JP2015077132A - 多能細胞集団を産生する方法およびその使用 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】非多能性の体細胞を選択し、1つまたはそれ以上の長(Prr+)numbアイソフォーム、Oct4、Sox2、及びNanogを含むたんぱく質又は配列を導入し又は過剰発現させ、サイトカインを含む成長培地において前記選択された細胞を増殖させ、所望の数の多能性細胞が得られるまで、これらの培養条件下で前記細胞を維持する培養方法。遺伝子生成の方法、多能な細胞集団の利用、多能性の細胞集団の利用、神経細胞集団の利用、筋細胞集団の利用、またHIV耐性細胞集団のような他の望まれる細胞集団の利用。
【選択図】図1
Description
まだ多能化されず自己再生できない細胞から、増殖し自己再生し、多能で多能化できる細胞集団を得る能力は、細胞療法を利用する全ての分野において明らかに有益なものであろう。これらの分野は、骨髄移植、輸血、遺伝子療法を含み、患者独自の幹細胞や、その他望まれる種類の細胞の生成が可能になる。同様に、神経、筋肉、その他の様々な望ましい細胞集団への分化を始める能力は、医療や動物を含む商業面の過程にとって大きな価値を生むであろう。それに応じて本発明は、遺伝子生成の方法、多能な細胞集団の利用、多能性の細胞集団の利用、神経細胞集団の利用、筋細胞集団の利用、またHIV耐性細胞集団のような他の望まれる細胞集団の利用を提供する。
全ての特許、特許出願、ならびに本出願書で引用された出版物は、そのまま参照し本論に引用されている。ここで論じられているように、「DNA」はデオキシリボ核酸を表わし、「RNA」はリボ核酸を表わす。ここで書かれている、「cDNA」は相補的DNAを意味し、「mRNA」はメッセンジャーRNAを表わす。
ここで用いているように、用語「ameliorating(改善する)」は影響を減らし、または損傷を少なくし、または作用、活性または機能の効果もしくは衝撃を最小にすることを意味し、例えば、疾患または状態による有害な影響を減らすことを含む。
。
2007)、臍帯血液細胞(例:Zhao, et al., 2006; Tian et al., 2007)、など)を利用した。しかしながら骨髄幹細胞、精原細胞(例:Guan et al., 2006; Takahashi et al., 2007)、始原生殖細胞(PGC)、羊膜から分離した幹細胞(例:Ilancheran et al., 2007)、羊水 (例:De Coppi et al., 2007)、同様に皮膚から分離した細胞(例:Tumbar, 2006; Dunnwaldet al., 2001 ; Szudal’tseva et al., 2007)などは、本発明においても利用された。このような細胞は、当該分野で知られている任意の手段によって、それが存在する組織から分離することができる。
a)増殖し自己再生できる多能性の細胞集団を得るために、選択された細胞および/あるいはその子孫細胞は、哺乳類のnumb遺伝子の「長」(PRR insert +)アイソフォームをコードするものを含むヌクレオチド配列によってトランスフェクトされる。それとほぼ同時に選択された細胞は、短いNumbアイソフォームおよびNumblikeとを標的にした合成オリゴヌクレオチドによってトランスフェクトされ、それから最適の成長速度で選択された細胞を成長させる環境下で培養され得る。選択された細胞はこのような環境下において、望まれる細胞数に達するまでの十分な期間維持される。細胞はLIF、鉄因子および/あるいは Il−6、hyper 1L−6、IL−7、オンコスタティン−Mおよび/あるいはカーディオトロフィン−1と等しい効力の濃度によって培養され得られた(最適な)成長速度で成長し、もしくは成長を増強する他のサイトカインの存在(例:多能性細胞を培養する条件、例: Guan et al., 2006)によって得られた成長速度によって成長する。成長速度は、前記の成長培地中での選択された細胞の倍加時間よって決定される。同様に、米国特許6432711と5453357にある培養環境は、長(PRR+)Numbアイソフォームによってトランスフェクトされた細胞が最適な成長速度で増殖や拡大するのに適切であり得る。他の適切なプロコトルや参照のサイトカイン濃度は、Koshimizuet al.,1996;Keller et al.,1996;Piquet−Pellorce, 1994;Rose et al.,1994;Park and Han, 2000;Guan et al., 2006; Dykstra et al., 2006; Zhang et al.,2007によって教示されている。しかしながら、本発明の実施は、これら教示の詳細に制限されない。
