率监控凝胶化期间样品振动模量，以机械方式确定凝胶化作用。结果显示了3毫克/毫升膀胱基质(UBM)凝胶和6毫克/毫升膀胱基质(UBM)凝胶的弹性模量(G′)和粘滞模量(G″)。

图11A显示了LS(肝基质细胞)和小肠粘膜下层(SIS)凝胶在凝胶化期间的流变性测量值。在5％菌株和1rad/sec下测定凝胶化动力学。结果显示了LS、SIS和UBM水凝胶在6毫克/毫升下的弹性模量(G′)。

图11B显示了LS(肝基质细胞)和小肠粘膜下层(SIS)凝胶在凝胶化期间的流变性测量值。在5％菌株和1rad/sec下测定凝胶化动力学。结果显示LS、SIS和UBM水凝胶在6毫克/毫升下的储能模量(G′)作为角频率的函数。

图12显示了3毫克/毫升胶原蛋白I凝胶和3毫克/毫升和6毫克/毫升膀胱基质(UBM)凝胶的频率对动态粘度的作用。

图13A显示了深入于膀胱基质(UBM)凝胶中的多孔肽纤维照片，其中，所述纤维不使用超声破碎处理。条形图度量是2000微米。

图13B显示了深入于膀胱基质(UBM)凝胶中的多孔肽纤维照片，其中，所述纤维使用超声破碎处理。条形图度量是2000微米。

图14A显示了在纤维孔中包含Ti6Al4V线的多孔金属脚手架的SEM图像。

图14B显示了杂合细胞外基质-(ECM-)/多孔金属脚手架的电子扫描显微镜图片，其中，膀胱基质(UBM)凝胶包覆Ti6Al4V线。

图14C显示了包含烧结的商品纯钛(CP Ti)小珠的多孔金属脚手架的SEM图像。

图14D显示了进行超声破碎之后杂合细胞外基质-(ECM-)/多孔金属脚手架和CPTi小珠的ESEM图像。

图15显示了最终消毒后水凝胶形成的定性观察。与未消毒的参照相比，在除去金属环霉菌(上图)之后，随着最终消毒皮肤细胞外基质-(ECM-)形成水凝胶的能力被消除。

图16A显示未消毒的冷冻干燥的预-凝胶。

图16B显示未消毒的冷冻干燥的在HCl中重组的预-凝胶。

图16C显示未消毒的冷冻干燥的在去离子水中重组的预-凝胶。

图16D显示了用环氧乙烷消毒的冷冻干燥的预-凝胶和在水中或者HCl中重组的预凝胶。图16B和图16C的比较显示，除了在HCl中消毒的样品(图16D)之外，其它所有样品的重组是完整的。

图17显示冷冻干燥的SIS-ECM预-凝胶的消毒导致水凝胶形成。

图18显示冷冻干燥的膀胱基质(UBM)预凝胶的消毒导致水凝胶形成。

图19A脱细胞的膀胱基质(UBM)各种消毒方法的比较。

图19B是图19A的定性比较。

具体实施方式

本申请中在指定各种范围时所使用的数值，除非另有明确说明，仅仅是约数，比如所述范围内的最小值和最大值之前都冠有“约”。在这种情况下，超过或者低于所述数值范围的微小变化数值也可以用于实现基本上相同的结果，这是由于这些数值也被认为在所述范围内。同样，除非另外说明，这里公开的范围指的是一种连续的范围，包括最大值和最小值之间的每一个值。如这里所使用，一个或者一种指的是一种或者一种以上。

如这里所使用的，术语“包括(comprising)”是开放式的，并且与“包含(including)”“含有(containing)”或者“特征在于(characterized by)”同义。术语“基本上由…组成”将权利要求的范围限制在指定的材料或者步骤，以及那些本质上不影响要求保护的发明的本质和新颖特性的材料或者步骤。相反，术语“由…组成”不包括任何在权利要求中没有特别指出的成分、步骤或者组分。如这里所使用的，实施方案“包括”一种或者一种以上所声称的元素或者步骤也包括，但是不局限于实施方案“基本上由”或者“由”这些所声称的元素或者步骤组成。

这里描述了制备细胞外基质(ECM)-衍生的组合物的方法，所述细胞外基质(ECM)-衍生的组合物包括来自任意多种组织的溶液化的细胞外基质。这里还描述了相关的组合物、装置及其使用方法。这种组合物是一种反向胶，也就是说当加热使温度高于组合物的低临界溶液温度(LCST)达到生理温度大约37℃时，这种基质的粘度增加。根据一个非限制性的实施方案，所述细胞外基质(ECM)-衍生的组合物在温度低于37℃时时可注射的溶液，但是在生理温度37℃条件下是凝胶态。根据特定的实施方案，所述凝胶具有生物活性，这是由于整个完整的细胞外基质(ECM)是溶液化的并且没有被透析、交联和/或额外处理来去除或者使细胞外基质(ECM)结构或者功能成分失活，因此产生的是高度生物活性的凝胶脚手架。这里提供了制备细胞外基质(ECM)-衍生的水凝胶的制备原则，以及从多种组织中制备凝胶的具体方案，所述组织包括膀胱、脾脏、肝脏、心脏、胰腺、卵巢、小肠、大肠、结肠、中枢神经系统(CNS)、脂肪组织和骨骼。美国专利第8,361,503号和美国专利公开号2010-0226895号和国际专利公开号第WO 2011/087743WO 2013/009595号公开了反向胶细胞外基质(ECM)-衍生的组合物的非限制性实施例。

如这里所使用的，“最终消毒”或者“末端消毒”指的是对组合物或者装置进行本质上或者实际上的完全消毒。这不包括去感染，例如，在制备细胞外基质(ECM)产品时作为去细胞化的一部分或者辅助操作，用过氧乙酸进行去感染。例如，细胞外基质(ECM)组合物可以通过浸泡在0.1％(v/v)过氧乙酸(σ)、4％(v/v)乙醇和96％(v/v)去离子水中两小时来去感染。然后用磷酸缓冲液(pH＝7.4)洗涤细胞外基质(ECM)组合物两次15分钟，用去离子水洗涤两次15分钟。尽管这也能实现去感染的特点，但是通常按照现行的操作规范这不会被认可为一种最终消毒方法。在最终消毒过程中，产品被暴露于一种有效的能够杀死存货的微生物的过程中。在细胞外基质(ECM)组合物中，去细胞化的细胞外基质(ECM)材料可以在增容、存储和/或商业分装之前进行最终消毒。本领域内已知多种最终消毒的方法，包括暴露于：环氧乙烷、环氧丙烷、γ辐射、电子束辐射、气体等离子体灭菌和超临界二氧化碳中(参见，例如，White,A,et al.,“Effective Terminal Sterilization UsingSupercritical Carbon Dioxide,”(2006)J.Biotech.123(4):504-515)。

本发明组合物还可以通过用戊二醛处理去感染，这回导致蛋白质材料的交联，但是这种处理本质上改变了材料因此吸收缓慢或者完全不能被吸收，并且会激发一种不同类型的宿主重塑，这种重塑更类似于疤痕组织形成或者包裹，而不是建设性的重塑。蛋白质材料的交联还可以被引入到亚胺、脱水热反应或者光氧化反应中。交联的细胞外基质(ECM)材料不被认为是完整的可用于本发明应用的细胞外基质(ECM)。

如下面实施例中所指出的，最终消毒的时间实质上影响了消化后的增容后的细胞外基质(ECM)材料形成反向胶凝胶的能力。对干燥的、酸性蛋白酶-消化的细胞外基质(ECM)组合物进行消毒。“干燥”或者“干燥的”指的是将组合物干燥或者冷冻干燥至基本上所有水份都被除去的程度，在实践中可以意识到，不可能完全除去组合物中的所有水分子。因此“干燥”或者“干燥的”指的是水含量，例如但是不局限于，小于组合物重量的5.0、1.0、0.5、0.1、0.01、0.001或者0.0001％(％重量)。可以使用多种方法干燥材料，比方说，例如并不限制于，通过在非破坏性温度(例如，室温下)下简单蒸发，或者通过冷冻干燥(冻干)法。

根据一个实施方案，这里提供了制备一种细胞外基质-衍生的凝胶的方法。在该方法中，细胞外基质(ECM)，例如，完整的细胞外基质(ECM)被酸性蛋白酶(比如胰蛋白酶或者胃蛋白酶)在酸性溶液中消化溶解产生消化溶液。干燥消化溶液，例如，通过空气干燥或者冷冻干燥。一旦溶液干燥，对其进行最终消毒，例如，通过电子束辐射或者γ射线辐射、或者暴露于环氧乙烷气体或者超临界二氧化碳。所述组合物可在其干燥状态，例如冷冻干燥状态被存储、分包和/或分配。然后水合消毒的材料，例如，通过溶解在水中或者水相溶液中(例如，TRIS缓冲液或者磷酸缓冲液)、或者溶解在盐溶液(例如，氯化钠溶液)中，例如(0.9％)盐水中产生消毒的消化溶液。然后，例如，通过与离子缓冲液或者碱(例如，但不局限于NaOH)混合将消毒的消化溶液的pH值调整到7.2-7.8之间，产生中和的消化溶液，所得溶液在温度大于25℃时成胶。将干燥的、消毒的组合物再水合在一种缓冲液中，例如pH为7.2-7.8的磷酸缓冲液中，可以同时完成再水合和中和步骤，如果再水合溶液的温度在25℃以上的话，该溶液会成胶，这样就可以将再水合、中和以及选择性的成胶步骤结合在一起。理想的情况是将温度维持在低于20-25℃，从而控制成胶进程，并且使所述组合物更均匀的再水合。

这里所描述的组合物可以被用作，例如但不局限于，可注射的移植物(例如，异源、异体或者自体移植物)用于需要修复或者增强的组织(例如，骨骼或者软组织)中，更典型的，用于需要弥补创伤或者疾病导致的组织缺陷中。所述组合物还可以用作移植构建物填充物，包括但是不局限于，形成理想形状的铸模构建物，用于装饰或者治疗创伤的外科手术。

