DE60028616T2

DE60028616T2 - Methoden und zusammensetzungen für die rekonstruktion von mehrschichtigen gewebestrukturen

Info

Publication number: DE60028616T2
Application number: DE60028616T
Authority: DE
Inventors: Anthony Weston ATALA
Original assignee: Childrens Medical Center Corp
Current assignee: Childrens Medical Center Corp
Priority date: 1999-12-29
Filing date: 2000-12-14
Publication date: 2007-01-11
Anticipated expiration: 2020-12-15
Also published as: EP1261692A1; JP2003527170A; AU778222B2; ATE329010T1; US6428802B1; DE60028616D1; EP1261692B1; ES2264425T3; WO2001049827A1; CA2395674A1; AU2096301A; CA2395674C

Description

Hintergrund der Erfindung
Das technische Gebiet der vorliegenden Erfindung ist die Herstellung von künstlichen Organen in vitro mit der nachfolgenden Implantation des künstlichen Organs in vivo und insbesondere die Herstellung von mehrschichtigen zellulären Organen mit einer natürlichen Grenzfläche zwischen den Gewebeschichten.
Ein beträchtliches Ausmaß der Bemühungen in der medizinischen Gemeinschaft ist auf den Ersatz von erkrankten Organen durch Austauschen des ganzen Organs oder eines Teils davon gerichtet. In vielen Fällen sind diese Organe vollständig künstlich, etwa künstliche Herzen, oder vollständig natürlich, etwa die Organe von zu den Säugetieren gehörenden Spendern. In beiden Bereichen gibt es jedoch Einschränkungen. Bei der Transplantation von natürlichen Organen besteht das potentielle Risiko der Übertragung von Krankheiten wie AIDS und Hepatitis und der Abstoßung des transplantierten Organs. Auch ist die Verfügbarkeit eines Spenderorgans oft ein begrenzender Faktor. Bei künstlichen Organen gibt es Komplikationen, die mit dem Auftreten von mechanischen Ausfällen und der Steinbildung verbunden sind.
Es wurden verschiedene Versuche unternommen, erkrankte Organe und erkranktes Gewebe zu rekonstruieren. Anfangs wurde die Möglichkeit des Überlebens der Zellen durch Injizieren von Suspensionen dissoziierter Zellen in anderes Gewebe wie Fett, Leber oder das Grundgewebe von Gastgewebe demonstriert, wobei das Gewebe die Matrix für die Anordnung und Reorganisation der Zellen bilden sollte. Es wurde jedoch keine anhaltende Zunahme der Zellenmasse beobachtet, wodurch die Grenzen des Versuchs aufgezeigt wurden, Wachstum und Strukturbildung von neuem Gewebe in bereits existierendem Gewebe zu erreichen (siehe Cima et al., J. Biomech. Engr. 113 (1991) 143–151).
Alternativ wurden Organe auf verschiedenen Matrizen erzeugt. Die Zellmorphologie und die Stoffwechselaktivität von kultivierten Zellen werden von der Zusammensetzung der Matrix beeinflußt, auf der sie wachsen. Es ist anzunehmen, daß kultivierte Zellen dann am besten funktionieren (d.h. sich vermehren und ihre natürlichen in-vivo-Funktionen ausführen), wenn sie auf Matrizen kultiviert werden, die ihrer natürlichen Umgebung sehr ähnlich sind. Zur Zeit wird das in-vitro-Studium der Zellfunktionen durch die Verfügbarkeit von Zellwachstumsmatrizen eingeschränkt, die für die Vermehrung und Entwicklung der kultivierten Zellen eine geeignete physiologische Umgebung bilden. Zum Beispiel haben Naughton et al. ein Kultursystem auf der Basis von fibroblastischen Stromazellen verwendet, um eine Anzahl von verschiedenen Zellen zu kultivieren (siehe WO 96/40175).
Eine weitere Einschränkung bei der Organ-Rekonstruktion ist die Nachbildung der Zellorganisation bei einem Organ mit mehreren Schichten. Viele Organe sind aus mehreren Schichten unterschiedlicher Gewebearten für die verschiedenen Eigenschaften des Organs aufgebaut. Zum Beispiel weist die Blase drei Haupt-Gewebeschichten auf: Die Mukosa, die Submukosa und den Detrusor. Die Mukosa mit den Harnwegsepithelzellen ist die innerste Schicht und aus dem Übergangszellepithelium zusammengesetzt. Die Submukosa liegt unmittelbar unter der Mukosa und deren Grundmembran. Sie ist eine Schicht aus interstitionellen Proteinen, die Blutgefäße enthält und die Mukosa mit Nährstoffen versorgt und die Lymphknoten bei der Entfernung von Abfallstoffen unterstützt. Die Submukosa hat eine wichtige Funktion, sie wird im Grenzbereich zwischen der Mukosa und dem Detrusor erzeugt. Der Detrusor ist eine Schicht aus glatten Muskelzellen, die sich bei der Aufnahme von Urin erweitern und zum Ausstoßen des Urins zusammenziehen. Die natürliche Grenzfläche, die in vivo zwischen den verschiedenen Zellpopulationen entsteht, führt zu der Ausbildung von biologischen Merkmalen, die wichtige strukturelle und funktionelle Eigenschaften aufweisen, zum Beispiel die Ausbildung der Submukosa, die der Mukosa Nährstoffe zuführt.
Die Rekonstruktion eines mehrschichtigen Organs umfaßt bisher in der Regel das Beschichten der beiden Seiten einer synthetischen Matrix mit verschiedenen Zellpopulationen. Dabei dient die Matrix als eine künstliche Barriere zwischen den verschiedenen Zellpopulationen (siehe Atala et al., US-Anmeldenr. 60/063790, eingereicht am 31. Oktober 1997, mit dem Titel "Blasen-Rekonstruktion"; Atala, WO 99/22781; Oberpenning et al., Nature Biotechn. 17 (1999) 149–155). Eine andere Matrix ist die Submukosa der Blase, die auf verschiedenen Seiten mit zwei unterschiedlichen Zellpopulationen beschichtet wurde (siehe Atala, WO 98/06445), oder eine dezellularisierte extrazelluläre Matrix (siehe Hu, US 5 916 265 ). Auch wenn zwischen den beiden unterschiedlichen Zellpopulationen durch die Poren der Matrix eine gewisse Wechselwirkung erfolgt, so ist diese Wechselwirkung doch bestenfalls minimal, und es fehlen die Eigenschaften der Wechselwirkungen zwischen den einzelnen Zellen, die das ganze Gewebe in vivo aufweist. Dadurch werden eine normale Funktion und die morphologische Wechselwirkung verhindert, die zu der Ausbildung von biologischem Material führt, etwa zu der Ausbildung von Epithelzellen wie in der Blasen-Submukosa, der Mund-Submukosa und dem Nasen-Epithelium. Das Vorhandensein der Submukosa sorgt für Wachstumfaktoren und stellt andere Proteine bereit, die die normale Teilung und Ausdifferentiation fördern.
Es besteht daher ein Bedarf an künstlichen Organen, die zwischen verschiedenen Zellpopulationen eine natürliche Grenzfläche aufweisen, um künstliche Organe herstellen zu können, die die Grenzfläche von natürlichen in-vivo-Organen besser nachbilden.
Zusammenfassung der Erfindung
Aufgabe der Erfindung ist es, künstliche Organe mit einer chimären Grenzfläche zwischen zwei verschiedenen Zellpopulationen zu schaffen, die die Grenzfläche eines natürlichen in-vivo-Organs besser nachbildet.
Aufgabe der Erfindung ist es, Verfahren zum Herstellen von künstlichen Organen mit einer chimären Grenzfläche zwischen zwei verschiedenen Zellpopulationen zu schaffen, die die Grenzfläche eines natürlichen in-vivo-Organs besser nachbildet.
Aufgabe der Erfindung ist es, künstliche Organe zu schaffen, deren Zellen ihre normale Morphologie und ihre Zellfunktionen behalten.
Die Erfindung beruht zum Teil auf der Feststellung, daß das Wachstum von verschiedenen Zellpopulationen auf einem biokompatiblen Substrat mit einer chimären Grenzfläche zwischen den verschiedenen Zellpopulationen neues interstitionelles Biomaterial erzeugt, das dem entsprechenden Biomaterial in einem natürlichen in-vivo-Organ entspricht. Dies kann dadurch erreicht werden, daß die aktive Vermehrung von heterogenen Mehrfachschichten aus verschiedenen Zellpopulationen in einer Kultur aufrecht erhalten wird, wobei jede der Mehrfachschichten das entsprechende spezifische Organgewebe eines in-vivo-Organs darstellt. Dies kann zum Teil an der Art des Erzeugens der Mehrfachschichten liegen. Mehrfachschichten werden dadurch erzeugt, daß auf einem biokompatiblen Substrat zuerst eine Schicht nach der anderen einer ersten homogenen Zellpopulation kultiviert wird, bis sich die Zellen jeder Schicht aktiv vermehren. Die Mehrfachschichten bleiben im Brutschrank, bis sich die Zellen entwickeln und vermehren, um die Struktur und Morphologie des entsprechenden spezifischen Organgewebes des in-vivo-Organs nachzubilden.
Die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren entwickelten Mehrfachschichten erzeugen daher die Proteine, Wachstumsfaktoren und Regelfaktoren, die erforderlich sind, um eine nachhaltige Vermehrung der homogenen Zellpopulation zu unterstützen. Nach der Ausbildung der ersten Mehrfachschicht bildet diese die Oberfläche zum Erzeugen der zweiten Mehrfachschicht. Die zweite Mehrfachschicht umfaßt eine zweite homogene Zellpopulation, die sich von der ersten homogenen Zellpopulation unterscheidet. Die zweite Mehrfachschicht entsteht durch Kultivieren der zweiten homogenen Zellpopulation eine Schicht nach der anderen, bis sich die Zellen jeder Schicht aktiv vermehren, um die Zellen-Mehrfachschicht aufzubauen.
Dort, wo die Zellen der beiden Mehrfachschichten in Kontakt stehen, entsteht eine chimäre Grenzfläche. Dadurch ergibt sich auf zellulärer Ebene eine Mikroumgebung, die der eines multizellularen in-vivo-Organs analog ist. Durch das Erzeugen einer solchen Mikroumgebung vermehren, differenzieren und trennen sich die Zellen unbehindert von strukturellen Einschränkungen an der Grenzfläche so, wie sie es in vivo tun würden. Dadurch können die Zellen an der Grenzfläche auch eine natürlichere Morphologie, Struktur und räumliche Verteilung annehmen, die den Zuständen in vivo besser entsprechen. Das Wachstum der Zellen an der chimären Grenzfläche kann durch das Zugeben von Proteinen, Glykoproteinen, Glykosaminoglykan, einer zellulären Matrix und anderer Materialien zwischen den verschiedenen Mehrfachschichten weiter gefördert werden.
Gemäß einem ersten Aspekt umfaßt damit die Erfindung ein künstliches Organkonstrukt mit:
einer ersten kultivierten Mehrfachschicht aus Zellen, die aus einer ersten Zellpopulation gewonnen werden; und mit
einer zweiten kultivierten Mehrfachschicht aus Zellen, die aus einer zweiten Zellpopulation gewonnen werden, die von der ersten Zellpopulation verschieden ist, wobei die zweite Mehrfachschicht derart über eine chimäre Grenzfläche mit der ersten Mehrfachschicht verbunden ist, daß das Konstrukt nach der Implantation ein funktionelles Äquivalent einer natürlichen biologischen Struktur darstellt.