一つの好適な実施形態において、選択された細胞および/またはその子孫細胞は、OCT3/4およびSOX2を含む他の導入遺伝子、ならびにLIF活性を伴う導入遺伝子をコードする配列でトランスフェクトされる。
さらに当然として、ゲノムの特定の場所においてDNAを導入または取り除くために設計された遺伝子ターゲティングならびに部位特異的方法はランダム変換のカテゴリーから除外される。
一つの好適な実施形態において、単一の遺伝子またはその一部に(特にここで挙げられたもので、ここで挙げられた手法によって発見され、他の公表された方法により発見されたもの;または多能、多能性、または自己再生を誘導することが知られているもの)に対応する核酸またはたんぱく質が、選択された細胞から多能、多能性および/あるいは自己再生細胞を生成するよう過剰発現した、および/あるいは導入された、唯一の核酸またはたんぱく質である。そして使用されている手法は電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび/あるいは、レトロウィルス/レンチウィルスの組込みまたはその他の細胞ゲノムのランダムな変換を避けるもう1つのアプローチである。
別の好適な実施形態において、Nanogに対応する核酸またはたんぱく質が、選択された細胞から多能、多能性および/あるいは自己再生細胞の集団を生成する限り、他の核酸またはたんぱく質を使用することができる。そして使用されている手法は電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび/あるいは、レトロウィルス/レンチウィルスの組込み、またはその他の細胞ゲノムのランダムな変換を避けるもう1つのアプローチである。
一つの好ましい実施の形態としては、c−mycに対応する核酸またはたんぱく質は、選択された細胞から多能、多能性および/あるいは自己再生細胞を生成するよう、過剰発現したおよび/あるいは導入された、唯一の核酸またはたんぱく質であり、使用されている手法は電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび/あるいは、レトロウィルス/レンチウィルスの組込み、または細胞ゲノムのその他ランダムな変換を避けるもう1つのアプローチである。
別個の好ましい実施の形態としては、c−mycに対応する核酸またはたんぱく質との調和の中で、選択された細胞から多能、多能性および/あるいは自己再生細胞を生成する限り、他の核酸またはたんぱく質は使用する事ができる。
別の好適な実施の形態としては、Oct4とSox2に対応する核酸またはたんぱく質は、選択された細胞から多能、多能性および/あるいは自己再生細胞を生成するよう、過剰発現したおよび/あるいは導入された、唯一の核酸またはたんぱく質である。
別の好適な実施形態において、長(PRR+) Numb アイソフォームに対応する核酸またはたんぱく質は、選択された細胞から、多能、多能性および/あるいは自己再生の細胞を生成するよう、過剰発現および/あるいは導入され、使用されている手法は電気穿孔法、リボソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび/あるいはレトロウィルス/レンチウィルスの組込みまたは細胞ゲノムのその他ランダムな変換を避けるもう1つのアプローチである。
