JP2003527170A

JP2003527170A - 多層組織構造の再構築方法および組成物

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Publication number: JP2003527170A
Application number: JP2001550356A
Authority: JP
Inventors: アタラ，アンソニー
Original assignee: Childrens Medical Center Corp
Current assignee: Childrens Medical Center Corp
Priority date: 1999-12-29
Filing date: 2000-12-14
Publication date: 2003-09-16
Also published as: CA2395674A1; ATE329010T1; ES2264425T3; AU2096301A; DE60028616T2; WO2001049827A1; CA2395674C; AU778222B2; DE60028616D1; EP1261692B1; EP1261692A1; US6428802B1

Abstract

(57)【要約】本発明は、異質多層を含む多層人工器官を製造する組成物および方法に関する。異質細胞集団を含む多層は、キメラ界面が異質多層間に製造されるように生体適合性基質の一方の側面に製造される。キメラ界面における細胞相互作用は、天然生体内期間に似ている形態学的および機能的特徴を有する間質医用材料を製造する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（発明の背景）本発明の技術分野は、生体外での人工器官の製造、及びこれに引き続いての生
体内人工器官の移植に関し、特に組織層間の天然界面を有する多層細胞器官の製
造に関する。

【０００２】、その全てのまたは一部の欠陥器官の置き換えによる、欠陥のある器官の置換
について、医療界で相当の努力が向けられている。数多くの例において、これら
の器官は、例えば人工心臓のような完全な人工であるか、あるいは、例えば哺乳
類ドナーからの器官である完全に天然である。しかしながら、これらの両方の取
り組みには制限がある。天然器官移植では、ＡＩＤＳや肝炎等の疾病の感染ある
いは移植された器官の拒絶に対する潜在的危険性がある。加えて、ドナー器官の
入手性がしばしば一定の制限因子である。人工器官では、機械的故障の生成およ
び結石形成に関連する問題がある。

【０００３】欠陥のある器官または細胞の再構築に対する取り組みが調査されている。最初
に、細胞生存の実現可能性が、解離した細胞の懸濁液をその他の器官、例えば脂
肪、肝臓に接種することによって、あるいは細胞結合および再組織のマトリック
スを提供するホスト組織の間質を用いて説明されている。しかしながら、細胞集
団の持続した増加が観察されておらず、従って予め存在する組織における新たな
組織の成長および構築を達成する努力の限界を強調している（Ｃｉｍａ等（１９
９１年）、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｃｈ．Ｅｎｇｒ．１１３：１４３〜１５１参照）。

【０００４】別法として、種々のマトリックス上で器官が調製されている。培養した細胞の
細胞形態学および代謝活性は、これらが成長するマトリックスの組成物によって
影響される。おそらく、天然環境と非常に似ているマトリックス上で培養した場
合に、培養した細胞は最も機能する（すなわち、その天然の生体外機能を増殖し
そして発揮する）であろう。近年、細胞の生体外研究は、培養した細胞の増殖お
よび発育のための適当な生理学的環境を提供する細胞成長マトリックスの入手性
により制限されている。

【０００５】器官再構築における更なる制限は、多層化器官の細胞組織を模倣している。数
多くの器官は、異なる組織の多数の層により構成されている。器官の機能的役割
に依存して、異なる組織は、異なる性質を器官に与える。例えば、膀胱は、３種
類の組織の主要層、すなわち粘膜、粘膜下層および排尿筋を有している。尿路上
皮細胞を含む粘膜は、最も内部の層であり、そして移行性細胞上皮組織から構成
されている。粘膜下層は、粘膜およびその基底膜のすぐ下にある。これは、血管
を支持する組織間質タンパク質の層であり、そしてこれは粘膜に栄養素および排
泄物の除去を補助するリンパ節を供給する。粘膜下層は、重要な機能を果たし、
そして粘膜と排尿筋との間の界面として製造される。排尿筋は、膨張して尿を保
存しそして収縮して尿を排出する平滑筋細胞の層である。異なる細胞集団間で生
体内製造された天然界面は、重要な構造的および機能的性質、例えば栄養素を粘
膜に供給する粘膜下層の製造を有するいくつかの生物学的特徴をもたらす。

【０００６】多層器官の再構築は、典型的にはマトリックスの両面を異なる細胞集団で被覆
すること含んでいる。これらの例において、マトリックスは、異なる細胞集団の
間の人工バリアとして作用する（１９９７年１０月３１日に出願された「膀胱再
構築（ＢｌａｄｄｅｒＲｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ）」の名称のＡｔａｌａ
等、米国出願番号６０／０６３，７９０号明細書参照）。異なる細胞集団間で、
いつくかの相互作用がマトリックスの孔を通じて生じるが、これらの相互作用は
、せいぜい最小限であり、そして生体内の全組織の細胞間相互作用特徴を欠いて
いる。これは、例えば膀胱粘膜下層、口腔粘膜および鼻上皮等の上皮細胞のよう
な生物学的材料を形成する、通常の機能的および形態学的相互作用を防止する。
粘膜下層の存在は、通常の分裂および分化を促進する成長因子および他のタンパ
ク質を提供する。

【０００７】従って、異なる細胞集団の間に天然界面を有する人工器官を作製し、そして本
来の生体内器官の界面に酷似している人工器官を製造するという要求がある。［発明の開示］本来の生体内器官の界面に酷似している二種類の異なる細胞集団間のキメラ界
面を有する人工器官を提供することが本発明の目的である。

【０００８】本来の生体内器官の界面により一層似ている二種類の異なる細胞集団間のキメ
ラ界面を有する人工器官を製造する方法を提供することが本発明の目的である。細胞がその通常の形態学および細胞機能を保持している人工器官を提供するこ
とが本発明の目的である。

【０００９】本発明は、異なる細胞集団間のキメラ界面を有する生体適合性基質上での異な
る集団の細胞の生長によって、本来の生体内器官における等価医用材料と似てい
る新規の間質医用材料が製造されるという発見に一部基づいている。これは、各
多層が生体内器官の等価実質組織と似るように、培養液中での異なる集団の細胞
からなる異質多層の活性増殖を持続することによって達成することができる。こ
のことは、一部多層の製造方法に依るものであろう。多層は、第一の均質な細胞
集団の一層を生体適合性基質上に、各層の細胞が活性増殖するまで一度に培養す
ることによって製造される。多層は、細胞が発育し増殖して生体内器官の等価実
質組織の構造および形態に似るまでインキュベートされる。

【００１０】従って、本発明の方法により発育した多層は、均質細胞集団の長時間増殖を支
持するのに必要なタンパク質、成長因子および調節因子を生産する。第一の多層
が確立された後、これは、第二の多層を製造するための表面を提供する。第二の
多層は、第一の均質細胞集団とは異なる第二の均質細胞集団から成る。第二の均
質細胞集団一層を各層の細胞が活性増殖するまで培養することによって第二の多
層を発育させる。

【００１１】二種類の多層が接触するキメラ界面が製造される。これは、生体内多細胞器官
のものと類似する細胞微小環境を創出する。かかる微小環境を創出することによ
って、生体内で構造的拘束により阻害されないように、界面における細胞が増殖
し、分化し、そして分離する。また、これは、界面における細胞をより天然の形
態、構造および生体内空間分布に回復させ、これにより生体内条件により一層近
づく。キメラ界面における細胞の成長は、さらにタンパク質、糖タンパク、グリ
コサミノグリカン、細胞マトリックスまたはその他の材料を異なる多層間に添加
することによって増強し得る。

【００１２】従って、一実施態様において、本発明は、第一の細胞集団から誘導した細胞の
第一の培養した多層；および前記第一の細胞集団とは異なる第二の細胞集団から誘導した第二の培養した多
層であって、移植した際に、構造体が天然生物学的構造体の機能的等価物を提供
するように前記第二の多層がキメラ界面により前記第一の多層と結合された第二
の培養した多層；を含む人工器官構造体人工器官構造体を提供する。

【００１３】１つの実施形態において、人工器官は、さらに第一の細胞集団および第二の細
胞集団と異なる第三の細胞集団から誘導した第三の培養した多層を含み、この際
前記第三の多層がキメラ界面により前記第二の多層と結合されている。

【００１４】好ましい実施形態において、キメラ界面はさらに、少なくとも１つの多層によ
り製造された間質医用材料を含む。この間質医用材料は、通常の形態を有する細
胞を含む。

【００１５】別の実施形態において、人工器官構造体は、さらに第一と第二の多層との間の
層状因子を含み、前記因子が栄養素、成長因子、サイトカイン、細胞外基質成分
、分化のインデューサ、分泌物、免疫調節物質、細胞ネットワークまたは神経線
維の成長を増強し、または許容する生物学的活性化合物から成る群から選択され
る。

【００１６】一実施形態において、器官は、心臓、腎臓、肝臓、膵臓、脾臓、膀胱、尿管お
よび尿道から成る群から選択される。別の実施形態において、人工器官は、心臓
、腎臓、肝臓、膵臓、脾臓、膀胱、尿管および尿道から成る群から選択される器
官の一部である。

【００１７】別の実施態様において、本発明は、平滑筋細胞集団から誘導した細胞の第一の
培養した多層および；尿路上皮細胞集団から誘導した第二の培養した多層であって、移植した際に、
構造体が天然膀胱の機能的等価物を提供するように前記第二の多層がキメラ界面
により前記第一の多層と結合された第二の培養した多層；を含む人工膀胱構造体を提供する。

