ES2306841T3 - Protesis para injertos con base de colageno. - Google Patents

Abstract

Una prótesis para injertos que comprende: una estructura de matriz con base de colágeno purificada, retirada de una fuente de tejido de submucosa, teniendo dicha estructura purificada un nivel de contaminantes que hace que dicha estructura purificada sea biocompatible y teniendo además dicha estructura purificada un nivel de endotoxinas menor que 12 unidades de endotoxinas por gramo.

Description

Prótesis para injertos con base de colágeno.

Campo técnico

Esta invención se relaciona de modo general con una estructura médica y en particular, con una prótesis para injertos y con los materiales para ello.

Antecedentes de la invención

Los implantes de tejidos en una forma purificada y derivados de materiales con base de colágeno se han fabricado y descrito en la literatura. Se han fabricado películas cohesivas de elevada resistencia a la tensión utilizando moléculas de colágeno o materiales con base de colágeno. Los aldehídos, sin embargo, se han utilizado generalmente para enlazar las moléculas de colágeno y obtener películas con elevadas resistencias a la tensión. Con estos tipos de materiales, los aldehídos pueden ser extraídos de la película, por ejemplo, por hidrólisis. Debido a que tales residuos son citotóxicos, las películas no son buenos implantes de tejidos.

Se han desarrollado otras técnicas para producir implantes de tejidos con base de colágeno al mismo tiempo que se evitan los problemas asociados con las moléculas de colágeno reticuladas con aldehídos. Una técnica de ese tipo se describe en la Patente U.S. 5,141,747, en la cual las moléculas de colágeno son reticuladas o acopladas por sus grupos épsilon amino de la lisina, seguido por la desnaturalización de las moléculas de colágeno acopladas, y preferiblemente modificadas. La descripción de tal material de colágeno es para la reparación de la membrana timpánica. Aunque se describe que tales membranas exhiben buenas propiedades físicas y que se esterilizan por un procesamiento subsiguiente, no son capaces de la remodelación o de la generación del crecimiento de las células o, en general, de estimular el recrecimiento y cicatrización de las estructuras de tejidos dañadas o enfermas.

En general, los investigadores de las técnicas quirúrgicas han estado trabajando durante muchos años para desarrollar técnicas y materiales nuevos para utilizarlos como implantes e injertos para sustituir o reparar estructuras de tejidos dañadas o enfermas, por ejemplo, vasos sanguíneos, músculos, ligamentos, tendones, etc. En la actualidad no es raro, por ejemplo, que un cirujano ortopédico cultive un tendón patelar de origen autógeno o alógeno para utilizarlo como sustituto de un ligamento cruzado desgarrado. Los métodos quirúrgicos de esas técnicas son conocidos. Además, ha sido común que los cirujanos utilicen prótesis implantables formadas a partir de materiales plásticos, metálicos y/o cerámicos para la reconstrucción o sustitución de estructuras fisiológicas. No obstante, a pesar de su amplio uso, las prótesis implantadas quirúrgicamente conllevan muchos riesgos para el paciente.

Los investigadores también han estado intentando desarrollar materiales poliméricos o plásticos satisfactorios que sirvan como tales estructuras de tejidos funcionales y/u otros tejidos conjuntivos, por ejemplo, los involucrados en lesiones de hernia y dislocación de articulaciones. Se ha descubierto que es difícil obtener un material plástico fuerte y duradero que sea adecuado para la sustitución de un tejido conjuntivo durante mucho tiempo. Los tejidos que circundan el material plástico pueden infectarse y las dificultades del tratamiento de tales infecciones conducen frecuentemente a la falla del implante o prótesis.

Como se mencionó anteriormente, varios materiales con base de colágeno se han utilizado también para las sustituciones de tejidos citadas antes; sin embargo estos materiales, o no cumplían con el requisito de la resistencia a la tensión, o tenían también problemas con infecciones y otras respuestas inmunogénicas, encapsulación, o tenían otros problemas cuando se cargaban con antibióticos, factores de crecimiento, etc. Por ejemplo, la Patente U.S. 4,956,178 describe una matriz submucosa de colágeno obtenida a partir del tracto intestinal de mamíferos; sin embargo, se describe que la matriz de colágeno se carga con antibióticos. En una Patente relacionada, la U.S. 5,372,821, se describe que una matriz submucosa de colágeno puede esterilizarse mediante técnicas convencionales, por ejemplo, curtido con aldehído, óxido de propileno, radiaciones gamma y ácido peracético. No se describen pasos de procesamiento específicos, excepto que la capa submucosa se deslamina del tejido circundante antes de proceder al tratamiento de esterilización.

Por lo tanto, existe la necesidad de obtener formas purificadas mejoradas de matrices con base de colágeno a partir de fuentes de tejidos de las mismas. La presente invención está dirigida a esa necesidad.

Sumario de la invención

De acuerdo con una realización preferida de la presente invención, se proporciona una prótesis para injertos, que incluye una estructura de matriz purificada con base de colágeno extraída de una fuente de tejido de submucosa, donde la estructura purificada tiene un nivel de contaminantes que hace que dicha estructura purificada sea biocompatible, y en la cual la estructura purificada tiene un nivel de endotoxinas menor que 12 unidades de endotoxinas por gramo.

Otra realización preferida de la invención proporciona una prótesis para injertos que incluye una estructura purificada de matriz con base de colágeno retirada de una fuente de tejido de submucosa, donde la estructura purificada tiene un nivel de contenido de ácido nucleico menor que 2 microgramos por miligramo y un nivel de endotoxinas menor que 12 unidades de endotoxinas por gramo.

Otra realización preferida de la invención proporciona una prótesis para injertos que incluye una estructura purificada de matriz con base de colágeno retirada de una fuente de tejido de submucosa, donde la estructura purificada tiene un nivel de virus menor que 500 unidades formadoras de placa (PFU) por gramo y un nivel de endotoxinas menor que 12 unidades de endotoxinas por gramo.

La presente invención proporciona también una prótesis para injertos que incluye una estructura purificada de matriz con base de colágeno retirada de una fuente de tejido de submucosa, donde la estructura purificada tiene un nivel de agente de procesamiento menor que 100,000 partes por millón por kilogramo y un nivel de endotoxinas menor que 12 unidades de endotoxinas por gramo.

La presente invención tiene que ver también con una composición, la cual incluye una estructura que contiene colágeno retirada de una fuente de tejido que contenía inicialmente la estructura y otros tejidos, donde la estructura que contiene colágeno tiene un nivel de endotoxinas no mayor de 12 unidades de endotoxinas por gramo.

La presente invención proporciona también una matriz purificada que contiene colágeno obtenida de una fuente de tejidos de un mamífero, incluyendo la matriz la tela submucosa del mamífero y que se puede obtener mediante un proceso, el cual incluye la desinfección de la fuente de tejidos de un mamífero, teniendo dicha matriz que contiene colágeno un nivel de endotoxinas menor que 12 unidades de endotoxinas por gramo.

En aspectos preferidos, la invención proporciona formas purificadas de matrices con colágeno de tela submucosa derivadas del tracto alimentario, respiratorio, urinario o genital de animales, teniendo las matrices un nivel de biocarga sustancialmente igual a cero, y/o estando sustancialmente libres de pirógenos. Una matriz de colágeno preferida se puede implantar dentro de un paciente humano o animal sin causar en la mayoría de los casos una respuesta citotóxica, infección, rechazo del implante o cualquier otro efecto dañino. Aunque una matriz de colágeno preferida implantable de acuerdo con algunos aspectos de la presente invención comprende principalmente tela submucosa, la matriz de colágeno en este caso puede también comprender capas parciales de laminar muscularis mucosa, muscularis mucosa, lamina propria, una capa de stratum compactum y/u otros materiales de tejidos, dependiendo de la fuente de donde se extrajo.