時間の経過に従い、ここに示されるものとは異なる他の遺伝子組み合わせで、細胞に対し、多能、多能性、自己再生可能になるようもたらすかまたは分化開始をもたらすことができることが示され、あるいは発見されるであろう。しかしながら本特許出願は、核酸またはたんぱく質の電気穿孔法(例:手法についてはGagne et al.,1991;Saito et al.,2001;Yuan,2008; Huang et al.,2007;Xia and Zhang,2007;Cemazar and Sersa 2007;Isaka and Imai,2007;Luxembourg et al., 2007;Van Tendeloos,2007;Takahashi,2007;その他を参照)、電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび/あるいはウィルスの組込みまたは細胞ゲノムのその他ランダムな変換を避けるもう1つのアプローチ(それらの手技は安全性と有効性を向上させるので)を用いる任意の有核細胞の遺伝子再プログラミングも包含する。
これらの異なる導入遺伝子配列の任意のサブセットでの同時トランスフェクションは、単一遺伝子ベクター、複数の遺伝的ベクター、シリアルトランスフェクションと異なるマーカータンパク質および/または抗生物質耐性に基づく選択を含む当該分野で公知の手段によって達成することができる。
効力と分化の評価
多能性と多能は次を含むその分野で公知の手法によって評価できる。1)移植、2)胚様体の形成を促進する条件での培養、3)動物の胚盤胞期胚芽への細胞注入とその後の成長、4)分化、多能、多能性など(Guanet al.,2006を参照)に関連した遺伝子発現のRNA発現検査(例:RT−PCR法ならびにマイクロアレイ法に基づいた分析)、5)コロニー形成のみならずES細胞類似形態による。ここで説明する、選択された細胞および/あるいはその子孫細胞の多能性を知るための1つの方法としては、蛍光タンパク遺伝子に作動可能に結び付けられたNanogプロモータを含む構築物を使うトランスフェクションが含まれる。これによりNanog発現細胞は、蛍光活性化細胞分別(FACS)などを使って特定し富化することができる。
b) 神経細胞集団、c) 筋肉細胞集団、d) その他の細胞集団がさらに生体内で環境的に制御されて分化が可能になるようにするには、選択された細胞および/あるいはその子孫細胞が、長(PPR+)Numbアイソフォーム配列および/あるいは合成されたオリゴヌクレオチド配列でのトランスフェクションを任意に受け、(上記の如く)試験管内で十分な時間をもって増加が拡大し望まれる数の子孫細胞が達成される。
この任意の手順に続いて、選択された細胞および/あるいはその子孫細胞を洗浄して拡大/最適の成長培地を構成するサイトカインと因子を取り除き、任意にNumblike遺伝子および/あるいは「短」(PRR−)Numbアイソフォームおよび/あるいは長(PRR+)アイソフォームなどを標的とする合成オリゴヌクレオチドをコードするヌクレオチド配列など (例:Zaehres et al.,2005)でトランスフェクションした。そして選択された細胞を望まれる細胞タイプに分化させるのを促進させる状況下で培養した。
望まれる細胞集団が神経細胞集団の時は、トランスフェクションが成功した細胞が、細胞を神経細胞に分化させるのを促進する因子が存在し、最適速度よりも低い速度で成長を促進する条件下で培養される。ニューロンへの分化を促進する条件については、次のような数多くの文献で説明されている(Benninger et al.,2003; Chung et al.2005;Harkany et al.,2004;Ikeda et al., 2004; Ikeda et al.,2005;Wernig et al.,2002;およびWernig et al.,2004)。さらには加えたサイトカインの存在とレチノイン酸曝露を組み合わせることは、特定の神経細胞タイプが試験管内で分化するのに有利である(例:Soundararajan etal., 2006; Soundararajan et al.,2007;U.S. Patent 6432711)。
筋細胞集団を得る