【００１８】好ましい実施形態において、キメラ界面は、さらに、少なくとも１つの多層に
より製造された間質粘膜下層を含む。別の実施態様において、本発明は、人工器官構造体の製造方法であって、器官の形状の生体適合性基質を用意し；第一の細胞集団から誘導した細胞の第一の培養した多層を前記基質のある領域
に作製し、前記第一の多層は前記生体適合性基質に付着し；前記第一の細胞集団とは異なる第二の細胞集団から誘導した第二の培養した多
層を作製し、移植した際に、構造体が天然生物学的構造体の機能的等価物を提供
するように前記第二の多層がキメラ界面により前記第一の多層と結合することに
よって人工器官構造体を製造することを含む人工器官構造体の製造方法を提供する。

【００１９】一実施形態において、生体適合性基質は、ポリマーである。別の実施形態にお
いて、生体適合性基質は、脱細胞化器官である。一実施形態において、脱細胞化
器官は、心臓、腎臓、肝臓、膵臓、脾臓、膀胱、尿管および尿道から成る群から
選択される。別の実施形態において、脱細胞化器官は、心臓、腎臓、肝臓、膵臓
、脾臓、膀胱、尿管および尿道から成る群から選択される脱細胞化器官器官の一
部である。

【００２０】別の実施態様において、本発明は、人工膀胱構造体の製造方法であって、膀胱の形状の生体適合性基質を用意し；平滑筋細胞集団を含む第一の培養した多層を前記基質のある領域に作製し、前
記第一の多層は前記生体適合性基質に付着し；尿路上皮細胞集団を含む第二の培養した多層を作製し、移植した際に、構造体
が天然膀胱の機能的等価物を提供するように前記第二の多層がキメラ界面により
前記第一の多層と結合することによって人工膀胱構造体を製造することを含む人工膀胱構造体の製造方法を提供する。

【００２１】好ましい実施形態において、キメラ界面がさらに、少なくとも１つの多層によ
り製造された間質粘膜下層を含む。別の実施態様において、本発明は、泌尿生殖器障害を有する被験者の治療方法
であって、平滑筋細胞集団から誘導した細胞の第一の培養した多層および尿路上皮細胞集
団から誘導した第二の培養した多層であって、前記第二の多層がキメラ界面によ
り前記第一の多層と結合された第二の培養した多層を含む人工器官構造体を用意
し、前記構造体が天然構造体と等価物を提供するように前記器官を被験者に移植し
、そして泌尿生殖器障害の変化について被験者を監視することを含む泌尿生殖器障害を有する被験者の治療方法を提供する。（詳細な説明）本発明をより理解するために、所定の用語をまず定義する。

【００２２】本明細書で使用する用語「多層」は、互いに積層された均質の培養した細胞周
団の多数の層を含む配列を言う。「多層」を製造する方法は、一層の細胞集団を
表面、例えば生体適合性基質に堆積させることを含む。堆積した細胞を成長培地
中でこれらが生育しそして増殖して所望の表現型および形態を有する細胞を含む
第一の単層を製造するまで培養する。第一の単層が所望の細胞密度を達成すると
、同一細胞集団の第二の層を、前記第一の単層上に堆積させる。堆積した細胞の
第二の層を、栄養素を第二の細胞層および第一の単層の両方に供給する成長培地
中で、第二の層における細胞が所望の細胞密度まで生育しそして増殖して所望の
表現型および形態を有する二層を製造するまで培養する。同一細胞集団の第三の
層を前記二層の上に堆積し、そして栄養素を二層および第三の層の細胞の両方に
供給する成長培地中で、第三の層における細胞が所望の細胞密度まで生育しそし
て増殖して、所望の表現型および形態を有する三層を形成するまで培養する。均
質細胞集団の多数の層が製造されるまで、この方法を繰り返す。多層の特徴は、
生体内器官の等価実質組織の形態学的および機能的特徴と非常に似ることである
。例えば、平滑筋細胞集団を含む多層は、膀胱、すなわち排尿筋の平滑筋組織の
機能的特徴を有するであろう。

【００２３】本明細書に使用する用語「結合（coupled）」とは、互いに接触する二種類の
異なる細胞集団間の相互の親密な相互作用を言う。これらの相互作用は、細胞間
相互作用、成長、発育および増殖を伴う。組織の発育、修復および維持に応答性
の細胞挙動は、細胞とその微小環境との相互作用によって大きく調節される。こ
れらの相互作用は、成長因子、酵素および細胞表現型の変化の結果生じる応答を
誘導するその他の分子を結合する細胞表面分子によって媒介される。また、これ
らの相互作用は、各々の異なる細胞集団の機能的性質とは異なる独特の機能的性
質を有する細胞性材料を発生することができる新規の細胞の発生させる。

【００２４】本明細書に使用する用語「キメラ界面」とは、二種類の異なる細胞集団間で形
成される境界を言う。本明細書に使用する用語「機能的等価物」とは、天然器官と同一または同様の
方法で挙動する本発明の方法によって製造された人工器官を言い、例えば人工膀
胱は、生体内膀胱と同一の機能的特徴を有している。

【００２５】本明細書に使用する用語「間質医療材料」とは、二種類の異なる細胞集団が互
いに相互接触するキメラ界面における細胞性材料の形成を言う。最も広い概念で
用語「間質医療材料」は、二種類以上の細胞集団が互いに接触する際に形成され
る新規の細胞性材料の形成を含むことを意図する。新規の細胞性材料は、器官の
通常の生体内細胞発育で製造された等価細胞性材料と似ている。例えば、人工膀
胱の再構築において、互いに相互接触する二種類の異なる細胞集団は、平滑筋細
胞集団および尿路上皮細胞集団である。従って、これらの集団の界面で製造され
た「間質医用材料」は、粘膜下層のものと似ている。

【００２６】本明細書に使用する語句「泌尿生殖器障害」とは、膀胱、尿管および尿道の通
常の機能に影響を与える疾病または感染を言う。本明細書に使用する用語「被験者」は、免疫応答が誘発される生存する生物を
含むことを意図している。好ましい被験者は、哺乳動物である。被験者の例とし
て、限定されるものではないがヒト、サル、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウシ
、ウマ、ブタ、ヤギおよびヒツジが挙げられる。

【００２７】本明細書に使用する用語「生体適合性基質」とは、細胞集団を堆積することが
できる被験者への移植に好適な材料を言う。生体適合性基質は、一度被験者に移
植されると毒性および損傷性の影響を与えない。一実施形態において、生体適合
性基質は、置き換えが必要な所望の器官に成形することができる表面を有するポ
リマーである。ポリマーは、置き換えが必要な器官の一部にも成形することがで
きる。

【００２８】別の実施形態において、生体適合性基質は、脱細胞化構造である。本発明で使
用する用語「脱細胞化構造」とは、複合下部構造を残し、全細胞性または全組織
成分を除去する方法によって製造された三次元医用配置（例えば器官）を言う。
器官、例えば膀胱または腎臓は、種々の特殊化された組織から構成されている。
器官の特殊化組織構造は、器官に関連する特定の機能を提供する実質である。器
官の支持繊維質ネットワークは、間質である。ほとんどの器官は、特殊化組織を
支持する非特殊化連結組織から構成される間質骨組みを有している。脱細胞化の
方法は、連結性細胞の複合三次元ネットワークを残して特殊化細胞を除去する。
連結組織下部構造は、主としてコラーゲンから構成されている。用語「脱細胞化
構造」は、細胞性組織材料を除去した全体器官を含むことを意図する。また、用
語「脱細胞化構造」は、器官構造の一部、例えば細胞性および組織が除去された
腎臓の腎動脈を含むことを意図する。脱細胞化構造は、異なる細胞集団を注入す
ることができる生体適合性基質を提供する。脱細胞化構造は、その形状を変える
能力を有する剛性または半剛性であることができる。例えば、脱組織化膀胱は、
流体で満たした際に膨張することが可能であるが、流体が除去されるとその元の
形状に戻る。脱細胞化構造の例として、限定されるものではないが、心臓、腎臓
、肝臓、膵臓、脾臓、膀胱、尿管および尿道が挙げられる。

【００２９】本発明は、生体外器官再構築のための組成物および方法を記載する。一般に、
本発明は、少なくとも二種類の異なる細胞集団を含む多細胞性器官を提供する。
器官構造体は、第一の細胞集団から誘導した細胞の第一の培養した多層および前
記第一の細胞集団とは異なる第二の細胞集団から誘導した第二の培養した多層を
含み、移植した際に、構造体が天然生物学的構造体の機能的等価物を提供するよ
うに前記第二の多層がキメラ界面により前記第一の多層と結合されている。

【００３０】また本発明は、第一の細胞集団から誘導した細胞の第一の培養した多層を前記
基質のある領域に作製し、前記第一の多層は前記生体適合性基質に付着し；前記第一の細胞集団とは異なる第二の細胞集団から誘導した第二の培養した多
層を作製し、移植した際に、構造体が天然生物学的構造体の機能的等価物を提供
するように前記第二の多層がキメラ界面により前記第一の多層と結合することに
よって人工器官構造体を製造することによる器官の形状の生体適合性基質を使用
する人工器官の製造方法を提供する。

【００３１】本発明の種々の実施態様を、以下のサブセクションにおいて説明する。Ｉ．器官細構築のための細胞の培養本発明の一実施態様は、少なくとも二種類の異なる細胞集合を含む人工器官構
造体に関する。人工構造体は、異なる細胞集団が被験者自身の組織から誘導され
た同種異系の人工構造体であることができる。例えば、細胞は、ヒト器官、例え
ば膀胱、尿管、尿道およびその他の泌尿生殖器組織から誘導することができる。
また、人工器官構造体は、異なる細胞集団が被験者と異なる哺乳類種から誘導さ
れた異種間のものであることもできる。例えば、細胞は、哺乳類、例えばサル、
イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウシ、ウマ、ブタ、ヤギおよびヒツジの器官から
誘導することができる。

