JP2010528613A - 多能細胞集団を産生する方法およびその使用 - Google Patents

多能細胞集団を産生する方法およびその使用 Download PDF

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Abstract

請求の範囲に記載されている発明は、生体内の様々な細胞への分化を促進し、更なる分化を可能にする多能、多能性、自己再生可能な細胞の生成に直接関係している。請求の範囲に記載されている発明は、望まれる移植可能の分化細胞集団、遺伝子組み換えされた細胞、これらの方法により改善されるであろう病気によって苦しんでいる患者の治療法に、直接関係する。本発明は、免疫不全ウィルス感染に関連した病気の予防や治療方法をも与える（ＨＩＶ−１，、ＨＩＶ−２、ＳＩＶ、ＦＩＶなど）。

Description

２１世紀の医療における優れた挑戦は、損傷し擦り切れまたは遺伝子学的に損なわれた細胞を、置換することであろう。ＤＮＡへ明確に結ばれる転写調節因子は、遺伝子発現の調節において重要な役割をなしている。どの細胞プログラムが活性化され、どれが止められているかを決定するものは各細胞における転写調節因子の特定の補完物である。この機能で転写調節因子は、細胞の同一性を決定・維持し、同様に細胞の脆弱性を決定する役割がある。
（発明の要約）
まだ多能化されず自己再生できない細胞から、増殖し自己再生し、多能で多能化できる細胞集団を得る能力は、細胞療法を利用する全ての分野において明らかに有益なものであろう。これらの分野は、骨髄移植、輸血、遺伝子療法を含み、患者独自の幹細胞や、その他望まれる種類の細胞の生成が可能になる。同様に、神経、筋肉、その他の様々な望ましい細胞集団への分化を始める能力は、医療や動物を含む商業面の過程にとって大きな価値を生むであろう。それに応じて本発明は、遺伝子生成の方法、多能な細胞集団の利用、多能性の細胞集団の利用、神経細胞集団の利用、筋細胞集団の利用、またＨＩＶ耐性細胞集団のような他の望まれる細胞集団の利用を提供する。
本発明の請求は、単独もしくは（ｎｏｔｃｈ、ｎｕｍｂおよびｎｕｍｂｌｉｋｅなどの）他の細胞運命デターミナントとの組み合わせによって、一時的（多能、多能性、および／または自己再生可能）な、または固定された（分化されたまたは体）細胞の表現型であると考えられるものの変換を可能にする、特定の転写調節因子の有効的な導入または過剰発現についてである。
信頼できる表現型の転換や細胞の再プログラムの能力により、個々の患者に適応した幹細胞、代替細胞、組織、器官の生成が可能になる。
遺伝子治療技術や細胞培養技術に合わせて、細胞タイプの相互変換は、移植に適応できる、疾患に耐性があり、遺伝子学的に修復された細胞を生成することもできる。
本発明の目的は、増殖でき、自己再生可能で、多能および／あるいは多能性の細胞集団だけでなく、他の望まれる細胞集団を生成する方法を、癌遺伝子を使わずに分裂した細胞または分裂していない細胞から提供することである。分化した細胞集団は、特定に分類された細胞タイプと関連する全てのマーカーではないが、いくつかのマーカーを発現する細胞から成る。ここで述べられているように、他の導入遺伝子（特に転写調整因子）との組み合わせによって発現する適切なＮｕｍｂアイソフォームは、分裂した、多能化した細胞集団または分化している細胞集団の生成を可能にする。さらに本発明における遺伝子ベクターは、遺伝子改変（例：患者で欠損している遺伝子産物が発現）を生み出すため、および、一時的もしくは永久的に増殖でき、自己再生できる細胞の性質または、幹細胞や前駆細胞の性質をインビボで内在性細胞中に誘導するために使われ得るが、具体的には、それらの内在性細胞は、普通ではこのような性質は見せないかもはや見せない組織の中で発見されるものである。最後に、本発明における他の遺伝子ベクターは、（癌細胞など）異常な作用を見せる細胞で、遺伝子改変を行い、および／あるいは増殖、自己再生、または幹細胞／前駆細胞の性質を防ぐのに用いられる。病気の過程を和らげることが予想される、合成オリゴヌクレオチド配列の発現を可能にする、治療上のベクターや細胞を生成することも本発明の目的である。例えば本発明では、ＨＩＶおよび他の免疫不全ウィルス感染、増殖また拡大に重要な遺伝子の発現を低減させるための合成オリゴヌクレオチドの利用を明らかにする。
本発明は脊椎動物の細胞ならびに魚類、哺乳類、鳥類、両性類、爬虫類の細胞など、いかなる適した細胞にも利用できる。
図１は、実施例１３のベクター配列に対応するベクターマップを示す。
（発明の詳細な説明）
全ての特許、特許出願、ならびに本出願書で引用された出版物は、そのまま参照し本論に引用されている。ここで論じられているように、「ＤＮＡ」はデオキシリボ核酸を表わし、「ＲＮＡ」はリボ核酸を表わす。ここで書かれている、「ｃＤＮＡ」は相補的ＤＮＡを意味し、「ｍＲＮＡ」はメッセンジャーＲＮＡを表わす。
「ｓｉＲＮＡ」は小干渉ＲＮＡを表わし、「ｓｈＲＮＡ」は小ヘアピンＲＮＡを表わす。「ｍｉＲＮＡ」は、単一ストランドＲＮＡ分子や、特に約２０から３０の長さのヌクレオチドを持ち遺伝子の発現を調節する可能性があるマイクロＲＮＡを表わす。「ｄｅｃｏｙ」および「ｄｅｃｏｙ ＲＮＡ」ならびに「ＲＮＡ ｄｅｃｏｙ」は、リガンドに対する天然の結合ドメインを模倣したＲＮＡ分子を表わす。
ここで用いているように、用語「ａｍｅｌｉｏｒａｔｉｎｇ（改善する）」は影響を減らし、または損傷を少なくし、または作用、活性または機能の効果もしくは衝撃を最小にすることを意味し、例えば、疾患または状態による有害な影響を減らすことを含む。
ここで用いているように、用語「ｒｅｔａｒｄｉｎｇ（遅らせる」は影響または作用の進行を緩めるかまたは減少させることを意味する。それは例えば、病気の進行を緩めたり、感染率を低下させたり、疾患または症状の発達あるいは進行を緩やかにするかまたは低下させるように作用することである。
ここで用いているように、「誘発剤」は作用を促進することを助けるかあるいは単独で効果的な作用物質である。例えば、活性を誘引するかまたは増進させることによりプロモータに作用し、またプロモータの統制のもと遺伝子発現に影響する外生の作用物質は誘発剤と称されるだろう。例えば、テトラサイクリンは誘発剤として使われ、ドキシサイクリンも誘発剤として使われるであろう。
核酸配列（ポリペプチドをコードする核酸配列など）は、第１の核酸配列が第２の核酸配列と機能的な関係のもとに配置された時に、他の核酸配列（プロモータなど）に対して「作動可能に連結する」と言われている。例えば、もしコード配列の転写または発現に、プロモータが影響を与えたら、プロモータはコード配列に作動可能に連結するということである。ここで用いられているように「駆動される」という言葉は、遺伝子やコード配列がプロモータ配列に作動可能に連結し、プロモータ配列がコード配列の転写または発現に影響を与えることを意味する。
ここで用いているように、「マーカー」は、探知できる分子または探知できる分子のコードまたはマーカーの存在を探知できるような他の分子上の作用のことである。「マーカーたんぱく質」あるいは「マーカーポリペプチド」は、研究室や臨床的環境において探知でき、実施形態において可視できる、たんぱく質あるいはポリペプチドのことである。「マーカー遺伝子」は、マーカーたんぱく質またはマーカーポリペプチドをコードするものである。
ここで用いているように、「ＨＩＶ」はヒト免疫不全ウィルスのことを表わし、例えばＨｌＶ−Ｉ、ＨＩＶ−２などの変異体を含む。他の免疫不全ウィルスとしては、ＳＩＶ（サル免疫不全ウィルス）やＦＩＶ（ネコ免疫不全ウィルス）などがある。ＨＩＶに関連する酵素は「ＨＩＶ酵素」と呼ばれることもでき、例えばインテグラーゼ、プロテアーゼ、逆転写酵素、ＴＡＴ（トランス活性化調節たんぱく質）などを含む。ＨＩＶによる感染は、「ＨＩＶ受容体」と呼ばれる受容体が関わっていると考えられている。「ＨＩＶ共受容体」として名づけられ得る複数のそのような受容体があるであろう。ここで記されているように、「ＨＩＶ共受容体」にはＣＸＣＲ４やＣＣＲ５などがある。
本発明の実施形態における理論上の論拠はここに記されているが、この議論は本発明を縛るか制限するものではない。当業者は、本発明の理論上の支持を説明するために用いられるモデルであるにもかかわらず、本発明の様々な実施形態が実施され得ることを理解する。
好ましい実施の形態としては、細胞は、ａ）増殖している多能または多能性の細胞集団、分化しているｂ）神経細胞の集団、ｃ）筋細胞の集団、ｄ）および／あるいは他の望まれる細胞集団を生成する目的で、利用しやすく分裂しているまたは分裂していない細胞集団から選択される。更に、所望の細胞集団は、生体外、生体内でさらなる分化が可能であり得、および／あるいは生体内で組織に適切な、および部位で適切な一層の分化ができる。
本発明に用いるための選択された細胞の供給源：選択された細胞は、本発明において利用可能であるすべての細胞を含んでいてもよい。本発明で使うために選択した細胞（ここでは「選択された細胞」という）は、他の器官システムに由来した細胞を含む患者の内生的な細胞に由来するか、または外生の供給源から由来した細胞（細胞株、低温保存された供給源、貯蔵された供給源、およびドナー由来のものを含む）であってよい。細胞は、合成あるいは天然の核酸配列を用いて遺伝子改変された細胞から選択されることもある。ここで使用されている「選択された細胞」とは、ヒト胎児性幹細胞は含まない。
本発明の実施形態においては侵襲的な手段の関与なしで単離し得るための選択された細胞は好ましくは容易に採取することができる細胞（例：末梢血白血球、循環造血幹細胞、上皮細胞）、（例：口頬細胞（例：Ｍｉｃｈａｌｃｚｙｋ ｅｔ ａｌ， ２００４））、脂肪組織（例：Ｇｉｍｂｌｅ ｅｔ ａｌ．， ２００７； Ｍａ ｅｔ ａｌ．， ２００７）、臍帯血液細胞（例：Ｚｈａｏ， ｅｔ ａｌ．， ２００６； Ｔｉａｎ ｅｔ ａｌ．， ２００７）、など）を利用した。しかしながら骨髄幹細胞、精原細胞（例：Ｇｕａｎ ｅｔ ａｌ．， ２００６； Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．， ２００７）、始原生殖細胞（ＰＧＣ）、羊膜から分離した幹細胞（例：Ｉｌａｎｃｈｅｒａｎ ｅｔ ａｌ．， ２００７）、羊水 （例：Ｄｅ Ｃｏｐｐｉ ｅｔ ａｌ．， ２００７）、同様に皮膚から分離した細胞（例：Ｔｕｍｂａｒ， ２００６； Ｄｕｎｎｗａｌｄｅｔ ａｌ．， ２００１ ； Ｓｚｕｄａｌ’ｔｓｅｖａ ｅｔ ａｌ．， ２００７）などは、本発明においても利用された。このような細胞は、当該分野で知られている任意の手段によって、それが存在する組織から分離することができる。
精原細胞は、二段階の酵素消化とそれに続くパーコール分離を使用して分離することができる。細胞をウシ血清アルブミンを補充した最小必須培地（ＭＥＭ）に１０ ６ ／ｍＬの最終濃度に再懸濁することができる。具体的には：細管の断片を手術で入手し、掻き裂いた後に、０．１０％炭酸水素ナトリウム、４ｍＭ Ｌ−グルタミン、非必須アミノ酸、４０マイクログラム／ｍｌのゲンタマイシン、１００ＩＵ〜１００マイクログラム／ｍｌのペニシリン−ストレプトマイシン、および１５ｍＭのＨＥＰＥＳを含むＭＥＭ中で１ミリグラム／ｍｌのトリプシン、ヒアルロニダーゼ、およびコラゲナーゼで処理し、続いて１ミリグラム／ｍｌのヒアルロニダーゼとコラゲナーゼで処理する。精原細胞をさらに細管の断片から３０倍の重力で遠心分離によって分離する。７７ミクロンおよび／または５５ミクロンの孔径を有するナイロンフィルターを介してろ過した後、細胞は収集され、不連続パーコール密度勾配上にロードされる。純度が４０％を超える前駆細胞／幹細胞／精原細胞を含む分画を洗浄して、１０ ６ 個の前駆細胞／幹細胞／精原細胞と等価な細胞濃度に懸濁する。その後、細胞は培養され、さらに／または当該分野で公知の任意の凍結保存技術によって保存される。
選択された細胞は遺伝子改変細胞であってよく、特に治療上または商業的に有利なデオキシリボ酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）配列をコードするため当該分野で知られている任意の技術で遺伝子改変された。
本発明の一つの側面によれば、選択された細胞から望まれる細胞集団（例：多能性、 神経、筋肉、など）を生成する方法が提供される。
多能、多能性および／あるいは自己再生可能な細胞集団の生成
ａ）増殖し自己再生できる多能性の細胞集団を得るために、選択された細胞および／あるいはその子孫細胞は、哺乳類のｎｕｍｂ遺伝子の「長」 （ＰＲＲ ｉｎｓｅｒｔ ＋） アイソフォームをコードするものを含むヌクレオチド配列によってトランスフェクトされる。それとほぼ同時に選択された細胞は、短いＮｕｍｂアイソフォームおよびＮｕｍｂｌｉｋｅとを標的にした合成オリゴヌクレオチドによってトランスフェクトされ、それから最適の成長速度で選択された細胞を成長させる環境下で培養され得る。選択された細胞はこのような環境下において、望まれる細胞数に達するまでの十分な期間維持される。細胞はＬＩＦ、鉄因子および／あるいは Ｉｌ−６、ｈｙｐｅｒ １Ｌ−６、ＩＬ−７、オンコスタティン−Ｍおよび／あるいはカーディオトロフィン−１と等しい効力の濃度によって培養され得られた（最適な）成長速度で成長し、もしくは成長を増強する他のサイトカインの存在（例：多能性細胞を培養する条件、例： Ｇｕａｎ ｅｔ ａｌ．， ２００６）によって得られた成長速度によって成長する。成長速度は、前記の成長培地中での選択された細胞の倍加時間よって決定される。同様に、米国特許６４３２７１１と５４５３３５７にある培養環境は、長（ＰＲＲ＋）Ｎｕｍｂアイソフォームによってトランスフェクトされた細胞が最適な成長速度で増殖や拡大するのに適切であり得る。他の適切なプロコトルや参照のサイトカイン濃度は、Ｋｏｓｈｉｍｉｚｕｅｔ ａｌ．，１９９６；Ｋｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９６；Ｐｉｑｕｅｔ−Ｐｅｌｌｏｒｃｅ， １９９４；Ｒｏｓｅ ｅｔ ａｌ．，１９９４；Ｐａｒｋ ａｎｄ Ｈａｎ， ２０００；Ｇｕａｎ ｅｔ ａｌ．， ２００６； Ｄｙｋｓｔｒａ ｅｔ ａｌ．， ２００６； Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００７によって教示されている。しかしながら、本発明の実施は、これら教示の詳細に制限されない。
一つの好適な実施形態において、選択された細胞は標準的な成長培地において培養される（例：補完（例：グルタミン、ベータ・ メルカプトエタノール）が有るまたは無い最少必須培地。培地は、基本的な繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、鉄因子、白血病抑制因子（ＬＩＦ）および／あるいはＬＩＦ活性がある因子（例：ＬＩＦ、ＬＩＦ受容体（ＬＩＦＲ）、 繊毛状神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、 オンコスタティン Ｍ （ＯＳＭ）、ＯＳＭ 受容体（ＯＳＭＲ）、カーディオトロフィン、ＩＬ−６などのインターロイキン（ＩＬ）、ｈｙｐｅｒ ＩＬ−６、ＧＰ １３０など）、ウマの血清を含む。ＬＩＦのみではなくＬＩＦ活性がある他の因子は、細胞の自発的な分化を防止する。このような環境下で、ＰＲＲ＋Ｎｕｍｂ アイソフォームでトランスフェクトされた選択された細胞およびその子孫細胞は、多能、多能性および／あるいは自己再生能力を得ることが期待されている。
一つの好適な実施形態において、選択された細胞および／あるいはその子孫細胞は、「長」 （ＰＲＲ ｉｎｓｅｒｔ ＋） Ｎｕｍｂ アイソフォームをコードするヌクレオチド配列のみならず、他の導入遺伝子をコードする配列によってトランスフェクトされる。これら導入遺伝子の多くは、ＮＣＢＩ配列データベースに、それぞれの対応する識別番号（アクセッション番号）に基づいて列挙される。
別の好適な実施形態において、選択された細胞および／あるいはその子孫細胞は、他の導入遺伝子をコードする配列と同様に、「長」（ＰＲＲ ｉｎｓｅｒｔ ＋） Ｎｕｍｂ アイソフォームの部分をコードするヌクレオチド配列によってトランスフェクトされる。これらの導入遺伝子の多くは、それぞれの対応する識別（アクセッション）番号（コード）に基づいてＮＣＢＩ配列データベースに列挙される。一つの好適な実施形態において、選択された細胞やその子孫細胞は、ＬＩＦなどの他の導入遺伝子をコードする配列と同様に、長（ＰＲＲ＋）Ｎｕｍｂアイソフォームをコードする配列によってトランスフェクトされる。
一つの好適な実施形態において、ＬＩＦ活性を有する導入遺伝子を含む他の導入遺伝子をコードする配列と同様に、長（ＰＲＲ＋） Ｎｕｍｂ アイソフォームをコードする配列によって、選択された細胞および／あるいはその子孫細胞はトランスフェクトされる。一つの好適な実施形態において、ＬＩＦＲを含む他の導入遺伝子をコードする配列と同様に、長（ＰＲＲ＋）Ｎｕｍｂ アイソフォームをコードする配列によって、選択された細胞および／あるいはその子孫細胞はトランスフェクトされる。
一つの好適な実施形態において、オンコンスタティンＭ（ＯＳＭ）を含む他の導入遺伝子の符号化された連鎖と同様に、長（ＰＲＲ＋） Ｎｕｍｂ アイソフォームによって連鎖を符号化して、選択された細胞および／あるいはその結果である細胞は核酸が入れられる。
一つの好適な実施形態において、オンコンスタティンＭ受容体（ＯＳＭＲ）を含む他の導入遺伝子をコードする配列と同様に、長（ＰＲＲ＋） Ｎｕｍｂ アイソフォームをコードする配列によって、選択された細胞やその結果である細胞は核酸が入れられる。一つの好適な実施例において、カーディオトロフィン−１を含む他の導入遺伝子の符号化された連鎖と同様に、長（ＰＲＲ＋） Ｎｕｍｂ アイソフォームによって連鎖を符号化して、選択された細胞やその子孫細胞はトランスフェクトされる。
一つの好適な実施形態において、ＣＮＴＦを含む他の導入遺伝子をコードする配列と同様に、長（ＰＲＲ＋） Ｎｕｍｂ アイソフォームをコードする配列によって、選択された細胞やその子孫細胞はトランスフェクトされる。
一つの好適な実施形態において、ＯＣＴ３／４やＳＯＸ２を含む他の導入遺伝子をコードする配列と同様に、長 （ＰＲＲ＋） Ｎｕｍｂ アイソフォームをコードする配列によって、選択された細胞やその子孫細胞はトランスフェクトされる。
一つの好適な実施形態において、ＮＡＮＯＧやＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２を含む他の導入遺伝子をコードする配列と同様に、長 （ＰＲＲ＋） Ｎｕｍｂ アイソフォームをコードする配列によって、選択された細胞やその子孫細胞はトランスフェクトされる。
一つの好適な実施形態において、ＯＣＴ３／４やＳＯＸ２を含む他の導入遺伝子および、ＬＩＦ活性を伴う導入遺伝子をコードする配列と同様に、長（ＰＲＲ＋） Ｎｕｍｂ アイソフォームをコードする配列によって、選択された細胞および／あるいはその子孫細胞はトランスフェクトされる。
一つの好適な実施形態において、選択された細胞および／またはその子孫細胞は、ＯＣＴ３／４およびＳＯＸ２を含む他の導入遺伝子、ならびにＬＩＦ活性を伴う導入遺伝子をコードする配列でトランスフェクトされる。
一つの好適な実施形態において、Ｎｏｔｃｈを含む他の導入遺伝子をコードする配列と同様に、長（ＰＲＲ＋） Ｎｕｍｂ アイソフォームをコードする配列によって、選択された細胞および／あるいはその子孫細胞はトランスフェクトされる（例：Ｇａｉａｎｏ ｅｔ ａｌ．， ２０００）。
一つの好適な実施形態において、ＯＣＴ３／４やＳＯＸ２、Ｎｏｔｃｈを含む他の導入遺伝子をコードする配列と同様に、長 （ＰＲＲ＋） Ｎｕｍｂ アイソフォームをコードする配列によって、選択された細胞および／あるいはその子孫細胞はトランスフェクトされる（例：ｎｏｔｃｈ１ および／あるいはｎｏｔｃｈ ２）。
一つの好適な実施形態において、ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧまたＮｏｔｃｈを含む他の導入遺伝子をコードする配列と同様に、長（ＰＲＲ＋） Ｎｕｍｂ アイソフォームによって連鎖を符号化して、選択された細胞および／あるいはその結果である細胞は核酸が入れられる。
一つの好適な実施形態において、選択された細胞および／あるいはその子孫細胞は、ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧを含む他の導入遺伝子、またＬＩＦ活性を伴う導入遺伝子をコードする配列と同様に、長 （ＰＲＲ＋） Ｎｕｍｂ アイソフォームをコードする配列によってトランスフェクトされる。一つの好適な実施形態において、選択された細胞および／あるいはその子孫細胞は、ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧを含む他の導入遺伝子、およびＬＩＦ活性がある多重導入遺伝子をコードするのと同様に、長（ＰＲＲ＋）Ｎｕｍｂアイソフォームをコードする配列によってトランスフェクトされる。
一つの好適な実施形態において、選択された細胞および／あるいはその子孫細胞は、ＯＣＴ３／４、 Ｎｏｔｃｈ，、 ＨＯＸＢ４ 、またＳＯＸ２を含む他の導入遺伝子をコードする配列と同様に、長（ＰＲＲ＋） Ｎｕｍｂ アイソフォームをコードする配列によってトランスフェクトされる。
さらに、他のここで記されたものとは異なる遺伝子の組み合わせが、細胞を、多能、多能性とならせることができ、自己再生することができるかまたは分化を始めるようにすることができることが記載または発見されるかもしれない。しかしながら、本特許出願は核酸またはたんぱく質の電気穿孔法（Ｇａｇｎｅ ｅｔ ａｌ．，１９９１；Ｓａｉｔｏ ｅｔ ａｌ．，２００１；Ｙｕａｎ，２００８；Ｈｕａｎｇ ｅｔａｌ．，２００７； Ｘｉａ ａｎｄ Ｚｈａｎｇ，２００７；Ｃｅｍａｚａｒ ａｎｄ Ｓｅｒｓａ ２００７；ｌｓａｋａ ａｎｄ Ｉｍａｉ，２００７； Ｌｕｘｅｍｂｏｕｒｇ ｅｔ ａｌ．，２００７；Ｖａｎ Ｔｅｎｄｅｌｏｏｓ，２００７；Ｔａｋａｈａｓｈｉ，２００７；など参照）、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトなどを適応する任意の有核細胞の「遺伝子再プログラミング」（Ｇｏｌｄｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．， ２００７； Ｌｉ ｅｔ ａｌ．， ２００７参照）および／あるいはウィルスの組込み、またはその他の細胞ゲノムのランダムな変換を避ける別のアプローチなどを包含する。なぜなら、それらの方法は、安全性と効率を向上させるからである。
さらに当然として、ゲノムの特定の場所においてＤＮＡを導入または取り除くために設計された遺伝子ターゲティングならびに部位特異的方法はランダム変換のカテゴリーから除外される。