In einer Ausführungsform umfaßt das künstliche Organ ferner eine dritte kultivierte Mehrfachschicht aus Zellen, die aus einer dritten Zellpopulation gewonnen werden, die von der ersten und der zweiten Zellpopulation verschieden ist, wobei die dritte Mehrfachschicht über eine chimäre Grenzfläche mit der zweiten Mehrfachschicht verbunden ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt die chimäre Grenzfläche ferner ein interstitielles Biomaterial, das durch wenigstens eine der Mehrfachschichten erzeugt wird. Das interstitielle Biomaterial umfaßt vorzugsweise Zellen mit einer normalen Morphologie.
In einer anderen Ausführungsform umfaßt das künstliche Organ ferner Schichtungsfaktoren zwischen der ersten und der zweiten Mehrfachschicht, wobei die Faktoren aus Nährstoffen, Wachstumsfaktoren, Zytokinen, extrazellulären Matrixkomponenten, Differentiations-Einleitern, Sekretionsprodukten, Immunmodulatoren und/oder biologisch aktiven Verbindungen bestehen, die das Wachstum des Zellennetzwerks oder von Nervenfasern steigern oder ermöglichen.
In einer Ausführungsform ist das künstliche Organ das Herz, die Niere, die Leber, die Bauchspeicheldrüse, die Milz, die Blase, der Harnleiter oder die Harnröhre. In einer anderen Ausführungsform ist das künstliche Organ ein Teil des Herzens, der Niere, der Leber, der Bauchspeicheldrüse, der Milz, der Blase, des Harnleiters oder der Harnröhre.
Gemäß einem anderen Aspekt umfaßt die Erfindung ein künstliches Blasenkonstrukt mit
einer ersten kultivierten Mehrfachschicht aus Zellen, die aus einer Zellpopulation glatter Muskelzellen gewonnen werden; und mit
einer zweiten kultivierten Mehrfachschicht aus Zellen, die aus einer Harnwegsepithel-Zellpopulation gewonnen werden, wobei die zweite Mehrfachschicht derart über eine chimäre Grenzfläche mit der ersten Mehrfachschicht verbunden ist, daß das Konstrukt nach der Implantation das funktionelle Äquivalent einer natürlichen Blase darstellt.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt die chimäre Grenzfläche eine interstitielle Submukosa, die durch wenigstens eine der Mehrfachschichten gebildet wird.
Gemäß einem weiteren Aspekt umfaßt die Erfindung ein Verfahren zum Herstellen eines künstlichen Organkonstrukts, mit
dem Bereitstellen eines biokompatiblen Substrats in der Form eines Organs;
dem Erzeugen einer ersten kultivierten Mehrfachschicht aus Zellen, die aus einer ersten Zellpopulation gewonnen werden, auf einer Fläche des biokompatiblen Substrats, wobei die erste Mehrfachschicht an das biokompatible Substrat angebracht wird; und mit
dem Erzeugen einer zweiten kultivierten Mehrfachschicht aus Zellen, die aus einer zweiten Zellpopulation gewonnen wurden, die von der ersten Zellpopulation verschieden ist, wobei die zweite Mehrfachschicht derart über eine chimäre Grenzfläche mit der ersten Mehrfachschicht verbunden wird, daß das Konstrukt nach der Implantation das funktionelle Äquivalent einer natürlichen biologischen Struktur darstellt, wodurch ein künstliches Organkonstrukt geschaffen wird.
In einer Ausführungsform ist das biokompatible Substrat ein Polymer. In einer anderen Ausführungsform ist das biokompatible Substrat ein dezellularisiertes Organ. In einer Ausführungsform ist das dezellularisierte Organ das Herz, die Niere, die Leber, die Bauchspeicheldrüse, die Milz, die Blase, der Harnleiter oder die Harnröhre. In einer anderen Ausführungsform ist das dezellularisierte Organ ein Teil des Herzens, der Niere, der Leber, der Bauchspeicheldrüse, der Milz, der Blase, des Harnleiters oder der Harnröhre.
Gemäß einem weiteren Aspekt umfaßt die Erfindung ein Verfahren zum Herstellen eines künstliches Blasenkonstrukts, mit
dem Bereitstellen eines biokompatiblen Substrats in der Form einer Blase;
dem Erzeugen einer ersten kultivierten Mehrfachschicht aus einer Population glatter Muskelzellen auf einer Fläche des biokompatiblen Substrats, wobei die erste Mehrfachschicht am biokompatiblen Substrat angebracht wird; und mit
dem Erzeugen einer zweiten kultivierten Mehrfachschicht aus einer Harnwegsepithel-Zellpopulation, wobei die zweite Mehrfachschicht derart über eine chimäre Grenzfläche mit der ersten Mehrfachschicht verbunden wird, daß das Konstrukt nach der Implantation das funktionelle Äquivalent einer natürlichen Blase darstellt, wodurch ein künstliches Blasenkonstrukt hergestellt wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt die chimäre Grenzfläche eine interstitionelle Submukosa, die von wenigstens einer der Mehrfachschichten gebildet wird.
Genaue Beschreibung
Zum besseren Verständnis der Erfindung werden zuerst einige Bezeichnungen definiert.
Die Bezeichnung "Mehrfachschicht" bezieht sich in der hier vorliegenden Verwendung auf eine Anordnung mit mehreren Schichten einer homogenen, kultivierten Zellpopulation, die übereinander liegen. Der Prozeß zum Erzeugen einer "Mehrfachschicht" umfaßt das Aufbringen einer Schicht einer Zellpopulation auf eine Oberfläche, z.B. ein biokompatibles Substrat. Die aufgebrachten Zellen werden in einem Wachstumsmedium kultiviert, bis sie sich entwickeln und vermehren und eine erste Monolage aus Zellen eines gewünschten Phänotyps und einer gewünschten Morphologie bilden. Nachdem die erste Monolage die gewünschte Zelldichte erreicht hat, wird darauf eine zweite Lage der gleichen Zellpopulation aufgebracht. Die zweite Lage der aufgebrachten Zellen wird in einem Wachstumsmedium kultiviert, das sowohl der zweiten Lage als auch der ersten Monolage Nährstoffe zuführt, bis die Zellen in der zweiten Lage sich entwickeln und vermehren und die gewünschte Zelldichte erreichen, um so eine Doppellage mit Zellen eines gewünschten Phänotyps und einer gewünschten Morphologie auszubilden. Auf die Doppellage wird eine dritte Lage der gleichen Zellpopulation aufgebracht, und die Zellen werden in einem Wachstumsmedium kultiviert, das der Doppellage und den Zellen der dritten Lage Nährstoffe zuführt, bis die Zellen der dritten Lage sich entwickeln und vermehren und die gewünschte Dichte erreichen, um eine Dreifachlage mit einem gewünschten Phänotyp und einer gewünschten Morphologie auszubilden. Der Vorgang wird wiederholt, bis eine Mehrfachschicht mit vielen Lagen einer homogenen Zellpopulation erzeugt wird. Die Eigenschaften der Mehrfachschicht entsprechen weitgehend der Morphologie und den funktionellen Eigenschaften des spezifischen Organgewebes eines in-vivo-Organs. Zum Beispiel kann eine Mehrfachschicht mit einer Population glatter Muskelzellen die funktionellen Eigenschaften des Gewebes glatter Muskelzellen einer Blase, d.h. des Detrusors, aufweisen.
Der Term "verbunden" bezieht sich in der vorliegenden Verwendung auf die gegenseitigen engen Wechselwirkungen zwischen zwei verschiedenen Zellpopulationen, die miteinander in Kontakt stehen. Diese gegenseitigen Wechselwirkungen umfassen die Zellen-Zellen-Wechselwirkung, das Wachstum, die Entwicklung und die Vermehrung. Das für die Entwicklung, die Reparatur und die Aufrechterhaltung von Geweben verantwortliche Zellenverhalten wird großteils durch die Wechselwirkungen zwischen den Zellen und den Komponenten ihrer Mikroumgebung geregelt. Diese Wechselwirkungen werden durch Oberflächenmoleküle der Zellen vermittelt, die Wachstumsfaktoren, Enzyme und andere Moleküle an sich binden, die Reaktionen auslösen, die zu einer Änderungen des Zellen-Phänotyps führen. Diese Wechselwirkungen führen auch zu der Erzeugung von neuen Zellen, die dann in der Lage sein können, Zellenmaterial mit bestimmten funktionalen Eigenschaften zu erzeugen, die sich von den funktionalen Eigenschaften jeder der verschiedenen Zellpopulationen unterscheiden.
Die Bezeichnung "chimäre Grenzfläche" bezieht sich in der vorliegenden Verwendung auf die zwischen zwei verschiedenen Zellpopulationen ausgebildete Grenze.
Die Bezeichnung "funktionales Äquivalent" bezieht sich in der vorliegenden Verwendung auf eine Struktur, z.B. ein künstliches Organ, das mit dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt wurde, das sich gleich oder ähnlich wie ein natürliches Organ verhält. Zum Beispiel hat die künstliche Blase die gleichen funktionalen Eigenschaften wie eine in-vivo-Blase.
Die Bezeichnung "interstitielles Biomaterial" bezieht sich in der vorliegenden Verwendung auf die Ausbildung von Zellmaterial an der chimären Grenzfläche, an der zwei verschiedene Zellpopulationen miteinander in Kontakt stehen. Die Bezeichnung "interstitielles Biomaterial" soll in ihrer allgemeinsten Bedeutung die Ausbildung jedes neuen Zellmaterials umfassen, das sich bildet, wenn zwei oder mehr verschiedene Zellpopulationen miteinander in Kontakt stehen. Das neue Zellmaterial gleicht dem äquivalenten Zellmaterial, das in der normalen in-vivo-Entwicklung der Zellen des Organs entsteht. Zum Beispiel stehen bei der Rekonstruktion einer künstlichen Blase als die beiden verschiedenen Zellpopulationen die glatte Muskelzellenpopulation und die Harnwegsepithel-Zellpopulation miteinander in Kontakt. Das an der Grenzfläche dieser beiden Populationen ausgebildete "interstitielle Biomaterial" gleicht daher der Submukosa.
Der Ausdruck "urogenitale Störung" bezieht sich in der vorliegenden Verwendung auf eine Erkrankung oder Infektion, die die normale Funktion der Blase, des Harnleiters oder der Harnröhre beeinflußt.
Die Bezeichnung "Subjekt" soll hier lebende Organismen umfassen, die einer Immunantwort unterliegen. Bevorzugte Subjekte sind Säugetiere. Beispiele für Subjekte sind, ohne darauf beschränkt zu sein, Menschen, Affen, Hunde, Katzen, Mäuse, Ratten, Kühe, Pferde, Schweine, Ziegen und Schafe.
Die Bezeichnung "biokompatibles Substrat" bezieht sich in der vorliegenden Verwendung auf ein Material, das zur Implantation in ein Subjekt geeignet ist und auf das eine Zellpopulation aufgebracht werden kann. Ein biokompatibles Substrat verursacht nach der Implantation in das Subjekt keine toxischen oder schädlichen Effekte. In einer Ausführungsform ist das biokompatible Substrat ein Polymer mit einer Oberfläche, die in die Form des gewünschten Organs gebracht werden kann, das zu ersetzen ist. Das Polymer kann auch in die Form eines Teils des Organs gebracht werden, der zu ersetzen ist.
