ES2213835T3 - Injerto de tejidos intestinales submucosales para la reparacion de tejidos neurologicos. - Google Patents

Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A CONSTRUCCIONES DE INJERTOS DE TEJIDO UTILES PARA ESTIMULAR EL CRECIMIENTO Y LA CICATRIZACION DE ESTRUCTURAS DE TEJIDO DE TIPO NEUROLOGICO DETERIORADAS O ENFERMAS. MAS PARTICULARMENTE LA INVENCION SE DIRIGE A UNA CONSTRUCCION DE INJERTO DE TEJIDO DE SUBMUCOSA Y A UN PROCEDIMIENTO PARA INDUCIR LA FORMACION DE ESTRUCTURAS NEUROLOGICAS ENDOGENAS EN UNA ZONA CON NECESIDAD DE TEJIDO NEUROLOGICO ENDOGENO.

Description

Injerto de tejidos intestinales submucosales para la reparación de tejidos neurológicos.

Sector de la invención

La presente invención se refiere a construcciones de injerto de tejido útiles para la estimulación de la regeneración y curación de estructuras de tejidos neurológicos dañados o enfermos. De manera más particular, la presente invención se refiere a un método para la inducción de la formación de estructuras neurológicas endógenas en un sitio con necesidad de crecimiento de tejido neurológico endógeno mediante el contacto de dicho sitio con una construcción injertada de tejido submucoso.

Antecedentes y descripción de la invención

Frecuentemente, el neurocirujano debe enfrentarse a la necesidad de llevar a cabo la reparación de defectos durales debidos a traumatismos, resección tumoral, y procedimientos decompresivos. Numerosos materiales han sido investigados para la utilización en actividades de reparación de la materia dural o duramadre y de los tejidos que se encuentran debajo de la misma. Las opciones existentes en la actualidad incluyen los materiales autólogos o pertenecientes al mismo organismo receptor autólogo (por ejemplo, pericráneo, fascia temporal, y fascia lata tensora), materiales cadavéricos liofilizados (por ejemplo, duramadre y fascia lata tensora) y materiales sintéticos (por ejemplo, elementos laminares Silastic, elementos laminares Dacron, mallas Vicryl); sin embargo, cada uno de estos materiales se encuentra asociado con limitaciones significativas.

Un objetivo de la presente invención es dar a conocer un material biodegradable que pueda servir como un substituto dural.

Numerosos individuos sufren lesiones en su sistema nervioso central que dejan a dicho individuo paralizado de manera parcial o producen la reducción de la función motora. En la actualidad, no existen estrategias de reparación ni materiales de injerto para llevar a cabo la reparación de los daños producidos en el sistema nervioso central. De manera particular, las fibras nerviosas dentro del cerebro y de la médula espinal, que difieren estructuralmente de los nervios periféricos, no se regenerarán después de haber sido dañados, aplastados o comprimidos. Por ejemplo, no existe en la actualidad un tratamiento conocido para seres humanos que estimule la regeneración funcional a lo largo de un corte completo en sección transversal de la médula espinal o un nervio óptico dañado.

Un objetivo adicional de la presente invención es dar a conocer una composición y un método que estimule la producción de células endógenas del sistema nervioso central, permitiendo de este modo la reparación de los daños producidos tanto en los tejidos del sistema nervioso central como en los tejidos nerviosos periféricos.

Se conoce que las composiciones que comprenden la túnica submucosa delaminada a partir de la túnica muscular y como mínimo la parte luminal de la túnica mucosa del intestino de los vertebrados de sangre caliente pueden ser utilizadas como materiales de injerto de tejido. Ver, por ejemplo, las patentes U.S.A. Nº 4.902.508 y 5.281.422. Las composiciones descritas en dichas patentes se caracterizan por propiedades mecánicas excelentes, incluyendo alta elasticidad, un alto punto de presión de derrame o rotura, y un índice de porosidad efectivo que permitieron la utilización de dichas composiciones de forma beneficiosa para las construcciones de injerto vasculares y en aplicaciones de reemplazo del tejido conectivo. Cuando son utilizados en dichas aplicaciones, las construcciones de injerto de la submucosa parecen servir como una matriz para la regeneración de los tejidos reemplazados por las construcciones de injerto. Además, como ha sido descrito en la patente U.S.A. Nº 5.275.826, las formas fluidizadas de los tejidos de la submucosa de los vertebrados también pueden ser utilizadas como injerto de tejido que puede ser inyectado o implantado sin pérdida de propiedades biotrópicas. También, de manera significativa, en 600 implantes cruzados entre especies, las composiciones de injerto de derivados de la submucosa no han mostrado en ningún caso la elucidación de una reacción de rechazo al injerto de tejido.

Los solicitantes de la presente invención han descubierto que el tejido submucoso induce el crecimiento y la proliferación de los tejidos de tipo neurológico, incluyendo la duramadre y las células nerviosas de los sistemas nervioso central y periférico. De acuerdo con ello, la presente invención está dirigida a la utilización de tejido submucoso como una construcción de injerto para la estimulación de la reparación de tejidos de tipo neurológico dañados o enfermos.

Descripción detallada de las realizaciones preferentes

Ha sido encontrado que las construcciones de tejido submucoso de la presente invención estimulan o inducen el crecimiento de tejidos de tipo neurológico. De acuerdo con la presente invención, el término "tejidos de tipo neurológico" incluye neuronas y células gliales, y tejido de la duramadre, tejido aracnoide y tejido de la piamadre. De acuerdo con la presente invención, se da a conocer un método para la utilización de composiciones que comprenden tejido submucoso de vertebrados de sangre caliente para llevar a cabo la reparación o mejorar la reparación de tejidos de tipo neurológico dañados o enfermos en un vertebrado de sangre caliente. Dicho método comprende la etapa en la que se pone en contacto el sitio que necesita ser reparado con una composición que comprende tejido submucoso.

El tejido submucoso adecuado para la utilización de acuerdo con la presente invención comprende matrices de colágeno natural que incluyen colágenos altamente conservados, glicoproteínas, proteoglicanos, y glicosaminoglicanos en sus configuraciones y concentraciones naturales. Una fuente de tejido submucoso es el tejido intestinal de los vertebrados de sangre caliente. El tejido del intestino delgado es una fuente preferente de tejido submucoso para la utilización en la presente invención.

El tejido submucoso para la utilización en la presente invención se deriva de numerosas fuentes de vertebrados de sangre caliente, incluyendo tejido intestinal cultivado a partir de animales criados para la producción de carne, tal como porcinos, ganado vacuno y ovejas u otros vertebrados de sangre caliente. Dicho tejido puede ser utilizado en su configuración natural o en una forma triturada o parcialmente fluidizada digerida enzimáticamente. El tejido submucoso de los vertebrados es un abundante subproducto de las operaciones de producción comercial de carnes, y resulta en consecuencia un material de injerto de bajo costo, de manera especial en el caso que el tejido submucoso es utilizado en su configuración nativa de láminas en capas o estratificadas.

El tejido submucoso intestinal adecuado comprende de manera típica como mínimo la túnica submucosa delaminada a partir de la túnica muscular y como mínimo la parte luminal de la túnica mucosa. En una realización de la presente invención, el tejido intestinal submucoso comprende la túnica submucosa y las partes basilares de la túnica mucosa incluyendo la mucosa muscular laminar y el stratum compactum. Es sabido que dichas capas varían de espesor y en su definición dependiendo de la especie vertebrada fuente.

La preparación del tejido submucoso para la utilización de acuerdo con la presente invención se encuentra descrita en la patente U.S.A. Nº 3.902.508. Un segmento de intestino de vertebrado, de manera preferente cultivado a partir de especies porcina, ovina o bovina pero sin excluir otras especies, es sometido a la abrasión utilizando un movimiento de limpieza longitudinal para eliminar las capas exteriores, que comprenden tejidos musculares lisos, y la capa más interior, es decir, la parte luminal de la túnica mucosa. El tejido submucoso es aclarado con solución salina y de manera opcional es esterilizado; puede ser almacenado en un estado hidratado o deshidratado. El tejido submucoso liofilizado o secado por aire puede ser hidratado nuevamente y utilizado de acuerdo con la presente invención sin una pérdida significativa de sus propiedades biotrópicas y mecánicas.

El tejido submucoso preparado a partir de órganos de vertebrados de sangre caliente tiene de manera típica una superficie abluminal y una superficie luminal. La superficie luminal es la superficie submucosa que se encuentra enfrentada al lumen o cavidad del órgano fuente y de manera típica es adyacente a una capa mucosa interior en el órgano fuente, mientras que la superficie abluminal es la superficie submucosa que se encuentra orientada en la dirección contraria al lumen del órgano fuente y de manera típica se encuentra en contacto con tejido muscular liso en el órgano fuente.