Además, en concordancia con la presente invención, se proporciona una matriz de colágeno de tela submucosa deslaminada y purificada, obtenida del tracto alimentario, respiratorio, urinario o genital de animales o humanos, donde dicha matriz submucosa de colágeno purificada se produce mediante la separación de una lámina de una fuente de tela submucosa desinfectada para obtener la lámina de matriz de colágeno de tela submucosa. Se puede obtener una matriz ventajosa, por ejemplo, mediante un proceso que comprende el tratamiento de una fuente de tela submucosa no deslaminada cultivada a partir del tracto alimentario, respiratorio, urinario o genital de animales con un agente desinfectante, seguido de la deslaminación de una matriz de colágeno de tela submucosa de los tejidos adyacentes. La matriz de colágeno preferida tiene un nivel de biocarga sustancialmente igual a cero y se puede implantar dentro de un paciente humano o animal sin causar en la mayoría de los casos una respuesta citotóxica, infección, rechazo del implante o cualquier otro efecto dañino.

Adicionalmente, en concordancia con la presente invención, se proporciona una matriz de colágeno de tela submucosa de alta pureza extraída del tracto alimentario, respiratorio, urinario o genital de animales, que tiene una biocarga sustancialmente igual a cero, y en la cual dicha matriz de colágeno de tela submucosa no tiene un contenido sustancial de residuos superficiales, por ejemplo, incluyendo un contenido no sustancial de tejido muscular, capas de mucosa, lípidos o residuos celulares. La matriz de colágeno preferida se puede implantar dentro de un paciente humano o animal sin causar una respuesta citotóxica, infección, rechazo del implante o cualquier otro efecto dañino a dicho paciente.

Adicionalmente, en concordancia con la presente invención, se proporciona una tela submucosa de alta pureza extraída del tracto alimentario, respiratorio, urinario o genital de animales y en la cual la tela submucosa se deslamina en condiciones sustancialmente estériles comprendiendo factores de crecimiento, y se produce enjuagando la fuente de tela submucosa en forma de lámina con un solvente, por ejemplo agua, seguido de un tratamiento con un agente desinfectante, preferiblemente un perácido, con un pH de alrededor de 1.5 a 10, seguido por la separación de la lámina de la tela submucosa de los tejidos adyacentes. El perácido se reduce a niveles de pH mayores que 7. Es deseable que las matrices de colágeno producidas de esta manera tengan un contenido sustancialmente alto de uno o más factores de crecimiento.

Adicionalmente, de acuerdo con la presente invención, se proporciona una composición de injerto de tejidos, que incluye una matriz de colágeno de tela submucosa esencialmente libre de pirógenos. Es preferible que tales composiciones incluyan una matriz de colágeno de tela submucosa que tenga un contenido de pirógenos de alrededor de 1 unidad de endotoxina por gramo (EU/g) o menos.

Más aún, de acuerdo con la presente invención, una tela submucosa de alta pureza como la descrita anteriormente, demostrará una angiogénesis activa in vivo al implantarse en un paciente humano o animal.

Esta invención se relaciona con construcciones de tejido implantables y purificadas, y su empleo para promover el recrecimiento y la cicatrización de estructuras de tejido dañadas o enfermas. Más particularmente, la invención está dirigida hacia formas purificadas de matrices de colágeno de tela submucosa adecuadas para su empleo como tejido implantable.

Estos y otros aspectos de la presente invención se harán obvios para aquellos que sean conocedores de este arte cuando revisen la descripción que sigue.

Breve descripción del dibujo

La Fig.1 proporciona una vista en perspectiva de una estructura tubular de prótesis para injertos de acuerdo con la invención.

Descripción detallada

Con el propósito de promover una comprensión de los principios de la invención, ahora se hará referencia a ciertas realizaciones preferidas de la misma, y se utilizará un lenguaje específico para describirlas. Se comprenderá no obstante que no se pretende establecer mediante ellas limitaciones al alcance de la invención. Se considera la posibilidad de que tales alteraciones, modificaciones y aplicaciones adicionales de los principios de la invención, según se describen aquí, pudieran ocurrir normalmente con alguien que tenga habilidades con el arte con el cual se relaciona la invención.

En esta discusión se utilizan varios términos. Para facilitar una comprensión clara y coherente de la descripción y de las reivindicaciones, se proporcionan las siguientes definiciones.

Biocarga: se refiere a la cantidad de microorganismos vivientes, expresada en unidades formadoras de colonias (CFU), encontrados sobre y/o en una cantidad dada de material. A modo de ilustración, los microorganismos incluyen bacterias, hongos y sus esporas.

Desinfección: se refiere a una reducción en la biocarga de un material.

Estéril: se refiere a una condición en la cual un material tiene una biocarga tal que la probabilidad de tener un microorganismo viviente (CFU) sobre y/o en una sección dada del material es de uno en un millón o menos.

Pirógena: se refiere a una sustancia que produce una respuesta febril después de su introducción en un huésped.

Endotoxina: se refiere a un pirógeno en particular, el cual es parte de las paredes de las células de las bacterias gram-negativas. Las endotoxinas son liberadas continuamente de las bacterias y contaminan los materiales.

Purificación: se refiere al tratamiento de un material para eliminar uno o más contaminantes que se encuentren en el material, por ejemplo, contaminantes que existan en el material en estado natural y/o microorganismos o componentes del mismo que se encuentren en el. A modo de ilustración, los contaminantes pueden ser aquellos que se sabe causan toxicidad, infecciones, pirogenicidad, irritación potencial, reactividad, actividad hemolítica, carcinogenicidad y/o inmunogenicidad.

Biocompatibilidad: se refiere a la capacidad de un material de pasar las pruebas de biocompatibilidad establecidas por la Organización Internacional de Normalización (ISO), Norma No. 10993 y/o la U.S. Pharmacopeia (USP) 23 y/o el memorando No. G95-1 de la Administración de Alimentos y Fármacos (FDA) de los Estados Unidos, titulado "Use of International Standard ISO-10993, Biological Evaluation of Medical Devices Part-1: Evaluation and Testing.". Típicamente estas pruebas hacen ensayos de los materiales con respecto a la toxicidad, la infectividad, la pirogenicidad, la irritación potencial, la reactividad, la actividad hemolítica, la carcinogenicidad y/o la inmunogenicidad. Una estructura o material biocompatible, cuando se introduce en la mayoría de los pacientes, no causará una reacción o respuesta adversa. Además, se considera la posibilidad de que la biocompatibilidad pueda afectarse por otros contaminantes tales como priones, sustancias tensoactivas, oligonucleótidos y otros agentes o contaminantes que afecten la biocompatibilidad.

Contaminante: se refiere a una sustancia no deseada que esté sobre un material, dentro de el o unido al mismo. Esto incluye, pero no está limitado a ellos: biocarga, endotoxinas, agentes de procesamiento tales como agentes antimicrobianos, sangre, componentes de la sangre, virus, ADN, ARN, esporas, fragmentos de capas de tejido indeseados, residuos celulares y mucosa.

Tela submucosa: se refiere a una capa de tejido conjuntivo con contenido de colágeno que se encuentra bajo la mucosa en la mayor parte de los tractos alimenticio, respiratorio, urinario y genital de los animales.

Como se describió anteriormente, la presente invención proporciona generalmente prótesis y materiales de injerto incluyendo una estructura de matriz purificada de base de colágeno. Se obtienen prótesis ventajosas de injerto de acuerdo con la invención a partir de una fuente de tejido de submucosa, por ejemplo, incluyendo tejidos animales tales como tejidos humanos o de otros mamíferos, como porcinos, bovinos u ovinos.

La tela submucosa, como ocurre con muchos tejidos animales, es generalmente aséptica en su estado natural, siempre que el humano o el animal no tengan una infección o enfermedad.

Este es particularmente el caso puesto que la tela submucosa es una capa interna que está dentro de los tractos alimentario, respiratorio, urinario y genital de los animales. De acuerdo con esto, generalmente no está expuesta a las bacterias y otros residuos celulares como ocurre con el epitelio del tracto intestinal. Una característica de la presente invención es el descubrimiento de que desinfectando el tejido fuente de la tela submucosa antes de deslaminarlo, el estado aséptico de la capa de tela submucosa puede preservarse o preservarse sustancialmente, particularmente si el proceso de separación de la lámina ocurre bajo condiciones estériles.

