DE10146903C1

DE10146903C1 - Verfahren zur Herstellung von in vitro-Hohlorganen

Info

Publication number: DE10146903C1
Application number: DE10146903A
Authority: DE
Inventors: Birgit Schaefer; Stefan Carl; Christian Lorenz; Karl-Herbert Schaefer
Original assignee: Cytonet GmbH and Co KG
Current assignee: Cytonet GmbH and Co KG
Priority date: 2001-09-24
Filing date: 2001-09-24
Publication date: 2002-11-14
Anticipated expiration: 2021-09-25
Also published as: WO2003029446A2; WO2003029446A3

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung tierischer und menschlicher in vitro-Gewebe und/oder tierischer und menschlicher in vitro-Hohlorgane, insbesondere in vitro-Harnröhren-, in vitro-Harnleiter-, in vitro-Harnblasen-, in vitro-Samenleiter-, in vitro-Eileiter-, in vitro-Blutgefäß-, in vitro-Dünndarm- und in vitro-Dickdarm-Hohlorgane, die Verwendung dieser in vitro-Gewebe und in vitro-Hohlorgane zur Transplantation oder für Testzwecke sowie die Herstellung einer mit Fibroblasten besiedelten Matrix zur operativen Beseitigung und/oder Deckung von Fisteln.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung von Geweben oder Hohlorganen, insbeson dere Harnröhre, Harnleiter, Harnblase, Samenleiter, Eileiter, Blutgefäße, Dünndarm und Dickdarm, sowie Bindegewebe, die ausgehend von tierischen und menschlichen Gewebeproben eine organtypische Gewe beschichtung aufweisen und zur Transplantation in vivo oder für Testzwecke in vitro geeignet sind.

Zur Wiederherstellung oder Verbesserung von Formen oder Funktionen von menschlichen Organen und/oder Geweben stehen in der Chirurgie prinzipiell drei Verfahren zur Verfügung. Den Resektionsverfahren, bei denen zumeist kranke Organ- oder Gewebeteile operativ entfernt werden, stehen Implantations- und Transplantationsverfahren gegenüber. Bei einer Im plantation werden aus körperfremden Materialien be stehende Implantate zur Erfüllung bestimmter Er satzfunktionen für einen begrenzten Zeitraum oder auf Lebenszeit in den Organismus eingebracht, bei spielsweise Kunststoff-Implantate für den Ersatz von Sehnen und Gefäßen oder Metall- oder Keramik- Implantate für den Ersatz von Gelenken oder Kno chen.

Bei einer Transplantation werden Zellen, Gewebe o der Organe auf ein anderes Individuum oder auf eine andere Körperstelle des gleichen Individuums über tragen. Unter einer allogenen (homologen) Trans plantation wird eine Transplantation verstanden, bei der Spender und Empfänger der gleichen Spezies angehören, immungenetisch jedoch verschieden sind. Unter einer syngenen Transplantation wird eine Transplantation von einem immungenetisch identi schen Zwillingsgeschwister verstanden. Als autogene (autologe) Transplantation wird die Übertragung ei gener Zellen oder Gewebe auf andere Körperstellen des gleichen Individuums bezeichnet.

Der Erfolg einer allogenen Transplantation hängt wesentlich von der Art und dem Umfang der Immunre aktion seitens des Empfängers ab. Die Unterschiede im Antigenmuster bei Spender und Empfänger können im Empfängerorganismus eine Immunantwort gegen das Transplantat hervorrufen, die durch die genetisch determinierten Histokompatibilitätsantigene des Spendergewebes induziert wird. Dabei können sensi bilisierte Lymphozyten und/oder Antikörper gebildet werden, die gegen das Transplantat cytotoxisch wir ken. Letztendlich kann es zu einer Abstoßung des Transplantats kommen. Eine Abstoßungsreaktion kann perakut verlaufen, wobei es zu einem irreversiblen, medikamentös nicht beeinflußbaren Verlust des Transplantats kommt. Eine Abstoßungsreaktion kann auch chronisch verlaufen, wobei es über Wochen bis Jahre hinweg zu einem medikamentös kaum beeinfluß baren Funktionsverlust des Transplantats kommt.

Eine Transplantation kann auch zu einer Graft versus-host-reaction (GVH), das heißt einer Trans plantat-gegen-Wirt-Reaktion, führen. Nach der Über tragung von beispielsweise nicht-autologen immun kompetenten Zellen aus Knochenmark, Lymphknoten o der Milz vermitteln diese Zellen im Organismus des Empfängers zelluläre Immunreaktionen. Im gesunden Empfängerorganismus werden diese Zellen normaler weise rasch abgebaut. Bei Empfängern, bei denen die Immunabwehr durch Bestrahlung oder immunsuppressive Behandlung unterdrückt ist, kann die GVH zur Graft versus-host-disease führen, einer akuten oder chro nischen Erkrankung mit Leber- und Milzvergrößerung, Atrophie der lymphatischen Organe, Durchfall und Kachexie.

Ein weiteres großes Problem der Transplatationschi rurgie ist generell der Mangel an verfügbaren Spen dergeweben oder -organen. Dies führt dazu, dass es bei einigen Organtransplantaten Wartelisten für zu behandelnde Patienten gibt. Bei Herztransplantatio nen beispielsweise beträgt die Wartezeit derzeit etwa 12 Monate. Verschlechtert sich während der Wartezeit der Zustand eines Patienten sehr rasch, so kann die beeinträchtige Organfunktion oftmals nur mittels eines implantierten Unterstützungssys tems mechanisch überbrückt werden, um die akute Ge fahrensituation zumindest kurzzeitig zu beseitigen. Der Mangel an geeigneten Spendergeweben oder - organen macht sich besonders gravierend in der Un fallchirurgie bemerkbar, wo es darauf ankommt, in nerhalb kürzester Zeit die Funktion verletzter oder geschädigter Organe oder Gewebe wiederherzustellen beziehungsweise zu ersetzen.

Aufgrund des Mangels an verfügbaren Spendergeweben- oder -organen ist versucht worden, auf Organe von Primaten (konkordante Spezies) oder Nichtprimaten (diskonkordante Spezies) auszuweichen. Beispiels weise konnten mit Erfolg entsprechend vorbehandelte Hautstücke oder Teile von Blutgefäßen vom Schwein auf den Menschen übertragen werden. Andererseits endeten Transplantationen von ganzen Organen meist als katastrophale Mißerfolge. Die immunologischen Ursachen dafür sind nicht ohne weiteres zu erklä ren. Wahrscheinlich stellen präformierte Antikörper (sogen. natürliche Antikörper) das größte Problem bei einer solchen Xenotransplantation dar. Darüber hinaus gibt es noch andere Hinderungsgründe für ei ne Xenotransplantation, beispielsweise das sehr große Risiko einer Erregerübertragung.

In einigen Fällen wird auch versucht, Organdefekte oder -störungen dadurch zu beheben, dass Gewebe aus anderen Organen des gleichen Organismus transplan tiert werden. So erfolgt beispielsweise die chirur gische Sanierung der sogenannten neurogenen Harn blase, die bei Spina bifida-Patienten oder Quer schnittsgelähmten auftritt, dadurch, dass Darmseg mente in die Harnblase eingenäht werden. Es hat sich jedoch gezeigt, dass die Inkorporation von Darmschleimhaut in der Harnblase zu vermehrt auf tretenden Infektionen, Stoffwechselstörungen, wie Vitaminmangel, Steinbildung vermehrter Schleimpro duktion und zur Entstehung von Malignomen führt.

Als Alternative zu den bisherigen Transplantationen wurden daher in den letzten Jahren in vitro-Organ- oder Gewebesysteme entwickelt, die unter Verwendung definierter Zellen und/oder definierter Gewebe und unter definierten Kulturbedingungen hergestellt werden (sogen. Tissue engineering). Generell lassen sich solche in vitro-Organ- oder Gewebesysteme nicht nur zu Implantations- beziehungsweise Trans plantationszwecken einsetzen, sondern auch als in vitro-Testsysteme, um beispielsweise chemische Sub stanzen, wie potentielle Arzneimittel, oder Agen zien, wie Licht und Wärme, auf ihre Wirkungen und/oder Nebenwirkungen auf Gewebe oder Zellen zu untersuchen. Solche in vitro-Systeme können darüber hinaus für vielfältige immunologische, histologi sche und molekularbiologische Fragestellungen ein gesetzt werden. Die Untersuchungen beziehungsweise Tests von Substanzen oder Agenzien an solchen in vitro-Organ- oder Gewebesystemen bieten gegenüber Versuchen an Tieren oder Versuchen mit menschlichen Probanden einige Vorteile, insbesondere weil die Untersuchungen kostengünstiger und schneller durch geführt werden und Ergebnisse liefern können, die insbesondere im Vergleich zu Tierversuchen besser auf den Menschen übertragbar sind. Unter gegebenen Umständen ist sogar eine individuelle Vorhersage für den jeweils betroffenen Patienten bezüglich Ne benwirkungen möglich. Darüber hinaus unterliegt die Testung von Pharmaka an Tieren strengen Richtli nien, die einen großen bürokratischen Aufwand zur Folge haben. So müssen beispielsweise Tierversuchs genehmigungen eingeholt werden. Auch aus ethischen Erwägungen heraus stoßen Tierversuche zunehmend auf Ablehnung. In vitro-Organ- oder Gewebesysteme kön nen also wesentlich dazu beitragen, Tierversuche zu vermeiden.

Im Stand der Technik sind verschiedene Verfahren zur Herstellung von in vitro-Organen oder in vitro- Geweben beschrieben worden, die zur Wiederherstel lung oder als Ersatz für erkrankte oder geschädigte native Organe oder Gewebe eingesetzt werden können.

Die WO 99/00152 offenbart ein Verfahren zur Her stellung eines bioartifiziellen Transplantates, wo bei aus einem allogenen oder xenogenen Gewebe alle antigen-reaktiven Zellen durch enzymatische oder chemische Behandlung entfernt werden und das so ge wonnene zellfreie, nicht-denaturierte Material mit gewünschten autologen Zellen besiedelt wird, wo durch ein unmittelbar einsatzbereites Transplantat, beispielsweise Herzklappen, Knorpel, Trachea, Haut oder Cornea, erhalten wird.

Das US-Patent Nr. 4,963,489 beschreibt ein dreidi mensionales Zellkultursystem, das ein Grundgerüst umfasst, das aus einem biologisch verträglichen nicht-lebenden Material besteht, das biologisch ab baubar oder nicht-abbaubar sein kann. In diesem System können beispielsweise Fibroblasten, Endo thelzellen, Knochenmarkszellen und andere Zellen kultiviert werden, wobei das Wachstum der Zellen durch die Zugabe von Proteinen, wie Kollagen, oder Glycoproteinen verbessert werden kann. Die mit Hil fe dieses Systems hergestellten dreidimesionalen Gewebemodelle sollen auch in der Transplantation Verwendung finden.

Aus der WO 95/33821 ist ein Verfahren zur Herstel lung von Stroma-Gewebe bekannt, bei dem Stroma zellen, wie Chondrocyten, Fibroblasten, Nabel schnurzellen und ähnliche, innerhalb eines dreidi mensionalen Netzwerkes aus einem biologisch abbau baren Material, beispielsweise Baumwolle, Gelatine oder Kollagen, oder einem biologisch nicht abbauba ren Material, beispielsweise einem Polyester oder einem Polycarbonat, kultiviert werden, wobei die interstitiellen Bereiche durch die Stroma-Zellen überbrückt werden und die Kultivierung des Netzwer kes in einem Kulturmedium durchgeführt wird.

Das US-Patent Nr. 5,755,814 beschreibt ein Hautmo dellsystem, das sich sowohl als in vitro-Testsystem als auch für therapeutische Zwecke einsetzen lässt. Das System umfasst eine dreidimensionale vernetzte Matrix von unlöslichem Kollagen, wobei die Matrix entweder durch thermische Behandlung unter Wasser entzug oder auch durch chemische Mittel, beispiels weise Carbodiimid, vernetzt wird. In der Matrix werden Fibroblasten, auf der Matrix Keratinocyten kultiviert, wobei man ein Hautäquivalent erhält.

Das US-Patent 5,567,612 beschreibt eine Zellen des Urogenitaltraktes enthaltende Matrix zur Implanta tion in den Menschen, die ein biologisch abbauba res, biologisch verträgliches Polymer und Paren chymzellen des menschlichen Urogenitaltraktes um faßt. Das Matrix-Material kann beispielsweise aus Polyglycolsäure, Polymilchsäure, Polyanhydrid, Po lyorthoester und Kombinationen davon bestehen.

Die US 5,944,754 beschreibt ein Verfahren zur Gene rierung von neuem Gewebe auf der Oberfläche eines Säugergewebes oder -organs unter Verwendung einer lebende Säugerzellen enthaltenden Hydrogel- Zusammensetzung, wobei eine flüssige Zell-Hydrogel- Zusammensetzung als dünne Schicht direkt auf die zu behandelnde Oberfläche ausgebracht wird. Die flüs sige Zell-Hydrogel-Zusammensetzung verfestigt sich unter Ausbildung einer Matrix und die darin enthal tenen Zellen bilden anschließend ein neues Gewebe. Zur Bildung des Hydrogels können Polysaccharide wie Alginate, Polyphosphazene und Polyacrylate verwen det werden. Zur Verbesserung der Adhäsion der Zell- Hydrogel-Zusammensetzung auf der behandelten Organ oberfläche kann ein biologisch verträglicher Kleb stoff wie Methacrylat oder Methyl-α-cyanoacrylat eingesetzt werden. Die zu behandelnde Oberfläche kann innerhalb oder außerhalb des Körpers liegen.

Die US 5,762,966 offenbart die Verwendung einer aus Vertebraten stammenden Submucosa-Matrix als Trans plantat für geschädigte Harnblasen-Bereiche. Als Beispiel wird die Verwendung von intestinalem Tuni ca submucosa-Gewebe vom Hund als Xenograft im Schwein beschrieben.