所述组合物可以通过多种方法植入病患、人体或者动物体中。在一个非限制性实施方案中，该组合物以液体形式被注射进入病患体内的理想位点。如这里所使用的，术语“接种”、“种植”或者“移植”指的是向特定组合物中加入、整合、传播或者扩散确定体积的细胞悬浮液或者确定的细胞数。所述组合物可以是细胞预先接种的，然后优选的使用大尺寸，例如，16号针管注射，从而防止细胞被切碎。在另一个非限制性实施方案中，所述组合物在模中成胶，并且成胶成模的产品被移植到病患体内合适的位点。所述成胶成模的产品可以用细胞预先接种，例如，接种病患的细胞。

如这里所使用的，术语“细胞外基质”和“ECM”指的是用于细胞生长的天然脚手架，通过对多细胞有机体(例如哺乳动物和人)中发现的组织进行去细胞化制备脚手架。细胞外基质-(ECM-)可以通过，例如透渗析或者交联进一步加工。细胞外基质(ECM)是一种结构性和非结构性生物分子的复杂混合物，包括但不限于：胶原蛋白、弹性蛋白、粘连蛋白、氨基多糖、含蛋白多糖、抗菌剂、趋化性细胞诱导因子、细胞因子和/或生长因子。在哺乳动物中，细胞外基质(ECM)常常包括大约90％的以各种形式存在的胶原蛋白。所述组合物和ECM的结构根据组织来源不同而变化。例如，由于各个组织需要的独特的细胞环境不同，小肠粘膜下层(SIS)、膀胱基质(UBM)和肝基质ECM在其整体结构和组合物各方面均不相同。

如这里所使用的，术语“完整的细胞外基质”和“完整的ECM”指的是其结构性或非结构性生物分子保持活性的细胞外基质，包括但不局限于，胶原蛋白、弹性蛋白、粘连蛋白、氨基多糖、含蛋白多糖、抗菌剂、趋化性细胞诱导因子、细胞因子和/或生长因子，例如，但不局限于这里所描述的粉碎的细胞外基质(ECM)。可以使用化学方法或者机械方法除去细胞外基质(ECM)中生物分子的活性，例如，通过交联和/或通过透析细胞外基质(ECM)。完整的细胞外基质(ECM)基本上没有交联或者没有被透析，这意味着所述细胞外基质(ECM)没有经过透渗析和/或交联过程，或者在溶解前，没有经过除了储存和处理细胞外基质(ECM)时会自然发生的过程之外的其他情况，如这里所述的。因此，本质上交联的和/或透析的细胞外基质(ECM)(以任何方式除了那些不能基本上影响所述细胞外基质(ECM)在这里所描述的应用中的凝胶化作用和功能性特点的小改变方式)不被认为是“完整的”。

“生物相容性”指的是一种装置、脚手架、组合物等等是本质地、实际上(用于其预计应用时)和/或基本上对与所述装置、脚手架、组合物等等接触的细胞、组织、器官和/或器官系统无毒的、无害的或者非抑制性或者不起抑制作用的。

通常，制备细胞外基质(ECM)-衍生的凝胶的方法需要从所关心的动物体或者所关心的器官中内分离细胞外基质(ECM)。在某些实施方案中，所述细胞外基质(ECM)是从哺乳动物组织中分离的。如这里所使用的，术语“哺乳动物组织”指的是来源于哺乳动物的组织，其中，所述组织包括动物的任何细胞组分。例如但不局限于，组织可以来源于细胞的集合体，例如，器官、器官部分或者器官组合。在某些实施方案中，所述细胞外基质(ECM)来源于脊椎动物，例如，但不局限于，人、猴子、猪、家牛和羊。在某些实施方案中，所述细胞外基质(ECM)来源于动物的任何组织的，例如但不局限于：膀胱、肝、中枢神经系统(CNS)、脂肪组织、小肠、大肠、结肠、食管、胰腺、真皮和心脏。在一个实施方案中，所述细胞外基质(ECM)来自膀胱。所述细胞外基质(ECM)可能包括或者可能不包括细胞外基质(ECM)的基膜部分。在某些实施方案中，所述细胞外基质(ECM)包括至少一部分所述基膜。细胞外基质(ECM)可能保持或者可能不保持一些包括原始组织的细胞分子，例如毛细血管内皮细胞或者纤维细胞。

如这里所使用的，术语“衍生于”及其相关的其他文字形式，例如，但是不局限于“来源于”、“衍生物”指的是通过任意有效的方法从任意所述来源处获得的一种组分或者一些组分。例如，但是不局限于，细胞外基质(ECM)-衍生的凝胶指的是由通过使用本领域内已知的多种适合分离细胞外基质(ECM)的方法从任意组织处获得的细胞外基质(ECM)的组分所组成的凝胶。在另一个实施例中，哺乳动物组织-衍生的细胞外基质(ECM)指的是由哺乳动物组织的组分所组成的细胞外基质(ECM)，其中所述哺乳动物组织是通过任何有效的方法获得的。

在分离所关心的组织之后，通过各种方法进行去细胞化，例如但是不局限于，暴露在高渗盐水中、过乙酸中、Triton-X中或者其他清洁剂中。然后，干燥或者冷冻干燥(冻干)或者风干去细胞化的细胞外基质(ECM)。通过一些方法可以粉碎干燥的细胞外基质(ECM)，所述方法包括但不限于，撕裂、碾压、切割、磨碎、和剪切。被粉碎的细胞外基质(ECM)还可以通过一些方法被进一步加工成粉末状，所述方法包括但是不局限于，例如，磨碎或者压碎冻结或者冻结干燥状态的细胞外基质(ECM)。

如这里所使用的，术语“粉碎”及该字的任何形式或者同义词，例如，但不局限于“粉末”和“制粉”值得是将大颗粒加工成小颗粒的过程，包括但是不局限于通过磨碎、掺杂、撕碎、切断、压碎、切割、切细等方法。细胞外基质(ECM)可以粉碎的，虽然不局限于任何形式，包括但是不局限于，水合式、冻结式、风干式、冷冻干燥式、粉末或者片式。

为了制备溶液化的细胞外基质(ECM)组织，用在酸性溶液中的酸性蛋白酶消化粉碎的细胞外基质(ECM)，形成消化溶液。如这里所使用的，术语“酸性蛋白酶”指的是能够裂解肽键的酶，其中，所述酶可以在酸性pH值下增加裂解肽键的能力。例如但不局限于，酸性蛋白酶可以包括胃蛋白酶和胰蛋白酶。

细胞外基质(ECM)的消化液通常在室温下持续搅拌一段时间。所述细胞外基质(ECM)消化液可以被立即使用或者在-20℃下存储，或者在例如但是不局限于-20℃或者-80℃条件下冷冻，被用于这里所描述的方法和组合物中，被干燥并消毒。随后，所述消化液的pH值被升高到7.2-7.8之间，产生中和的消化液。可以通过加入一种或者一种以上的碱或者等渗缓冲溶液升高pH值，例如但是不局限于，NaOH或者pH值为7.4的磷酸缓冲液。这些方法通常不包括凝胶化之前的透析步骤，产生更完整的细胞外基质(ECM)-样基质，该基质在37℃下比可比较的胶原蛋白或者透析过的细胞外基质(ECM)制剂更缓慢的成胶。因此，所述凝胶更易于注入病人体内，并且由于保持了许多天然可溶性因子(例如，但是不局限于，细胞因子)而维持更多质量的天然细胞外基质(ECM)。从各种组织制备的未透析(全细胞外基质(ECM))制剂生成一种其动力学适用于成模成胶或者原位成胶应用的凝胶的能力是出乎意料的。

如这里所使用的，术语“等渗缓冲液”指的是一种能够将溶液的pH值缓冲到7.2到7.8之间的等渗溶液，并且这种等渗溶液具有平衡的盐浓度从而促进等渗环境。如这里所使用的，所述术语“碱”指的是pH值大于7的任何化合物或者化合物的溶液。例如，但是不局限于，所述碱是碱性氢氧化物或者碱性氢氧化物的水溶液。在某些实施方案中，所述碱是NaOH或者在磷酸缓冲液中的NaOH。

中和的消化液可以在合适的温暖气温下培养，例如，但是不局限于，在大约37℃下培养成胶。所述中和的消化液可以在，例如但是不局限于，-20℃或者-80℃的条件下冷冻并存储。如这里所使用的，术语“中和的消化液”或者“中和的消化物”指的是其中pH值增加的消化物或者消化液，可以以溶液或者干燥组合物的形式存在。例如但是不局限于，中和的消化物的pH值在7.2到7.8之间。

这里所描述的方法、组合物和装置可以使用任何种类的细胞外基质组织(通常参见，美国专利号4,902,508；4,956,178；5,281,422；5,352,463；5,372,821；5,554,389；5,573,784；5,645,860；5,711,969；5,753,267；5,762,966；5,866,414；6,099,567；6,485,723；6,576,265；6,579,538；6,696,270；6,783,776；6,793,939；6,849,273；6,852,339；6,861,074；6,887,495；6,890,562；6,890,563；6,890,564；和6,893,666),只是所述材料不是最终消毒的。在某些实施方案中，所述细胞外基质(ECM)来源于脊椎动物，例如，但不局限于，来源于热血的哺乳脊椎动物，包括但不限于，人、猴子、猪、母牛和羊。所述细胞外基质(ECM)可以来源于任何器官或者组织，包括但是不局限于，膀胱、肠、肝、食管和皮肤。在一个实施方案中，所述细胞外基质(ECM)分离自膀胱。在另一个实施方案中，所述细胞外基质(ECM)分离自肠，或者肠的一部分。所述肠从幽门括约肌伸出，延伸至肛门，并且包括：小肠，从幽门瓣伸出延伸至回盲瓣；大肠，从回盲瓣伸出；及其他部分，包括十二指肠；空肠；回肠；盲肠；附件；升结肠、横结肠、降结肠和乙状结肠；直肠和/或肛管(参见，例如，Marieb,EN,Human Anatomy and Physiology,第二版,1992,Benjamin/Cummings印刷有限公司，Redwood城，加利福尼亚州，第792,793,802,和803页).所述细胞外基质(ECM)可能包括或者可能不包括细胞外基质(ECM)的基膜部分。在某些实施方案中，所述细胞外基质(ECM)包括至少一部分所述基膜。