Las composiciones de injerto de tejido submucoso de la presente invención pueden ser acondicionadas de forma previa mediante el estiramiento del material en una dirección lateral o longitudinal, tal como se describe en la patente U.S.A. Nº 5.275.826. Varias tiras/fragmentos de tejido submucoso también pueden ser fusionados de manera conjunta para conformar una construcción de tejido submucoso unitario con capas múltiples que tiene un área de superficie mayor que las tiras/fragmentos individuales de tejido submucoso. El proceso de formación de las construcciones de tejido submucoso con capas múltiples de área extensa es descrito en la solicitud de patente U.S.A. 08/418.515. En resumen, el proceso de formación de elementos laminares con áreas de superficie de gran tamaño de tejido submucoso comprende como mínimo la superposición de una parte de una tira de tejido submucoso con una parte como mínimo de otra tira de tejido submucoso y la aplicación de una presión como mínimo a dichas partes superpuestas bajo condiciones que permitan la deshidratación del tejido submucoso. Bajo las condiciones mencionadas, las partes superpuestas se "fusionarán" para conformar un elemento laminar unitario de tejido de gran tamaño.

Las construcciones de injerto de áreas de superficie de gran tamaño consisten de manera esencial en tejido submucoso, libre de adhesivos y tratamientos químicos previos potencialmente comprometedores, y tienen un área de superficie de mayor tamaño y una resistencia mecánica mayor que las tiras individuales utilizadas para conformar la construcción de injerto. Las construcciones de submucosa de capas múltiples puede ser perforadas de manera opcional tal como se describe en la patente U.S.A. Nº 5.711.969. Las perforaciones de la construcción de tejido submucoso permiten que los fluidos extracelulares atraviesen el material de injerto de tejido, disminuyendo la retención de fluidos dentro del injerto y mejorando las propiedades de remodelado de los injertos de tejido. La perforación del tejido submucoso resulta beneficioso de manera especial para las construcciones de injerto de tejido de láminas múltiples en las cuales las mencionadas perforaciones mejoran además la fuerza adhesiva entre las capas adyacentes.

El tejido submucoso especificado para la utilización de acuerdo con la presente invención puede encontrarse también en una forma fluidizada. El tejido submucoso puede ser fluidizado mediante la trituración del tejido y sometiendo de manera opcional dicho tejido a una digestión enzimática para conformar de manera substancial una solución homogénea. La preparación de formas fluidizadas de tejido submucoso es descrita en la patente U.S.A. Nº 5.275.826, cuyo descubrimiento se encuentra incorporado expresamente en el presente documento a modo de referencia. Las formas fluidizadas de tejido submucoso son preparadas mediante la trituración del tejido submucoso por desgarro, corte, molido o cizalladura del tejido submucoso cultivado. En consecuencia, los fragmentos de tejido submucoso pueden ser triturados mediante cizalladura en una máquina mezcladora de gran velocidad, o mediante el molido de la submucosa en un estado congelado o deshidratado por congelamiento para llevar a cabo la producción de un polvo que puede ser hidratado posteriormente con agua o una solución salina tamponada para conformar un fluido submucoso de consistencia líquida, consistencia de gel o consistencia de pasta. La formulación de la submucosa fluidizada puede ser tratada de manera adicional con enzimas, tal como la proteasa, incluyendo la tripsina y la pepsina con un pH ácido, durante un período de tiempo suficiente para producir la disolución de todos los componentes del tejido submucoso o la mayor parte de los mismos y puede ser filtrada de forma opcional para proporcionar una solución homogénea de submucosa parcialmente disuelta.

Las composiciones de injerto de la presente invención pueden ser esterilizadas utilizando técnicas de desinfección/esterilización de tipo convencional, incluyendo el curtido con glutaraldehido, el curtido con formaldehído en pH ácido, el tratamiento con óxido de propileno, el tratamiento con óxido de etileno, la esterilización con gas plasma, radiación gamma o tratamiento por bombardeo de electrones, y desinfección con ácido peracético (PAA). Resultan preferentes las técnicas de esterilización que no tienen un efecto adverso sobre la resistencia mecánica, la estructura y las propiedades biotrópicas del tejido submucoso. Por ejemplo, la radiación gamma fuerte puede producir la pérdida de resistencia de las láminas de tejido submucoso. Las técnicas de esterilización preferentes incluyen la exposición del injerto a ácido peracético, irradiación gamma de 1 - 4 Mrads (de manera más preferente 1 - 2,5 Mrads de irradiación gamma) o esterilización con gas plasma. De manera típica, el tejido submucoso es sometido a dos o más procesos de esterilización. Después que el tejido submucoso es tratado en una etapa de desinfección inicial, por ejemplo mediante un tratamiento con ácido peracético, el tejido puede ser envuelto en un plástico o funda laminar y esterilizado nuevamente utilizando técnicas de esterilización de irradiación con haz de electrones o radiación gamma.

De acuerdo con una realización de la presente invención, el tejido submucoso es utilizado como una construcción de injerto de tejido para la sustitución o reparación de tejidos de tipo neurológico dañados o enfermos. En particular se ha hallado que las presentes construcciones de tejido submucoso estimulan el crecimiento y proliferación de las neuronas. En consecuencia, las presentes composiciones pueden ser utilizadas en un método para la reparación de tejidos de tipo neurológico dañados o enfermos en un vertebrado de sangre caliente.

La construcción de tejido submucoso utilizada de acuerdo con la presente invención comprende tejido submucoso intestinal delaminado a partir de la túnica muscular y como mínimo la parte luminal de la túnica mucosa del intestino de vertebrados de sangre caliente, o una digestión de los mismos. La construcción puede ser combinada con un factor de crecimiento añadido tal como un factor de crecimiento endotelial vascular, un factor de crecimiento nervioso o un factor de crecimiento fibroblástico o un factor de crecimiento conteniendo extractos de tejido submucoso. De manera alternativa, la construcción de injerto de tejido puede comprender tejido submucoso en combinación con tejido neuronal periférico y de manera opcional factores de crecimiento añadidos.

En una realización de la presente invención, las formas sólidas de tejido submucoso son combinadas con uno o más factores de crecimiento empapando el tejido con una solución tamponada que contiene el factor de crecimiento. Por ejemplo, el tejido submucoso es sumergido durante 7 - 14 días a 4ºC en una solución salina tamponada de fosfato (PBS) conteniendo 5 a 500 mg/ml del factor de crecimiento de manera aproximada, o de manera más preferente 25 a 100 mg/ml. El tejido submucoso lleva a cabo de manera sencilla la unión con las proteínas y mantendrá una asociación con un agente bioactivo durante varios días. Sin embargo, para mejorar la absorción de los factores de crecimiento en el tejido submucoso, el mismo puede ser deshidratado de manea parcial antes de ser puesto en contacto con la solución del factor de crecimiento. Para composiciones que comprenden extractos fluidizados, solubilizados o extractos de guanidina de tejido submucoso, polvos liofilizados o soluciones de factores de crecimiento pueden ser mezcladas de manera directa con el tejido submucoso. Por ejemplo, el tejido submucoso fluidizado o solubilizado puede ser mezclado con un factor de crecimiento y luego introducido dentro de un tubo de tejido submucoso (u otro tejido biodegradable). El extremo abierto del tubo es cerrado de manera estanca después del llenado del mismo con el tejido submucoso fluidizado o solubilizado.

De acuerdo con la presente invención, el tejido submucoso de un vertebrado de sangre caliente es utilizado para la fabricación de una construcción de injerto de tejido útil para la inducción de la reparación de tejido neurológico en un vertebrado de sangre caliente. El proceso de fabricación comprende las etapas de la combinación del tejido submucoso de un vertebrado de sangre caliente, o una digestión de dicho tejido submucoso, con un factor de crecimiento añadido seleccionado de un grupo que consiste en factor de crecimiento endotelial vascular, factor de crecimiento nervioso y factor de crecimiento de fibroblasto.