Die US 5,851,833 beschreibt ein Verfahren zur Iso lierung und Kultivierung von Säuger-Urothelzellen, wobei die Zellen auf einer biologisch verträgli chen, biologisch abbaubaren polymeren Matrix kulti viert werden. Die die kultivierten Zellen enthal tende Matrix kann zur Wiederherstellung oder als Ersatz für geschädigtes Urothelgewebe verwendet werden. Die Matrix selbst besteht aus Polymeren wie Polyglycolsäure oder Polymilchsäure. Gegebenenfalls kann die Anlagerung der Urothelzellen an die Matrix verbessert werden, indem die Polymermatrix mit Ba salmembran-Verbindungen, Agar, Gelatine, Kollagen, Fibronectin etc. beschichtet wird. Die verwendeten Zellen können in vitro an der Matrix proliferieren, und anschließend zusammen mit der Matrix in einen Empfängerorganismus eingebracht werden. Die Zellen können aber auch unmittelbar nach Adhäsion an der Matrix in den Empfänger übertragen werden.

Die WO 98/06445 beschreibt ein Verfahren zur Ver mehrung oder Wiederherstellung von Gewebe unter Verwendung isolierter Blasen-Mucosa. In einem Bei spiel wird gezeigt, dass eine allogene Blasen- Mucosa, auf die in vitro vermehrte Urothel- und Muskelzellen ausgesät/aufgebracht wurden, nach In kubation in vitro und Transplantation in Rezipien ten neues Blasengewebe bilden kann, das sich histo logisch und funktionell nicht von nativem Blasenge webe unterscheiden läßt.

Die WO 98/10775 beschreibt ein Gewebetransplantat zur Förderung der Wiederherstellung von geschädig ten Gewebestrukturen warmblütiger Vertebraten, die mit dem Nervensystem im Zusammenhang stehen, wobei das Transplantat intestinales Submucosa-Gewebe ei nes warmblütigen Vertebraten und/oder einen Verdau davon sowie einen Wachstumsfaktor umfaßt. Bei dem Wachstumsfaktor handelt es sich um einen Gefäße pithel-Wachstumsfaktor, Nerven-Wachstumsfaktor oder Fibroblasten-Wachstumsfaktor. Das mit dem Wachs tumsfaktor behandelte Submucosa-Gewebe kann entwe der direkt transplantiert oder nach enzymatischem Verdau in fluidisierter Form injiziert werden. Das Verfahren wird beispielsweise zur Regeneration von Rückenmark, Neuroglia, Dura mater, Pia mater und Arachnoidea eingesetzt.

Gabella und Uvelius beschreiben in Neurosciences, 83 (1998), 645-653, die Transplantation eines gro ßen Teils des Ganglion pelvinum erwachsener Ratten in die Harnblase der gleichen Tiere. Bei allen Ganglion-Transplantaten blieb der allgemeine Aufbau im wesentlichen erhalten. Zum Zeitpunkt der Trans plantation degenerierten zwar die Synapsen, später bildeten sich jedoch neue Synapsen. Insgesamt zeig te sich, dass die ins Blasengewebe transplantierten Becken-Nervenzellen unter Erhaltung ihrer Morpholo gie langfristig überleben und wachsen konnten.

Die im Stand der Technik bekannten in vitro-Organe oder in vitro-Gewebe weisen zahlreiche Nachteile auf. So wirkt sich bei vielen dieser Systeme häufig nachteilig aus, dass die zur Herstellung verwendete Matrix teilweise oder vollständig aus körperfremden Materialien besteht. Bei Verwendung solcher Materi alien ergeben sich nach erfolgter Transplantation beziehungsweise Implantation oft mechanische, strukturelle, funktionelle oder Verträglichkeits probleme. Beispielsweise hat sich gezeigt, dass ar tifizielle Blasenwand-Grafts, die unter Verwendung permanenter, das heißt biologisch nicht-abbaubarer, synthetischer Materialien hergestellt wurden, nach einer bestimmten Zeit im Körper mechanisch versa gen. Darüber hinaus kommt es bei solchen Grafts häufig zu einer sehr starken Bildung von Harnstein. Artifizielle Blasen-Grafts, die unter Verwendung von biologisch abbaubaren Matrixmaterialien herge stellt wurden, führen andererseits im Lauf der Zeit zur Ablagerung von Fibroblasten, zur Vernarbung, zur Kontraktur, das heißt dauerhaften Verkürzung, des Transplantats und zu einem verminderten Reser voirvolumen.

Probleme haben sich auch bei Matrizes gezeigt, die auf Kollagen basieren. So konnten zwar in einigen Fällen Kollagen-Matrizes enthaltende Blasengrafts relativ langfristig die Funktion des nativen Organs ersetzen, in den meisten Fällen wurden sie jedoch undefinierten Schrumpfungsprozessen unterworfen. Zumindest bei einigen Kollagen-Matrizes scheint dies mit deren spongiösen, quervernetzten Struktur, die untypisch für lebendes Gewebe ist, im Zusammen hang zu stehen.

Ein anderer Nachteil vieler im Stand der Technik beschriebener in vitro-Organe oder in vitro-Gewebe besteht darin, dass sie selbst nach längerer Ver weilzeit im Körper nicht die Gewebeschichtung auf weisen beziehungsweise ausbilden, die dem morpholo gischen Aufbau des nativen Gewebes oder Organs ent spricht. Dies bedeutet, dass diese in vitro-Organ- oder Gewebesysteme im Körper auch keinen vollstän digen funktionellen Ersatz für native Organe oder Gewebe darstellen.

Bei einigen der bekannten Verfahren zur Herstellung von in vitro-Organ- oder Gewebesystemen ist des Weiteren nicht gewährleistet, dass die verwendeten Zellen, sofern es sich um bereits weitestgehend differenzierte Zellen handelt und diese Zellen in vitro einer Kultivierung unterworfen werden, nach mehreren Kultivierungs-Passagen auch ihren natürli chen Stoffwechsel aufrecht erhalten. Dieses Problem ist insbesondere bei der Kultivierung von Knorpel zellen bekannt, die im Verlauf der Kultivierung häufig einer Dedifferenzierung unterliegen. Es be trifft aber auch andere Zelltypen.

Viele der bekannten dreidimensionalen Strukturen zur Kultivierung von Zellen können häufig dem je weiligen Organ- oder Gewebedefekt nicht spezifisch angepasst werden. Ein großer Nachteil besteht eben falls darin, dass sich viele der artifiziellen Grafts nur zur Wiederherstellung beziehungsweise zum Ersatz relativ kleiner beschädigter oder er krankter Bereiche eines Organs eignen, nicht jedoch zum Ersatz eines ganzen Organs. Weiterhin ist nicht gewährleistet, dass die artifiziellen Organ- oder Gewebegrafts dauerhaft und differenziert an der Stelle des Defektes verbleiben und damit die Rege neration des entsprechenden Organs oder Gewebes o der deren Funktionsübernahme ermöglichen.

Ein erheblicher Nachteil der im Stand der Technik bekannten in vitro-Organe oder in vitro-Gewebe be steht nicht zuletzt darin, dass ihre Herstellung oft mehrere Wochen dauert. Die relativ lange Her stellungszeit stellt insbesondere dann einen großen Nachteil dar, wenn eine schnelle Wiederherstellung oder ein schneller Ersatz eines beschädigten oder erkrankten Gewebes oder Organs erforderlich ist, beispielsweise nach einem Unfall oder bei einer ra piden Verschlechterung des Zustandes eines Patien ten.

Das der vorliegenden Erfindung zugrunde liegende technische Problem besteht also darin, Verfahren und Mittel zur Herstellung menschlicher oder tieri scher in vitro-Gewebe oder in vitro-Organe bereit zustellen, die die vorstehend beschriebenen Nachteile im Stand der Technik überwinden und die sich insbesondere dazu eignen, diese in vitro- Organ- oder Gewebesysteme in sehr kurzer Zeit her zustellen, wobei die Gewebeschichtung der so herge stellten Gewebe oder Organe weitestgehend den nati ven menschlichen oder tierischen Geweben oder Orga nen entspricht und wobei sich die so hergestellten Gewebe oder Organe insbesondere zur Verwendung als dauerhaftes funktionsfähiges Transplantat oder als Testsystem eignen.

Die Erfindung löst das ihr zugrunde liegende Prob lem insbesondere durch die Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung eines ein- oder mehr schichtigen menschlichen oder tierischen in vitro- Gewebes oder eines vollständigen oder partiellen, menschlichen oder tierischen in vitro-Hohlorgans, umfassend, vorzugsweise in der angegebenen Reihen folge:

a) das Behandeln einer biologisch verträgli chen, biologisch abbaubaren oder nicht abbau baren plattenförmigen Matrix mit einem biolo gisch verträglichen, biologisch abbaubaren Klebemittel oder konditioniertem Medium,
b) das Ausbringen von isolierten gewebe- oder organtypischen oder gewebe- oder organuntypi schen mesenchymalen und/oder epithelialen Ge webestücken einer Biopsie auf die Matrix zum Auswachsen der primären Zellen, das heißt An setzen einer Explantkultur, und/oder das Aus säen von mindestens einem Typ einer isolierten differenzierten oder nicht-differenzierten ge webe- oder organtypischen oder gewebe- oder organuntypischen Zelle, die zuvor in vitro kultiviert und vermehrt wurde, in geringer Zelldichte auf der Matrix,
c) das Aussäen von isolierten, gewebe- oder organtypischen oder gewebe- oder organuntypi schen, neurogenen Zellen in geringer Zelldich te auf der Matrix,
d) das Kultivieren der Explant-Zellen und/oder zuvor in vitro kultivierte Zellen und neuroge ne Zellen enthaltenden Matrix unter geeigneten Bedingungen,
e) das Schneiden der Matrix in gewünschter Form und Größe und/oder Ausformen der Matrix zu einem Hohlorgan.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist also dadurch ge kennzeichnet, dass zunächst eine biologisch ver trägliche, biologisch abbaubare, plattenförmige Matrix mit einem biologisch verträglichen, biolo gisch abbaubaren Klebemittel oder konditioniertem Medium behandelt, insbesondere beschichtet, be sprüht oder getränkt wird. Anschließend werden epi theliale oder mesenchymale Gewebestücke und/oder zuvor in vitro kultivierte und vermehrte Zellen, die typisch für das herzustellende Gewebe oder Or gan sind, auf die behandelte Matrix aufgebracht. Danach werden isolierte neurogene Zellen auf der behandelten Matrix ausgesät. Erfindungsgemäß ist insbesondere vorgesehen, dass auf der Unterseite der Matrix neurogene Zellen sowie Muskelzellen und Fibroblasten aufgebracht werden, während auf der Oberseite der Matrix Epithelzellen aufgebracht wer den. Die zellhaltige Matrix wird kurzzeitig in vitro kultiviert und nach der Kultivierung und un mittelbar vor der Verwendung als Transplantat in die gewünschte Form gebracht. Entweder wird die zellbesiedelte Matrix-Platte so zurechtgeschnitten, dass sie der Form eines zu behandelnden Gewebede fekts angepaßt ist, oder sie wird zu einem Hohlor gan ausgeformt, beispielsweise in eine Zylinder- oder Blasenform gebracht.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von in vitro-Geweben oder in vitro-Organen, insbesonde re in vitro-Hohlorganen, weist gegenüber den im Stand der Technik beschriebenen Verfahren mehrere entscheidende Vorteile auf, die unter anderem aus der erfindungsgemäßen Verwendung eines Klebemittels oder konditionierten Mediums resultieren. Überra schenderweise hat sich gezeigt, dass durch die er findungsgemäße Behandlung der Matrix mit einem Kle bemittel oder einem konditionierten Medium die Her stellungsdauer für ein in vitro-Gewebe oder in vitro-Organ gegenüber den im Stand der Technik be schriebenen Verfahren insgesamt wesentlich verkürzt wird.

Da die Matrix vor dem Aussäen der Zellen mit dem Klebemittel oder konditioniertem Medium behandelt wird, besitzen die ausgesäten Zellen beziehungswei se die aufgebrachten Explantkultur-Zellen eine er heblich verbesserte Haftung an der Matrix. Überra schenderweise hat sich gezeigt, dass, wenn das er findungsgemäße in vitro-Hohlorgan oder in vitro- Gewebe unter Verwendung isolierter, zuvor in vitro kultivierter und vermehrter Zellen hergestellt wird, aufgrund der verbesserten Adhäsion der Zellen an der Matrix gegenüber den Stand der Technik be schriebenen Verfahren wesentlich weniger Zellen auf die Matrix ausgebracht werden müssen. Das wiederum bedeutet, dass die in vitro-Vorkultivierung der später auf der Matrix auszusäenden Zellen erheblich verkürzt werden kann. Die in vitro-Vorkultivierung dient primär dazu, ausreichend Zellmaterial zum Aussäen auf die Matrix zur Verfügung zu stellen. Da entsprechend dem erfindungsgemäßen Verfahren weni ger Zellen zum Aussäen benötigt werden, kann somit die Vorkultivierung der Zellen erheblich verkürzt werden, weil eine geringere Zelldichte erreicht werden muss. Insbesondere bei Verwendung als Trans plantat kann auch die Kultivierung der gewebe- oder organtypische Zellen und neurogene Zellen enthal tenden Matrix aufgrund der verbesserten Adhäsion der Zellen an der Matrix wesentlich verkürzt wer den. Beispielsweise reicht es aus, die Matrix mit den Zellen nur wenige Stunden, vorzugsweise die Nacht über zu kultivieren, bis die darauf ausgesä ten/aufgebracht Zellen einen (semi-)konfluenten Zellmonolayer bilden. Bei Verwendung von Explant kulturen kann der Zeitraum von der Biopsieentnahme bis zum fertigen Transplantat auf zwei Wochen ver kürzt werden. Die Zellen enthaltende Matrix kann also bereits nach sehr kurzer Kultivierung zur Transplantation verwendet werden, obwohl die darauf enthaltenen Zellen noch keine vollständigen und funktionsfähigen Gewebeschichten ausgebildet haben, sondern nur (semi-)konfluente Monolayer. Soll die zellhaltige Matrix als Testsystem verwendet werden, kann sie natürlich auch so lange kultiviert werden, bis die organtypischen Gewebeschichten des ge wünschten Zielorgans vollständig ausgebildet sind.