【００３２】細胞を、数多くの供給源、例えば生検試料または部検から単離することができ
る。単離した細胞は、被験者の生検試料からの自己由来細胞であることが好まし
い。例えば、腕、前腕または四肢からの骨格筋あるいは皮下接種される少量のリ
ドカインでの局所麻酔で処理されそして培養液に広げられた領域からの平滑筋の
生検試料である。生検試料は、生検針、操作を迅速かつ単純にする迅速に作用す
る針を使用して得ることができる。Ａｔａｌａ等（１９９２）Ｊ．Ｕｒｏｌ．１
４８，６５８〜６２；Ａｔａｌａ等（１９９３）Ｊ．Ｕｒｏｌ．１５０：６０８
〜１２および実施例１に記載の通り、次いで、骨格筋または平滑筋のいずれかの
少量の生検試料コアを広げて、そして培養することができる。親類または同一種
の他のドナーからの細胞も好適な免疫抑制によって使用することもできる。

【００３３】細胞の単離および培養方法は、参考文献として本明細書に組み込んであるＦａ
ｕｚａ等（１９９８）Ｊ．Ｐｅｄ．Ｓｕｒｇ．３３，７〜１２に議論されている
。細胞を当業者に公知の技術を使用して単離することができる。例えば、組織ま
たは器官を機械的に脱凝集しおよび／またはかなりの細胞破壊なしに、近接する
細胞間の連結を弱めて組織を個々の細胞の懸濁液に分散することが可能な消化酵
素および／またはキレート化剤で処理することができる。酵素解離は、組織を細
断し、そして細断した組織を数多くの消化酵素のいずれか単独であるいは組合せ
て処理することによって達成することができる。これらとして、限定されるもの
ではないがトリプシン、キモトリプシン、コラーゲナーゼ、エラスターゼおよび
／またはヒアルロニダーゼ、ＤＮＡアーゼ、プロナーゼおよびディスパーゼが挙
げられる。また、機械的破壊は、限定されるものではないが器官の表面の解体、
グラインダ、ブレンダ、篩、ホモジナイザ、プレッシャセルまたはインソニケー
タの使用を含む数多くの方法により達成することができる。組織脱凝集技術の論
評については、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，（１９８７），ＣｕｌｔｕｒｅｏｆＡｎ
ｉｍａｌＣｅｌｌｓ．ＡＭａｎｕａｌｏｆＢａｓｉｃＴｅｃｈｎｉ
ｑｕｅｓ，第二版、Ａ．Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，ＮｅｗＹｏｒｋ、Ｃｈ９，
ｐｐ１０７〜１２６を参照のこと。

【００３４】好ましい細胞種として、限定されるものではないが尿路上皮細胞、間葉細胞、
特に平滑筋または骨格筋細胞、ミオサイト（筋肉幹細胞）、繊維芽細胞、軟骨細
胞、脂肪細胞、繊維筋芽細胞および延性および皮膚細胞を含む外胚葉細胞、肝細
胞（ｈｅｐｔｏｃｙｔｅｓ）、島細胞、腸内に存在する細胞およびその他の実質
細胞、骨芽細胞、および骨および軟骨を形成するその他の細胞が挙げられる。好
ましい実施形態において、尿路上皮細胞および平滑筋細胞が単離される。全ての
発育段階からの尿路上皮細胞、例えば胎児、新生児、幼年から成人までの尿路上
皮細胞を使用し得る。

【００３５】組織を個々の細胞の懸濁液に戻したら、懸濁液を、細胞要素が得られる亜集団
に分画することができる。また、これは、限定されるものではないが特定細胞種
のクローニングおよび選択、望ましくない細胞の選択的破壊（負の選択）、混合
集団における示差的細胞凝集性に基づく分離を含む細胞分離、凍結解凍操作、混
合集団における細胞の示差的粘着性、濾過、従来およびゾーン遠心分離、遠心分
離（向流遠心分離）、単位比重分離、向流分配、電気泳動および蛍光活性化細胞
選別の標準技術を使用して達成することもできる。クローン選択および細胞分離
技術に関して、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（１９８７），ＣｕｌｔｕｒｅｏｆＡｎｉ
ｍａｌＣｅｌｌｓＡＭａｎｕａｌｏｆＢａｓｉｃＴｅｃｈｎｉｑｕ
ｅｓ，第二版、Ａ．Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，ＮｅｗＹｏｒｋ、Ｃｈ１１およ
び１２，ｐｐ１３７〜１６８を参照のこと。例えば、尿路上皮細胞は、蛍光活性
化細胞選別により濃縮することができ、平滑筋細胞および繊維芽細胞は、尿路上
皮細胞集合に対して減少できる。同様にして、平滑筋細胞を濃縮し、尿路上皮細
胞および繊維芽細胞を平滑筋細胞集合に対して減少し得る。

【００３６】例えば、ドナーが疾病、例えば膀胱癌またはその他の腫瘍の膀胱への転移を有
する場合、細胞分画も好ましいであろう。膀胱細胞集団を選別して、通常の非癌
性膀胱細胞から悪性腫瘍膀胱細胞またはその他の腫瘍細胞を分離し得る。１以上
の選別技術にから単離した通常の非癌性膀胱細胞を、次いで膀胱再構築に使用し
得る。

【００３７】単離した細胞を生体外培養して生体適合性基質を被覆するのに有効な細胞の数
を増加させることができる。同種異型細胞およびより好ましくは自己細胞の使用
が組織拒絶反応を防ぐために好ましい。しかしながら、人工器官の移植後に免疫
応答が被験者に生じる場合、被験者は、免疫抑制剤、例えばシクロスポリンまた
はＦＫ５０６で処理して拒絶反応を起す見込みを減じることができる。一定の実
施形態において、キメラ細胞または遺伝子組替え動物からの細胞を生体適合性基
質上に被覆することができる。

【００３８】遺伝子材料で被覆する前に、単離した細胞を形質移入することができる。有効
な遺伝子材料は、例えば、宿主における免疫応答を減じるあるいは除くことがで
きる遺伝子配列であり得る。例えば、細胞表面抗体、例えばクラスＩおよびＩＩ
組織適合性抗体の発現を抑制し得る。これにより、移植した細胞に対して宿主に
よる拒絶の機会を減少し得る。加えて、形質移入も遺伝子送達に使用することが
できる。生体適合性基質の被覆に先だって、尿路上皮細胞および筋肉細胞は、特
定の遺伝子で形質移入することができた。細胞−基質構造体は、宿主または人工
器官の長期間の生存に必要とされる遺伝子情報を運ぶことができた。

【００３９】単離した細胞は、通常のものであってもよくあるいは付加的または通常機能を
与えるように遺伝子操作されることもできる。レトロウイルスベクター、ポリエ
チレングリコールでの遺伝子操作方法あるいはその他の当業者に公知の方法を使
用することができる。これらとして、細胞中の核酸分子を輸送しそして発現する
ベクターを使用することが挙げられる（Ｇｏｅｄｄｅｌ；ＧｅｎｅＥｘｐｒｅ
ｓｓｉｏｎＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏ
ｇｙ１８５、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ(１
９９０)参照）。

【００４０】ベクターＤＮＡを、原核または細胞に従来の形質転換または形質移入技術を介
して導入する。宿主細胞を形質転換または形質移入する好適な方法は、Ｓａｍｂ
ｒｏｏｋ等（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ；ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ、第二版、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒ
ａｔｏｒｙｐｒｅｓｓ(１９８９)）およびその他の実験教科書に記載されてい
る。ＩＩ器官再構築本発明の別の実施態様は、多層化人工器官を製造する方法に関する。好ましい
実施形態において、人工器官は、生体適合性基質の一表面上に製造される。移植
に先立つ生体外人工構造体の組立ては、生体内移植後の細胞の起こり得る末端分
化を促進し、そして生体適合性基質−細胞マトリックスに対する炎症応答の危険
を極小化し、従って移植片拘縮および収縮を回避する。以下の区分は、好適な生
体適合性基質の例を記載する。（ｉ）脱細胞化構造体生物学的構造体、例えば全器官または器官の一部を、器官から全細胞性および
組織含有物を除去することによって脱細胞化することができる。脱細胞化方法は
、一連の連続抽出を含む。この抽出方法の一つの鍵となる特徴は、生物学的構造
体の複合下部構造を乱しそして破壊する過酷な抽出を避けるということである。
第一段階は、細胞性細片の除去および細胞膜の溶解を含む。これに続いて、原形
質成分および核成分の溶解を行う。

【００４１】器官を取り囲む細胞膜および細胞細片を穏やかな機械的破壊法を使用して除去
することによって生物学的構造体、例えば器官を脱細胞化することが好ましい。
穏やかな機械的破壊法は、細胞膜を破壊するのに充分であるべきである。しかし
ながら、脱細胞化方法は、生物学的構造体の複合下部構造の損傷および乱れを避
けるべきである。穏やかな機械的破壊法は、器官の表面を擦過し、器官を攪拌し
、あるいは好適な容量の流体、例えば蒸留水中で攪拌することを含む。一つの好
ましい実施形態において、穏やかな機械的破壊法は、細胞膜が破壊されそして細
胞細片が器官から除去されるまで好適な容量の蒸留水中で器官を攪拌することを
含む。