望まれる細胞集団が筋細胞集団である場合、形質移入に成功した細胞は、細胞が筋細胞でと分化し、しかも最適速度未満の速度で成長するよう促進する因子の存在下で培養される。筋細胞への分化を促進する条件は以前に記載した(Nakamura et al.,2003;Pal and Khanna,2005;Pipes et al.,2005;Albilez et al.,2006;Pal and Khanna,2007;Behfar et al.,2007;U.SPatent 6432711)。さらに、選択した細胞および/またはそれらの子孫細胞を追加のサイトカインの存在下でヘキサメチレンビス−アクリルアミドまたはジメチルスルホキシドに曝露することは、インビトロで筋タイプの分化の開始に有利である。
実施の形態としては、内生細胞(例:中枢神経系の上衣層細胞)は、生体内において、再生または増加した幹細胞の増殖を一過性に促進する目的(引き続く子孫細胞の分化を伴う)で、長numbアイソフォームおよび/あるいはここで名づけられた他の導入遺伝子をコードする遺伝子ベクターでトランスフェクトされる。この再生または増加は、分裂している前駆細胞に関連したマーカーの新規発生の発現を見せる細胞の数によって計測される。これは遺伝子ベクターを器官システムに、その目的に適した方法を用いて導入して達成され得る(実施例を参照)。
好ましい一つの実施形態において、単一の遺伝子またはその一部に対応する核酸(単数または複数)またはタンパク質(単数または複数)、(具体的には、本明細書で命名されたもの、本明細書に記した方法によって発見されたもの、他の公表された方法によって発見されたもの、および/または所望する分化の様式を開始できることが公知のもの)は、選択された細胞において分化を開始するために過剰発現および/または導入された唯一の核酸(単数または複数)またはタンパク質(単数または複数)であり、さらに、用いる方法は、電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールト、および/またはレトロウイルス/レンチウイルスの組込みまたは他の細胞のゲノムのランダムな変換を避ける別のアプローチである。
別個の好ましい実施形態において、分化している細胞の集団が、選択される細胞から産生する限り、他の核酸(単数または複数)またはタンパク質(単数または複数)は、単一の遺伝子またはその一部に対応する核酸(単数または複数)またはタンパク質(単数または複数)と協力して使用することができる(具体的には、本明細書で命名したもの、本明細書に記載の方法によって発見されたもの、他の公表された方法によって発見されたもの、および/または望ましい分化の様式を開始できることが公知のもの)。
別個の好ましい実施形態において、分化している細胞の集団が、選択される細胞から産生し、さらに用いる方法が、電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールト、および/またはレトロウイルス/レンチウイルスの組込みまたは他の細胞のゲノムのランダムな変換を避ける別のアプローチである限り、他の核酸(単数または複数)またはタンパク質(単数または複数)は、単一の遺伝子またはその一部に対応する核酸(単数または複数)またはタンパク質(単数または複数)と協力して使用することができる(具体的には、本明細書で命名したもの、本明細書に記載の方法によって発見されたもの、他の公表された方法によって発見されたもの、および/または望ましい分化の様式を開始できることが公知のもの)。
選択された細胞の集団は、様々な幹細胞、前駆細胞また体細胞から得られるであろう。しかしながら核が欠損している体細胞(例:成熟したヒトの赤血球細胞)は、とりわけ排除された。選択された幹細胞は、存在する細胞株から得られるかまたは貯蔵されている、バンク化されている、または凍結保存されている供給源から単離されるであろう。典型的な幹細胞の供給源は、骨髄、末梢血、胎盤血、羊水(例:De Coppi et al.2007)、靭帯血(例:Zhao,et al.,2006;Tian et al.,2007)、脂肪組織(例:Gimble et al., 2007;Ma et al.,2007)、ヒト以外の胚などである。循環白血球や他の幹細胞ではない細胞は、同様に、選択され、結果として多能、多能性および/あるいは自己再生能力を得る効果的な上記に記されたような培養条件におかれる。本発明において有用なたやすく利用できる他の体胞の例には、リンパ球、上皮細胞(例:頬)が含まれる。本発明の中で利用するために選択された細胞の単離および収集は、当分野で知られているいかなる方法によって実施されてもよい。