En particular, se ha descubierto que la desinfección de la fuente de la tela submucosa, seguida de la remoción de una matriz purificada que incluya la tela submucosa, por ejemplo, mediante la deslaminación de la tela submucosa de la tunica muscularis y de la tunica mucosa, minimiza la exposición de la tela submucosa a las bacterias y a otros contaminantes. A su vez, esto permite minimizar la exposición de la matriz de tela submucosa aislada a los desinfectantes o esterilizadores si se desea, preservando así sustancialmente la bioquímica inherente de la tela submucosa y muchos de los efectos beneficiosos de la misma.

Una matriz de colágeno implantable de tela submucosa, de acuerdo con la presente invención puede, como se indicó anteriormente, obtenerse a partir del tracto alimentario, respiratorio, urinario o genital de animales. Preferiblemente, los tejidos de tela submucosa, los cuales son a base de colágeno y así predominantemente Colágeno, se derivan del tracto alimentario de mamíferos, y mejor aún del tracto intestinal de los cerdos. La fuente más preferida de intestino delgado entero se cultiva a partir de cerdos adultos que pesen más de 450 libras aproximadamente. Los intestinos cultivados a partir de animales saludables contendrán vasos sanguíneos y suministro de sangre dentro del tracto intestinal, así como varios microbios, tales como E. coli contenidos dentro del lúmen intestinal. Por lo tanto, la desinfección de todo el intestino antes de la deslaminación de la tela submucosa elimina sustancialmente estos contaminantes y proporciona un tejido de tela submucosa implantable preferido, el cual está sustancialmente libre de sangre y de componentes de la sangre, así como de cualesquiera otros organismos microbianos, pirógenos u otros agentes patógenos que pudieran estar presentes. En efecto, se cree que este procedimiento preserva sustancialmente el estado inherentemente aséptico de la tela submucosa, aunque debe comprenderse que no se pretende que la presente invención sea limitada por cualquier teoría.

Es también deseable que la matriz de colágeno de acuerdo con la presente invención esté sustancialmente libre de cualesquiera antibióticos, agentes antivirales o de cualesquiera agentes del tipo antimicrobiano, los cuales pueden afectar la bioquímica inherente de la matriz y su eficacia en la implantación. En el pasado un método de tratamiento de tal material de tejido era enjuagarlo, ya deslaminado, en una solución salina y remojarlo en un agente antimicrobiano, por ejemplo, según se describe en la Patente U.S. No. 4,956,178. Aunque dichas técnicas pueden practicarse opcionalmente con la submucosa aislada de la presente invención, los procesos preferidos, descritos en la solicitud de origen EP 97 954 888 de la presente invención, evitan el uso de agentes antimicrobianos y similares, los cuales pueden no sólo afectar la bioquímica de la matriz de colágeno sino también que pueden introducirse innecesariamente en los tejidos del paciente.

Como se discutió anteriormente, se ha descubierto que se puede obtener una forma de matriz de colágeno de tela submucosa implantable de elevada pureza desinfectando primero una fuente de tela submucosa antes de extraer una matriz de colágeno purificada incluyendo la capa de tela submucosa, por ejemplo, deslaminando la fuente de la tela submucosa. También se ha descubierto que se obtienen mediante este procedimiento ciertas ventajas de procesamiento, así como el mejoramiento de las propiedades de la tela submucosa resultante, incluyendo una mayor facilidad en la eliminación de los tejidos adyacentes de la capa submucosa y, como una característica, un perfil de baja contaminación.

Los procesos para la preparación de la matriz con base de colágeno purificada de la invención son el objeto de la solicitud de patente No. 97 954 888 y se describen a continuación solamente con fines de información. Es deseable que los procesos involucren primero el enjuague de la fuente de tela submucosa una o más veces con un solvente, convenientemente con agua. El paso de enjuague es seguido por el tratamiento con un agente desinfectante. Es deseable que el agente desinfectante sea un agente oxidante. Los agentes desinfectantes preferidos son los compuestos de peróxido, preferiblemente los compuestos orgánicos de peróxido y, más preferiblemente los perácidos. Es deseable que tales agentes desinfectantes se usen en un medio líquido, preferiblemente una solución, que tenga un pH de alrededor de 1.5 a alrededor de 10, más preferiblemente un pH de alrededor de 2 a alrededor de 6, y lo más preferido un pH de alrededor de 2 a alrededor de 4. En los métodos de la presente invención, el agente desinfectante se utilizará generalmente bajo condiciones y por un período de tiempo que proporcionen la recuperación de las matrices de submucosa purificadas descritas aquí, exhibiendo preferiblemente una biocarga esencialmente igual a cero y/o estando esencialmente libres de pirógenos. En este sentido, los procesos deseables de la invención incluyen la inmersión de la fuente de tejido (sumergiéndola o mediante la aspersión) en un medio líquido que contenga el agente desinfectante por un período de al menos de alrededor de 5 minutos, típicamente en el rango de alrededor de 5 minutos a alrededor de 40 horas, y más típicamente en el rango de alrededor de 0.5 horas a alrededor de 5 horas.

Un agente desinfectante preferido de peróxido es el peróxido de hidrógeno. La concentración de peróxido de hidrógeno puede variar desde alrededor del 0.05% hasta el 30% en volumen. Más preferiblemente, la concentración de peróxido de hidrógeno está desde alrededor del 1% al 10% en volumen y lo más preferido desde alrededor del 2% al 5% en volumen. La solución puede estar o no reducida hasta un pH desde alrededor de 5 a 9. Más preferiblemente el pH está desde alrededor de 6 a 7. Estas concentraciones pueden diluirse en agua o en una solución acuosa de alcohol de alrededor del 2% a alrededor del 30% en volumen. Lo más preferido es que sea etanol. La temperatura de la solución puede variar desde alrededor de 15ºC a 50ºC. Más preferiblemente, la temperatura de la solución está desde alrededor de 20 a 40ºC. Lo más preferido es que la temperatura de la solución esté desde alrededor de 32 a 37ºC. El tiempo de exposición puede variar desde alrededor de 10 a 400 minutos. Preferiblemente, el tiempo de exposición es desde alrededor de 120 a 240 minutos. Más preferiblemente, el tiempo de exposición está desde alrededor de 180 a 210 minutos.

Un agente desinfectante orgánico de peróxido preferido es el ácido perpropiónico. La concentración de ácido perpropiónico puede variar desde alrededor del 0.1% al 10% en volumen. Más preferiblemente, la concentración de ácido perpropiónico es de alrededor del 0.1% al 1.0% en volumen y lo más preferido desde alrededor del 0.2% al 0.5% en volumen. Estas concentraciones de ácido perpropiónico pueden diluirse en agua o en una solución acuosa de alcohol de alrededor del 2% a alrededor del 30% en volumen. Lo más preferido es que el alcohol sea etanol. La fuente de tejido de tela submucosa puede exponerse a la solución orgánica de peróxido por períodos desde alrededor de 15 minutos a alrededor de 40 horas, y más típicamente en el rango de alrededor de 0.5 horas a alrededor de 8 horas, aproximadamente. Otros agentes desinfectantes de peróxido son adecuados para este uso, como se describe en "Peroxygen Compounds", S. Block, en Disinfection, Sterilization and Preservation, S. Block, Editor, 4ta Edición, Filadelfia, Lea y Febiger, pp. 167-181, 1991; y "Disinfection with peroxygens". M.G.C. Baldry y J.A.L. Fraser, en Industrial Biocides, K. Payne, Editor, Nueva York, John Wiley and Sons, pp. 91-116, 1988.

Otro agente desinfectante oxidante es la clorhexidina (1,6-di(4-clorofenildiguanido)hexano) en su forma de digluconato. La concentración del digluconato de clorhexidina puede variar desde alrededor del 0.1% al 15% en peso. Más preferiblemente, la concentración de digluconato de clorhexidina está desde alrededor del 0.1% al 2% en peso y lo más preferido desde alrededor del 0.2% al 5% en peso. La solución puede estar o no reducida hasta un pH desde alrededor de 5 a 8. Más preferiblemente el pH debe está desde alrededor de 5.5 a 7. Estas concentraciones pueden diluirse en agua o en una solución acuosa de alcohol de alrededor del 2% a alrededor del 20% en volumen. Lo más preferido es que el alcohol sea etanol a una concentración de alrededor del 5% al 10%. La temperatura de la solución puede variar desde alrededor de 15 a 30ºC. El tiempo de exposición puede variar desde alrededor de 10 a 400 minutos. Más preferiblemente, el tiempo de exposición es desde alrededor de 30 a 60 minutos. Otros agentes de cloro se describen en "Clorhexidine", G. W. Denton, en Disinfection, Sterilization and Preservation, S. Block, Editor, 4ta Edición, Filadelfia, Lea y Febiger, pp. 274-289, 1991.