同様にして、本特許出願は、核酸またはたんぱく質の電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトなどを用いる任意の有核細胞の遺伝子再プログラミングおよび／あるいは、レトロウィルスの／レンチウィルスの組込み、またはその他の細胞ゲノムのランダムな変換を避ける別のアプローチを包含する。なぜならそれらの方法は、安全性や効率の向上を意味するからである。を意味する。このようなアプローチや手法は、すべて当該分野で公知であり、本発明において実施可能である。
一つの好適な実施形態において、単一の遺伝子またはその一部（特にここで挙げられたもので、ここで挙げられた手法によって発見され、他の公表された方法により発見されたもの；または多能、多能性、自己再生を誘導することが知られているもの）に対応する核酸またはたんぱく質が、選択された細胞から多能、多能性および／または自己再生細胞を生成するよう過剰発現した、および／あるいは導入された、唯一の核酸またはたんぱく質である。
一つの好適な実施形態において、単一の遺伝子またはその一部に（特にここで挙げられたもので、ここで挙げられた手法によって発見され、他の公表された方法により発見されたもの；または多能、多能性、または自己再生を誘導することが知られているもの）に対応する核酸またはたんぱく質が、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成するよう過剰発現した、および／あるいは導入された、唯一の核酸またはたんぱく質である。そして使用されている手法は電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいは、レトロウィルス／レンチウィルスの組込みまたはその他の細胞ゲノムのランダムな変換を避けるもう１つのアプローチである。
別の好適な実施形態において、他の核酸またはたんぱく質は、単一の遺伝子やその一部（特にここで挙げられたもので、ここで挙げられた手法によって発見され、他の公表された方法により発見されたもの； もしくは多能で、多能分化し、または自己再生を誘導することが知られているもの）に対応する核酸またはたんぱく質との調和の中で、選択された細胞から、多分能、多能性および／あるいは自己再生細胞の集団が生成されている限り使用できる。
別の好適な実施形態において、他の核酸またはたんぱく質は単一の遺伝子またはその一部（特にここで挙げられたもので、ここで挙げられた手法によって発見され、他の公表された方法により発見されたもの、もしくは多能で多能分化し、または自己再生を誘導することが知られているもの）に対応する核酸またはたんぱく質との調和の中で、選択された細胞から、多能、多能性および／あるいは自己再生細胞の集団を生成する限り、そして使用されている手法は電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいは、レトロウィルスの／レンチウィルスの組込みまたはその他の細胞ゲノムのランダムな変換を避けるもう１つのアプローチである限り、使用することができる。
一つの好適な実施形態において、Ｎａｎｏｇに対応する核酸またはたんぱく質が、選択された細胞から、多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成するよう過剰発現したおよび／あるいは導入された、唯一の核酸またはたんぱく質である。そして使用されている手法は電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいは、レトロウィルス／レンチウィルスの組込み、またはその他の細胞ゲノムのランダムな変換を避けるもう１つのアプローチである。
別の好適な実施形態において、他の核酸またはたんぱく質はＮａｎｏｇに対応する核酸またはたんぱく質との調和の中で、選択された細胞から、多能、多能性および／あるいは自己再生細胞の集団を生成される限り、そして使用されている手法は電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールト、および／あるいは、ウィルスの組込み、またはその他の細胞ゲノムのランダムな変換を避けるもう１つのアプローチである限り、使用できる。
別の好適な実施形態において、Ｏｃｔ４ とＳｏｘ２に対応する核酸またはたんぱく質が、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成するよう過剰発現したおよび／あるいは導入された、唯一の核酸またはたんぱく質である。そして使用されている手法は電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいは、ウィルスの組込み、またはその他の細胞ゲノムのランダムな変換を避けるもう１つのアプローチである。
別の好適な実施形態において、他の核酸またはたんぱく質はＯｃｔ４／Ｓｏｘ２に対応する核酸またはたんぱく質との調和の中で、選択された細胞から、多能、多能性および／あるいは自己再生細胞の集団が生成されている限り、そして使用されている手法は電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいは、ウィルスの組込み、またはその他の細胞ゲノムのランダムな変換を避けるもう１つのアプローチである限り、使用する。
別の好適な実施形態において、長（ＰＲＲ＋） Ｎｕｍｂアイソフォームに対応する核酸またはたんぱく質が、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成するよう過剰発現した、および／あるいは導入された、唯一の核酸またはたんぱく質である。そして使用されている手法は電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいは、ウィルスの組込み、またはその他の細胞ゲノムのランダムな変換を避けるもう１つのアプローチである。
別の好適な実施形態において、他の核酸またはタンパク質は、長（ＰＲＲ＋） Ｎｕｍｂアイソフォームに対応する核酸またはたんぱく質との調和の中で、選択された細胞から、多能、多能性および／あるいは自己再生細胞の集団を生成される限り、そしてその手法は電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいは、ウィルスの組込み、またはその他の細胞ゲノムのランダムな変換を避けるもう１つのアプローチである限り、使用する。
一つの好適な実施形態において、Ｎａｎｏｇに対応する核酸またはたんぱく質が、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成するために過剰発現した、および／あるいは導入された、唯一の核酸またはたんぱく質である。
一つの好適な実施形態において、Ｎａｎｏｇに対応する核酸またはたんぱく質が、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成するよう過剰発現した、および／あるいは導入された、唯一の核酸またはたんぱく質である。そして使用されている手法は電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいは、レトロウィルス／レンチウィルスの組込み、またはその他の細胞ゲノムのランダムな変換を避けるもう１つのアプローチである。
別の好適な実施形態において、Ｎａｎｏｇに対応する核酸またはたんぱく質が、選択された細胞から、多能、多能性および／あるいは自己再生細胞の集団を生成する限り、他の核酸またはたんぱく質を使用することができる。
別の好適な実施形態において、Ｎａｎｏｇに対応する核酸またはたんぱく質が、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞の集団を生成する限り、他の核酸またはたんぱく質を使用することができる。そして使用されている手法は電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいは、レトロウィルス／レンチウィルスの組込み、またはその他の細胞ゲノムのランダムな変換を避けるもう１つのアプローチである。
一つの好適な実施形態において、ＬＩＦ活性をもつ遺伝子に対応する核酸またはたんぱく質が、多能、多能化、および／あるいは自己再生細胞を生成するよう選択された細胞から過剰発現および／あるいは導入された唯一の核酸またはたんぱく質である。
一つの好適な実施形態において、ＬＩＦ活性のある遺伝子に対応する核酸またはたんぱく質が、多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成するよう選択された細胞から過剰発現した、および／あるいは導入された、唯一の核酸またはたんぱく質である。そして使用されている手法は電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいは、レトロウィルス／レンチウィルスの組込み、またはその他の細胞ゲノムのランダムな変換を避けるもう１つのアプローチである。
別の好適な実施形態において、他の核酸またはたんぱく質は、ＬＩＦ活性がある遺伝子に対応する核酸またはたんぱく質との調和の中で、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞の集団が生成されている限り、使用する事ができる。
別の好適な実施形態において、他の核酸またはたんぱく質は、ＬＩＦ活性がある遺伝子に対応する核酸またはたんぱく質との調和の中で、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞の集団が生成されている限り、そして使用されている手法は電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいは、レトロウィルス／レンチウィルスの組込み、、またはその他の細胞ゲノムのランダムな変換を避けるもう１つのアプローチである限り、使用することができる。
一つの好適な実施形態において、Ｏｃｔ４に対応する核酸またはたんぱく質が、多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成するよう選択された細胞から過剰発現した、および／あるいは導入された、唯一の核酸またはたんぱく質である。
一つの好適な実施形態において、Ｏｃｔ４に対応する核酸またはたんぱく質が、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成するよう過剰発現した、および／あるいは導入された、唯一の核酸またはたんぱく質である。そして使用されている手法は電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいは、レトロウィルス／レンチウィルスの組込み、またはその他の細胞ゲノムのランダムな変換を避けるもう１つのアプローチである。
別の好適な実施形態において、他の核酸またはたんぱく質はＯｃｔ４に対応する核酸またはたんぱく質との調和の中で、選ばれた細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞の集団が生成されている限り、使用する事ができる。
別の好適な実施形態において、他の核酸またはたんぱく質はＯｃｔ４に対応する核酸またはたんぱく質との調和の中で、選ばれた細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞の集団が生成されている限り、そして使用されている手法は電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいは、レトロウィルス／レンチウィルスの組込み、またはその他の細胞ゲノムのランダムな変換を避けるもう１つのアプローチである限り、使用することができる。
一つの好適な実施形態において、Ｓｏｘ２に対応する核酸またはたんぱく質は、選ばれた細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成するよう過剰発現した、および／あるいは導入された、唯一の核酸またはたんぱく質である。
一つの好適な実施形態において、Ｓｏｘ２に対応する核酸またはたんぱく質は、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成するよう、過剰発現したおよび／あるいは導入された、唯一の核酸またはたんぱく質である。そして使用されている手法は電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいはレトロウィルス／レンチウィルスの組込み、または細胞ゲノムのその他のランダムな変換を避けるもう１つのアプローチである。
別の好適な実施形態において、Ｓｏｘ２に対応する核酸またはたんぱく質との調和の中で、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞の集団を生成する限り、他の核酸またはたんぱく質は使用する事ができる。
別の好適な実施形態において、Ｓｏｘ２に対応する核酸またはたんぱく質との調和の中で、選択された細胞から、多能、多能性および／あるいは自己再生細胞の集団が生成されている限り、そして使用されている手法は電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいは、レトロウィルス／レンチウィルスの組込み、または細胞ゲノムのその他のランダムな変換を避けるもう１つのアプローチである限り、他の核酸またはたんぱく質は使用する事ができる。
一つの好適な実施形態において、ｌｉｎ２８に対応する核酸またはたんぱく質は、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成するよう、過剰発現したおよび／あるいは導入された、唯一の核酸またはたんぱく質である。
一つの好適な実施形態において、ｌｉｎ２８に対応する核酸またはたんぱく質は、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成するよう、過剰発現したおよび／あるいは導入された、唯一の核酸またはたんぱく質である。そして使用されている手法は電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいは、レトロウィルス／レンチウィルスの組込み、または細胞ゲノムのその他ランダムな変換を避けるもう１つのアプローチである。
別の好適な実施形態において、ｌｉｎ２８に対応する核酸またはたんぱく質との調和の中で、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞の集団を生成する限り、そして使用されている手法は電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいは、レトロウィルス／レンチウィルスの組込み、または細胞ゲノムのその他ランダムな変換を避けるもう１つのアプローチである限り、他の核酸またはたんぱく質は使用する事ができる。
一つの好適な実施形態において、ｃ−ｍｙｃに対応する核酸またはたんぱく質は、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成するよう、過剰発現したおよび／あるいは導入された、唯一の核酸またはたんぱく質である。
一つの好ましい実施の形態としては、ｃ−ｍｙｃに対応する核酸またはたんぱく質は、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成するよう、過剰発現したおよび／あるいは導入された、唯一の核酸またはたんぱく質であり、使用されている手法は電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいは、レトロウィルス／レンチウィルスの組込み、または細胞ゲノムのその他ランダムな変換を避けるもう１つのアプローチである。
別個の好ましい実施の形態としては、ｃ−ｍｙｃに対応する核酸またはたんぱく質との調和の中で、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成する限り、他の核酸またはたんぱく質は使用する事ができる。
別の好適な実施形態において、ｃ−ｍｙｃに対応する核酸または、たんぱく質との調和の中で、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成するよう導入された細胞の集団が生成されている限り、そして使用されている手法は電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいは、レトロウィルス／レンチウィルスの組込み、または細胞ゲノムのその他ランダムな変換を避けるもう１つのアプローチである限り、他の核酸またはたんぱく質は使用する事ができる。
別の好適な実施の形態としては、Ｏｃｔ４とＳｏｘ２に対応する核酸またはたんぱく質は、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成するよう、過剰発現したおよび／あるいは導入された、唯一の核酸またはたんぱく質である。
別の好適な実施形態において、Ｏｃｔ４とＳｏｘ２に対応する核酸またはたんぱく質は、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成するよう、過剰発現したおよび／あるいは導入された、唯一の核酸またはたんぱく質であり、使用されている手法は電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいは、レトロウィルス／レンチウィルスの組込み、または細胞ゲノムのその他ランダムな変換を避けるもう１つのアプローチである。
別の好適な実施形態において、Ｏｃｔ４とＳｏｘ２に対応する核酸またはたんぱく質との調和の中で、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞の集団が生成されている限り、他の核酸またはたんぱく質が使用される。
別の好適な実施形態において、Ｏｃｔ４とＳｏｘ２に対応する核酸またはたんぱく質との調和の中で、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞の集団が生成されている限り、および、使用されている手法は電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいは、レトロウィルス／レンチウィルスの組込み、または細胞ゲノムのその他ランダムな変換を避けるもう１つのアプローチである限り、他の核酸またはたんぱく質が使用される。
別の好適な実施形態において、長（ＰＲＲ＋）Ｎｕｍｂ アイソフォームに対応する核酸またはたんぱく質は、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成するよう、過剰発現したおよび／あるいは導入された、唯一の核酸またはたんぱく質である。
別の好適な実施形態において、長（ＰＲＲ＋）Ｎｕｍｂ アイソフォームに対応する核酸またはたんぱく質は、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成するよう、過剰発現したおよび／あるいは導入された、唯一の核酸またはたんぱく質であり、使用されている手法は電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいは、レトロウィルス／レンチウィルスの組込み、または細胞ゲノムのその他ランダムな変換を避けるもう１つのアプローチである。
別の好適な実施形態において、長（ＰＲＲ＋） Ｎｕｍｂ アイソフォームに対応する核酸またはたんぱく質との調和の中で、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞の集団が生成されている限り、他の核酸またはたんぱく質は使用する。
別の好適な実施形態において、長（ＰＲＲ＋） Ｎｕｍｂ アイソフォームに対応する核酸またはたんぱく質との調和の中で、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞の集団が生成されている限り、さらに使用されている手法は電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいは、レトロウィルス／レンチウィルスの組込み、または細胞ゲノムのその他ランダムな変換を避けるもう１つのアプローチである限り、他の核酸またはたんぱく質は使用される。
別の好適な実施形態において、Ｏｃｔ４、 Ｓｏｘ２とＮａｎｏｇに対応する核酸またはたんぱく質は、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成するよう、過剰発現した、および／あるいは導入された、唯一の核酸またはたんぱく質である。
別の好適な実施形態において、Ｏｃｔ４、 Ｓｏｘ２とＮａｎｏｇに対応する核酸またはたんぱく質は、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成するよう、過剰発現した、および／あるいは導入された、唯一の核酸またはたんぱく質であり、使用されている手法は電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいは、レトロウィルス／レンチウィルスの組込み、または細胞ゲノムのその他ランダムな変換を避けるもう１つのアプローチである。
別の好適な実施形態において、Ｏｃｔ４， Ｓｏｘ２とＮａｎｏｇに対応する核酸またはたんぱく質との調和の中で、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞の集団が生成されている限り、他の核酸またはたんぱく質は使用する。
別の好適な実施形態において、Ｏｃｔ４， Ｓｏｘ２とＮａｎｏｇに対応する核酸またはたんぱく質との調和の中で、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞の集団が生成されている限り、さらに使用されている手法は電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいは、レトロウィルス／レンチウィルスの組込み、または細胞ゲノムのその他ランダムな変換を避けるもう１つのアプローチである限り、他の核酸またはたんぱく質は使用される。
別の好適な実施形態において、長（ＰＲＲ＋）Ｎｕｍｂ アイソフォームに対応する核酸またはたんぱく質が、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞を生成するよう、過剰発現したおよび／あるいは導入された、唯一の核酸またはたんぱく質である。