En una realización de la presente invención el tejido submucoso es utilizado para la fabricación de una construcción de injerto que dirige el crecimiento in vivo de neuronas a lo largo de una trayectoria predeterminada. El proceso de fabricación comprende las etapas de formación de un tubo de material biodegradable, y el llenado de dicho tubo con tejido submucoso fluidizado. El tubo debe encontrarse conformado de modo que tenga un diámetro entre 0,5 mm y 4 mm de manera aproximada para aplicaciones nerviosas periféricas, y entre 1 mm y 2 cm de manera aproximada para aplicaciones nerviosas centrales. En una realización de la presente invención el tubo es conformado a partir de tejido submucoso en el que dicho tejido submucoso es manipulado para definir un cilindro que tenga un diámetro del tamaño preferente. De manera típica el tejido submucoso es preparado de manera directa a partir de tejido intestinal y en consecuencia tiene de manera general una forma cilíndrica. El tejido puede ser manipulado para definir un cilindro que tenga el diámetro preferente suturando o asegurando de otro modo el injerto de forma longitudinal y eliminando el exceso de tejido. Por ejemplo, la construcción de injerto puede ser preparada mediante la selección de una varilla de vidrio esterilizada que tenga un diámetro exterior igual al diámetro deseado para la cavidad interior o cavidad luminal de la construcción de injerto formada. La varilla de vidrio es introducida en la cavidad luminal del injerto, entonces el tejido sobrante es juntado, y el diámetro deseado de la cavidad o lumen se logra suturando a lo largo de la longitud del injerto o utilizando otros procedimientos de fijamiento de tejidos reconocidas en la técnica.

De manera alternativa, un tubo de tejido submucoso puede ser formado envolviendo un mandril con tiras de tejido submucoso, en el cual el tejido submucoso aplicado alrededor del mismo se encuentra superpuesto, no dejando expuesta ninguna parte del mandril. Ver la solicitud provisional U.S.A. Nº 60/032.679, cuya descripción se encuentra incorporado expresamente en el presente documento. El tejido submucoso puede ser aplicado en espiral de forma envolvente en un mandril como un fragmento continuo de tejido submucoso, y pueden utilizarse múltiples tiras de dicho tejido submucoso para conformar las construcciones con forma de tubo. Entonces el tejido submucoso envolvente es comprimido, encontrándose sometido a condiciones de deshidratación y la prótesis tubular es eliminada del mandril. El grado de superposición o solapamiento de una construcción envolvente con forma de espiral de acuerdo con la presente realización se encuentra en el rango entre el 10 y 60% de la anchura de la tira original y de manera preferente la parte superpuesta es el 50% de la tira original.

Durante la formación del tubo biodegradable, dicho tubo es llenado con tejido submucoso fluidizado o solubilizado y es cerrado de forma estanca en un extremo o en ambos extremos utilizando métodos reconocidos en la técnica (incluyendo pinzado, sutura, pastas adhesivas, y compresión bajo condiciones de deshidratación). De manera alternativa el tubo puede ser cerrado de forma estanca en un extremo o en ambos extremos antes de ser llenado con tejido fluidizado/solubilizado. Entonces dicho tubo puede ser introducido mediante la inyección del tejido fluidizado/solubilizado en la cavidad luminal utilizando una jeringa.

Las construcciones de injerto de tejido submucoso de la presente invención son utilizadas para llevar a cabo la reparación de tejidos de tipo neurológico y de manera más particular componentes del sistema nervioso central y periférico. El método comprende la puesta en contacto del sitio que necesita ser reparado con una composición que comprende tejido submucoso intestinal delaminado a partir de la túnica muscular y como mínimo la parte luminal de la túnica mucosa del intestino de un vertebrado de sangre caliente. El tejido submucoso puede ser utilizado, por ejemplo, en forma de láminas, tiras, trenzas o bucles y puede ser implantado de forma quirúrgica en el sitio que necesita reparación. La composición del tejido submucoso también puede ser administrada en una forma fluidizada y ser inyectada en el vertebrado de sangre caliente en el sitio que necesita reparación. Finalmente, la composición puede incluir un cilindro de tejido submucoso llenado con tejido submucoso fluidizado.

En una realización de acuerdo con la presente invención, las construcciones de tejido submucoso son utilizadas para la inducción de la formación de tejido de tipo neurológico entre estructuras de tejido neurológico endógeno en un vertebrado de sangre caliente. Dicho método comprende las etapas de implantación de forma quirúrgica de una composición de injerto de tejido que comprende un tejido submucoso de un vertebrado de sangre caliente en el organismo huésped para conectar las estructuras del tejido endógeno de tipo neurológico e inducir el crecimiento del mismo entre las estructuras neurológicas conectadas.

Cuando el tejido submucoso que comprende las partes de la túnica submucosa y la basilar de la túnica mucosa incluyendo la mucosa muscular laminar y el stratum compactum, es utilizado en una forma no fluidizada, es preferible que sea implantado de modo que el stratum compactum haga contacto con los tejidos superficiales más propensos a la formación de adhesiones con el material de injerto.

De acuerdo con una realización de la presente invención, los daños en la médula espinal pueden ser reparados mediante la separación de forma manual de las fibras nerviosas longitudinales adyacentes en la médula espinal, en la cual las separaciones o incisiones se extienden paralelas a los axones de las neuronas de dicha médula espinal y penetran a través de las capas de la duramadre, aracnoide y piamadre. Las tiras de tejido submucoso son implantadas de forma quirúrgica en las separaciones verticales o hendiduras naturales y en consecuencia se encuentran en contacto directo con los tejidos de tipo neurológico y son sostenidas en el sitio por dichos tejidos. De forma alternativa, las láminas de tejido submucoso pueden ser utilizadas para envolver el exterior de la zona dañada a efectos de estimular la reparación de los tejidos que han resultado dañados. De manera opcional pueden utilizarse suturas para asegurar el tejido submucoso en los sitios deseados.

En aplicaciones en las que la médula espinal ha resultado cortada o seccionada de manera transversal, el tejido submucoso puede ser posicionado entre los dos extremos dañados para actuar como puente en dicha separación y servir como una armazón que dirija el crecimiento de las neuronas de cada uno de los mencionados dos extremos dañados, uno hacia el otro. Las formas fluidizadas de la submucosa también pueden ser utilizados de acuerdo con la presente invención para llevar a cabo la reparación de los tejidos de tipo neurológico dañados o enfermos. De forma ventajosa, las formas fluidizadas pueden ser inyectadas en el sitio que necesita ser reparado y en consecuencia pueden ser utilizadas en un procedimiento menos invasivo para inducir la proliferación de tejidos endógenos de tipo neurológico.

De acuerdo con una realización de la presente invención una composición de injerto de tejido, que comprende un tejido submucoso de un vertebrado de sangre caliente, es administrada a un vertebrado de sangre caliente en un sitio que presenta necesidad de crecimiento del tejido endógeno de tipo neurológico, en una cantidad efectiva para inducir dicho crecimiento en el sitio en el que la composición es administrada. Las propiedades biotrópicas del tejido submucoso estimulan el crecimiento de tejido neurológico a lo largo del "tracto" definido por la trayectoria del tejido submucoso implantado. En consecuencia, el crecimiento de las neuronas, incluyendo neuronas de los sistemas nerviosos central y periférico, puede ser dirigido en un sitio que presenta necesidad de innervación. En una realización de la presente invención, el crecimiento de tejido neurológico es "dirigido" mediante la utilización de una construcción de injerto de tejido que comprende un tubo que ha sido llenado con un tejido submucoso fluidizado. En dicha realización el tejido neuronal sano es insertado en un extremo del tubo y es situado en contacto directo con el tejido submucoso fluidizado contenido en dicho tubo. El extremo opuesto de dicho tubo es entonces posicionado en el sitio que presenta necesidad de innervación o en las cercanías de dicho sitio. El tubo es fijado en su posición y proporciona un conducto in vivo para el nuevo crecimiento neuronal y la innervación del sitio deseado. El tubo de tejido submucoso fluidizado también puede ser utilizado para llevar a cabo la reparación de nervios cortados de forma transversal, en los cuales los dos extremos del nervio cortado son insertados en el tubo para inducir el acoplamiento de los extremos dañados y restablecer la función nerviosa.

Cada uno de los métodos siguientes puede ser utilizados en conjunto con las construcciones de injerto de tejido de la presente invención para proporcionar un conducto para la regeneración dirigida de tejidos neuronales. En una realización de la presente invención el tejido submucoso es preparado en la forma de un tubo teniendo una cavidad luminal y dos extremos abiertos. En una realización, el tubo de tejido submucoso es implantado de forma directa en el organismo huésped y el extremo de la fibra nerviosa dañada puede ser introducida en el lumen del tubo de tejido submucoso. Entonces se utiliza una jeringa para llenar el tubo con el tejido submucoso triturado o solubilizado. De manera alternativa, el tejido submucoso puede ser realizado con forma de un tubo, llenado con tejido submucoso fluidizado/solubilizado y cerrado de forma estanca en un extremo. El tubo de tejido submucoso cerrado de forma estanca entonces puede ser almacenado hasta que se necesite. En una realización de la presente invención, el tubo de tejido submucoso cerrado de forma estanca es insertado en el organismo huésped y fijado en su sitio mediante la utilización de métodos conocidos para aquellas personas especializadas en la técnica. Las construcciones de injerto insertadas proporcionan un conducto para el crecimiento de tejido neuronal nuevo. En una realización preferente de la presente invención, una hendidura u orificio es practicado en el tubo de tejido submucoso y el extremo dañado o amputado de un tejido nervioso es insertado a través de la hendidura u orificio y en la cavidad luminal del tubo.