En procesos preferidos de preparación, un perácido u otro agente desinfectante puede disolverse en una solución acuosa de alcohol, preferiblemente en la cual el alcohol tenga desde 1 hasta alrededor de 6 átomos de carbono, y en la cual el alcohol puede comprender generalmente desde alrededor del 1% a alrededor del 30% de la solución en volumen. Los alcoholes más preferidos para su uso en la invención se seleccionan de entre el grupo consistente en etanol, propanoles y butanoles. El etanol es el alcohol más preferido para estos propósitos.

Cuando se utiliza un perácido en la desinfección, es preferible seleccionarlo de entre el grupo consistente en ácido peracético, ácido perpropiónico o ácido perbenzóico. El ácido peracético es el agente desinfectante más preferido. Se diluye preferiblemente en alrededor de un 2% a alrededor de un 10% en volumen. La concentración del ácido peracético puede variar, por ejemplo, desde alrededor del 1.0% en volumen a alrededor del 0.5% en volumen. Lo más preferido es que la concentración del ácido peracético esté desde alrededor del 0.1% a alrededor del 0.3% en volumen. El peróxido de hidrógeno puede usarse también como un agente desinfectante. Alternativamente, o adicionalmente, la fuente de tejido de tela submucosa, tal como el intestino delgado, puede desinfectarse utilizando agentes desinfectantes tales como el glutaraldehído, la formalina y sustancias similares, de las cuales se conoce su capacidad para introducir la reticulación sustancial en las matrices de colágeno, en contraste con la acción de otros agentes desinfectantes tales como los perácidos, los cuales pueden utilizarse para desinfectar sin introducir tal reticulación. Adicionalmente, la fuente de tela submucosa puede tratarse con radiaciones, por ejemplo, radiaciones gamma, con fines de desinfección.

Las variaciones del proceso de desinfección pueden incluir también lo siguiente:

1. El intestino se trata con una solución del 0.2% de ácido peracético y 5% de etanol con una relación entre la solución y el intestino de 10:1 en peso. La solución tiene un pH de 2.6. La solución y el intestino se mezclan vigorosamente durante dos horas.

2. El intestino se trata con una solución del 1% de ácido peracético y 25% de etanol con una relación entre la solución y el intestino de 5:1: en peso. La solución tiene un pH de 2. La solución y el intestino se mezclan vigorosamente durante una hora.

3. El intestino se trata con una solución del 1% de ácido peracético, el 15% de etanol y el 10% de peróxido de hidrógeno con una relación entre la solución y el intestino de 5:1 en peso. La solución y el intestino se mezclan vigorosamente durante una hora.

4. Todo el intestino delgado se enjuaga cuatro veces con agua de elevada pureza durante 15 minutos. A continuación el intestino se somete a la radiación de un Haz de Electrones de 1.5 MRAD.

5. Todo el intestino delgado se enjuaga cuatro veces con agua de elevada pureza durante 15 minutos. El intestino se somete a una luz pulsante de alta intensidad a lo largo de una cinta transportadora, lo cual lo desinfecta.

Siguiendo al tratamiento, como se describe en la solicitud de patente EP 97 954 888, la capa de tela submucosa se deslamina de su fuente, tal como el intestino entero, el útero vacuno, etc. Se ha encontrado que, siguiendo este procedimiento de denudación posdesinfección, es más fácil separar la capa de tela submucosa de los tejidos adyacentes, por ejemplo, al menos del tejido de tunica muscularis adyacente, si se compara con el procedimiento de separación de la capa de tela submucosa antes de la desinfección. Además, se ha descubierto que la capa de tela submucosa resultante en su forma más preferida exhibe una histología superior, donde hay menos tejidos y residuos adheridos a la superficie si se compara con una capa de tela submucosa obtenida al deslaminarla primero de su fuente y después desinfectarla. Además, mediante este proceso se obtiene un tejido de tela submucosa más uniforme, y en cada ejecución independiente del proceso se puede obtener consistentemente una tela submucosa con las mismas o similares propiedades físicas y bioquímicas. Muy importante, mediante este proceso se puede obtener una tela submucosa altamente purificada y sustancialmente estéril.

La denudación de la fuente de tela submucosa se lleva a cabo preferiblemente utilizando una máquina de embutir desinfectada o estéril, para producir una tela submucosa que sea sustancialmente estéril y que haya sido sometida a un procesamiento mínimo. Una máquina de embutir adecuada es el Modelo 3-U-400 Stridhs Universal Machine para hacer embutidos de cerdo, disponible comercialmente en AB Stridhs Maskiner, Götoborg, Suecia. Por lo tanto, los niveles medidos de biocarga son mínimos o sustancialmente iguales a cero. Por supuesto, se pueden emplear otros medios para deslaminar la fuente de tela submucosa, incluyendo, por ejemplo, la separación a mano.

También se ha descubierto que los procesos más preferidos, descritos en la solicitud de origen EP 97 954 888 de la presente solicitud, no solamente eliminarán o reducirán significativamente los contaminantes contenidos en la matriz de colágeno de tela submucosa, sino que también producirán un tejido que no exhibirá una degradación sustancial de las propiedades físicas y mecánicas, como por ejemplo, la porosidad diferencial (es decir, en la cual un lado de la capa submucosa tenga mayor porosidad que el otro lado) y una buena resistencia, por ejemplo, resistencia a la ruptura. También se ha descubierto que los procesos más preferidos no afectan la porosidad diferencial de la matriz de colágeno de tela submucosa la cual, en última instancia, afecta el nivel de eficacia de este implante de tejidos. Por ejemplo, el tejido no se trata necesariamente con un agente de reticulación o con un material que perturbe la porosidad o la estructura inherente o nativa de la matriz de colágeno. Además, cuando se emplea el peróxido de hidrógeno, la matriz tiene una mayor porosidad en conjunto, así como un mayor contenido de oxígeno. Esto ayuda a garantizar la ausencia de contaminantes tales como endotoxinas, pirógenos, etc.

También, en una forma ventajosa, las matrices con base de colágeno de la presente invención (incluyendo la tela submucosa) demuestran la capacidad de inducir una angiogénesis activa, es decir, un crecimiento hacia adentro de vasos sanguíneos dentro de la matriz del tejido. En este aspecto, estas matrices preferidas de la invención contendrán componentes beneficiosos que se encuentran de modo natural en las matrices, incluyendo, por ejemplo, una o más glicosaminoglicanos, glicoproteínas, proteoglicanos, y/o factores de crecimiento (tales como el Factor de Crecimiento-6 Transformante y/o Factor de Crecimiento 2 de Fibroblastos (básico)).

Las matrices con base de colágeno de la invención, preferiblemente matrices que contengan submucosa, se caracterizan también por los bajos niveles de contaminantes presentados en la Tabla 1 que aparece a continuación, tomado cada nivel de contaminante de modo individual o en cualquier combinación de alguno o con todos los otros niveles de contaminantes descritos. Las abreviaturas de la Tabla 1 son las siguientes: CFU/g = unidades formadoras de colonias por gramo; PFU/g = unidades formadoras de placas por gramo; \mug/mg = microgramos por miligramo; ppm/kg = partes por millón por kilogramo.

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Las matrices con base de colágeno aún más preferidas de la invención, contienen un nivel de endotoxinas menor que 1 EU/g, y lo más preferido, menor que 0.5 EU/g.