別の好適な実施形態において、長（ＰＲＲ＋） Ｎｕｍｂ アイソフォームに対応する核酸またはたんぱく質は、選択された細胞から、多能、多能性および／あるいは自己再生の細胞を生成するよう、過剰発現および／あるいは導入され、使用されている手法は電気穿孔法、リボソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいはレトロウィルス／レンチウィルスの組込みまたは細胞ゲノムのその他ランダムな変換を避けるもう１つのアプローチである。
別の好適な実施形態において、長 （ＰＲＲ＋）Ｎｕｍｂ アイソフォームに対応する核酸またはたんぱく質との調和の中で、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞集団が生成されている限り、他の核酸またはたんぱく質は使用する。
別の好適な実施形態において、長 （ＰＲＲ＋）Ｎｕｍｂ アイソフォームに対応する核酸またはたんぱく質との調和の中で、選択された細胞から多能、多能性および／あるいは自己再生細胞の集団が生成されている限り、他の核酸またはたんぱく質は使用する事ができ、使用されている手法は電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいは、レトロウィルス／レンチウィルスの組込みまたは細胞ゲノムのその他ランダムな変換を避けるもう１つのアプローチである。
ここに示される核酸またはたんぱく質の配列のあらゆる組み合わせは、望まれる細胞集団または性質が得られる限り、Ｎｕｍｂおよび／あるいはＮｕｍｂｌｉｋｅに対応する核酸またはたんぱく質の配列を除外することで改変できるということが理解されるべきである。
同様にここで示される分化を開始する方法は、ここにある手法で得られた細胞に対してだけでなく、誘発されたまたは誘発されなかった、多能、多能性、または自己再生する幹細胞、他の前駆細胞、または他の選択された細胞に対し適応できることが理解されるべきである。ここに示される核酸またはたんぱく質の配列のあらゆる組み合わせは、望まれる細胞集団が得られる限り、Ｎｕｍｂおよび／あるいはＮｕｍｂｌｉｋｅに対応する核酸またはたんぱく質を除外することで改変できることが理解されるべきである。
別の好適な実施形態において、ここに示される核酸またはたんぱく質の様々な組み合わせは、Ｎｕｍｂｌｉｋｅおよび／あるいはＮｕｍｂ アイソフォームに対応する核酸またはたんぱく質を除外することで使用できる。
好ましい実施態様では、選択された細胞および／またはその子孫が遺伝的に、事前に変更されている細胞である。
好ましい実施態様では、ここに説明するトランスフェクションの手順は、一時的なトランスフェクションを表す。さらに好ましい実施態様ではこのような一時的なトランスフェクションは、ホストゲノムへの組込みがないウイルスベクターを使用して達成される。
別の好適な実施形態において、かかる一時的なトランスフェクションは、標準のトランスフェクション技術（電気穿孔法、化学的に媒介されたトランスフェクション、融合性または非融合性リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトなど）を用いて達成される。
時間の経過に従い、ここに示されるものとは異なる他の遺伝子組み合わせで、細胞に対し、多能、多能性、自己再生可能になるようもたらすかまたは分化開始をもたらすことができることが示され、あるいは発見されるであろう。しかしながら本特許出願は、核酸またはたんぱく質の電気穿孔法（例：手法についてはＧａｇｎｅ ｅｔ ａｌ．，１９９１；Ｓａｉｔｏ ｅｔ ａｌ．，２００１；Ｙｕａｎ，２００８； Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００７；Ｘｉａ ａｎｄ Ｚｈａｎｇ，２００７；Ｃｅｍａｚａｒ ａｎｄ Ｓｅｒｓａ ２００７；Ｉｓａｋａ ａｎｄ Ｉｍａｉ，２００７；Ｌｕｘｅｍｂｏｕｒｇ ｅｔ ａｌ．， ２００７；Ｖａｎ Ｔｅｎｄｅｌｏｏｓ，２００７；Ｔａｋａｈａｓｈｉ，２００７；その他を参照）、電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいはウィルスの組込みまたは細胞ゲノムのその他ランダムな変換を避けるもう１つのアプローチ（それらの手技は安全性と有効性を向上させるので）を用いる任意の有核細胞の遺伝子再プログラミングも包含する。
別の好ましい実施態様では長（ＰＲＲ＋）ｎｕｍｂアイソフォームをコードする配列（および／または合成オリゴヌクレオチドｎｕｍｂｌｉｋｅと短ｎｕｍｂアイソフォーム）が、ヒトＬＩＦ（例えば、Ｄｕ ａｎｄ Ｓｈｉ，１９９６）、オンコスタチン−Ｍ、ｃａｒｄｉｏｔｒｏｐｈｉｎ-１、ＩＬ−１１、ＩＬ−６、ＩＬ６Ｒ、Ｈｙｐｅｒ ＩＬ−６、ＬＩＦＲ、ｇｐｌ３０、ＯＣＴ３（ＯＣＴ４）、Ｎａｎｏｇ、ＳＯＸ２、および／またはＦＧＦ−４をコードするものから選択される配列を含む他の配列で、一時的または永久的なトランスフェクションを伴うかまたはそれによって置換される。
これらの異なる導入遺伝子配列の任意のサブセットでの同時トランスフェクションは、単一遺伝子ベクター、複数の遺伝的ベクター、シリアルトランスフェクションと異なるマーカータンパク質および／または抗生物質耐性に基づく選択を含む当該分野で公知の手段によって達成することができる。
別の好ましい実施態様では、長（ＰＲＲ＋）ｎｕｍｂアイソフォームでトランスフェクトされた細胞は、ＥＧＦ、ｂＦＧＦ、オンコスタチン（例えば、Ｄｕ ａｎｄ Ｓｈｉ，１９９６）、ＬＩＦ、鉄因子、ＩＬ−１１、ｃａｒｄｉｏｔｒｏｐｈｉｎ−１、ＩＬ−６、Ｈｙｐｅｒ ＩＬ−６、ＣＮＴＦ、および／または水溶性ｇｐｌ３０を含む、上記のような最適成長速度を促進する細胞培養で培養される。
効力と分化の評価
多能性と多能は次を含むその分野で公知の手法によって評価できる。１）移植、２）胚様体の形成を促進する条件での培養、３）動物の胚盤胞期胚芽への細胞注入とその後の成長、４）分化、多能、多能性など（Ｇｕａｎｅｔ ａｌ．，２００６を参照）に関連した遺伝子発現のＲＮＡ発現検査（例：ＲＴ−ＰＣＲ法ならびにマイクロアレイ法に基づいた分析）、５）コロニー形成のみならずＥＳ細胞類似形態による。ここで説明する、選択された細胞および／あるいはその子孫細胞の多能性を知るための１つの方法としては、蛍光タンパク遺伝子に作動可能に結び付けられたＮａｎｏｇプロモータを含む構築物を使うトランスフェクションが含まれる。これによりＮａｎｏｇ発現細胞は、蛍光活性化細胞分別（ＦＡＣＳ）などを使って特定し富化することができる。
実施の形態としては、内因細胞（例：火傷または怪我をした部分の周りの細胞）が長（ＰＲＲ＋）ｎｕｍｂ アイソフォームをコードする遺伝子ベクターのみと、あるいはここで名前を挙げた他の導入遺伝子と共に生体内でトランスフェクションし、一時的に細胞再生したかあるいは増加した細胞の増殖を促進する。この手法は低形成組織、幹／前駆細胞が異常に欠損する疾患、また他のこの手法が有効であることが示され得る疾患に対して臨床的に用いることができる。
分化する細胞集団を得る
ｂ） 神経細胞集団、ｃ） 筋肉細胞集団、ｄ） その他の細胞集団がさらに生体内で環境的に制御されて分化が可能になるようにするには、選択された細胞および／あるいはその子孫細胞が、長（ＰＰＲ＋）Ｎｕｍｂアイソフォーム配列および／あるいは合成されたオリゴヌクレオチド配列でのトランスフェクションを任意に受け、（上記の如く）試験管内で十分な時間をもって増加が拡大し望まれる数の子孫細胞が達成される。
この任意の手順に続いて、選択された細胞および／あるいはその子孫細胞を洗浄して拡大／最適の成長培地を構成するサイトカインと因子を取り除き、任意にＮｕｍｂｌｉｋｅ遺伝子および／あるいは「短」（ＰＲＲ−）Ｎｕｍｂアイソフォームおよび／あるいは長（ＰＲＲ＋）アイソフォームなどを標的とする合成オリゴヌクレオチドをコードするヌクレオチド配列など （例：Ｚａｅｈｒｅｓ ｅｔ ａｌ．，２００５）でトランスフェクションした。そして選択された細胞を望まれる細胞タイプに分化させるのを促進させる状況下で培養した。
殆どの例において、細胞は５から１０％の胎仔ウシ血清と、選択された細胞および／あるいはその結果の子孫細胞を望まれる細胞集団に分化させるのを促進させる因子が存在するという条件下で培養された。胎仔ウシ血清とその因子が存在することにより、最適（または拡大）成長速度よりも低い速度で成長あるいは増殖し、望まれる細胞集団に分化するのに好都合である。因子と正確な培養条件は、下記で描写された所望の細胞集団により選ばれる。
ニューロンまたは神経細胞集団を得る
望まれる細胞集団が神経細胞集団の時は、トランスフェクションが成功した細胞が、細胞を神経細胞に分化させるのを促進する因子が存在し、最適速度よりも低い速度で成長を促進する条件下で培養される。ニューロンへの分化を促進する条件については、次のような数多くの文献で説明されている（Ｂｅｎｎｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００３； Ｃｈｕｎｇ ｅｔ ａｌ．２００５；Ｈａｒｋａｎｙ ｅｔ ａｌ．，２００４；Ｉｋｅｄａ ｅｔ ａｌ．， ２００４； Ｉｋｅｄａ ｅｔ ａｌ．，２００５；Ｗｅｒｎｉｇ ｅｔ ａｌ．，２００２；およびＷｅｒｎｉｇ ｅｔ ａｌ．，２００４）。さらには加えたサイトカインの存在とレチノイン酸曝露を組み合わせることは、特定の神経細胞タイプが試験管内で分化するのに有利である（例：Ｓｏｕｎｄａｒａｒａｊａｎ ｅｔａｌ．， ２００６； Ｓｏｕｎｄａｒａｒａｊａｎ ｅｔ ａｌ．，２００７；Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ ６４３２７１１）。
実施の形態としては、試験管内でニューロンまたは、神経細胞の分化は５０ｎｇ／ｍｌの神経成長因子（ＮＧＦ）の存在下でおこる。
一つの好適な実施形態において、神経細胞集団が望まれる細胞集団である時、短ｎｕｍｂアイソフォーム（および／あるいはｎｕｍｂｌｉｋｅ）をコードする配列とのトランスフェクションが、Ｎｕｒｒｌ、ＲＥＮ、ネウロジェニン１、ネウロジェニン２、ネウロジェニン３、Ｍａｓｈ１、Ｐｈｏｘ２ｂ、Ｐｈｏｘ２ａ、ｄＨａｎｄ、Ｇａｔａ３、Ｓｈｈ、ＦＧＦ８、Ｌｍｘｌｂ、Ｎｋｘ２．２、Ｐｅｔｌ、Ｌｂｘｌおよび／あるいはＲｎｘをコードしたものから選ばれた配列を含む他の配列と、一時的または永続的なトランスフェクションを伴うか置き換えられる。
別の好適な実施形態において、ドーパミン作動性ニューロンが望まれるニューロン集団である時、短ｎｕｍｂアイソフォーム（および／あるいはｎｕｍｂｌｉｋｅをコードした配列とのトランスフェクションが、Ｍａｓｈ１、Ｎｇｎ２、Ｎｕｒｒｌ、Ｌｍｘｌｂおよび／あるいはＰｔｘ−３をコードしたものから選ばれた配列を含む他の配列と、一時的または永続的なトランスフェクションを伴うか置き換えられる。
別の好適な実施形態において、セロトニン作動性ニューロンが望まれるニューロン集団である時に、短ｎｕｍｂアイソフォーム（および／あるいはｎｕｍｂｌｉｋｅ）をコードした配列とのトランスフェクションが、Ｍａｓｈｌ、Ｐｈｏｘ２ｂ、Ｌｍｘｌｂ、Ｎｋｘ２．２、 Ｇａｔａ２、 Ｇａｔａ３、 および／あるいはＰｅｔｌをコードしたものから選ばれた配列を含む他の配列と、一時的または永続的なトランスフェクションを伴うか置き換えられる。
別の好適な実施形態において、コリン作動性ニューロンが望まれるニューロン集団である時、短ｎｕｍｂアイソフォーム（および／あるいはｎｕｍｂｌｉｋｅ）をコードした配列とのトランスフェクションが、ＭＡＳＨ１、Ｐｈｏｘ２ａおよび／あるいはＲＥＳＴ４をコードしたものから選ばれた配列を含む他の配列と、一時的または永続的なトランスフェクションを伴うか置き換えられる。
別の好適な実施形態において、ＧＡＢＡ作動性ニューロンが望まれるニューロン集団である時、短ｎｕｍｂアイソフォーム（および／あるいはｎｕｍｂｌｉｋｅ）をコードした配列とのトランスフェクションが、ＭＡＳＨ１、Ｐｈｏｘ２ａおよび／あるいはＲＥＳＴ４をコードしたものから選ばれた配列を含む他の配列で一時的または永続的なトランスフェクションを伴うか置き換えられ、任意的にＬＩＦ、Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ ３（ＮＴ３）および／あるいは神経成長因子（ＮＧＦ）が補足された媒体での培養が続く。
別の好適な実施形態において、ノルアドレナリン作動性ニューロンが望まれるニューロン集団の時、短ｎｕｍｂアイソフォーム（および／あるいはｎｕｍｂｌｉｋｅ）を符号化した配列とのトランスフェクションが、Ｍａｓｈｌ、ｄＨａｎｄ、Ｐｈｏｘ２ａ、 Ｐｈｏｘ２ｂ、Ｇａｔａ２ および／あるいは Ｇａｔａ３をコードしたものから選ばれたを配列を含む他の配列と、一時的または永続的なトランスフェクションを伴うか置き換えられる。
別の好適な実施形態において、ＧＡＢＡ作動性ニューロンが望まれるニューロン集団である時、短ｎｕｍｂアイソフォーム（および／あるいはｎｕｍｂｌｉｋｅ）をコードする配列とのトランスフェクションした細胞が、ＰＩＴＸ２、Ｄｌｘ２、Ｄｌｘ５、アンチセンスＨｅｓｌ ＲＮＡおよび／あるいはその他のＨＥＳ１を標的にした合成オリゴヌクレオチドをコードしたものから選ばれた配列を含む他の配列と、一時的又は永続的なトランスフェクションを伴うか置き換えられる。
他の実施形態において、ニューロンまたは神経細胞集団が所望の集団である場合、短（ＰＲＲ−）ｎｕｍｂアイソフォーム（および／またはｎｕｍｂｌｉｋｅ）でトランスフェクトされた細胞は、上記のような、および１つまたは複数の次の因子：レチノイン酸、ＮＴ３、ＮＧＦ、グリア細胞株由来成長因子（ＧＤＮＦ）およびインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）を含む、分化を促進する細胞培養培地中で培養される。
筋細胞集団を得る
望まれる細胞集団が筋細胞集団である場合、形質移入に成功した細胞は、細胞が筋細胞でと分化し、しかも最適速度未満の速度で成長するよう促進する因子の存在下で培養される。筋細胞への分化を促進する条件は以前に記載した（Ｎａｋａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，２００３；Ｐａｌ ａｎｄ Ｋｈａｎｎａ，２００５；Ｐｉｐｅｓ ｅｔ ａｌ．，２００５；Ａｌｂｉｌｅｚ ｅｔ ａｌ．，２００６；Ｐａｌ ａｎｄ Ｋｈａｎｎａ，２００７；Ｂｅｈｆａｒ ｅｔ ａｌ．，２００７；Ｕ．ＳＰａｔｅｎｔ ６４３２７１１）。さらに、選択した細胞および／またはそれらの子孫細胞を追加のサイトカインの存在下でヘキサメチレンビス−アクリルアミドまたはジメチルスルホキシドに曝露することは、インビトロで筋タイプの分化の開始に有利である。
一つの好適な実施形態において、心筋細胞集団が望まれる細胞集団である時、短（ＰＲＲ−） ｎｕｍｂアイソフォーム（および／あるいはｎｕｍｂｌｉｋｅでトランスフェクトされた細胞は、心筋細胞（ｃａｒｄｉｏｍｙｃｙｔｅｓ）（Ｈｅ ｅｔ ａｌ．，２００３； Ｇｕａｎ ｅｔ ａｌ．， ２００７；その他）への分化を促進する細胞倍地中で培養するか、心臓細胞の分化を促進する濃度の特定の因子（例：０．７５％− １ ％ ジメチルスルホキシド （ＤＭＳＯ）、２０％の正常ウシ血清（ＮＢＳ）、１０（−７） ｍＭ レチノイン酸（ＲＡ） 、２０％ 心筋細胞の訓化培地（Ｈｕａ ｅｔ ａｌ．， ２００６）を含む細胞培地にて培養される。
別の好適な実施形態において、心筋細胞集団が望まれる細胞集団の時、それら細胞はＧａｔａ ４、Ｇａｔａ ５、およびＧａｔａ ６をコードする配列から選択された配列を含むヌクレオチド配列でトランスフェクトされる。
一つの好適な実施形態において、筋細胞集団が望まれる細胞集団である時、短ｎｕｍｂアイソフォーム （および／あるいはｎｕｍｂｌｉｋｅ）をコードする配列による核酸のトランスフェクションは、筋タイプ特定 ｂＨＬＨ−符号化連鎖、ＭｙｏＤ、ミオゲニン、Ｍｙｆ５、Ｍｙｆ６、 Ｍｅｆ２、ミオカーディン、Ｉｆｒｄｌや他の筋肉転写因子をコードするこれらから、選択された配列を含む他の配列と、一時的もしくは永久的なトランスフェクションを伴うか置き換えられる。
一つの好適な実施形態において、平滑筋細胞集団が望まれる細胞集団である時、短ｎｕｍｂアイソフォーム （および／あるいはｎｕｍｂｌｉｋｅ）をコードする配列によるトランスフェクションは、筋タイプ特定ミオカーディンヌクレオチド配列をコードするこれらから選択された配列を含む他の配列と、一時的もしくは永久的なトランスフェクションを伴うか置き換えられる。
一つの好適な実施形態において、骨格筋細胞集団が望まれる細胞集団である時、短ｎｕｍｂアイソフォーム（および／あるいはｎｕｍｂｌｉｋｅ）をコードする配列によるトランスフェクションは、筋タイプ特定ＭｙｏＤとミオゲニンヌクレオチド鎖を符号化するこれらから選択された配列を含む他の配列と、一時的もしくは永久的なトランスフェクションを伴うか置き換えられる。
一つの好適な実施形態において、ｏｌｉｇｏｄｅｎｓｒｏｃｙｔｅ細胞集団が望まれる細胞集団である時、短ｎｕｍｂアイソフォーム（および／あるいはｎｕｍｂｌｉｋｅ）をコードする配列によるトランスフェクションは希突起膠細胞の特有の−ＯＬＩＧｌ、 ＯＬＩＧ２、またＺｆｐ４８８ ヌクレオチド配列をコードするこれらから選択された配列を含む他の配列と、一時的もしくは永久的なトランスフェクションを伴うか置き換えられる。
上記のこれらの異なる導入遺伝子配列の任意のサブセットでの同時トランスフェクションは、複数の遺伝子のベクター、シリアルトランスフェクションだけでなく、異なるマーカータンパク質および／または抗生物質耐性に基づく選択の使用を含む当分野で既知の任意の手段によって達成することができる。所望の細胞集団が造血細胞集団である場合、分化培地は、造血前駆細胞（例えば、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、トロンボポイエチンなど（例えば、Ｏｈｍｉｚｏｎｏ、１９９７、Ｗａｎｇら、２００５； Ｓｒｉｖａｓｔａｖａら、２００７； Ｇｕｐｔａら、２００７）、または分化造血細胞の型（未分化または多能性細胞から分化した造血細胞型を提供するための当分野で既知の方法による）に分化を促進する濃度で特定の因子を含む。
望まれた細胞集団が生殖細胞集団である時、分化培地は生殖細胞への分化を促進させる濃度において特定の因子を含む（例Ｎａｙｅｒｎｉａら２００６ａ、２００６ｂ）。望まれた細胞集団が、内胚葉およびすい臓島細胞の時、分化培地は、内胚葉およびすい臓島細胞への分化を促進させる濃度において特定の因子を含む（例：徐ら、２００６；デネールら、２００７；シムら、２００７；江ら、２００７）。
一つの好適な実施形態において、選択された細胞および／あるいはその子孫細胞の分化は、分化培地において、ｎｕｍｂｌｉｋｅ、短Ｎｕｍｂ ｉｄｓｏフォームや他の導入遺伝子でのトランスフェクションなしだが培地を変更しない場合、起こり得る。
複数の実施形態において、単一のベクターを利用するが、このものは、一つの調節可能なプロモーター（例えば、テトラサイクリン調節プロモーター）のもとで、哺乳動物ｎｕｍｂ遺伝子の「長」（ＰＲＲ＋）をコードするヌクレオチド配列（単数または複数）（および／またはｎｕｍｂｌｉｋｅまたは短ｎｕｍｂアイソフォームを標的とする合成オリゴヌクレオチド）の発現を調節し、その一方、Ｎｕｍｂｌｉｋｅおよび短Ｎｕｍｂアイソフォーム（および／または長（ＰＲＲ＋）アイソフォームを標的とする合成オリゴヌクレオチド）が、別の、異なるが、調節可能でもあるプロモーターの調節下で発現される。従って、長（ＰＲＲ＋）ｎｕｍｂアイソフィオーム（単数または複数）は、選択された細胞の拡大が望まれ、誘導因子（例えばテトラサイクリン）が成長培池に添加される場合、発現できる（および／または短アイソフォームが抑制される）。分化が望ましい場合、後でｎｕｍｂｌｉｋｅおよび短アイソフォームは発現できる（および／または長（ＰＲＲ＋）ｎｕｍｂアイソフォーム（単数または複数）は抑制される）。
あるいは、本明細書に列挙するＮｕｍｂアイソフォーム、Ｎｏｔｃｈ、ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２および他のＤＮＡ配列に対応するタンパク質およびペプチドは、ナノ粒子、陽イオン性脂質、融合性リポソーム（例えば、Ｙｏｓｈｉｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，２００５；２００７）などを用いるか、代わりに、または遺伝子トランスフェクションと組合わせた、電気穿孔法（例えば、Ｋｏｋｅｎ ｅｔ ａｌ．， １９９４：Ｒｉｔｃｈｉｅ ａｎｄ Ｇｉｌｒｏｙ， １９９８）を介して選択した細胞および／またはそれらの子孫細胞に、類似の様式で適用してよい。一般に、電気穿孔法は、導入遺伝子をゲノムへ組込むことなしに、高いトランスフェクション効率（および所望の細胞の効率的な生産）をもたらすので、それゆえ、安全性向上が伴う。
選択した細胞の増殖、多能力、多能性力、または分化を促進するタンパク質（単数または複数）またはポリペプチド（単数または複数）をコードするＤＮＡまたはＲＮＡは、標準的な遺伝子工学技法（例えば、特定の細胞系統のｃＤＮＡライブラリーからそのようなＤＮＡを単離することによって）に従って単離し、それを適当な発現ベクターに入れることができ、その後、選択した細胞にトランスフェクトする。
別の好ましい実施形態において、内胚葉およびランゲルハンス島細胞は所望の集団であり、短ｎｕｍｂアイソフォーム（および／またはｎｕｍｂｌｉｋｅ）は、Ｆｏｘａ２、Ｓｏｘ１７、ＨＬＸＢ９および／またはＰｄｘ１をコードするこれらから選ばれる配列を含む他の配列と、一時的または永続的なトランスフェクションを伴うかそれによって置換される。
一つの好適な実施形態において、肝細胞が望まれる集団であり短ｎｕｍｂアイソフォーム（および／あるいはｎｕｍｂｌｉｋｅ）をコードする配列によるトランスフェクションは、肝核因子（ＨＮＦ）−１、ＨＮＦ−３ 、ＨＮＦ−４、ＨＮＦ−６ならびにｃｒｅｂ結合たんぱく質をコードするこれらから選択された配列を含む他の配列と、一時的もしくは永久的なトランスフェクションを伴うかまたは置き換えられる。
別の好適な実施形態において、造血細胞が望まれる細胞集団であり、短ｎｕｍｂアイソフォーム（および／あるいはｎｕｍｂｌｉｋｅ）をコードする配列でのトランスフェクションは、Ｒｕｎｘｌ／ＡＭＬｌとＮＯＶ（ＣＣＮ３）をコードするこれらのものおよび／あるいは望まれる細胞集団に特異的なコロニー刺激因子の存在下での細胞培養物から選択された配列を含む他の配列と、一時的もしくは永久的なトランスフェクションを伴うかまたは置き換えられる。Ｒｕｎｘｌ／ ＡＭＬ１ａアイソフォームは、移植が望まれる時に、ｂアイソフォームは分化が望まれる時に導入される（Ｃｒｅｅｍｅｒｓ ｅｔ ａｌ．， ２００６）。
別の好適な実施形態において、軟骨細胞が望まれる集団であり、短ｎｕｍｂアイソフォーム（および／あるいはｎｕｍｂｌｉｋｅ）を符号化する配列によるトランスフェクションは、Ｓｏｘ９、ＣＲＥＢ結合たんぱく質、Ｇａｔａ６、および／あるいはＲｕｎｘ２をコードする配列含む他の配列と、一時的もしくは永久的なトランスフェクションを伴うか置き換えられる。