Bei Verwendung der zellhaltigen Matrix zu Trans plantationszwecken wird die vollständige Ausbildung der einzelnen organtypischen Gewebeschichten und somit die vollständige Funktionsfähigkeit des in vitro hergestellten Transplantats erfindungsgemäß erst in vivo erreicht. Diese bevorzugte erfindungs gemäße Vorgehensweise ahmt daher durch das Setzen von in vitro generierten "Zellinseln" in vorteil hafter Weise den primären Wundheilungsprozess nach. Vorteilhafterweise werden die auf der transplan tierten Matrix enthaltenen Zellen der (semi-)kon fluenten Monolayer in vivo, das heißt im Organis mus, in den die zellhaltige Matrix als Transplantat eingebracht wurde, über Diffusionsprozesse ernährt. Im Gegensatz dazu könnten vollständig ausgebildete Gewebeschichten in vivo erst dann ernährt werden, wenn eine Vaskularisierung dieser Gewebe stattge funden hat.

Die erfindungsgemäß verwendete Matrix wirkt sich sowohl auf die Ausbildung der Zellmonolayer in vitro als auch auf die Ausbildung der vollständigen organtypischen Gewebeschichten in vivo vorteilhaft aus. Bei der Matrix handelt es sich vorzugsweise um eine aus einer biologischen Quelle stammende oder aus einem biologischen Material hergestellte acel luläre Matrix, die vorzugsweise aus Kollagen oder anderen Stoffen, beispielsweise Chitosan, besteht und darüber hinaus eine Vielzahl anderer Substan zen, wie Chondroitinsulfat, Fibronectin und Wachs tumsfaktoren, enthält. Dadurch werden die auf der Matrix enthaltenen Zellen mit Nährstoffen versorgt und gleichzeitig wird nach Transplantation in den Organismus die Regeneration vieler Gewebe geför dert. Die Matrix wird in vivo nach der Regeneration der einzelnen Gewebeschichten des in vitro-Gewebes oder -Organs entweder komplett abgebaut oder ver bleibt dauerhaft im Organismus.

Durch die Einbeziehung neurogener Zellen im erfin dungsgemäßen Verfahren wird erreicht, dass in vivo die Vaskularisierung der transplantierten zellhal tigen Matrix schneller erfolgt, da das Einwachsen von Zellen aus den Wundrändern stark beschleunigt wird. Die auf der Matrix enthaltenen neurogenen Zellen bewirken, dass nach Abschluss der Gewebebil dungs- und Wundheilungsprozesse im Körper ein auch unter nervösen Gesichtspunkten funktionsfähiger Or ganersatz erhalten wird.

Mit Hilfe der erfindungsgemäßen Verfahren werden somit tierische oder humane in vitro-Gewebe- oder Organsysteme erhalten, die bereits nach kurzer Zeit transplantiert werden können, wobei die vollständi ge Ausbildung der organtypischen Gewebeschichten in vivo erfolgt. Dadurch wird erreicht, dass die transplantierten in vitro-Hohlorgane oder in vitro- Gewebe bezüglich ihres Aufbaus weitgehend den nati ven Organen oder Geweben entsprechen und somit die Funktion der ersetzten nativen Organe oder Gewebe in vivo übernehmen können. Da die verwendeten Mate rialien keine immunogenen Stoffe enthalten, werden Abstoßungsreaktionen seitens des Empfängerorganis mus minimiert und die Überlebenszeit der Transplan tate wird wesentlich erhöht. Die erfindungsgemäß hergestellten in vitro-Gewebe oder in vitro-Organe können nach entsprechender Kultivierung auch in vitro für Testzwecke verwendet werden, um bei spielsweise die Wirkung potentieller Medikamente auf einzelne Zelltypen, einzelne Gewebeschichten oder ein vollständiges Gewebe oder Organ zu unter suchen.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung be deutet der Begriff "biologisch verträgliche, biolo gisch abbaubare oder nicht abbaubare plattenförmige Matrix" eine ebene flache Struktur, an der Zellen haften und sich vermehren können, wobei die Be standteile dieser Struktur im Körper eines Rezi pienten keine immunologischen, toxischen oder sons tigen Reaktionen hervorrufen und im Körper des Re zipienten metabolisiert werden können, wobei auch die Metabolisierungsprodukte keine immunologische oder toxischen Reaktionen hervorrufen und darüber hinaus im Fall der abbaubaren Matrix im Körper des Rezipienten gut resorbierbar sind. Die erfindungs gemäß verwendete biologisch verträgliche Matrix zeichnet sich daher auch durch gute Resorbierbar keit aus. Vorzugsweise besteht die Matrix haupt sächlich aus Kollagen oder anderen Stoffen wie z. B. Chitosan oder einem Gemisch davon. Darüber hinaus enthält die erfindungsgemäß verwendete Matrix vor zugsweise Substanzen, die das Wachstum und/oder die Vermehrung der an ihr haftenden Zellen fördern. Die erfindungsgemäß verwendete Matrix kann natürlichen Ursprungs sein oder synthetisch hergestellt worden sein. Vorzugsweise ist sie acellulär. Das heißt, obwohl sie beispielsweise aus einer biologischen Quelle, beispielsweise einem Gewebe, stammen kann, enthält sie aufgrund ihrer Aufarbeitung keine Zell strukturen, sondern nur ein Kollagengerüst, das weitestgehend der komplexen extrazellulären Matrix entspricht, oder ein Gerüst anderer Stoffe, wie z. B. ein Chitosan-Gerüst. Die erfindungsgemäß ver wendete Matrix ist in der räumlichen Projektion e ben, das heißt, sie weist vor und während des er findungsgemäßen Verfahrens beispielsweise die Form einer Platte auf. Sie besitzt jedoch eine solche Elastizität oder Flexibilität, dass sie im letzten Schritt des erfindungsgemäßen Verfahren zu einem dreidimensionalen Körper, beispielsweise einen Zy linder, ausgeformt werden kann. Die erfindungsgemäß eingesetzte Matrix zeichnet sich daher auch durch eine gute Formbarkeit aus.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung handelt es sich bei der verwendeten biologisch ab baubaren, biologisch verträglichen Matrix um eine Kollagen-haltige Matrix.

In einer besonders bevorzugten Ausgestaltung ist die Kollagen-haltige Matrix eine VET-BIO-SIS T™- Matrix von Cook Deutschland GmbH, Mönchengladbach, Deutschland. Diese im Handel erhältliche Matrix wird aus der Dünndarm-Submucosa vom Schwein herge stellt. Sie ist bereits desinfiziert, so dass alle Bakterien und viralen Komponenten entfernt sind. Sie enthält Kollagen vom Typ I, III und V sowie Fibronectin, Decorin, Hyaluronsäuren, Chondroitin sulfat A, Heparinsulfate und Wachstumsfaktoren, insbesondere TGFβ und bFGF. Die VET-BIO-SIS-T- Matrix wird üblicherweise als operatives Patch zur Wiederherstellung und Verstärkung von Gewebe ver wendet. Die Matrix unterstützt die Wundheilung und Gewebeneuformung durch Herstellung eines biologisch verträglichen absorbierbaren Stützgewebes, das als Gerüst für das Gewebewachstum dient. Die VET-BIO- SIS T™-Matrix ist vor allem zur Herstellung von tierischen in vitro-Geweben beziehungsweise in vitro-Hohlorganen geeignet, nicht jedoch zur Her stellung menschlicher Gewebe oder Organe.

In einer anderen besonders bevorzugten Ausgestal tung der Erfindung handelt es sich bei der verwen deten Kollagen-haltigen Matrix um die Stratasis™- Matrix von Cook Urological, Spencer, Indiana, USA. Wie die VET-BIO-SIS-T™-Matrix wird die Stratasis™- Matrix ebenfalls aus der Dünndarm-Subsubmucosa vom Schwein hergestellt. Statasis™-Matrix ist insbe sondere zur Herstellung von menschlichen in vitro- Geweben oder menschlichen in vitro-Hohlorganen ge eignet.

In einer weiteren besonders bevorzugten Ausgestal tung der Erfindung wird die verwendete Kollagen haltige Matrix unter Verwendung von rekombinantem humanem Kollagen vom Typ I und/oder von rekombinan tem humanem Kollagen vom Typ III hergestellt. Bei Kollagen vom Typ I handelt es sich um Kollagen, das vorwiegend in Haut, Knochen und Sehnen vorkommt, während das hämostatischere Kollagen vom Typ III hauptsächlich in Blutgefäßen vorkommt. Die Verwen dung einer aus rekombinantem humanem Kollagen be stehenden Matrix zur Herstellung eines in vitro- Organs oder in vitro-Gewebes bietet gegenüber der Verwendung einer Matrix, die aus einer natürlichen Quelle, wie der Dünndarm-Subsubmucosa vom Schwein isoliert wurde, mehrere entscheidende Vorteile. Da das in einer solchen Matrix enthaltene Kollagen menschlichen Ursprungs ist, wird das Potential für Immunreaktionen erheblich gesenkt. Eine rekombinan tes humanes Kollagen enthaltende Matrix ist im Ge gensatz zu einer aus natürlichen Quellen isolierten Matrix auch frei von pathogenen Agenzien, wie bak teriellen Keimen, Viren, Prionen und ähnlichen.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung handelt es sich bei der verwendeten bio logisch abbaubaren, biologisch verträglichen Matrix um eine Chitosan-haltige Matrix. Chitosan ist ein Substanzgemisch, das bei Zerlegung von Chitin durch alkalische Mittel erhalten wird. Bei Chitin handelt es sich um ein Aminozucker-haltiges Polysaccharid, das aus tierischen Organismen, insbesondere Arthro poden, aber auch aus der Zellwand von Pilzen iso liert werden kann. Chitin besteht aus Ketten von β- 1,4-glykosidisch verknüpften N-Acetyl-D-glucosamin- (NAG)-Resten. Bei Chitosan handelt es sich um Chi tin, das in unterschiedlichem Maße desacetyliert und depolymerisiert sein kann. Verfahren zur Her stellung von Chitosan sind beispielsweise in Malet te et al., Ann. Thor. Surg., 36 (1983), 55, be schrieben. Chitosan besitzt gel- und filmbildende Eigenschaften. Untersuchungen haben gezeigt, dass Chitosan das exophytische Wachstum von Kallus bei der Regeneration von Knochengewebe reduzieren kann und das Einwachsen vaskulärer glatter Muskeln in vaskuläre Grafts fördert (Malette et al., in: Chi tin in Nature and Technology (Herausgeber Muzzarel li, Jeuniaux und Gooday), (1986), 435-442, Plenum Press, New York). Auch wurde gezeigt, dass Chitosan keine nachteilige Wirkung auf den Heilungsprozess urogenitaler Wunden ausübt (Bartone und Adickes, J. Urol., 140 (1988), 1134-1137). In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist vorgesehen, zur Herstellung einer Matrix insbesondere Chitosan ein zusetzen, das zu etwa 80% bis zu etwa 90% deacety liert ist und ein Molekulargewicht von 600 000 bis 800 000 aufweist.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einem "Klebemittel" eine Substanz oder ein Substanzgemisch verstanden, mit dem Gewebe oder Zellen miteinander oder mit einer Matrix verbunden werden können, wobei die Adhäsion, das heißt die Haftung der Zellen oder Gewebe aneinander oder an der Matrix verbessert wird. Das erfindungsgemäß verwendete Klebemittel ist vorzugsweise biologisch verträglich und biologisch abbaubar, das heißt, es enthält keine Bestandteile, die im Körper eine to xische, immunologische oder sonstige Reaktion her vorrufen. Die Bestandteile des erfindungsgemäß ver wendeten Klebemittels werden im Körper metaboli siert, wobei die Metabolisierungsprodukte ebenfalls keine immunologischen oder toxischen Reaktionen hervorrufen.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Fibrin-Kleber als Klebemittel eingesetzt. Ein Fibrin-Kleber ist da durch gekennzeichnet, dass er Fibrinogen- und Thrombin-Bestandteile enthält. Vorzugsweise liegen diese beiden Hauptkomponenten des Fibrin-Klebers zunächst getrennt vor und kommen erst beim eigent lichen Verkleben der Gewebe und/oder Zellen mit der Matrix in Kontakt. Bei der Verklebung von Geweben und/oder Zellen mit einer Matrix unter Verwendung eines aus zwei Komponenten bestehenden Fibrin- Klebers wird vorzugsweise zunächst die Matrix mit der Fibrinogen-Komponente, beispielsweise einer Fibrinogen enthaltenden Lösung behandelt, indem die Matrix beispielsweise in dieser Fibrinogen-Lösung getränkt wird oder die Fibrinogen-Lösung auf die Matrix gesprüht wird. Die Thrombin-Komponente wird vorzugsweise erst später zusammen mit den auszusä enden gewebetypischen Zellen und/oder neurogenen Zellen auf die Matrix aufgetragen.

Bei Anwendung eines Fibrin-Klebers laufen Prozesse ab, die im wesentlichen der letzten Phase der Blut gerinnung beispielsweise beim Wundverschluß ent sprechen. Bei der Verklebung der Zellen an der Mat rix wird, ebenso wie bei der Blutgerinnung, Fibri nogen durch Thrombin unter Abspaltung der Fibrino peptide A und B zu monomerem Fibrin umgesetzt. Mo nomeres Fibrin seinerseits bildet spontan durch End-zu-End- und Seit-zu-Seit-Anlagerung aggregier tes Fibrin. In Gegenwart von Calciumchlorid, das beispielsweise in handelsüblichen Fibrin-Klebern enthalten ist, wird das aggregierte Fibrin dann in polymeres Fibrin umgewandelt, wobei sich kovalente Bindungen zwischen benachbarten γ- und α-Ketten der Fibrinmonomere bilden. Nachdem die zellhaltige Mat rix als Transplantat in einen Körper eingebracht wurde, fördert das durch den Fibrin-Kleber gebilde te polymere Fibrin wie bei der normalen Wundheilung z. B. das Einsprossen von Fibroblasten in das Wund gebiet, wobei Fibrin die Funktion einer Leitschiene übernimmt. Dieser Prozess stellt ein multifakto rielles Geschehen dar, bei dem Thrombin, Fibrin und Faktor XIII eine stimulierende Wirkung auf die Fibroblastenproliferation ausüben. Danach setzt im Körper der allmähliche proteolytische Abbau des Fi brinnetzes ein.