Las matrices con base de colágeno de acuerdo con la presente invención pueden procesarse de varias formas para proporcionar matrices colagenosas útiles tanto in vitro como in vivo. Por ejemplo, la submucosa puede configurarse para proporcionar injertos de tejidos útiles en aplicaciones vasculares, tales como las descritas de modo general en las Patentes U.S. 2,127,903 y U.S. 4,902,508. Haciendo ahora referencia a la Figura 1, se trata de una estructura de prótesis para injertos 1 generalmente tubular en forma de chimenea, con o incluyendo la matriz con base de colágeno 12 para el empleo en un injerto vascular, aproximándose el diámetro de dicha estructura al del vaso sanguíneo receptor. En un modo, esto puede alcanzarse manipulando un segmento tubular o una lámina de la tela submucosa para definir un cilindro que tenga un diámetro "D" que sea aproximadamente el mismo que el del vaso sanguíneo receptor, y suturando, pegando o asegurando de otra forma la costura longitudinal 13 para formar un injerto vascular tubular debidamente dimensionado que tenga un lúmen 14 para el paso de la sangre. En los procedimientos de preparación ilustrativos, el injerto se forma sobre una varilla o mandril estéril que tenga un diámetro exterior aproximadamente igual al del vaso sanguíneo al cual se le va a colocar el injerto. Por ejemplo, la varilla se introduce en el lúmen de un segmento de tela submucosa que mantenga su forma tubular nativa. Entonces puede recolectarse el tejido redundante y alcanzar el diámetro deseado del lúmen mediante la sutura a lo largo del injerto (por ejemplo, utilizando dos líneas de sutura continua o una única línea de sutura interrumpida), o mediante el empleo de otras técnicas para asegurar tejidos reconocidas en el arte. Alternativamente, se enrolla una lámina de la tela submucosa de la invención alrededor de la varilla para formar una costura superpuesta, la cual puede suturarse, pegarse o asegurarse de otro modo, para proporcionar la construcción del injerto tubular. En formas preferidas, la superficie interior luminar del injerto puede formarse por el lado de la mucosa de la tela submucosa.

La tela submucosa de la invención posee propiedades mecánicas altamente deseables para los materiales utilizados en injertos de tejidos para aplicaciones vasculares, incluyendo un bajo índice de porosidad, elevada conformidad y alta resistencia a la ruptura. Una persona con habilidad en el arte apreciará que el material preferido para el injerto de tejidos tendrá una porosidad lo suficientemente baja como para evitar una hemorragia intraoperativa pero lo suficientemente elevada como para permitir la extensión del vasa vasorum de nuevo desarrollo a través del material de injerto para alimentar la neoíntima y la superficie luminal.

El tejido de tela submucosa de la presente invención puede también procesarse para proporcionar composiciones fluidizadas, por ejemplo, utilizando técnicas como las descritas en la patente U.S. 5,275,826. En este sentido, pueden prepararse soluciones o suspensiones de la tela submucosa mediante el desmenuzamiento y/o digestión de la tela submucosa con una proteasa (tales como la tripsina o la pepsina) por un período de tiempo suficiente para solubilizar el tejido y formar una solución sustancialmente homogénea. El material de submucosa de partida se desmenuza preferiblemente mediante el desprendimiento, el corte, la moledura, el cizallamiento, etc. La moledura de la submucosa en estado de congelación o de liofilización es ventajosa, aunque se pueden obtener buenos resultados igualmente sometiendo una suspensión de fragmentos de la submucosa al tratamiento con una licuadora de alta velocidad y extrayendo el agua, si es necesario, mediante la centrifugación y decantando el exceso de residuos. La tela submucosa puede secarse, por ejemplo, liofilizarse, para formar un polvo. Después, si se desea, el polvo puede hidratarse, es decir, combinarse con agua, con solución salina reducida y opcionalmente con otros excipientes farmacéuticamente aceptables, para formar una composición fluida de injerto de tejidos, por ejemplo, con una viscosidad de alrededor de 2 a 300,000 cps a 25 EC. Las composiciones de injertos de viscosidades más elevadas pueden tener una consistencia de gel o de pasta.

La tela submucosa fluidizada de esta invención encuentra uso en un heteroinjerto inyectable para tejidos, por ejemplo, huesos o tejidos blandos, ante la necesidad de reparar o aumentar, más frecuentemente corregir, defectos de los tejidos debidos a traumas o inducidos por enfermedades. Las composiciones fludizadas de submucosa presentes también se usan ventajosamente como relleno para construcciones implantadas que comprenden, por ejemplo, una o más láminas de tela submucosa formada en bolsas selladas (suturadas) para su empleo en cosmética o en procedimientos quirúrgicos para el tratamiento de traumas.

En una preparación ilustrativa, la tela submucosa preparada como se describe en este documento se reduce a pequeños pedazos (por ejemplo, cortándola) y estos pedazos se colocan en un recipiente de acero inoxidable de fondo plano. Se introduce nitrógeno líquido en el recipiente para congelar las muestras, las cuales entonces se desmenuzan mientras están en el estado de congelación para formar un polvo grueso de tela submucosa. Tal procesamiento puede efectuarse, por ejemplo, con una prensa de árbol manual que tenga una barra cilíndrica de latón colocada en la parte superior de las muestras congeladas. La barra sirve como una interfaz entre las muestras y el árbol de la prensa. Se puede añadir nitrógeno líquido periódicamente para que las muestras de tela submucosa se mantengan
congeladas.

Pueden utilizarse otros métodos para el desmenuzamiento de las muestras de tela submucosa para producir un polvo de tela submucosa utilizable de acuerdo con la presente invención. Por ejemplo, las muestras de tela submucosa pueden liofilizarse y después molerse utilizando una prensa de árbol manual u otros métodos de moledura. Alternativamente, la tela submucosa puede procesarse en una licuadora de alto cizallamiento para producir, al extraer el agua y secarse, un polvo de tela submucosa.

La moledura adicional de la tela submucosa utilizando una mano y un mortero enfriados previamente puede realizarse para obtener un producto consistente y más fino. De nuevo se utiliza nitrógeno líquido según sea necesario para mantener las partículas sólidas congeladas durante la moledura final. El polvo puede hidratarse fácilmente usando, por ejemplo, una solución salina reducida para producir un material de injerto de tejidos fluidizado de esta invención a la viscosidad deseada.

Para preparar otro material fluidizado preferido, puede tamizarse el polvo de tela submucosa a través de una malla de alambre, recolectarse y someterse a una digestión proteolítica para formar una solución sustancialmente homogénea. Por ejemplo, el polvo puede digerirse con 1 mg/ml de pepsina (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri) y 0.1 M de ácido acético, ajustada a un pH de 2.5 con HCl, por un período de 48 horas a temperatura ambiente. Después de este tratamiento, el medio reactivo puede neutralizarse con hidróxido de sodio para inhibir la actividad péptica. La submucosa solubilizada puede entonces concentrarse mediante precipitación salina de la solución y separarla para purificarla aún más y/o liofilizarla para formar una submucosa intestinal solubilizada proteásica en forma de polvo.

Las composiciones fluidizadas de tela submucosa de esta invención encuentran amplia aplicación en sustitución de tejidos, aumento y/o reparación. Las composiciones fludizadas de submucosa pueden utilizarse para inducir el recrecimiento del tejido conjuntivo natural o de los huesos en el área de un defecto existente. Mediante la inyección de una cantidad efectiva de una composición fluidizada de submucosa en el área local de un defecto de los tejidos o en una herida que necesite cicatrización, uno puede fácilmente sacar ventaja de las propiedades biotrópicas de la tela submucosa.

También es posible formar construcciones en áreas de gran superficie mediante la combinación de dos o más segmentos de tela submucosa de la invención, por ejemplo, utilizando técnicas como las descritas en la Patente U.S. 2,127,903 y/o la Publicación Internacional No. WO 96/32146, con fecha 17 de octubre de 1996, publicación de la Solicitud Internacional No. PCT/US96/04271, presentada el 5 de abril de 1996. Así, una pluralidad de cintas de tela submucosa pueden fundirse una en otra, por ejemplo, mediante la compresión de áreas superpuestas de las cintas bajo condiciones de deshidratación, para formar una construcción plana general que tenga un área superficial mayor que la de cualquier superficie plana de las cintas individuales utilizadas para formar la construcción.

La tela submucosa de la invención puede también emplearse para preparar construcciones de injerto de tejidos útiles en aplicaciones de tejidos blandos en ortopedia, por ejemplo en la reparación de tendones o ligamentos, empleando técnicas del arte las cuales se hayan aplicado a otros materiales de injerto naturales o sintéticos. Por ejemplo, las técnicas de reparación descritas de modo general en las Patentes U.S. 2,127,903 y U.S. 5,281,422 pueden acometerse utilizando tela submucosa de la presente invención.