別の好適な実施形態において、骨細胞（特に骨芽細胞）が望まれる細胞集団であり、短ｎｕｍｂアイソフォーム（および／あるいはｎｕｍｂｌｉｋｅ）をコードする配列によるトランスフェクションは、Ｒｕｎｘ２を含む他の配列の、一時的もしくは永久的なトランスフェクションが伴うかまたは置き換えられる。
別の好適な実施形態において、長Ｎｕｍｂアイソフォームをコードする遺伝子ベクターは、過渡的にまたは制御可能なプロモータの調節のもとで、一時的にそれらの細胞の増殖を起こす目的で生体内の内在細胞に導入される。
別の好適な実施形態において、内生細胞（例：中枢神経系の上衣層細胞）は生体内において、中枢神経系における前駆細胞／上衣細胞の再生したまたは増加した分化（特にニューロンの分化）および遊走を一過性あるいは永久的に促進するための、最短ｎｕｍｂアイソフォームまたはｎｕｍｂｌｉｋｅタンパク質のいずれか一方をコードする、遺伝子ベクター単独でまたはここで名付けられているような他の導入遺伝子とともにトランスフェクトされる。この再生または増加は、分化に関連したマーカーの新規発生の発現を見せる細胞の数によって計測される。これは遺伝子ベクターを器官システムに、この目的のために適した方法を用いて導入されることにより達成され得る（実施例を参照）。
実施の形態としては、内生細胞（例：中枢神経系の上衣層細胞）は、生体内において、再生または増加した幹細胞の増殖を一過性に促進する目的（引き続く子孫細胞の分化を伴う）で、長ｎｕｍｂアイソフォームおよび／あるいはここで名づけられた他の導入遺伝子をコードする遺伝子ベクターでトランスフェクトされる。この再生または増加は、分裂している前駆細胞に関連したマーカーの新規発生の発現を見せる細胞の数によって計測される。これは遺伝子ベクターを器官システムに、その目的に適した方法を用いて導入して達成され得る（実施例を参照）。
同様に、この方法は、他の組織（皮膚など）における他の幹細胞集団から、再生または増加した分化を起こすためにも適している。この方法は、例えば中枢神経系の傷害、通常の分化または遊走が不十分な他の組織の障害、形成異常疾患、本アプローチが有益な他の障害の場合に臨床的に用いることができる。
好ましい実施態様では、単一の遺伝子またはその一部（具体的、本明細書で命名されたもの、本明細書で記載された方法に従って発見われたもの、他の公表された方法に従って発見されたもの、および／または所望する分化の様式を開始することができることが知られているもの）に対応する核酸またはタンパク質は、選択された細胞において分化を誘導するように過剰発現されるかまたは導入される唯一の核酸またはタンパク質である。
好ましい一つの実施形態において、単一の遺伝子またはその一部に対応する核酸（単数または複数）またはタンパク質（単数または複数）、（具体的には、本明細書で命名されたもの、本明細書に記した方法によって発見されたもの、他の公表された方法によって発見されたもの、および／または所望する分化の様式を開始できることが公知のもの）は、選択された細胞において分化を開始するために過剰発現および／または導入された唯一の核酸（単数または複数）またはタンパク質（単数または複数）であり、さらに、用いる方法は、電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールト、および／またはレトロウイルス／レンチウイルスの組込みまたは他の細胞のゲノムのランダムな変換を避ける別のアプローチである。
別個の好ましい実施形態において、分化している細胞の集団が、選択される細胞から産生する限り、他の核酸（単数または複数）またはタンパク質（単数または複数）は、単一の遺伝子またはその一部に対応する核酸（単数または複数）またはタンパク質（単数または複数）と協力して使用することができる（具体的には、本明細書で命名したもの、本明細書に記載の方法によって発見されたもの、他の公表された方法によって発見されたもの、および／または望ましい分化の様式を開始できることが公知のもの）。
別個の好ましい実施形態において、分化している細胞の集団が、選択される細胞から産生し、さらに用いる方法が、電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールト、および／またはレトロウイルス／レンチウイルスの組込みまたは他の細胞のゲノムのランダムな変換を避ける別のアプローチである限り、他の核酸（単数または複数）またはタンパク質（単数または複数）は、単一の遺伝子またはその一部に対応する核酸（単数または複数）またはタンパク質（単数または複数）と協力して使用することができる（具体的には、本明細書で命名したもの、本明細書に記載の方法によって発見されたもの、他の公表された方法によって発見されたもの、および／または望ましい分化の様式を開始できることが公知のもの）。
ここで記されているどの核酸またはタンパク質配列の組み合わせも、Ｎｕｍｂおよび／あるいはＮｕｍｂｌｉｋｅに対応する配列を除くことで、望まれる細胞集団または性質が達成される限り、改変できることが理解されるべきである。
同様にして、ここ（または別のところ）に記されている分化を開始するための方法は、ここで記されている様式で得られた細胞だけでなくいかなる誘導されたもしくは誘導されていない多能、多能性または自己再生する幹細胞、または他の選択された細胞に利用することができることも理解すべきである。
選択された細胞の供給源
選択された細胞の集団は、様々な幹細胞、前駆細胞また体細胞から得られるであろう。しかしながら核が欠損している体細胞（例：成熟したヒトの赤血球細胞）は、とりわけ排除された。選択された幹細胞は、存在する細胞株から得られるかまたは貯蔵されている、バンク化されている、または凍結保存されている供給源から単離されるであろう。典型的な幹細胞の供給源は、骨髄、末梢血、胎盤血、羊水（例：Ｄｅ Ｃｏｐｐｉ ｅｔ ａｌ．２００７）、靭帯血（例：Ｚｈａｏ，ｅｔ ａｌ．，２００６；Ｔｉａｎ ｅｔ ａｌ．，２００７）、脂肪組織（例：Ｇｉｍｂｌｅ ｅｔ ａｌ．， ２００７；Ｍａ ｅｔ ａｌ．，２００７）、ヒト以外の胚などである。循環白血球や他の幹細胞ではない細胞は、同様に、選択され、結果として多能、多能性および／あるいは自己再生能力を得る効果的な上記に記されたような培養条件におかれる。本発明において有用なたやすく利用できる他の体細胞の例には、リンパ球、上皮細胞（例：頬）が含まれる。本発明の中で利用するために選択された細胞の単離および収集は、当分野で知られているいかなる方法によって実施されてもよい。
動物に関する実施形態では、前立腺、精巣、胎児脳、腸から単離された幹細胞は、選択された細胞の好まれる供給源であるとして明らかにれている。
一つの好適な実施形態において、選択された細胞および／あるいはその子孫細胞は３次元の型で培養される。
本発明の更なる目的は、かかる器官または組織を必要とするとみなされる患者に移植するための患者に適合性があり、患者に特異的な組織や器官の生産に利用するための細胞を提供することである。ここにある方法（または同様の方法）によって与えられた多能性、多能および／あるいは分化する細胞は、そのような器官および／あるいは組織の生成のための技術とともに使用されることが明らかにている（例：Ｂｏｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，２００６．Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，２００６；Ｃａｍｐｂｅｌｌ ａｎｄ Ｗｅｉｓｓ，２００７）。そのような利用は、本発明により明確にされているカバー。例えば、ここで記された方法（または他の公表された方法）により生成されあるいは処理された多能性、多能および／あるいは分化する細胞は、正常な組織構造および／あるいは器官構造の再生のためにされた足場に関連して成長し得る（例：Ｙａｒｌａｇａｄａ ｅｔ ａｌ．， ２００５； Ｋｉｍら、１９９８； ＷＯ／２００３／０７００８４； ＥＰ１４８２８７１； ＷＯ０３０７００８４；米国特許２３９５６９８、７２９７５４０、６９９５０１３、６８００７５３；アイゼンバーグら、２００６）。
同様に、多能性、多能および／あるいは分化する細胞によって占領される足場は、死体の器官あるいは組織（例えば、骨、心臓、腎臓、肝臓、肺など）において宿主免疫細胞や他の望まれないまたは付属する宿主細胞が除去されるように処置され得たあとの、死体の器官または組織から得られてよい。（例えば、放射線、滅菌（Ｍｒｏｚら、２００６）により、および／あるいは各種脱細胞方法（米国特許６７３４０１８；６９６２８１４、６４７９０６４、６３７６２４４、米国特許第５０３２５０８、４９０２５０８、４９５６１７８、５２８１４２２、５５５４３８９、６０９９５６７、および６２０６９３１、４３６１５５２および６５７６６１８、６７５３１８１、米国出願第１１／１６２，７１５；ＷＯ／２００１／０４８１５３；ＷＯ／２００２／０２４２４４；ＷＯ ００３００２１６５；ＷＯ／２００１／０４９２１０；ＷＯ／２００７／０２５２３３；欧州特許ＥＰ１４８２８７１、ＥＰ１２４６９０３、ＥＰ１２４４３９６、ＥＰ０９８７９９８、ＥＰ１２４４３９６；ＥＰ１３３３８７０；Ｒｉｅｄｅｒら、２００４；Ｏｔｔら、２００８；Ｔａｙｌｏｒら、１９９８））。
同様にして、本発明における多能性、多能および／あるいは分化する細胞が、組織工学におけるインクジェット式印刷を利用する応用において用いられる（例：Ｂｏｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．， ２００６． Ｘｕ ｅｔ ａｌ．， ２００６；Ｃａｍｐｂｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， ２００７）。それゆえに、ここで記された方法により生成されるかあるいは扱われる細胞のような使用も、包含される。
別の好適な実施形態において、選択された細胞および／あるいはそれらの子孫細胞は、ハンギングドロップ法で培養される。
本発明の別の側面によれば、選択された細胞は、前もって遺伝子的に改変することができる。本発明の別の側面によれば、細胞を望まれる細胞集団に分化させることを促進するタンパク質またはポリペプチドをコードする選択された細胞はＤＮＡまたはＲＮＡで改変することもできる。
細胞集団の検査
一つの実施形態では、本発明による方法は、細胞株、ドナー源、臍帯血からの細胞のスクリーニング、および自己あるいはドナーの骨髄、血液、精原細胞、始原生殖細胞、口腔細胞、あるいは本発明において効果的なその他の細胞源からの細胞のスクリーニングが含まれる。選択した細胞は、有益な配列または治療ベクターを用いたトランスフェクションの成功を確認するため、ならびに問う分野で公知の任意の方法による分化の開始の成功を確認するために検査され得る（Ｇｕａｎ ｅｔ ａｌ．， ２００６；米国特許６，４３２，７１ １）。いくつかの実施形態では、標準的なＰＣＲ法および核酸ハイブリダイゼーションベースの方法を用いて、あるいは急速なタイピング方法を用いて、これらの細胞はスクリーニングされる。好適な実施形態では、レポーター遺伝子の発現に応じて細胞がスクリーニングされる。いくつかの実施形態では、抗生物質抵抗性遺伝子や蛍光たんぱく質（ＧＦＰなど）遺伝子などの導入遺伝子発現ベクターによりコードされたマーカー遺伝子の発現によって細胞はスクリーニングされる。
治療ベクターおよび有益な配列のスクリーニング
治療ベクターと有益な配列について、特定配列の検出のための当分野で知られている任意の方法を用いて、細胞がスクリーニングされ得る。それぞれ細胞サンプルは、同時に配列の多様性について調べられ得る。あるいは、多数のサンプルは、同時に検査され得る。
細胞の分化は、（ｉ）形態学的評価、（ｉｉ）逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応を利用した（ＲＴ−ＰＣＲ）、ノーザンブロットまたは遺伝子発現における変化を監視するためのマイクロアレイ技術、（ｉｉｉ） βチューブリンＩＩＩ（ニューロンに対する）（Ｏｚａｗａら、１９８５）などの特異的マーカーの細胞発現をアッセイすることを含むいくつかの手段によって監視できる。いくつかの実施形態において、細胞は、筋細胞中のミオシンプロモーター；ヒト心筋細胞における心臓α−アクチンプロモーター；インシュリン産生細胞におけるインシュリンプロモーター；ニューロン分化のためのニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーター、またはドパミン作動性ニューロンにおけるチロシンヒドロキシラーゼプロモーターのような神経伝達物質関連のプロモーターなど）のような細胞型特異的プロモーターの調節下で細胞型特異的マーカーまたはトランスジェニックマーカーの発現（例えば、抗生物質耐性または蛍光タンパク質発現）に基づくＦＡＣＳソーティングを用いた分化開始の成功についてスクリーニングする。いくつかの実施形態では、細胞は標準的なＰＣＲ法と核酸ハイブリダイゼーションベースの方法を使用してスクリーニングされる。特に好ましい実施態様では、細胞は急速なタイピング方法を使用してスクリーニングされる。
ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）タイプの検査
特定の実施の形態としては、選択された細胞はＨＬＡタイピングに適合するように選択される。ＨＬＡの遺伝子型は、当業者にとって既知の任意の方法により決定される。
検査に利用される細胞は、ドナーから直接採取された細胞、またはドナー細胞から作られた細胞株由来の細胞、または実用できる細胞源由来の細胞からなってよい。細胞は有益な配列および／あるいは治療ベクター、またＨＬＡタイプを一度にまたは個々に検査され得る。有益な配列でうまくトランスフェクトされ、適当なＨＬＡ遺伝子型を示すこれらの細胞は、患者への移植のために調製することができる。
特定の実施の形態としては、トランスフェクトされた細胞は、ＨＬＡタイピングすることなく移植される。他の実施の形態としては、細胞は適応するようにＨＬＡタイピングされる。
細胞の表現型を促進させる作用物質の検査
本発明はまた、選択された細胞および／あるいはその子孫細胞の望まれる細胞集団への表現型の変化あるいは分化を誘発する能力についてたんぱく質および因子をスクリーニングする方法を提供する。簡単に言えば、適切なｃＤＮＡライブラリから相補のＤＮＡ（ｃＤＮＡ）をコードするベクターは選択した細胞および／あるいはその子孫細胞にトランスフェクトされる。分化あるいはその他の表現型の変化を誘発する固有のｃＤＮＡのが特定されると、このようなｃＤＮＡは単離され、インビトロで適切な細胞（ＣＯＳ細胞など）でたんぱく質を生成するための適切な発現ベクターにクローン化され得る。
その後、上清を含むたんぱく質は、このような細胞から分泌された任意のたんぱく質が分化を誘発するかどうかを決めるのに選択した細胞培養物に適用できる。あるいは、候補の因子は、このような細胞から分泌された任意のたんぱく質が分化を誘発するかどうかを決めるのに選択した細胞培養物に適用できる（米国特許６４３２７１１参照）。本発明はまた、多能、多能性および／あるい自己再生を誘導する能力あるいは選択された細胞および／あるいその子孫細胞の分化を開始する能力について、核酸をスクリーニングするための方法を提供する。
これらの方法では、電気穿孔法、ナノカプセル、ナノヴォールト、リポソーム、レトロウイルス、レンチウイルス、および／あるいはその他の適用可能なトランスフェクション手段を用いて、選択されたｃＤＮＡ（あるいは適切なｃＤＮＡのライブラリからのｃＤＮＡあるいはその他の配列）をコードするベクターは、選択された細胞および／あるいはその子孫細胞に導入される。表現型の変化、多能、多能性および／あるい自己再生を誘発する固有のｃＤＮＡのが特定されると、このようなｃＤＮＡは単離され、適切な発現ベクターにクローン化され得る。このような変化を決定するアッセイには、本明細書の他のところで説明されるものが含まれる。同様に、上清をふくむたんぱく質が選択された細胞培養物に適用可能であるか、所望の変化を誘発するかを決定するのに適用、インビトロの適切な細胞（ＣＯＳ細胞など）で特定されたｃＤＮＡに対応するたんぱく質が生成されてよい。
最後にたんぱく質は、電気穿孔法、ナノカプセル、ナノヴォールト、リポソーム、レトロウィルス、レンチウィルスおよび、あるいは任意のトランスフェクションのその他の実用的な方法を用いて選択された細胞および／あるいはそれらの子孫細胞に導入してよく、さらにその結果得られた細胞は、多能、多能性、自己再生または分化の開始について、本明細書に記載したとおりに評価される。
患者への細胞移植
検査後、選択された細胞および／あるいはそれらの子孫細胞は、凍結保存され、培養する細胞株として維持されるか、患者に与えられ得る。選択された細胞は、当該分野で知られている任意の手法により、凍結保存されまたは維持され、将来の移植術のために保存される。
できれば、検査される細胞は、容易に採取できる、入手が容易な供給源から得る。
ＨＩＶ抵抗性細胞の生成に関して：本発明における標的となる体細胞および幹細胞はＨＩＶに感染しうる細胞に分化できるあらゆる種類であり得、ＨＩＶの転写および／あるいは複製を維持でき、ＨＩＶの免疫反応を変更でき、エイズへの進行を遅らせうる種類の細胞でありうる。このような幹細胞には、精原細胞、始原生殖細胞、造血幹細胞、末梢血液細胞、胎盤の血液細胞、羊水細胞、臍帯血細胞、口腔細胞、脂肪組織の細胞（これらの組織由来幹細胞を含む）、再プログラムされた細胞、誘導多能細胞、誘導多能性細胞など、人間以外の胚細胞、および／または血液や免疫細胞は、ＨＩＶ標的細胞およびその他の細胞を形成できるその他の細胞型に由来する多能性細胞が含まれるが、これに限定されない。
「有益な配列」を発現する治療ベクターは、ＨＩＶの複製や転写を維持する能力がより少ないトランスフェクトした細胞または感染細胞をもたらすことを意図する。「有益な配列」を発現する遺伝子ベクターは、そのようなベクターから得られるいかなるウィルスと同様、ここでは“治療ベクター”と名づけられている。
検査後、望まれる治療ベクターでトランスフェクトし、有益な配列を発現している細胞（ＨＬＡ遺伝型と適合性を有するかまたは有しない）は、細胞を分裂させ安定的な細胞株として保たせる標準の培養法を用いて（米国特許６４３２７１１および５４５３３５７を参照として本明細書に引用）生体外（試験管内）で拡大され得る。その代わりに、これらの細胞は、患者に投与することができ、さらに生体内で拡大することができる。
選択された細胞は、この技術分野で良く知られた任意の方法で低温保存され、将来の移植術のために保存することができる。
患者への望ましい細胞集団の移植
特定の実施の形態としては、細胞集団は移植に先立って幹細胞のために富化される。幹細胞を選択する様々な方法は、この技術分野では良く知られている。例えば、蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）を介して分取するため、細胞サンプルを、分化していない造血幹細胞（例：、ＣＤ３４、ＣＤ５９、Ｔｈｙｌ、ＣＤ３８ ｌｏｗ、ｃ-ｋｉｔ ｌｏｗ、ｌｉｎ−ｍｉｎｕｓ）を認識する単クローンの抗体によって富化することができる。その他の実施の形態としては、選択された細胞のサンプルは、富化させられることなく移植される。
いくつかの実施の形態としては、骨髄の内生幹細胞は、治療幹細胞の移植に先立って排除されるか減少される。治療幹細胞は、有用な配列または治療ベクターを含む幹細胞として定められる。いくつかの実施の形態としては、移植過程は、以下の段階を含んでよい。
（１）訓化、（２）幹細胞注入、（３）好中球減少段階、（４）移植段階、そして（５）移植後期間。
いくつかの実施の形態としては、一般的に望まれる細胞（例：骨髄幹細胞）を生成する内在性の幹細胞は、移植に先立って排除または減少される。化学療法、放射線などおよび／あるいは米国特許６２１７８６７にあるものに類似した方法は、移植術に適切な移植のために骨髄の状態を整える手法として利用してよい。最終的には治療幹細胞は、この技術分野で知られている任意の方法を用いて患者に移植してよい。
Ｎｕｍｂ／Ｎｕｍｂｌｉｋｅとその他の導入遺伝子をコードするベクターの設計
ある実施の形態としては、ｎｕｍｂｌｉｋｅ／ｎｕｍｂアイソフォームをコードする核酸配列でのトランスフェクションは、ウィルストランスフェクションを介して完成される。「Ｎｕｍｂ／Ｎｕｍｂｌｉｋｅをコードするベクター」という用語は、ｎｕｍｂｌｉｋｅ／ｎｕｍｂアイソフォームおよび／あるいはｎｕｍｂｌｉｋｅまたはｎｕｍｂアイソフォームを標的とする合成オリゴヌクレオチドをコードする核酸配列だけでなく、あらゆる付加的な導入遺伝子配列、合成オリゴヌクレオチドなど、およびそれらのベクター配列に組み込まれた任意の関連ウィルス上清を組み込んでいるベクターのことを指す。
Ｎｕｍｂ／Ｎｕｍｂｌｉｋｅをコードするベクターは、発現ベクターを含みうる適切な発現ベクターは、ＤＮＡまたはＲＮＡを真核細胞へトランスフェクトするために用いることができる。そのようなベクターは、これらに限られるわけではないが、例えばバクテリアベクター、真核細胞ベクター、例えばイーストベクター、真菌ベクターなど、またそれらに限定されないが、アデノウィルスベクター、アデノ関連ウィルスベクター、レトロウィルスベクターなどのウィルスベクターがある。用いることができるレトロウィルスベクターの例としては、これらに限られるわけではないが、モロニーマウス白血病ウィルス、モロニーマウス肉腫ウィルスや、ラウス肉腫ウィルス、ＦＩＶ、ＨＩＶ、ＳＩＶ、および混成ベクター由来のものを含む。
Ｎｕｍｂ／Ｎｕｍｂｌｉｋｅをコードするベクターが生体外および／あるいは生体内の細胞へトランスフェクトするためにも用いられ得ることが明らかにされている。トランスフェクションは、この技術分野では知られた任意の方法により行うことができ、特にウィルスパッケージ細胞から生成されたウィルスを用いて行うことができる。このようなウィルスは、様々な細胞タイプに感染できるようキャプシド形成することができる。言うまでも無く、選択された細胞タイプおよび／あるいはその子孫細胞の感染を可能にする任意のキャプシド形成技術は、本発明における状況において実用的である。
ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）の遺伝子治療ベクターの設計
“治療用ベクター”は発現ベクターを含んでいてもよい。適切な発現ベクターはＤＮＡあるいはＲＮＡを真核細胞にトランスフェクトするために使用できるベクターである。このようなベクターには、それらに限定されないが、例えば、細菌ベクター；例えばイーストベクターおよび真菌ベクターなどの真核細胞ベクター；および、それらに限定されないが、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、およびレトロウイルスベクターなどのウイルスベクターが挙げられる。使用できるレトロウイルスベクターの例は、モロニーマウス白血病ウイルス、モロニーマウス肉腫ウイルス、およびラウス肉腫ウイルス、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ＨＩＶ、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）およびハイブリッドベクターが含まれるが、これらに限定されない。