In besonders bevorzugter Ausführungsform der Erfin dung handelt es sich bei dem Fibrin-Kleber um einen handelsüblichen Fibrin-Kleber zur biologischen Wundversorgung, beispielsweise um Tissucol®-Fibrin- Kleber. Tissucol®-Fibrin-Kleber enthält neben Thrombin und Fibrinogen Calciumchlorid und geringe Mengen an Plasminogen, welches in vivo durch Kal likrein und andere Gewebefaktoren zu Plasmin umge setzt und somit die Fibrinolyse in Gang setzt. Das durch den Fibrin-Kleber gebildete Fibrin wird somit im Körper allmählich abgebaut.

Die Erfindung betrifft auch die Verwendung des vor stehend definierten Klebemittels, insbesondere Fi brin-Klebers, zur Herstellung von menschlichen oder tierischen ein- oder mehrschichtigen in vitro- Geweben oder vollständigen oder partiellen Hohlor ganen.

In einer weiteren besonders bevorzugten Ausfüh rungsform der vorliegenden Erfindung wird die Mat rix mit konditioniertem Medium vorbehandelt. Kondi tioniertes Medium ist dadurch gekennzeichnet, dass es 24 Stunden mit den zu transplantierenden Zellen vor deren Aufbringen auf die Kollagenmembran kulti viert wurde. Durch diese Kultivierung wird das Me dium mit von den Zellen freigesetzten Wachstumsfak toren angereichert. Die Vorbehandlung der Kollagen membran mit konditioniertem Medium bewirkt ein ver bessertes Anhaften, Proliferieren und Überleben der Zellen auf der Membran.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist vorgesehen, dass zur Herstellung eines ein- o der mehrschichtigen menschlichen oder tierischen in vitro-Gewebes oder eines vollständigen oder par tiellen, menschlichen oder tierischen in vitro- Hohlorgans mindestens ein Typ, vorzugsweise jedoch mehrere Typen, von isolierten differenzierten oder nicht-differenzierten gewebe- oder organspezifi schen oder gewebe- und organunspezifischen Zellen, die zuvor in vitro kultiviert und vermehrt wurden, in geringer Zelldichte auf der mit einem Klebemit tel oder konditioniertem Medium vorbehandelten Mat rix aufgebracht werden.

In einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden zur Herstellung eines ein- oder mehrschichtigen menschlichen oder tierischen in vitro-Gewebes oder eines vollständigen oder par tiellen, menschlichen oder tierischen in vitro- Hohlorgans epitheliale und/oder mesenchymale Zel len, die aus Gewebeanteilen einer Biopsie als soge nannte Explantkulturen gewonnen werden, auf der mit einem Klebemittel oder konditioniertem Medium vor behandelten Matrix aufgebracht. Die Explantkulturen aus mukosalen bzw. submukosalen Gewebsanteilen wer den hierbei direkt auf der Membran angelegt. Dabei wird das als Biopsie gewonnene Gewebe mittels einer Schere in einen mukosalen und einen submukosalen Teil getrennt. Die jeweiligen Gewebsanteile werden in ca. 2 × 2 mm² große Stückchen zerkleinert und auf die Membran aufgebracht. Die mukosalen Gewebs stückchen werden im Fall der Kollagenmembran auf die glatte Seite, die submukosalen Gewebsstückchen auf der rauen Seite aufgebracht. Die Kulturen wer den dann für 10 bis 14 Tage inkubiert.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden epitheliale und/oder mesenchymale Zellen, die aus Gewebeanteilen einer Biopsie als sogenannte Explantkulturen gewonnen werden, und i solierte, zuvor in vitro kultivierte und vermehrte Zellen kombiniert auf der vorbehandelten Matrix ausgebracht, um ein in vitro-Gewebe oder ein in vitro-Hohlorgan herzustellen. Beispielsweise kann die Membran gleichzeitig mit epithelialen Zellen, die mittels Explantkultur vermehrt werden, und mit Muskelzellen und Fiboblasten, die zuvor in vitro vermehrt wurden, besiedelt werden.

Die auszusäenden isolierten Zellen und/oder Explantkultur-Zellen werden im Allgemeinen so aus gewählt, dass sie mit dem in vitro herzustellenden Zielorgan oder Zielgewebe kompatibel sind. Vorzugs weise handelt es sich bei den ausgesäten Zellen und/oder Explantkulturzellen um Zellen, die norma lerweise in dem herzustellenden Zielorgan oder Zielgewebe vorgefunden werden. Besteht das herzu stellende in vitro-Gewebe oder -Organ aus mehreren histologisch und funktionell unterscheidbaren Gewe beschichten und/oder Zellanhäufungen, werden für jede Gewebeschicht und jede Zellanhäufung typische Zelltypen ausgesät oder aufgebracht, wobei die er findungsgemäß erhaltene Schichtung der Zelltypen in bevorzugter Ausführung der natürlichen Schichtung gleicht. So werden beispielsweise zur Herstellung einer in vitro-Harnblase Urothelzellen, Muskelzel len, Fibroblasten und neurogene Zellen ausgesät o der aufgebracht. Zur Herstellung einer in vitro- Darmwand werden beispielsweise Mucosazellen, Mus kelzellen, Fibroblasten und neurogene Zellen ausge sät oder aufgebracht.

Der Ausdruck "in geringer Zelldichte aussäen" be deutet, dass pro cm² Matrix-Oberfläche 0,01 × 10⁶ Zellen bis 1 × 10⁷ Zellen, vorzugsweise 0,05 × 10⁶ Zellen bis 2 × 10⁶ Zellen ausgesät oder aufgebracht werden. Vorzugsweise werden pro cm² Matrix- Oberfläche 0,1 bis 0,5 × 10⁶ Urothelzellen und Mus kelzellen und 0,01 bis 0,05 × 10⁶ Fibroblasten aus gesät oder aufgebracht.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung um fasst der Begriff "Zelle" insbesondere isolierte, natürlicherweise vorkommende oder gentechnisch ver änderte menschliche oder tierische Zellen oder de ren Vorläufer. Natürlicherweise vorkommende Zellen können Zellen sein, die nicht-krankhaft verändert, krankhaft verändert, nicht-entartet oder entartet sind. "Krankhaft veränderte Zellen" sind Zellen, deren normale Zellfunktionen, wie Stoffwechselleis tungen, Reizbeantwortung, Motilität oder Reduplika tion, gestört oder geschädigt sind. Der Begriff "entartet" umfasst alle Veränderungen einer norma len Zelle, beispielsweise Zellpolymorphie, Anisozy tose, Kernpolymorphie, Polychromasie, gestörte Kern-Plasma-Relation und Aneuploidie, die zu einer gestörten Differenzierung oder zu einer Entdiffe renzierung und zu einem deregulierten Wachstum der Zelle führen können, und betrifft insbesondere Zel len maligner Tumore. Unter dem Begriff "gentech nisch veränderte Zellen" werden in der Erfindung alle Zellen verstanden, die mit Hilfe gentechni scher Verfahren manipuliert wurden, wobei entweder Fremd-DNA in die Zelle eingeschleust wurde oder die eigene DNA der Zelle, beispielsweise durch Deletio nen, Inversionen und Anlagerungen, modifiziert wur de.

Zur Herstellung eines menschlichen oder tierischen in vitro-Organ- oder Gewebesystems können darüber hinaus, bezogen auf den späteren Empfängerorganis mus, autologe, homologe oder heterologe Zellen ver wendet werden. In bevorzugten Ausführungsformen sind die Zellen homologe oder allogene Zellen, die von einem Donor der gleichen Art gewonnen werden, so dass nach Transplantation des in vitro herge stellten Organs oder in vitro hergestellten Gewebes Immunreaktionen im Wirtsorganismus vermieden oder vermindert werden. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform werden die Zellen aus dem Organis mus gewonnen, in den anschließend das erfindungsge mäß hergestellte in vitro-Organ oder -Gewebe ver bracht werden soll. In einer besonders vorteilhaf ten Ausgestaltung der Erfindung handelt es sich bei den verwendeten Zellen um menschliche oder tieri sche Stammzellen.

Die erfindungsgemäß verwendeten Zellen werden in vitro kultiviert und vermehrt, um die Anzahl der Zellen zu erhöhen, die anschließend zur Herstellung eines in vitro-Gewebes oder in vitro-Hohlorgans auf der mit einem Klebemittel oder konditioniertem Me dium behandelten Matrix ausgebracht werden können. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bedeutet der Begriff "Kultivieren und Vermehren von Zellen in vitro" ein außerhalb der natürlichen Um gebung, das heißt beispielsweise außerhalb des Kör pers, stattfindendes Aufrechterhalten der Lebens funktionen von Zellen in einer geeigneten Umgebung, beispielsweise unter Zu- und Abfuhr von Stoffwech seledukten und -produkten, wobei die gewählten Be dingungen die Teilung der Zellen und somit deren Vermehrung gewährleisten.

Erfindungsgemäß ist vorgesehen, dass die Kultivie rung und Vermehrung der Zellen in einem zur Zell kultur geeigneten Vollmedium, beispielsweise DMEM- Medium, M199-Medium, F12-Medium etc. erfolgt. Das zur Kultivierung und Vermehrung der Zellen verwen dete Medium kann weitere Zusätze, wie eine Puffer substanz, beispielsweise Hepes-Puffer, Serum, bei spielsweise fötales Kälberserum (FCS), Antibiotika, etc., enthalten.

Ein Zellkulturmedium, das Bestandteile wie FCS ent hält, die aus natürlichen, insbesondere tierischen Quellen gewonnen wurden, kann möglicherweise patho gene Agenzien, wie Viren, Prionen, bakterielle Kei me und ähnliche, enthalten. Bei Verwendung derarti ger Zellkulturmedien zur Kultivierung und Vermeh rung der erfindungsgemäß eingesetzten Zellen be steht daher das potentielle Risiko, dass solche pa thogenen Agenzien auf die Zellen übertragen werden.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist daher vorgesehen, dass die erfin dungsgemäß verwendeten Zellen in einem vollsynthe tischen Medium kultiviert werden. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einem "vollsynthetischen Medium" ein Medium einschließ lich aller erforderlichen Zusätze verstanden, des sen Bestandteile ausschließlich unter Verwendung chemischer Syntheseverfahren und/oder gentechni scher Verfahren (DNA-Rekombinationsverfahren) her gestellt und nicht aus tierischen Ausgangsmateria lien, insbesondere nicht aus Geweben, Organen, Kör perflüssigkeiten oder sonstigen Körperteilen eines Säugetiers, gewonnen wurden. Bei der gentechnischen Herstellung eines oder mehrerer Bestandteile des vollsynthetischen Mediums erfolgt die Expression dieser Bestandteile daher vorzugsweise in einer prokaryotischen Wirtszelle, beispielsweise einer gramnegativen oder grampositiven Wirtszelle, oder einer eukaryotischen nicht-tierischen Wirtszelle, beispielsweise einer Pilz- oder pflanzlichen Wirts zelle.

Bei der Kultivierung und Vermehrung der Zellen in vitro bleiben deren ektodermale, mesodermale oder endodermale Prägung erhalten. Nach Differenzierung der Zellen bilden sich deren spezifisch entwickelte Zellfunktionen, wie spezifische Stoffwechselleis tungen, spezifisches Reizbeantwortungsvermögen, Mo tilitätseigenschaften, etc., wieder aus, das heißt die Zellen weisen nach Kultivierung, Vermehrung und anschließender Differenzierung einen dem Ursprungs zustand ähnlichen Differenzierungsstatus auf. Gege benenfalls ist der Ursprung der Zellen des Harn traktes variierbar, das heißt, dass beispielsweise Blasenzellen für Urethra oder Ureter oder Nierenbe cken einsetzbar sind. In einer bevorzugten Ausfüh rungsform ist auch vorgesehen, Muskelzellen und Fibroblasten aus anderen Organen, zum Beispiel Haut, zur Besiedelung der Matrix zu verwenden.

In einer besonders vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung ist vorgesehen, dass die auszusäenden Zellen aus einer menschlichen oder tierischen Biop sie-Probe stammen, die dem nativen Zielgewebe oder Zielorgan in vivo entnommen wurde. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bedeutet der Begriff "Biopsie-Probe" eine Gewebeprobe, die einem leben den Organismus als ungezielte Biopsieprobe, das heißt als sogenannte Blindpunktion, durch Punktion mit einer Hohlnadel, unter Anwendung spezieller In strumente wie Zangen, Stanzinstrumente, Biopsieson den, Bürsten, Schlingen und ähnlicher Instrumenten oder operativ mit dem Skalpell, oder als gezielte Biopsie unter Ultraschall- oder Röntgenkontrolle beziehungsweise im Rahmen einer Endoskopie oder La paroskopie entnommen wurde. Vor der weiteren Ver wendung wird das gewonnene bioptische Material vor zugsweise histologischen, cytologischen, immunhis tologischen, histochemischen oder gentechnologi schen Kontrollen sowie einer zusätzlichen Testung auf Viren, Bakterien, Prionen und andere pathogene Agenzien unterworfen.

In einer vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung ist vorgesehen, dass die Biopsieprobe aus einer menschlichen oder tierischen Harnröhre entnommen wurde. In einer weiteren vorteilhaften Ausgestal tung ist vorgesehen, dass die Biopsieprobe aus ei ner menschlichen oder tierischen Harnblase stammt.

In noch einer weiteren Ausgestaltungsform der Er findung ist vorgesehen, dass die Biopsieprobe aus einem menschlichen beziehungsweise tierischen Harn leiter oder Nierenbecken stammt. Erfindungsgemäß ist auch vorgesehen, dass die Biopsieprobe aus ei nem menschlichen oder tierischen Samenleiter oder Eileiter stammen kann. Erfindungsgemäß ist eben falls vorgesehen, dass die Biopsieprobe aus einem menschlichen oder tierischen Blutgefäß, menschli chem oder tierischem Dünndarm oder menschlichem o der tierischem Dickdarm stammt.