Para aplicaciones de sustitución de tendones y ligamentos, se puede preacondicionar un segmento de tela submucosa mediante el alargamiento longitudinal hasta una longitud mayor. Por ejemplo, un segmento de tela submucosa puede acondicionarse mediante la aplicación prolongada de una carga según el eje longitudinal del segmento (por ejemplo, suspendiendo un peso del segmento) por un período de tiempo suficiente como para permitir una elongación del segmento de tejido de alrededor del 10% al 20%. El material de injerto puede también preacondicionarse estirándolo en la dimensión lateral. El segmento de tela submucosa puede entonces configurarse, solo o en combinación con otros segmentos, en una variedad de formas para servir como sustitución de tendones o ligamentos, o para sustituir o reparar un tendón o ligamento roto o severamente dañado.

Para tales aplicaciones de injertos de tejidos conjuntivos, es deseable que el segmento se configure en forma de capas o de multicapas, con al menos las porciones extremas opuestas y/o las porciones laterales opuestas conformadas en capas múltiples del material de injerto, para proporcionar un reforzamiento para la fijación a las estructuras fisiológicas tales como huesos, tendones, ligamentos, cartílagos y músculos. En una aplicación de sustitución de ligamentos, los extremos opuestos se unirán al primer y segundo huesos, respectivamente, estando los huesos típicamente articulados como es el caso de la articulación de la rodilla. En una aplicación de sustitución de tendones, un primer extremo de la construcción de injerto se unirá a un hueso, y un segundo extremo se unirá a un músculo.

Como se indicó anteriormente, en aplicaciones de tejidos conjuntivos será ventajoso formar, manipular o conformar las porciones extremas de la construcción de injerto para unirlas, por ejemplo, a una estructura ósea, de manera que se reducirá la posibilidad de desgarramiento del injerto en el punto de unión. Para estos propósitos el material de injerto de tela submucosa puede doblarse o everterse parcialmente para proporcionar capas múltiples para la fijación, por ejemplo, con arandelas con puntas o presillas. Alternativamente, un segmento de tela submucosa puede doblarse hacia atrás sobre sí mismo para unir las porciones de los extremos y proporcionar una primera porción de unión para la fijación, por ejemplo, a un primer hueso, y doblarla en la porción intermedia para proporcionar una segunda porción de unión para fijarla a un segundo hueso articulado con respecto al primer hueso.

Por ejemplo, una de las porciones extremas del injerto de tela submucosa puede acomodarse para tirar de ella a través de un túnel de, por ejemplo, el fémur y unirla a este, mientras que la otra de las porciones extremas puede acomodarse para tirar de ella a través de un túnel en la tibia y fijarla a ella para proporcionar un sustituto del ligamento cruzado natural, acomodándose el segmento para colocarse bajo tensión entre los túneles para proporcionar una función de ligamento, es decir, una función de tensión y posicionamiento proporcionada por un ligamento normal.

Debido a que los injertos utilizados en aplicaciones ortopédicas son colocados normalmente bajo tensión en su instalación quirúrgica, es preferible combinar dos o incluso más segmentos de tejido para proporcionar una construcción de injerto multicapa. Es otro objeto de la presente invención, por lo tanto, proporcionar injertos en los cuales estén dispuestos dos o más segmentos de submucosa de forma tal que tengan sus porciones extremas unidas, con estas porciones unidas y/o las porciones laterales acomodadas para unirlas a un hueso, tendón, ligamento u otra estructura fisiológica. Un método para proporcionar un doble segmento puede ser tirar de un segmento tubular por dentro de otro segmento para proporcionar un tubo de doble pared, los extremos unidos del cual pueden unirse, por ejemplo, a un hueso, a un tendón o a un ligamento. Estos dobles segmentos proporcionarán una mayor resistencia a la tensión, por lo que será menor la elongación de la tela submucosa sometida a una tensión determinada. En otras formas, pueden disponerse múltiples segmentos o cintas de tela submucosa en una configuración entrelazada, por ejemplo, en forma de diamante, de fajín o de malla, incluyendo múltiples lazos interconectados con lazos vecinos, lo cual es muy útil en la reparación de tendones o ligamentos.

La tela submucosa de la presente invención puede usarse también para proporcionar un injerto ortopédico para utilizarlo como un tejido conjuntivo de unión y sujeción de dos partes de un hueso fracturado y con una orientación adecuada en el cuerpo, el segmento de tejido puede conformarse para servir como una venda para fracturas alrededor de los segmentos de un hueso fracturado y para unirla al hueso.

En otras aplicaciones ortopédicas, la tela submucosa de la invención puede usarse para reparar tejido óseo, por ejemplo, usando las técnicas generales descritas en la Patente U.S. 5,641,518. Así, la tela submucosa en forma de polvo puede implantarse en una región ósea dañada o enferma para su reparación. El polvo de tela submucosa puede usarse solo o en combinación con uno o más agentes bioactivos tales como minerales fisiológicamente compatibles, factores de crecimiento, antibióticos, agentes quimioterapéuticos, antígenos, anticuerpos, enzimas y hormonas. Preferiblemente, el implante en forma de polvo se comprimirá dándole una constitución predeterminada y tridimensional, la cual se implantará en la región ósea y retendrá sustancialmente su forma durante la sustitución del injerto con tejidos endógenos.

La tela submucosa de la invención puede usarse también como sustrato para el crecimiento de las células, ilustrativamente en forma de lámina, pasta o gel, en combinación con nutrientes que ayudan al crecimiento de las células objeto de estudio, por ejemplo, las células eucarióticas tales como las células endoteliales, fibroblásticas, de piel fetal, osteosarcomas y adenocarcinomas (consulte, por ejemplo, en la Publicación Internacional No. WO 96/24661 de fecha 15 de agosto de 1996, que publica la Solicitud Internacional No. PCT/US96/G1842 presentada el 9 de febrero de 1996). En las formas preferidas, la composición del sustrato de tela submucosa sustentará la proliferación y/o diferenciación de células de mamíferos, incluyendo las células humanas.

La tela submucosa de la invención puede servir también como una matriz de colágeno en composiciones para producir células transformadas, (consulte, por ejemplo, las Publicaciones Internacionales Nos. WO 98/22158, WO 96/25179 y WO 95/22611). Tales composiciones para transformación de células incluirán generalmente la tela submucosa purificada de la presente invención, por ejemplo en formas fluidizada o de pasta, en combinación con un vector recombinante (tal como un plásmido) conteniendo una secuencia de ácido nucléico con la cual las células blanco in vitro e in vivo van a ser transformadas genéticamente. Las células seleccionadas para la transformación pueden incluir, por ejemplo, células progenitoras óseas.

La tela submucosa de la invención puede usarse también en la reparación de las paredes del cuerpo incluyendo, por ejemplo, la reparación de los defectos de la pared abdominal tales como hernias, utilizando técnicas análogas a las descritas en Ann. Plast. Surg., 1995, 35:374-380; y Surg. Res., 1996, 60:107-114. En tales aplicaciones, los injertos del tejido de tela submucosa preferido de la invención promueven la organización, vascularidad y consistencia favorables del tejido remodelado. En aplicaciones dermatológicas, la tela submucosa de la invención puede usarse en la reparación de la profundidad parcial o total de una herida y en el aumento dérmico utilizando técnicas generales de injerto, las cuales son conocidas en el arte y en la literatura (consulte, por ejemplo, Annals of Plastic Surgery 1995, 35:381-388). Además, se sabe que en el área del tratamiento de quemaduras se aplica generalmente un sustituto dérmico sobre el cual se transplantan los injertos epidérmicos cultivados (preferiblemente autoinjertos epidérmicos cultivados, CEA). Tales injertos cultivados han involucrado típicamente el trasplante de queratinocitos y/o fibroblastos sobre el sustituto dérmico. De acuerdo con la presente invención, la tela submucosa purificada puede usarse como sustituto dérmico, por ejemplo, en forma de lámina, transplantando entonces el CEA sobre la tela submucosa. En uno de los modos de practicar este aspecto de la invención, los queratinocitos pueden transplantarse, por ejemplo, sembrando o transfiriendo una lámina de queratinocitos sobre el lado mucoso de la tela mucosa. Los fibroblastos pueden transplantarse también en el lado mucoso y/o en el lado opuesto (abluminal) de la tela submucosa.