治療的ベクター（単数または複数）を用いて試験管内および／あるいは生体内で標的細胞にトランスフェクトできることが本明細書に開示される。トランスフェクションは、当技術分野で公知の任意の手技によって、とりわけ、ウイルスパッケージ細胞から産生されるウイルスを介して実施できる。そのようなウイルスは、ＣＤ３４＋細胞および／またはＣＤ４＋細胞に感染できるようにカプセル形成されてよい。しかしながら、幾つかの例において、他の細胞形がＣＤ４またはＣＤ３４タンパク質が関与しない手段でトランスフェクトされる。それにもかかわらず、そのような細胞型への感染を可能にする任意のカプセル形成技法が、従って、本発明の開示に含まれ得る。
異なるエンベロープタンパク質を用いる仮タイピングは、ウイルスベクターおよび治療用ベクターによって形質導入が可能になる宿主細胞の範囲を拡大し、特に、水疱性口内炎ウイルスのエンベロープ糖タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）で仮タイピングする場合、ウイルスを高力価に濃縮することができる（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．， １９９８；Ｒｅｉｓｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２０００）。
ベクター構築
本発明に用いられるウイルスベクターは、ハイブリッドベクターを含む様々な種類があるだろう。例えば、ベクターは天然ゲノムのとても小さな断片だけを含む（Ｚｕｆｆｅｒｅｙ ｅｔ ａｌ．， １９９８）、第三世代のレンチウイルスであろう。導入遺伝子をコードするベクターの生成は、標的細胞への感染のあとに全長ベクターＲＮＡの生成を 排除する、自己不活化転移ベクター（Ｚｕｆｆｅｒｅｙ ｅｔ ａｌ．， １９９８； Ｍｉｙｏｓｈｉ ｅｔ ａｌ．， １９９８）も含み得る。
ウイルスベクターは、複製に必要である、ある種のウイルスプロテインを発現し損なうことによる、複製不可能なものを利用されるだろう。しかしながら、ヘルパーウイルスが治療用ウイルス複製を可能にすることも考えられる。この可能性は自己不活性化ベクターを使用することで減じることができる。
好ましい実施の形態にて、導入遺伝子配列はユビチキンプロモーター、，Ｕ６プロモーター、ＥＦｌ アルファプロモーター、ＣＭＶプロモーター、調節可能なプロモーターおよび、あるいは、望まれる細胞タイプの特定なプロモーターによって駆動される。
ウイルス向性
好ましい１つの実施の形態としては、本発明のＮｕｍｂ アイソフォーム／ Ｎｕｍｂｌｉｋｅをコードするベクター、治療用ベクターおよび、あるいはその他のトランスジェニックベクターに由来するウイルスは、水疱性口内炎ウイルスエンベロープ糖タンパク質によって仮タイピングし、ウイルス濃度を高力価にすることができ、ＣＤ３４＋細胞の感染を促進する。
配列選択
ＮＵＭＢまたはＮｕｍｂｌｉｋｅ配列（Ｅｎｔｒｅｚ−Ｐｕｂｍｅｄ データベースを用いて検索可能）として参照される任意の配列に７０％以上同一である（または相補性である）任意の配列の使用は、本発明により書かれた方法により利用されるならば、本発明によって包含される。
本発明は、ＨＩＶ １ とＨＩＶ−２ウィルス（両方とも本明細書ではＨＩＶと呼ぶ）による哺乳類細胞の感染のしやすさを顕著に減少させることができる配列を誘導する遺伝子ベクターに一部関係する。
本発明は、有害なＨＩＶ／ＡＩＤＳ病の過程に重要な遺伝子発現を減少させる新規の合成オリグヌクレオチドの組み合わせを明らかにする。
共受容体に「ノックダウン」をもたらす合成オリゴヌクレオチドとＴＡＲおよびＲＲＥデコイ配列の発現との組合せの望ましいところは、個々の細胞において、１）ＨＩＶ感染、２）ＨＩＶ転写、および３）ＨＩＶ複製を同時に標的とする組合せの複数の遺伝子治療アプローチが、これらの単独でのアプローチのどのものよりも高い治療的有益性を生み出すらしいという、本明細書で述べた命題に起因している。
治療用ベクターは、ＨＩＶの複製や転写の持続性を減少させるようトランスフェクトされた細胞または感染細胞に対しもたらすことを意図した、「有益な配列」を発現する。「有益な配列」を発現する遺伝子ベクターならびに、そのような遺伝子ベクターに由来するいかなるウィルスは、「治療用ベクター」とここで名づけられている。
本発明では、一部にはＨＩＶ感染に対し感受性が強いかまたはＨＩＶを伝播できる細胞への遺伝子改変に向けられている。そのような細胞は、ここでは「標的細胞」と名づけられている。
本発明は、成熟したまたは未成熟の標的細胞、白血球、血液細胞、あらゆる幹／前駆細胞、および／あるいはそれらの子孫細胞のＨＩＶ感染に対する感受性を減少させる組成物と治療用のウィルスベクターの使用方法を与える。
また本発明は、再プログラムされた細胞、誘発された多能細胞、誘発された多能性細胞および／あるいはそれらの子孫細胞のＨＩＶ感染に対する感受性を減少させる組成物と治療用のウィルスベクターの利用方法を与える。
本発明の更なる目的は成熟したあるいは未成熟の標的細胞、幹／前駆細胞（再プログラムされた細胞、誘発された多能細胞、誘発された多能性細胞を含む）および／あるいはそれらの子孫細胞が免疫不全ウィルスの複製や転写を維持する能力を減少させることである。
本発明のもう１つの目的は、成熟または未成熟の標的細胞、その他の静止状態の細胞、幹／前駆細胞および／あるいはそれらの子孫細胞において有効で長期的に治療用配列発現することである。
ある局面では本発明は、ＨＩＶ感染を予防しまたは治療する方法も提供する。その方法は、治療用ベクターまたは配列をトランフェクトされた幹細胞を、ＨＩＶに感染した患者に移植することを含む。
有効な配列は、ＨＩＶウィルスが細胞に感染する能力、ウィルスＤＮＡを転写する能力、または感染した細胞内で複製する能力を減少させるまたはＨＩＶ感染を中和する細胞の能力を高めるものだろう。
特定の実施形態においては、、有効な配列とはＨＩＶの侵入を妨げる合成オリゴヌクレオチドを示し、いかなるＨＩＶ共受容体（ＣＸＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ２ｂ、 ＣＣＲ３、 およびＣＣＲｌなどに限らず）に対抗するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡまたはｍｉＲＮＡが挙げられる。
好ましい実施形態では、治療用ベクターとは、ＣＸＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲｌ、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＸＣＲ６および／あるいは ＢＯＢなどのＨＩＶ共受容体の１つまたはそれ以上を標的にする、合成オリゴヌクレオチドを含む。
別の好ましい実施形態では、治療用ベクターは主要なＨＩＶ共受容体であるＣＸＣＲ４ とＣＣＲ５を標的にする、合成オリゴヌクレオチドなどがある。
更なる好ましい実施形態では、治療用ベクターは、１つまたはそれ以上のＨＩＶ逆転写酵素、インテグラーゼ、タンパク分解酵素などのＨＩＶ酵素を標的にする合成オリゴヌクレオチドを含む。
合成オリゴヌクレオチドとして適切な配列は、１）コンピュータのアルゴリズムにより、標的配列の減少に効果的であると予想でき、２）標準の定量的ＲＮＡ分析検査および、酵素活性検査で７０パーセントを超えるか、またはそれより劣っていても治療的である度合いで標的酵素の量を減少させる能力のあるものである。
「標的配列」という言葉は、特定の配列が、ウイルスゲノムのヌクレオチド配列と少なくとも７０％一致するヌクレオチド塩基配列を有しているあるいはその補足物（例えば、そのようなウイルスゲノム配列に同じかまたは相補性である）、あるいは対応するＲＮＡ配列であることを示す。本発明の特定の実施形態においては、この言葉は、配列が、オリゴヌクレオチドが指向される特定のウイルスのウイルスゲノム配列あるいはその相補配列と少なくとも７０％一致することを示す。
合成オリゴヌクレオチドの様々な種類のいずれも、治療用ベクターのトランスフェクションを介して発現されてもよい。また、本発明はこのようなオリゴヌクレオチドのあらゆる可能な組み合わせに関する。
一つの好適な実施形態において、合成オリゴヌクレオチドの配列は標的細胞、特定のプロモーターにより駆動される。別の好ましい実施態様では、合成オリゴヌクレオチド配列はＵ６プロモーターにより駆動される。
合成オリゴヌクレオチドは、デコイＲＮＡと同じ治療用ベクターに含めてよい。
デコイＲＮＡ
デコイＲＮＡは、特定のたんぱく質に結合して、その機能を抑制するのに効果を示すＲＮＡの配列である。
一つの好ましい実施形態では、治療用ベクターは、複数のデコイＲＮＡ配列から成る。
更なる実施形態では、デコイＲＮＡ配列は、デコイ配列の安定性を与える配列に隣接する。
その他の好ましい実施形態では、デコイＲＮＡ配列はＲＲＥおよび／あるいは ＴＡＲデコイ配列である。
一つの実施形態では、ＲＲＥとＴＡＲデコイ配列は、ＨＩＶ−２から操作されるＴＡＲとＲＲＥ配列である。他の好ましい実施の形態としては、デコイ配列は、Ｐｓｉ要素デコイ配列をも含む。
一つの好ましい実施形態では、デコイ配列はそれぞれＵ６プロモータによって駆動される。
別個の好ましい実施の形態としては、デコイ配列は標的細胞の特定プロモータによって駆動される。
一つの好ましい実施の形態としては、治療用ベクターは、ＨＩＶ−２ ＴＡＲ および／あるいはＲＲＥデコイ配列を組み合わせて合成ヌクレオチド配列をコードすることによって、ＨＩＶのライフサイクルの複数の段階を標的とする。
別個の好ましい実施の形態としては、ベクターはｍｉＲＮＡオリゴヌクレオチド配列を含む。
別個の好ましい実施の形態としては、ベクターはｓｈＲＮＡオリゴヌクレオチド配列を含む。
別個の好ましい実施の形態としては、ベクターはｓｉ ＲＮＡオリゴヌクレオチド配列を含む。
別個の好ましい実施の形態としては、ベクターはＲＮＡｉオリゴヌクレオチド配列を含む。
別個の好ましい実施の形態としては、ベクターはリボザイム配列を含む。
別個の好ましい実施の形態としては、ベクターは合成オリゴヌクレオチドクラスの組み合わせを含む。
更なる実施の形態としては、合成ヌクレオチド配列は、ＣＣＲ５、 ＣＸＣＲ４などのＨＩＶ共受容体を標的にする。
更なる実施の形態としては、合成ヌクレオチド配列はインテグラーゼ、プロテアーゼ、逆転写酵素、ＴＡＴなどのＨＩＶ酵素を標的にする。
更なる実施形態としては、リボザイム配列は、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ４などのＨＩＶ共受容体や、インテグラーゼ、プロテアーゼ、逆転写酵素、ＴＡＴなどのＨＩＶ酵素を標的にする。
一つの好ましい実施形態では、ウィルスは治療用ベクターを用いて生成され、ウィルスはシュードダイピングされる。
一つの好ましい実施形態では、ウィルスは治療用ベクターを用いて生成され、ウィルスはシュードタイプされずに、天然のＨＩＶトロピズムを見せる。
一つの好ましい実施形態では、治療用ベクターは、ウィルスベクターである。
一つの好ましい実施の形態としては、治療用ベクターは、レンチウィルスベクターである。
一つの好ましい実施形態では、治療用ベクターは第三世代のレンチウィルスベクターである。一つの好ましい実施形態では、治療用ベクターは、合成ヌクレオチドクラスの組合せを含む。
好ましい一つの実施形態では、合成ヌクレオチド配列の発現は、ＥＦ−１ ａｌｐｈａプロモータまたは他の標的細胞の適正なプロモータによって駆動される。
一つの好ましい実施形態では、合成ヌクレオチド配列の発現は、Ｕ６プロモータまたは他の標的細胞の適正なプロモータによって駆動される。
一つの好ましい実施形態では、合成ヌクレオチド配列の発現は、ＥＦ−１ ａｌｐｈａとＵ６の組み合わせおよび／あるいは、他の標的細胞の適正なプロモータによって駆動される。
一つの好ましい実施の形態としては、ＥＦ−１ ａｌｐｈａは、Ｕ６プロモータがＲＮＡデコイの遺伝子発現を操作する一方で、ｍｉＲＮＡの遺伝子発現を駆動する。
好ましい一つの実施形態では、ＥＦ−１ ａｌｐｈａは、Ｕ６プロモータがＲＮＡデコイの発現を駆動する一方で、ｓｉＲＮＡ配列の発現を駆動している。
好ましい一つの実施形態では、ＥＦ−１ ａｌｐｈａは、Ｕ６プロモータがＲＮＡデコイの発現を駆動する一方で、ｓｈＲＮＡ配列の発現を駆動している。
好ましい実施態様では、治療用のベクターはＣＸＣＲ４に向けられた複数のｍｉＲＮＡ配列、ＣＣＲ５に向けられた複数のｍｉＲＮＡ配列、ＨＩＶ−２ ＲＲＥデコイ配列および、ＨＩＶ−２のＴＡＲデコイ配列を含み、およびベクターはウイルスベクターである。
好ましい実施態様では、治療用ｖｃｃｔｏｒ含む治療は、薬理学的治療を含む抗レトロウイルス療法の他のモードと組合わされる。治療用ベクターとの組み合わせに適した抗レトロウイルス療法は、治療用ベクターとの組み合わせにおける付加または相乗効果のある治療である。
ＨＩＶの遺伝子治療のための標的となる細胞には、成熟末梢血Ｔリンパ球、単球、組織マクロファージ、Ｔ細胞の前駆細胞、マクロファージ−単球前駆細胞、および／あるいは臍帯血、末梢血、および占有骨髄スペース中に見出されるような多能造血幹細胞が含まれ得るが、これらに限定されない。
本発明は、ＣＤ４＋ Ｔ細胞、マクロファージ、Ｔ細胞の前駆細胞、マクロファージ−単球前駆細胞、ＣＤ３４＋幹細胞／前駆細胞および／またはその他の任意の静止細胞、分裂細胞で、体外あるいは体内でＨＩＶ標的細胞に分化可能な幹細胞または前駆細胞、ＣＤ４ ＋ Ｔ細胞、マクロファージ、Ｔ細胞の前駆細胞、マクロファージ−単球前駆細胞、および／またはＣＤ３４ ＋幹細胞／前駆細胞のトランスフェクションに関する。そのため、トランスフェクトされた細胞は、インサイチュでの内因性の細胞あるいは、他の身体部位、あるいはその他の個々のドナーから取り出した外因性の細胞であってよい。この目的のために選択された細胞を本明細書では「選択された細胞」と呼ぶ。
同様に、自己再生、多能、および／あるいは多能性幹細胞（再プログラムされ、誘発された多能性細胞を含む）は、ＨＩＶの遺伝子治療のための別の論理的なターゲットを表し、その使用は、特に本発明に包含される。本プロセスの一実施形態では、選択された細胞（スチールファクター、皮膚幹細胞、臍帯細胞、始原生殖細胞（ＰＧＣ）、精原細胞、アクセス可能な任意の体細胞など）は、１）培養中に１つあるいは複数のサイトカイン（造血幹細胞因子、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、カーディオトロピン−１、ＩＬ−１１、ＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ、ＧＰ−１３０、ＣＮＴＦ、ＩＧＦ−Ｉ、ｂＦＧＦ、および／あるいはオンコンスタチン−Ｍなど）を用いて培養され、２）当該技術分野（本明細書で参考として援用されたＵＳＰａｔｅｎｔ ５６７７１３９に記載されたものなど）で既知の任意の方法を用いた、あるいはその他の標的細胞に関して、ＵＳ Ｐａｔｅｎｔ ５６７７１３９に類似した方法による分化の前に治療用ベクターまたは有益な配列でトランスフェクトされる。
別の実施形態では、トランスフェクションの前にさまざまな段階を実施することが望ましいかもしれない。別個の実施の形態としては、多能性の幹細胞集団を生成する目的で、上記の培養の段階だけが行われることが望ましい。
その他の細胞培養条件の他、幹細胞および前駆細胞の増殖／増殖のためのＬ１Ｆおよび造血幹細胞因子の適切な濃度についてはすでに説明している（例えば、本明細書において参考用に引用されているＵＳ Ｐａｔｅｎｔ６４３２７１１および５４５３３５７）。その他の適切なプロトコルおよび参照のサイトカイン濃度については、Ｋｏｓｈｉｍｉｚｕ ｅｔ ａｌ．、１９９６； Ｋｅｌｌｅｒｅｔ ａｌ．、１９９６； Ｐｉｑｕｅｔ−Ｐｅｌｌｏｒｃｅ、１９９４； Ｒｏｓｅ ｅｔ ａｌ．、１９９４； Ｐａｒｋ ａｎｄ Ｈａｎ、２０００； Ｇｕａｎ ｅｔ ａｌ．、２００６； Ｄｙｋｓｔｒａ ｅｔ ａｌ．， ２００６において説明されている。
標的細胞の集団は、体細胞、幹細胞、前駆細胞を含むであろう。幹細胞はおそらく、既存の細胞株に由来するか、貯蔵、バンク化、または低温保存された供給源から分離されたものである。幹細胞の典型的な供給源は、骨髄、末梢血、胎盤血、羊水液、臍帯血、脂肪組織、ヒト以外の胎芽などである。
体細胞、特に循環白血球やその他の非前駆細胞／幹細胞も同様に幹細胞／前駆細胞について有効な上記したと同じ培養条件におかれてよく、結果として、それらの細胞は幹細胞／前駆細胞の性質を得る。
本発明は、ＨＩＶ感染および／あるいはＨＩＶ複製へ相対的に抵抗性があるよう作られ得る幹細胞／前駆細胞から標的細胞を生成することも明らかにする（ＵＳＰａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ２００３００９９６２１など）。
しかしながら、以前に増やした幹細胞／前駆細胞／白血球を所望の細胞に分化させる任意の方法は、ＨＩＶ感染および／あるいはＨＩＶ複製および／あるいはＨＩＶ転写に対し相対的に抵抗性のある機能的標的細胞が生成される限り、本発明の範囲内で働き得る。
好ましい一つの実施形態では、治療用ウィルスベクターは、ネイティブＨＩＶ株が感染し得るあらゆる細胞に対し感染する能力を治療用ウィルスに与えるネイティブＨＩＶウイルスからの１つないしそれ以上のエンベロープたんぱく質でパックされる。
本発明で使用するために選択された細胞は、幾つかの例では手に入りやすい細胞である（例えば、臍帯幹細胞、骨髄幹細胞、精巣の精原細胞、および始原生殖細胞、羊水液から単離された幹細胞、皮膚から単離された幹細胞など）。これら細胞はこの技術分野で知られている任意の方法により、それらが存在する組織から単離することができる。
他の選択された細胞は、再プログラムされた細胞、誘導された多能細胞、誘導された多能化細胞などから成るであろう。
本発明の一つの側面によれば、選択した細胞から、目的の細胞株、細胞型、あるいは細胞クラスを生成する方法が提供される。一般的に、この方法は、最適な成長速度で選択した細胞の成長を促進する条件下での選択した細胞および／あるいはその子孫細胞の培養を含む。
次に、生成された細胞集団は通常最適な速度未満の速度で、および細胞の必要な細胞株、細胞型、細胞クラス（ＣＤ４ ＋ Ｔ細胞など）への分化を促進する因子の存在下で細胞の成長を促進する条件下で培養される。
発明はこの他に、治療用ベクターによるトランスフェクション前あるいは後に当該技術分野で既知の手段（ＵＳ Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ２００６００９９１７７など）によって、選択した細胞および／または子孫細胞の培養での増殖を開示する。このような方法はまた、ＬＩＦ、スチールファクター、Ｉｌ−６、ＩＬ−７、オンコンスタチン−Ｍおよび／あるいはカーディオトロピン−Ｉ、およびその他の成長促進サイトカインなどによる培養を含む。
本発明はさらに、適切なサイトカインおよびＭ−ＣＳＦ（ＣＳＦ−１）、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−７、ＣＤ４＋Ｔ細胞分化を促進する任意のサイトカインなどコロニー刺激因子などの成長因子を含む培地での更なる培養により治療用ベクターでトランスフェクトされた細胞の所望の細胞型への定方向分化も開示する。
トランスフェクション
選択した細胞および標的細胞の遺伝子改変は、それらが外因性の細胞あるいは内因性の細胞であるかに関係なく、当該技術分野において既知であり、公開済みあるいは未公開の方法（Ｕ．Ｓ． Ｐａｔ． Ｎｏｓ． ６，４３２，７１１， Ｕ．Ｓ． ０５，５９３，８７５， Ｕ．Ｓ． ０５，７８３，５６６， Ｕ．Ｓ．５，９２８，９４４， Ｕ．Ｓ． ０５，９１０，４８８， Ｕ．Ｓ． ０５，８２４，５４７など）、あるいはその他の一般的に通用する手段によって実施可能である。宿主細胞を形質転換するための適切な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｐｒｅｓｓ （１９８９））およびその他の研究室の教科書に記載されている。
うまくトランスフェクトした細胞をＲＮＡの発現アッセイと形態学的解析に加えて、抗生物質耐性遺伝子などのマーカーを含む選択プロトコルによって識別できる。適切なレベルで適切な外因性のＤＮＡを発現するうまくトランスフェクトした細胞から生成されたクローンは、凍結保存（当該技術分野で既知の適切な冷凍保存方法を用いて）によって細胞株として保存できる。
選択可能なマーカー（例えば、抗生物質耐性遺伝子）は、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、アンピシリンとブラストサイジンなどの薬に耐性を与えるマーカーを含んでいてもよい。対象となる遺伝子を含む細胞は、選択可能なマーカー遺伝子を組み込んだ細胞が生き残り、それ以外の細胞は死滅する薬品選択によって特定できる。
本発明の実施の形態における理論上の根拠は、ここで記されている通りである。しかしながら、ここでの議論は本発明を縛るとか制限するものではない。当業者は、本発明の理論上の根拠を記すために用いられたモデルに関わらず本発明の様々な実施形態が実施可能であることを理解するであろう。
本発明は、以下の例に関して記載され例示されるであろう。しかしながら、本発明の範囲は、これらに限定して示されたわけではない。
例１．本発明において使用するための適切なトランスジェニックベクターの構築
適切なＥＧＦＰ−ＮｕｍｂおよびＥＧＦＰ−Ｎｕｍｂｌｉｋｅ、およびＥＧＦＰ−Ｘレンチウイルスベクター（ここでＸは本発明で説明した任意の導入遺伝子）は適切なウイルスベクターにクローニングによって生成されることができる（例えば、二つの遺伝子ＨＩＶ−ＥＧＦＰ−ＨＳＡベクター）（ライザーら、２０００））。アダプタプライマーは、ＮｕｍｂｌｉｋｅとＮｕｍｂアイソフォームｃＤＮＡのＰＣＲ増幅のためおよび遺伝的ベクター中へのクローニングのために選択することができる。クローニングのための準備では、遺伝子ベクターは酵素で消化される。その後、各導入遺伝子のｃＤＮＡは、先にＨＳＡのｃＤＮＡで占められたネフコーディングに挿入される。ＥＧＦＰ（強化緑色蛍光たんぱく質）と細胞集団に適切なプロモーター（すなわちＣＭＶまたはＥＦｌアルファなど）は、その前に、ウイルスコード領域に挿入された。遺伝子構築物は、ベクターバックボーンを含むおよび異種核酸配列に作動可能に連結するプロモーターを調節するトランスアクチベーターを含むことができる。