一つの実施形態では、本発明による方法は、細胞株、ドナー源、臍帯血からの細胞のスクリーニング、および自己あるいはドナーの骨髄、血液、精原細胞、始原生殖細胞、口腔細胞、あるいは本発明において効果的なその他の細胞源からの細胞のスクリーニングが含まれる。選択した細胞は、有益な配列または治療ベクターを用いたトランスフェクションの成功を確認するため、ならびに問う分野で公知の任意の方法による分化の開始の成功を確認するために検査され得る(Guan et al., 2006;米国特許6,432,71 1)。いくつかの実施形態では、標準的なPCR法および核酸ハイブリダイゼーションベースの方法を用いて、あるいは急速なタイピング方法を用いて、これらの細胞はスクリーニングされる。好適な実施形態では、レポーター遺伝子の発現に応じて細胞がスクリーニングされる。いくつかの実施形態では、抗生物質抵抗性遺伝子や蛍光たんぱく質(GFPなど)遺伝子などの導入遺伝子発現ベクターによりコードされたマーカー遺伝子の発現によって細胞はスクリーニングされる。
治療ベクターおよび有益な配列のスクリーニング
治療ベクターと有益な配列について、特定配列の検出のための当分野で知られている任意の方法を用いて、細胞がスクリーニングされ得る。それぞれ細胞サンプルは、同時に配列の多様性について調べられ得る。あるいは、多数のサンプルは、同時に検査され得る。
特定の実施の形態としては、選択された細胞はHLAタイピングに適合するように選択される。HLAの遺伝子型は、当業者にとって既知の任意の方法により決定される。
本発明はまた、選択された細胞および/あるいはその子孫細胞の望まれる細胞集団への表現型の変化あるいは分化を誘発する能力についてたんぱく質および因子をスクリーニングする方法を提供する。簡単に言えば、適切なcDNAライブラリから相補のDNA(cDNA)をコードするベクターは選択した細胞および/あるいはその子孫細胞にトランスフェクトされる。分化あるいはその他の表現型の変化を誘発する固有のcDNAのが特定されると、このようなcDNAは単離され、インビトロで適切な細胞(COS細胞など)でたんぱく質を生成するための適切な発現ベクターにクローン化され得る。
検査後、選択された細胞および/あるいはそれらの子孫細胞は、凍結保存され、培養する細胞株として維持されるか、患者に与えられ得る。選択された細胞は、当該分野で知られている任意の手法により、凍結保存されまたは維持され、将来の移植術のために保存される。できれば、検査される細胞は、容易に採取できる、入手が容易な供給源から得る。
植術のために保存することができる。
特定の実施の形態としては、細胞集団は移植に先立って幹細胞のために富化される。幹細胞を選択する様々な方法は、この技術分野では良く知られている。例えば、蛍光活性化細胞分取(FACS)を介して分取するため、細胞サンプルを、分化していない造血幹細胞(例:、CD34、CD59、Thyl、CD38 low、c-kit low、lin−minus)を認識する単クローンの抗体によって富化することができる。その他の実施の形態としては、選択された細胞のサンプルは、富化させられることなく移植される。
“治療用ベクター”は発現ベクターを含んでいてもよい。適切な発現ベクターはDNAあるいはRNAを真核細胞にトランスフェクトするために使用できるベクターである。このようなベクターには、それらに限定されないが、例えば、細菌ベクター;例えばイーストベクターおよび真菌ベクターなどの真核細胞ベクター;および、それらに限定されないが、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、およびレトロウイルスベクターなどのウイルスベクターが挙げられる。使用できるレトロウイルスベクターの例は、モロニーマウス白血病ウイルス、モロニーマウス肉腫ウイルス、およびラウス肉腫ウイルス、ネコ免疫不全ウイルス(FIV)、HIV、サル免疫不全ウイルス(SIV)およびハイブリッドベクターが含まれるが、これらに限定されない。