El tejido submucoso utilizado de acuerdo con la presente invención puede ser utilizado solo o combinado con factores de crecimiento añadidos tales como factor de crecimiento endotelial vascular, factor de crecimiento nervioso o factor de crecimiento fibroblástico acídico. Además, pueden utilizarse implantes de nervios periféricos en combinación con el tejido submucoso para mejorar la reparación del tejido neuronal. El término implante de nervio periférico es utilizado en el presente documento para hacer referencia a tejido neuronal cultivado a partir del sistema nervioso periférico de un vertebrado de sangre caliente, y de manera preferente tejido neuronal periférico autólogo. Los componentes adicionales pueden ser añadidos a las composiciones de injerto de tejido neuronal que proporcionen a los composiciones un soporte estructural para las aplicaciones que involucren la médula espinal, especialmente en sitios en los que faltan partes de la columna vertebral o existen partes que deben ser reemplazadas. Por ejemplo la hidroxiapatita y/u otros minerales que contengan calcio biocompatible pueden ser combinados con la composición de injerto, o varillas metálicas o hilos metálicos también pueden ser utilizados de forma conjunta con el tejido submucoso para dar soporte estructural adicional al tejido de reemplazo.

Las construcciones de injerto de tejido submucoso de la presente invención también pueden ser utilizadas para llevar a cabo la estimulación del crecimiento y proliferación de otros tejidos asociados con el sistema nervioso central y los tejidos de soporte. El tejido submucoso mejora la reparación de células gliales, y tejidos de duramadre, tejidos aracnoides y tejidos de piamadre.

En una realización de la presente invención el tejido submucoso es utilizado como un sustituto dural formado como un injerto de tejido parche formado para cubrir un defecto u orificio en la duramadre endógena. Las opciones actualmente disponibles de materiales de sustituto para la duramadre tienen limitaciones significativas: los materiales autólogos de manera frecuente no son adecuados en cuanto a la cantidad y son obtenidos con la morbosidad asociada de las incisiones adicionales, y las características de manipulación de las láminas sintéticas son pobres comparadas con los materiales biológicos. Además, ha aumentado la preocupación en cuanto al riesgo de hemorragias a largo plazo a partir de la reacción del tejido a los materiales de injerto sintéticos. La duramadre de origen cadavérico es costosa, de manera ocasional de suministro limitado, y presenta únicamente buenas características de manipulación. Una preocupación mayor es el rol documentado como un vector en la transmisión de virus lentos tal como la enfermedad de Jakob-Creutzfeld.

El tejido submucoso proporciona un substituto dural excelente dado que dicho material no invoca una respuesta inmunológica adversa e induce la proliferación de células endógenas que invaden y reemplazan finalmente el injerto con células endógenas. Se ha llevado a cabo un experimento utilizando ratas huésped a efectos de confirmar la utilidad de las composiciones de tejido submucoso como sustitutos durales.

Como se describe en el Ejemplo 1, el tejido submucoso implantado en una rata que presenta una resección dural funciona como un sustituto dural adecuado. A los 28 días después de la implantación comenzó el remodelado del tejido submucoso, como es indicado por la presencia de células fusiformes, neovascularización enérgica, y manchado eosinófilo de la matriz del tejido conectivo. La incorporación y remodelado del injerto toma lugar en la ausencia de cualquier efecto adverso en el córtex cerebral que se encuentra debajo.

Ejemplo 1 Tejido submucoso como substituto dural Diseño experimental y procedimiento quirúrgico

Doce ratas de laboratorio de tamaño mediano Sprague-Dawley fueron anestesiadas (ketamina 90 mg/kg y xilazina 10 mg/kg, IM) y colocadas en un armazón de cabeza estereotáxico para estabilizar el cráneo. El cuero cabelludo fue afeitado, preparado con clorhexadina, e infiltrado con 1% de lidocaína. A continuación se llevó a cabo la incisión de la fascia en la línea temporal, los músculos temporales fueron elevados de manera lateral a través de la incisión central del cuero cabelludo exponiendo las convexidades parietales. Se realizaron craneoctomías parietales bihemisféricas, aproximadamente de 4 mm X 8 mm, con un taladro manual eléctrico y un trépano. La duramadre, una membrana delgada casi transparente en la rata, fue cortada en los sitios en los que se practicaron las craneoctomías mediante ampliación en circuito cerrado. Se tuvo cuidado de no lastimar el córtex cerebral que se encuentra debajo de la duramadre.

Un material de injerto de submucosa intestinal de tamaño pequeño con forma de lámina fue preparado de acuerdo con la presente invención y esterilizado mediante exposición a ácido peracético al 0,1%. El injerto fue cortado para obtener un tamaño adecuado y situado como un injerto exterior sobre una de las convexidades, con el injerto orientado de modo que la superficie del stratum compactum se orientó hacia el córtex cerebral. El hemisferio contralateral no recibió injerto, sirviendo de dicho modo como un control de la respuesta del organismo huésped al procedimiento operativo. En dos animales el fragmento de hueso fue reemplazado. La herida fue irrigada con una solución salina normal y cerrada con grapas. Se aplicó una única dosis postoperatoria de ampicilina (25 mg/kg, SQ). El cuidado postoperatorio inmediato incluyó la colocación en una placa de calentamiento, recubrimiento con una toalla, volteado cada 15 minutos hasta despertar y detectar movimiento, y monitorización de la frecuencia cardíaca y la respiratoria. Los animales fueron controlados diariamente en cuanto a los ataques o deficiencias neurológicas, apetito y aceptación de líquidos, y peso. Diez de las ratas fueron sacrificadas mediante una sobredosis de barbiturato (150 mg/kg, IC) 7 días después de la colocación del injerto. Las ratas restantes fueron sacrificadas 28 días después de la colocación del injerto.

Preparación histológica y evaluación

Tres de las veinte ratas murieron por complicaciones relacionadas con la anestesia en el período postoperatorio primario. Las diecisiete ratas restantes se recuperaron del procedimiento sin incidentes y sin evidencia de ataques, infecciones o deficiencias neurológicas. Ocho ratas fueron sacrificadas al día 7. Nueve ratas fueron sacrificadas al día 28.

A continuación del sacrificio las ratas fueron irrigadas con formalina a través de la arteria carótida mediante catéteres. El cráneo fue dispuesto en formalina y descalcificado. Fueron cortadas secciones de seis micrones de espesor, manchadas con hematoxilina y cosina, y preparadas para el examen histológico. Los tejidos examinados incluyeron las interfaces del injerto con el córtex, hueso y cuero cabelludo. El lado de control fue preparado de manera similar.

La evaluación microscópica de los especímenes fue aumentada con la cuantificación de la infiltración, vascularización, y espesor celular del sitio defectuoso mediante la utilización de un sistema de análisis por imágenes (Optimus Image Analysis System; Bioscan, Inc; Edmonds, WA). La información del sitio defectuoso tratado con el implante de injerto submucoso fue comparada con el sitio de control correspondiente a los 7 días y 28 días. La puntuación numérica otorgada a los tejidos de remodelación se basaron en el criterio mostrado en la Tabla 1. Los valores fueron comparados utilizando el test T de Student. La puntuación total para los grupos respectivos fue utilizada para comprobar la hipótesis de nulidad en la que no existió diferencia entre los cambios morfológicos observados en los sitios defectuosos llenados con submucosa y los sitios defectuosos no llenados con submucosa a los 7 y 28 días. Un valor p menor que 0,05 fue considerado como significativo.