In einer anderen Ausführungsform ist das biokompatible Substrat eine dezellularisierte Struktur. Die Bezeichnung "dezellularisierte Struktur" bezieht sich in der vorliegenden Verwendung auf eine dreidimensionale biologische Anordnung (z.B. ein Organ), die durch einen Prozeß hergestellt wird, bei dem der ganze Gehalt an Zellen und an Gewebe entfernt wird und nur die komplexe Infrastruktur zurückbleibt. Organe wie die Blase oder die Niere sind aus verschiedenen spezialisierten Geweben zusammengesetzt. Die spezialisierte Gewebestruktur eines Organs ist das spezielle Organgewebe, das die spezifische Funktion des Organs bewerkstelligt. Das faserige Stütznetzwerk des Organs ist das Stroma. Die meisten Organe weisen ein Stromagerüst auf, das aus nicht spezialisiertem Bindegewebe besteht, das das spezialisierte Gewebe hält. Bei dem Prozeß der Dezellularisierung wird das spezialisierte Gewebe entfernt, so daß nur das komplexe dreidimensionale Netzwerk des Bindegewebes übrig bleibt. Die Bindegewebe-Infrastruktur besteht vor allem aus Kollagen. Die Bezeichnung "dezellularisierte Struktur" soll das ganze Organ umfassen, aus dem das Zellmaterial und das Gewebematerial entfernt wurden. Die Bezeichnung "dezellularisierte Struktur" soll auch Teile einer Organstruktur umfassen, z.B. die Nierenarterie einer Niere, aus der das Zellmaterial und das Gewebematerial entfernt wurden. Die dezellularisierte Struktur stellt ein biokompatibles Substrat dar, auf das verschiedene Zellpopulationen aufgebracht werden können. Dezellularisierte Strukturen können starr sein oder halbstarr mit der Fähigkeit, ihre Form zu ändern. Zum Beispiel kann sich eine dezellularisierte Blase erweitern, wenn sie mit einem Fluid gefüllt wird, wobei sie in ihre ursprüngliche Form zurückkehrt, wenn das Fluid wieder entfernt wird. Beispiele für dezellularisierte Organe umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, das Herz, die Niere, die Leber, die Bauschspeicheldrüse, die Milz, die Blase, den Harnleiter und die Harnröhre.
Die vorliegende Erfindung beschreibt den Aufbau und das Verfahren für eine in-vitro-Organrekonstruktion. Allgemein umfaßt die vorliegende Erfindung mehrzellige Organe mit wenigstens zwei verschiedenen Zellpopulationen. Die Organkonstrukte umfassen eine erste kultivierte Mehrfachschicht aus Zellen einer ersten Zellpopulation und eine zweite kultivierte Mehrfachschicht aus Zellen einer zweiten Zellpopulation, die sich von der ersten Zellpopulation unterscheidet, wobei die zweite Mehrfachschicht über eine chimäre Grenzfläche mit der erstem Mehrfachschicht verbunden ist, um ein Konstrukt zu erzeugen, das das funktionelle Äquivalent einer natürlichen biologischen Struktur ist.
Die Erfindung umfaßt auch Verfahren zum Herstellen von künstlichen Organen unter Verwendung eines biokompatiblen Substrats in der Form eines Organs durch Erzeugen einer ersten kultivierten Mehrfachschicht aus Zellen einer ersten Zellpopulation auf einem Bereich des biokompatiblen Substrats, wobei die erste Mehrfachschicht am biokompatiblen Substrat angebracht wird; und durch Erzeugen einer zweiten kultivierten Mehrfachschicht aus Zellen einer zweiten Zellpopulation, die sich von der ersten Zellpopulation unterscheidet, wobei die zweite Mehrfachschicht derart über eine chimäre Grenzfläche mit der erstem Mehrfachschicht verbunden ist, daß das Konstrukt nach der Implantation das funktionelle Äquivalent einer natürlichen biologischen Struktur ist, um dadurch ein künstliches Organkonstrukt herzustellen.
In den folgenden Abschnitten sind verschiedene Aspekte der Erfindung genauer beschrieben.
I. Das Kultivieren von Zellen für die Organ-Rekonstruktion
Ein Aspekt der Erfindung betrifft künstliche Organkonstrukte mit wenigstens zwei verschiedenen Zellpopulationen. Die künstlichen Konstrukte können allogene künstliche Konstrukte sein, bei denen die verschiedenen Zellpopulationen aus dem Gewebe des Subjekts selbst gewonnen werden. Zum Beispiel können die Zellen von einem menschlichen Organ wie der Blase, dem Harnleiter, der Harnröhre oder anderem urogenitalem Gewebe stammen. Das künstliche Organkonstrukt kann auch xenogen sein, wobei die verschiedenen Zellpopulationen von einer Säugetierart stammen, die sich von der des Subjekts unterscheidet. Zum Beispiel können die Zellen aus Organen von Säugetieren wie den Menschen, Affen, Hunden, Katzen, Mäusen, Ratten, Kühen, Pferden, Schweinen, Ziegen und Schafen stammen.
Die Zellen können aus verschiedenen Quellen isoliert werden, zum Beispiel von Biopsien oder Autopsien stammen. Die isolierten Zellen sind vorzugsweise autologe Zellen, die durch eine Biopsie am Subjekt erhalten werden, zum Beispiel durch eine Biopsie des Skelettmuskels am Arm, Vorderarm oder den unteren Extremitäten oder von glatten Muskeln aus einem Bereich, der durch eine kleine Menge subkutan injiziertes Lidocain lokal betäubt wurde, wobei die Zellen dann in einer Kultur angesetzt werden. Die Biopsie kann mit einer Biopsienadel erfolgen, einer Schnellwirkungsnadel, die den Vorgang schnell und einfach macht. Der kleine Biopsiekern von einem Skelettmuskel oder einem glatten Muskel kann dann expandiert und kultiviert werden, wie es von Atala et al. in J. Urol. 148 (1992) 658–62, Atala et al. in J. Urol. 150 (1993) 608–12 und im Beispiel 1 beschrieben ist. Zellen von Verwandten oder anderen Spendern der gleichen Art können bei geeigneter Immunosuppression ebenfalls verwendet werden.
Verfahren zur Isolierung und Kultivierung von Zellen sind in Fauza et al., J. Ped. Surg. 33 (1998) 7–12 beschrieben. Diese Druckschrift wird hiermit durch Bezugnahme eingeschlossen. Die Zellen können mit den Techniken isoliert werden, die dem Fachmann bekannt sind. Zum Beispiel kann das Gewebe oder Organ mechanisch zerlegt und/oder mit Verdauungsenzymen und/oder Chelatierungsmitteln behandelt werden, die die Verbindungen zwischen benachbarten Zellen schwächen und es so ermöglichen, das Gewebe in eine Suspension von einzelnen Zellen zu zerlegen, ohne daß die Zellen zerbrechen. Durch Zerkleinern des Gewebes und Behandeln des zerkleinerten Gewebes mit einem oder mehreren von verschiedenen Verdauungsenzymen läßt sich eine enzymatische Dissoziation erreichen. Diese Enzyme umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, Trypsin, Chymotrypsin, Kollagenase, Elastase und/oder Hyaluronidase, DNase, Pronase und Dispase. Durch eine Anzahl von Methoden kann eine mechanische Zerlegung erreicht werden, zum Beispiel durch, ohne darauf beschränkt zu sein, Abschaben der Oberfläche des Organs, die Verwendung von Mühlen, Mischern, Sieben, Homogenisatoren, Druckzellen und Insonikatoren. Für einen Überblick über Gewebe-Zerlegungstechniken siehe Freshney, Culture of Animal Cells. A Manual of Basic Techniques, 2. Ausgabe, A. R. Liss, Inc., New York 1987, Kap. 9, Seiten 107–126.
Die bevorzugten Zelltypen umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, Harnwegsepithelzellen, Mesenchymalzellen, besonders glatte oder skeletale Muskelzellen, Myozyten (Muskel-Stammzellen), Fibroblasten, Chondrozyten, Adipozyten, Fibromyoblasten und ektodermale Zellen, einschließlich duktiler und Hautzellen, Hepozyten, Inselzellen, Zellen aus dem Darm und andere Parenchymalzellen, sowie Osteoblasten und andere Zellen, die Knochen oder Knorpel bilden. In manchen Fällen kann es wünschenswert sein, Nervenzellen einzuschließen. In einer bevorzugten Ausführungsform werden Harnwegsepithelzellen und glatte Muskelzellen isoliert. Es können Harnwegsepithelzellen und glatte Muskelzellen aller Entwicklungsstufen verwendet werden, etwa fetale, neonatale, juvenile oder adulte.
Nachdem das Gewebe auf eine Suspension von einzelnen Zellen reduziert wurde, kann die Suspension in Subpopulationen aufgeteilt werden, aus denen die Zellelemente erhalten werden können. Dies kann mit den Standardtechniken für die Zellenseparation erfolgen, einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein, dem Klonen und der Auswahl von bestimmten Zelltypen, der selektiven Zerstörung unerwünschter Zellen (negative Selektion), der Trennung auf der Basis der verschiedenen Zellanhaftung in der Mischpopulation, Gefrier-Tau-Prozessen, den unterschiedlichen Haftungseigenschaften der Zellen in der Mischpopulation, der Filtrierung, der herkömmlichen und der zonalen Zentrifugierung, der Zentrifugen-Abschlämmung (Gegenstrom-Zentrifugierung), der Schwerkrafttrennung, der Gegenstromverteilung, der Elektrophorese und der fluoreszenzaktivierten Zellsortierung. Für einen Überblick über die klonale Auswahl und die Zellseparationstechniken siehe Freshney, Culture of Animal Cells. A Manual of Basic Techniques, 2. Ausgabe, A. R. Liss, Inc., New York 1987, Kap. 11 und 12, Seiten 137–168. Zum Beispiel können Harnwegsepithelzellen durch die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung angereichert werden und glatte Muskelzellen und Fibroblastzellen für die Sammlung der Harnwegsepithelzellen dadurch reduziert werden. Durch eine Sammlung glatter Muskelzellen können glatte Muskelzellen angereichert und Harnwegsepithelzellen und Fibroblastzellen reduziert werden.
Es kann auch eine Zellfraktionierung wünschenswert sein, zum Beispiel wenn der Spender eine Erkrankung wie Blasenkrebs oder Metastasen anderer Tumore an der Blase hat. Eine Blasenzellpopulation kann aussortiert werden, um bösartige Blasenzellen oder andere Tumorzellen von den normalen, nicht-kanzerogenen Blasenzellen zu trennen. Die mit einer oder mehreren Sortiertechniken isolierten normalen, nicht-kanzerogenen Blasenzellen können dann für die Blasenrekonstruktion verwendet werden.
Die isolierten Zellen können in vitro kultiviert werden, um die Anzahl der Zellen zu erhöhen, die zum Beschichten des biokompatiblen Substrats zur Verfügung stehen. Die Verwendung von allogenen Zellen und besser noch autologen Zellen wird wegen der Gefahr einer Gewebeabstoßung bevorzugt. Wenn in dem Subjekt nach der Implantation des künstlichen Organs eine immunologische Reaktion auftritt, kann das Subjekt mit Immunosuppressiva wie Cyclosporin oder FK506 behandelt werden, um die Gefahr einer Abstoßung zu verringern. In bestimmen Ausführungsformen werden chimäre Zellen oder Zellen von einem transgenen Tier auf das biokompatible Substrat aufgebracht.