治療的ベクター(単数または複数)を用いて試験管内および/あるいは生体内で標的細胞にトランスフェクトできることが本明細書に開示される。トランスフェクションは、当技術分野で公知の任意の手技によって、とりわけ、ウイルスパッケージ細胞から産生されるウイルスを介して実施できる。そのようなウイルスは、CD34+細胞および/またはCD4+細胞に感染できるようにカプセル形成されてよい。しかしながら、幾つかの例において、他の細胞形がCD4またはCD34タンパク質が関与しない手段でトランスフェクトされる。それにもかかわらず、そのような細胞型への感染を可能にする任意のカプセル形成技法が、従って、本発明の開示に含まれ得る。
異なるエンベロープタンパク質を用いる仮タイピングは、ウイルスベクターおよび治療用ベクターによって形質導入が可能になる宿主細胞の範囲を拡大し、特に、水疱性口内炎ウイルスのエンベロープ糖タンパク質(VSV−G)で仮タイピングする場合、ウイルスを高力価に濃縮することができる(Li et al., 1998;Reiser et al., 2000)。
ベクター構築
本発明に用いられるウイルスベクターは、ハイブリッドベクターを含む様々な種類があるだろう。例えば、ベクターは天然ゲノムのとても小さな断片だけを含む(Zufferey et al., 1998)、第三世代のレンチウイルスであろう。導入遺伝子をコードするベクターの生成は、標的細胞への感染のあとに全長ベクターRNAの生成を 排除する、自己不活化転移ベクター(Zufferey et al., 1998; Miyoshi et al., 1998)も含み得る。
ウイルスベクターは、複製に必要である、ある種のウイルスプロテインを発現し損なうことによる、複製不可能なものを利用されるだろう。しかしながら、ヘルパーウイルスが治療用ウイルス複製を可能にすることも考えられる。この可能性は自己不活性化ベクターを使用することで減じることができる。
好ましい実施の形態にて、導入遺伝子配列はユビチキンプロモーター、,U6プロモーター、EFl アルファプロモーター、CMVプロモーター、調節可能なプロモーターおよび、あるいは、望まれる細胞タイプの特定なプロモーターによって駆動される。
ウイルス向性
好ましい1つの実施の形態としては、本発明のNumb アイソフォーム/ Numblikeをコードするベクター、治療用ベクターおよび、あるいはその他のトランスジェニックベクターに由来するウイルスは、水疱性口内炎ウイルスエンベロープ糖タンパク質によって仮タイピングし、ウイルス濃度を高力価にすることができ、CD34+細胞の感染を促進する。
配列選択
NUMBまたはNumblike配列(Entrez−Pubmed データベースを用いて検索可能)として参照される任意の配列に70%以上同一である(または相補性である)任意の配列の使用は、本発明により書かれた方法により利用されるならば、本発明によって包含される。
本発明は、HIV 1 とHIV−2ウィルス(両方とも本明細書ではHIVと呼ぶ)による哺乳類細胞の感染のしやすさを顕著に減少させることができる配列を誘導する遺伝子ベクターに一部関係する。
本発明は、有害なHIV/AIDS病の過程に重要な遺伝子発現を減少させる新規の合成オリグヌクレオチドの組み合わせを明らかにする。
共受容体に「ノックダウン」をもたらす合成オリゴヌクレオチドとTARおよびRREデコイ配列の発現との組合せの望ましいところは、個々の細胞において、1)HIV感染、2)HIV転写、および3)HIV複製を同時に標的とする組合せの複数の遺伝子治療アプローチが、これらの単独でのアプローチのどのものよりも高い治療的有益性を生み出すらしいという、本明細書で述べた命題に起因している。
治療用ベクターは、HIVの複製や転写の持続性を減少させるようトランスフェクトされた細胞または感染細胞に対しもたらすことを意図した、「有益な配列」を発現する。「有益な配列」を発現する遺伝子ベクターならびに、そのような遺伝子ベクターに由来するいかなるウィルスは、「治療用ベクター」とここで名づけられている。
本発明では、一部にはHIV感染に対し感受性が強いかまたはHIVを伝播できる細胞への遺伝子改変に向けられている。そのような細胞は、ここでは「標的細胞」と名づけられている。