Zur Gewinnung von isolierten Zellen wird die gewon nene Biopsieprobe vorzugsweise mit Hilfe einer Schere, eines Skalpells und/oder einer Pinzette und/oder eines ähnlich geeigneten Instrumentes me chanisch in einzelne Gewebeschichten getrennt. An schließend werden die einzelnen Gewebeschichten me chanisch zerkleinert. Erfindungsgemäß ist insbeson dere vorgesehen, dass die mechanisch getrennten und zerkleinerten Gewebeschichten unter Verwendung ei nes Protease-Gemisches, beispielsweise des BZ1- Gemisches (Roche), das Collagenase I, Collagenase II, Dispase und neutrale Proteasen (Caseinase) ent hält, enzymatisch verdaut werden, um einzelne iso lierte Zelltypen zu gewinnen und spezifisch anzu reichern. Durch die enzymatische Verdauung wird insbesondere die Interzellularsubstanz abgebaut, die ein wesentlicher Bestandteil der Binde- und Stützgewebe ist und aus Fasern und der lichtmikro skopisch homogenen Grundsubstanz besteht, die che misch hauptsächlich Mucopolysaccharide und Proteine umfasst. Erfindungsgemäß ist vorgesehen, dass die unter Verwendung von Proteasen durchgeführte enzy matische Spaltung der getrennten und zerkleinerten Gewebeschichten durch Zugabe eines Inhibitors, ins besondere durch Zugabe von Serum oder anderen Inhi bitoren wie zum Beispiel Sojabohnen-Trypsin- Inhibitor gestoppt wird.

Die eigentliche Trennung der einzelnen Zelltypen erfolgt erfindungsgemäß jedoch über eine in vitro- Vorkultivierung des nach der proteolytischen Spal tung erhaltenen Zellgemisches. Erfindungsgemäß wer den insbesondere zellspezifische Medien verwendet, die sich dadurch auszeichnen, dass das Wachstum er wünschter Zellen gefördert wird, während das Wachs tum nicht-gewünschter Zelltypen unterdrückt wird. Jedes proteolytische Zellgemisch einer zuvor mecha nisch getrennten und zerkleinerten Gewebeschicht wird daher erfindungsgemäß in unterschiedlichen ge webespezifischen Medien kultiviert, um gezielt spe zifische Zelltypen dieser Gewebeschicht zu vermeh ren und anzureichern. Beispielsweise ist vorgese hen, dass zur Anreicherung von Muskelzellen aus Harnblasen-Biopsien ein Smooth muscle cell-Serum (Promocell C-22060) geringen Serumgehalts verwendet wird. Zur Anreicherung von Fibroblasten aus Harn blasen-Biopsien wird vorzugsweise serumfreies Medi um (Promocell C-23010) verwendet. Zur Anreicherung von Mucosazellen aus Harnblasen-Biopsien wird vor zugsweise serumfreies Keratinozytenmedium (GibcoBRL 17005034) verwendet. Andere Medien zur Selektion und Vermehrung der jeweiligen Zelltypen insbesonde re Medien, die vollständig chemisch definiert sind, wie z. B. EpiLife (Cascade Biologics Inc.) können ebenfalls zur Anwendung kommen. Die Vorkultivierung der Zellen in vitro erfolgt nach herkömmlichen Ver fahren zur Kultivierung menschlicher oder tieri scher Zellen. So können die Zellen beispielsweise auf Mikrotiterplatten oder auf dem Boden von Kul turgefäßen, wie Flaschen, kultiviert werden. Vor zugsweise erfolgt die Kultivierung epithelialer Zellen auf Kollagen-beschichteten Flaschen, die Kultur der Muskelzellen, Fibroblasten und neurona len Zellen in unbeschichteten Flaschen. Während der in vitro-Vorkultivierung der einzelnen Zelltypen einer Gewebeschicht werden die Zellen jedes Zellty pes vorzugsweise zwei- oder dreimal einer Passage in frisches Medium unterworfen, wobei der Medium wechsel alle zwei bis drei Tage erfolgt, insbeson dere dann, wenn die Zellschicht eine Konfluenz von etwa 50 bis 75% aufweist.

Nach zwei- bis dreimaliger Passage in vitro können die vorkultivierten und angereicherten Zellen jedes Zelltypes auf der erfindungsgemäßen Matrix ausgesät oder aufgebracht werden. Erfindungsgemäß ist es vorgesehen, dass zur Herstellung eines aus mehreren Gewebeschichten bestehenden in vitro-Hohlorganes, das insbesondere als Transplantat Verwendung finden soll, Zellen auf mindestens einer Seite der Matrix ausgesät oder aufgebracht werden. Beispielsweise werden auf der Unterseite der Matrix nur Muskelzel len ausgesät, wobei die restlichen Komponenten nach Implantation vom Empfänger geliefert werden. In ei ner anderen Ausführungsform werden beispielsweise auf der Oberseite der Matrix (glatt erscheinende Seite) die Zellen von mindestens einem Zelltyp und auf der Unterseite der Matrix die Zellen von min destens einem anderen oder dem gleichen Zelltyp ausgesät oder aufgebracht. Vorzugsweise werden auf der Oberseite der Matrix solche Zellen ausgesät o der aufgebracht, die im nativen Organ die das Lumen begrenzende Zellschicht bilden. Auf der Unterseite der Matrix (rau erscheinende Seite) werden vorzugs weise die Zellen ausgesät oder aufgebracht, die im nativen Organ die Zellschichten bilden, die dem Lu men des Hohlorganes abgewandt sind. Selbstverständ lich ist es auch möglich, nur eine Seite der Matrix mit Zellen zu besäen, beispielsweise um ein ein schichtiges oder mehrschichtiges Gewebe herzustel len, das insbesondere zur Transplantation oder für Testzwecke eingesetzt werden soll.

Zur Herstellung von beispielsweise einem in vitro- Harnblasen-Hohlorgan werden Muskelzellen und Fibroblasten, die aus einer Harnblasen-Biopsie stammen und wie vorstehend beschrieben isoliert und angereichert wurden, auf der Unterseite der Matrix ausgesät/aufgebracht. Dementsprechend werden auf der Oberseite der erfindungsgemäß verwendeten Mat rix aus einer Harnblasenbiopsie stammende Urothel zellen ausgesät/aufgebracht.

Erfindungsgemäß ist vorgesehen, dass die Zellen auf der Unterseite und auf der Oberseite der Matrix in einer Dichte von 0,01 × 10⁶ bis 0,1 - 0,5 × 10⁶ Zellen/cm² Matrix, vorzugsweise in einer Dichte von 0,1 × 10⁶ bis 0,5 × 10⁶ Zellen/cm² ausgesät oder aufgebracht werden. Zur Herstellung eines erfin dungsgemäßen in vitro Harnblasen-Hohlorgans werden beispielsweise pro cm² Unterseite der Matrix 0,5 × 10⁶ Muskelzellen und 0,05 × 10⁶ Fibroblasten ausge sät/aufgebracht, während pro cm Oberseite der Mat rix 0,5 × 10⁶ Urothelzellen benötigt werden.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist vorgesehen, dass gleich zeitig mit den isolierten und angereicherten Zel len, die aus Biopsie-Proben gewonnen und in vitro kultiviert wurden, oder später neurogene Zellen auf die mit einem Klebemittel/konditioniertem Medium behandelte Matrix ausgebracht werden.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wer den unter "neurogenen Zellen" Nervenzellen verstan den, die aus größeren Nervenzellstrukturen bezie hungsweise Nervenzellgeweben wie einem Ganglion o der einem Nervenplexus stammen. Erfindungsgemäß ist vorgesehen, dass zur Herstellung eines speziellen in vitro-Hohlorganes die verwendeten neurogenen Zellen entweder aus dem gleichen nativen Organ oder aus einem anderen Organ stammen. Zur Herstellung eines in vitro-Harnblasen-Hohlorganes können bei spielsweise neurogene Zellen aus dem nativen Blasengewebe isoliert werden. Die neurogenen Zellen können jedoch auch aus einem anderen Organ, bei spielsweise den Taeniae coli, das heißt den drei Streifen der Längsmuskelschicht des Kolons, iso liert werden. Im Gegensatz zu den anderen auf der Matrix ausgesäten/aufgebrachten Zellen werden die neurogenen Zellen nach ihrer Isolierung unter Ver wendung herkömmlicher Verfahren nicht in vitro kul tiviert, sondern unmittelbar nach Isolierung direkt auf der Matrix ausgebracht. Erfindungsgemäß ist vorgesehen, dass die isolierten neurogenen Zellen in einer Dichte von 1 × 10² Zellen/cm² auf der Un terseite der Matrix ausgesät/aufgebracht werden.

Nach dem Ausbringen der Zellen wird die zellhaltige Matrix unter geeigneten Bedingungen kultiviert, so dass ein in vitro-Gewebe oder in vitro-Organ erhal ten wird, das entweder zur Transplantation oder für Testzwecke verwendet werden kann. Geeignete Bedin gungen zur Kultivierung der zellhaltigen Matrix um fassen unter anderem ein geeignetes Zellkulturmedi um, vorzugsweise DMEM-/F12-Medium, eine geeignete Temperatur, vorzugsweise 37°C, sowie eine geeignete Gasatmosphäre, die vorzugsweise 7% CO₂ enthält. Soll die zellbesiedelte Matrix später zur Trans plantation verwendet werden, wird die Matrix so lange kultiviert, bis die auf der Unter- bezie hungsweise Oberseite der Matrix befindlichen gewe be- oder organtypischen Zellen einen Monolayer, al so eine vollständige einzellige Schicht gebildet haben. Die Bildung eines Zellmonolayers wird bei spielsweise bei Verwendung von in vitro vorkulti vierten Zellen schon durch eine Kultivierung über Nacht erreicht. Anschließend kann die Zellmonolayer enthaltende Matrix transplantiert werden. Bei Ver wendung der zellhaltigen Matrix für Testzwecke kann die Kultivierung natürlich so lange erfolgen, bis alle organtypischen Gewebeschichten des herzustel lenden Gewebes oder Organs vollständig ausgebildet sind. Unter diesen Bedingungen wird eine Kultur der Zellen in ihrem jeweiligen zellspezifischen Medium angestrebt. Hierfür werden die Transplantate in ei gens dafür hergestellten Kulturkammern kultiviert.

In einer vorteilhaften Ausführungsform der Erfin dung ist vorgesehen, dass die auf der Matrix ausge brachten Zellen während und/oder nach der Kultivie rung hinsichtlich ihrer Funktion, ihrer Morphologie und/oder ihres Diffenzierungsstatus überprüft wer den. Die Erfindung betrifft daher auch unter Ver wendung solcher Zellen durchgeführte Screening- und Diagnoseverfahren, wobei die Zellen gemäß den vor stehend beschriebenen Verfahren kultiviert und wäh rend und/oder danach untersucht werden, beispiels weise auf pharmakologische, toxikologische, physio logische, morphologische und/oder molekularbiologi sche Parameter. Im Rahmen dieser Untersuchungen können auch die Auswirkungen potentieller Medika mente, Krankheitserreger, Antigene oder ähnlichen auf die kultivierten Zellen untersucht werden. Da bei werden in bevorzugter Ausführungsform die Zel len in An- und Abwesenheit eines Agens untersucht und die beobachteten Auswirkungen werden miteinan der verglichen.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist vorgesehen, dass die Kultivierung der Zellen an der Matrix zur Herstellung eines in vitro-Gewebes in einem Zellreaktor erfolgt. Unter einem Zellreaktor wird im Zusammenhang mit der Er findung eine Vorrichtung zur automatischen Vermeh rung von Zellen und/oder zur automatischen Herstel lung von in vitro-Geweben verstanden. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Zellreaktor um einen Compu ter-gestützten Bioreaktor vom Typ Kerator. Ein Zellreaktor besteht aus mindestens einer Zellwachs tumskammer und einer Medium enthaltenden Kammer, die durch eine semipermeable Membran, beispielswei se die erfindungsgemäß verwendete Kollagen-haltige Matrix, getrennt sind, wobei die Membran als Träger für die herzustellende Zellschicht dient. Der Vor teil einer Herstellung eines in vitro-Gewebes in einem Zellreaktor besteht insbesondere darin, dass das Verfahren unter Computerkontrolle automatisch abläuft, wobei ein sehr gleichmäßiges Wachstum der einzelnen Zellschichten erreicht wird und gleich zeitig eine Kontamination mit Keimen vermieden wird. Die in dem Bioreaktor hergestellte zellbesie delte Membran oder Matrix kann sowohl für Trans plantationszwecke als auch für Testzwecke verwendet werden.

Die vorliegende Erfindung umfasst daher in bevor zugter Ausführungsform die Kultivierung menschli cher oder tierischer Zellen zur Herstellung von ein- oder mehrschichtigen menschlichen oder tieri schen in vitro-Geweben oder menschlichen oder tie rischen in vitro-Hohlorganen, die sich als Trans plantat beziehungsweise partieller oder vollständi ger Ersatz für ein erkranktes oder geschädigtes Ge webe oder Organ im Körper eines Menschen oder eines Tieres verwenden lassen. Erfindungsgemäß ist insbe sondere vorgesehen, dass die zellhaltige Matrix erst nach Kultivierung, das heißt nach Ausbildung der Zellmonolayer, und unmittelbar vor Transplanta tion in die Form gebracht wird, in der sie trans plantiert werden soll. Sollen beispielsweise nur kleinere Bereiche eines erkrankten oder geschädig ten Gewebes oder Hohlorgans im Körper eines Men schen oder Tieres ersetzt werden, so kann die zell besiedelte Matrix-Platte unmittelbar nach der Kul tivierung im Operationssaal durch den Mediziner durch mechanische Bearbeitung, beispielsweise mit einem Skalpell oder einer Schere, in Größe und Form dem Defekt angepaßt werden. Die entsprechend dem Defekt zurecht geschnittene zellbesiedelte Platte wird dann eingenäht und zusätzlich unter Verwendung eines Gewebeklebers, beispielsweise eines Fibrin klebers, im Defekt fixiert.