採用してよいレトロウイルスベクターの例は、これらに限定されないが、Ｍｏｌｏｎｅｙマウス白血病ウイルス、Ｍｏｌｏｎｅｙマウス肉腫ウイルス、およびラウス肉腫ウイルス、ＦＩＶとＨＩＶ由来のものを含む。適切な発現ベクターは、真核生物の細胞にＤＮＡまたはＲＮＡのトランスフェクションに使用してよい発現ベクターである。このようなベクターには、これらに限定されないが、例えば、細菌のベクター；真核生物のベクター（例えば、酵母のベクターと真菌のベクター）；およびウイルスベクター（これらに限定されないが、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター）が含まれる。
複製能のないｐｃＤＮＡ ６．２／ＥｍＧＦＰ−Ｂｓｄ／Ｖ５−ＤＥＳＴベクターは、適切な発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の一例であり、標的配列を開裂する能力をもつｐｃＤＮＡ ６．２ＧＷ／ｍｉＲベクターから転移した合成オリゴヌクレオチド（例えば、ｍｉＲＮＡ）の発現を可能にする。これらのベクターには、より長いｐｏｌ ＩＩの転写産物（プレｍｉＲＮＡ）からの操作されたｍｉＲＮＡの切断を指向するための内因性ｍｉＲＮＡ由来の隣接配列およびループ配列が含まれる。
特定の内生ＲＮＡ種に対して向けられた複数のｍｉＲＮＡ配列の組合せは、標的細胞配列の遺伝子発現を減少させる成功を促進させる可能性がある。ｍｉＲＮＡ配列は、調節可能なまたは組織特異的プロモータに作動可能に連結していてよい。
遺伝子発現のためにレンチウィルスベクターを使用することによって生じる本発明の、Ｎｕｍｂ ／ Ｎｕｍｂｌｉｋｅコードベクターおよび／あるいは他のトランスジェニックベクターは、分裂細胞型と非裂細胞型のいずれにも安定的な形質導入することができるようになる。
好ましい実施の形態としては、結果として生じる本発明のＮｕｍｂ ／ Ｎｕｍｂｌｉｋｅコードベクターおよび／あるいは他のトランスジェニックベクターは、特定のｎｕｍｂアイソフォームおよび／あるいはｎｕｍｂｌｉｋｅの発現を減少させるかぎり、１つまたはそれ以上のプロモータによて駆動された複数の合成ヌクレオチド配列を含む。
例２：他の適したベクターの例は、レトロウィルスベクターである。レトロウィルスは、ＲＮＡゲノムを含むＲＮＡウィルスである。Ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ遺伝子は、末端長反復（ＬＴＲ）配列によって隣接される。５’ と３’ ＬＴＲ配列は、ｍＲＮＡの転写とポリアデルニ化を促進する。
レトロウィルスベクターは、調節可能なトランス活性化エレメント、内部リボソーム再侵入部位（ＩＲＥＳ）、選択マーカー、調節可能なプロモータによって操作された標的異種性遺伝子を与えることができる。
また、複数の配列を、複数のプロモーターの制御下で発現することができる。最後に、レトロウイルスベクターは、逆転写と組込みのために必要なシス作用配列を含んでいてよい。感染時には、ＲＮＡは、効率的にホストゲノムに組み込まれるＤＮＡに逆転写される。本発明の組換えレトロウイルスは、ネイティブなウイルスのレトロウイルス遺伝子、感染性遺伝子のいくつかが削除され、特定の例では、その代わりに細胞の遺伝子改変のための標的核酸配列に置き換えられるような方法で遺伝子改変される。配列は、天然型またはその変形型において、ＤＮＡまたはＲＮＡであってよい。
例３：本発明のＮｕｍｂ／Ｎｕｍｂｌｉｋｅコードベクター、および／または他のトランスジェニックベクターの生成のための例示の方法
本発明の、得られるＮｕｍｂ／Ｎｕｍｂｌｉｋｅコードベクター、および／または他のトランスジェニックベクターは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のウイルスパワーレンチウイルス発現システムマニュアル、２００７年に教えているものを含む。簡潔には、ＥｍＧＦＰに基づくカセットＰｍｌＩ−ＢＩｐＩフラグメントとしてｐＬｅｎｔｉ６／Ｒ４Ｒ２／Ｖ５−ＤＥＳＴベクターにクローン化され、一方、ｍｉＲ−長（ＰＲＲ＋）ｎｕｍｂアイソフォームかまたはｍｉＲ−短ｎｕｍｂアイソフォーム／ ｎｕｍｂｌｉｋｅカセットは、
同時にＢＰ反応によってｐＤＯＮＲ２２１に移入される。その後、調節可能なプロモーターとｍｉＲ −アイソフォームカセットは、改変されたｐＬｅｎｔｉ６／ＥｍＧＦＰに基づく／Ｒ４Ｒ２−ＤＥＳＴベクター中にマルチサイトＬＲ交差される。複数のベクターは、合成オリゴヌクレオチドと導入遺伝子カセットのさまざまな組み合わせを含むこの方法で生成することができる。
ｐＬｅｎｔｉ６／Ｒ４Ｒ２／Ｖ５−ＤＥＳＴベクター配列：
例４：治療用ベクターの生成の追加的方法
「パッケージ細胞株」は、ウィルスのｇａｇ、 ｐｏｌ、 ｅｎｖ構造遺伝子によって、正常細胞株にトランスフェクトしたまたは感染させて生じたヒトおよび／あるいは動物の繊維芽細胞株から得られる。その一方で、パッケージ細胞株は、ｐｓｉ配列のＲＮＡ欠陥を生む。従って、パッケージ細胞から生成されたウィルス粒子は、ｇａｇ、ｐｏｌ、またはｅｎｖ遺伝子を含まない。一度、ｐｓｉ配列を含む治療用ベクターのＤＮＡが、トランスフェクションまたは感染によって、パッケージ細胞に導入されると（治療用遺伝子とともに）、パッケージ細胞は治療用のＲＮＡを最終標的細胞（例：ＣＤ４＋細胞）へ移送する様々な能力を生成することができる。
治療用ベクターの「感染しやすい範囲」は、パッケージ細胞株によって決められる。
多くのパッケージ細胞株が、広範囲のヒトの細胞タイプに感染するのに適したウィルス生成のために入手できる。これらのパッケージ細胞株は、それでも普段自然では他の動物種に感染するウィルスから得られるキャプシド形成ができるウィルスベクターである。例えば、ＳＩＶ またはＭＭＬＶ由来のベクターは、ＧＰ １２０キャプシド形成細胞株によりパッケージされ得る。
治療用ベクターの上清を生成する例のプルコトルは以下の方法で得られる。
１．２０マイクログラムのレトロウィルスベクターが、１．５ｍｌのプラスチック・チューブ中でＨｅｐｅｓ緩衝生理食塩水（ｐＨ＝７．０５）０．８‐１ミリリットルのゆるやかなタッピングによって選別できるマーカー遺伝子（例えば、抗生物質耐性遺伝子）を含む２‐３マイクログラムのウィルスＤＮＡと混ぜ合わせられる。
２．７０マイクロリットルの２ＭＣａＣｌ ２ が、ゆるやかなタッピングを繰り返しながら混合液に入れられる。
３．チューブの中に、青い沈殿が初めて起こったら、生成物はパッケージ細胞（商業用ベンダーのいくつからでも）の３０％の密集した層にゆるやかに適用すべきであるＤＮＡ混合物は、パッケージ細胞から最初に培地を除いた後にのみ適用すべきである。
４．パッケージ細胞は、室温（２５℃）に置いて２０−３０分培養してから、３６‐３８度のインキュベーターに３．５時間入れられる。
５．３．５−４ミリリットルの１５％グリセロールを含むヘペス緩衝化生理食塩水を３分間加えて、次に細胞をＤｕｌｂｅｃｃｏの改変Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）＋１０％ ＦＢＳ ｘ２で洗浄する。
６．ＤＭＥＭ＋１０％ ＦＢＳをもどして加え、３７度で２０時間細胞を培養する。
７．取り除き、治療用のウィルス粒子を含む培養液を取り除いてろ過する。
過剰なウィルスの上澄みは、瞬時に保存されるかまたは濃縮され摂氏−８０度で保存される。上澄みは、標的細胞感染効率を増加させるため、５から８マイクログラムのポリブレンとともに保存される。別の方法で、ポリブレンは除かれるかまたは感染させる前に加えてよい。
安定的な生産者ラインは、
８．安定的な生産ラインは、分割パッケージ細胞株を１から２０、または１から４０に分割し、その後に、これらの細胞を最大１０日間（３日ごとに培地を交換する）選択薬（トランスフェクトした耐性遺伝子に対応する特定の抗生物質）を含む培地中で培養することによって確立することができる。
９．１０日のちに単離したコロニーは選びとられ、成長させて一定分量に分けられ保存のために冷凍される。
レトロウイルスの感染性／滴定アッセイは、２０％集密度で置かれたＮＩＨ ３Ｔ３細胞などの「テスト」細胞のコンフルエントな層にウイルス上清の規定ボリュームを適用して実施する。２〜３回の細胞分裂（ＮＩＨ ３Ｔ３細胞については２４−３６時間）の後、抗生物質を含む培地中で３７℃で培養された“テスト”細胞のコロニーがカウントされる。上清の力価は、これらのコロニー数から次の式により推定され：
コロニー形成単位／ｍｌ＝同定されたコロニーＸの０．５（分割因子）／ウイルスの液量（ｍｌ）
この推定値の精度は、“テスト”細胞の多くのプレートにわたり大液量の上清を試験することによって上昇する。
治療用ウィルスの上澄みの標的細胞へのアプリケーションは、臨床の状況に適した様々な方法により成される。
例５：選択された細胞のための成長培地
選択された細胞は、グルタミン、β−メルカプトエタノール、１０％（体積で）ウマ血清、ヒト遺伝子組換え白血病抑制因子（ＬＩＦ）で補充したダルベッコの改変最小必須培地（ＤＭＥＭ）で増殖／成長させることができる。ＬＩＦによって、細胞のフィーダー層上で選択した細胞を維持する必要がなくなり、（それもまた使用してもよく）、さらに、未分化、多能、または多能性の状態にある選択された細胞を維持するために必須であり、このような細胞をグルタミン、β−メルカプトエタノール、１０％（体積で）ウマ血清、およびヒト遺伝子組換え白血病抑制因子（ＬＩＦ）を補充したダルベッコの改変最小必須培地（ＤＭＥＭ）で維持することができる。ＬＩＦにより、細胞のフィーダー層上で細胞を維持する必要がなくなり、（それもまた使用してもよく）、さらに未分化状態にある細胞を維持するために必須である（米国特許６４３２７１１によって）。
選択した細胞をニューロン細胞へと分化開始するためには、細胞をトリプシン処理し、洗浄してＬＩＦを除き、１０％牛胎仔血清（ＦＢＳ）を補充したＤＭＥＭ中に置く。 ＤＭＥＭおよび１０％のＦＢＳ中に再懸濁した後、１×ｌＯ ６ 細胞を６０ミリメートルフィッシャー細菌学的グレードのペトリ皿中の、５ｍｌのＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、０．５マイクロモル（ｍｉｃｒｏ Ｍ）のレチノイン酸中におくが、そこでは細胞が小さな集合体を形成すると予想される。集合は、適切な細胞の分化に役立つ。適切なニューロン転写因子による高効率トランスフェクションが、ＤＭＥＭ培地、ＦＢＳ、およびレチノイン酸中におく前かその後におこることができる。（追加の詳細については米国特許６４３２７１１および５４５３３５７を参照）。
例６：ＨＬＡマッチング。 選択した細胞（例：臍帯血、またはその他の適する供給源および／あるいはそれらの子孫細胞からの細胞．）は検査され、遺伝子が改変され（オプション）、増殖させられ、望まれる細胞タイプ（オプション）への分化開始のために誘導することができる。それら細胞は、標準的な幹細胞移植プロコトルに従って移植される。特定の例として、細胞はＨＬＡマッチングなしに移植してよい。
例７：ごくまれな例では、生体内における細胞分裂または細胞分化を刺激するか抑制する目的で、導入遺伝子をコードするベクターを患者に導入することは適切であろう。
例８：選択された細胞の遺伝子改変
体外では外因性の細胞や、患者の内因性の細胞の遺伝子改変のいずれかを当技術分野で公知の公表されたか未公表の方法（米国特許第６，４３２，７１１、同第０５５９３８７５、同第０５７８３５６６、同第５９２８９４４、同第０５９１０４８８、同第０５８２４５４７など）または、他の一般に受け入れられた手順によって実施することができる。宿主細胞を形質転換するために適した方法をＳａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｐｒｅｓｓ（１９８９））、および他の研究室の教科書に発見することができる。うまくトランスフェクトした細胞はＲＮＡの発現アッセイと形態学的解析に加えて、抗生物質耐性遺伝子などのマーカーを含む選択プロトコルによって識別される。適切なレベルで適切な外因性のＤＮＡを発現するうまくトランスフェクトした細胞からクローンは、凍結保存（当技術分野で公知の任意の適切な凍結保存方法を用いて）によって細胞株として凍結保存することができる。
選択マーカー（例えば、抗生物質耐性遺伝子）として、Ｇ４１８、ハイグロマイシンとメトトレキサートなどの薬に耐性を与えるものなどを挙げることができる。関心のある遺伝子を含む細胞を、選択可能なマーカー遺伝子を組み込んだ細胞は生き残るが、そうでない細胞は死滅する薬剤選択によって識別することができる。
本発明は、本発明の「選択された細胞」としての、遺伝子改変の選択を開示する。遺伝子改変という用語は、当技術分野で公知の手段によって、天然または合成の核酸を選択した細胞および／またはその子孫細胞に、または不死化した細胞株および／またはその子孫細胞に導入することによって細胞の遺伝子型を変えることを指す。また遺伝子発現パターンの永続的な変化を誘発する培養条件は、本明細書においては遺伝子改変を表すことと考えられている。幹細胞の改変は、それらが宿主の脳、内因性ドナー源、外因性のドナー源、または細胞株に由来するものであろうと、特定の人間の病気、特に人間の神経系の病気、の治療に実行可能なアプローチを表している。
本開示に包含される遺伝的改変は、これらに限定されないが：ｉｎ ｖｉｖｏで実行される遺伝子改変；変更は、内因性または外因性の選択した細胞および／またはその子孫細胞が発現する代謝酵素の活性または量、；変更は、改変細胞たんぱく質の活性、量、または抗原性を変更する；シグナル伝達経路に関与するたんぱく質の活性または量を変更する改変；ＨＬＡのタイプを変更する改変；細胞の分化を変更する改変；腫瘍の可能性を変更する改変；細胞の分化を変更する改変；構造たんぱく質の量または活性を変更する改変；膜関連たんぱく質（構造または酵素的）の量または活性を変更する改変；活性やたんぱく質、ＤＮＡ修復および染色体の維持に関与するたんぱく質の活性または量を変える改変；細胞輸送に関与するたんぱく質の活性または量を変更する改変；酵素の活性または量を変える改変；シナプスの形成と維持に関与するたんぱく質の活性または量を変える改変；神経突起伸長または軸索伸長や形成に関与するたんぱく質の活性または量を変える改変；細胞内の抗酸化物質生成酵素の量または活性を変える改変；細胞たんぱく質の翻訳後修飾の変更につながる改変；細胞修復の他の側面に関与するたんぱく質の活性または量を変更する改変、および細胞の寿命を増加させる変更（テロメラーゼの生産など）が含まれる。上記たんぱく質のようなこのような蛋白質は、ヒトゲノムや他の動物、植物、ウイルス、または細菌ゲノム由来のＤＮＡやＲＮＡによりコードされることがある。本発明はまた、デノボ設計された配列包含する。
加えて、本発明は、病気の治療のための選択した細胞および／またはその子孫細胞のｉｎ − ｓｉｔｕ遺伝子改変に関連する。内因性幹細胞は、組織の物質への、または脳の脳室システムの適当な部分へのウイルス、レトロウイルス、リポソームなどを含むＤＮＡまたはＲＮＡベクターを直接の注入または適用することによってインサイチュで改変してよい。１９９２年以来、本発明者らは、この方法で、数千の幹細胞／前駆細胞や何千もの子孫細胞を改変している。本発明者らのデータは、前駆細胞を改変するこの方法が、神経系全体においてきわめて多くの種類の改変細胞をもたらすが、有害作用は決してもたらさなかったことを示している。
例９：遺伝子ベクターの宿主への導入
好ましい実施形態において、治療用ベクター（単数または複数）を宿主の血液、組織、神経性、骨髄などに導入することによって、本明細書に記載のベクターなどのベクターでインビボでトランスフェクトされる。最大の利益は、多数の内因性標的細胞を改変することによって達成することができる。これは、治療用ベクター（単数または複数）を静脈または動脈循環、筋肉組織などの特定の組織、または神経系に注射するための適当な大きさに作られたカテーテル様のデバイスまたはニードルを用いることによって実施してよい。好ましい実施形態において、ウイルスはＶＳＶ−Ｇエンベロープ糖タンパク質および天然ＨＩＶ−１ ｅｎｖタンパク質でシュードタイプされる。
例１０：神経系への注射
選択した細胞（成長培池または分化培池の何れか由来）の胎児神経系への移植または遺伝子ベクターを用いる内因性胎児細胞の遺伝子改変は、以下の様式で実施することができる：無菌状態の下では、子宮や胎児を超音波や放射線学の指針によって視覚化される。あるいは、胎児の頭蓋骨のランドマークの直接の識別を容易にするため、子宮が手術で露出されることがある。次に選択された細胞を注射によって（適切な大きさに作られたカテーテルまたは針を用いて）、脳室のシステム、胚ゾーンまたは神経系の物質に導入することができる。注射は、特定の場合では、母親の腹壁、子宮壁と胎児の膜を介して胎児になされることがある。注射の精度を直接観察、超音波、コントラスト、または放射性同位体に基づく方法、または当技術分野で公知の放射線学の指針のその他の任意の手段によって監視する。
適切な無菌の条件下では、胎児の頭蓋骨のランドマークの直接の同定は、定位および放射線学の指針と結びついた身体の検査および触診によるのと同様視覚的にも達成される。細胞培養後、選択された細胞または分化細胞の適切な量を注射または他の手段によって脳室のシステムは、胚のゾーン、または神経系の物質に導入することができる。注射の精度を直接観察、超音波、または他の放射線学の指針によって監視することができる。
ハンチントン病やパーキンソン病などの成人の神経系の特定の神経学的疾患では、脳の特定部分の細胞は、選択的に影響を受ける。パーキンソン病の場合には、それは黒質のドーパミン作動性細胞である。成人を冒す局所特異的な疾患において、局所への細胞移植は、無菌条件の下で放射線学で指針化された分化細胞の移植で達成することができる。放射線学の指針には、ＣＴおよび／またはＭＲＩの使用を含めることができ、注入された材料を監視するためのコントラストや同位体に基づく手法に利益をもたらし得る。
幾つかの代謝貯蔵障害などの特定の神経疾患では、細胞が神経系の多様な領域に渡って冒されるので、最大の利益は、内因性細胞を遺伝子改変することによって、または本発明の選択された細胞（成長培池または分化培池由来の何れか）を拡散様式で多数を組織に導入することによって達成されるだろう。中枢神経系では、これらの疾患は、脳室内注射によって（適切な大きさに作られたカテーテル様デバイス、または針を用いて）（特に開発の初期段階では最初にアプローチされるであろう。）脳室内注射は、広範な内因性細胞を改変または成長培地および／または分化培地から単離した選択した細胞の広範な移植を可能にする。それにもかかわらず、同じ目的のために循環系への細胞の注入も包含されている。しかし、複数の臓器または体を広範に冒す（例えば、リソソーム貯蔵障害、ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎｐａｔｈｉｅｓ、筋ジストロフィー）すべての障害に関し、成長培地および／または分化培地から単離した細胞は、優先的に直接循環器官および／または内臓器官（肝臓、腎臓、消化管、脾臓、副腎、膵臓、肺などの臓器および胸腺）に、内視鏡ガイダンスおよび適切な大きさに作られたカテーテル様デバイスを用いて導入し、選択された器官への細胞の特異的な導入および浸潤と同じく、体全体に広範な細胞の移植を可能にする。
例１１：血液循環の流れと器官への注入による細胞送達
１つの器官系の病気は、別々の器官系から遺伝子改変細胞で治療できる可能性がある。また、いくつかの場合、選択した細胞を、成長培地および／または分化培地で培養した後、血流（動脈、静脈または肝のいずれか）に注入されるならば、その選択した細胞はインビボで十分な量組み込んでそれら自身で分化し得ることが明らかになるだろう。このアプローチは、本発明により包含される。びまん性筋（例えば、筋ジストロフィー）、器官、組織または血液障害（例えば、遺伝性球状赤血球症、鎌状赤血球貧血、他のｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎｏｐａｔｈｉｅｓ等）は、例えば、成長培地または分化培地から分離された細胞の患者への、特に患者の循環への注入を伴う。このアプローチは、また、心筋梗塞、脳卒中などの虚血性傷害を改善するだけでなく、脳や他の組織への外傷を改善すると考えられている。針やカテーテルによる血流中に本発明によって生成したそのような細胞の直接の注入により、細胞が骨髄、筋肉、腎臓、肺、および／またはその他の他の任意の器官系に「帰る」ことが可能となり、同様に、骨髄空間に直接注射することは、本発明の実施に適している。同様に、超音波、放射線または蛍光透視指針を用いるか用いないで、損傷部位に細胞を直接注射することも本発明の実施に適している。
本発明において有用な選択された細胞を単離する方法は、Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．， ２００６によって書かれているものを含む。
好ましい実施の形態としては、ｎｕｍｂｌｉｋｅ および／あるいはｎｕｍｂアイソフォームをコードする遺伝子ベクターは、Ｎｕｍｂ またはｎｕｍｂｌｉｋｅ導入遺伝子に作動可能に連結している調節可能なプロモータを含む。
別個の好ましい実施の形態としては、トランスフェクションのモードは、ｎｕｍｂｌｉｋｅ とｎｕｍｂアイソフォームの永久的な発現よりも、一過性の発現を提供するトランスフェクションのモードから選択することができる。
例１２：遺伝子改変の例
カナバン病（ＡＳＰ）；テイサックス病（ＨＥＸＡ）；レッシュナイハン症候群（ＨＲＰＴ）；ハンチントン病（ＨＴＴ）；スライ症候群；タイプＡとＢのニーマンピック病；サンドホフ病（ＨＥＸＢ）、ファブリー病（ＧＬＡ）； Ｃ型ニーマンピック病（ＮＰＣｌ）；ゴーシェ病（ＧＢＡ）；パーキンソン病（ＰＡＲＫ２等）フォンヒッペルリンダウ病、鎌状赤血球貧血（ＨＢＢ）およびその他のサラセミアならびに同じような病気を含むが、これらに限定されない数百の病気や臨床状態が、本発明の方法によって治療および／あるいは改善することができる。これらの導入遺伝子は、正常遺伝子のコーディング領域、またはコーディング領域の一部を表すことがある。しかしながら、本発明の範囲は、特定の実施態様および、上記の例に限定されないことが理解されるべきである。本発明は、具体的に記載したものとは別のように実施してもよく、それらは添付の特許請求の範囲内である。
例１３：テトラサイクリン感受性プロモーターの調節下で細胞を多能性にし、長Ｎｕｍｂアイソフォーム、Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ−２、およびＥｍＧＦＰ核配列を発現することが可能なベクターの配列の例は、
上のベクター配列に対応する図式化マップは、図１に示されている。
ベクターを完全にｄｅ ｎｏｖｏの遺伝子合成を通じて、または一部をＮｕｍｂ、ＳｏｘとＯＣＴ３／４ ｃＤＮＡ配列のクローニングを通じて、インビトロジェンｐｃＤＮＡ４ｔｏｌａｃＺベクターの中にＬａｃＺで占められる位置に構築してよい。同様に、ｔｅｔＲ遺伝子インビトロジェンｐｃＤＮＡ６／ＴＲベクターの中に見出される。参照した遺伝子のコード配列もｐｃＤＮＡ４１ａｃＺベクターのクローニングに適している。