Vor dem Aufbringen können die isolierten Zellen mit genetischem Material behandelt werden. Brauchbares genetisches Material kann zum Beispiel genetische Sequenzen umfassen, die eine Immunantwort im Empfänger verringern oder ausheben. Zum Beispiel kann die Expression von Zellenoberflächenantigenen wie Histokompatibilitäts-Antigenen Klasse I und Klasse II unterdrückt werden. Dadurch verringert sich die Gefahr, daß die transplantierten Zellen vom Empfänger abgestoßen werden. Zusätzlich kann die Transfektion auch für eine Genübertragung benutzt werden. Harnwegsepithel- und Muskelzellen können vor dem Aufbringen auf das biokompatible Substrat mit bestimmten Genen präpariert werden. Das Zell-Substrat-Konstrukt kann genetische Informationen enthalten, die für das längerfristige Überleben des Empfängers oder des künstlichen Organs von Nutzen sind.
Um eine normale oder zusätzliche Funktionen aufzuweisen, können die isolierten Zellen normal oder genetisch verändert sein. Es können die dem Fachmann bekannten Methoden angewendet werden, etwa die Methoden für eine genetische Veränderung von Zellen mit retroviralen Vektoren oder Polyethylenglykol. Darin eingeschlossen sind Expressionsvektoren, die Nukleinsäuremolkeüle in die Zellen transportieren und für deren Expres sion sorgen. (Siehe Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)).
Mittels herkömmlicher Transformations- oder Transfektionstechniken wird Vektor-DNA in Prokaryoten oder Zellen eingebracht. Geeignete Verfahren zum Transformieren oder Transfektieren von Wirtszellen sind in Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) und anderen Labor-Handbüchern beschrieben.
II. Die Organ-Rekonstruktion
Ein anderer Aspekt der Erfindung betrifft Verfahren zum Herstellen von mehrschichtigen künstlichen Organen. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das künstliche Organ auf der Oberfläche des biokompatiblen Substrats erzeugt. Das Aufbauen von dreidimensionalen künstlichen Konstrukten in vitro vor der Implantation erleichtert die eventuelle Ausdifferenzierung der Zellen nach der Implantation in vivo und minimiert das Risiko einer Entzündungsreaktion an der Zellmatrix des biokompatiblen Substrats, wodurch ein Zusammenziehen und Schrumpfen des Implantats vermieden wird. Die folgenden Abschnitte beschreiben Beispiele für geeignete biokompatible Substrate.
(i) Dezellularisierte Strukturen
Biostrukturen, d.h. ganze Organe oder Teile von Organen, können durch Entfernen des gesamten Gehalts an Zellen und Gewebe aus dem Organ dezellularisiert werden. Der Dezellularisierungsprozeß umfaßt eine Reihe von aufeinanderfolgenden Exktraktionen. Bei diesem Extraktionsprozeß ist darauf zu achten, daß scharfe Extraktionen, die die komplexe Infrastruktur der Biostruktur schädigen oder zerstören können, zu vermeiden sind. Der erste Schritt umfaßt das Entfernen von Zelltrümmern und die Auflösung der Zellmembran. Es folgt die Auflösung der Kern-Zytoplasma-Komponenten an den Kernkomponenten.
Vorzugsweise wird die Biostruktur, d.h. das Organ, dadurch dezellularisiert, daß mit sanften mechanischen Brechverfahren die Zellmembran und die Zelltrümmer um das Organ entfernt werden. Das sanfte mechanische Brechverfahren muß ausreichen, die Zellmembran aufzubrechen. Der Prozeß der Dezellularisierung sollte jedoch eine Beschädigung oder Zerstörung der komplexen Infrastruktur der Biostruktur vermeiden. Sanfte mechanische Brechverfahren umfassen das Abschaben der Oberfläche des Organs, das Bewegen des Organs oder das Aufrühren des Organs in einem geeigneten Fluidvolumen. z.B. destilliertem Wasser. In einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt das sanfte mechanische Brechverfahren das Aufrühren des Organs in einer geeigneten Menge destillierten Wassers, bis die Zellmembran zerstört ist und die Zelltrümmer vom Organ entfernt sind.
Nach dem Entfernen der Zellmembran werden die Kernkomponenten und Zytoplasmakomponenten der Biostruktur entfernt. Dies kann ohne Zerstörung der Infrastruktur durch Auflösen der Zellkomponenten und Kernkomponenten erfolgen. Zum Auflösen der Kernkomponenten können nichtionische Detergenzien oder oberflächenaktive Mittel verwendet werden. Beispiele für nichtionische Detergenzien und oberflächenaktive Mittel umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, die Triton-Reihe von Rohm und Haas in Philadelphia, Pa., die Triton X-100, Triton N-101, Triton X-114, Triton X-405, Triton X-705 und Triton DF-16 umfaßt und an vielen Verkaufsstellen erhältlich ist; die Tween-Reihe, etwa Monolaurat (Tween 20), Monopalmitat (Tween 40), Monooleat (Tween 80) und Polyoxethylen-23-Laurylether (Brij. 35), Polyoxyethylenether W-1 (Polyox) und dergleichen, Natriumcholat, Deoxycholat, CHAPS, Saponin, n-Decyl-β-D-Glukopuranosid, n-Heptyl-β-D-Glukopyranosid, n-Octyl-α-D-Glukopyranosid und Nonidet P-40.
Der Fachmann weiß, daß eine Beschreibung solcher Verbindungen und die Verkaufsstellen in "Chemical Classification, Emulsifiers and Detergents", McCutcheon's Emulsifiers and Detergents, 1986, North American and International Editions, McCutcheon Division, MC Publishing Co., Glen Rock, N. J., USA, und Judith Neugebauer, A Guide to the Properties and Uses of Detergents in Biology and Biochemistry, Calbiochem. R., Hoechst Celanese Corp., 1987, zu finden sind. In einer bevorzugten Ausführungsform stammt das nichtionische oberflächenaktive Mittel aus der Triton-Reihe, vorzugsweise ist es Triton X-100.
Die Konzentration des nichtionischen Reinigungsmittels kann in Abhängigkeit von der Art der zu dezellularisierenden Biostruktur verändert werden. Zum Beispiel sollte bei empfindlichen Geweben wie z.B. Blutgefäßen die Konzentration des Reinigungsmittels verringert werden. Die bevorzugten Konzentrationsbereiche für das nichtionische Reinigungsmittel liegen zwischen etwa 0,001 bis etwa 2% (w/v), besser zwischen etwa 0,05 bis etwa 1,0% (w/v), noch besser zwischen etwa 0,1 bis etwa 0,8% (w/v). Die bevorzugten Konzentrationsbereiche reichen von etwa 0,001 bis etwa 0,2% (w/v), mit einer besonderen Bevorzugung des Bereichs von etwa 0,05 bis etwa 0,1% (w/v).
Die zytoskeletale Komponente, die aus dem dichten Zytoplasma-Faser-Netzwerk, den Zwischenzellenkomplexen und den apikalen Mikrozellenstrukturen besteht, kann in alkalischen Lösungen gelöst werden, etwa in Ammoniumhydroxid. Zum Auflösen der zytoskeletalen Komponenten können auch andere alkalische Lösungen aus Ammoniumsalzen und deren Derivate verwendet werden. Beispiele für geeignete Ammoniumlösungen sind Ammoniumsulfat, Ammoniumacetat und Ammoniumhydroxid. In der bevorzugten Ausführungsform wird Ammoniumhydroxid verwendet.
Die Konzentration der alkalischen Lösung, z.B. des Ammoniumhydroxid, kann in Abhängigkeit von der Art der zu dezellularisierenden Biostruktur verändert werden. Zum Beispiel sollte bei empfindlichen Geweben wie z.B. Blutgefäßen die Konzentration des Reinigungsmittels verringert werden. Die bevorzugten Konzentrationsbereiche liegen zwischen etwa 0,001 bis etwa 2,0% (w/v), besser zwischen etwa 0,005 bis etwa 0,1% (w/v), noch besser zwischen etwa 0,01% (w/v) bis etwa 0,08% (w/v).
Die dezellularisierte, gefriergetrocknete Struktur kann bei einer geeigneten Temperatur aufbewahrt werden, bis sie gebraucht wird. Vor dem Gebrauch kann die dezellularisierte Struktur in einer geeigneten isotonischen Pufferlösung oder einem Zellkulturmedium ins Gleichgewicht gebracht werden. Geeignete Pufferlösungen sind, ohne darauf be schränkt zu sein, eine phosphatgepufferte Salzlösung (PBS), Salzlösung, MOPS, HEPES, Hank's ausgeglichene Salzlösung und dergleichen Geeignete Zellkulturmedien sind, ohne darauf beschränkt zu sein, RPMI 1640, Fisher's, Iscove's, McCoy's, Dulbecco's Medium und dergleichen.
(ii) Polymere
Auch Polymere wie Polyglykolsäure sind geeignete biokompatible Strukturen für die Organrekonstruktion. Das biokompatible Polymer kann mit Methoden wie Lösungsmittelgießen, Spritzgießen, Fadenziehen, Verfasern, Laugen, Weben und Beschichten ausgebildet werden.
Beim Lösungsmittelgießen wird eine Lösung eines oder mehrerer Polymere in einem geeigneten Lösungsmittel wie Methylenchlorid als sich verzweigendes Reliefmuster gegossen. Nach dem Verdampfen des Lösungsmittels wird eine dünne Schicht erhalten.
Beim Spritzgießen wird ein Polymer mit bis zu 30.000 psi in ein geeignetes Muster gedrückt. Das Fadenziehen beinhaltet das Ziehen aus dem geschmolzenen Polymer und das Verfasern das Ausbilden eines Gitters durch das Zusammendrücken von Fasern zu einem filzartigen Material.
Beim Laugen wird eine Lösung, die zwei Materialien enthält, in eine Form eingebracht, die der fertigen Form des Organs ähnlich ist. Dann wird ein Lösungsmittel verwendet, um eine der Komponenten aufzulösen, mit dem Ergebnis der Porenbildung (siehe Mikos, US 5 514 378 , hiermit durch Bezugnahme eingeschlossen).
Bei der Nukleation werden dünne Schichten in der Form des Organs radioaktiven Spaltprodukten ausgesetzt, die Spuren von strahlengeschädigtem Material erzeugen. Dann werden die Polykarbonatfolien mit einer Säure oder Lauge geätzt, was die Spuren an strahlengeschädigtem Material in Poren verwandelt. Schließlich kann ein Laser verwendet werden, um einzelne Löcher durch viele Materialien zu formen und brennen, um eine Organstruktur mit gleichmäßiger Porengröße zu erzeugen.
Das Polymersubstrat kann mit einer kontrollierten Porenstruktur versehen werden, damit Nährstoffe aus dem Kulturmedium die aufgebrachte Zellpopulation erreichen, die kultivierten Zellen jedoch nicht durch die Poren wandern können. Mit einem Rasterelektronenmikroskop und einer histologischen und quantitativen Bewertung mittels Radioisotopen kann die Zellanlagerung und die Lebensfähigkeit der Zellen festgestellt werden.
Die Polymersubstrate können in jede beliebige Anzahl von gewünschten Konfigurationen gebracht werden, um jede Anzahl von Gesamtsystembeschränkungen, geometrischen Einschränkungen oder Raumbeschränkungen zu erfüllen. Zum Beispiel kann für die Verwendung eines Polymersubstrats für die Blasenrekonstruktion das Substrat so geformt werden, daß es den Abmessungen und der Form einer ganzen Blase oder eines Teils der Blase entspricht. Die Polymersubstrate können verschiedene Größen aufweisen, um den Blasen von verschieden großen Patienten zu entsprechen. Das Polymersubstrat kann auch so geformt werden, daß es den besonderen Anforderungen eines Patienten entspricht, zum Beispiel eines behinderten Patienten, der eine anders geformte Bauchhöhle besitzen kann, die es erfordert, die Blasenrekonstruktion an den vorhandenen Raum anzupassen.