Umfasst der erkrankte oder beschädigte Bereich ei nes Hohlorgans, beispielsweise eines Harnleiters, größere Abschnitte, wird die zellbesiedelte Matrix- Platte zu einem geeigneten Hohlorgan geformt. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einem "Hohlorgan" ein Organ verstanden, bei dem das Gewebe partiell oder vollständig einen Hohlraum umschließt, wobei die lichte Weite oder der Durchmesser des Hohlorgans als Lumen bezeichnet wird. Die Formung der zellbesiedelten Matrix-Platte zu einem gewünschten Hohlorgan bedeutet daher, dass eine oder mehrere zellbesiedelte Matrix-Platten in die dreidimensionale Körperform mit den entspre chenden Abmessungen gebracht wird/werden, die das native Organ besitzt.

Soll beispielsweise ein partieller in vitro- Harnleiter hergestellt werden, wird die zellbesie delte Matrix-Platte in der entsprechenden Größe zu rechtgeschnitten und dann in eine Röhren- oder Zy linderform gebracht. Eine Röhren- oder Zylinderform kann beispielsweise durch eine chirurgische Naht fixiert werden und zusätzlich unter Verwendung ei nes Gewebeklebers, beispielsweise eines Fibrin- Klebers verstärkt werden. Die Zylinderform kann zu sätzlich oder ausschließlich mit chirurgischen Nahtverfahren fixiert werden. Beispielsweise kann die zellbesiedelte Matrix an ihren Kanten durch ei ne 3,0 oder 4,0-Naht oder durch kleine chirurgische Klemmen gesichert werden. Bei zusätzlicher Verwen dung eines Fibrin-Klebers werden die Enden der zellbesiedelten Matrix-Platte mit dem Kleber be strichen oder besprüht und danach kurzzeitig zusam mengepresst. Ist der zu ersetzende Abschnitt eines Hohlorgans sehr groß, können gegebenenfalls mehrere zellbesiedelte Matrices durch chirurgische Nahtver fahren und/oder Anwendung eines Fibrin-Klebers mit einander verbunden werden, um so ein größeres in vitro-Hohlorgan herzustellen.

Die Herstellung eines in vitro-Hohlorgans erfolgt ebenfalls unmittelbar nach der Kultivierung der Matrix/Matricen und vor der Transplantation. Vor zugsweise erfolgt die Herstellung des in vitro- Hohlorgans durch den Mediziner im Operationssaal.

Die vorliegende Erfindung betrifft daher auch ein partielles oder vollständiges menschliches oder tierischen in vitro-Harnröhren-Hohlorgan, das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren und einem gegebe nenfalls anschließenden und/oder vorausgehenden Kultivierungsverfahren herkömmlicher Art herge stellt wurde, wobei Urothelzellen, Muskelzellen, Fibroblasten und neurogene Zellen verwendet wurden. Das in vitro-Harnröhren-Hohlorgan kann als partiel ler oder vollständiger Ersatz für eine geschädigte oder erkrankte tierische oder menschliche Harnröhre verwendet werden. Ein in vitro hergestelltes Harn röhren-Hohlorgan beziehungsweise ein in vitro Harn röhren-Ersatz kann beispielsweise nach einer Harn röhrenverletzung, das heißt einer offenen oder ge schlossenen Verletzung der Urethra infolge Gewalt einwirkung im Bereich von Becken, Damm oder anderen Verletzungen der Blase, bei Harnröhrenfehlbildun gen, beispielsweise Epispadie, Hypospadie, partiel ler oder totaler Obliteration oder Stenose einge setzt werden.

Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls ein partielles oder vollständiges menschliches oder tierisches in vitro-Harnblasen-Hohlorgan, das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren und einem gegebe nenfalls anschließenden und/oder vorausgehenden Kultivierungsverfahren herkömmlicher Art herge stellt wurde, wobei Muskelzellen, Fibroblasten, U rothelzellen und neurogene Zellen verwendet wurden. Das in vitro-Harnblasen-Hohlorgan kann als partiel ler oder vollständiger Ersatz für eine geschädigte oder erkrankte tierische oder menschliche Harnblase verwendet werden. Ein in vitro hergestellter Harn blasen-Ersatz kann beispielsweise bei Harnblasen fehlbildungen, Blasendystrophie, zum Beispiel Bla senekstrophie, Harnblasencarcinom oder bei sekundär verursachten Schrumpfblasen infolge neurogener, hy perreflexibler Blasenfunktionsstörungen eingesetzt werden. Bei Verwendung zur chirurgischen Sanierung einer neurogenen Harnblase werden insbesondere die Komplikationen vermieden, die bei der Blasenaugmen tation mit Darm oder bei der Autoaugmentationen auftreten können.

Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls ein partielles oder vollständiges menschliches oder tierisches in vitro-Harnleiter-Hohlorgan sowie ein in vitro-Nierenbecken, das nach dem erfindungsgemä ßen Verfahren und einem gegebenenfalls anschließen den und/oder vorausgehenden Kultivierungsverfahren herkömmlicher Art hergestellt wurde, wobei Urothel zellen, Muskelzellen, Fibroblasten und gegebenen falls neurogene Zellen verwendet wurden. Das in vitro-Harnleiter-Hohlorgan kann als partieller oder vollständiger Ersatz für einen erkrankten oder ge schädigten menschlichen oder tierischen Harnleiter verwendet werden. Ein in vitro hergestellter Harn leiterersatz kann beispielsweise bei Nierenbecken abgangsengen, subpelvinen Stenosen, Harnleiterfehl bildungen wie dem kongenitalen Megaureter, bei Obliteration oder Stenose im Verlauf, zum Beispiel bei Steinleiden oder nach operativen Eingriffen, bei spezifischen Formen von Harnleiterentzündungen oder traumatischen Läsionen eingesetzt werden.

Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls ein partielles oder vollständiges menschliches oder tierisches in vitro-Samenleiter-Hohlorgan, das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren und einem gegebe nenfalls anschließenden und/oder vorausgehenden Kultivierungsverfahren herkömmlicher Art herge stellt wurde, wobei Epithelzellen, Muskelzellen, Fibroblasten und gegebenenfalls neurogene Zellen verwendet werden. Der in vitro-Samenleiter kann als partieller oder vollständiger Ersatz für einen menschlichen oder tierischen Samenleiter verwendet werden. Ein in vitro hergestellter Samenleiter- Ersatz kann beispielsweise bei Samenleiteraplasie, Obstruktionen des Samenleiters infolge von Entzün dungen oder zur Wiederherstellung der Kontinuität (Vasovasostomle) infolge einer Refertilisierung beim Zustand nach Vasektomie eingesetzt werden.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein par tielles oder vollständiges menschliches oder tieri sches in vitro-Eileiter-Hohlorgan, das nach dem er findungsgemäßen Verfahren und einem gegebenenfalls anschließenden und/oder vorausgehenden Kultivie rungsverfahren herkömmlicher Art hergestellt wurde, wobei Flimmerepithelzellen, Muskelzellen, Fibroblasten und gegebenenfalls neurogene Zellen verwendet wurden. Der in vitro-Eileiter kann als partieller oder vollständiger Eileiter-Ersatz für einen menschlichen oder tierischen Eileiter verwen det werden. Ein in vitro hergestellter Eileiter- Ersatz kann beispielsweise nach Obliteration des Eileiters verwendet werden.

Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls ein in vitro hergestelltes partielles oder vollständiges Blutgefäß-Hohlorgan, das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren und einem gegebenenfalls anschließenden und/oder vorausgehenden Kultivierungsverfahren her kömmlicher Art hergestellt wurde, wobei Endothel zellen, Muskelzellen und Fibroblasten verwendet wurden. Das in vitro-Blutgefäß kann als partieller oder vollständiger Ersatz für ein menschliches oder tierisches Blutgefäß verwendet werden. Ein in vitro hergestellter Blutgefäßersatz kann beispielsweise bei der Beseitigung oder Umgehung von Strömungshin dernissen bei Verschlusskrankheiten, der Beseiti gung pathologischer Strömungsverhältnisse, bei spielsweise bei Varikosis, Aneurysma, Angiom und arteriovenöser Fistel, oder bei Änderung der Strö mungsrichtung beispielsweise durch Anlage eines ge fäßchirurgischen Shunts usw. verwendet werden.

Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls ein partielles oder vollständiges menschliches oder tierisches in vitro-Dünndarm-Hohlorgan, das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren und einem gegebe nenfalls anschließenden und/oder vorausgehenden Kultivierungsverfahren herkömmlicher Art herge stellt wurde, wobei Mucosazellen, Muskelzellen, Fibroblasten und neurogene Zellen verwendet wurden. Das in vitro-Dünndarm-Hohlorgan kann als Ersatz für Bereiche eines menschlichen oder tierischen Dünn darms verwendet werden. Ein in vitro hergestellter Dünndarmersatz kann beispielsweise nach vollständi ger oder partieller Dünndarmresektion bei Dünndarm tumoren, chronisch entzündlichen Darmerkrankungen oder anderweitigem Verlust (Darminfarkt, Volvulus, neurogene Schädigung) eingesetzt werden. Es ist ge eignet "Pouches" anzulegen, wie sie zum Beispiel im Rahmen von Dickdarm- oder Dünndarmoperationen Ver wendung finden.

Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls ein partielles oder vollständiges menschliches oder tierisches in vitro-Dickdarm-Hohlorgan, das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren und einem gegebe nenfalls anschließenden und/oder vorausgehenden Kultivierungsverfahren herkömmlicher Art herge stellt wurde, wobei Mucosazellen, Muskelzellen, Fibroblasten und neurogene Zellen verwendet wurden. Das in vitro-Dickdarm-Hohlorgan kann als Ersatz für Bereiche eines menschlichen oder tierischen Dick darms verwendet werden. Ein in vitro hergestellter Dickdarm-Ersatz kann beispielsweise bei vollständi ger oder teilweiser Resektion infolge einer chro nisch entzündlichen Darmentzündung, eines Dickdarm carcinoms oder bei angeborenen Innervationsstörun gen (Hirschsprung-Krankheit) verwendet werden.

Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls die Herstellung einer mit Fibroblasten besiedelten Mat rix zur operativen Beseitigung/Deckung von Fisteln die beispielsweise vom Urogenitaltrakt oder Darm ihren Ausgang nehmen. Die Fisteln können beispiels weise durch entzündliche Darmerkrankungen und durch operative Eingriffe verursacht sein. Zur Herstel lung der mit Fibroblasten besiedelten Matrix werden Fibroblasten entweder aus der Haut oder aus den betreffenden Organen isoliert und kultiviert.

Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls die Herstellung einer mit Fibroblasten besiedelten Mat rix in Form einer Schlinge zur operativen Hebung von Organen beispielsweise der Harnblase bei Frauen mit Beckenbodenschwäche.

Eine weitere besonders bevorzugte Ausführungsform der Erfindung umfasst die Verwendung der erfin dungsgemäß hergestellten dreidimensionalen ein- o der mehrschichtigen menschlichen oder tierischen in vitro-Organ- oder Gewebesysteme als Testsysteme.

Aufgrund der Komplexität der erfindungsgemäß herge stellten in vitro-Organ- oder Gewebesysteme, insbe sondere durch die Verwendung primärer Zellen, ihre Anordnung in ihrer natürlicherweise vorliegenden Schichtung und durch die Einbeziehung neurogener Zellen, können die in vitro-Systeme gezielt für verschiedene Fragestellungen der chemisch- pharmazeutischen Industrie verwendet werden. Diese Komplexität der erfindungsgemäßen in vitro-Systeme erlaubt es, die Wirkung eines Stimulus auf einzelne Zellpopulationen sowie auf die Interaktion der Zel len zu untersuchen. Insbesondere die Verwendung neurogener Zellen erlaubt frühzeitige Aussagen über die Wirkungen von Wirkstoffen auf Nervenzellen, die bislang nicht erfasst werden konnten. Beispielswei se eignen sich die erfindungsgemäßen in vitro- Systeme zur Produktprüfung, insbesondere im Hin blick auf Wirksamkeit, Wirkmechanismus, unerwünsch te Nebenwirkungen, beispielsweise Reiz-, Toxizi täts- und Entzündungswirkungen, oder Verträglich keit von Wirkstoffen. Erfindungsgemäß werden unter dem Begriff Wirkstoff jedwede Stoffe, aber auch an dere Agenzien, beispielsweise physikalische Ein flussgrößen wie elektromagnetische Strahlen, Radio aktivität, Wärme, Schall oder ähnliches verstanden, welche biologische Zellen oder Teile davon, insbe sondere Zellorganellen, beeinflussen oder erkennen können. Derartige Wirkstoffe können insbesondere chemischer Natur sein, zum Beispiel Diagnostika o der Therapeutika. Im Zusammenhang mit der vorlie genden Erfindung werden unter Diagnostika jedwede Stoffe verstanden, die spezifisch das Vorhandensein von Zuständen, Prozessen oder Substanzen bezie hungsweise deren Abwesenheit erkennen können und insbesondere Rückschlüsse auf Krankheitszustände geben können. Diagnostika weisen häufig erkennende und markierende Funktionen auf. Unter dem Begriff Therapeutika werden insbesondere solche Stoffe ver standen, die entweder prophylaktisch oder krank heitsbegleitend eingesetzt werden können, um Krank heitszustände zu vermeiden, zu lindern oder zu be seitigen. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Er findung werden unter Krankheiten auch Zustände wie unnatürliche Gemütszustände, Schwangerschaften, Al terserscheinungen, Entwicklungsstörungen oder ähn liches verstanden. Mit Hilfe der erfindungsgemäßen tierischen und menschlichen in vitro-Gewebe- oder in vitro-Hohlorgan-Testsysteme können die Wirksam keit beziehungsweise der Wirkmechanismus und/oder die Nebenwirkungen von Wirkstoffen wesentlich ge nauer analysiert werden als bei herkömmlichen Test systemen. Die ein- und mehrschichtigen in vitro Ge webe- oder Hohlorgansysteme können darüber hinaus zum Screenen von potentiellen Wirkstoffen und zur Untersuchung der Eigenschaften wie Spezifitäten so wie von Interaktionen von Wirkstoffen mit Zielzel len verwendet werden.