TABLA 1 Valoración Histológica Cuantitativa de aplicación dural de submucosa

Injerto vs. Control

Grupo	Espesor	Vascularización	Densidad Celular	Puntuación Total
Injerto de 7 días (n = 8)	1,1 \pm 0,2	0,9 \pm 0,2	1,4 \pm 0,2	3,4 \pm 0,8^{a}
Control de 7 días (n = 8)	0,2 \pm 0,1	0,1 \pm 0,1	0,1 \pm 0,1	0,4 \pm 0,1
Injerto de 28 días (n = 9)	1,9 \pm 0,3	1,9 \pm 0,4	0,8 \pm 0,3	4,6 \pm 1,1^{a}
Control de 28 días (n = 9)	1,1 \pm 0,3	0,8 \pm 0,2	0,3 \pm 0,2	2,2 \pm0,5
^{a} valor significativamente diferente del valor en el grupo de control en un valor p < 0,05

Los sitios de injerto de submucosa fueron comparados con los sitios de control utilizando el criterio de puntuación del espesor, vascularización y densidad celular. Los valores listados representan el valor medio \pm S.E.M. (error estándar de la media).

Criterio	Puntuación	Descripción de la puntuación
Espesor
\hskip1,5cm 0 =		< 100 \muM
\hskip1,5cm 1 =		100 - 200 \muM
\hskip1,5cm 2 =		> 200 \muM
Vascularización
\hskip1,5cm 0 =		0 - 1 secciones transversales del vaso /100, \muM^{2}
\hskip1,5cm 1 =		2 - 4 secciones transversales del vaso /100, \muM^{2}
\hskip1,5cm 2 =		\geq 5 secciones transversales del vaso /100, \muM^{2}
Densidad Celular
\hskip1,5cm 0 =		Superficie celular total: material de la matriz extracelular < 0,5
\hskip1,5cm 1 =		Superficie celular total: material de la matriz extracelular 0,5 - 1,0
\hskip1,5cm 2 =		Superficie celular total: material de la matriz extracelular > 1,0

La evaluación histológica mostró la infiltración del injerto por las células mononucleares con forma fusiforme, deposición del tejido conectivo, y neovascularización. Además, el análisis histológico reveló diferencias distintas entre los defectos reparados con el tejido submucoso respecto al control (es decir, defectos sin sanar sin ningún material dispuesto en el sitio del defecto). Las puntuaciones totales para los grupos respectivos fueron comparadas utilizando el test T de Student, siendo aceptada la significancia para un valor p < 0,05. Una diferencia significativa entre las puntuaciones histológicas del sitio de injerto de submucosa y el sitio de control fue encontrada a los 7 días (3,4 \pm 0,8 vs. 0,1 \pm 0,1) y a los 28 días (4,6 \pm 1,1 vs. 2,2 \pm 0,5). No fue observada evidencia de efectos adversos en el córtex subyacente.

En el día 7, las principales diferencias entre los dos grupos fueron la infiltración celular, la vascularización, y el espesor del tejido conectivo depositado en el sitio defectuoso. Dichos cambios morfológicos fueron comparados de una forma semicuantitativa como ha sido definido en la tabla 1. Dicho método de comparación mostró un incremento en el espesor, un incremento en la vascularización, y una mayor infiltración celular de los defectos tratados con submucosa respecto a los defectos que no fueron tratados con material submucoso. Las células mononucleares que fueron vistas dentro y alrededor del material submucoso al día 7, a menudo mostraron forma fusiforme y se encontraron rodeadas por material de matriz extracelular de manchado eosinófilo (ECM). El material submucoso de remodelado mostró un gran número de vasos de sangre de tamaño capilar en contraste con aquellos observados en los defectos de control sin material submucoso.

A los 28 días, el infiltrado celular se había moderado en los defectos llenados con material submucoso y la cantidad de ECM había aumentado. El tejido conectivo de manchado eosinófilo en la submucosa y alrededor de la misma mostró una orientación en la dirección que se extendería desde un borde de la calvaria o bóveda del cráneo cortada hasta el borde opuesto. También se produjo una organización moderada del tejido conectivo vista en los defectos sin aplicación de material submucoso; sin embargo la cantidad de material presente fue mucho menor que en los sitios defectuosos con aplicación de material submucoso. El material submucoso mismo no fue discernible al día 28. La ECM pareció homogénea en dichas secciones manchadas H&E. El infiltrado celular fue mucho menor en el día 28 que en el día 7 y virtualmente todas las células presentes fueron coherentes con las células mesenquimales con forma fusiforme.

Fueron notadas adherencias ocasionales entre la ECM dentro del sitio defectuoso y el córtex cerebral subyacente en el lado de aplicación de material submucoso y en el lado sin aplicación de material submucoso. Ninguno de los especímenes mostró cambios coherentes con encefalitis, degeneración o necrosis.

Ejemplo 2 Tejido submucoso como un substituto dural en el modelo canino Diseño experimental y procedimiento quirúrgico

Ocho perros mestizos de tamaño mediano (20 - 30 kg) fueron anestesiados, intubados y colocados en la posición supina esternal (inducción con 2% tiopental 1,0 mg/kg intravenoso; mantenimiento con isoflurano 1% - 2%; atropina 0,5 mg/ml, intravenoso). Se administró una pomada oftálmica. El cuero cabelludo fue afeitado, preparado con clorhexadina e infiltrado con lidocaína 1%. Mediante una incisión en la línea central de cuero cabelludo y una incisión subsiguiente de la fascia en la línea temporal superior, el músculo temporal fue elevado de forma lateral exponiendo la convexidad parietal. Se practicó una craneotomía temporoparietal de 2 X 3 cm con un taladro eléctrico manual y un trépano. Los bordes sangrantes del hueso fueron encerados. La duramadre fue cortada en los sitios en los que se practicó la craneotomía mediante ampliación en circuito cerrado. Se tuvo precaución para evitar el daño del córtex cerebral subyacente.

El material de injerto de tejido submucoso fue cultivado y esterilizado mediante exposición a ácido peracético al 0,1% en etanol 20% durante 120 minutos. El material fue cortado a un tamaño adecuado y dispuesto con las capas basales compactas de la túnica mucosa orientadas hacia el córtex cerebral y fue asegurado con sutura de nylon trenzada. En cinco animales se llevó a cabo un procedimiento contralateral en el que la duramadre autóloga cortada fue utilizada para cerrar el defecto, sirviendo en consecuencia como un control para la respuesta del organismo huésped al procedimiento operatorio.

En tres animales el lado contralateral fue sometido a un corte dural con reemplazo submucoso intestinal sesenta días después del procedimiento inicial. La parte del cráneo eliminada por la craneotomía fue colocada nuevamente, la herida fue irrigada con solución salina normal, y cerrada con grapas. Se aplicó pomada tribiótica, vendaje de cabeza estéril y un collarín. Se administró un tratamiento antibiótico consistente en cefalexina 1000 mg, PO, b.i.d., un día antes de la operación y durante tres días después de la operación. El cuidado postoperatorio inmediato incluyó el recubrimiento con una manta y la monitorización de la frecuencia cardiaca y respiratoria. El dolor postoperatorio fue tratado con butorfanol (2,4 mg, intramuscular) y Ace Promazine (2,0 mg, intramuscular). Los animales fueron controlados en cuanto a la ocurrencia de ataques o deficiencias neurológicas, apetito y admisión de fluidos y peso. El sacrificio se llevó a cabo con una sobredosis de barbiturato (150 mg/kg, intracardiaca) a los 7, 30, 60, 90 y 120 días después de la aplicación del injerto inicial y a los 7, 30 y 60 días siguientes a la repetición de la exposición del tejido submucoso intestinal. Antes del sacrificio se llevó a cabo la aspiración de 5 cc de fluido cerebroespinal (CSF) mediante una punción suboccipital y se examinó el diferente conteo celular.

Preparación histológica y evaluación

Posteriormente al sacrificio, la cabeza y el cuello de los perros fueron irrigados con formalina a través de la arteria carótida mediante catéteres. El cráneo fue colocado en formalina y descalcificado. Después del emplazamiento en parafina, fueron cortadas, manchadas con hematoxilina y eosina secciones de seis micrones de espesor de los sitios quirúrgicos, y preparadas para el examen histológico. Los tejidos examinados incluyeron las interfaces del injerto con el córtex cerebral, hueso y cuero cabelludo.

Resultados

Los ocho perros se recuperaron del procedimiento sin incidencias y sin mostrar evidencia de ataques, infecciones o deficiencia neurológica. La repetición del injerto no fue acompañada por evidencia clínica de sensibilización al tejido submucoso.

Al día 7 después de la implantación se presentó una respuesta celular mononuclear intensa en el tejido submucoso intestinal, con neovascularización intensa y deposición de la matriz extracelular desordenada alrededor del tejido submucoso. Sin embargo, no hubo evidencias de participación del córtex cerebral subyacente. Hubo una pequeña cantidad de células fusiformes coherentes con fibroblastos alrededor del sitio de injerto y dentro del mismo.