【００４２】細胞膜を除去した後、生物学的構造体の核および原形質成分を除去する。これ
は、細胞および核成分を下部構造を破壊することなしに溶解することによって行
うことができる。核成分を溶解するために、非イオン性洗浄剤または界面活性剤
を使用し得る。非イオン性洗浄剤または界面活性剤の例として、限定されるもの
ではないが、種々のベンダから入手可能なＰｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡのＲ
ｏｈｍａｎｄＨａｓｓ社製のＴｒｉｔｏｎシリーズ、例えばＴｒｉｔｏｎ
Ｘ−１００、ＴｒｉｔｏｎＮ−１０１、ＴｒｉｔｏｎＸ−１１４、Ｔｒｉｔ
ｏｎＸ−４０５、ＴｒｉｔｏｎＸ−７０５およびＴｒｉｔｏｎＤＦ−１６
、Ｔｗｅｅｎシリーズ、例えばモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ２０）、モノパル
ミテート（Ｔｗｅｅｎ４０）、モノオレエート（Ｔｗｅｅｎ８０）およびポ
リエチレン−２３−ラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ３５）、ポリエチレンエーテ
ルＷ−１（Ｐｏｌｙｏｘ）等、コール酸ナトリウム、デオキシコーレート、Ｃ
ＨＡＰＳ、サポニン、ｎ−デジルβＤ−グルコプラノサイド、ｎ−ヘプチルβ−
Ｄ−グルコピラノサイド、ｎ−オクチルα−Ｄ−グルコピラノサイドおよびＮｏ
ｎｉｄｅｔＰ−４０が挙げられる。

【００４３】当業者は、前述の分類に属する化合物の記載およびベンダが商業的に得られそ
して「ＣｈｅｍｉｃａｌＣｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｅｍｕｌｓｉｆｉ
ｅｒｓａｎｄＤｅｔｅｒｇｅｎｔｓ」，ＭｃＣｕｔｃｈｅｏｎ’ｓ、Ｅｍｕ
ｌｓｉｆｉｅｒｓａｎｄＤｅｔｅｒｇｅｎｔｓ、１９８６、ＮｏｒｔｈＡ
ｍｅｒｉｃａｎａｎｄＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＥｄｉｔｉｏｎｓ，Ｍ
ｃＣｕｔｃｈｅｏｎＤｉｖｉｓｉｏｎ、ＭＣＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏ．
，ＧｌｅｎＲｏｃｋ，Ｎ．Ｊ．，Ｕ．Ｓ．ＡおよびＪｕｄｉｔｈＮｅｕｇｅ
ｂａｕｅｒ、ＡＧｕｉｄｅｔｏｔｈｅＰｒｏｐｅｒｔｉｅｓａｎｄ
ＵｓｅｓｏｆＤｅｔｅｒｇｅｎｔｓｉｎＢｉｏｌｏｇｙａｎｄＢｉ
ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ．Ｒ．，ＨｏｅｃｈｓｔＣｅ
ｌａｎｅｓｅＣｏｒｐ．，１９８７に記載されていることを理解するであろ
う。一つの好ましい実施形態において、非イオン性界面活性剤は、Ｔｒｉｔｏｎ
シリーズ、好ましくはＴｒｉｔｏｎＸ−１００である。

【００４４】非イオン性洗浄剤の濃度は、脱細胞化される生物学的構造体の種類に依存して
変更してもよい。例えば、繊細な細胞、例えば血管については、洗浄剤の濃度を
減少すべきである。非イオン性洗浄剤の好ましい濃度範囲は、約０．００１ない
し約２．０％（ｗ/ｖ）である。より好ましくは、約０．０５ないし約１．０％
（ｗ/ｖ）である。より一層好ましくは、約０．１％（ｗ/ｖ）ないし約０．８％
（ｗ/ｖ）である。これらの好ましい濃度は、約０．００１ないし約２．０％（
ｗ/ｖ）であり、約０．０５ないし約１．０％（ｗ/ｖ）が特に好ましい。

【００４５】原形質フィラメントネットワーク、細胞間複合体および尖端微細細胞構造を含
んで成る細胞骨格成分を、アルカリ溶液、例えば水酸化ナトリウムを使用して溶
解することができる。アンモニウム塩またはこれらの誘導体から成るその他のア
ルカリ性溶液を使用して細胞骨格成分を溶解することもできる。その他の好適な
アンモニウム溶液の例として、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウムおよび水酸
化アンモニウムが挙げられる。好ましい実施形態において、水酸化アンモニウム
が使用される。

【００４６】アルカリ性溶液、例えば水酸化アンモニウムの濃度は、脱細胞化される生物学
的構造体の種類に依存して変更してもよい。例えば、繊細な細胞、例えば血管に
ついては、洗浄剤の濃度を減少すべきである。好ましい濃度範囲は、約０．００
１ないし約２．０％（ｗ/ｖ）である。好ましくは、約０．００５ないし約０．
１％（ｗ/ｖ）である。より一層好ましくは、約０．０１％（ｗ/ｖ）ないし約０
．０８％（ｗ/ｖ）である。

【００４７】脱細胞化され親油化された構造体は、好適な温度で使用に要求されるまで保存
することができる。使用に先だって、脱細胞化された構造体を好適な等張緩衝液
中または細胞培養培地中で等張化することができる。好適な緩衝液として、限定
されるものではないが、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、食塩水、ＭＯＰＳ、ＨＥ
ＰＥＳ、ハンクス平衡塩溶液等が挙げられる。好適な細胞培養培地として、限定
されるものではないが、ＲＰＭＩ１６４０、フィッシャ（Ｆｉｓｈｅｒ’ｓ）
、イソコーブ（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ）、マッコイ（ＭｃＣｏｙ’ｓ）、ダルベッコ
（Ｄｕｌｌｂｅｃｃｏ’ｓ）培地等が挙げられる。（ｉｉ）ポリマーポリマー、例えばポリグリコール酸も器官再構築に好適な生体適合性構造体で
ある。生体適合性ポリマーは、方法、例えば溶剤注型、圧縮成形、フィラメント
延伸、メッシング、リーチング、ウィービングおよびコーティングを使用して成
形することができる。

【００４８】溶剤注型において、好適な溶剤、例えば塩化メチレン中の１種以上のポリマー
の溶液を分枝パターンレリーフ構造体として注型する。溶剤蒸発後、薄膜が得ら
れる。

【００４９】圧縮成形において、ポリマーを平方インチ当たり３０，０００ポンドまでの圧
力で好適なパターンに圧縮する。フィラメント延伸は、溶融ポリマーからの延伸
を含み、そしてメッシングは、繊維をフェルト状材料に圧縮することによりメッ
シュを形成することを含む。

【００５０】リーチングにおいて、二種類の材料を含有する用液を器官の最終形態に近い形
状に拡げる。次いで、溶剤を使用して、一方の成分を溶解・除去して純粋な形態
とする（参考文献として組み込んだＭｉｋｏｓによる米国特許第５，５１４，３
７８号明細書を参照のこと）。

【００５１】核化において、器官の形状の薄膜を、放射線損傷材料の跡を作製する放射線活
性分裂生成物に曝露する。次いで、ポリカーボネートシートを酸または塩基でエ
ッチングし、放射線損傷材料の跡を孔に変える。最後に、レーザを使用して、数
多くの材料を通じて個々の孔を形成そして、燃焼して均一な孔径を有する器官構
造体を形成してもよい。

【００５２】培養培地からの栄養素を堆積した細胞集団に到達させるが培養した細胞を孔か
ら移動するのを防ぐ制御された孔構造を有するように、に高分子基質を作製する
ことができる。走査型電子顕微鏡、組織像および放射線同位元素による定量評価
を用いて生体外細胞付着および細胞生存度を評価することができる。

【００５３】高分子基質を、多数の全体のシステム、幾何配列または空間制限を満足するよ
う多数の所望の構成に成形することができる。例えば、膀胱再構築のための高分
子基質を使用するに際して、膀胱の全体および一部の寸法および形状に順応する
ように基質を成形してもよい。高分子基質を異なる寸法に成形して、異なる寸法
の患者に順応させることができる。また、患者の特別の要求、例えば異なる腹腔
空間を有する障害患者が膀胱をその空間に適するように再構築するような要求を
促進するように高分子基質を成形してもよい。

【００５４】別の実施形態において、高分子基質を身体における層状の構造、例えば尿道、
輸精管、卵管、涙管の治療に使用される。これらの用途において、高分子基質を
、中空管として形成することができる。

【００５５】生体適合性基質（脱細胞化器官またはポリマー）を、材料、例えば液化コポリ
マー（ポリ−ＤＬ−ラクチド−コ−グリコシド５０：５０８０ｍｇ／ｍｌ塩化
メチレン）で浸透して、その機械的特性を変えることができる。これは、所望の
機械的性質が達成されるまで一層または多層を被覆することによって行うことが
できる。ＩＩＩ細胞集団の多層の発生別の実施態様において、本発明は、人工多層器官構造体に使用する培養した細
胞集団を使用して人工器官を作製する方法を提供する。セクションＩで記載した
通りに細胞を広げて使用して生体適合性基質の一方の側面に多層を作製すること
ができる。ａ）脱細胞化構造体上への多層の製造一実施形態において、異なる培養した細胞集団を使用して脱細胞化構造体、例
えば脱細胞化器官または器官の一部の上に異なる多層を製造することができる。
脱細胞化器官の三次元下部構造の局所化位置に埋め込まれた針を使用して、第一
の均質細胞懸濁液を脱細胞化構造体中に灌流することができる。灌流した細胞は
、下部組織の三次元の隙間を分配して成長して下部組織を覆う細胞の層を製造す
る。第一の均質細胞懸濁液の灌流後に、細胞が発育しそして増殖して脱細胞化器
官の下部構造に付着した培養した細胞の第一の集団の単層を製造するまで、脱細
胞化器官を培養培地中３７℃にて温置する。単層が確立されると、第一の均質懸
濁液を単層上の脱細胞化構造体中に再び灌流する。細胞が発育しそして増殖して
第一の単層上に第二の単層を製造することによって二層を製造するまで、脱細胞
化器官を温置する。第一の均質細胞集団の多層が製造されるまで、この方法を繰
り返す。