In anderen Ausführungsformen wird das Polymersubstrat für die Behandlung von Laminarstrukturen im Körper wie der Harnröhre, dem Samenleiter, dem Eileiter und dem Tränennasengang verwendet. Bei diesen Anwendungen hat das Polymersubstrat die Form eines hohlen Rohrs.
Um die mechanischen Eigenschaften zu verändern, kann ein biokompatibles Substrat (ein dezellularisiertes Organ oder ein Polymer) mit einem Material getränkt werden, zum Beispiel verflüssigten Copolymeren (Poly-DL-Laktid-Coglykolid 50:50 80 mg/ml Methlyenchlorid). Dies kann durch Aufbringen einer Schicht oder von mehreren Schichten erfolgen, bis die gewünschten mechanischen Eigenschaften erreicht sind.
III. Die Erzeugung einer Mehrfachschicht einer Zellpopulation
Gemäß einem anderen Aspekt umfaßt die Erfindung Verfahren zum Herstellen von künstlichen Organen unter Verwendung von kultivierten Zellpopulationen zum Erzeugen von Mehrfachschichten des künstlichen multizellularen Organkonstrukts. Die Zellen können wie im Abschnitt I beschrieben expandiert werden und dazu verwendet werden, auf einer Seite eines biokompatiblen Substrats Mehrfachschichten zu erzeugen.
a) Erzeugung von Mehrfachschichten auf einer dezellularisierten Struktur
In einer Ausführungsform werden verschiedene kultivierte Zellpopulationen verwendet, um auf einer dezellularisierten Struktur, z.B. einem dezellularisierten Organ oder Teil eines Organs, verschiedene Mehrfachschichten auszubilden. Mit Nadeln, die an speziellen Positionen der dreidimensionalen Infrastruktur des dezellularisierten Organs eingebettet sind, kann eine erste homogene Zellsuspension in die dezellularisierte Struktur eingebracht werden. Die eingebrachten Zellen verteilen sich im dreidimensionalen Zwischenraum der Infrastruktur und wachsen, um eine Schicht von Zellen zu erzeugen, die die Infrastruktur umhüllt. Nach dem Einbringen der ersten homogenen Zellsuspension wird das dezellularisierte Organ in einem Kulturmedium bei 37°C inkubiert, bis sich die Zellen entwickelt und vermehrt haben und eine Monolage einer ersten Population von kultivierten Zellen erzeugt haben, die an der Infrastruktur des dezellularisierten Organs haften. Nachdem die Monolage ausgebildet ist, wird die erste homogene Zellsuspension über der Monolage erneut in die dezellularisierte Struktur eingebracht. Das dezellularisierte Organ wird inkubiert, bis sich die Zellen entwickelt und vermehrt haben und eine zweite Monolage von Zellen auf der ersten Monolage gebildet haben, so daß eine Doppelschicht entsteht. Der Prozeß wird wiederholt, bis eine Mehrfachschicht einer ersten homogenen Zellpopulation ausgebildet ist.
Die erste Mehrfachschicht weist die funktionellen Eigenschaften und die Morphologie des entsprechenden spezifischen Organgewebes eines in-vivo-Organs auf. Zum Beispiel ist bei einer dezellularisierten Blase die erste Zellpopulation eine glatte Muskelzellenpopulation. Die glatte Muskelzellensuspension wird in die Blase eingebracht, bis eine Mehrfachschicht aus glattem Muskelgewebe ausgebildet ist, die die funktionellen Eigenschaften des glatten Muskelgewebes (d.h. des Detrusors) einer Blase besitzt.
Nach dem Erzeugen der ersten Mehrfachschicht wird mit einer zweiten kultivierten Zellpopulation, die sich von der ersten Zellpopulation unterscheidet, eine zweite Mehrfachschicht ausgebildet. Auf die erste Mehrfachschicht des dezellularisierten Organs wird eine Zellsuspension der zweiten homogenen Zellpopulation aufgebracht. Die aufgebrachten Zellen verteilen sich auf der ersten Mehrfachschicht, und das dezellularisierte Organ wird inkubiert, bis sich die Zellen der zweiten Population zu einer ersten Monolage entwickelt und vermehrt haben. Nachdem die erste Monolage ausgebildet ist, wird die zweite homogene Zellpopulation erneut über der ersten Monolage auf die dezellularisierte Struktur aufgebracht. Das dezellularisierte Organ wird inkubiert, bis sich die Zellen entwickelt und vermehrt haben und eine zweite Monolage auf der ersten Monolage gebildet haben, so daß eine Doppelschicht entsteht. Der Prozeß wird wiederholt, bis eine zweite Mehrfachschicht einer zweiten homogenen Zellpopulation ausgebildet ist.
Die zweite Mehrfachschicht weist die funktionellen Eigenschaften und die Morphologie des entsprechenden spezifischen Organgewebes eines in-vivo-Organs auf. Zum Beispiel ist die zweite Mehrfachschicht bei dem Blasenkonstrukt eine Harnwegsepithelzellen-Mehrfachschicht, die die morphologischen und funktionellen Eigenschaften des Harnwegsepithelzellengewebes (d.h. der Mukosa) der Blase besitzt.
Der Fachmann erkennt, daß eine Anzahl von heterogenen Mehrfachschichten ausgebildet werden kann, um künstliche multizellulare Organkonstrukte zu erzeugen. Jede Mehrfachschicht umfaßt mehrere Schichten einer homogenen Zellpopulation, auch wenn die Zellpopulationen der Mehrfachschichten unterschiedlich sind. In einer Ausführungsform umfaßt das künstliche Organ wenigstens fünf Mehrfachschichten. In einer anderen Ausführungsform umfaßt das künstliche Organ wenigstens vier Mehrfachschichten. In wieder einer anderen Ausführungsform umfaßt das künstliche Organ wenigstens drei Mehrfachschichten. In der bevorzugten Ausführungsform umfaßt das künstliche Organ wenigstens zwei Mehrfachschichten.
Dort, wo zwei oder mehr heterogene Mehrfachschichten miteinander in Kontakt stehen, entsteht eine chimäre Grenzfläche. Dadurch kann zwischen den Zellen der Mehrfachschichten eine ungehinderte Wechselwirkung erfolgen. Eine intensive Wechselwirkung zwischen verschiedenen Zellpopulationen führt zur Produktion eines interstitiellen Biomaterials, das sich von dem der Mehrfachschichten unterscheidet. Da die Wechselwirkung zwischen den beiden verschiedenen Zellpopulationen nicht von strukturellen Barrieren wie biokompatiblen Substraten (z.B. Polymere) behindert wird, nehmen die Zellen an der chimären Grenzfläche eine natürlichere Form und Konfiguration an. Durch das Ausbilden einer Mikroumgebung an der chimären Grenzfläche, die besser der Mikroumgebung eines in-vivo-Organs entspricht, entwickeln sich die Zellen an der chimären Grenzfläche natürlicher und erzeugen Wachstumsfaktoren und andere Proteine, die eine normale Teilung und Differentiation begünstigen. Dies kann zur Produktion von interstitionellem Bio material führen, das einmalige biologische und funktionelle Eigenschaften aufweist und die Herstellung von künstlichen Organen erlaubt, die den in vivo festgestellten Eigenschaften besser entsprechen. Zum Beispiel erzeugt die Wechselwirkung der glatten Muskel-Mehrfachschicht und der Harnwegsepithel-Mehrfachschicht an einem künstlichen Blasenkonstrukt eine chimäre Grenzfläche, die zu der Produktion einer Zellschicht führt, die der Submukosa einer in-vivo-Blase entspricht. Die Submukosa weist funktionelle Eigenschaften auf, die sich von denen der glatten Muskelzellen und der Harnwegsepithelzellen unterscheiden, da die Submukosa, wenn sie voll ausgebildet ist, die Blutzufuhr für die glatten Muskelzellen übernimmt.
Der Fachmann erkennt, daß jedes interstitionelle Biomaterial, das erzeugt wird, wenn zwei oder mehr heterogene Mehrfachschichten aus verschiedenen Zellpopulationen wechselwirken, innerhalb des Umfangs der Erfindung liegt. Welches interstitielle Biomaterial erzeugt wird, hängt von der Art der Zellen in der heterogenen Mehrfachschicht ab.
In einer Ausführungsform werden zusätzliche Kollagenschichten zu den Innenflächen der dezellularisierten Struktur hinzugefügt, um eine glatte Oberfläche zu erzeugen, wie es in der internationalen PCT-Veröffentlichung Nr. WO 95/22301 beschrieben ist. Die glatten Kollagenschichten verbessern die Anbindung der Zellen, wodurch das Wachstum und die Entwicklung günstig beeinflußt werden. Wie in der internationalen PCT-Veröffentlichung Nr. WO 95/22301 beschrieben, kann diese glatten Kollagenschicht aus einem säureextrahierten fibrillaren oder nichtfibrillaren Kollagen bestehen, das vor allem Kollagen vom Typ I ist, jedoch auch Kollagen vom Typ II oder Kollagen vom Typ IV oder beides enthalten kann. Das verwendete Kollagen kann aus jeder beliebigen Säugetierquelle stammen, in der Regel aus Schweine- und Kuhhäuten und -sehnen. Das Kollagen wird in der Regel mit einer Säureextraktion behandelt, um eine Fibrildispersion oder ein Gel mit hoher Reinheit zu erhalten. Das Kollagen kann mit einer schwachen Säure aus der Kollagenquelle extrahiert werden, etwa mit Essigsäure, Zitronensäure oder Ameisensäure. Aus der Lösung kann das Kollagen mit NaCl ausgefällt und gewonnen werden, wobei Standardtechniken wie Zentrifugieren und Filtrieren angewendet werden. Die Einzelheiten der Säureextraktion sind zum Beispiel im US-Patent Nr. 5 106 949 an Kemp et al. beschrieben.