La tela submucosa de la invención puede también usarse en el injerto de tejidos en aplicaciones urogenitales. Por ejemplo, la tela submucosa puede usarse en la reparación de la vejiga urinaria para proporcionar un andamio para la regeneración de la vejiga, utilizando técnicas correspondientes a esas descritas de modo general en la Patente U.S. 5,645,860; Urology, 1995,46:396-400; y J. Urology, 1996,155:2098. En forma fluidizada, la tela submucosa de la invención puede encontrar uso también en un procedimiento de inyección endoscópica para corregir el reflujo vesicoureteral. En tales aplicaciones se puede realizar una inyección submucosa, por ejemplo, en el área bajo el orificio uretral de un paciente, para inducir el crecimiento de músculos lisos y la formación de colágeno en el sitio de la inyección.

En otras áreas, se pueden usar construcciones de injerto de tejidos formadas con la tela submucosa de la presente invención en aplicaciones neurológicas, por ejemplo, en técnicas que requieran un sustituto dural para reparar defectos debidos a un trauma, a la resección de un tumor o a procedimientos de descompresión.

Para contribuir a una mejor comprensión de la presente invención y de sus características y ventajas, se proporcionan los siguientes ejemplos específicos. Se comprenderá que estos ejemplos específicos, descritos en la solicitud de patente No. EP 97 954 888, son solamente ilustrativos y no limitativos de la presente invención.

Ejemplo 1

Treinta pies de intestino entero de un cerdo maduro adulto se enjuaga con agua. Este material se trata entonces en ácido peracético al 0.2 por ciento en volumen en una solución acuosa de etanol al 5 por ciento en volumen por un período de dos horas con agitación. La capa de tela submucosa se deslamina entonces del intestino entero en una máquina de embutir desinfectada. La tela submucosa deslaminada se enjuaga cuatro (4) veces con agua estéril y se somete a pruebas para detectar impurezas o contaminantes tales como endotoxinas, organismos microbianos y pirógenos. Se encontró que el tejido resultante tiene un nivel de biocarga esencialmente igual a cero. La capa de tela submucosa se separa fácil y consistentemente del intestino entero y se encontró que tenía mínimos residuos de tejidos sobre su superficie.

Ejemplo 2

Una sección de diez pies de intestino entero de cerdo se lava con agua. Después de enjuagado, este material fuente de colágeno intestinal contenido en la tela submucosa se trata por alrededor de dos horas y media en ácido peracético al 0.2 por ciento en volumen en una solución acuosa de etanol al 5 por ciento en volumen con agitación. Siguiendo al tratamiento con ácido peracético, la capa de tela submucosa se deslamina del intestino entero. La tela submucosa resul-
tante se enjuaga entonces cuatro (4) veces con agua estéril. Se encontró que la biocarga era esencialmente igual a cero.

Ejemplo 3

Una pequeña sección del material de colágeno intestinal de la tela submucosa se implantó subcutáneamente en una rata. En el plazo de 72 horas se observó una angiogénesis significativa.

Ejemplo 4

Dos secciones de intestino delgado son procesadas por métodos diferentes. La primera sección se enjuaga con agua del grifo, se desinfecta por 2 horas en una solución acuosa de etanol al 5% en volumen comprendiendo ácido peracético al 0.2% en volumen, con un pH aproximado de 2.6, se deslamina hasta la tela submucosa, esta se enjuaga en agua purificada, se divide en dos muestras y se congela rápidamente. La segunda sección se enjuaga en agua del grifo, se deslamina hasta la tela submucosa, se enjuaga en agua purificada, se coloca en una solución de sulfato de neomicín al 10% durante 20 minutos (como se describe en la Patente U.S. 4,902,508), se enjuaga en agua purificada, se divide en dos muestras y se congela rápidamente. Las cuatro muestras preparadas anteriormente se prueban para determinar los niveles de biocarga y de endotoxinas. Las primeras dos muestras tienen biocargas menores de 0.1 CFU/g y niveles de endotoxinas menores que 0.1 EU/g. Las segundas dos muestras tienen biocargas respectivas de 1.7 CFU/g y de 2.7 CFU/g, y niveles respectivos de endotoxinas de 23.9 EU/g y 15.7 EU/g.

Ejemplo 5

Tres secciones de intestino delgado son procesadas por métodos diferentes. La primera sección se enjuaga con agua del grifo, se desinfecta por 2 horas en una solución acuosa de etanol al 5% en volumen comprendiendo ácido peracético al 0.2% en volumen, con un pH aproximado de 2.6, se deslamina hasta la tela submucosa, esta se enjuaga en agua purificada, se divide en dos muestras y se congela rápidamente. La segunda se enjuaga en agua del grifo, se deslamina hasta la tela submucosa, se enjuaga en agua purificada, se desinfecta de acuerdo con los métodos del Ejemplo 1 de la Patente U.S. 5,460,962 (tratamiento por 40 horas en una solución acuosa de ácido peracético al 0.1% en volumen, suavizada hasta un pH de 7.2) y se congela rápidamente. La segunda se enjuaga en agua del grifo, se deslamina hasta la tela submucosa, se enjuaga en agua purificada, se desinfecta de acuerdo con los métodos del Ejemplo 2 de la Patente U.S. 5,460,962 (tratamiento en ácido peracético al 0.1% en volumen en una solución salina alta, suavizada hasta un pH de 7.2) y se congela rápidamente. Las tres muestras se probaron para determinar sus niveles de endotoxinas. Los niveles de endotoxinas fueron <0.14 EU/g para la primera muestra, >24 EU/g para la segunda muestra y >28 EU/g para la tercera muestra.

Ejemplo 6

Dos secciones de un intestino delgado de cerdo se infectaron con 7 x 10^{6} unidades formadoras de placas (PFU) de virus. Ambas fueron expuestas a ácido peracético al 0.18%, solución acuosa de etanol al 4.8% en una relación de peso de nueve a uno de la solución con respecto al material. Una primera muestra se sumergió en esta solución durante 5 minutos; la segunda se sumergió durante 2 horas. El material procesado durante 5 minutos exhibía 400 PFU por gramo de material. El material procesado durante 2 horas exhibía cero PFU por gramo de material.

Ejemplo 7

Una tela submucosa purificada, preparada como se describió aquí, se probó para determinar su contenido de ácido nucléico. Cuatro muestras de material pesando 5 mg cada una se sometieron a la extracción del ADN/ARN como se detalló en el Kit de Aislamiento de ADN/ARN de Amersham Lifescience Inc., Arlington Heights, Illinois. La cuantificación del ácido nucleico se realizó mediante la determinación espectrofotométrica de las densidades ópticas de la solución a 260 nm y 280 nm. El contenido promedio de ácido nucleico fue de 1.9 \pm 0.2 \mug por miligramo de material.

La submucosa del intestino delgado, preparada como se describió en la Patente U.S. 4,902,508, se probó para determinar su contenido de ácido nucleico. Cuatro muestras de material pesando 5 mg cada una se sometieron a la extracción del ADN/ARN como se detalló en el Kit de Aislamiento de ADN/ARN de Amersham. La cuantificación del ácido nucleico se realizó mediante la determinación espectrofotométrica de las densidades ópticas de la solución a 260 nm y 280 nm. El contenido promedio de ácido nucleico fue de 2.4 \pm 0.2 \mug por miligramo de material.

Ejemplo 8

Se enviaron a un laboratorio de ensayos independiente (NamSA, Inc., Northwood, Ohio) secciones de tela submucosa preparadas de acuerdo con los métodos descritos aquí para realizarles pruebas de biocompatibilidad, como se describe en la norma ISO 10993. Las muestras se probaron para determinar la Toxicidad Sistémica Aguda USP, la Toxicidad Intracutánea USP, la Citotoxicidad, la Endotoxina LAL, la Pirogenicidad mediada por el material, la Hemólisis por Contacto Directo y la Irritación Primaria de la Piel. Las muestras pasaron todas las pruebas indicando que el material es biocompatible.