能用于脚手架中的细胞外基质(ECM)的种类可以根据伤口愈合时或者组织再生时需要募集的细胞类型、被替换的组织器官的天然组织结构、来源于组织的细胞外基质(ECM)的有效性或其他影响最后脚手架质量和制备脚手架可能性的因素而变化。例如但是不局限于，细胞外基质(ECM)可以包含基膜表面和非-基膜表面，这可以有效用于促进组织再造，所述组织例如，膀胱、食管或者血管，这些组织都有基膜部分和非-基膜部分。

在一个非限制性实施方案中，从猪膀胱中收获细胞外基质(ECM)(也被称作膀胱基质或者UBM)。简单的说，通过从猪中取出膀胱组织并修整剩余的外部结缔组织(包括脂肪组织)来制备细胞外基质(ECM)。通过重复用自来水洗涤去掉残余尿液。首先将所述组织浸泡在真皮生长溶液(例如但是不局限于，高渗盐水(例如1.0N盐水)中10分钟到四小时，使组织分层。与高渗盐水溶液的接触从基膜下层除去所述上皮细胞。选择性地，可以向所述盐溶液中加入钙螯合剂。经过最初分层过程处理后剩余的组织包括上皮细胞基膜和与所述上皮细胞基膜连接的管腔组织层。随后，该组织进一步被处理去掉大部分管腔组织但是维持上皮细胞基膜和固有膜。通过机械磨蚀或者通过酶组合物的处理(例如，使用胰蛋白酶或者胶原酶)，随后进行水合作用和磨蚀，从剩余的真皮组织中除掉外浆膜、外膜、肌膜粘膜、粘膜下层和大部分粘膜肌层。在机械法除去这些组织的同时伴随着系膜组织的去除，例如但是不局限于，使用Adson-Brown镊子和Metzenbaum剪刀，并使用纵向擦抹动作，用解剖刀处理或者其他包裹在湿纱布中的刚性物体擦去肌膜和粘膜下层。本发明还包括自动机器处理法，包括切削片、激光及其他组织分离方法。在去掉这些组织之后，产生的细胞外基质(ECM)主要有上皮细胞基膜和下层固有膜组成(图3的层B和层C)。

在另一个实施方案中，通过用解剖刀和湿纱布进行纵向摩擦动作磨擦猪膀胱组织去掉包括浆膜层和肌膜的外层(图3中的层G和层F)制备所述细胞外基质(ECM)。在反转组织片段之后，使用相同的擦抹动作使下层组织中粘膜的腔部分(图3中的层H)被分层。小心不要使粘膜下层穿孔(图3的层E)。在去掉这些组织之后，产生的细胞外基质(ECM)主要由所述粘膜下层组成(图3的层E)。

许多细胞外基质(ECM)制剂是市场上可买到的，可以通过多种方法制备。市场上可买到的小肠粘膜下层(SIS)制剂包括，但是不局限于，Surgisis^TM,Surgisis-ES^TM,Stratasis^TM和Stratasis-ES^TM(Cook Urological公司；印第安纳波利斯，印地安那州)和GraftPatch^TM(Organogenesis公司；麻萨诸塞州)。市场上可买到的皮肤制剂包括，但是不局限于，(在欧洲以的名称出售；Bard，科灵顿，乔治亚州)，(Microvasive公司；波士顿，麻萨诸塞州)和(LifeCell公司；Branchburg，新泽西州)。市场上可买到的膀胱制剂包括，但是不局限于UBM(Acell公司；Jessup，马里兰州)。这些细胞外基质(ECM)制剂的任何一种都可以没有最终消毒的形式被提供，因此可以是适合于这里所描述的方法和组合物的前体。

这里所描述的组合物可以被用于多种方法或者形式中。例如但是不局限于，根据第一实施方案，所述中和消化物放置于适当的模具中形成器官或者器官的一部分。作为一种非限制性的实施例，所述组合物在模具中形成肝的一部分，从而促进肝组织的再生。在另一个非限制性实施例中，所述组合物在模具中形成鼻子的形状或者耳朵软骨的形状，或其一部分，适用于替换损伤或者删除的软骨组织。在依旧另一个非限制性实施例中，所述组合物在模具中形成伤口形状，促进组织的非疤痕性愈合。为了制备成模的凝胶，中和的消化物被放置在生物相容性的并且优选的无菌模具中，例如，塑料膜中，并且在一定温度下培养合适的时间使组合物进行凝胶化，例如但是不局限于在大约37℃条件下。在一个实施方案中，37℃下所述组合物和模具放置在培养箱中成胶。由于二氧化碳已经被发现能够减缓凝胶化的过程，在一个非限制性实施方案中，不将二氧化碳注入所述培养器中，但是在依旧另一个实施方案中，二氧化碳和温度被用于控制凝胶化过程。

在凝胶化或者扩散、吸收和/或通过成胶后的凝胶吸附之前，任何有效的细胞因子、趋化性细胞诱导因子或者细胞可以与组合物相混合。例如但是不局限于，有用的组分包括生长因子、干扰素、白介素、趋化因子、单核因子、激素、拮抗因子、药物和抗生素。细胞可以被混合物中和的、溶液化的凝胶中或者一旦成胶，可以被放置在成模组合物中。在每种情况下，当凝胶中被接种上细胞时，通过在生物反应器或者培养器中合适的介质上培养适当时间，所述细胞可以生长和/或沿着成模的细胞外基质(ECM)凝胶壁生长，从而最佳制备或者有利的制备适用于在病人中抑制的组合物。可以向成模的组合物中接种细胞，从而促进内部生长、分化作用和/或细胞的适应性。例如但是不局限于，所述细胞可以是自体细胞或者相对于接受包括所述凝胶的组合物/装置的病人来讲的异源细胞。所述细胞可以是干细胞或者其他祖细胞，或者分化细胞。在一个实施例中，从病人处获得的皮肤层被接种在模具上，用于恢复皮肤损伤和/或延伸与组织下部。

如这里所使用的，术语“模具”指的是用于使凝胶形成三维性质的腔或者表面。例如但是不局限于，所述模具可以是平皿、细胞培养盘或者管，或者可以被塑形成任何有用的形状。在某一实施方案中，所述模具可以被塑形成某一器官或者器官的一部分的形状。凝胶可以通过多种方法传递到模具中，包括但不限于，注入、沉淀。

如这里所使用的，术语“药物”和“药物们”指的是任何具有预防或者治疗作用的组合物，包括但是不限制于，抗生素、肽、激素、有机分子、维生素、补充物、因子、蛋白质和趋化性细胞诱导因子。

如这里所使用的，术语“细胞”或者“细胞群”值得是任意种类的来自任意动物的细胞，例如，但是不局限于，大鼠、小鼠、猴子和人。例如但是不局限于，所述细胞可以是祖细胞，例如干细胞或者分化细胞，例如内皮细胞、平滑肌细胞。在某些实施方案中，用于医疗过程的细胞可以来自于病人，用于自体过程，或者来源于其他供体，适合于异源过程。

使用预成模组织的一个好处是可以产生层状组合物。例如，使用来自第一来源的第一细胞外基质(ECM)凝胶制备待移植组合物的核心部分，包覆层可以含有来自第二来源的第二细胞外基质(ECM)凝胶，所述第二来源与第一来源不同，或者与第一来源相同但是包括不同成分，例如细胞因子或者细胞。

在预成模组合物的另一个实施方案中，所述细胞外基质(ECM)被包括在非粉碎性和未消化的细胞外基质(ECM)组织(例如，小肠粘膜下层(SIS)或者膀胱基质(UBM))片状的套中，从而增加凝胶的机械强度。在这些实施方案中，在用溶液化的细胞外基质(ECM)组织充满模具之前，使用本领域已知方式制备的细胞外基质(ECM)组织的各个层可以被放置在模具中，用于产生凝胶。细胞外基质(ECM)组织的各个层可以被用作模具，只要他们之间形成并缝合或者交联成需要的形状。以这种方式，可以产生比只有凝胶的情况具有更大机械强度的固体组合物。

在另一个非限制性实施方案中，所述组合物作为一种中和的消化液被注入病人体内。所述组合物被注射入病人体内需要基质进行细胞生长的位点。例如但是不局限于，当病人由于外伤必须去掉组织、清创术和/或除去损伤的、患病的或者癌性组织时，所述组合物可以被注射进入除去组织的位点从而促进组织内部生长。通过改变制备预凝胶所使用的水的量(例如，通过改变水、酸、碱、缓冲液(例如磷酸缓冲液)或者其他稀释剂的量)来控制预凝胶的粘度。在使用小规格针头的应用中，例如在内窥镜检查时，需要使用粘度更小的预凝胶，这通常会导致粘度更小的凝胶，一旦形成预凝胶的话。在使用大规格针头的应用中，可以使用粘度更高的凝胶，当成胶时具有更高的强度。同样，使用更大规格的针头时，不管预凝胶的粘度怎样，最好在移植前立刻将预凝胶与活细胞相混合，降低切碎细胞的风险。

在一个实施方案中，通过增加酸性消化液的pH值制备中和消化液，并在发生明显的凝胶化作用之前将所述组合物直接注射入病人体内。在一个实施方案中，所述组合物处于冻结状态并在注入之前解冻并升温。在另一个实施方案中，所述酸性消化液被加热到生理温度并在注射期间在静态混合器中与大量碱和/或缓冲液(例如磷酸缓冲液)混合。适当的静态混合器包括但是不局限于，螺旋状或者正方形的静态混合器，可以从加拿大安大略省科伯格Cammda公司商业购得，或者具有微静态混合器的微二重注射器，可以从康泊狄格诺维斯的Plas-Pak工业公司商业购得。