In einer anderen Ausführungsform werden zusätzliche Kollagenschichten zwischen den heterogenen Mehrfachschichten hinzugefügt, um das Wachstum und die Entwicklung zwischen den Zellen der heterogenen Mehrfachschichten zu fördern. In einer weiteren Ausführungsform werden Faktoren wie Nährstoffe, Wachstumsfaktoren, Zytokine, extrazellulare Matrixkomponenten, Einleiter einer Differentiation oder Sekretionsprodukte, Immunomodulationsprodukte, sowie biologisch aktive Verbindungen zwischen die heterogenen Mehrfachschichten eingebracht, die das Wachstum des zellularen Netzwerks oder von Nervenfasern fördern oder ermöglichen (siehe Abschnitt IV).
b) Erzeugung von Mehrfachschichten auf einem Polymer
In einer anderen Ausführungsform werden verschiedene kultivierte Zellpopulationen verwendet, um auf einem Bereich eines Polymers heterogene Mehrfachschichten zu erzeugen. Beispiele für geeignete Polymere sind, ohne darauf beschränkt zu sein, Kollagen, Poly(Alphaester) wie Poly(Milchsäure), Poly(Glykolsäure), Polyorthoester und Polyanhydride und deren Copolymere, Zelluloseether, Zellulose, Zelluloseester, fluoriniertes Polyethylen, Phenolharz, Poly-4-Methylpenten, Polyacrylnitril, Polyamid, Polyamidimid, Polyacrylat, Polybenoxazol, Polykarbonat, Polycyanacrylether, Polyester, Polyesterkarbonat, Polyether, Polyetheretherketon, Polyetherimid, Polyetherketon, Polyethersulfon, Polyethylen, Polyflourolefin, Polyimid, Polyolefin, Polyoxadiazol, Polyphenylenoxid, Polyphenylen, Sulfid, Polypropylen, Polystyrol, Polysulfid, Polysulfon, Polytetraflourethylen, Polythioether, Polytriazol, Polyurethan, Polyvinylidenfluorid, regenerierte Zellulose, Ureaformaldehyd und Copolymere oder physikalische Mischungen dieser Materialien.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine Seite des biokompatiblen Substrats dazu verwendet, eine Mehrfachschicht aus einer ersten homogenen Zellpopulation zu erzeugen. Dies erfolgt durch Beschichten einer Seite des biokompatiblen Substrats mit einer Suspension der ersten homogenen Zellpopulation, z.B. glatten Muskelzellen. Die erste homogene Zellsuspension wird in einem Kulturmedium inkubiert, bis sich die Zellen entwickeln und vermehren und eine Monoschicht entsteht, wobei die Zellen der Monoschicht am biokompatiblen Substrat haften. Nachdem die Monoschicht ausgebildet ist, wird die erste homogene Zellsuspension auf die erste Monoschicht aufgebracht, und die Zellen werden kultiviert, bis sie sich entwickeln und vermehren und eine zweite Monoschicht aus Zellen auf der ersten Monoschicht entsteht, so daß sich eine Doppelschicht ergibt. Der Prozeß wird wiederholt, bis eine Mehrfachschicht aus einer Anzahl von Schichten der ersten homogenen Zellpopulation ausgebildet ist. Die erste Mehrfachschicht weist morphologische und funktionelle Eigenschaften auf, die dem spezifischen Organgewebe eines in-vivo-Organs entsprechen, z.B. dem Detrusor.
Nach dem Ausbilden der ersten Mehrfachschicht wird auf der ersten Mehrfachschicht eine zweite Mehrfachschicht aus einer zweiten homogenen Zellpopulation (z.B. einer Harnwegsepithelzellpopulation) erzeugt. Dadurch ergibt sich zwischen den beiden verschiedenen Zellpopulationen eine chimäre Grenzfläche. Die zweite Mehrfachschicht wird durch Abscheiden einer Zellsuspension aus einer zweiten homogenen Zellpopulation auf der ersten Mehrfachschicht erzeugt. Die Zellen der zweiten homogenen Zellpopulation werden kultiviert, bis sie sich entwickeln und vermehren und eine erste Monoschicht entsteht. Nachdem die erste Monoschicht ausgebildet ist, wird die zweite homogene Zellsuspension auf die erste Monoschicht aufgebracht, und die Zellen werden kultiviert, bis sie sich entwickeln und vermehren und eine zweite Monoschicht der Zellen auf der ersten Monoschicht entsteht, so daß sich eine Doppelschicht ergibt. Der Prozeß wird wiederholt, bis eine zweite Mehrfachschicht aus einer Anzahl von Schichten der zweiten homogenen Zellpopulation ausgebildet ist. Die zweite Mehrfachschicht weist morphologische und funktionelle Eigenschaften auf, die dem spezifischen Organgewebe eines in-vivo-Organs entsprechen, z.B. der Mukosa. An der chimären Grenzfläche zwischen den beiden verschiedenen Zellpopulationen wird wie beschrieben ein interstitielles Biomaterial ausgebildet.
Die Erfindung umfaßt daher Anordnungen und Verfahren zum Herstellen von künstlichen Organen mit einer multizellularen Organisation, den besser dem Vorbild des in-vivo-Organs entsprechen. Die zellulare Organisation umfaßt heterogene Mehrfachschichten. Jede Mehrfachschicht des künstlichen Organs besteht aus eine Anzahl von Lagen einer homogenen Zellpopulation, so daß eine organisierte Struktur mit einer zellularen Morphologie und funktionellen Eigenschaften entsteht, die dem entsprechenden Gewebe in den in-vivo-Schichten eines natürlichen Organs ähnlich sind.
Die chimäre Grenzfläche zwischen den verschiedenen Mehrfachschichten ergibt eine Mikroumgebung, die die natürliche Mikroumgebung zwischen verschiedenen Zellpopulationen nachbildet. Der Fachmann weiß, daß die Zellform eine wichtige Rolle bei der Zellteilung und der Zelldifferentiation spielt (siehe z.B. Darnell et al. in Molecular Cell Biology (1986), veröffentlicht von Scientific American Books). Die durch das erfindungsgemäße Verfahren geschaffene natürlichere Mikroumgebung erlaubt eine gegenseitige dynamische, ungehinderte Zell-Zell-Wechselwirkung zwischen den Zellen der heterogenen Mehrfachschichten. Diese ungehinderte Wechselwirkung ermöglicht es, daß die Zellen an der Grenzfläche eine natürlichere zellulare und morphologische Konfiguration annehmen. Die natürlichere Zellentwicklung an der chimären Grenzfläche ermöglicht es den Zellen auch, Proteine zu erzeugen, die die normale Teilung und Differentiation fördern.
Das erfindungsgemäße künstliche Organkonstrukt, das als Ersatz-Körperteil dient, kann flach, rohrförmig oder von einer komplexen Geometrie sein. Die Form des Organs wird von der vorgesehenen Verwendung bestimmt. Das künstliche Organ kann implantiert werden, und ein erkranktes oder geschädigtes Organ nachzubilden, zu vergrößern oder zu ersetzen, etwa bei einem Bachwanddefekt, einem Herzbeutelfehler oder einem Bruch. Die Organe und Strukturen umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, Knochen, Knochenhaut, Knorpelhaut, Bandscheiben, Gelenkknorpel, die Dermis, die Epidermis, den Darm, Bänder und Sehnen. Die Gewebe-Reparaturfabrik kann als vaskuläres oder intrakardiales Pflaster oder als künstliche Herzklappe verwendet werden.
Zum Beispiel können flache Folien dazu verwendet werden, vorgefallene oder hypermobile Organe zu stützen, wobei die Folie als Schlinge für das Organ verwendet wird. Diese Schlinge kann Organe wie die Blase oder den Uterus festhalten.
Rohrförmige Implantate können zum Beispiel dazu verwendet werden, um Querschnitte von rohrförmigen Organen wie der Speiseröhre, der Luftröhre, den Gedärmen und den Eileitern zu ersetzen. Diese Organe weisen eine rohrförmige Grundform mit einer Außenseite und einer luminalen Seite auf.
IV. Zelladhäsion
In einigen Ausführungsformen wird die Haftung der Zellen am biokompatiblen Substrat durch Beschichten des biokompatiblen Substrats mit Verbindungen wie Membran-Basiskomponenten, Agar-Agar, Agarose, Gelatine, Gummi arabikum, Kollagen vom Typ I, II, III, IV und V, Fibronektin, Laminin, Glykosaminglykan, Mischungen davon und anderen hydrophilen und Peptid-Haftmaterialien, die dem Fachmann für Zellkulturen bekannt sind, gefördert. Ein bevorzugtes Material zum Beschichten des biokompatiblen Substrats ist Kollagen.
In anderen Ausführungsformen kann das biokompatible Substrat vor der Implantation mit Faktoren oder Arzneien behandelt werden, bevor oder nachdem es mit kultivierten Zellen beschichtet wird, um z.B. die Ausbildung von neuem Gewebe nach der Implantation zu fördern. Die Faktoren einschließlich Arzneimittel können in das biokompatible Substrat eingebracht werden oder in Verbindung mit dem biokompatiblen Substrat vorgesehen werden. Die Faktoren werden im allgemeinen entsprechend dem nachgebildeten oder vergrößerten Organ ausgewählt, um sicherzustellen, daß in dem implantierten Organ oder Gewebe geeignetes neues Gewebe ausgebildet wird (für Beispiele für solche Additive zum Fördern der Knochenheilung siehe z.B. Kirker-Head, Vet. Surg. 24 (1995), 408–19). Zum Beispiel kann ein vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor (VEGF) verwendet werden, wenn biokompatible Substrate zum Ersetzen von vaskulärem Gewebe verwendet werden, um die Ausbildung von neuem vaskulärem Gewebe zu fördern. (siehe z.B. das US-Patent Nr. 5 624 273 an Gallo et al.). Andere nützliche Additive schließen antibakterielle Mittel wie Antibiotika ein.
Das Implantieren der künstlichen Organe kann mit dem üblichen Methoden erfolgen (siehe z.B. Fauza et al., J. Ped. Surg. 33 (1998), 7–12).
Der Fachmann erkennt anhand der obigen Beschreibung weitere Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung. Entsprechend ist die Erfindung nicht auf das beschränkt, was ausdrücklich gezeigt und beschrieben ist. Eine Ausnahme bildet lediglich, was die folgenden Patentansprüche angeben.
Beispiele
Beispiel 1 Zellentnahme und Kultivierung
Die entnommenen Zellen werden entsprechend den verschiedenen vorveröffentlichten Protokollen von Atala et al., J. Urol. 150 (1993) 608, Cilento et al., J. Urol. 152 (1994) 655, Fauza et al., J. Ped. Surg. 33 (1998), 7–12 kultiviert.
a) Das Kultivieren von Harnwegsepithelzellpopulationen
Es wurde eine Blasenprobe entnommen und zum Kultivieren vorbereitet. Zur Minimierung von Zellenschäden wurde die Probe scharf herausgeschnitten und nicht mittels Elektrokauterisation gewonnen. Die Serosalfläche wurde mit Nahtmaterial markiert, um sicherzustellen, daß es keine Unklarheiten darüber gibt, welche Seite die Harnwegsepithel-Oberfläche ist.
Die Probe wurde in einer Laminarfluß-Zellkulturhaube bearbeitet, wobei sterile Instrumente verwendet wurden. Es wurde ein Kulturmedium mit Keratinocyte-SFM (GIBCO BRL, Kat. Nr. 17005) mit Bovine Pituitary Extrakt (Kat. Nr. 13028, 25 mg/500 ml Medium) und Recombinant Epidermal Growth Factor (Kat. Nr. 13029, 2,5 μg/500 ml Medium) als Ergänzungsmittel vorbereitet. In jede von zwei 10 cm-Zellkulturschalen wurden bei 4 °C 10 ml des Kulturmediums gegeben und 3,5 ml in eine dritte Schale. Aus der Probe wurde das Blut dadurch entfernt, daß sie in die erste Schale gegeben und sanft vor und zurück bewegt wurde. Der Prozeß wurde in der zweiten Schale wiederholt, woraufhin die Probe in die dritte Schale verbracht wurde. Die Harnwegsepithel-Oberfläche wurde mit einer Skalpellklinge Nr. 10 sanft abgeschabt, ohne in die Probe zu schneiden. Die Harnwegsepithelzellen waren als kleine undurchsichtige Teilchen zu sehen, die sich im Medium verteilten. Die Harnwegsepithelzellen/Mediumsuspension wurde abgesaugt und mit jeweils etwa 0,5 bis 1 ml Medium in sechs Becher einer 24-Becher-Zellkulturplatte eingegeben, um insgesamt 1 bis 1,5 ml pro Becher zu erhalten. Die Zellen wurden bei 37°C mit 5% CO₂ inkubiert.
Am folgenden Tag (Tag 1 nach der Entnahme) wurde das Medium aus den sechs Bechern abgesaugt und frisches Medium zugeführt. Die Zellen wurden bei 1000 Upm für 4 Minuten zentrifugiert und der Überstand entfernt. Die Zellen wurden wieder in 3 bis 4,5 ml frischen Medium suspendiert, das in einer 24-Becher-Platte auf 37°C erwärmt worden war.