Diese Tests von Wirkstoffen, Therapeutika und Di agnostika an den erfindungsgemäßen tierischen oder menschlichen in vitro-Gewebe- oder in vitro- Hohlorgan-Testsystemen können sowohl herkömmliche morphologische oder histologische Verfahren als auch herkömmliche biochemische, toxikologische, im munologische und/oder molekularbiologische Verfah ren umfassen. Die Wirkungen von Substanzen oder A genzien auf die Zellen der erfindungsgemäßen drei dimensionalen in vitro-Organ- oder Gewebesysteme lassen sich beispielsweise anhand der Freisetzung von Stoffen, beispielsweise Cytokinen oder Mediato ren, durch Zellen, sowie anhand ihrer Wirkungen auf die Genexpression, den Stoffwechsel, die Prolifera tion, die Differenzierung und die Reorganisation der Zellen eines in vitro-Organ- oder Gewebetest systems ermitteln. Unter Verwendung von Verfahren zur Quantifizierung der Zellschädigung, insbesonde re unter Verwendung eines Vitalfarbstoffes, wie ei nes Tetrazoliumderivates, können beispielsweise cy totoxische Wirkungen auf Zellen nachgewiesen wer den.

Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung um fasst daher Verfahren zur Untersuchung der pharma kologischen Wirkungen von Wirkstoffen, Diagnostika und Therapeutika auf menschliche oder tierische Ge webe unter Verwendung der erfindungsgemäß herge stellten menschlichen oder tierischen in vitro- Hohlorgan- oder in vitro-Gewebesysteme, wobei die in vitro-Organ- oder Gewebesysteme mit dem zu un tersuchenden Wirkstoff behandelt werden und die in An- und Abwesenheit des zu untersuchenden Wirkstof fes erhaltenen Ergebnisse miteinander verglichen werden.

In einer weiteren besonders bevorzugten Ausfüh rungsform der Erfindung werden die erfindungsgemäß hergestellten menschlichen oder tierischen in vitro-Organ- oder Gewebesysteme zur Untersuchung gewebe- oder organspezifischer Krankheiten und zur Entwicklung neuer Behandlungsmöglichkeiten für die se Krankheiten verwendet. In einer vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung werden die erfindungs gemäßen in vitro-Dünndarm- und/oder in vitro- Dickdarmsysteme zur Untersuchung von chronisch entzündlichen Darmerkrankungen wie Morbus Crohn und Colitis ulcerosa verwendet. Diese Krankheiten sind durch schubartige destruierende Entzündungsreaktio nen der Darmschleimhaut gekennzeichnet. Erfindungs gemäß ist vorgesehen, Biopsieproben von Patienten mit einer chronisch entzündlichen Darmerkrankung zu entnehmen und unter Verwendung der erfindungsgemä ßen Verfahren in vitro Gewebe oder ein partielles Darmorgan herzustellen. An diesen in vitro-Geweben oder in vitro-Organen können dann potentielle Wirk stoffe untersucht werden. Noch eine andere vorteil hafte Ausgestaltung der Erfindung umfasst die Ver wendung des erfindungsgemäß hergestellten in vitro- Harnblasensystems zur Untersuchung von neurogenen, hyperreflexiblen und areflexiblen Blasenstörungen.

In einer besonders vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung werden primäre Zellen und/oder Zelllinien von Patienten mit einer spezifischen Krankheit, beispielsweise einer spezifischen Darmerkrankung, verwendet, um daraus patientenspezifische in vitro- Organ- oder Gewebesysteme, beispielsweise ein pati entenspezifisches in vitro-Darmsystem, zu etablie ren und daran die Wirksamkeit bestimmter Therapien und/oder Medikamente zu untersuchen und zu beurtei len.

Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung um fasst die Verwendung der erfindungsgemäßen mensch lichen oder tierischen dreidimensionalen in vitro- Organ- oder Gewebesysteme zur Untersuchung der Me chanismen der Tumorpathogenese und zur Untersuchung von Wirkstoffen auf ihre Eignung als Arzneimittel, zum Beispiel gegen einen spezifischen Tumor. In ei ner vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung wird ein aus entarteten Zellen, insbesondere der vorstehend genannten Organe oder Gewebe, aufgebau tes in vitro-Organ- oder Gewebetestsystem zur Ge winnung größerer Mengen eines entarteten Zellmate rials verwendet. Das gewonnene Material wird dann mit herkömmlichen Verfahren, beispielsweise histo logischen, biochemischen, molekularbiologischen o der immunologischen Verfahren, weiter analysiert, um beispielsweise morphologische Änderungen entar teter Zellen oder die Ausschüttung spezifischer Stoffe genauer zu untersuchen oder um Transkripti ons- und/oder Expressionsprofile zu erstellen. In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung der Er findung wird an einem aus entarteten Zellen aufge bauten in vitro-Organ- oder Gewebetestsystem die Wirkung von Arzneimitteln oder anderen Substanzen, beispielsweise im Hinblick auf deren Fähigkeit zur Hemmung der Zellteilung, studiert.

Eine weitere besonders bevorzugte Ausführungsform der Erfindung umfasst die Verwendung der erfin dungsgemäßen in vitro-Organ- oder Gewebesysteme zur Überprüfung gentechnisch veränderter Zellen, insbe sondere der vorstehend genannten Gewebe und Organe. In einer vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung werden Zellen getestet, die im Hinblick auf eine Gentherapie zur Ausschaltung genbedingter Fehlfunk tionen beziehungsweise Wiederherstellung normaler Genfunktionen bei Erkrankungen der vorstehend ge nannten Organe gentechnisch modifiziert wurden.

Weitere vorteilhafte Ausgestaltungen ergeben sich aus den Unteransprüchen.

Die Erfindung wird anhand von Fig. 1 und von Bei spielen näher erläutert.

Fig. 1 zeigt mittels PTK26 gefärbte Muskelzellen einen Tag nach deren Aufbringen auf eine Kollagen- Matrix.

Beispiel 1 Herstellung eines in vitro-Harnblasen-Hohlorgans 1. Materialien Medien

Smooth muscle cell medium-low serum (Promocell C- 22060 (Supplement: C-39265))
Fibroblast cell medium-low serum (Promocell C- 23010 (Supplement: C-39315))
Keratinocyte growth medium serumfrei (GibcoBRL 17005034 (Supplement: 37000015))
F12-Medium (GibcoBRL 21765-029)
DMEM (GibcoBRL 41966-029)
FCS (SIGMA F-7524)
BZ1 (Roche 1988417): 9 mg Proteasen/ml PBS
EDTA/Trypsin (1x) (Sigma T-3924)
Trypsin-Inhibitor aus Sojabohnen (Gibco 17075-011)
PBS mit Antibiotikazusatz
Transportmedium mit Antibiotikazusatz (DMEM)

Antibiotika

Claforan: 0.15 mg/ml (1 ml auf 500 ml PBS/DMEM; Glaxo Claforan 2.0)
Amphotericin: 2.5 E/ml (5 ml auf 500 ml PBS/DMEM; GibcoBRL 15290-018)
Gentamycin: 50 µg/ml (0.5 ml auf 500 ml PBS/DMEM; GibcoBRL 15750-037)

2. Verfahren A. Biopsieaufbereitung

Am ersten Tag wird eine Biopsieprobe steril entnom men, in ein Transportmedium gegeben und in diesem in ein Labor transportiert. Von jeder Biopsie wird am Tag der Entnahme ein etwa 1 bis 2 cm² großes Stück für immunhistologische und andere ggf. mole kularbiologische Untersuchungen entfernt und einge froren. Die restliche Biopsie wird die Nacht über bei 4°C im Transportmedium gelagert. Zur Kontrolle aller verwendeten Medien und Puffer wird eine Ste rilkontrolle der Lösung angelegt.

Am zweiten Tag wird die Biopsie aus dem Transport medium entnommen und eine Kultur des Transportmedi ums wird zur Sterilkontrolle angelegt.

Die Muscularis- und Mucosa-Schichten der Biopsie probe werden mittels einer Schere getrennt. Die ge trennten Schichten werden anschließend mittels ei ner Schere zerkleinert, so dass die Gewebestücke kleiner als 0,5 mm² sind. Die zerkleinerten Gewebe schichten werden anschließend dreimal in PBS, ent haltend Claforan, Amphotericin und Gentamycin, ge waschen und dann gewogen.

Anschließend wird die zerkleinerte Muscularis schicht enzymatisch verdaut, wobei 0,4-0,5 g in 3 ml Protease enthaltendes Medium 15 Minuten bei 37°C inkubiert werden (1 : 5; 1 ml BZ1 : 4 ml F12 Medium). Anschließend werden nochmals 2 ml 1 : 5 verdünntes BZ1 hinzugegeben und die Verdauungsreaktion wird 15 Minuten weitergeführt. Die zerkleinerte Mucosa schicht wird identisch behandelt, wobei allerdings das BZ1-Proteasegemisch 1 : 10 in F12-Medium verdünnt wird. Nach der Spaltung der Gewebeschicht mit Pro teasen wird der Reaktionsansatz mikroskopisch un tersucht und mit FCS auf 10 ml oder mit Soja- Trypsin-Inhibitor auf 50 ml aufgefüllt, um die Re aktion zu stoppen. Die verdaute Muscularisschicht wird in Medium resuspendiert. 25 ml davon werden in ein neues 50 ml-Falconröhrchen überführt, so dass ein Röhrchen für die Kul 05053 00070 552 001000280000000200012000285910494200040 0002010146903 00004 04934tur der glatten Muskelzel len und ein Röhrchen für die Kultur der Fibroblasten zur Verfügung steht. Beide Ansätze werden zum Absetzen der größeren Gewebestückchen etwa 5 Minuten stehen gelassen. Die Zellen im Über stand werden in ein neues 50 ml-Falconröhrchen ü berführt. Danach werden die Zellen bei etwa 1000 Upm 10 Minuten zentrifugiert. Anschließend wird das Pellet dreimal in 15 ml des jeweiligen zellspezifi schen Mediums gewaschen.

Die abgesetzten Pellets der verdauten Muscularis schicht werden verworfen, während das Pellet des Mucosaschicht mit 15 ml Keratinocytenmedium dreimal gewaschen wird.

Die Muskelzellen und Fibroblasten werden mikrosko pisch gezählt, in 12 ml zellspezifisches Medium aufgenommen und in jeweils 6 Vertiefungen einer Mikrotiterplatte mit 29 Vertiefungen ausge sät/aufgebracht, wobei pro Vertiefung 1 ml aufge tragen wird.

Die Urothelzellen werden ebenfalls gezählt, in 6 ml Keratinocytenmedium aufgenommen und jeweils 3 ml Zellsuspension werden auf zwei 9 cm² Kollagen- beschichteten Petrischalen verteilt.

Von den restlichen Mucosastückchen wird eine Explantkultur auf Kollagen-beschichteten Petrischa len mit einem Durchmesser von 10 cm durchgeführt. Hierzu werden die Mucosastücke in 1,5 ml Medium mit 200 µl Thrombin versetzt. Die Petrischale wird mit Fibrin-haltigem Medium (200 µl Fibrin in 1,5 ml Ke ratinocytenmedium) vorgespült und dann wird der Ü berstand entfernt, so dass die Petrischale voll ständig benetzt ist. Die Thrombin-haltige Zell- be ziehungsweise Gewebesuspension wird in der Mitte der Petrischale aufgebracht, wobei sie polymeri siert.

Am nächsten Tag werden bei allen Zellkulturen die Überstände abgenommen und entweder in einer Mikro titerplatte mit 24 Vertiefungen oder eine frische Petrischale mit einer 9 cm² Kollagen-beschichteten Oberfläche überführt, um weitere Zellen zu gewin nen. Etwa alle zwei bis drei Tage wird ein Medien wechsel vorgenommen, wobei die Passage der Zellen bei einer Konfluenz von etwa 50 bis 75% erfolgt. Im Fall der Urothelzellen werden diese in eine Kol lagen-beschichtete Flasche mit einer Beschichtungs fläche von 25 cm², im Falle der glatten Muskelzel len und Fibroblasten in zwei Flaschen mit einer Kultivierungsfläche von 25 cm² überführt.

Die Ablösung der Fibroblasten und Muskelzellen er folgt, indem 100 µl EDTA/Trypsin, vorgewärmt bei 37°C, pro Vertiefung einer 24 Vertiefungen enthal tenden Mikrotiterplatte gegeben werden und 10 min bei 37°C inkubiert wird. Die Ablösung der Zellen wird mikroskopisch kontrolliert. Die Reaktion wird mit 100 µl FCS oder 900 µl Sojabohnen-Inhibitor ge stoppt. Die Überstände von jeweils 6 Vertiefungen werden vereinigt und die Zellen werden abzentrifu giert. Das gewonnene Zellpellet wird zweimal im entsprechenden zellspezifischen Medium gewaschen und die Zellen werden anschließend um den Faktor 1 : 3 verdünnt.

Die Ablösung der Urothelzellen erfolgt, indem die Zellen mit 3 ml vorgewärmten 0,2%-igen EDTA 10 Mi nuten bei 37°C inhibiert werden. Das EDTA wird da nach abpippetiert. Anschließend werden die Urothel zellen zum zweiten Mal mit 1,5 ml 0,1% Trypsin/0,2 % EDTA 5 bis 10 Minuten inkubiert. Danach wird die Reaktion mit 5 ml FCS oder 10 ml Sojabohnen- Inhibitor gestoppt. Die Zellen werden zentrifu giert, zweimal in 15 ml Keratinocytenmedium gewa schen und um den Faktor 1 : 2 verdünnt.