代わりにｔｅｔＲ遺伝子はｐｃＤＮＡ６／ＴＲベクターを、ｔｅｔＲ遺伝子とそのＰＣＭＶプロモータを除いたここでの配列を含むベクターと組み合わせて用いることにより標的細胞に個々にトランスフェクトすることができる。
同様に、複数のベクターは、上記配列に含まれる要素に類似の要素が存在する限り、使用することができる。これはプロモーターの競合の可能性を減らすことができる。他の暫定的なプロモーター要素は、テトラサイクリン感受性のプロモーター要素の代わりに使用できることが理解されるべきである。
例１４ 一回もしくは複数回、ここに記された方法（またはその他の公表された方法）により生成された多能性の幹細胞の、静脈内投与および他の投与は、体に細胞の置換を提供し、そのような投与が加齢性老化の患者において寿命を延ばすかまたは健康増進に役立ち得ることが期待される。
例１５ 生殖細胞の生成
本発明は、ここで記されている方法（またはその他の公表された方法による）により生成された多能、多能性、および／または自己再生できる幹細胞からの生殖細胞の誘導を包含する。このような生殖細胞の生成は、不妊の治療ならびに生体外での胎芽の生成に適するであろう。（例： Ｈｕｂｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２００３； Ｋｅｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２００５；Ｎａｙｅｒｎｉａ ｅｔ ａｌ．， ２００６ａ； Ｎａｙｅｒｎｉａ ｅｔ ａｌ．， ２００６ｂ； Ｄｒｕｓｅｎｈｅｉｍｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２００７；Ｍｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ．， ２００７； など）
例１６：トランスジェニック動物の形成
本発明は、トランスジェニック動物の形成を包含する。他の多能性細胞を用いる場合、ここで記されている方法（またはその他の公表された方法）により生成された多能性細胞は、当技術分野で知られている任意の方法によりトランスジェニック動物を生成するために利用することができる。
例１７：治療用ベクターの構築
用いることができるレトロウイルスベクターの例は、Ｍｏｌｏｎｅｙマウス白血病ウイルス、Ｍｏｌｏｎｅｙマウス肉腫ウイルスとラウス肉腫ウイルス、ＦＩＶや、ＨＩＶに由来するベクターを含むがそれらに限定されない。適切な発現ベクターは、真核生物の細胞にＤＮＡまたはＲＮＡのトランスフェクションに用いることができるものである。このようなベクターには、原核生物のベクター（例えば、細菌のベクターなど；真核生物のベクター（例えば、酵母のベクターと真菌のベクターなど、およびウイルスベクター（限定されないが、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターおよび、レトロウイルスベクターなど）が含まれるが、これらに限定されない。
レプリケーション無能なｐｃＤＮＡ ６．２ＧＷ／ｍｉＲとｐｃＤＮＡ ６．２／ＥｍＧＦＰ−Ｂｓｄ／Ｖ５−ＤＥＳＴベクターは、適切な発現ベクター（インビトロジェン社）の例であり、ターゲット配列を切断する能力がある合成オリゴヌクレオチド（例えば、ｍｉＲＮＡ）の発現が可能である。これらのベクターには、より長いｐｏｌＩＩの転写産物（プレｍｉＲＮＡ）由来の操作されたｍｉＲＮＡの切除を誘導するための内因性ｍｉＲＮＡ由来の隣接配列およびループ配列がふくまれる。
代わりに、ＨＩＶｐｓｉ配列の包含は、治療用ベクターが、ウイルス粒子を形成することに関してネイティブのＨＩＶゲノムと競合し、ＨＩＶの伝播もそがいすることを可能にする。
単一の標的に対抗する複数のｍｉＲＮＡ配列の組合せは、標的配列の発現を減少させる成功の可能性を上昇させる。ｍｉＲＮＡ配列は、ＥＦ−１ ａｌｐｈａプロモータ、任意のＴ細胞特異的プロモータ、または望まれる細胞型での発現を確実にするマクロファージ特異的プロモータなどの組織特異的プロモータに作動可能に連結することができる。
遺伝子発現のためのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのレンチウイルス表記（ＤＥＳＴ）ベクターを利用すると、結果として生まれた治療用ベクターは、分裂する細胞と分裂しない細胞型の両方の安定的な形質導入が可能になる。
好ましい実施の形態としては、治療用ベクターは、ＣＸＣＲ４、ＣＣＲ５および／あるは標的細胞におけるＨＩＶ感染の共受容体として作用することが知られている他の任意の細胞たんぱく質の発現を減少させるかぎり、１つないしそれ以上のプロモータにより駆動される複数の合成オリゴヌクレオチド配列を含む。
ある治療用ベクターでは（２００６年に構築）、ＣＸＣＲ４ とＣＣＲ５の共受容体を標的にする４つのｍｉＲＮＡ配列が、ＨＩＶ −２ ＴＡＲ とＲＲＥ を標的にするデコイＲＮＡ配列とともに、ｐｃＤＮＡ６．２ ＧＷ／ｍｉＲベクターにクローン化された。
遺伝子構築物は、ベクターのバックボーンおよび、異種核酸配列に作動可能に連結するプロモータを調節するトランス活性化因子を含み得る。
他の適したベクターの例としては、レトロウィルスベクターがある。レトロウィルスは、ＲＮＡゲノムを含むＲＮＡウィルスである。ｇａｇ、 ｐｏｌ、 ｅｎｖ 遺伝子は、末端長反復（ＬＴＲ）配列によって隣接される。５’ と ３’ＬＴＲ配列は、ｍＲＮＡの転写とポリアデニル化を促進させる。
レトロウイルスベクターは、調節可能なトランス活性化エレメント、内部リボソームリエントリー部位（ＩＲＥＳ）、選択マーカーおよび、調節可能なプロモータによって操作される標的の異種遺伝子を提供することができる。
あるいは、複数の配列を、複数のプロモーターの制御下で発現することができる。最後に、レトロウイルスベクターは、逆転写と組込みのために必要なシス作用配列を含むことができる。感染時には、ＲＮＡは逆転写されてＤＮＡになり、効率的にホストゲノムに組み込まれる。本発明の組換えレトロウイルスは、天然ウイルスのレトロウイルス性の感染性の遺伝子のいくつかを削除し、実施形態において、細胞の遺伝子改変のかわりに標的核酸配列に置き換えるような方法で遺伝子改変される。配列は、天然型または変形型において外因性ＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。
例１８：治療用ベクターを生成する方法の例
治療用ベクターを生成する方法は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ’ｓ Ｖｉｒａｌ Ｐｏｗｅｒ Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｍａｎｕａｌに記されている通りのものを含む。簡潔に言えば、ＥｍＧＦＰに基づくカセットは、ＰｍｌＩ−ＢｌｐＩ断片としてｐＬｅｎｔｉ６／Ｒ４Ｒ２／Ｖ５−ＤＥＳＴベクター中にクローン化され、一方、ｍｉＲデコイカセットが同時にＢＰ反応によってｐＤＯＮＲ２２１に輸送される。それから、ＥＦ１ａプロモータとｍｉＲデコイは、改変されたｐＬｅｎｔｉ６／ＥｍＧＦＰ−ｂｓｄ／Ｒ４Ｒ２−ＤＥＳＴベクターに交差するＭｕｌｔｉｓｉｔｅ ＬＲである。
ｐＬｅｎｔｉ６／Ｒ４Ｒ２／Ｖ５−ＤＥＳＴベクター配列：
例１９：生体内で増殖する／増殖する幹細胞／前駆細胞のための方法
１）ＨＩＶ感染症、２）ＨＩＶの複製および／または３）ＨＩＶの転写に比較的耐性のある多数の標的細胞を取得するため、前駆細胞／幹細胞をグルタミン、β−メルカプトエタノール、１０％（体積で）ウマ血清、およびヒト組換え白血病抑制因子（ＬＩＦ）を補充したダルベッコの改変最小必須培地（ＤＭＥＭ）で成長させることができる。ＬＩＦにより、前駆細胞／幹細胞を細胞のフィーダー層（使用しても構わない）上で維持する必要がなくなるが、ＬＩＦは、未分化状態の前駆細胞／幹細胞を維持するために必須である。
例２０：幹細胞は個人から集められ、細胞は治療用ベクターによってトランスフェクトされ、次にＨＬＡタイピングやマッチングを伴うか伴わない標準的な方法により移植のため調製される。
例２１：臍帯血サンプルは臍帯血コードバンクから得られる。細胞は、次に有用な配列の治療用ベクターでトランスフェクトされ、次にＨＬＡタイピングやマッチングを伴うか伴わない標準的な方法により移植のために調製される。
例２２：治療用ベクターに含有させるのに適する合成オリゴヌクレオチド配列の例
７０％を超える標的配列のたんぱく質発現をうまく減少させるいかなる合成オリゴヌクレオチド配列も本発明に包含される。
標的細胞がＨＩＶ複製を維持する能力を７０％を超えるかそれよりも少ないが治療的程度にまで、または、標的細胞がＨＩＶのウイルス活性を維持する能力を７０％を超えるかそれよりも少ないが治療的程度にまでうまく減じる任意の合成オリゴヌクレオチド配列もまた本発明に包含される。
ｍｉＲＮＡ配列の例には、ＩＶＧＮアルゴリズム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に由来するｍｉＲＮＡが含まれる。ＣＸＣＲ４遺伝子を標的とするｍｉＲＮＡ配列は最上段の鎖を含む：
同様に、ＣＣＲ５遺伝子を標的とするｍｉＲＮＡ配列は最上段の鎖を含む：
例２３：治療用ベクターに含有されるのに適したデコイＲＮＡの例
標的細胞がＨＩＶ複製を維持する能力を７０％を超えるかそれよりも少ないが治療的程度にまで、または、標的細胞がＨＩＶのウイルス活性を維持する能力を７０％を超えるかそれよりも少ないが治療的程度にまでうまく減じる任意のデコイ配列もまた本発明に包含される。
例のＴＡＲデコイ配列は、
例のＲＲＥデコイ配列は、
例２４：ＲＮＡデコイの安定性を提供するフランキング配列
ＲＮＡデコイに適したフランキング配列の例は以下に挙げられる：
５’サイドのＵ６ ＲＮＡの１９ヌクレオチド（ｎｔｄｓ）ならびにＰｏＬＩＩＩに対するポリＵターミネータがすぐに先行する３’ステムの何れかのサイドにおいてヘアピンで隣接されたデコイ配列は、より大きな安定性を示すことが以前に実証されている。この配置は３’−５’エキソヌクレアーゼの攻撃から保護するものと期待され、挿入ＲＮＡの折り畳みに干渉する３’トレーラー（ｔｒａｉｌｅｒ）の機会を低減することが期待される。最初の３／４のｔＲＮＡ配列のみが存在するので、挿入の５’末端は保護されるはずであるし、核からの輸送が阻止されるはずである（グッドら、１９９７）。
例２５：治療用のベクターの宿主への導入
好ましい実施の形態としては、血液幹細胞／前駆細胞、および標的細胞は、治療用ベクター（または随伴の治療用ウイルス）の宿主血液や組織、または骨髄などへの導入により、生体内において治療用ベクターを用いてトランスフェクトされる。最大の利点は、多くの内因性標的細胞および幹細胞／子孫細胞を改変することによって得られる。これは、適したサイズのカテーテルのような装置またはニードルを用いて、治療用ベクターを静脈循環または動脈循環に注入することによって達成することができる。好ましい実施形態において、ウイルスはＶＳＶ−Ｇエンベロープ糖たんぱく質および天然ＨＬＶ−１ ｅｎｖたんぱく質でシュードタイプされる。
例２６：宿主への遺伝子改変細胞の導入
成熟した末梢血Ｔリンパ球、単球、マクロファージ、Ｔ細胞前駆細胞、マクロファージ単球前駆細胞、および／あるいは多能性の造血幹細胞（臍帯血および占有骨髄空間にみられるものなど）などの血液細胞は、他の幹細胞／前駆細胞と同様に、生体外において治療用ベクターを用いてトランスフェクトすることができる。治療用ベクターの適切な濃度は、Ｂｒｏｗｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ．， １９９９と一致したものであってよい。その後、細胞は、生体外で拡張（増殖）され、続いて、細胞は、静脈内用針またはカテーテルを用いて静脈循環または動脈循環に細胞を導入することを介して宿主に移入される。その後、治療用ベクターによってトランスフェクトされた細胞は、骨髄や他の組織に「帰る」ことができる。
ここで書かれている例や実施の形態は、説明的な目的のみであり、それに照らした様々な改変または変更が当業者に示唆され、本出願の精神および範囲内および添付の特許請求の範囲内に含まれることが理解される。本明細書で引用された全ての出版物、特許、特許出願は、すべての目的において、その全てが参照により本明細書に援用される。
例２７：本発明において利用した発現、または標的にされた導入遺伝子の例
本発明を実行するのに有効な任意の導入遺伝子配列は、本発明における利用に適切である。適したヌクレオチド配列は、望まれる細胞または性質が得られる限り、どの種からも採取されてよい。このような配列の呼称方法は、同様に、本明細書において小文字または大文字のいずれも、特別な種類は表わさない。ＮＣＢＩデータベース（アクセッション番号で列挙される）に保存される以下の配列は、本出願で上記で引用した配列の例を表わす。これらは、本発明に用いるのに適した配列（ｃｄｓ）をコードする特定遺伝子の例でもあるが、いずれの場合であっても、本発明の実施を制限するものではない。
挿話として引用されている全刊行物の内容および次のアメリカ合衆国における特許は、その全てを参照として記載および援用する： ７２１１２４７， ５６７７１３９， ６４３２７１１および５４５３３５７， Ｕ．Ｓ． ０５，５９３，８７５， Ｕ．Ｓ． ０５，７８３，５６６， Ｕ．Ｓ． ５，９２８，９４４， Ｕ．Ｓ．０５，９１０，４８８， Ｕ．Ｓ． ０５，８２４，５４７

Claims (135)

  1. デコイ、合成オリゴヌクレオチド連鎖、合成オリゴヌクレオチドを含む、ＨＩＶ共受容体に直接対抗するｌｌｌＶ−ｌおよび／あるいはＩＩＩＶ−２の感染を減少させるベクター。
  2. 合成オリゴヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ連鎖グループから選択される合成オリゴヌクレオチド連鎖を含む請求項１のベクター。
  3. 合成オリゴヌクレオチドの組み合わせを含む請求項１のベクターは分類される。
  4. ウィルスベクターである請求項１のベクター。
  5. ＨＩＶ酵素を標的にする合成オリゴヌクレオチドの請求項１のベクター。
  6. 標的細胞においてプロモータ活性によって操作される合成オリゴヌクレオチドの請求項１のベクター。
  7. ＥＦ−１ ａｌｐｈａプロモータによって操作される合成オリゴヌクレオチドの請求項１のベクター。
  8. 抗生たんぱく質または蛍光性たんぱく質を符号化するマーカー遺伝子を含む、請求項１のベクター。
  9. ＨＩＶ−Ｉおよび／あるいはＨＩＶ−２の感染を減少させる、デコイ合成オリゴヌクレオチド鎖と合成オリゴヌクレオチドは、ＨＩＶ共受容体に対抗するＨＩＶ ＲＲＥおよび／あるいはＴＡＲデコイ鎖を含むベクター。
  10. ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ連鎖を含む合成オリゴヌクレオチドの請求項９のベクター。
  11. 合成オリゴヌクレオチドの組み合わせを含む請求項９のベクター。
  12. ウィルスベクターである請求項９のベクター。
  13. ＨＩＶ酵素も標的とする合成オリゴヌクレオチドの請求項９のベクター。
  14. 標的細胞においてプロモータ活性によって操作された合成オリゴヌクレオチドの請求項９のベクター。
  15. 合成オリゴヌクレオチドがＥＦ−Ｉ ａｌｐｈａプロモータによって操作される請求項９のベクター。
  16. 抗生たんぱく質または蛍光性たんぱく質を符号化するようなマーカー遺伝子を含む、請求項９のベクター。
  17. ＩＩＩＶ−Ｉおよび／あるいはＨ１Ｖ−２感染を減少させ、デコイ鎖がＨＩＶ−Ｉ とＨＩＶ−２デコイ連鎖の組み合わせを表わすベクター。
  18. 合成オリゴヌクレオチドがｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ またはｓｈＲＮＡ連鎖を含む請求項１７のベクター。
  19. 合成オリゴヌクレオチド鎖の組み合わせを含む請求項１７のベクター。
  20. ベクターがウィルスベクターである請求項１７のベクター。
  21. ＨＩＶ酵素を標的とする合成オリゴヌクレオチドの請求項１７のベクター。
  22. 標的細胞においてプロモータ活性によって操作された合成オリゴヌクレオチドの請求項１７のベクター。
  23. 合成オリゴヌクレオチドがＥＦ−Ｉ ａｌｐｈａプロモータによって操作される請求項１７のベクター。
  24. 抗生たんぱく質また蛍光性たんぱく質を符号化するようなマーカー遺伝子を含む、請求項１７のベクター。
  25. ＩＩＩＶ−Ｉ および／あるいはＨ１Ｖ−２感染を減少させ、デコイ鎖がＨＩＶ−２ ＲＲＥ ａｎｄ ＨＩＶ−２ ＴＡＲ連鎖の組み合わせを表わすベクター。
  26. 合成オリゴヌクレオチドがｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ あるいはｓｈＲＮＡ連鎖を含む請求項２５のベクター。
  27. 合成オリゴヌクレオチド鎖の組み合わせを含む請求項２５のベクター。
  28. ベクターがウィルスベクターである請求項２５のベクター。
  29. ＨＩＶ酵素を標的とする合成オリゴヌクレオチドの請求項２５のベクター。
  30. 標的細胞においてプロモータ活性によって操作された合成オリゴヌクレオチドの請求項２５のベクター。
  31. 合成オリゴヌクレオチドがＥＦ−Ｉ ａｌｐｈａプロモータによって操作される請求項２５のベクター。．
  32. 抗生たんぱく質または蛍光性たんぱく質を符号化するようなマーカー遺伝子を含む、請求項２５のベクター。
  33. ＨＩＶ−Ｉおよび／あるいはＨＩＶ−２の感染を減少させることのできる、ＨＩＶ共受容体、ＨＩＶ ＲＲＥ、ＨＩＶ ＴＡＲデコイ連鎖に直接対抗する合成オリゴヌクレオチドを含むベクター。
  34. 請求項３３のベクターは、合成オリゴヌクレオチドがｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ連鎖を含む。
  35. 合成オリゴヌクレオチド鎖の組み合わせを含む請求項３４のベクター。
  36. ウィルスベクターである請求項３４のベクター。
  37. ＨＩＶ酵素を標的とする合成オリゴヌクレオチドの請求項３４のベクター。
  38. 標的細胞においてプロモータ活性によって操作された合成オリゴヌクレオチドの請求項３４のベクター。
  39. 合成オリゴヌクレオチドがＥＦ−Ｉ ａｌｐｈａプロモータによって操作される請求項３４のベクター。
  40. 抗生たんぱく質または蛍光性たんぱく質を符号化するようなマーカー遺伝子を含む、請求項３４のベクター。
  41. ＨＩＶ−Ｉおよび／あるいはＨＩＶ−２の感染を減少させることのできる、ＨＩＶ共受容体や単一ＨＩＶ共受容体に直接対抗する合成オリゴヌクレオチドを含むベクター。
  42. 前記合成オリゴヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡあるいはｓｈＲＮＡ配列を含む請求項４１のベクター。
  43. 前記ベクターは合成オリゴヌクレオチド分類の組み合わせを含む請求項４１のベクター。
  44. 前ベクターがウイルスベクターである請求項４１のベクター。
  45. 前記合成オリゴヌクレオチドは、ＨＩＶの酵素のターゲットである請求項４１のベクター。
  46. 合成オリゴヌクレオチドのプロモーターの標的細胞に積極的で駆動される請求項４１のベクター。
  47. 合成オリゴヌクレオチドがＥＦ−Ｉアルファプロモータによって駆動される請求項４１のベクター。
  48. 前記ベクターが抗生物質抵抗たんぱく質あるいは蛍光たんぱく質を符号化するためのマーカー遺伝子などのマーカ遺伝子を含む請求項４１の方法。
  49. ＣＸＣＲ４およびＣＣＲ５を含む請求項４９のＨＩＶコレセプタを標的とする合成ヌクレオチドを含むＨＩＶ−Ｉおよび／あるいはＨＩＶ−２感染を遅らせることができるベクター。
  50. 前記合成ヌクレオチドはｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡあるいはｓｈＲＮＡ配列を含む請求項４９のベクター。
  51. 前記ベクターは合成オリゴヌクレオチド分類の組み合わせを含む請求項４９のベクター。
  52. 前記ベクターはウイルスベクターである請求項４９のベクター。
  53. 前記合成オリゴヌクレオチドは、ＨＩＶ酵素も標的とする請求項４９のベクター。
  54. 前記合成オリゴヌクレオチドは、前記標的細胞でアクティブなプロモーターによって駆動される請求項４９のベクター。
  55. 前記合成オリゴヌクレオチドはＥＦ−Ｉアルファプロモーターによって駆動される請求項４９のベクター。
  56. 前記ベクターは抗生物質耐性たんぱく質や蛍光たんぱく質を符号化するためのマーカー遺伝子などのマーカー遺伝子を含む請求項４９のベクター。
  57. ＣＸＣＲ４およびＣＣＲ５を含む請求項４９のＨＩＶコレセプタを標的とする合成ヌクレオチドを含むＨＩＶ−Ｉおよび／あるいはＨＩＶ−２感染を遅らせることができるベクターであって、ＨＩＶコレセプタに対して指向される合成オリゴヌクレオチドがｍｉＲＮＡ配列であるベクター。
  58. 前記合成オリゴヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡあるいはｓｈＲＮΛ配列を含む請求項５７のベクター。
  59. 前記ベクターは、合成オリゴヌクレオチド分類の組み合わせを含む請求項５７のベクター。
  60. 前記ベクターは、ウイルスベクターである請求項５７のベクター。
  61. 前記合成オリゴヌクレオチドは、ＨＩＶ酵素の標的でもある請求項５７のベクター。
  62. 前記合成オリゴヌクレオチドは、前記標的細胞でアクティブなプロモーターによって駆動される請求項５７のベクター。
  63. 前記合成オリゴヌクレオチドは、ＥＦ−Ｉアルファプロモーターによって駆動される請求項５７のベクター。
  64. 前記ベクターは抗生物質耐性たんぱく質や蛍光たんぱく質を符号化するためのマーカー遺伝子などのマーカー遺伝子を含む請求項５７のベクター。
  65. デコイ合成ヌクレオチド配列およびＨＩＶコレセプタに対して指向される合成オリゴヌクレオチドを含むＨＩＶ−Ｉおよび／あるいはＨＩＶ−２感染を遅らせることができるベクターであって、ＨＩＶコレセプタに対して指向される合成オリゴヌクレオチドがｍｉＲＮＡ配列であるベクター。
  66. 前記合成オリゴヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡあるいはｓｈＲＮΛ配列を含む請求項６５のベクター。
  67. 前記ベクターは、合成オリゴヌクレオチド分類の組み合わせを含む請求項６５のベクター。
  68. 前記ベクターは、ウイルスベクターである請求項６５のベクター。