在进一步的实施方案中，提供了可市售的试剂盒，包括这里所描述的组合物。试剂盒包括适当的包装材料和所述组合物。在一个非限制性实施方案中，所述试剂盒在容器中包括消化液，这可以是被包装的，或者可以包含在包装中。在这些实施方案中，如果所述消化液是中和的，她可以被冷冻、冷却；例如，在接近冷冻温度下储存，例如，但是不局限于，低于大约4℃或者在室温下储存，例如，20-25℃。在另一个非限制性实施方案中，所述试剂盒包括第一容器，第一容器包含一种酸性溶液，所述酸性溶液包括这里所描述的预中和的消化物，并且，所述试剂盒还包括一种第二容器，第二容器包括中和溶液，所述中和溶液中包括碱和/或缓冲剂(多种)，从而使第一容器中的酸性溶液回到生理学离子强度和pH，生成中和的消化物。在进一步的实施方案中，第一容器包含最终消毒的、冷冻干燥的、预中和的消化物，这种消化物可以用水或者能够选择性的中和酸的适当的水溶液水合。在此实施方案中，选择性的提供一种第二容器，其中包括如上所述的中和溶液，既能够水合冻干产品也能够中和她，或者选择性的提供一种第三容器，其中包括水或者其他能够在使用中和溶液中和前有效水合所述冻干产品的适当的溶液。该试剂盒还选择性的包括混合针和/或冷却包装。所述容器可以是小瓶、注射器、管或者任何其他适合在商业分销途径中贮存和传递所述试剂盒的容器。

在所述试剂盒依旧另一个实施方案中，凝胶组合物成模并在包装和分配之前预成胶。在一个实施方案中，成模的凝胶被包装在气泡包装中，包括塑料容器和一种纸质、塑料和/或薄箔密封的部分，如本领域技术人员已知的。模具和包装通常在包装之前或者之后消毒，例如但是不局限于，通过γ或者电子束照射或者超临界的二氧化碳消毒。所述成模的组合物可以被包装在任意合适的生理溶液中，例如，磷酸缓冲液或者盐水。如果成模的凝胶包含活细胞，则所述模具可以通过密封的广口瓶或者其他容器运输到一种适当的细胞培养基中。当然，包含细胞的成模凝胶以一种加快保存细胞的方式运输。

如这里所使用的，术语“杂合无机/细胞外基质(ECM)脚手架”指的是包覆在生物相容性无机结构上的细胞外基质(ECM)-衍生的凝胶，所述生物相容性无机结构例如，但是不局限于，一种金属、一种无机钙化合物(例如氢氧化钙，磷酸钙或者碳酸钙)或者一种陶瓷组合物。在一个实施方案中，使用超声作用来给无机结构包覆上细胞外基质(ECM)衍生的凝胶。如这里所使用的，术语“超声作用”指的是暴露于拼读高于15千赫兹并低于400千赫兹的超声波中。

如这里所使用的，术语“包覆”及其同义词例如“涂布”和“包裹”指的是一种过程，这一过程包括用细胞外基质(ECM)衍生的凝胶或者杂合无机/细胞外基质(ECM)脚手架覆盖无机结构。例如但是不局限于，用细胞外基质(ECM)-衍生的凝胶包覆无机结构可以包括倒、装入、分层、浸泡、喷雾等方法。

在这里所描述的技术的另一个实施方案中，所述组合物被包覆在一种生物相容性结构材料上，所述生物相容性结构材料例如金属、无机钙化合物(例如氢氧化钙、磷酸钙或者碳酸钙)或者陶瓷组合物。适当的金属的非限制性实施例是钴铬合金、不锈钢、钛合金、钽合金、钛-钽合金，其可以包括非金属成分和金属成份，例如钼、钽、铌、锆、铁、锰、铬、钴、镍、铝和镧，包括但不局限于，各种等级的CP Ti(商品纯钛)或者Ti 6Al 4V(90％重量Ti、6％重量铝和4％重量钒)、不锈钢316、镍钛金属互化物(镍钛合金)、镀有羟基磷灰石的钛合金。由于金属的高强度、柔韧性和生物适应性，金属是有效的。金属还可以形成各种复杂的形状并且许多金属能够经受生物环境的腐蚀，减少磨损，并且不会对组织造成损伤。在一个非限制性实施例中，所述金属是股骨或者髋臼组分，用于臀部修复。在另一个实施例中，所述金属是纤维或者其他突起，用于永久附着于病人的修复体上。其他组合物，包括陶瓷、钙化合物，例如，但是不局限于碳酸钙，可以是优选的，例如但是不局限于，用在骨骼或者牙齿结构的修复或者再塑形中。金属、陶瓷和/或其他材料的组合也被证明是有效的。例如，臀部置换物的金属股骨部分可以包括陶瓷球和/或可以包括包覆在球表面的塑料，作为髋臼部分。

金属及其他合适的材料可以以其不同的形式被使用，包括但是不局限于线状、薄片、小珠、棒状和粉末状，包括纳米晶体粉末。组合物和金属或其他材料的表面还可以被改变来保护生物相容性，例如，通过硅烷处理使表面钝化、包覆生物相容性塑料或者陶瓷、复合金属/陶瓷材料。这里所使用的材料和方法是本发明所述领域已知的。

使用金属插入物修复病人骨骼结构的一个难题是插入物必须锚定/附着于现存的骨骼部分。传统方法使用粘合剂和/或螺旋钉。就修复体而言，修复体一般不与病人组织相连，除非，通常使用粘合剂粘合。因此，理想的情况是使医疗装置生物附着在病人组织上。这可以通过使用这里所描述的细胞外基质(ECM)凝胶包覆移植物表面来实现，这里所描述的细胞外基质(ECM)凝胶能够促进组织的内生长，因此附着所述装置。多种多孔结构可以附着在移植物上，产生脚手架，在此脚手架中，细胞外基质(ECM)凝胶和随后的细胞或其他组织(例如，骨骼)可以渗透进入其中。这些结构包括，但是不局限于，编织的网孔或者非编织的网孔、海绵样的多孔材料、融合小珠，等等。多孔脚手架会促进活组织之间的有力连接，包括骨骼和该装置之间。多孔脚手架的“孔”可以是任意能够允许细胞外基质(ECM)凝胶渗入的尺寸，选择性的，通过巢式或者其他帮助凝胶和随后的细胞或其他生物材料(例如，骨骼、软骨、腱、韧带、筋膜或者其他结缔组织)渗入脚手架的方式处理来促进渗入。在一个实施方案中，金属丝附着于所述装置上并且所述金属丝表面包覆有这里所描述的细胞外基质(ECM)凝胶，从而允许组织在纤维内的内生长。在第二实施方案中，小珠基质被焊接或者附着于装置表面，这里所描述的细胞外基质(ECM)凝胶包覆在小珠基质上，促进组织在小珠间的内生长。在一个实施例中，包含纤维突起的装置可以插入骨骼内部，允许金属丝与骨骼的融合。在一个实施方案中，在细胞外基质(ECM)凝胶上接种适当的细胞群(例如载体成骨细胞)并培养，促进骨骼生长。

在另一个实施方案中，杂合无机/细胞外基质(ECM)脚手架还可以用来包覆其他结构移植物，例如但不局限于，股骨移植物、手义肢。图1显示了在臀部置换过程中被插入到股骨15中的装置10的一个实施方案。图1显示了装置10，表明了适合于插入股骨15的插入部分20，和可以螺丝固定或插入小球(未显示)的扩充部分25.装置10包括多孔涂层30，例如但是不局限于焊接在装置10上的金属珠的多孔涂层。图1中的区域A显示了装置10的涂层30的放大的视窗。小珠32被焊接在装置10的金属表面34上。细胞外基质(ECM)凝胶36被涂布在小珠32上或者小珠32之间。通过细胞外基质(ECM)凝胶36的存在促进骨骼组织向小珠32的生长。

义肢需要锚定到骨头上，以使用具有多孔涂层插入物类似的方式，多孔涂层延长附着到病人组织所需要的限制。举例来说，如图2所示，手部义肢100包括外部分115和内部分120，其中包括径向插入部分122和尺骨插入部分124。多孔涂层130从插入部分122和124中延伸出来，附着到骨头上，从外部分115开始，允许皮肤以及骨骼和皮肤之间的中间组织附着。

这里所描述的装置(例如，义肢)可以被中和的预凝胶涂布，并且随后将凝胶温度升高产生中和的预凝胶和凝胶。在另一个实施方案中，所述酸性预凝胶被用于装置或者义肢。然后可以干燥装置上的预凝胶，例如，冷冻干燥，并对整个装置进行最终消毒，随后包装并分配。装置上的冷冻干燥产品可以被最终的用户水合，并向装置使用水、盐水或者磷酸缓冲液中和，随后或者同时升高装置的温度至，例如，高于37℃。

在使用时，表面徒步游适当的脚手架和这里所描述的细胞外基质(ECM)凝胶的装置可以与细胞相接触，例如，与病人或者异源细胞相接触，并且所述细胞被允许渗透入基质中。细胞的内生长或者细胞深入可以在体内或者体外发生，取决于最优的使用方法。例如但是不局限于，就股骨移植物来讲，所述移植物可以被插入股骨中，病人的细胞、理想的骨骼组织会渗入脚手架将装置与骨骼相融合。在另一个实施方案中，例如，对于人工腱或者韧带，病人腱或者韧带的活体解剖物与适当的脚手架一起培养，从而产生自体韧带或者腱移植物。

实施例

实施例1-猪细胞外基质(ECM)(膀胱基质(UBM))的制备

之前已经描述了膀胱基质(UBM)的制备[Sarikaya A,et al.TissueEng.2002Feb；8(1):63-71；Ringel RL,et al.J Speech Lang Hear Res.2006Feb；49(1):194-208].简单地说，从6个月大的体重在108-118千克的猪(Whiteshire-Hamroc，IN)中收获猪膀胱，随后立即使其安乐死。从绒膜表面除去结缔组织和脂肪组织，然后重复用自来水洗涤除掉残余尿液。机械除去浆膜层、肌膜外膜、粘膜下层和大多数肌膜粘膜。在1.0N盐溶液中浸泡组织，隔开腔表面，分离粘膜的泌尿道上皮细胞，产生由基膜加下层固有膜所组成的生物材料，这被认为是膀胱基质(UBM)。图3显示了膀胱壁的剖面图以及其内部结构。

在振荡器上，在包含0.1％(体积/体积)过乙酸、4％(体积/体积)乙醇和95.9％(体积/体积)无菌水溶液中消毒膀胱基质(UBM)层。使用无菌磷酸盐缓冲盐水(pH＝7.4)洗涤两边，每次15分钟，并用无菌水洗涤两次，每次15分钟，除去过乙酸残基。然后使用FTS系统批量冰冻干燥器型号8-54冷冻干燥(图4B)膀胱基质(UBM)片(如图4A所示)，并使用Wiley小型粉碎器制粉。