【００５６】第一の多層は、生体内器官の等価実質組織の機能的特徴および形態に似ている
。例えば、脱細胞化膀胱では、第一の細胞集団は、平滑筋細胞集団である。膀胱
の平滑筋組織（すなわち、排尿筋）と似ている平滑筋組織の多層が形成されるま
で、平滑筋細胞懸濁液を膀胱中に灌流する。

【００５７】第一の多層を形成した後、第一の細胞集団とは異なる第二の培養した細胞集団
を使用して第二の多層を作製する。第二の均質細胞集団の細胞懸濁液を脱細胞化
器官中の第一の多層上に灌流する。灌流した細胞は、第一の多層に沿って分配し
、そして第二の細胞集団の細胞が第一の単層に発育し増殖するまで脱細胞化器官
を温置する。第一の単層が確立されると、第二の均質細胞集団を、第一の単層上
の脱細胞化構造体中に再び灌流する。細胞が発育しそして増殖して第一の単層上
に第二の単層を製造することによって二層を製造するまで、脱細胞化器官を温置
する。第二の均質細胞集団の多層が製造されるまで、この方法を繰り返す。

【００５８】第二の多層は、生体内器官の等価実質組織の機能的特徴および形態に似ている
。例えば、膀胱構造体用の第二の多層は、膀胱の尿路上皮組織（すなわち、粘膜
）の形態学的および機能的特徴に似ている尿路上皮多層である。

【００５９】数多くの異質の多層が製造されて人工器官構造体を作成することを当業者が理
解するであろう。多層の細胞集団は異なるが、各多層は、均質細胞集団の多数の
層を含む。一実施形態において、人工器官は、少なくとも約５層の多層を含む。
別の実施形態において、人工器官は、少なくとも約４層の多層を含む。更に別の
実施形態において、人工器官は、少なくとも約３層の多層を含む。好ましい実施
形態において、人工器官は、少なくとも約２層の多層を含む。

【００６０】２以上の異質の多層が互いに相互接触したキメラ界面が製造される。これによ
り、妨害しない相互作用が多層の細胞間で生じる。異なる細胞集団間での広範囲
の相互作用は、各多層とは異なる間質の医用材料を製造させる。二種類の異なる
細胞集団間での相互作用が、構造的バリア、例えば生体適合性基質（すなわち、
多層）により障害とならないので、キメラ界面での細胞は、より自然な形状およ
び構成を回復する。生体内器官の微小環境により伝導性のあるキメラ界面での微
小環境を提供することによって、キメラ界面での細胞は、より自然に発育し、そ
して成長因子および通常の分裂および分化を促進するその他のタンパク質を産生
する。これにより、生体内で見出されるものと酷似する人工器官を作製する独特
の生物学的および機能的特徴を提供する間質医用材料を製造することができる。
例えば、人工膀胱構造体の平滑筋多層と尿路上皮多層との相互作用は、生体内膀
胱の粘膜下層と似ている細胞の層の製造するキメラ層を製造する。粘膜下層は、
充分に発育した際に平滑筋細胞への血液供給を提供するという点で平滑筋細胞お
よび尿路上皮細胞のものからは独特である機能的特徴を提供する。

【００６１】異なる細胞集団を含む二種類以上の異質多層が相互作用した際に製造される間
質医用材料が本発明の範囲内であるということを当業者は理解するであろう。製
造された異なる間質医用材料は、異質多層における細胞の種類に依存する。

【００６２】一実施態様において、付加的コラーゲン層を脱細胞化構造体の内部表面に添加
して、内容が本明細書に組み込まれているＰＣＴ国際公開番号ＷＯ９５／２２３
０１号明細書に記載されているような平滑な表面を作製してもよい。この平滑コ
ラーゲン層は、成長および発育を促進する細胞付着を促進する。ＰＣＴ国際公開
番号ＷＯ９５／２２３０１号明細書に記載されるように、平滑コラーゲン層は、
有意にはタイプＩコラーゲンであるがタイプＩＩコラーゲン、タイプＩＶコラー
ゲンまたは両者を含むことができる酸抽出原繊維または非原繊維コラーゲンから
作製し得る。使用するコラーゲンは、数多くの哺乳類源、代表的にはブタおよび
ウシの皮膚および腱から誘導し得る。コラーゲンは、酸抽出により加工されて高
い純度の原繊維分散液またはゲルとなっているのが好ましい。弱酸、例えば酢酸
または蟻酸を使用して、コラーゲンをコラーゲン源から酸抽出することができる
。溶液中に抽出されると、ＮａＣｌを使用してコラーゲンを塩沈し、そして標準
技術、例えば遠心分離または濾過を使用して回収することができる。酸抽出した
コラーゲンの詳細は、例えば参考文献として組み込まれているＫｅｍｐ等による
米国特許第５，１０６，９４９号公報に記載されている。

【００６３】別の実施形態において、付加的コラーゲン層を異質多層の間に添加して異質多
層の細胞間の成長および発育を促進してもよい。さらに別の実施形態において、
因子、例えば栄養素、成長因子、サイトカイン、細胞外マトリックス成分、分化
のインデューサ、分泌物、免疫調節物質、細胞ネットワークまたは神経線維の成
長を増加または認める生物学的活性化合物を、異質多層の間に添加することもで
きる（セクションＩＶ参照）。ｂ）ポリマー上への多層の製造別の実施態様において、異なる培養した細胞集団を使用してポリマーのある領
域上に異質多層を製造することができる。好適なポリマーの例として、限定され
るものではないが、コラーゲン、ポリ（アルファエステル類）、例えばポリ（乳
酸）、ポリ（グリコール酸）、ポリオルトエステル類およびポリ酸無水物および
これらのコポリマー、セルロースエーテル、セルロース、セルロース化合物エー
テル、フッ化ポリエチレン、フェノール、ポリ−４−メチルペンテン、ポリアク
リロニトリル、ポリアミド、ポリアミドイミド、ポリアクリレート、ポリベンゾ
オキサゾール、ポリカーボネート、ポリシアノアリールエーテル、ポリエステル
、ポリエステルカーボネート、ポリエーテル、ポリエーテルエーテルケトン、ポ
リエテールイミド、ポリエーテルケトン、ポリエーテルスルホン、ポリエチレン
、ポリフルオロオレフィン、ポリイミド、ポリオレフィン、ポリオキサジアゾー
ル、ポリフェニレンオキサイド、ポリフェニレンサルファイド、ポリプロピレン
、ポリスチレン、ポリサルファイド、ポリスルホン、ポリテトラフルオロエチレ
ン、ポリチオエーテル、ポリトリアゾール、ポリウレタン、ポリビニリデンフル
オライド、再生セルロース、尿素−ホルムアミドまたはこれらの材料のコポリマ
ーまたは物理的ブレンドが挙げられる。

【００６４】好ましい実施形態において、生体適合性基質の一方の側面を使用して第一の均
質細胞集団の多層を製造する。これは、生体適合性基質の一方の側面を第一の均
質細胞集団、例えば平滑筋細胞の懸濁液で被覆することによって達成される。細
胞が発育しそして増殖して単層を製造するまで、第一の均質細胞懸濁液を培養培
地中で温置し、そして細胞が発育しそして増殖して第一の単層上の細胞の第二の
単層を製造することによって二層を製造するまで細胞を培養する。この方法を、
多数の層の第一の均質細胞集団を含む多層が発生するまで繰り返す。第一の多層
は、生体内器官の実質組織、例えば排尿筋に似ている形態学的および機能的特徴
を有している。

【００６５】第一の多層が確立された後、第二の均質細胞集団を含む第二の多層を第一の多
層上に作製する（例えば尿路上皮細胞集団）。これにより二種類の異なる細胞集
団の間のキメラ界面が製造される。第二の均質細胞集団は、第二の均質細胞集団
の懸濁液を第一の多層上に堆積させることによって作製される。第二の均質細胞
集団を、これらが発育しそして増殖して第一の単層を作製するまで培養する。第
一の単層が確立されると、第二の均質細胞懸濁液を第一の単層上に堆積し、そし
て細胞が発育しそして増殖して第一の単層上の細胞の第二の単層を製造すること
によって二層を製造するまで細胞を培養する。この方法を、多数の層の第二の均
質細胞集団を含む多層が発生するまで繰り返す。第一の多層は、生体内器官の実
質組織、例えば粘膜に似ている形態学的および機能的特徴を有している。上記の
通り、間質医用材料は、二種類の異なる細胞集団の間のキメラ界面で製造される
。

【００６６】従って、本発明は、本来の生体内器官と酷似する多細胞組織を有する人工器官
を製造する組成物および方法を提供する。細胞組織は、異質多層を含んでいる。
人工器官の各多層は、均質細胞集団の多数の層を含み、自然器官の本来の生体内
層の等価組織と似ている器質化構造を発生する。