En cada examen posterior al período de tiempo de 7 días (30, 60, 90 y 120 días) se evidenció un tejido conectivo denso de manchado eosinófilo bien organizado, sin evidencias de tejido submucoso remanente hacia el día 60. No fueron observadas adhesiones meningocerebrales. En los perros sometidos a una segunda exposición al tejido submucoso intestinal, se encontró una respuesta indistinguible respecto a aquellos perros con una única exposición de tejido submucoso intestinal.

En algunos animales, en el sitio de prueba y en el sitio de control, se produjo una ligera reacción de inflamación de la piamadre adyacente al cerebro. Dado que dicho hecho se encontró presente en el sitio de control y en el sitio de prueba, es probable que represente una respuesta al procedimiento quirúrgico. En ningún animal se evidenció participación del córtex cerebral en sí mismo. La neovascularización fue más intensa a los 7 y 30 días en los sitios con aplicación de tejido submucoso en comparación con los sitios de control. No se encontró evidencia de una reacción de mediación inmunológica del injerto de la sensibilización del organismo huésped en los implantes iniciales o en los animales implantados nuevamente. No se encontraron anormalidades en la química del suero o citología del CSF en ninguna de las muestras postoperatorias.

Comentarios

Las opciones actuales para un substituto dural incluyen materiales autólogos (por ejemplo pericráneo, fascia temporal y fascia lata tensora), materiales cadavéricos liofilizados (por ejemplo duramadre y fascia lata tensora), biomateriales xenogénicos (pericardio bovino y ovino, duramadre bovina, y esponjas de colágeno bovino reconstituidas) y materiales sintéticos (por ejemplo polímero expandido de fluoretileno, láminas Silastic, láminas Dacron, mallas Vicryl). Sin embargo, cada uno de dichos materiales se encuentra asociado con limitaciones significativas.

Los materiales autólogos de manera frecuente no resultan adecuados en cuanto a la cantidad y son obtenidos con la morbosidad asociada de las incisiones adicionales. Las características de manipulación de las láminas sintéticas son pobres en comparación con los materiales biológicos. Además, ha aumentado la preocupación respecto a los riesgos de hemorragias a largo plazo a partir de la reacción del tejido adyacente al injerto. La duramadre cadavérica es costosa, de manera ocasional limitada en cuanto al suministro, y presenta únicamente buenas características de manipulación. El rol documentado de la duramadre cadavérica como vector de transmisión de la enfermedad de Jakob-Creutzfeld limita su atractivo de forma seria. Del mismo modo, las evidencias recientes de la transmisión a los seres humanos de la encefalopatía espongiforme bovina elevan la preocupación respecto a los tejidos neurológicos de base bovina.

La duramadre consiste primariamente en colágeno de Tipo I, y en consecuencia los productos a base de colágeno son candidatos razonables para la substitución dural. Además, a pesar de la cualidad inerte biológica relativa, ha sido considerada de forma previa como una característica de implante deseable, existe conocimiento creciente de las ventajas potenciales de una respuesta biológica inducida favorable al injerto. De hecho se ha mostrado que las células de fibroblasto y endoteliales invaden a lo largo de un andamiaje de colágeno reconstituido, reemplazándolo por colágeno recién sintetizado. Numerosas preparaciones a base de colágeno han sido investigadas y parecen exhibir muchas de dichas características. Las preparaciones presentadas para la substitución dural incluyen peritoneo y dermis porcinas procesadas, corión y pericardio bovino, pericardio ovino, y múltiples productos reconstituidos de la placenta humana. La incorporación del injerto con la resorción subsiguiente es informada para cada uno de dichos materiales. Además, no produjeron reacciones inmunológicas agudas ni cicatrices meningocefalíticas epileptogénicas cuando fueron aplicadas al córtex.

Sin embargo, únicamente el pericardio bovino se encuentra disponible comercialmente. En consecuencia, una preparación de colágeno de base no bovina con propiedades biológicas favorables parece ofrecer numerosos beneficios al mismo tiempo que evita muchas desventajas. El material submucoso acelular de la presente invención proporciona un material novedoso para las construcciones de substituto de la duramadre. Además de la ausencia de una respuesta inmunológica adversa, se ha demostrado una remodelación distintiva del tejido submucoso y la incorporación en el tejido del organismo huésped. La forma final del injerto dural remodelado se muestra histológicamente indistinguible del tejido original. De forma adicional, la exposición al tejido submucoso intestinal dos meses después del injerto inicial no fue acompañado por acontecimientos clínicos adversos. La citología del CSF rutinaria no proporcionó evidencias de una respuesta adversa del organismo huésped al injerto de tejido submucoso.

Ejemplo 3 Crecimiento in vitro y diferenciación de células neuronales cultivadas en tejido submucoso

Las células de feocromocitoma (células PC12) son células neuronales que crecen como células de cromafina esférica en ausencia del factor de crecimiento nervioso (NGF) pero se diferencian para formar neuronas como las simpáticas durante la exposición al tratamiento con el factor de crecimiento nervioso. Las células PC12 son una línea celular establecida y bien estudiada que ha sido utilizada como un sistema modelo para el estudio de la diferenciación y proliferación neuronal. La respuesta de las células PC12 a la exposición a varias formas de tejidos submucosos (deshidratados, ETO, PAA) fue investigada a efectos de determinar si el tejido submucoso estimularía la diferenciación, el crecimiento y la proliferación de células neuronales.

Cultivo celular

Se obtuvieron células (PC12) de fenocromocitoma de rata a partir de American Type Culture Collection (Rockville, MD) y fueron cultivadas como ha sido descrito por Green Tishler (1983). Inicialmente las células fueron desarrolladas hasta la confluencia en monocapas acopladas a matraces plásticos de 75 cm. Las células PC12 fueron mantenidas en medio RPMI 1640 complementado con 10% de suero de caballo, 5% de suero fetal bovino, 1% L-glutamina y 100 unidades/ml de penicilina y 100 ug/ml de estreptomicina. Las células fueron sembradas en placas de cultivo de 6 pocillos de plástico recubiertas de forma previa con 0,2 mg/ml de colágeno. Las células PC12, sirviendo como un control positivo, se diferenciaron en células con forma de simpatoblastos mediante el tratamiento con factor de crecimiento nervioso (NGF) en una concentración de 50 mg/ml durante 7 - 10 días en RPMI. El medio conteniendo NGF fue cambiado cada día durante dicho período. Después de 10 días en cultivo, las células PC12 se hubieron diferenciado de forma terminal y se tornaron dependientes del NGF para la supervivencia.

Productos químicos

Se adquirió suero equino y suero bovino de Hyclone (Logan, UT), RPMI de Gibco BRL (Grand Island, NY). Se preparó submucosa de intestino delgado de acuerdo con los procedimientos descritos en el presente documento. Todos los químicos restantes fueron adquiridos a partir de Sigma Chemical Company.

1. Estudios de crecimiento y diferenciación

Para demostrar que las células PC12 producen una diferenciación en submucosa, dichas células fueron sembradas (50.000/ml) en placas de cultivo de 6 pocillos de plástico sin revestimiento, conteniendo cada pocillo un cuadrado de 1 - 2 pulgadas de submucosa (la submucosa deshidratada fue preservada como una lámina estéril, ERO, PAA) y medio RPMI durante 10 días. La submucosa fue cortada en fragmentos de tamaño pequeño y colocada en pocillos de placa de cultivo de células mediante fórceps estériles y dichas células fueron pipeteadas en la submucosa. Las células fueron observadas bajo un microscopio de luz invertida cada día para detectar los cambios en las células PC12.

Cada 2, 4, 6, 8 y 10 días se tomaron fotografías para realizar la comparación del grado de diferenciación de las células PC12 mediante la observación cuantitativa de la cantidad de neuritas y la longitud de dichas neuritas. Cada experimento se repitió tres veces (n = 3) por triplicado. La diferenciación de las células fue observada para las células en contacto directo con el tejido submucoso como también para las células que no se encontraban en contacto directo con el tejido submucoso presente en el pocillo.

Los siguientes controles fueron utilizados para la comparación de las observaciones experimentales, cada control (comprendiendo cuatro pocillos) fueron repetidos tres veces (n = 3);

Control Positivo: las células fueron sembradas en placas de cultivo de 6 pocillos de plástico recubiertas de forma previa con 0,2 mg/ml de colágeno en un medio conteniendo 50 mg/ml de NGF. Las células fueron desarrolladas durante 10 días en RPMI conteniendo NGF que fue cambiado cada dos días.

Control Negativo 1: las células fueron sembradas en placas de cultivo de 6 pocillos de plástico recubiertas de forma previa con 0,2 mg/ml de colágeno en un medio sin NGF.