将1克冷冻干燥的膀胱基质(UBM)粉末(图4B)和100毫克胃蛋白酶混合进入100毫升的0.01M HCl中。在室温下(25℃)持续搅拌溶液48小时。在胃蛋白酶消化之后，消化液(图4C)分部分储存在-20℃下，直到使用时。完成后，所述溶液被认为是消化液或者细胞外基质(ECM)消化物或者细胞外基质(ECM)储备溶液。

实施例2-猪脾细胞外基质(ECM)的制备

获得新鲜的脾组织。切除外层脾膜，然后剩余组织被切成均匀的块。修整外膜的残余物，然后在水中漂洗三次。通过使用筛网除去水中菌株。通过按摩溶解脾细胞。在0.02％胰蛋白酶/0.05％乙二胺四乙酸溶液中，37℃下水浴培养脾切片1小时。如果需要的话，通过按摩进一步地溶解脾细胞。在洗涤之后，用3％Triton X-100溶液中吸收切片并在振荡器上放置1小时。如果需要的话，通过按摩进一步地溶解脾细胞。然后将切片在4％脱氧胆酸溶液中吸收，并放置在振荡器上1小时。彻底清洗之后，保存纯化的脾细胞外基质(ECM)用于进一步处理。这些组织随后用过乙酸处理消毒，并干燥。

将1克干燥的猪脾细胞外基质(ECM)和100毫克胃蛋白酶混合进入100毫升的0.01MHCl中。在室温下(25℃)持续搅拌溶液72小时。如果在溶液中没有明显的细胞外基质(ECM)碎片浮动的话，将样品分部分并冷冻(-20℃)或者立即使用。

实施例3-猪肝基质细胞外基质(ECM)的制备

获得新鲜的肝组织。修整多余的脂肪和组织。切除外层肝膜，然后剩余组织被切成均匀的块。用解剖刀或者刀片修整外膜的残余物，然后在水中漂洗三次。通过使用筛网除去水中菌株。通过按摩溶解细胞。在0.02％胰蛋白酶/0.05％乙二胺四乙酸溶液中，37℃下水浴培养肝切片1小时。如果需要的话，通过按摩进一步地溶解细胞。在洗涤之后，用3％Triton X-100溶液中吸收切片并在振荡器上放置1小时。如果需要的话，通过按摩进一步地溶解细胞。然后将切片在4％脱氧胆酸溶液中吸收，并放置在振荡器上1小时。彻底清洗之后，将肝基质保存在去离子水中用于进一步处理。这些组织随后用过乙酸处理消毒，并干燥。

将1克干燥的猪肝基质细胞外基质(ECM)和100毫克胃蛋白酶混合进入100毫升的0.01M HCl中。持续搅拌溶液24-48小时，在室温下(25℃)。如果在溶液中没有明显的细胞外基质(ECM)碎片浮动的话，将样品分部分并冷冻(-20℃)或者立即使用。

实施例4-人肝基质细胞外基质(ECM)的制备

将1克干燥的人肝基质细胞外基质(ECM)和200毫克胃蛋白酶混合进入500毫升的0.01M HCl中。在室温下(25℃)持续搅拌溶液3-5天。所述溶液需要每天监控。如果在溶液中没有明显的细胞外基质(ECM)碎片浮动的话，将样品分部分并冷冻(-20℃)或者立即使用。

实施例5-猪心细胞外基质(ECM)的制备

将1克干燥的猪心的细胞外基质(ECM)和100毫克胃蛋白酶混合进入50毫升的0.01M HCl中。在室温下(25℃)持续搅拌溶液48小时。

实施例6-猪胰腺细胞外基质(ECM)的制备

将1克干燥的去脂肪的猪胰腺细胞外基质(ECM)和100毫克胃蛋白酶混合进入50毫升的0.01M HCl中。在室温下(25℃)持续搅拌溶液48小时。

实施例7-猪卵巢细胞外基质(ECM)的制备

在6小时内收获新鲜的卵巢组织。除去卵巢并在生理盐水中保存组织，直到可以用于解剖，并且除掉剩余的子宫组织。纵切穿过卵巢门脐，使卵泡囊分离。一旦所有的卵泡囊都被分离，则从所述卵巢中收获细胞外基质(ECM)。在过滤后的水中漂洗三遍并用滤网给水除菌。通过轻柔按摩溶解细胞。在0.02％胰蛋白酶/0.05％乙二胺四乙酸溶液中，37℃下水浴培养细胞外基质(ECM)1小时然后洗涤。如果需要的话，通过按摩进一步地溶解细胞。用3％Triton X-100溶液中吸收细胞外基质(ECM)并在振荡器上放置1小时。漂清之后，如果需要的话，通过按摩进一步地溶解细胞。然后将切片在4％脱氧胆酸溶液中吸收，并放置在振荡器上1小时。在彻底漂清去掉剩余的表面活性剂以后，所述细胞外基质(ECM)被保存在无菌的/过滤水中直到进一步地使用。这些组织随后用过乙酸处理消毒，并干燥。

将1克冷冻干燥的卵巢细胞外基质(ECM)粉末和100毫克胃蛋白酶混合进入100毫升的0.01M HCl中。在室温下(25℃)持续搅拌溶液48小时。在胃蛋白酶消化之后，消化液分部分储存在-20℃下，直到使用时。

实施例8:脊髓和硬膜细胞外基质(ECM)的制备

使用镊子、剪刀和解剖刀，从猪脊髓中去掉硬膜。用解剖刀刀刃弄碎硬膜内表面除去所有碎片。将脊髓和硬膜处在不同的容器中并用如下相同的方法处理。横切或者纵切脊髓来增加表面积，然后放置在暗盒中。选择性的，在37℃下，用胰蛋白酶-乙二胺四乙酸酶催化处理组织30分钟。在4℃下，在Triton X-100^TM(4-辛苯酚多聚羟乙基酸)溶液中以3％的浓度培养组织2-3天。在6％的Triton X-100^TM溶液中重复这一步骤，然后在9％的Triton X-100^TM溶液中再次重复这一步骤。在4℃下，在卵磷脂或者卵磷脂-脱氧胆酸盐中培养脊髓组织整夜，去掉脂质。硬膜不受该过程的影响。然后在3％的Triton X-100^TM或者1％的SDS中洗涤组织1-2小时在室温下，在磷酸缓冲液中洗涤3次每次15分钟。然后在室温下在DNase I溶液中培养组织1小时。在室温下，在磷酸缓冲液中洗涤组织3次每次15分钟。最后，在室温下，在去离子水中洗涤组织3次每次15分钟。该过程产生胶状的非细胞性脊髓材料，和非细胞性硬膜材料片。

实施例9–脂肪细胞外基质(ECM)的制备

在水中解冻冷冻的脂肪组织并进行人工按摩，加速细胞溶解。将组织放置在包含0.02％胰蛋白酶/0.05％乙二胺四乙酸溶液的烧瓶中并在37℃下培养1小时，然后在蒸馏的去离子水(ddH2O)中简单的漂洗，并再次人工按摩。然后将组织放置在包含3％Triton X-100的烧瓶中，并在室温下放置在轨道振荡器上1小时。在简单水洗之后，将组织放置在4％的脱氧胆酸溶液中，并再次防止在轨道振荡器下在室温中处理1小时。在水中洗涤组织三次，并在4℃下存储整夜。然后在轨道振荡器上用4％乙醇和0.1％过乙酸溶液处理组织2小时，随后在室温下用磷酸盐缓冲盐水(PBS，pH 7.4)洗涤两次并用水洗涤两次，每次15分钟。然后在轨道振荡器上，在室温下用100％正丙醇洗涤所得材料1小时，并在四份ddH2O中洗涤1小时，除去正丙醇，然后进行冷冻干燥。

实施例10–神经-衍生的细胞外基质(ECM)凝胶的制备

在-80℃下存储鼠脊髓组织直到用于细胞外基质(ECM)衍生物加工。解冻材料并除掉脊髓上的影魔，然后纵向将脊髓切成长度大约在1英尺并具有均匀厚度的直柱。4℃下将脊髓块放置在水中整夜，并在去细胞化之前，在120转/分下机械破除天然组织结构。18小时之后，通过使用孔径大约840微米的网孔或者筛网过滤将脊髓块从水中除去。用镊子收集脊髓片，并放入烧瓶中使用0.02％胰蛋白酶/0.05％乙二胺四乙酸溶液进行蛋白酶消化。将消化物在37℃下水浴1小时，同时以120转/分的速度摇动。在一个小时以后，溶解所得溶液并在水流下轻轻的冲洗脊髓组织，按规定梳理。重新将脊髓块放置回烧瓶，用镊子从过滤器中收集尽可能多的小组织块。然后向烧瓶中加入3％的Triton X-100溶液，开始对组织进行去细胞化，将其放置在振荡器中在200转/分下处理1小时。一小时后，将所得组织除菌、漂洗并收集。将组织块放回烧瓶中，然后进行渗透压震荡进行进一步去细胞作用。向烧瓶中加入高渗的1M蔗糖并放置在振荡器上200转/分下处理15分钟。所得组织被除菌、洗涤、收集并与低渗溶液(去离子水)结合，然后放置在振荡器上200转/分处理15分，从而溶解剩余细胞。去细胞的组织被再次除菌、漂洗并灰收入烧瓶中。向烧瓶中加入4％的脱氧胆酸盐溶液并放置在振荡器上200转/分下处理1小时。随后，所述组织块在I型(超高纯)水中被重复除菌并漂洗直到除去所有表面活性剂(气泡)的痕迹。剩余的组织现在富集细胞外基质(ECM)，收集剩余组织并使用过乙酸溶液(由I型水(96％)和100％EtOH醇(4％)组成)和20:1过乙酸溶液消毒，增重细胞外基质(ECM)并在200转/分下晃动2小时。在磷酸盐缓冲盐水(PBS)进行一系列漂洗之后，在-20℃下冷却细胞外基质(ECM)然后进行冷冻干燥，直到全部水都被除去。将冷冻干燥的细胞外基质(ECM)加入包含1.0毫克/毫升胃蛋白酶的0.01N盐酸溶液中来制备凝胶脚手架预凝胶材料，用等渗盐水稀释，根据需要得到浓度在大约1毫克/毫升和200毫克/毫升的细胞外基质(ECM)。