Das Kulturmedium wurde entfernt und zu jedem Becher der 24-Becher-Platte wurde PBS/EDTA (37°C, pH 7,2, 0,53 mM EDTA (0,53 ml von 0,5 M EDTA, pH 8,0, in jeweils 500 ml PBS)) hinzugefügt oder 10 ml zu jeder 10 cm-Schale. Die Zellen wurden dann zu zwei 10 cm-Schalen übertragen. Danach wurden die Zellen immer dann weiterbefördert, wenn sie 80 bis 90% Konfluenz erreichten, wobei den Zellen nie erlaubt wurde, 100% Konfluenz zu erreichen.
Die Zellen wurden unter einem Phasenkontrastmikroskop betrachtet. Wenn die Zell-Zell-Verbindungen für einen Großteil der Zellen getrennt waren (nach etwa 5 bis 15 Minuten), wurde das PBS/EDTA entfernt und zu jedem Becher der 24-Becher-Platte 300 μl Trypsin/EDTA (37°C, GIBCO BRL, Kat. Nr. 25300-054) hinzugefügt oder 7 ml zu jeder 10 cm-Schale. Die Platte/Schale wurde periodisch bewegt. Wenn sich 80 bis 90% der Zellen von der Platte gelöst hatten und zu schwimmen begannen (nach etwa 3 bis 10 Minuten), wurde die Wirkung des Trypsins durch Hinzufügen von 30 μl eines Sojabohnen-Trypsininhibitors (GIBCO BRL; Kat. Nr. 17075-029, 294 mg des Inhibitors auf 20 ml PBS) in jeden Becher der 24-Becher-Platte oder 700 μl zu jeder 10 cm-Schale unterdrückt, um die Wirkung des EDTA zu beenden. Zu jedem Becher der 24-Becher-Platte wurde 0,5 ml Kulturmedium hinzugefügt oder 3 ml Kulturmedium zu jeder 10 cm-Schale. Die PBS/EDTA- und Trypsin/EDTA-Inkubationen erfolgten bei Raumtemperatur, sie waren jedoch wirkungsvoller, wenn die Platten bei 37°C inkubiert wurden.
Die Zellen wurden durch Zentrifugation bei 1000 Upm für 4 Minuten gewonnen und der Überstand entfernt. Die Zellen wurden erneut in 5 ml Kulturmedium suspendiert und die Anzahl der Zellen mit einem Hämozytometer bestimmt. Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde mit dem Standard-Trypan-Blaufärbungstest bestimmt. Die optimale Eingabedichte für eine 100 mm-Kulturplatte betrug etwa 1 × 10⁶ Zellen/Platte. Die gewünschte Anzahl der Zellen wurde in die Schalen eingegeben und das Volumen des Mediums auf insgesamt etwa 10 ml/Platte hinzugefügt.
b) Das Kultivieren von glatten Muskelzellen für die Blase
Nach dem Entfernen der Harnwegsepithelzellenschicht von der Blasenprobe im Beispiel I, Abschnitt (a) wurde der verbleibende Muskel in Muskelsegmente mit 2–3 mm aufgeteilt. Die Muskelsegmente wurden gleichmäßig in einer 100 mm-Zellkulturschale verteilt. Die Muskelsegmente wurden getrocknet, bis sie an der Schale hafteten (nach etwa 10 Minuten). Zu den getrockneten Muskelsegmenten wurden 20 ml Dulbecco's Modified Eagle Medium mit 10% FCS gegeben. Die Muskelsegmente wurden ungestört für 5 Tage bei 37°C mit 5% CO₂ inkubiert. Das Kulturmedium wurde am 6. Tag gewechselt und dabei nicht anhaftende Segmente entfernt. Die übrigen Segmente wurden für insgesamt 10 Tage kultiviert, wonach alle Muskelsegmente entfernt wurden. Die Zellen der Muskelsegmente, die an der Schale haften geblieben waren, wurden inkubiert, bis sich kleine Inseln aus Zellen gebildet hatten. Diese Zellen wurden trypsiniert, gezählt und in eine T75-Kulturflasche gegeben.
Die Zellen wurden in Abhängigkeit von der Zelldichte jeden dritten Tag ernährt und übertragen, wenn sie 80 bis 90% Konfluenz erreicht hatten.
Beispiel 2 Blasenvergrößerung mit fetalem Gewebe
Das folgende Beispiel zeigt die Möglichkeit der Herstellung von funktionellen multizellularen künstlichen Organen unter Verwendung von Harnwegsepithelzellen und glatten Blasenzellen aus einer fetalen Blase, wie es von Fauza et al. in J. Ped. Surg. 33 (1998) 7–12 beschrieben ist.
Maternale und fetale chirurgische Manipulationen
Unter zeitlicher Beobachtung stehende trächtige Mutterschafe wurden nach 90 bis 95 Tagen Tragezeit nach dem intramuskulären Einführen von 15 mg/kg Ketamine (Parke-Davis Co., Morris Plains, NJ) mit 2 bis 4% Halothane (Halocarbon Laboratories, River Edge, NJ) betäubt. Sie erhielten intravenös 1 g Cefazolin (BMH Ltd., Philadelphia, PA). Durch Marsupialisieren des vorderen Abschnitts der Blase an die Bauchwand wurde an zehn fetalen Lämmern mittels offener Chirurgie eine Blasenexstrophie hervorgerufen. Am Ende der Prozedur wurde das Fruchtwasser, das vorher entfernt und bei 37°C aufbewahrt worden war, zusammen mit 500 mg Cefazolin wieder in die Amnionhöhle gegeben. Die Gestationsmembranen und Gebärmutterwände wurden in einer Schicht mit einem TA 90 mm Titan chirurgischen Klammerer (United States Surgical Corp. (USSC), Norwalk, CT) geschlossen. Daraufhin wurden die Fötusse in zwei Gruppen aufgeteilt.
In der Gruppe 1 wurde ein videofetoskopischer Zugang zu der Amnionhöhle geschaffen, wie es von Fauza et al. in J. Ped. Surg. 33 (1998) 7–12 beschrieben ist. Halbflexible, mit einer Ballonspitze versehene Kanülen (Marlow Surgical Technologies, Inc., Willoughby, OH) wurden durch drei Öffnungen (eine mit 10 mm Größe und zwei mit 5 mm Größe) in den Uterus eingeführt. Entweder mit einer kontinuierlichen Amnioinfusion von warmer Salzlösung oder mit medizinischer Luft als Arbeitsmedium erfolgte eine videofetoskopische Manipulation. Aus der Exstrophieblase wurde eine Probe voller Dicke gewonnen, die nicht größer war als 1,5 × 1,0 cm. Es wurden ein 30° 5 mm-Teleskop (Karl Storz Endoscopy-America, Inc., Los Angeles, CA) zusammen mit 2 mm- und 5 mm-Endoskopiegreifern, 2 mm- und 5 mm-Endoskopiescheren und 10 mm-Titan-Endoskopieklammern, diese zum Schließen des Gewinnungsbereichs, verwendet (alles von USSC). Die Uterusöffnungen wurden mit absorbierbaren synthetischen 4-0 Glycomer 631 (Biosyn; USSC) in doppelt verlaufender Art geschlossen. In der Gruppe II erfolgte keine weitere fetale Prozedur.
Der Bauch der Mutter wurde in Schichten geschlossen. Am ersten Tag nach der Operation erhielten die Mutterschafe intramuskulär 1,2 Millionen Einheiten Benzatin-Penicillin (Wyeth Laboratories, Inc., Philadelphia, PA). Es wurde eine normale Geburt ermöglicht.
Zellmanipulation
Die Harnwegsepithel- und Muskelschichten der entnommenen fetalen Blasenproben wurden chirurgisch voneinander getrennt und separat verarbeitet.
Zellkultur
Die Blasenzellen wurden mit den oben beschriebenen Verfahren (Cilento et al., J. Urol. 52 (1994) 665–670) und wie in Beispiel I angegeben kultiviert. Kurz gesagt wurden Detrusor-Muskelzellen durch Aufschneiden der glatten Muskelproben in Fragmente von etwa 0,5 mm Durchmesser isoliert. Die Explantate wurden in eine 10 cm-Kulturschale gegeben und mit Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), dem 10% fetales Kalbserum (Biowhittaker, Inc., Walkersville, MD) hinzugegeben wurde, in einer Kammer mit 95% Feuchtigkeit und 5% CO₂ bei 37°C gehalten und expandiert, wie es im Detail im Beispiel I beschrieben ist.
Die Harnwegsepithelzellen wurden von der chirurgischen Probe durch Abschaben von der Epithelfläche getrennt und in eine 24-Becher-Platte gegeben. Sie wurden mit serumfreien Keratinocyte-Wachstumsmedium, das 5 ng/ml Epidermal Growth Factor und 50 μg/ml Rinderhypophysenpräparat (Keratinocyte SFM, Gibco BRL, Life Technologies, Grand Island, NY) enthielt, in der gleichen Kammer wie oben erhalten und expandiert.
Sowohl die Detrusormuskelzellen als auch die Harnwegsepithelzellen wurden unabhängig voneinander in vitro für 50 bis 55 Tage expandiert, bis sie eine Dichte von etwa 1,3 × 10⁷ Zellen/cm² erreicht hatten.
Zellgewinnung
Das Zellgewinnungsvehikel bestand aus einem Polyglykolsäurepolymervlies mit einer Dichte von 58 mg/ml und einem Faserdurchmesser von 15 μm. Das Gitter hatte vor dem Zugeben eine Porosität von mehr als 95% und wurde mit Ethylenoxid sterilisiert. Es war vorgesehen, daß sich das Gerüst durch Hydrolyse innerhalb von 6 bis 8 Wochen nach der Implantation zersetzt.
Sieben bis zehn Tage vor der Implantation in vivo wurden die Detrusor-Muskelzellen auf 16 bis 20 cm² eines 3 mm dicken Polyglykolsäurepolymergerüsts gegeben. Drei Tage später wurden die Harnwegsepithelzellen über den Detrusorzellen auf das gleiche Polymer gegeben. Die mittlere Zahl von Zellen pro Polymer betrug 200 Millionen. Die Doppelschicht aus Harnwegsepithelzellen und Detrusorzellen wurde in DMEM für etwa 1 Woche kultiviert, bevor sie in die neu geborenen Tiere implantiert wurde.
Manipulation der Neugeborenen
Prophylaktisch wurde allen Neugeborenen einmal täglich oral Sulfamethoxazole/Trimethoprim (Barre-National, Inc., Baltimore, MD) (6 mg/kg Sulfa) verabreicht.
Chirurgie
Einen bis vier Tage nach der Geburt wurden die Neugeborenen nach dem intramuskulären Einführen von 15 mg/kg Ketamin mit 1.5 bis 3.5% Isoflurane (Abbott Laboratories, North Chicago, IL) betäubt. Intravenös wurde eine Dosis von 100 mg/kg Cefazolin gegeben. Die Exstrophieblase wurde chirurgisch von der Bauchwand gelöst. Die Blasenrekonstruktion erfolgt in jeder Gruppe wie folgt.