Control Negativo 2: en un segundo control negativo las células fueron sembradas en placas de cultivo de 6 pocillos de plástico en un medio sin NGF. Dado que las células en el control negativo 2 comenzaron a morir y flotar después de 2 - 3 días, dicho control fue descartado y no se realizó ninguna comparación de información con dicho control.

Resultados

Las células neuronales PC12 cultivadas en substratos de tejido submucoso en ausencia de cualquier factor de crecimiento añadido producen diferenciación, proliferación y parecen migrar en el substrato. Un estudio temporal fue realizado y las observaciones fueron tomadas después de 2, 4, 6, 8 y 10 días de cultivo a efectos de correlacionar el tiempo de exposición al substrato submucoso con los cambios en la diferenciación de las células neuronales. Las células PC12 produjeron diferenciación en el substrato submucoso de manera temprana un día después del sembrado. Al segundo día se observó una diferenciación notable en comparación con el control negativo. Sin embargo, se observó una mayor cantidad de células diferenciadas y un mayor grado de diferenciación de dichas células después de dos días de cultivo. Las diferencias cualitativas entre los controles y las muestras experimentales continuaron después de cuatro días de cultivo: al cuarto día el control positivo mostró un mayor grado de diferenciación que las células creciendo en la submucosa y finalmente el control negativo mostró el mínimo grado de diferenciación.

Después de seis días de cultivo, una comparación visual de las células bajo el microscopio indicó un incremento en la cantidad de las células. Sin embargo numerosas células se encontraron flotando y agrupadas. Este resultado es muy típico de los cultivos de células PC12 in vitro, y sugiere que aquellas células que no llegaron a diferenciarse, continuaron proliferando y como resultado de la mayor cantidad de células produjeron agrupamientos. Al sexto día las células cultivadas en el material submucoso mostraron de ninguna a muy pocas neuritas en comparación con el control positivo, y muchas de las células en dicha etapa parecieron migrar en la submucosa. Un mayor grado de diferenciación fue observado en las células que no se encontraban en contacto directo con el material submucoso en la placa de cultivo. Es decir, las células PC12 que se encontraban inmediatamente adyacentes al tejido submucoso intestinal, pero no en contacto directo con el mismo, mostraron buena diferenciación.

Estudios Histológicos

Se utilizó un análisis histológico temporal para investigar el momento en que se produjo la migración celular en el substrato submucoso y para determinar si las células migrantes permanecieron en estado diferenciado o cambiaron a células no diferenciadas y perdieron neuritas. Los pocillos con material submucoso fueron limpiados con PBS (2 ml) y posteriormente puestos en formalina tamponada con solución salina (4 ml) durante la noche antes de que pudieran ser procesados para el preparado en una platina o portaobjetos. Las muestras en duplicados en los días 2, 4, 6, 8 y 10 de los estudios temporales fueron dispuestas para el preparado en el portaobjetos. Los portaobjetos estuvieron debajo del preparado.

Los experimentos también fueron llevados a cabo para demostrar qué lado de la submucosa (mucoso o serosal) fue capaz de realizar mejor la diferenciación de las células PC12. Las métodos para el sembrado de las células PC12 a ambos lados de la submucosa fueron similares a los descritos anteriormente en el presente documento. Se observó que el lado mucoso de la submucosa pareció ser más propenso a la diferenciación de las células neuronales en comparación con el otro lado de la submucosa.

Para observar el efecto de la radiación Gamma en la diferenciación de las células PC12, se sembraron células PC12 a ambos lados de la submucosa irradiada con rayos Gamma. Los resultados preliminares indicaron que el grado de diferenciación de las células cultivadas en la submucosa irradiada con rayos Gamma fue mayor que el de las células cultivadas en una submucosa normal (ETO hidratada, PAA). Dicho estudio fue llevado a cabo una única vez (n = 1) por triplicado, por lo tanto son necesarios los estudios repetidos para la confirmación de los resultados. Sin embargo, estos resultados iniciales sugieren la posibilidad de asistir con radiación Gamma la ruptura/perturbación de la estructura mecánica de la submucosa y la liberación de algún tipo de factores de estimulación de la diferenciación a efectos de mostrar una mayor diferenciación.

Para la determinación del efecto del movimiento físico de la placa de cultivo ("Estudios de Perturbación Mecánica") sobre la diferenciación celular, se llevó a cabo el sembrado de células PC12 en material submucoso como ha sido descrito anteriormente. La placa de cultivo sembrada no fue movida durante 5 días y las células fueron controladas bajo el microscopio. El experimento fue llevado a cabo una única vez (n = 1) en 6 pocillos. El movimiento físico de la placa de cultivo resultó en un menor grado de diferenciación, implicando que el movimiento de las placas de cultivo después del sembrado interfiere con la diferenciación celular.

Se llevaron a cabo dos experimentos por duplicado para la determinación del efecto del cambio del medio sobre la diferenciación celular. El medio RPMI fue reemplazado en los días 2, 4, 6, 8 y 10 en los pocillos que consistieron en células sembradas en el lado mucoso de la submucosa y el lado abluminal de la submucosa, control negativo y control, en los que las células fueron sembradas en una placa sin recubrimiento y sin NGF. El experimento fue repetido dos veces (n = 2) por triplicado. Los resultados obtenidos a partir de dicho estudio indicaron que el cambio del medio no tuvo un efecto significativo sobre la diferenciación celular utilizando cualquiera de los lados de la submucosa y del control negativo. Sin embargo, en el control las células no flotaron ni murieron de manera tan temprana como las células de control cultivadas sin cambio en el medio.

Ejemplo 4 Estudios de neutralización de anticuerpo de células PC12 cultivadas en substratos de tejido submucoso Materiales y Métodos

Células: células de fenocromocitoma (PC12) de rata fueron obtenidas de American Type Culture Collection (Rockville, MD) y fueron cultivadas como se ha sido descrito por Green Tishler (1983). Inicialmente las células fueron desarrolladas hasta la confluencia en monocapas acopladas a matraces de plástico de 75 cm. Las células PC12 se mantuvieron en medio RPMI 1640 complementado con 10% de suero equino, 5% de suero fetal bovino, 1% de L-glutamina y 100 unidades/ml de penicilina y 100 ug/ml de estreptomicina. Fueron utilizados los pasajes 3 - 4 para los estudios a una concentración de 40.000 células/ml.

Placas de cultivo: placas de 12 pocillos (Falcon) fueron tratadas durante la noche con 1 ml de una solución de 0,2 mg/ml de colágeno de cola de rata a 37ºC. Las placas recubiertas con colágeno fueron utilizadas para los experimentos dentro de los tres días desde el recubrimiento.

Medio de prueba: se utilizó medio Completo RPMI y Medio Acondicionado de Tejido Submucoso (STCM) en los presentes experimentos. El STCM fue preparado mediante la incubación de medio comercial RPMI 1640 libre de suero con PAA (0,1%) y radiación Gamma (1Mrad) de tejido submucoso tratado a una concentración de 2g de tejido submucoso cada 15 ml de medio. El tratamiento se realizó durante 48 horas a 37ºC. El suero y otros complementos fueron agregados al medio de tejido submucoso tratado para producir el STCM.

Factores de crecimiento: 7S-NGF (BT-5023) de ratón fue adquirido de Harlan y fue utilizado a una concentración de 50 ng/ml. Se adquirió FGF2 (1363 - 719) bovino recombinante de Boehringer Mannheim y fue utilizado a una concentración de 10 ng/ml.

Anticuerpos: NGF (1087 - 754) anti-ratón fue adquirido de Boehringer Mannheimn y fue utilizado a una concentración de 150 ng/ml. Se adquirió FGF2 (AB - 33 - NA) anti-bovino de conejo de R&D y fue utilizado a una concentración de 40 - 50 \mug/ml.

Método: las células PC12 fueron colocadas en la placa por duplicado a una concentración de 40.000 células/ml en placas de 12 pocillos conteniendo 0,5 ml de medio RPMI o STCM. Los factores de crecimiento y/o anticuerpos fueron añadidos de manera adecuada. Los cultivos fueron evaluados en cuanto a la diferenciación PC12 48 horas después de la colocación en las placas mediante el conteo de campos 3-20X por pocillo.

Diferenciación: las células PC12 se consideraron diferenciadas si exhibieron como mínimo una extensión con forma de neurita extendiéndose un mínimo de 2 diámetros de cuerpo celular a partir del núcleo celular.