  69. 前記合成オリゴヌクレオチドは、ＨＩＶ酵素の標的でもある請求項６５のベクター。
  70. 前記合成オリゴヌクレオチドは、前記標的細胞でアクティブなプロモーターによって駆動される請求項６５のベクター。
  71. 前記合成オリゴヌクレオチドは、ＥＦ−Ｉアルファプロモーターによって駆動される請求項６５のベクター。
  72. 前記ベクターは抗生物質耐性たんぱく質や蛍光たんぱく質を符号化するためのマーカー遺伝子などのマーカー遺伝子を含む請求項６５のベクター。
  73. ＣＸＣＲ４に対して指向される複数のｍｉＲＮＡ配列と、ＣＣＲ５に対して指向される複数のｍｉＲＮＡ配列と、Ｉ１ＩＶ−２ ＲＲＥデコイ配列と、ＨＩＶ−２ ＦＡＲデコイ配列とを含み、前記ベクターがウイルスベクターであるベクター。
  74. 前記合成オリゴヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡあるいはｓｈＲＮΛ配列を含む請求項７３のベクター。
  75. 前記ベクターは、合成オリゴヌクレオチド分類の組み合わせを含む請求項７３のベクター。
  76. 前記ベクターは、ウイルスベクターである請求項７３のベクター。
  77. 前記合成オリゴヌクレオチドは、ＨＩＶ酵素の標的でもある請求項７３のベクター。
  78. 前記合成オリゴヌクレオチドは、前記標的細胞でアクティブなプロモーターによって駆動される請求項７３のベクター。
  79. 前記合成オリゴヌクレオチドは、ＥＦ−Ｉアルファプロモーターによって駆動される請求項７３のベクター。
  80. 前記ベクターは抗生物質耐性たんぱく質や蛍光たんぱく質を符号化するためのマーカー遺伝子などのマーカー遺伝子を含む請求項７３のベクター。
  81. ＨＩＶ−２ ＲＲＥデコイ配列および／あるいはＨＩＶ−２ ＴＡＲ配列を含む免疫不全による感染を遅らせることができるベクター。
  82. 前記合成オリゴヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡあるいはｓｈＲＮΛ配列を含む請求項８１のベクター。
  83. 前記ベクターは、合成オリゴヌクレオチド分類の組み合わせを含む請求項８１のベクター。
  84. 前記ベクターは、ウイルスベクターである請求項８１のベクター。
  85. 前記合成オリゴヌクレオチドは、ＨＩＶ酵素の標的でもある請求項８１のベクター。
  86. 前記合成オリゴヌクレオチドは、前記標的細胞でアクティブなプロモーターによって駆動される請求項８１のベクター。
  87. 前記合成オリゴヌクレオチドは、ＥＦ−Ｉアルファプロモーターによって駆動される請求項８１のベクター。
  88. 前記ベクターは抗生物質耐性たんぱく質や蛍光たんぱく質を符号化するためのマーカー遺伝子などのマーカー遺伝子を含む請求項８１のベクター。
  89. 患者の感染を改善するための方法であって、
    １）免疫不全ウイルス感染を遅らせることができるベクターを生成するステップと、
    ２）臍帯血細胞、造血細胞、末梢血、骨髄、精原細胞、始原生殖細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、マクロファージ、Ｔ細胞の前駆細胞、マクロファージ単球前駆細胞、ＣＤの３４＋幹細胞あるいは前駆細胞および／または体外あるいは体内でＨＩＶ標的細胞に分化できる任意の細胞から選択される幹細胞あるいは前駆細胞をトランスフェクトするステップと、
    ３）トランスフェクトした細胞を患者の血液や骨髄に導入するステップとを含む方法。
  90. 前記幹／前駆細胞は、成長促進媒体で培養され、患者への循環に導入する前に前記細胞を拡張する請求項８９の方法。
  91. マーカーたんぱく質の発現により、正常なトランスフェクションが監視される請求項８９の方法。
  92. クレーム８９の方法は、選択された幹細胞／前駆細胞ドナーの臍帯血前駆細胞である、請求項８９の方法。
  93. クレーム８９の方法は、選択された幹細胞／前駆細胞が自家末梢血の幹／前駆細胞である、請求項８９の方法。
  94. 前記選択された幹／前駆細胞が同系細胞から由来した、誘発した、あるいは再プログラミングされた多能性あるいは多能化幹細胞である請求項８９の方法。
  95. 患者のＨＩＶ感染を遅らせることができる方法であって、前記ウイルスベクターとを生成するステップと、前記ベクターから生成されたウイルスを患者の循環器に導入するステップとを含む方法。
  96. デコイ合成オリゴヌクレオチド配列と、ＨＩＶコレセプタに対して指向された合成オリゴヌクレオチドとを含む免疫不全ウイルスによる感染を遅らせることができるベクターであって、前記デコイ配列は、ＨＩＶ−２ ＲＲＥデコイ配列および／あるいはＨＩＶ−２ ＦＡＲデコイ配列とを含み、前記ベクターは、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２配列に対して指向されたリボザイム配列を含むベクター。
  97. デコイ合成オリゴヌクレオチド配列と、ＨＩＶコレセプタに対して指向された合成オリゴヌクレオチドとを含む免疫不全ウイルスによる感染を遅らせることができるベクターであって、前記デコイ配列は、ＨＩＶ−２ ＲＲＥデコイ配列および／あるいはＨＩＶ−２ ＦＡＲデコイ配列とを含み、前記デコイ配列は、Ｕ６プロモーターにより駆動されるベクター。
  98. Ｓｏｘ２たんぱく質、Ｏｃｔ４たんぱく質、ＮＡＮＯＧたんぱく質、ＩＯＸＢ４たんぱく質、ＦＧＦたんぱく質、ＬＩＦ活性を有するたんぱく質、Ｎｏｔｃｈ活性を有するたんぱく質を符号化する配列から選択された配列を含む追加のヌクレオチド配列の他、哺乳類ｎｕｍｂたんぱく質の「長い」（ＲＲＲ挿入＋）アイソフォームを符号化するヌクレオチド配列を含む遺伝子ベクター。
  99. 前記ベクターは短いＮｕｍｂアイソフォームおよびＮｕｍｂｌｉｋｅを標的とする合成オリゴヌクレオチドを含む請求項９８のベクター。
  100. 哺乳類の長（ＰＲＲｉｎｓｅｒｔ＋）アイソフォームを符号化したヌクレオチド配列が、ナノ粒子の Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｈｏｘｂ４、ＦＧＦ− ４、ＬＩＦ、 ＬＩＦＲ、ＣＮＴＦ、オンコスタティン（ＯＳＭ）、オンコスタティン 受容体（ＯＳＭＲ）カーディオトロフィン−ｌ、ＩＬ−６、ＩＬ６Ｒ、 ｈｙｐｅｒ ＩＬ−６、 ＩＬ−１ １、 ｇｐｌ３０、そして白血病抑制因子の活動を伴う他のたんぱく質や細胞表面の細胞表面のシグナル受容体遺伝子ファミリー（ノッチ）の活動のアークにより選り抜かれたヌクレオチド配列を含み付加されたヌクレオチド配列と同じくらいたんぱく質を鈍くするとする請求項９８のベクター。
  101. 多能、多能性、及び／または選択した細胞から自己再生できる細胞を製造する方法は、以下のものを含む：骨髄、末梢血、胎盤の血液、羊水、臍帯血、皮膚、脂肪組織、非人間の胚細胞、造血細胞、精原細胞、精巣の始原生殖細胞、上皮細胞、白血球の循環、単球マクロファージ、その他の体細胞、遺伝子組み換え臍帯血細胞、遺伝子組み換え羊水中の幹細胞、遺伝子組み換え骨髄細胞、遺伝子組み換え末梢血細胞、遺伝子組み換えの皮膚細胞、遺伝子組み換え精原細胞、遺伝子組み換え精巣の始原生殖細胞、遺伝子組み換え末梢血の幹細胞、遺伝子組み換え上皮細胞、遺伝子組み換え白血球、遺伝子組み換え非人間の胚細胞、その他の遺伝子組み換え幹細胞／前駆細胞と体細胞からなる体細胞の種類と幹細胞／前駆細胞のグループから細胞を選択する；ノッチ活性を有する蛋白質とＬＩＦ活性を有する蛋白質、ＦＧＦ４蛋白質、Ｈ０ＸＢ４蛋白質、ＮＡＮＯＧ蛋白質、Ｏｃｔ４蛋白質、Ｓｏｘ２蛋白質をエンコーディングするヌクレオチド配列から選択した追加のヌクレオチド配列と哺乳類の蛋白質のアイソフォーム”ｌｏｎｇ” （ＰＲＲ ｉｎｓｅｒｔ ＋）をエンコーディングするヌクレオチド配列を有する選択した細胞をトランスフェクションする；ＦｉＧＦ， ｂＦＧＦ， ＬＩＦ， 鋼因子、１１−６， ｈｙｐｅｒ ＩＬ−６， ＩＬ−７， オンコスタチン−Ｍ， ｃａｒｄｉｏｔｒｏｐｈｉｎ−１、その他の成長率を高めるサイトカインから選択したサイトカインを構成する成長培地に選択した細胞を決まった率で拡大し成長させる；前記率は前記成長培地に選択した細胞の時間の２倍から決定される；そして目的の細胞数になるまで、前記培養条件下で細胞を維持する。
  102. 成熟したメディアが遺伝子を超えた発現を誘導するために誘引剤をさらに構成するとする、請求項１０１の方法。
  103. 体内でさらなる分化が可能な必要な分化細胞集団を提供する方法であって、前記必要な細胞は、分化造血細胞、神経細胞、ドーパミン系の細胞、セロトニン系の細胞、コリン作用性の細胞、ノルアドレナリン作用性の細胞、ＧＡＢＡ作動性の細胞、筋細胞、心筋細胞、内胚葉と膵臓ランゲルハンス島の細胞、細菌細胞、骨髄あるいはその他の必要な細胞を含む方法であって、骨髄、末梢血、胎盤の血液、羊水、臍帯血、皮膚、脂肪組織、非人間胚細胞、造血細胞精原細胞、精巣、上皮細胞の始原生殖細胞、循環白血球、単球マクロファージ、その他の体細胞、遺伝子組み換え臍帯血細胞、遺伝子組み換え羊水幹細胞、遺伝子組み換え骨髄細胞、遺伝子組み換え末梢血細胞、遺伝子組み換え脂肪細胞、遺伝子組み換え胎盤細胞、遺伝子組み換え造血細胞、遺伝子組み換え皮膚細胞、遺伝子組み換え精原細胞、遺伝子組み換え始原生殖細胞、遺伝子組み換え末梢血幹細胞、変更遺伝子組み換え上皮細胞、遺伝子組み換え白血球、遺伝子組み換え非人間胚細胞、その他の遺伝子組み換え幹／前駆細胞および体細胞の集団から細胞を選択し、選択された細胞を提供するステップと、
    Ｓｏｘ２たんぱく質、Ｏｃｔ４たんぱく質、ＮＡＧＯＮたんぱく質、ＨＯＸＢ４たんぱく質、ＦＧＦ４たんぱく質、ＬＩＦ活性を有するたんぱく質、Ｎｏｔｃｈ活性を有するたんぱく質を符号化する配列から選択された配列を含む付加されたヌクレオチド配列の他、哺乳類のｎｕｍｂたんぱく質の「長い」（ＰＲＲ 挿入＋）アイソフォーム を符号化するヌクレオチド配列で前記細胞をトランスフェクトするステップと、
    前記選択された細胞を第１の成長速度で成長させるための成長媒体で前記選択された細胞を成長させるステップであって、前記第１の成長速度は前記成長培養媒体内で前記選択された細胞の２倍の時間から決定されるステップと、
    目的の細胞数を達成するまで、成長培養媒体で前記細胞を維持するステップと、
    前記選択された細胞を分化媒体の中で第２の成長時間で成長させるよう、前記分化媒体で前記選択された細胞を培養するステップであって、前記第２の成長速度は、前記成長培養媒体内で前記選択された細胞の２倍の時間から決定される、前記第２の成長速度は前記第１の成長速度の１０％から９０％の間で決定されるステップとを含み、
    前記分化媒体は、分化あるいは前記選択された細胞を前記必要な分化細胞への変更を促進する上で効果的な少なくとも１つの分化促進剤を含み、
    前記分化促進剤はレチノイン酸、神経成長因子、ジメチルスルホキシド、エキサメタジムアクリルアミド、前記必要な細胞型に適切なその他の分化促進剤からなる集団から選択される方法。
  104. 請求項１０３の方法であって、
    ｉ）ヌクレオチド配列と共に行われる核酸移入、特に転写調節因子はある細胞を望まれる細胞への分化を促すステップと、
    ｉｉ）細胞をヌクレオチド配列と共に最も短い（Ｐｒｒ−／ＰＴＢ−）へ核酸移入することはアイソフォームを和らげるステップと、
    ｉｉｉ）ＰＲＲ＋Ｎｕｍｂアイソフォームを標的にした合成オリゴヌクレオチド鎖により細胞を核酸移入するステップとを含む方法。
  105. 望まれる細胞が心筋細胞であり、その細胞がＤＭＳＯやＮＢＳ、レチノ酸、またはオルカディオミオサイドを含む分化媒介物の中で培養されるとする、請求項１０３の方法。
  106. 望まれる細胞が神経細胞であり、その細胞が神経成長因子やレチノイン酸から選択された分化作用物質を含む分化培養物の中で培養されるとする、請求項１０３の方法。
  107. 望まれる細胞が筋細胞であり、その筋細胞がエキサメタジムアクリルアミド、またはジメチルスルホキシドから選択された分化作用物質を含む分化培養物の中で培養されるとする、請求項１０３の方法。
  108. 体内でさらなる分化が可能な必要な細胞集団を提供する方法であって、
    骨髄、末梢血、胎盤の血液、羊水、臍帯血、皮膚、脂肪組織、非人間胚細胞、造血細胞精原細胞、精巣、上皮細胞の始原生殖細胞、循環白血球、単球マクロファージ、その他の体細胞、遺伝子組み換え臍帯血細胞、遺伝子組み換え羊水幹細胞、遺伝子組み換え骨髄細胞、遺伝子組み換え末梢血細胞、遺伝子組み換え脂肪細胞、遺伝子組み換え胎盤細胞、遺伝子組み換え造血細胞、遺伝子組み換え皮膚細胞、遺伝子組み換え精原細胞、遺伝子組み換え始原生殖細胞、遺伝子組み換え末梢血幹細胞、変更遺伝子組み換え上皮細胞、遺伝子組み換え白血球、遺伝子組み換え非人間胚細胞、遺伝子組み換えその他の幹／前駆細胞および体細胞から由来する細胞などの幹／前駆細胞および体細胞型の集団から細胞を選択し、選択した細胞を提供するステップと、
    目的の細胞数を達成するまで、成長培養媒体で前記細胞を維持するステップと、
    前記細胞をヌクレオチド配列、特に転写因子でトランスフェクトするステップと、前記細胞の必要な細胞への分化開始を促進するステップと、
    細胞を最も短い（Ｐｒｒ−／ＰＴＢ−） ＮｕｍｂアイソフォームあるいはＮｕｍｂｌｉｋｅを符号化するヌクレオチド配列と共にトランスフェクトするステップと、
    分化培養物の中で、少なくとも１つの効果的な分化作用物質が選択された細胞を望まれる分化をした細胞に、分化や改造培養されるよう促進するとされる培養するステップを含み、
    分化作用物質はレチノインや神経成長因子、ジメチルスルホキシド、エキサメタジムアクリルアミド、または望まれる細胞タイプと同じくらい適した他の分化作用物質である方法。
  109. 細胞が、最も短い（Ｐｒｒ−／ＰＴＢ−） Ｎｕｍｂアイソフォームが符号化したヌクレオチド配列と共に培養されないとする請求項１０８の方法。
  110. 望まれる細胞が筋細胞であり、その細胞が骨格筋細胞、平滑筋、心筋であるか否かに依存するＭｙｏＤ，ミオゲニン、ミオカルディン、Ｍｙｆ５、Ｍｙｆ６、Ｍｅｆ２Ａ、Ｇａｔａ５、Ｇａｔａ６を含む転写調整因子と共に培養されるとする請求項１０８の方法。
  111. ドーパミン作動性の神経が望む細胞であり、その細胞が分化培養物の中で培養されるために、Ｍａｓｈ１ｙａＮｇｎ２、Ｌｍｘｌｂ、またはＰｔｘ３を含む転写調整因子と共に核酸移入するとする請求項１０８の方法。
  112. セロトニン作用性の神経が望む細胞であり、その細胞が分化培養物の中で培養されるために転写調整因子と共に核酸移入されるとする請求項１０８の方法。
  113. Ｍａｓｈｌ、 Ｐｈｏｘ２ｂ、 Ｌｍｘｌｂ、Ｎｋｘ２．２、 Ｇａｔａ２、Ｇａｔａ３ 、Ｐｅｔｌ を含む転写調節因子請求項１１２の方法。
  114. コリン作用性の神経が望む細胞であり、その細胞が分化培養物の中で培養されるために、ＭＡＳＨｌ、 Ｐｈｏｘ２ａ またＲＥＳＴ４を含む転写調節因子とともに培養されるとする請求項１０８の方法。
  115. ＧＡＢＡ神経が望む細胞であり、その細胞がＬｌＦ、ＮＴ３、ＮＧＦを引き起こす分化培養物の中で培養されるために、ＭＡＳＨｌ、Ｐｈｏｘ２ａ、ＲＥＳＴ４を含む転写調節因子とともに培養されるとする請求項１０８の方法。
  116. ノルアドレナリン神経が望む細胞であり、その細胞が分化培養物の中で培養されるために、Ｍａｓｈｌ、ｄｌＩ（ＨＡＮＤ２）、Ｐｈｏｘ２ａ、Ｐｈｏｘ２ｂ、Ｇａｔａ２ またＧａｔａ３を含む転写調節因子とともに培養されるとする請求項１０８の方法。
  117. ＧＡＢＡ神経が望む細胞であり、その細胞が分化培養物の中で培養されるために、ＰＩＴＸ２、Ｄｌｘ２、Ｄｌｘ５、Ｈｅｓ１をターゲットとするＲＮＡ を含む転写調節因子とともに培養されるとする請求項１０８の方法。
  118. ノルアドレナリン神経が望む細胞であり、その細胞が分化培養物の中で培養されるために、Ｍａｓｈｌ、ｄｌＩ（ＨＡＮＤ２）、 Ｐｈｏｘ２ａ、Ｐｈｏｘ２ｂ。Ｇａｔａ２またＧａｔａ３を含む転写調節因子とともに培養されるとする請求項１０８の方法。
  119. 膵臓ランゲルハンス島細胞、または内胚葉細胞が望む細胞であり、選択された細胞はＦｏｘａ２、Ｓｏｘｌ７、ＨＬＸＢ９またＰｄｘｌを含む転写調節因子と共に核酸移入する。そして付加された分化作用因子はソディウム酪酸、アクチビンＡ、レチノイン酸、上皮細胞成長因子、塩基性線維芽細胞増殖因子、ノギン、インスリン様成長因子ＩＩ、ニコチンアミドから選ばれるとする請求項１０８の方法。
  120. 必要な細胞は造血細胞であり、前記細胞はＲｕｎｘｌ／ＡＭＬｌを符号化するヌクレオチド配列とにトランスフェクトされ、分化分化作用因子は、必要な細胞型に適したＶＥＧＦ、血小板産生因子、コロニー刺激因子から選択される請求項１０８の方法。
  121. 腹部機関や筋組織、心臓、中枢神経、血液、他の組織の不調を患っていて、治療が必要な患者に処置する方法であって、
    祖先／種族の細胞と骨髄や末梢神経、胎盤の血液、羊水、臍帯血、肌、脂肪細胞、ヒト以外の胎芽、造血細胞、精原細胞、精巣の原始細胞、上皮細胞、循環白血球、単球マクロファージ、他の体細胞、そして遺伝子的に改造された骨髄や末梢神経、胎盤の血液、羊水、臍帯血、肌、脂肪細胞、ヒト以外の胎芽、造血細胞、精原細胞、精巣の原始細胞、上皮細胞、循環白血球、単球マクロファージから抽出された体細胞細胞を選択するステップと、
    細胞が哺乳類の長（ＰＲＲ ｉｎｓｅｒｔ −＋）アイソフォームと共に起こる核酸移入は、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｈｏｘｂ４、ＦＧＦ−４、ＬＩＦ、ＬＩＦＲ、ＣＮＴＦ、オンコスタティンを含む付加されたヌクレオチド配列と同じくらいたんぱく質を和らげるステップと、
    選択されだ細胞が最初の成長率で育ち、分化培養物の中で培養するステップと、
    核酸移入は効果的な分化培養物の中で育つ選択された細胞は、その倍の成長率で成長させるステップと、成長媒介物と呼ばれる効果的な分化は、選択された細胞の２倍の時間と決められている成長率を伸ばす、というような効果的な成長過程で細胞を発達させるステップと、
    そして望む個体数を獲得するまでこの環境で細胞を保存するステップと、
    選択された細胞は異なる媒介物の中で第２の成長率で成長し、成長率は選択された細胞の２倍の時間がかかるとされており、第２の成長率は１０％から９０％の間の成長率であり、
    このような効果的な発達過程で細胞を発達させるステップと、
    分化作用物質は、レチノイン酸や神経成長因子、ジメチルスルホキシド、エキサメタジムアクリルアミド、他の望む細胞タイプに適した誘導体からなるステップを含む方法。。
  122. 請求項１２１に記載の方法であって、
    望まれる細胞へと分化させるよう促すヌクレオチド配列、特に転写調節因子と共に細胞を核酸移入させるステップと。
    そして細胞を最も短い（Ｐｒｒ−／ＰＴＢ−） ＮｕｍｂまたはＰＲＲ＋ ｎｕｍｂアイソフォームを符号化したヌクレオチド配列と共に核酸移入させるステップとを更に含む方法。
  123. 選択された細胞は望まれる細胞の個体数を獲得した後に成長媒体から分離され、患者の循環組織、神経組織、他の細胞に注入されるとする請求項１２１の方法。
  124. （Ｐｒｒ＋） ｎｕｍｂアイソフォーム、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、ノッチ導入遺伝子、Ｈｏｘｂ４，ＦＧＦ−４、ＬＩＦ、ＬＩＦＲ、ＣＮＴＦを含む核酸、オンコスタティン、オンコスタティン受動体、心臓毒、ＩＬ−６、ＩＬ６Ｒ、ｈｙｐｅｒ ＩＬ−６、Ｌ−１１、ｇｐｌ３０を含むたんぱく質が、選択された細胞へと導入され、自己再生、多能、多能性細胞の集団を獲得する方法。
  125. 請求項１２４に記載の方法であって、前記トランスフェクション方法がは、電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいはレトロウィルス／レンチウィルスの統合を避ける別の方法、あるいは、または細胞遺伝子の恣意的な変質である方法。
  126. 自己再生、多能、多能性細胞の集団を獲得する方法であって、単一の遺伝子あるいはその一部に対応する核酸あるいはたんぱく質が過剰発言あるいは誘発され、選択された細胞となる方法であって、これらの核酸あるいはたんぱく質が長（Ｐｒｒ＋） Ｎｕｍｂアイソフォーム、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｎｏｔｃｈ活動を有するトランス遺伝子、Ｈｏｘｂ４、ＦＧＦ−４、 ＬＩＦ、 ＬＩＦＲ、 ＣＮＴＦ、ＯＳＭ、 ＯＳＭＲ、カーディオトロフィン−１ 、 ＩＬ−６、ＩＬ６Ｒ、ｈｙｐｅｒ ＩＬ−６、 ＩＬ−１ １、 ｇｐｌ３０を符号化する核酸あるいはたんぱく質から選択された１つに対応する方法。
  127. 核酸移入の方法の利用は、電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび／あるいはレトロウィルス／レンチウィルスの統合を避けるもう１つのアプローチ、または細胞遺伝子のランダムな変質である請求項１２１の方法。
  128. 組織を作ることを目的とし、遺伝子的に発生させた自己再生、多能、多能化および／あるいは分化細胞を３次元または２次元で構成される請求項１２１の方法。
  129. 組織を作ることを目的とし、遺伝子的に自己再生、多能、多能化細胞、または分化した細胞は、細胞膜形成器官か細胞膜形成組織が培養されるとする請求項１２１の方法。
  130. 組織を作ることを目的とし、遺伝子的に自己再生、多能、多能性、またくは分化した細胞はインクジェット印刷の技術と合わせ利用するとする請求項１２１の方法。
  131. 組織を作ることを目的とし、遺伝子的に自己再生、多能、多能化細胞、または分化した細胞は懸滴で分化されるとする請求項１２１の方法。
  132. 神経細胞は遺伝子的に引き起こされる自己再生、多能、多能化細胞を供給するとする請求項１２１の方法。
  133. 核酸は自己再生、多能、多能性細胞を低下させ、その配列は電気穿孔法、ナノカプセルまたナノヴォールトを利用して選択された細胞を促進させるとする請求項１２１の方法。
  134. 自己再生、多能、多能性細胞を低下させる能力のために核酸をスクリーニングし、その配列が電気穿孔法、ナノカプセル、ナノヴォールトを利用して選択されだ細胞を促進させる分化を始めるとする請求項１０８の方法。
  135. 分化細胞が所望され、所望な分化細胞中に通常存在する一つまたは一つより多い転写因子に対応する核酸またはタンパク質の過剰発現または導入による、遺伝子賛成、自己再生、多能、および／または多能性細胞から産生される、請求項１２１の方法。
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