Herstellung der zellbesäten Matrix

Die Matrix wird in DMEM/F12 10% FCS getränkt. Im Anschluss daran wird die Membran in 3 ml DMEM/F12, die 1 : 2 mit Fibrinogenlösung (Fibrinogenlösung des Fibrinklebemittels von Tissucol) vermischt wurde, inkubiert. Die Zellpellets für die Unterseite der Membran, das heißt Muskelzellen, Fibroblasten und neurogene Zellen, werden in 1,5 ml DMEM/F12-Medium aufgenommen. Zu dieser Zellsuspension wird ein gleiches Volumen Thrombinlösung (das heißt zweite Komponente des Fibrinklebers) zugegeben und ge mischt. Diese Lösung von 3 ml wird homogen auf der Unterseite der Fibrin-durchtränkten Matrix ver teilt. Hierbei kommt es zur Polymerisierung der Zellsuspension. Pro Quadratzentimeter Unterseite der Membran werden 0,5 × 10⁶ Muskelzellen, 0,05 × 10⁶ Fibroblasten und 1 × 10² neurogene Zellen aus gesät/aufgebracht. Nach der Polymerisierung wird die Membran umgedreht. Die Urothelzellen werden nach Standardprotokoll isoliert und ebenfalls in 3 ml DMEM/F12-Medium, das außerdem die Thrombinlösung enthält, suspendiert und auf der Oberseite der Membran verteilt. Pro cm Oberseite werden dabei 0,5 × 10⁶ Urothelzellen benötigt. Nach der Polyme risierung der Oberseite wird die Membran die Nacht über bei 37°C und 7% CO₂ in DMEM/F12 kultiviert und danach transplantiert.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung eines ein- oder mehr schichtigen menschlichen oder tierischen in vitro- Gewebes oder eines vollständigen oder partiellen, menschlichen oder tierischen in vitro-Hohlorgans, umfassend das:

a) Behandeln einer biologisch verträglichen, biologisch abbaubaren plattenförmigen Matrix mit einem biologisch verträglichen, biologisch abbaubaren Klebemittel oder konditioniertem Medium,
b) Ausbringen von isolierten gewebe- oder or gantypischen oder gewebe- oder organuntypi schen mesenchymalen und/oder epithelialen Ge webestücken einer Biopsie auf die Matrix zum Auswachsen der primären Zellen, das heißt An setzen einer Explantkultur, und/oder das Aus säen von mindestens einem Typ einer isolierten differenzierten oder nicht-differenzierten ge webe- oder organtypischen oder gewebe- oder organuntypischen Zelle, die zuvor in vitro kultiviert und vermehrt wurde, in geringer Zelldichte auf der Matrix,
c) Aussäen von isolierten, gewebe- oder organ typischen oder gewebe- oder organuntypischen, neurogenen Zellen in geringer Zelldichte auf der Matrix,
d) Kultivieren der Explant-Zellen und/oder zu vor in vitro kultivierte Zellen und neurogene Zellen enthaltenden Matrix unter geeigneten Bedingungen,
e) Schneiden der Matrix in gewünschter Form und Größe und/oder Ausformen der Matrix zu ei nem Hohlorgan.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei es sich bei der biologisch verträglichen Matrix um eine acelluläre Kollagen-haltige Matrix handelt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die acelluläre Kollagen-haltige Matrix aus der Dünndarm-Submucosa vom Schwein hergestellt ist.

4. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die acelluläre Kollagen-haltige Matrix aus rekombinantem humanem Kollagen hergestellt ist.

5. Verfahren nach Anspruch 1, wobei es sich bei der biologisch verträglichen Matrix um eine acelluläre Chitosan-haltige Matrix handelt.

6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei die acelluläre Chitosan-haltige Matrix aus Chitosan hergestellt ist, das zu etwa 80% bis zu etwa 90% deacetyliert ist und ein Molekulargewicht von 600 000 bis 800 000 aufweist.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wo bei das zur Behandlung der Matrix verwendete Klebe mittel ein Fibrin-Kleber zur biologischen Wundver sorgung ist, der mindestens die beiden Komponenten Fibrinogen und Thrombin umfaßt, oder konditionier tes Medium.

8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Matrix zu erst mit der Fibrinogen-Komponente des Fibrin- Klebers behandelt wird und die Thrombin-Komponente des Fibrin-Klebers danach zusammen mit den in vitro kultivierten Zellen und/oder neurogenen Zellen auf die Matrix aufgetragen wird oder die Matrix zuerst mit konditioniertem Medium behandelt wird und die kultivierten Zellen im Anschluß in konditioniertem Medium aufgebracht werden.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wo bei es sich bei den in vitro kultivierten gewebe- oder organtypischen oder gewebe- oder organuntypi schen Zellen um nicht-krankhaft veränderte, nicht- entartete, krankhaft veränderte, entartete oder gentechnisch veränderte Zellen oder ein Gemisch da von handelt.

10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei die in vitro kultivierten gewebe- oder organtypischen oder gewe be- oder organuntypischen Zellen aus einer mensch lichen oder tierischen Biopsie-Probe stammen.

11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Biopsie- Probe aus einer menschlichen oder tierischen Harn röhre stammt.

12. Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Biopsie- Probe aus einer menschlichen oder tierischen Harn blase stammt.

13. Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Biopsie- Probe aus einem menschlichen oder tierischen Harn leiter oder Nierenbecken stammt.

14. Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Biopsie- Probe aus einem menschlichen oder tierischen Samen leiter stammt.

15. Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Biopsie- Probe aus einem menschlichen oder tierischen Eilei ter stammt.

16. Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Biopsie- Probe aus einem menschlichen oder tierischen Blut gefäß stammt.

17. Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Biopsie- Probe aus menschlichem oder tierischem Dünndarm stammt.

18. Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Biopsie- Probe aus menschlichem oder tierischem Dickdarm stammt.

19. Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Biopsie- Probe aus menschlicher oder tierischer Haut stammt.

20. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 19, wobei die Biopsie-Probe mit Hilfe einer Schere, ei nes Skalpells, einer Pinzette und/oder eines ähnli chen geeigneten Instruments mechanisch in einzelne Gewebeschichten getrennt und die einzelnen Gewebe schichten mechanisch zerkleinert werden.

21. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 20, wobei die mechanisch getrennten und zerkleinerten Gewebeschichten zur Gewinnung einzelner isolierter Zelltypen einem separaten enzymatischen Verdau un ter Verwendung eines Protease-Gemisches unterworfen werden.

22. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 21, wobei der enzymatische Verdau der getrennten und zerkleinerten Gewebeschichten durch Zugabe von FCS oder Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor gestoppt wird.

23. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 22, wobei das durch enzymatischen Verdau oder durch Explantkultivierung gewonnene Zellgemisch jeder Ge webeschicht zur Anreicherung von Zellen jedes Zell typs einer separaten in vitro-Kultivierung in einem zellspezifischen Medium unterworfen wird.

24. Verfahren nach Anspruch 23, wobei das zellspe zifische Medium ein Medium ist, dessen Bestandteile mittels chemischer Syntheseverfahren und/oder gen technischer Verfahren hergestellt sind.

25. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 24, wobei die Zellen jedes Zelltyps während der in vitro-Kultivierung bei einer Konfluenz von 50% bis 75% einer Passage in frisches Medium unterworfen werden.

26. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 25, wobei die Zellen jedes Zelltyps nach der zweiten oder dritten Passage in vitro zum Aussäen auf der biologischen Matrix verwendet werden.

27. Verfahren nach Anspruch 26, wobei die kulti vierten Zellen von mindestens einem Zelltyp auf der Unterseite der Matrix ausgesät werden.

28. Verfahren nach Anspruch 26, wobei die kulti vierten Zellen von mindestens einem anderen Zelltyp auf der Oberseite der Matrix ausgesät werden.

29. Verfahren nach einem der Ansprüche 26 bis 28, wobei die kultivierten Zellen auf der Unterseite und auf der Oberseite des Matrix in einer Dichte von 0,01 × 10⁶ bis 1 × 10⁶ Zellen/cm² Matrix ausge sät werden.

30. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 29, wobei es sich bei den auf der Matrix ausgebrachten neurogenen Zellen um aus Darmtänien oder aus nati vem Blasengewebe isolierte Zellen handelt.

31. Verfahren nach Anspruch 30, wobei die neuroge nen Zellen in einer Dichte von 1 × 10² Zellen/cm² auf der Unterseite der Matrix ausgesät werden.

32. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 31, wobei die Matrix mit den ausgesäten kultivierten Zellen und neurogenen Zellen unter geeigneten Kul tivierungsbedingungen mindestens die Nacht über o der im Fall der Explantkultivierung 10 bis 14 Tage kultiviert wird.

33. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 20, wobei die mechanisch getrennten und zerkleinerten Gewebeschichten zur Gewinnung einzelner isolierter Zelltypen einer Explantkultur auf einer Matrix un terworfen werden.

34. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 33, wobei die Herstellung des in vitro-Gewebes in einem Zellreaktor erfolgt.

35. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 34, wobei die kultivierte Zellen und neurogene Zellen enthaltende flache Matrix zu einem zylinderförmigen Hohlorgan mit einem dem nativen Organ entsprechen den Durchmesser geformt wird und die Zylinderform der Matrix unter Verwendung eines Fibrinklebers und/oder von chirurgischem Nahtmaterial fixiert wird.

36. Partielles oder vollständiges menschliches oder tierisches in vitro-Harnröhren-Hohlorgan, herge stellt nach einem der Ansprüche 1 bis 11 und 20 bis 35.

37. Partielles oder vollständiges menschliches oder tierisches in vitro-Harnblasen-Hohlorgan, herge stellt nach einem der Ansprüche 1 bis 10, 12 und 20 bis 35.

38. Partielles oder vollständiges menschliches oder tierisches in vitro-Harnleiter/Nierenbecken- Hohlorgan, hergestellt nach einem der Ansprüche 1 bis 10, 13 und 20 bis 35.

39. Partielles oder vollständiges menschliches oder tierisches in vitro-Samenleiter-Hohlorgan, herge stellt nach einem der Ansprüche 1 bis 10, 14 und 20 bis 35.

40. Partielles oder vollständiges menschliches oder tierisches in vitro-Eileiter-Hohlorgan, hergestellt nach einem der Ansprüche 1 bis 10, 15 und 20 bis 35.

41. Partielles oder vollständiges menschliches oder tierisches in vitro-Blutgefäß-Hohlorgan, herge stellt nach einem der Ansprüche 1 bis 10, 16 und 20 bis 35.

42. Partielles oder vollständiges menschliches oder tierisches in vitro-Dünndarm-Hohlorgan, hergestellt nach einem der Ansprüche 1 bis 10, 17 und 20 bis 35.

43. Partielles oder vollständiges menschliches oder tierisches in vitro-Dickdarm-Hohlorgan, hergestellt nach einem der Ansprüche 1 bis 10, 18 und 20 bis 35.

44. Partielles oder vollständiges menschliches oder tierisches in vitro-Bindegewebsäquivalent, herge stellt nach einem der Ansprüche 1 bis 10 und 19 bis 35.

45. Verwendung eines partiellen oder vollständigen menschlichen oder tierischen in-vitro-Harnröhren- Hohlorgans nach Anspruch 36 als Transplantat zur Behandlung geschädigter oder erkrankter Harnröhren bereiche.

46. Verwendung eines partiellen oder vollständigen menschlichen oder tierischen in-vitro-Harnblasen- Hohlorgans nach Anspruch 37 als Transplantat zur Behandlung geschädigter oder erkrankter Harnblasen bereiche.

47. Verwendung eines partiellen oder vollständigen menschlichen oder tierischen in-vitro- Harnleiter/Nierenbecken-Hohlorgans nach Anspruch 38 als Transplantat zur Behandlung geschädigter oder erkrankter Harnleiterbereiche.

48. Verwendung eines partiellen oder vollständigen menschlichen oder tierischen in-vitro-Samenleiter- Hohlorgans nach Anspruch 39 als Transplantat zur Behandlung geschädigter oder erkrankter Samenlei terbereiche.

49. Verwendung eines partiellen oder vollständigen menschlichen oder tierischen in-vitro-Eileiter- Hohlorgans nach Anspruch 40 als Transplantat zur Behandlung geschädigter oder erkrankter Eileiterbe reiche.

50. Verwendung eines partiellen oder vollständigen menschlichen oder tierischen in-vitro-Blutgefäß- Hohlorgans nach Anspruch 41 als Transplantat zur Behandlung geschädigter oder erkrankter Blutgefäß bereiche.

51. Verwendung eines partiellen oder vollständigen menschlichen oder tierischen in-vitro-Dünndarm- Hohlorgans nach Anspruch 42 als Transplantat zur Behandlung geschädigter oder erkrankter Dünndarmbe reiche.

52. Verwendung eines partiellen oder vollständigen menschlichen oder tierischen in-vitro-Dickdarm- Hohlorgans nach Anspruch 43 als Transplantat zur Behandlung geschädigter oder erkrankter Dickdarmbe reiche.

53. Verwendung eines partiellen oder vollständigen menschlichen oder tierischen in vitro- Bindegewebsäquivalents nach Anspruch 44 als Trans plantat zur Behandlung von Fisteln und zur "Hebung" von Organen in Form einer Schlingenplastik.

54. Verwendung eines ein- oder mehrschichtigen menschlichen oder tierischen in vitro- Gewebesystems, hergestellt nach einem der Ansprüche 1 bis 35 oder eines partiellen oder vollständigen, menschlichen oder tierischen in vitro-Hohlorgans nach einem der Ansprüche 36 bis 44 als Testsystem zur Bestimmung der Wirkung eines Wirkstoffes auf menschliche oder tierische Zellen, wobei der Wirk stoff mit dem in vitro-Organ- oder Gewebesystem in Kontakt gebracht wird und die Wechselwirkung zwi schen dem in vitro-Organ- oder Gewebesystem und dem Wirkstoff bestimmt wird.

55. Verwendung eines ein- oder mehrschichtigen menschlichen oder tierischen in vitro- Gewebesystems, hergestellt nach einem der Ansprüche 1 bis 35 oder eines partiellen oder vollständigen, menschlichen oder tierischen in vitro-Hohlorgans nach einem der Ansprüche 36 bis 44 als Testsystem zur Bestimmung der Wirkung von Wirkstoffen auf krankhaft veränderte menschliche oder tierische Zellen, wobei der Wirkstoff mit dem krankhaft ver änderte Zellen enthaltenden in vitro-Organ- oder Gewebesystem in Kontakt gebracht wird und die Wech selwirkung zwischen dem krankhaft veränderte Zellen enthaltenden in vitro-Organ- oder Gewebesystem und dem Wirkstoff bestimmt wird.