Resultados

Tratamientos de medio RPMI: fue descubierto que el NGF y el FGF2 indujeron la diferenciación PC12 en las concentraciones ensayadas. Los pocillos que no contenían factor de crecimiento no llevaron a cabo diferenciación. Se observó que la actividad del factor de crecimiento fue neutralizada de forma efectiva mediante la adición del anticuerpo neutralizador respectivo al factor de inducción de neurita. La adición de anti-NGF a los pocillos conteniendo FGF2 también bloqueó la diferenciación en el medio RPMI 1640, la adición de anti-FGF2 a los pocillos conteniendo NGF no alteró la diferenciación.

Tratamientos STCM: el STCM indujo la diferenciación de las células PC12. La diferenciación fue bloqueada de manera efectiva con la adición del anticuerpo neutralizador anti-FGF2. La adición del anticuerpo neutralizador anti-NGF no afectó la diferenciación.

Conclusiones

1. El medio STCM contiene una sustancia que produce la diferenciación PC12. El efecto de dicha sustancia puede ser neutralizado mediante la adición de un anticuerpo neutralizador anti-FGF2.

2. La diferenciación PC12 en el medio STCM no resulta afectada por la adición de un anticuerpo neutralizantes anti-NGF.

3. El anticuerpo neutralizador anti-NGF puede producir una reacción cruzada con el FGF2 bovino. También resulta posible que se una de forma no específica con el receptor FGF2.

Ejemplo 5 Regeneración del nervio ciático Diseño experimental y procedimiento quirúrgico

Se preparó material de injerto submucoso de intestino delgado con forma de lámina de acuerdo con la presente invención y fue esterilizado por exposición a 0,1% de ácido peracético. Una única lámina de tejido submucoso fue realizada con forma de un tubo teniendo un diámetro luminal de 2 mm de manera aproximada y los extremos opuestos del tejido laminar fueron suturados de manera longitudinal a lo largo del eje del tubo. La cavidad luminal del tejido submucoso fue llenada con una suspensión de tejido submucoso triturado inmediatamente antes de la implantación de la construcción de injerto en la rata.

Once ratas de laboratorio Sprague-Dawley de tamaño mediano fueron anestesiadas (Ketamine 90 mg/kg y Xilacina 10 mg/kg, I.M.) y se llevó a cabo un corte de 6 a 7 mm de manera aproximada de la rama tibial del nervio ciático en cada una de las ratas. La parte cortada fue reemplazada con un tubo "silastic" vacío (sirviendo como control) o una construcción tubular llenada con tejido submucoso fluidizado. Los dos extremos dañados de la rama tibial fueron insertados en los tubos preparados, encontrándose posicionado un extremo del nervio dañado en el primer extremo del tubo y el otro extremo del nervio dañado encontrándose insertado en el extremo opuesto del tubo de modo que una distancia de 6 a 7 mm de manera aproximada separó los dos extremos de la rama tibial cortada. Cinco de las ratas sirvieron como controles, teniendo colocados los extremos del nervio dañado dentro de un tubo silastic vacío, y seis ratas tuvieron los extremos del nervio dañado insertados en tubos de tejido submucoso en contacto directo con el tejido submucoso fluidizado (ver Tabla 2). La construcciones de injerto fueron fijadas en posición mediante la sutura con el tejido circundante. La herida fue irrigada con solución salina normal y cerrada con grapas. El cuidado postoperatorio inmediato incluyó la colocación en una placa de calentamiento, el recubrimiento con una toalla, el volteado cada 15 minutos hasta despertar y observar movimiento, y el control de la frecuencia cardiaca y respiratoria.

Los animales fueron controlados de forma diaria, y a los 30 días fueron examinados utilizando sus piernas únicamente para marchar o impulsarse. No se registró jadeo. Cuatro animales fueron sacrificados el 23 de agosto de 1997. Las dos ratas que portaban el tubo silástic implantado mostraron algunos signos de crecimientos del tejido neuronal y dirigieron algún crecimiento a lo largo del eje de los tubos. Sin embargo, en las construcciones de tubo de tejido submucoso, los extremos cortados de la rama tibial parecían encontrarse reacoplados.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 2 Programa Experimental

1

Claims (16)

1. Construcción de injerto de tejido para la estimulación de la reparación de tejidos de tipo neurológico dañados o enfermos en un vertebrado de sangre caliente, comprendiendo dicha construcción un tejido submucoso intestinal delaminado a partir de la túnica muscular y como mínimo la parte luminal de la cubierta mucosa del intestino de un vertebrado de sangre caliente, o una digestión del mismo y un factor de crecimiento o desarrollo añadido.

2. Construcción de acuerdo con la reivindicación 1, en la que el factor de crecimiento es seleccionado entre factor de crecimiento nervioso y factor de crecimiento de fibroblasto.

3. Construcción de injerto de tejido de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el tejido submucoso comprende un tubo de tejido submucoso y un tejido submucoso fluidizado localizado en la cavidad luminal del tubo de tejido submucoso, en el que dicho tejido submucoso fluidizado es seleccionado a partir de tejido submucoso triturado y solubilizado o una fracción extraída del mismo.

4. Construcción de injerto de tejido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 - 3, que comprende:

un tubo biodegradable que tiene una cavidad luminal; y

dicha digestión de tejido submucoso intestinal localizado dentro de la cavidad luminal de dicho tubo, encontrándose combinado dicho tejido submucoso intestinal con el factor de crecimiento añadido.

5. Construcción de injerto de tejido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 - 4, en la que el factor de crecimiento añadido es un factor de crecimiento nervioso.

6. Construcción de injerto de tejido para la reparación de tejidos neurológicos, comprendiendo dicha composición un tubo biodegradable que presenta un diámetro de cavidad luminal de un tamaño adecuado para recibir el tejido nervioso; y

tejido submucoso fluidizado seleccionado a partir de tejido submucoso triturado y solubilizado, en el que dicho tejido submucoso fluidizado se encuentra situado en la cavidad luminal del tubo.

7. Construcción de injerto de tejido de acuerdo con la reivindicación 6, en la que el tubo biodegradable comprende tejido submucoso.

8. Construcción de injerto de tejido de acuerdo con la reivindicación 6, en la que el tubo biodegradable tiene un diámetro de cavidad luminal de 0,5 mm a 2 cm de manera aproximada.

9. Construcción de injerto de tejido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 - 8, comprendiendo de forma adicional un factor de crecimiento añadido.

10. Construcción de injerto de tejido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 - 9, que se encuentra configurada para actuar como puente de las estructuras de tejido neurológico endógeno para la inducción del crecimiento del tejido de tipo neurológico endógeno entre las estructuras de tejido neurológico conectadas.

11. Material biodegradable de sustituto de duramadre que comprende tejido submucoso intestinal delaminado a partir de la túnica muscular y como mínimo la parte luminal de la túnica mucosa de intestino de un vertebrado de sangre caliente, o una digestión del mismo, y formado como un injerto de tejido con forma de parche formado para cubrir un defecto u orificio en la duramadre endógena, en el cual los bordes del injerto de tejido con forma de parche se encuentran plegados hacia atrás sobre sí mismos para proporcionar zonas reforzadas para el acoplamiento con los tejidos endógenos.

12. Utilización del tejido submucoso de un vertebrado de sangre caliente para la fabricación de una construcción de injerto de tejido útil para la inducción de la reparación de tejido neurológico en un vertebrado de sangre caliente, comprendiendo dicho proceso de fabricación las etapas de combinación del tejido submucoso de un vertebrado de sangre caliente, o una digestión de dicho tejido, con un factor de crecimiento añadido seleccionado a partir de factor de crecimiento nervioso y factor de crecimiento de fibroblasto.

13. Utilización de acuerdo con la reivindicación 12 en la que el factor de crecimiento añadido es un factor de crecimiento nervioso.

14. Utilización de acuerdo con la reivindicación 12, en la que la construcción de injerto de tejido se encuentra configurada para actuar como puente entre estructuras neurológicas endógenas para realizar la inducción del crecimiento de tejidos neurológicos endógenos entre las estructuras de tejido neurológicas conectadas.

15. Utilización del tejido submucoso de un vertebrado de sangre caliente para la fabricación de una construcción de injerto de tejido útil para la inducción de la reparación del tejido neurológico en un vertebrado de sangre caliente, comprendiendo dicho proceso de fabricación las etapas de formación de un tubo de tejido submucoso teniendo un diámetro de cavidad luminal de 0,5 mm a 2 cm de manera aproximada y llenado dicha cavidad luminal de dicho tubo de tejido submucoso con el tejido submucoso fluidizado seleccionado a partir de tejido submucoso triturado y solubilizado.

16. Utilización de acuerdo con la reivindicación 15 en la cual los extremos del tubo de tejido submucoso se encuentran cerrados de forma estanca.