实施例11-从细胞外基质(ECM)中制备凝胶的一般方法

在4℃下将0.1N NaOH(1/10消化液体积)和10X磷酸缓冲液(pH7.4)(1/9消化液体积)以适当的量相混合形成膀胱基质(UBM)。使用冷(4℃)1X PBS pH 7.4将所得溶液调整到理想的体积和浓度，放置在37℃培养器中发生凝胶化反应(图4D)。

如图4所示，在40分钟后细胞外基质(ECM)能够在溶液中形成基质。所述细胞外基质(ECM)衍生的凝胶在温度低于20℃时是液态的，但是当温度升高到37℃时会变成凝胶。

在从细胞外基质(ECM)中制备凝胶时，所有溶液应该被保存在冰上，并且变量具有以下的定义：

C_f＝最终凝胶浓度，单位为mg/ml

C_s＝ECM消化液浓度，单位为mg/ml

V_f＝实验所需最终凝胶溶液体积

V_d＝ECM消化液所需体积，单位毫升

V_10X＝需要的10X PBS的体积，单位毫升

V_1X＝需要的1X PBS的体积，单位毫升

V_NaOH＝需要的0.1N NaOH的体积，单位毫升

首先，确定所需要的ECM凝胶的最终浓度(C_f)和体积(V_f)。然后，计算通过乘式C_f(mg/ml)*V_f(ml)确定需要的ECM的量。所得值会提供需要的ECM消化液的体积(V_d)，其中V_d＝[C_f(mg/ml)*V_f(ml)]/C_s.

将计算的体积V_d除以9来计算需要的10X PBS的体积(V_10X＝V_d/9)。将计算的体积V_d除以10来计算需要的0.1N NaOH的体积(V_NaOH＝V_d/10).计算需要的1X PBS的量，所述1X PBS能够使溶液具有合适的浓度/体积，计算方法如下所示：V_1X＝V_f–V_d–V_10X–V_NaOH。向合适的容器(通常是15或者50毫升的离心管)中加入所有试剂(V_1X+V_d+V_10X+V_NaOH)，所述容器中不含有ECM消化物(V_d)。将所得溶液放置在冰上并一直在冰上保存。

向上述制备的磷酸缓冲液/NaOH混合物中加入适当体积的细胞外基质(ECM)消化液(Vd)，用1毫升微量吸液管混合均匀，同时小心不要在溶液中产生气泡。根据细胞外基质(ECM)消化液的粘度，在转移过程中可能会有一些显著的体积损失。监控总体积并增加适当的量，直到实现最终体积。测量预凝胶液的pH值，其中，pH值应该是在7.4左右。

将预凝胶溶液加入到模具或者适当的小孔中。将所得模具或者小孔放在37℃的培养器中培养至少40分钟。不要使用具有二氧化碳参照的培养器。如果担心水分蒸发的话，将所述模具放置在带拉连锁的塑料袋中然后在放在培养器中。在凝胶化之后，从模具中移出凝胶并放置在1X PBS中。如果凝胶在组织培养皿中制备，则1XPBS可以被放置在凝胶顶部直到用于维持凝胶水合。

样品计算：从10毫克/毫升储备溶液中制备6毫升凝胶，最终浓度为6毫克/毫升。

前提C_s＝10mg/ml；C_f＝6mg/ml； V_f＝6ml

V_d＝[6mg/ml*6ml]/10mg/ml ＝3.600ml

V_10X＝3.6/9 ＝0.400ml

V_NaOH＝3.6/10 ＝0.360ml

V_1X＝6ml–3.6ml–0.400ml–0.360 ＝1.640ml

实施例12-组合物和猪膀胱基质(UBM)形态学

膀胱基质(UBM)和鼠尾1型胶原蛋白(BD生物科学公司)溶液在还原条件下(5％的2-巯基乙醇)，4-20％聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳。用凝胶-密码蓝(Bio-Rad公司)使蛋白显色，用柯达成像站纪录照片。

分别使用羟脯氨酸试验[Reddy GK,et al.“A simplified method for theanalysis of hydroxyproline in biological tissues,(在生物组织中分析羟脯氨酸的简单方法)”(1996)Clin.Biochem.29(3):225-9]和Blyscan^TM试验试剂盒(Biocolor公司，北爱尔兰)确定胶原蛋白和氨基多糖硫酸盐(购自S-GAG)含量(三个样品进行实验)。根据使用说明书进行Blyscan^TM实验。在120℃下通过使用2M的NaOH(100微升总体积)在高压锅中水解样品20分钟确定羟脯氨酸含量。用50微升4M HCl中和样品并与300微升的0.056M氯胺T(光谱)发生反应，轻柔的混合并允许其在室温下氧化25分钟。然后将样品与300微升的1M埃利希醛(光谱)并在65℃下培养20分钟。使用鼠尾I型胶原蛋白(BD生物科学公司)制备标准曲线，并使用此标准曲线计算消化的膀胱基质(UBM)溶液中存在的胶原蛋白的总量。使用SpectraMax分光光度计在550nm下测定吸光度，确定比色变化。

凝胶组合物已经被确定了。胃蛋白酶消化的膀胱基质(UBM)中的胶原蛋白浓度被发现是0.8±0.2毫克每毫克干冷冻干燥的膀胱基质(UBM)粉末(平均值±SD)。总S-GAG含量是5.1±0.9微克每毫克干冷冻干燥的膀胱基质(UBM)粉末(平均值±SD)。电泳的蛋白质显示在膀胱基质(UBM)通路上含有典型的I型胶原蛋白带，还有其他的条带，如图5所示。区别部分由于膀胱基质(UBM)凝胶剂中存在的其他组分(例如，小分子肽和氨基多糖)。

使用扫描电镜(SEM)检验膀胱基质(UBM)凝胶剂的表面形态。将样品固定在冷2.5％戊二醛中，并在磷酸缓冲液中漂洗，随后通过阶梯系列的乙醇(30％-100％)进行脱水工艺，最后在Emscope CPD 750临界点干燥器中进行临界点干燥。将样品固定在铝扫描电镜样品固定架(Electron Microscopy科学有限公司，Hatfield，美国宾夕法尼亚州)上，并用自动喷射涂布机108(Cressington科学仪器公司，巴伦西亚，美国宾夕法尼亚州)将金-钯合金喷射涂布在样品上。最后，用扫描电镜(JEOL 6330F)检验样品。以5,000和10,000倍放大取像。扫描电子显微镜照片显示了膀胱基质(UBM)凝胶剂在浓度为3毫克/毫升和6毫克/毫升(图6A-6D)以及在4毫克/毫升(图7B)时的纤维状外表。

实施例10-猪膀胱基质(UBM)、SIS和LS凝胶的流变性质和凝胶化动力学

在凝胶化期间检定膀胱基质(UBM)衍生的凝胶的流变性质。膀胱基质(UBM)凝胶由温度低于25℃的粘稠溶液和生理学温度(37℃)的凝胶组成。使用这里所描述的类似的方法可以测量其他凝胶的流变性质。同时测量肝基质(LS)和小肠粘膜下层(SIS)的流变性质。

按照之前的描述使用分光光度法确定比浊的凝胶动力学(Gelman RA,et al.,“Collagen fibril formation.Evidence for a multistep process,”(1979)J.Biol.Chem.254(1):180-6).最终，适当浓度的预凝胶溶液在4℃下保存，并转移到冷96孔板上，每孔100微升，一式三份。SpectraMax分光光度计(Molecular Devices公司)被预先加热到37℃，将平皿放置于分光光度计中，在405纳米下测定每个孔板的浊度，每两分钟测定一次进行1.5小时(图8A)。还可以在530纳米处测量浊度(图9)。记录吸光度值并如图8B所示规范化。达到50％最大浊度测量值(例如，最大吸光光度值)所需的时间被定义为t_1/2，且通过外延曲线的线性增长计算Lag相(t_lag)根据比浊测量值，如图8B所示计算曲线生长部分的斜率确定凝胶化速度(s)。

动态振动测量通常被用于凝胶化的机理研究以及用于凝胶粘弹性质定性中。将样品与摆动菌株接触：

γ(t)＝γ₀cos(2πft) (1)

其中，γ₀是正弦菌株的量，t是时间，f是频率。样品产生的正弦力如下所述：

σ(t)＝|G^*|γ(t) (2)

其中，G*是样品的频率依赖型复合模量。G*的实数部分，写作G′，与使用的菌株在一个相中，并且由于其对应于样品弹性形变过程中存储的机械能而被叫做存储模量。G*的虚数部分，写作G″，与使用的菌株相成90°，并且由于其对应于样品内因粘性消散造成的能量损失而被叫做损失模量。由于样品被期望发展成固体状特点，如进行的凝胶化作用，因此期望G′能够显著增长。

所关心的最终性质是复合粘度的数值，如下定义：

其中，|η^*|是频率依赖型复合粘度，G^*是频率依赖型复合模量，并且f是频率。通常，相对于频率数据将复合粘度拟合成幂率分布，形成：

|η^*|＝k fⁿ (4)

其中，k和n都是常数。

使用TA测试仪AR2000应力-控制流变仪进行流变学实验，使用40毫米直径的平行平板几何结构和Peltier细胞维持样品温度。按照之前的描述制备样品并装入流变仪中，所述流变仪中含有温度维持在15℃的Peltier细胞。在样品边缘使用矿物油避免蒸发。首先通过对样品施加恒定的1帕压力，并在15℃下持续1分钟来测定样品粘度。然后将温度设定到37℃，产生凝胶化作用。通常Peltier细胞在10秒内温度能够达到30℃，在50秒内温度能够达到37℃。在温度增加过程中以及随后的凝胶化过程中，以固定的频率0.159赫兹(rad/s)和5％的菌株持续监测样品的振动模量。当弹性模量(G')不再随时间发生进一步的变化时，认为完成凝胶化作用。通过在37℃下和5％的菌株中进行扫频，扫频范围在15.9赫兹和0.08赫兹之间，来调节凝胶的最终线性粘稠弹性性质。