【００６７】異なる多層間のキメラ界面は、異なる細胞集団間の本体の微小環境をまねる微
小環境を提供する。細胞形状が細胞分裂および分化に重要な役割を果たすことを
当業者は理解するであろう（例えば、Ｄａｒｎｅｌｌ等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
ＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙ（１９８６）、ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＡｍｅｒｉｃ
ａｎＢｏｏｋｓによる出版を参照）。本発明の方法により製造されたより自然
な微小環境は、異質多層間の相互の機能上の障害のない細胞−細胞相互作用を認
める。これらの障害のない相互作用は、界面における細胞をより自然な細胞およ
び形態学的構成を回復させる。キメラ界面におけるより自然な細胞発育は、細胞
を通常の分裂および分化を促進するタンパク質を製造させる。

【００６８】代替身体部分として機能する本発明の人工器官は、平ら、管状であることがで
き、あるいは複雑な幾何配列を有することができる。器官の形状は、目的とする
用途により決定されるであろう。人工器官を移植して疾病または損傷器官、例え
ば腹壁欠陥、心膜、ヘルニアおよび限定されるものではないが骨、骨膜、軟骨膜
、椎間板、関節軟骨、真皮、表皮、腸、靭帯および腱を含む種々の他の器官およ
び構成を修復、増大または置換することができる。加えて、組織修復織物を、血
管または心臓内パッチとしてあるいは置換心弁として使用することができる。

【００６９】平らなシートを使用して、例えば器官用の吊り包帯としてシートを使用するこ
とによって脱出または超移動性の器官を支持し得る。この吊り包帯は、器官、例
えば膀胱または子宮を支持することができる。

【００７０】管状切片を使用して、例えば管状器官の横断面、例えば食道、気管、腸および
卵管を置き換えることができる。これらの期間は、外側表面および管腔表面を有
する基本的管形状を有している。ＩＶ細胞付着いくつかの実施形態において、細胞の生体適合性基質への付着を生体適合性基
質を化合物、例えば基底膜成分、寒天、アガロース、ゼラチン、アラビアゴム、
コラーゲンタイプＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶおよびＶ、フィブロネクチン、ラミニ
ン、グリコサミノグリカン、これらの混合物および細胞培養の当業者に公知のそ
の他の親水性およびペプチド付着材料で被覆することによって強めることができ
る。生体適合性基質を被覆する好ましい材料は、コラーゲンである。

【００７１】別の実施形態において、生体適合性基質を培養した細胞で被覆する前または後
に、生体適合性基質を、移植に先だって因子または薬剤で処理して、例えば移植
後に新規の組織の形成を促進することができる。薬剤を含む因子は、生体適合性
基質に導入することができ、あるいは生体適合性基質と共に提供することができ
る。かかる因子を、一般に再構築または拡大される組織または器官に従って選択
して、適当な新規組織が移植された器官または組織中に確実に形成させる（例え
ば、骨の治療を促進するのに使用される添加剤（例えば、Ｋｉｒｋｅｒ−Ｈｅａ
ｄ，（１９９５）Ｖｅｔ．Ｓｕｒｇ．２４：４０８〜１９）。例えば、生体適合
性基質を使用して血管組織を拡大する場合、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）を使
用して新規血管細胞の形成を促進することができる（例えば、Ｇａｌｌｏ等の米
国特許第５，６５４，２７３号明細書を参照のこと）。その他の有効な添加剤と
して、抗菌剤、例えば抗生物質が挙げられる。

【００７２】人工器官の移植は、当該技術分野で認められた方法に従って行うことができる
（例えばＦａｕｚａ等（１９９８）Ｊ．Ｐｅｄ．Ｓｕｒｇ．３３，７〜１２を参
照）。

【００７３】当業者は、上記の実施形態に基づく本発明の更なる特徴および利点を理解する
であろう。従って、本発明は、請求の範囲に示されたものを除いて特に示しそし
て記載したものに限定されない。本明細書に引用した全ての刊行物および参考文
献は、その全ての箇所を参考文献として本明細書に明白に組み込む。［実施例］実施例１細胞収集および培養収集した細胞を、参考文献として特に組み込んである先に出版されたＡｔａｌ
ａ等、（１９９３）Ｊ．Ｕｒｏｌ．１５０：６０８、Ｃｉｌｅｎｔｏ等（１９９
４）Ｊ．Ｕｒｏｌ．１５２：６５５、Ｆａｕｚａ等（１９９８）Ｊ．Ｐｅｄ．Ｓ
ｕｒｇ．３３，７〜１２のプロトコールに従って培養した。ａ）尿路上皮細胞集団の培養膀胱検体を得て、そして培養のために調製した。細胞障害を最小化するため、
検体を電気メスで切断するというよりも鋭く切開した。漿膜表面を、縫合糸でマ
ークし、側部が尿路上皮表面を表すように不明確とならないようにした。

【００７４】滅菌器具を使用して、検体を層状フローセル培地フード中で加工した。ケラチ
ノサイト−ＳＦＭ（ＧＩＢＣＯＢＲＬ（Ｃａｔ．Ｎｏ．１７００５）、ウシ下
垂体抽出物（Ｃａｔ．Ｎｏ．１３０２９、２．５ｍｇ／５００ｍｌ培地）およ
びサプリメントとしての組替え尿路細胞成長因子（Ｃａｔ．Ｎｏ．１３０２９、
２．５μｇ／５００ｍｌ培地）を有する培養培地を調製した。４℃の培養培地１
０ｍｌを、２枚の１０ｃｍ細胞培養皿の各々に配置し、そして３．５ｍｌを第三
の皿に配置した。検体を第一の皿に配置し、そしてこれを前後に穏やかに攪拌す
ることによって血液を検体から除去した。この方法を第二の皿中で繰り返し、そ
して最後に検体を第三の皿に移した。検体を切断することなにし、尿路上皮表面
を、Ｎｏ．１０メスの刃で穏やかに掻爬した。尿路上皮細胞は、培地に分散した
小さな曇った材料として目視できた。尿路上皮細胞／培地懸濁液を吸引し、そし
て各ウェルに培地約０．５ないし１ｍｌを有する２４ウェル細胞培養プレートの
うちの６ウェルに播種して、ウェル当たり全量１ないし１．５ｍｌとした。５％
ＣＯ₂を使用して細胞を３７℃で温置した。

【００７５】次の日（収集後１日）、培地を前記６ウェルから吸引し、新鮮な培地を適用し
た。細胞を１００ｒｐｍで４時間遠心分離し、そして上澄み液を除去した。細胞
を２４ウェルプレート中３７℃に温められた新鮮な培地３〜４．５ｍｌ中に再懸
濁させた。

【００７６】培養培地を除去し、そしてＰＢＳ／ＥＤＴＡ（３７℃、ｐＨ７．２、０．５３
ｍＭＥＤＴＡ（各々ＰＢＳ５００ｍｌ中０．５ＭＥＤＴＡ０．５３ｍｌ、ｐ
Ｈ８．０））を各２４ウェルプレートのウェルまたは１０ｍｌを各１０ｃｍ皿に
添加した。次いで、細胞を２枚の１０ｃｍ皿に継代した。しかる後、細胞を１０
０％集密とさせないで、８０〜９０％集密となる毎に、細胞を継代した。

【００７７】位相差顕微鏡で細胞を観察した。大部分の細胞について細胞−細胞結合を分離
し（約５〜１５分）、ＰＢＳ／ＥＤＴＡを除去し、そしてトリプシン／ＥＤＴＡ
（３７℃、ＧＩＢＣＯＢＲＬ，ＣａｔＮｏ．２５３００〜０５４）３００μ
ｌを各２４ウェルプレートのウェルまたは７ｍｌを各１０ｃｍ皿に添加した。細
胞８０〜９０％がプレートから脱離しそして浮遊し始めた際に（約３〜１０分）
、大豆トリプシン禁止剤３０μｌ（ＧＩＢＣＯＢＲＬ，ＣａｔＮｏ．１７０
７５〜０２９、ＰＢＳ２０ｍｌに禁止剤２９４ｍｇ）を各２４ウェルプレートの
ウェルまたは７００μｌを各１０ｃｍ皿に添加してＥＤＴＡの作用を停止するこ
とによってトリプシンの作用を禁止した。培養培地０．５ｍｌを各２４ウェルプ
レートのウェルに添加するかあるいは培養培地３ｍｌを各１０ｃｍ皿に添加した
。ＰＢＳ／ＥＤＴＡおよびトリプシン／ＥＤＴＡ温置を室温で行ったが、プレー
トを３７℃で温置した場合より有効であった。

【００７８】１０００ｒｐｍで４分間の遠心分離により細胞を収集し、そして上澄み液を除
去した。細胞を培養培地５ｍｌ中に再懸濁し、そして血球計数計を使用して細胞
の数を測定した。細胞生存度を、標準トリプシンブルー染色試験により測定した
。１００ｍｍ培養プレートに関する最適播種密度は、約１×１０⁶細胞／プレー
トであった。所望の数の細胞を皿に分注し、そして培地の容量を添加して総計約
１０ｍｌ／プレートとした。ｂ）膀胱平滑筋細胞の培養実施例１、セクション（ａ）に記載の通り尿路上皮細胞層を膀胱検体から除去
した後、残りの筋肉を２〜３ｍｍ筋肉セグメントに切断した。各筋肉セグメント
を１００ｍｍ細胞培養皿上に均等に間隔を置いて配置した。筋肉セグメントを乾
燥し、そして皿に付着させた（約１０分間）。１０％ＦＣＳを有するダルベッコ
変性イーグル培地２０ｍｌを乾燥筋肉セグメントに添加した。筋肉セグメントを
５日間阻害しないで３７℃で５％ＣＯ₂を用いて温置した。培養培地を第６日に
変え、非付着セグメントを除去した。残りのセグメントを全１０日間培養し、し
かる後全ての細胞セグメントを除去した。小さい島状の細胞が出現するまで、皿
に付着した筋肉セグメントからの細胞を温置した。これらの細胞をトリプシン処
理し、計数し、そしてＴ７５培養フラスコに播種した。