Se apreciará que las variaciones de los procedimientos de procesamiento descritos anteriormente están contempladas en el alcance de esta invención. Por ejemplo, el tejido fuente para la tela submucosa, tal como estómago, intestino entero, útero vacuno y similares, puede deslaminarse parcialmente, tratarse con un agente desinfectante o esterilizante y a continuación realizar una deslaminación completa de la tela submucosa. Ilustrativamente, las capas adyacentes de mesenterio y/o las capas de serosa del intestino entero pueden retirarse antes del tratamiento con el agente desinfectante, deslaminando a continuación de la tela submucosa los tejidos adyacentes que quedan. Estos pasos pueden estar seguidos o no de pasos adicionales de desinfección, por ejemplo, purificación enzimática y/o eliminación de ácido nucleico. Alternativamente, la fuente de tela submucosa puede recibir un tratamiento mínimo con un desinfectante u otro agente similar, deslaminar la tela submucosa de la tunica muscularis y de la tunica mucosa, realizando a continuación un tratamiento completo de desinfección hasta obtener los niveles deseados de contaminantes. Todas estas variaciones y modificaciones se consideran parte del proceso descrito aquí, y están dentro del alcance de la invención.

Claims (39)

1. Una prótesis para injertos que comprende:

una estructura de matriz con base de colágeno purificada, retirada de una fuente de tejido de submucosa, teniendo dicha estructura purificada un nivel de contaminantes que hace que dicha estructura purificada sea biocompatible y teniendo además dicha estructura purificada un nivel de endotoxinas menor que 12 unidades de endotoxinas por gramo.

2. La prótesis para injertos de la reivindicación 1, donde dicha estructura purificada tiene un nivel de endotoxinas menor que 30 unidades de endotoxinas por gramo.

3. La prótesis para injertos de la reivindicación 2, donde dicho nivel de endotoxinas es menor que 5 unidades de endotoxinas por gramo.

4. La prótesis para injertos de la reivindicación 3, donde dicho nivel de endotoxinas es menor que 1 unidad de endotoxinas por gramo.

5. La prótesis para injertos de la reivindicación 4, donde dicho nivel de endotoxinas es menor que 0.5 unidades de endotoxinas por gramo.

6. La prótesis para injertos de la reivindicación 1, donde dicha estructura purificada tiene un nivel de biocarga menor que 2 unidades formadoras de colonias por gramo.

7. La prótesis para injertos de la reivindicación 6, donde dicho nivel de biocarga tiene menos de 1 unidad formadora de colonias por gramo.

8. La prótesis para injertos de la reivindicación 7, donde dicho nivel de biocarga tiene menos de 0.5 unidades formadoras de colonias por gramo.

9. La prótesis para injertos de la reivindicación 1, donde dicha estructura purificada tiene un nivel de contenido de ácido nucleico menor que 30 microgramos por miligramo.

10. La prótesis para injertos de la reivindicación 9, donde dicho contenido de ácido nucleico es menor que 2 microgramos por miligramo.

11. La prótesis para injertos de la reivindicación 1, donde dicha estructura purificada tiene un nivel de virus menor que 500 unidades formadoras de placas por gramo.

12. La prótesis para injertos de la reivindicación 11, donde dicho nivel de virus es menor que 100 unidades formadoras de placas por gramo.

13. La prótesis para injertos de la reivindicación 12, donde dicho nivel de virus es menor que 1 unidad formadora de placas por gramo.

14. La prótesis para injertos de la reivindicación 1, donde dicha estructura purificada tiene un nivel de agentes de procesamiento menor que 100,000 partes por millón por kilogramo.

15. La prótesis para injertos de la reivindicación 14, donde dicho nivel de agentes de procesamiento es menor que 1,000 partes por millón por kilogramo.

16. La prótesis para injertos de la reivindicación 15, donde dicho nivel de agentes de procesamiento es menor que 100 partes por millón por kilogramo.

17. La prótesis para injertos de la reivindicación 1, donde dicha estructura purificada tiene un nivel de hongos menor que 2 unidades formadoras de colonias por gramo.

18. La prótesis para injertos de la reivindicación 17, donde dicho nivel de hongos es menor que 1 unidad formadora de colonias por gramo.

19. La prótesis para injertos de la reivindicación 18, donde dicho nivel de hongos es menor que 0.5 unidades formadoras de colonias por gramo.

20. La prótesis para injertos de la reivindicación 1, donde dicha estructura purificada comprende una fuente de tejido de submucosa deslaminada.

21. La prótesis para injertos de la reivindicación 1, donde dicha estructura purificada comprende una fuente de tejido de submucosa desinfectada y deslaminada.

22. La prótesis para injertos de la reivindicación 1, donde dicha estructura purificada comprende una fuente de tejido de submucosa desinfectada y después deslaminada.

23. Una prótesis para injertos que comprende:

una estructura de matriz con base de colágeno purificada, retirada de una fuente de tejido de submucosa, teniendo dicha estructura purificada un nivel de endotoxinas menor que 12 unidades de endotoxinas por gramo.

24. Una prótesis para injertos de la reivindicación 23, donde

dicha estructura purificada tiene además un nivel de contenido de ácido nucleico menor que 2 microgramos por miligramo.

25. Una prótesis para injertos de la reivindicación 23, donde

dicha estructura purificada tiene además un nivel de virus menor que 500 unidades formadoras de placas por gramo.

26. Una prótesis para injertos de la reivindicación 23, donde

dicha estructura purificada tiene además un nivel de agentes de procesamiento menor que 100,000 partes por millón por kilogramo.

27. Una composición que comprende:

una estructura que contiene colágeno retirada de una fuente de tejido que contenía inicialmente dicha estructura y otros tejidos, teniendo dicha estructura que contiene colágeno un nivel de endotoxinas no mayor de 12 unidades de endotoxinas por gramo.

28. La composición de la reivindicación 27, donde dicha capa conteniendo colágeno es una submucosa y dicha fuente de tejido es un intestino delgado.

29. La composición de la reivindicación 28, donde dicha fuente de tejido es el intestino delgado de un cerdo.

30. La composición de la reivindicación 27, donde dicho nivel de endotoxinas es menor que 10 unidades de endotoxinas por gramo.

31. La composición de la reivindicación 30, donde dicho nivel de endotoxinas es menor que 5 unidades de endotoxinas por gramo.

32. Una matriz purificada que contiene colágeno obtenida a partir de una fuente de tejidos de un mamífero, comprendiendo dicha matriz tela submucosa de mamífero y contaminantes residuales provenientes de dicha fuente de tejidos de un mamífero, siendo obtenible dicha matriz que contiene colágeno mediante un proceso el cual comprende la desinfección de dicho tejido de mamífero y después la extracción de dicha matriz que contiene colágeno del tejido de mamífero desinfectado, y teniendo además dicha matriz que contiene colágeno un nivel de endotoxinas menor que 12 unidades de endotoxinas por gramo.

33. La matriz purificada que contiene colágeno de la reivindicación 32, donde dicha desinfección incluye poner en contacto la fuente de tejidos de un mamífero con una solución acuosa que contiene un perácido.

34. La matriz purificada que contiene colágeno de la reivindicación 33 donde el perácido es ácido peracético.

35. La prótesis para injertos de las reivindicaciones 1, 23, 24, 25 ó 26, donde la estructura de la matriz con base de colágeno retiene sustancialmente su porosidad nativa.

36. La prótesis para injertos de las reivindicaciones 1, 23, 24, 25 ó 26, donde la estructura de la matriz con base de colágeno retiene sustancialmente su estructura nativa.

37. La prótesis para injertos de las reivindicaciones 1, 23, 24, 25 ó 26, donde la estructura de la matriz con base de colágeno no se trata con un agente de reticulación.

38. La prótesis para injertos de las reivindicaciones 1, 23, 24, 25 ó 26, donde la estructura de la matriz con base de colágeno es efectiva para inducir una angiogénesis activa.

39. La prótesis para injertos de las reivindicaciones 1, 23, 24, 25 ó 26, donde la estructura de la matriz con base de colágeno contiene uno o más de los glicosaminoglicanos, proteoglicanos o factores de crecimiento que existen naturalmente en la estructura de la matriz.