图8显示了比浊凝胶动力学和计算参数，结果显示在表1中。膀胱基质(UBM)和I型胶原蛋白凝胶的比浊凝胶动力学形成S形状(图8A)。在凝胶化之后，浓度为3毫克/毫升的I型胶原蛋白凝胶比3毫克/毫升和6毫克/毫升的膀胱基质(UBM)凝胶变得更浑浊(图8A)。膀胱基质(UBM)凝胶(浓度为3和6毫克/毫升时)的lag相(t_lag)和达到最终浊度的一半所需要的时间(t_1/2)比I型胶原蛋白(3毫克/毫升)的大。另外，与I型胶原蛋白相比，膀胱基质(UBM)的比浊凝胶化动力学(S)的速度较低。在膀胱基质(UBM)凝胶中，当浓度发生改变时，t_lag、t_1/2和S不发生变化，但是当达到最大浊度时，则发生变化。

1毫克/毫升的小肠粘膜下层(SIS)凝胶的比浊动力学也形成S形(图9)。而膀胱基质(UBM)测量值在405纳米下获得，小肠粘膜下层(SIS)测量值在530纳米处获得。小肠粘膜下层(SIS)测量值还显示在达到最大浊度前，浊度下降。

在样品的温度从15℃升高到37℃后，膀胱基质(UBM)凝胶的储存模量(G′)和损失模量(G″)都随时间变化呈S型(图10)。G′和G″在大约8分钟之后达到稳定状态，说明发生凝胶化作用。G′和G″的动力学比比浊动力学更快。图12显示了在0.08-15赫兹的膀胱基质(UBM)和I型胶原蛋白的粘度，结果总结在表1中。

在样品的温度升高到37℃后，LS和SIS凝胶的储存模量(G′)也随时间变化呈S型(图11A)。LS和SIS凝胶的G′动力学比膀胱基质(UBM)凝胶的G′动力学更快。LS、SIS和膀胱基质(UBM)凝胶的储存模量(G′)也可以被测量为角频率的函数(图11B)。

表1:结果来自膀胱基质(UBM)凝胶化动力学的浊度分析。数据表示为平均值±标准差。使用三个样品进行实验(n＝3).

^*p<0.05

在努力探索将膀胱基质(UBM)用作可注射材料可能性的工作中，进行了多次试验在注射设定中检验他们。悬浮在盐水中的细胞外基质(ECM)粉末和膀胱基质(UBM)凝胶剂一起被检验，观察他们是否可以成功的穿过经常被用于医学过程的注射针，例如声带扩张器。这些针长度为1厘米，口径为25规格，说明里面附着着25厘米长，16规格的针状轴。膀胱基质(UBM)凝胶可以容易地并且连续的穿过这些针。膀胱基质(UBM)粉末悬浮液的浓度上限为10毫克/毫升，在此上限之上，针会时常阻塞，从而难以确定传递的细胞外基质(ECM)的实际量。该实验显示膀胱基质(UBM)凝胶有可能用作可注射的材料(表2)。

表2:膀胱基质(UBM)凝胶和市场上可买到的可注射材料的粘度比较

^a Chan RW,et al.Viscosities of implantable biomaterials in vocal foldaugmentation surgery.Laryngoscope.1998May；108(5):725-31.

^b Klemuk SA,et al.Viscoelastic properties of three vocal-foldinjectable biomaterials at low audio frequencies.Laryngoscope.2004 Sep；114(9):1597-603.

实施例14-杂合无机/细胞外基质(ECM)脚手架

在四肢截肢以及用义肢置换之后连接动力学的恢复是受到限制的，这是由于不能将存在的肌肉系统与义肢通过腱的骨间插入相附着(Higuera,C.A.,et al.,J OrthopRes.1091-9(23)2005).虽然有很多多孔钛和钽合金已经成功的促进了骨骼的内向生长，但是目前没有替换手段来促进纤维软骨组织的内向生长，二纤维软骨组织修复韧带或者腱的插入位点。最近，多孔钽脚手架已经被研究测定其促进血管化的纤维组织向内生长的能力，并使所述纤维组织具有约定的机械强度(Hacking,S.A.,et al.:J Biomed Mater Res,631-8(52)2000)。从猪小肠和膀胱(UBM)中自然衍生的细胞外基质(ECM)脚手架也已经显示形成结构稳定的腱、韧带、软骨和骨骼以及强壮的、具有很好机械强度的骨间插入位点(Badylak,S.F.:Transpl Immunol.367-77(12)2004；Dejardin,L.M.,et al.:AJSM.175-84(29)2001)。可以合理预计在其小孔中装入细胞外基质(ECM)的多孔钽或者钛脚手架可以改善软组织的向内生长，长入金属表面并促进纤维软骨组织的形成。目前研究的目标是确定使用细胞外基质(ECM)凝胶包覆多孔的钛脚手架的可能性，确定是否适合最终的韧带或者腱插入修复。

按照之前的描述制备膀胱基质(UBM)粉末(Freytes,DO et al,Biomaterials,2004.25(12):2353-61)。室温下，将1克冷冻干燥的膀胱基质(UBM)粉末与在100毫升0.01MHCl中的100毫克的胃蛋白酶相混合，持续搅拌大约48小时，制备膀胱基质(UBM)凝胶消化物。37℃下使用磷酸缓冲液将pH和离子强度调整到生理学范围，引发膀胱基质(UBM)凝胶聚合作用。凝胶在30分钟内进行完全聚合作用。用丙酮、甲醇、水清洁多孔金属脚手架，并用20-45％的硝酸钝化。

测量膀胱基质(UBM)凝胶消化物(在[10毫克/毫升]之前和生理活化作用[6毫克/毫升]之后)和CP Ti片或者Ti 6Al 4V片之间的接触角。向每个表面加入1毫升的消化物并照数字照片用于随后确定角度。

两个方法测试促进聚合的膀胱基质(UBM)凝胶穿入CP钛纤维网孔或者CP钛烧结的小珠的能力。每个多孔金属脚手架的全部表面都被活化的膀胱基质(UBM)凝胶覆盖五分钟。对于一般的脚手架来说，凝胶能在静态条件下穿过，而另一半样品需要使用超声处理才能发生穿透作用。加入染料从而观察凝胶。

为了确定多孔钛脚手架中存在膀胱基质(UBM)凝胶，以及为了更好地理解膀胱基质(UBM)凝胶和所述金属之间的相互作用，制备用于环境扫描电子显微镜法(ESEM)的样品。由于当在水合状态下保持静止时，样品可以用环境扫描电子显微镜法(ESEM)目测，钛脚手架和膀胱基质(UBM)凝胶之间的相互作用能够在不脱水分裂细胞外基质(ECM)的情况下被确定。

膀胱基质(UBM)凝胶消化物和活化的膀胱基质(UBM)凝胶润湿CP Ti和Ti 6Al 4V孔表面(表4)。因此，多孔金属将不会排斥细胞外基质(ECM)。根据这些结果，随后的实验集中在活化的凝胶上。在静态条件下膀胱基质(UBM)凝胶能够穿过每个多孔金属脚手架厚度的一半。在加入超声处理之后，小孔可以渗入脚手架的整个厚度(图13A和13B)。用环境扫描电子显微镜法(ESEM)检验杂合脚手架，显示在多孔肽内很好的穿透，并很好的包覆所述多孔钛(图14A-14D)。

使用膀胱基质(UBM)凝胶和多孔钛脚手架制备一种杂合的细胞外基质(ECM)/多孔金属脚手架是可能的。未来的研究会评价这些脚手架是否可以支持细胞体外生长并促进结缔组织在体内的内向生长。这些努力的最终目标是开发一种脚手架，它能够促进软组织向内生长进入金属中并用作韧带和腱的插入位点。

表4:膀胱基质(UBM)材料在钛合金上的接触角(平均值±SD)

实施例15-预消化的细胞外基质(ECM)材料的消毒.

已经注意到，细胞外基质(ECM)脚手架的最终消毒能够抑制随后的水凝胶形成蛋白酶-溶解的细胞外基质(ECM)材料。下面解释了消毒对定性水凝胶形成的作用，使用没有渗析的皮肤细胞外基质(ECM)(也就是说，如上所述完整的细胞外基质(ECM))。如上所述使猪皮肤去细胞，并且使用多种方法进行最终消毒。通过暴露于(1)用量为10kGy、25kGy和40kGy的γ射线、(2)用量为10kGy、25kGy和40kGy的电子束辐射，和(3)剂量为750毫克/小时的环氧乙烷(EtO)气体，进行16小时。参照皮肤细胞外基质(ECM)片不消毒。然后在带有60网筛的Wiley碾压器上机械粉碎消毒的和参照的皮肤细胞外基质(ECM)，在4℃下用在0.01NHCl中的1毫克/毫升胃蛋白酶进行酶消化48小时产生预凝胶，并在室温下(20-25℃)，通过将pH值中和到大约7.4来检验水凝胶的形成，然后在不包括二氧化碳的培养器中升高温度到37℃。图15显示最终消毒的皮肤细胞外基质(ECM)不能形成水凝胶，无论使用什么消毒方法，而未消毒的皮肤细胞外基质(ECM)形成固体凝胶，并且在除去金属环模型后仍然能够维持。

实施例16-冷冻干燥产品的消毒

由于在预-消化的去细胞化的细胞外基质(ECM)材料进行最终消毒之后不能形成水凝胶，并且已经认识到消毒的临床/商业需要，我们假设消毒前材料形式的改变能够使细胞外基质(ECM)凝胶化。不使用冷冻干燥的固体细胞外基质(ECM)片，我们对从未渗析(如上所述完整的细胞外基质(ECM))中制备的冷冻干燥的预凝胶进行消毒，机械粉碎经过酶消化(基本上如上所述)的细胞外基质(ECM)，并检测是否形成水凝胶。根据标准方案，不包括渗析，对来源于小肠粘膜下层的细胞外基质(SIS-ECM)进行脱细胞作用。小肠粘膜下层(SIS)-细胞外基质(ECM)粉末使用上述同样的方法进行酶消化，在-80℃下在干冰上冷冻，并冷冻干燥。然后通过暴露于环氧乙烷气体(用量为750毫克/小时，进行16小时)对冷冻干燥的预凝胶消毒，和/或在去离子水或者0.01N HCl中重组(图16A-16D)。图16A-16D显示在室温下，在消毒之前使用水可完全重组，但是在消毒后(图16D)只有在去离子水中的预凝胶是完全重组的。