【００７９】細胞密度に依存して細胞を３日毎に供給し、そして８０〜９０％密集に到達し
たさいに細胞を継代した。実施例２胎児組織を使用した膀胱増強以下の実施例は、Ｆａｕｚａ等（１９９８）Ｊ．Ｐｅｄ．Ｓｕｒｇ．３３，７
〜１２に記載の通り胎児膀胱からの尿路上皮および平滑膀胱細胞を使用して機能
的多細胞性人工器官を製造することの可能性を説明する。母性および胎児外科操作妊娠９０〜９５日の妊娠雌ヒツジを、ケタミン１５ｍｇ／ｋｇ（Ｐａｒｋｅ-
ＤａｖｉｓＣｏ．，ＭｏｒｒｉｓＰｌａｉｎｓ，ＮＪ）での筋肉内誘発後に
、２％〜４％ハロタン（ＨａｌｏｃａｒｂｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｒ
ｉｖｅｒＥｄｇｅ、ＮＪ）で麻酔した。これらは、セファゾリン（ＢＭＨＬ
ｔｄ．Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ）１ｇを静脈内に受けた。次いで、胎児
ラムは、膀胱の前側部分を腹部壁に有袋化（ｍａｒｓｕｐｉａｌｉｚｉｎｇ）す
ることによって、膀胱外反症の開放外科製造（ｏｐｅｎｓｕｒｇｉｎａｌｃ
ｒｅａｔｉｏｎ）を受けた。操作の最後に、予め除去し３７℃で保持ておいた羊
膜液を、セファゾリン５００ｍｌとともに羊膜腔に再注入した。妊娠性の膜およ
び子宮壁を、ＴＡ９０ｍｍチタン外科ステープラ（ＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓ
ＳｕｒｇｉｎａｌＣｏｒｐ．（ＵＳＳＣ）、Ｎｏｒｗａｌｋ、ＣＴ）を用い
て一層に閉鎖した。引き続いて、胎児を二種類のグループに分類した。

【００８０】グループＩにおいて、羊膜腔に対するビデオ胎児鏡評価を、Ｆａｕｚａ等（１
９９８）Ｊ．Ｐｅｄ．Ｓｕｒｇ．３３，７〜１２に記載の通り確立した。半柔軟
性バルーン先端カニューレ（ＭａｒｌｏｗＳｕｒｇｉｎａｌＴｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｗｉｌｌｏｕｇｈｂｙ，ＯＨ）を、３つのポート（一つ
は寸法１０ｍｍでありおよび二つは寸法５ｍｍである）を介して子宮に導入した
。ビデオ胎児鏡操作を、連続的温めた食塩水羊膜注入液の下であるいは操作媒体
として医用空気を用いて行った。１．５×１０ｃｍ以下の全厚検体を、外反膀胱
から収集した。２−ｍｍおよび５−ｍｍ内視鏡クリップ、２−ｍｍおよび５−ｍ
ｍ内視鏡握り、２−ｍｍおよび５−ｍｍ内視鏡挟みおよび１０−ｍｍチタン内視
鏡クリップ（後者は収集領域の閉鎖用）とともに３０°５−ｍｍ望遠鏡（Ｋａｒ
ｌＳｔｒｏｚＥｎｄｏｓｃｏｐｙ−Ａｍｅｒｉｃａ．，Ｉｎｃ．，Ｌｏｓ
Ａｎｇｅｌｓ，ＣＡ）を使用した（すべてＵＳＳＣ製）。４−０合成粘着性グル
コマ６３１（Ｂｉｏｓｙｎ；ＵＳＳＣ）を用いて二重操作法により子宮ポートを
閉鎖した。グループＩＩにおいて、更なる胎児操作を行わなかった。

【００８１】母親の腹を層に閉鎖した。調製後第一日に、雌ヒツジは、ベンザチンペニシリ
ン１２０万単位を筋肉内に受けた（ＷｙｅｔｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉ
ｎｃ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐ．Ａ．）。通常に輸送された。細胞操作採取した胎児膀胱の尿路上皮及び平滑筋層を、外科的に相互に剥離し、別々に
処理した。細胞培養膀胱細胞を先に記載した方法（Ｃｉｌｅｎｔｏ等（１９９４）Ｊ．Ｕｒｏｌ．
１５２：６５５）によりそして実施例１に記載の通りに培養した。要約すると、
平滑筋検体を直径約０．５ｍｍのフラグメントに切断することによって、排尿筋
細胞を単離した。外植片を１０−ｃｍ培養皿に移植し、そして９５％湿度、５．
０％ＣＯ₂チャンバ中で３７℃にて実施例１に記載の通り１０％ウシ胎児血清（
Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｃｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｗａｌｋｅｒｖｉｌｌｅ，Ｍ）で補充
されたダルベッコ変性イーグル培地（ＤＭＥＭ，ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌ
Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｓｉｓ，ＭＯ）を用いて保持および拡大した。

【００８２】尿路上皮細胞を、その上皮表面の掻爬を介して外科的検体から分離しそして２
４ウェルプレートに配置した。これらを、上皮成長因子５ｎｇ／ｍＬおよびウシ
下垂体抽出物５０μｇ／ｍＬ（ケラチノサイト−ＳＦＭ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ、
ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＧｒａｎｄＩｓｌａｎｄ，ＮＹ）を含
有する血清不含ケラチノサイト成長培地を用いて前記と同一のチャンバ内で保持
および拡大した。

【００８３】排尿筋および尿路上皮細胞の両方を別々に５０〜５５日間、およその密度が１
．３×１０⁷細胞／ｃｍ²に到達するまで生体外拡大した。細胞送達細胞送達媒体は、密度５８ｍｇ／ｍＬおよび繊維直径１５μｍを有するポリグ
リコール酸ポリマーの不織シートから構成した。メッシュは、９５％以上の多孔
度を有しており、これを播種前にエチレンオキサイドで滅菌した。移植後６〜８
週間で加水分解を介して分解するように骨格を設計した。

【００８４】生体内移植の７〜１０日前、排尿筋細胞を１６から２０ｃｍ²、３−ｍｍ厚の
ポリグリコール酸骨格に播種した。３日後、尿路上皮細胞を排尿筋細胞上に同一
ポリマーに播種した。ポリマー当たりの平均細胞数は２００００万であった。新
生児動物への移植まで排尿筋／尿路上皮細胞二層をＤＭＥＭ中の培地中に約１週
間放置した。新生児操作予防のために日に一度スルファメトキサゾール／トリメトプリウム（Ｂａｒｒ
ｅ−Ｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ）（６ｍｇ／ｋｇ
のサルファ）を新生児に経口的に与えた。外科手術ケタミン１５ｍｇ／ｋｇでの筋肉内誘発後に、生後１〜４日の新生児を１．５
％〜３．５％イソフルラン（ＡｂｂｏｔｔＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｎｏｒ
ｔｈＣｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）で麻酔した。セファゾリン１００ｍｇ／ｋｇの一
当薬量を静脈内投与した。外反膀胱を、腹腔壁から外科的に脱離した。膀胱再構
築を各グループに対して以下の通り行った。

【００８５】グループＩにおいて、自己操作胎児膀胱組織を、膀胱の外科的増大に使用した
。尿路外皮細胞層が膀胱の管腔部分上にありそして筋肉層がその外側部分上にあ
るような操作方法で操作組織の境界を、３−０合成粘着性ラクトマ９−１（Ｐｏ
ｌｙｓｏｒｂ；ＵＳＳＣ）で縫合した。フィブリン糊（ＭｅｌｖｉｌｌｅＢｉ
ｏｌｏｇｉｃｓ，Ｉｎｃ．，ＮｅｗＹｏｒｋ，ＮＹ）を、その移植後に操作組
織の外側表面上に適用した。網を使用して操作組織を被覆したが、これは３−０
合成粘着性ラクトマ９−１の４本の単純な基本針で移植片の先端付近で膀胱にゆ
るく付着した。グループＩＩにおいて、膀胱欠陥を、３−０合成粘着性ラクトマ
９−１で操作方法により主として閉鎖した。