In der Gruppe I wurde das autologische künstliche fetale Blasengewebe für eine chirurgische Vergrößerung der Blase verwendet. Die Ränder des künstlichen Gewebes wurden mit synthetischem absorbierbaren 3-0 Lactomer 9-1 (Polysorb; USSC) in laufender Weise derart an die Ränder der natürlichen Blase angenäht, daß sich die Harnwegsepithelzellschicht am luminalen Abschnitt der Blase befand und die Muskelschicht an deren äußeren Abschnitt. Nach der Implantation wurde auf die Außenseite des künstlichen Gewebes Fibrinkleber (Melville Biologies, Inc., New York, NY) aufgetragen. Zum Abdecken des künstlichen Gewebes wurde Omentum verwendet – es wurde um die Ränder des Implantats mit vier einfachen Kardinalstichen mit synthetischem absorbierbaren 3-0 Lactomer 9-1 lose an der Blase angebracht. In der Gruppe II wurde der Blasendefekt primär verschlossen, mit synthetischem absorbierbaren 3-0 Lactomer 9-1 auf laufende Weise.
In beiden Gruppen wurde bei den beiden genannten Rekonstruktionstechniken ein 15 Zoll langer multiperforierter 5F-Kunststoffkatheter (Davol Inc., Cranston, RI) in der Blase belassen, der durch einen separaten Einstich nach außen geführt und so angeordnet, daß ein kontinuierlicher Abfluß in einen offenen äußeren Behälter erfolgte. Einen Tag nach der Operation erhielten alle Neugeborenen eine Dosis von 0,6 ME von Benzatin-Penicillin intramuskulär.
Danach
Drei Wochen nach der Operation wurde bei beiden Gruppen mit verdünntem Iothalamat-Meglumin (Mallinck-Rodt Medical, Inc., St. Louis, MO), das mit 15 mm Hg durch den Blasenkatheter eingeflößt wurde, ein Kontrast-Zystogramm aufgenommen. Der Katheter wurde dann entfernt. Nach dem direkten Einführen eines Katheters (Medex Inc., Hilliard, OH) in die Blase und die Verbindung mit einem 78534C digitalen Monitor/Terminal (Hewlett Packard, Andover, MA) wurde die Sulfamethoxazole/Trimethoprim-Verabreichung unterbrochen. Nach dem vollständigen Entleeren der Blase wurde normale Salzlösung mit einer Rate von 8 ml/min infundiert. Nach der Infusion von jeweils 5 ml wurde nach der Stabilisierung der Blasendruck aufgezeichnet, gefolgt von einem radiographischen Zystogramm. Die Tiere wurde durch eine intravenöse Injektion von Somlethal (J. A. Webster, Inc., Sterling, MA) getötet. Die Blase wurde zur histologischen Untersuchung entfernt.
Die histologische Untersuchung
Proben der primär verschlossenen und der künstlichen Blase wurden bei der Entnahme in eine 10%-ige gepufferte Formalinlösung (Stephens Scientific, Riversdale, NJ) getaucht und 24 bis 48 Stunden nach der Entnahme einer regulären Hematoxilin-Eosin-Verarbeitung unterworfen. Mit einem Zeiss Labor-Lichtmikroskop (Zeiss, Deutschland) erfolgte eine mikroskopische Analyse bei 25-facher und 100-facher Vergrößerung.
Statistische Analyse
sDurch Untersuchung der Streuung (ANOVA) und einen Scheffe-f-Test bei einer Konfidenzgrenze von 95% erfolgte eine statistische Analyse. P-Werte von kleiner als 0,05 wurden als signifikant betrachtet.
Ergebnisse
Die Kontrastzystogramme waren augenscheinlich in beiden Gruppen verschieden. Die künstlichen Blasen ergaben nahezu normale Bilder, im Gegensatz dazu wurde bei der Gruppe mit dem primären Blasenverschluß kleinere und verzerrte Blasen beobachtet.
Im Alter von zwei Monaten waren die künstlichen Blasen mehr im Einklang (P < 0,05) und hatten bei Drücken von mehr als 30 mm Hg (P < 0,05) eine größere Kapazität als die primär verschlossenen.
Die hystologische Analyse des künstlichen Gewebes zeigte eine mehrschichtige, pseudogeschichtete Harnwegsepithelauskleidung (Übergangsepithelium) an der luminalen Seite und darüberliegende Schichten von glatten Muskelzellen, die von Bindegewebe umgeben waren. Der mikroskopische Aufbau der künstlichen Mikosa unterschied sich von dem einer natürlichen Blase, war ihr jedoch ähnlich. In den primär verschlossenen Exstropieblasen lag erwartungsgemäß eine muskuläre Hypertrophie vor, nicht jedoch in den künstlichen.
Das erfindungsgemäße Verfahren ergibt autologes Blasengewebe, und es überwindet auch bestimmte Grenzen der autologen Transplantation. Nach der fetalen Entnahme ist die Zeitspanne, die zum Herstellen eines autologen Implantats erforderlich ist, parallel zum Rest der Schwangerschaft, so daß Zeit kein begrenzender Faktor ist. Darüberhinaus besteht häufig eine umgekehrte Beziehung zwischen dem Spenderalter und der Zellwachstumsrate in Kultur (Langer et al. in Science 260 (1993) 920–926). Die Tatsache, daß bei unserem Experiment fetale Zellen verwendet wurden, hat dieses Prinzip unterstrichen, wie es sich durch die große Expansionsrate bei den fetalen Detrusorzellen gezeigt hat.
Darüberhinaus kann sich die Blasenvergrößerung mit dem erfindungsgemäßen Verfahren als nützlich für die Behandlung von bestimmten angeborenen menschlichen Anomalien wie Blasen- und Kloakenexstrophien erweisen, bei denen nicht genug restliche Blase für einen richtigen Verschluß während der Neugeborenenperiode vorhanden ist.

Claims

Künstliches Organkonstrukt mit einem biokompatiblen Substrat; einer ersten kultivierten Mehrfachschicht von Zellen, die aus einer isolierten Population glatter Muskelzellen gewonnen werden; und mit einer zweiten kultivierten Mehrfachschicht von Zellen, die aus einer zweiten Zellpopulation gewonnen werden, die von der Zellpopulation glatter Muskelzellen verschieden ist, wobei die zweite Mehrfachschicht auf der ersten Mehrfachschicht kultiviert und mit dieser an einer chimären Grenzfläche verbunden ist, an der interstitielles Biomaterial erzeugt wird, so daß das Konstrukt nach der Implantation ein funktionelles Äquivalent einer natürlichen biologischen Struktur darstellt.
Künstliches Organ nach Anspruch 1, ferner mit einer dritten kultivierten Mehrfachschicht von Zellen, die aus einer dritten Zellpopulation gewonnen wurden, die von der ersten und der zweiten Zellpopulation verschieden ist, wobei die dritte Mehrfachschicht an einer chimären Grenzfläche mit der zweiten Mehrfachschicht verbunden ist.
Verfahren zum Herstellen eines künstlichen Organkonstrukts, wobei ein biokompatibles Substrat in der Form eines Organs bereitgestellt wird; eine erste kultivierte Mehrfachschicht von Zellen, die aus einer isolierten Population glatter Muskelzellen gewonnen werden, auf einer Fläche des biokompatiblen Substrats erzeugt wird, wobei die erste Mehrfachschicht an das biokompatible Substrat angebracht wird; und eine zweite kultivierte Mehrfachschicht von Zellen erzeugt wird, die aus einer zweiten Zellpopulation gewonnen werden, die von der Zellpopulation glatter Muskelzellen verschiedenen ist, wobei die zweite Mehrfachschicht auf der ersten Mehrfachschicht kultiviert und mit dieser an einer chimären Grenzfläche verbunden wird, wobei interstitielles Biomaterial erzeugt wird, so daß das Konstrukt nach der Implantation das funktionelle Äquivalent einer natürlichen biologischen Struktur darstellt, wodurch ein künstliches Organkonstrukt geschaffen wird.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei ferner eine dritte kultivierte Mehrfachschicht von Zellen erzeugt wird, die aus einer dritten Zellpopulation gewonnen werden, die von der ersten und der zweiten Zellpopulation verschieden ist, wobei die dritte Mehrfachschicht an einer chimären Grenzfläche mit der zweiten Mehrfachschicht verbunden ist.
Künstliches Organkonstrukt nach Anspruch 1 oder 2 oder Verfahren zum Herstellen eines künstlichen Organkonstrukts nach Anspruch 3 oder 4, wobei die chimäre Grenzfläche ferner ein interstitielles Biomaterial umfaßt, das durch wenigstens eine der Mehrfachschichten, vorzugsweise Zellen mit einer normalen Morphologie, erzeugt wird.
Künstliches Organkonstrukt nach Anspruch 1 oder 2 oder Verfahren zum Herstellen eines künstlichen Organkonstrukts nach Anspruch 3 oder 4, ferner mit Schichtungsfaktoren zwischen der ersten und der zweiten Mehrfachschicht, wobei die Faktoren aus Nährstoffen, Wachstumsfaktoren, Zytokinen, extrazellulären Matrixkomponenten, Differentiations-Einleitern, Sekretionsprodukten, Immunmodulatoren und/oder biologisch aktiven Verbindungen bestehen, die das Wachstum des Zellennetzwerks oder von Nervenfasern fördern oder ermöglichen.
Künstliches Organkonstrukt nach Anspruch 1 oder 2 oder Verfahren zum Herstellen eines künstlichen Organkonstrukts nach Anspruch 3 oder 4, wobei das künstliche Organ das Herz, die Niere, die Leber, die Bauchspeicheldrüse, die Milz, die Blase, der Harnleiter oder die Harnröhre oder ein Teil dieser Organe ist.
Künstliches Blasenkonstrukt mit einem biokompatiblen Substrat; einer ersten kultivierten Mehrfachschicht von Zellen, die aus einer isolierten Population glatter Muskelzellen gewonnen werden; und mit einer zweiten kultivierten Mehrfachschicht von Zellen, die aus einer Harnwegsepithel-Zellpopulation gewonnen werden, wobei die zweite Mehrfachschicht auf der ersten Mehrfachschicht kultiviert und mit dieser an einer chimären Grenzfläche verbunden ist, an der interstitielles Biomaterial erzeugt wird, so daß das Konstrukt nach der Implantation das funktionelle Äquivalent einer natürlichen Blase darstellt.
Verfahren zum Herstellen eines künstliches Blasenkonstrukts, wobei ein biokompatibles Substrat in der Form einer Blase bereitgestellt wird; eine erste kultivierte Mehrfachschicht mit einer isolierten Population glatter Muskelzellen auf einer Fläche des biokompatiblen Substrats erzeugt wird, wobei die erste Mehrfachschicht an das biokompatible Substrat angebracht wird; und wobei eine zweite kultivierte Mehrfachschicht mit einer Harnwegsepithel-Zellpopulation erzeugt wird, wobei die zweite Mehrfachschicht auf der ersten Mehrfachschicht kultiviert und mit dieser an einer chimären Grenzfläche verbunden wird, so daß das Konstrukt nach der Implantation das funktionelle Äquivalent einer natürlichen Blase darstellt, wodurch ein künstliches Blasenkonstrukt hergestellt wird.
Künstliches Blasenkonstrukt nach Anspruch 8 oder Verfahren zum Herstellen eines künstlichen Blasenkonstrukts nach Anspruch 9, wobei die chimäre Grenzfläche ferner eine interstitielle Submukosa umfaßt, die durch wenigstens eine der Mehrfachschichten erzeugt wird.
Verfahren zum Herstellen eines künstlichen Organkonstrukts nach Anspruch 3 oder 9, wobei das biokompatible Substrat aus einem Polymer, einer dezellularisierten Blase oder einem Teil einer dezellularisierten Blase besteht.