由于只有在去离子水中的预凝胶实现了完全重组，使用这些样品检验水凝胶的形成。图17显示，当中和后被放入不含有二氧化碳的培养器中时，未消毒的和环氧乙烷消毒的预凝胶会产生固体凝胶，在除去金属环模具之后仍维持凝胶形式。

为了巩固图17的结果，根据标准方案对来源于膀胱的细胞外基质(UBM)进行去细胞化，并使用上面对小肠粘膜下层(SIS)-细胞外基质(ECM)所使用的相同的方法进行实验。相似的结果说明冷冻干燥的预凝胶的消毒会增进水凝胶的形成(图18)。

实施例17-冷冻干燥产品的消毒-进一步研究

展开上述实施例的工作，基本上按照上述制备的细胞外基质(ECM)材料被以不同的形式消毒，如下所示：未被消化的细胞外基质(ECM)材料，粉末形式或者二位片状形式；未被消化的水合的粉末或者二维片状细胞外基质(ECM)材料；酸性蛋白酶消化的但是没有被中和的预凝胶溶液；和/或消化的但没有被中和的冷冻干燥预凝胶。对各种来源的细胞外基质(ECM)材料进行实验，包括膀胱、脾、肝、心脏、胰腺、卵巢、小肠、中枢神经系统(CNS)、脂肪组织和/或骨骼。

用环氧乙烷、γ射线(2kGy、30kGy，在室温和-80℃下)、电子束辐射(2kGy、30kGy，在室温和-80℃下)、和/或超临界二氧化碳(高和/或低)。同时运行未灭菌的参照物。

实施例18–经历各种消毒方法的脱细胞的膀胱基质(UBM)

根据标准方案对膀胱基质去细胞化并进行各种消毒方法。在对(1)膀胱基质(UBM)片、(2)机械粉碎的膀胱基质(UBM)粉末、和(3)在消化和冷冻干燥之后进行消毒，随后检验水凝胶的形成。每种凝胶在环形模具中形成并成像(图19A)。用冷冻干燥的消化物所形成的刚性最强的水凝胶检测凝胶形成作用，随后进行粉末形式的，最后显示为储存模量值(参见图19B)。膀胱基质(UBM)片的消毒不允许随后形成水凝胶。每种消毒方法都会影响水凝胶的形成，但是这个影响可以通过开始形成细胞外基质(ECM)材料而减轻，通过将scCO2和EtO冷冻干燥的消化物与粉末形式的储存模量相比较可以清楚的证明这一结论。有趣的是，未消毒的参照样品在水凝胶形成方面也显示了明显的差异，冷冻干燥的消化物形成更具刚性的凝胶。定性的说，冷冻干燥的消化物形成最具刚性的水凝胶，随后的粉末形式，而膀胱基质(UBM)片的消毒使随后的水凝胶形成变得不可能。这些凝胶刚性的流变性表征(即，储存模量或者G’)进一步确证凝胶刚性的定性趋势。这些图一起强调了经过消毒的细胞外基质(ECM)形式(即，片型、粉末或者消化物)的重要性。

本发明已经根据一些实施例进行了描述，所述实施例只是起说明作用，而不是以任何形式作为限制。因此，本发明能够在具体实施过程中有许多变化，这些变化可以是本发明所属领域技术人员通过这里所包含的描述衍生的内容，并且之前的描述不会起到局限作用，本发明应当被解释为与下述权利要求书的范围一样宽。

Claims

1.一种制备能够凝胶化的最终消毒的细胞外基质消化物的方法，包括：(i)通过使用在酸性溶液中的酸性蛋白酶消化溶解未经透析的或者未经交联加工的细胞外基质(ECM)，产生消化液，(ii)干燥所述消化液来产生干燥消化物，和(iii)对干燥消化物进行最终消毒从而产生最终消毒的干燥消化物，其中所述细胞外基质(ECM)在溶解步骤之前不是最终消毒的。

2.根据权利要求1所述的方法，进一步地包括(iv)水合所述消毒的干燥消化物，产生消毒的消化液，(v)将所述消化液的pH值提高到7.2-7.8之间，产生中和的消化液，和(vi)在温度大于25℃时使所述中和的消化液成胶，从而产生凝胶。

3.根据权利要求1所述的方法，进一步地包括(iv)水合并中和所述消毒的干燥消化物，使其pH值提高到7.2-7.8之间，产生中和的消化液，和(v)在温度大于25℃时使所述中和的消化液成胶，从而产生凝胶。

4.根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，其中所述消化液是冷冻干燥的。

5.根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，其中使用γ射线、电子束辐射、环氧乙烷和/或超临界的二氧化碳对干燥的消化物进行消毒。

6.根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，其中所述细胞外基质(ECM)来源于哺乳动物组织。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述哺乳动物组织来源于膀胱、脾、肝、心脏、中枢神经系统、脂肪组织、骨骼、胰腺、卵巢，或者肠的其中之一。

8.根据权利要求6所述的方法，其中所述哺乳动物组织来源于猪、母牛、猴子，或者人。

9.根据权利要求6所述的方法，其中所述哺乳动物组织来源于肠。

10.根据权利要求9所述的方法，其中哺乳动物组织来源于大肠或者结肠。

11.根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，其中所述细胞外基质(ECM)包括上皮细胞的基膜和猪膀胱的固有膜。

12.根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，其中所述细胞外基质(ECM)是粉碎的。

13.根据权利要求2或者3所述的方法，其中，在凝胶化之前，所述消化液被维持在25℃或者低于25℃。

14.根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，其中所述酸性蛋白酶是胃蛋白酶。

15.根据权利要求1所述的方法，其中，所述细胞外基质(ECM)在pH为2或者更高的情况下溶解。

16.根据权利要求1所述的方法，其中，所述细胞外基质(ECM)在pH在3到4之间时溶解。

17.根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，其中所述酸性溶液包括0.01M HCl。

18.根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，其中所述酸性蛋白酶是胰蛋白酶。

19.根据权利要求2或者3所述的方法，其中，中和所述消化液包括加入碱或者等渗溶液。

20.根据权利要求19所述的方法，其中，所述碱或者等渗溶液是NaOH或者磷酸盐缓冲盐水(PBS)。

21.根据权利要求2或3所述的方法，其中所述中和的消化液在pH为7.4的情况下成胶。

22.根据权利要求2或3所述的方法，其中所述中和的消化液在30℃或者更高的温度下成胶。

23.根据权利要求22所述的方法，其中所述中和的消化液在37℃下成胶。

24.根据权利要求2或3所述的方法，进一步包括向凝胶中整合一个或多个细胞、药物、细胞因子和生长因子。

25.根据权利要求24所述的方法，其中向所述中和的消化液中整合细胞、药物、细胞因子和生长因子中的一个或多个。

26.根据权利要求2或3所述的方法，进一步包括用细胞接种凝胶。

27.根据权利要求2或3所述的方法，进一步包括在中和期间或者中和之后，向中和的消化液中加入细胞。

28.根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，进一步地包括用溶解的细胞外基质(ECM)包覆生物相容性支架基质，并使该基质成胶。

29.根据权利要求1-28中任意一项所述的方法制备的组合物。

30.一种制备杂合细胞外基质支架的方法，包括：(i)通过使用在酸性溶液中的酸性蛋白酶消化溶解未经透析的或者未经交联加工的细胞外基质(ECM)，产生消化液，(ii)干燥所述消化液从而产生干燥消化物，和(iii)对干燥消化物进行最终消毒，从而产生最终消毒的干燥消化物，其中所述细胞外基质(ECM)在溶解步骤之前不是最终消毒的，(iv)水合所述消化液产生消毒的消化液，(v)将所述消化液的pH值升高到7.2-7.8之间，产生中和的消化液，和(vi)在温度大于25℃时对所述中和的消化液成胶，从而产生凝胶，其中，生物相容性支架或者被处在溶解细胞外基质(ECM)步骤和干燥消化液步骤之间的消化液所包覆，或者被水合消化液步骤之后、中和的消化液成胶步骤之前的消毒的消化液或者中和的消化液所包覆。

31.根据权利要求30所述的方法，其中，所述生物相容性支架被处于溶解细胞外基质(ECM)步骤和干燥消化液步骤之间的消化液所包覆。

32.根据权利要求30所述的方法，其中所述生物相容性支架被水合消化液步骤之后、中和的消化液成胶步骤之前的消毒的消化液或者中和的消化液所包覆。

33.根据权利要求30所述的方法，其中所述生物相容性支架包括钴铬合金，不锈钢，钛，钽，和/或钛合金中的一种或者多种，其中选择性地包括非金属和金属成份。

34.根据权利要求30所述的方法，其中所述生物相容性支架包括工业纯钛。

35.根据权利要求30所述的方法，其中所述生物相容性支架包括钛合金，钛合金包括钼、钽、铌、锆、铁、锰、铬、钴、镍、铝和镧中的一个或多个。

36.根据权利要求30所述的方法，其中所述生物相容性支架包括一种合金，所述合金包括Ti、铝，和钒。

37.根据权利要求36所述的方法，其中，所述合金包括90％重量的Ti、6％重量的铝和4％重量的钒。

38.根据权利要求30所述的方法，其中所述生物相容性支架包括丝状体或者融合的小珠。

39.根据权利要求30所述的方法，其中所述生物相容性支架包括一种无机矿，所述无机矿包括钙。

40.根据权利要求30所述的方法，其中所述生物相容性支架包括一种矿物质，所述矿物质包括Ca、P和O。

41.根据权利要求40所述的方法，其中所述矿物质是磷灰石。

42.根据权利要求30所述的方法，其中所述生物相容性支架包括陶瓷材料。

43.根据权利要求30所述的方法，其中所述生物相容性支架包括聚合物。

44.包括根据权利要求30-43中任意一项所述的方法制备的杂合细胞外基质支架的生物相容性装置。

45.根据权利要求44所述的生物相容性装置，其中，所述装置是义肢。

46.根据权利要求45所述的生物相容性装置，其中所述义肢是手、手臂、脚或者腿中的一个。

47.根据权利要求44所述的生物相容性装置，其中，所述装置是股骨移植物。