【００８６】両グループにおいて、上記いずれかの再構築技術の際に、５Ｆ、１５−インチ
長の多孔性プラスチックカテーテル（ＤａｖｏｌＩｎｃ．，Ｃｒａｎｓｔｏｎ
，ＲＩ）を膀胱内に放置し、開放外部貯蔵器に連続的に排出するように折り曲げ
られ配置された別の針（ｓｔａｂ）を介して体外に露出させた。調製後第一日に
、全ての新生児は、１投与量０．６ｍＵのベンザチンペニシリンを筋肉内に受け
た。経過観察操作後３週間、膀胱カテーテルを介して１５ｍｍＨｇで点滴される希釈イトタ
ラメートメグルミン（ｉｏｔｈａｌａｍａｔｅｍｅｇｌｕｍｉｎｅ）（Ｍａｌ
ｌｉｎｃｋ-ｒｏｄｔＭｅｄｉｃａｌ．，Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ
）を用いてコントラスト膀胱造影を両グループに対して行った。次いで、カテー
テルを除去した。スルファメトキサゾール／トリメトプリウム投与を、カテーテ
ル（ＭｅｄｅｘＩｎｃ．，Ｈｉｌｌｉａｒｄ，ＯＨ）を直接膀胱に挿入し、そ
して７８５３４Ｃデジタルモニタ／ターミナル（ＨｅｗｌｅｔｔＰａｃｋａｒ
ｄ，Ａｎｄｏｖｅｒ，ＭＡ）に接続した。膀胱を完全に空にした後、通常の食塩
水を８ｍＬ／分の速度で注入した。各５ｍＬ注入時に、安定化後、膀胱圧力を記
録した。これに続いて、Ｘ線写真膀胱造影を行った。サムレタール（Ｓｏｍｌｅ
ｔｈａｌ）（Ｊ．Ａ．Ｗｅｂｓｔｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ、ＭＡ）の
静脈内接種により動物を殺した。膀胱を組織学的分析のために除去した。組織学的分析主として閉鎖され操作された膀胱の検体を、回復の際に１０％緩衝ホルマリン
溶液（ＳｔｅｐｈｅｎｓＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｉｖｅｒｓｄａｌｅ，ＮＪ
）中に浸漬し、そして収集後２４〜４６時間規則正しいヘマトキシリン−エオシ
ン処理を行った。Ｚｅｉｓｓ（Ｚｅｉｓｓ、ドイツ）実験失光学顕微鏡を使用し
て顕微鏡分析を、２５×および１００×倍率で行った。統計的分析分散（ＶＮＯＶＡ）の分析および９５％信頼限界でのシェッフェ試験により、
統計的分析を行った。０．０５未満のｐ値が有意であると考慮された。結果コントラスト膀胱造影は、両グループにおいて明らかに相違した。主要膀胱閉
鎖を受けたグループで観察されたより小くかつ曲がったものと反対に操作膀胱は
、通常のものと近い画像が生じた。

【００８７】２ヶ月齢で、操作膀胱は、主として閉鎖されたものより従順であり（Ｐ＜０．
０５）そして３０ｍｍＨｇより高い圧力でより大きい収容力であった（Ｐ＜０．
０５）。

【００８８】操作組織の組織学的分析は、その管腔側面での多層、偽重層尿路上皮裏打ち（
移行性上皮）および連結性組織により囲まれた平滑筋細胞のその上を覆った層を
示した。操作粘膜の顕微鏡構造は、本体のものとは相違するが似ていた。筋肉肥
大が、主として閉鎖された外反膀胱に存在した。

【００８９】本発明の方法は、自己膀胱組織を提供し、そしてまた自己移植の一定の制限を
克服する。胎児収集の後、自己移植片を操作するのに必要とされる間隔は、残り
の懐胎期間に平行であり、従って時間は、制限因子ではない。さらに、ドナーと
培養液中の細胞成長速度との間の逆関係がしばしばある（Ｌａｎｇｅｒ等（１９
９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６０：９２０〜９２６）。胎児細胞が本実験で使用さ
れた事実は、胎児排尿筋細胞で観察された高い拡大率により実証された通りこの
原理を最大化した。

【００９０】加えて、ここに提供される本発明による膀胱増大は、一定のヒト先天性異常、
例えば新生児期間の適当な閉鎖に充分な残存膀胱がない膀胱および総排出腔外反
症の治療に有効であるとみなされる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】第一の細胞集団から誘導した細胞の第一の培養した多層；お
よび前記第一の細胞集団とは異なる第二の細胞集団から誘導した第二の培養した多
層であって、移植した際に、構造体が天然生物学的構造体の機能的等価物を提供
するように前記第二の多層がキメラ界面により前記第一の多層と結合された第二
の培養した多層；を含む人工器官構造体人工器官構造体。
【請求項２】さらに第一の細胞集団および第二の細胞集団と異なる第三の
細胞集団から誘導した第三の培養した多層であって、前記第三の多層がキメラ界
面により前記第二の多層と結合された第三の培養した多層を含む請求項１に記載
の人工器官構造体。
【請求項３】前記キメラ界面がさらに、少なくとも１つの多層により製造
された間質医用材料を含む請求項１または請求項２に記載の人工器官構造体。
【請求項４】前記間質医用材料が通常形態を有する細胞を含む請求項３に
記載の人工器官構造体。
【請求項５】さらに第一と第二の多層との間の層状因子を含み、前記因子
が栄養素、成長因子、サイトカイン、細胞外マトリックス成分、分化のインデュ
ーサ、分泌物、免疫調節物質、細胞ネットワークまたは神経線維の成長を増加ま
たは認める生物学的活性化合物から成る群から選択される請求項１に記載の人工
器官構造体。
【請求項６】器官が心臓、腎臓、肝臓、膵臓、脾臓、膀胱、尿管および尿
道から成る群から選択される請求項１に記載の人工器官構造体。
【請求項７】人工器官が心臓、腎臓、肝臓、膵臓、脾臓、膀胱、尿管およ
び尿道から成る群から選択される器官の一部である請求項１に記載の人工器官構
造体。
【請求項８】平滑筋細胞集団から誘導した細胞の第一の培養した多層およ
び；尿路上皮細胞集団から誘導した第二の培養した多層であって、移植した際に、
構造体が天然膀胱の機能的等価物を提供するように前記第二の多層がキメラ界面
により前記第一の多層と結合された第二の培養した多層；を含む人工膀胱構造体。
【請求項９】前記キメラ界面がさらに、少なくとも１つの多層により製造
された間質粘膜下層を含む請求項８に記載の人工膀胱構造体。
【請求項１０】人工器官構造体の製造方法であって、器官の形状の生体適合性基質を用意し；第一の細胞集団から誘導した細胞の第一の培養した多層を前記基質のある領域
に作製し、前記第一の多層は前記生体適合性基質に付着し；前記第一の細胞集団とは異なる第二の細胞集団から誘導した第二の培養した多
層を作製し、移植した際に、構造体が天然生物学的構造体の機能的等価物を提供
するように前記第二の多層がキメラ界面により前記第一の多層と結合することに
よって人工器官構造体を製造する；ことを含む人工器官構造体の製造方法。
【請求項１１】さらに第一の細胞集団および第二の細胞集団と異なる第三
の細胞集団から誘導した第三の培養した多層であって、前記第三の多層がキメラ
界面により前記第二の多層と結合された第三の培養した多層を作製する請求項１
０に記載の方法。
【請求項１２】前記キメラ界面がさらに、少なくとも１つの多層により製
造された間質医用材料を含む請求項１０または請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】前記間質医用材料が通常形態を有する細胞を含む請求項１
２に記載の方法。
【請求項１４】さらに第一と第二の多層との間に因子を積層することを含
み、前記因子が栄養素、成長因子、サイトカイン、細胞外基質成分、分化のイン
デューサ、分泌物、免疫調節物質、細胞ネットワークまたは神経線維の成長を増
加または認める生物学的活性化合物から成る群から選択される請求項１０に記載
の方法。
【請求項１５】器官が心臓、腎臓、肝臓、膵臓、脾臓、膀胱、尿管および
尿道から成る群から選択される請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】人工器官が心臓、腎臓、肝臓、膵臓、脾臓、膀胱、尿管お
よび尿道から成る群から選択される器官の一部である請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】生体適合性基質がポリマーである請求項１０に記載の方法
。
【請求項１８】生体適合性基質が脱細胞化器官である請求項１０に記載の
方法。
【請求項１９】脱細胞化器官が心臓、腎臓、肝臓、膵臓、脾臓、膀胱、尿
管および尿道から成る群から選択される請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】脱細胞化器官が心臓、腎臓、肝臓、膵臓、脾臓、膀胱、尿
管および尿道から成る群から選択される脱細胞化器官の一部である請求項１８に
記載の方法。
【請求項２１】人工膀胱構造体の製造方法であって、膀胱の形状の生体適合性基質を用意し；平滑筋細胞集団を含む第一の培養した多層を前記基質のある領域に作製し、前
記第一の多層は前記生体適合性基質に付着し；尿路上皮細胞集団を含む第二の培養した多層を作製し、移植した際に、構造体
が天然膀胱の機能的等価物を提供するように前記第二の多層がキメラ界面により
前記第一の多層と結合することによって人工膀胱構造体を製造する；ことを含む人工膀胱構造体の製造方法。
【請求項２２】前記キメラ界面がさらに、少なくとも１つの多層により製
造された間質粘膜下層を含む請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】生体適合性基質がポリマーである請求項２１に記載の方法
。
【請求項２４】生体適合性基質が脱細胞化膀胱である請求項２１に記載の
方法。
【請求項２５】生体適合性基質が脱細胞化膀胱の一部である請求項２１に
記載の方法。
【請求項２６】泌尿生殖器障害を有する被験者の治療方法であって、平滑筋細胞集団から誘導した細胞の第一の培養した多層および尿路上皮細胞集
団から誘導した第二の培養した多層であって、前記第二の多層がキメラ界面によ
り前記第一の多層と結合された第二の培養した多層を含む人工器官構造体を用意
し、前記構造体が天然構造体と等価物を提供するように前記器官を被験者に移植し
、そして泌尿生殖器障害の変化について被験者を監視することを含む泌尿生殖器障害を有する被験者の治療方法。
【請求項２７】前記キメラ界面がさらに、少なくとも１つの多層により製
造された間質粘膜下層を含む請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】生体適合性基質がポリマーである請求項２８に記載の方法
。
【請求項２９】生体適合性基質が脱細胞化器官である請求項２６に記載の
方法。
【請求項３０】脱細胞化器官が膀胱、尿管および尿道から成る群から選択
される請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】脱細胞化器官が膀胱、尿管および尿道から成る群から選択
される脱細胞化器官の一部である請求項２９に記載の方法。