本発明は、成熟したまたは未成熟の標的細胞、白血球、血液細胞、あらゆる幹/前駆細胞、および/あるいはそれらの子孫細胞のHIV感染に対する感受性を減少させる組成物と治療用のウィルスベクターの使用方法を与える。
また本発明は、再プログラムされた細胞、誘発された多能細胞、誘発された多能性細胞および/あるいはそれらの子孫細胞のHIV感染に対する感受性を減少させる組成物と治療用のウィルスベクターの利用方法を与える。
本発明の更なる目的は成熟したあるいは未成熟の標的細胞、幹/前駆細胞(再プログラムされた細胞、誘発された多能細胞、誘発された多能性細胞を含む)および/あるいはそれらの子孫細胞が免疫不全ウィルスの複製や転写を維持する能力を減少させることである。
本発明のもう1つの目的は、成熟または未成熟の標的細胞、その他の静止状態の細胞、幹/前駆細胞および/あるいはそれらの子孫細胞において有効で長期的に治療用配列発現することである。
ある局面では本発明は、HIV感染を予防しまたは治療する方法も提供する。その方法は、治療用ベクターまたは配列をトランフェクトされた幹細胞を、HIVに感染した患者に移植することを含む。
有効な配列は、HIVウィルスが細胞に感染する能力、ウィルスDNAを転写する能力、または感染した細胞内で複製する能力を減少させるまたはHIV感染を中和する細胞の能力を高めるものだろう。
合成オリゴヌクレオチドの様々な種類のいずれも、治療用ベクターのトランスフェクションを介して発現されてもよい。また、本発明はこのようなオリゴヌクレオチドのあらゆる可能な組み合わせに関する。
デコイRNA
一つの好ましい実施の形態としては、治療用ベクターは、HIV−2 TAR および/あるいはRREデコイ配列を組み合わせて合成ヌクレオチド配列をコードすることによって、HIVのライフサイクルの複数の段階を標的とする。
更なる実施の形態としては、合成ヌクレオチド配列は、CCR5、 CXCR4などのHIV共受容体を標的にする。
好ましい一つの実施形態では、EF−1 alphaは、U6プロモータがRNAデコイの発現を駆動する一方で、siRNA配列の発現を駆動している。
好ましい実施態様では、治療用vcctor含む治療は、薬理学的治療を含む抗レトロウイルス療法の他のモードと組合わされる。治療用ベクターとの組み合わせに適した抗レトロウイルス療法は、治療用ベクターとの組み合わせにおける付加または相乗効果のある治療である。
しかしながら、以前に増やした幹細胞/前駆細胞/白血球を所望の細胞に分化させる任意の方法は、HIV感染および/あるいはHIV複製および/あるいはHIV転写に対し相対的に抵抗性のある機能的標的細胞が生成される限り、本発明の範囲内で働き得る。
次に、生成された細胞集団は通常最適な速度未満の速度で、および細胞の必要な細胞株、細胞型、細胞クラス(CD4 + T細胞など)への分化を促進する因子の存在下で細胞の成長を促進する条件下で培養される。
発明はこの他に、治療用ベクターによるトランスフェクション前あるいは後に当該技術分野で既知の手段(US Patent Application 20060099177など)によって、選択した細胞および/または子孫細胞の培養での増殖を開示する。このような方法はまた、LIF、スチールファクター、Il−6、IL−7、オンコンスタチン−Mおよび/あるいはカーディオトロピン−I、およびその他の成長促進サイトカインなどによる培養を含む。 本発明はさらに、適切なサイトカインおよびM−CSF(CSF−1)、GM−CSF、IL−7、CD4+T細胞分化を促進する任意のサイトカインなどコロニー刺激因子などの成長因子を含む培地での更なる培養により治療用ベクターでトランスフェクトされた細胞の所望の細胞型への定方向分化も開示する。
選択した細胞および標的細胞の遺伝子改変は、それらが外因性の細胞あるいは内因性の細胞であるかに関係なく、当該技術分野において既知であり、公開済みあるいは未公開の方法(U.S. Pat. Nos. 6,432,711, U.S. 05,593,875, U.S. 05,783,566, U.S.5,928,944, U.S. 05,910,488, U.S. 05,824,547など)、あるいはその他の一般的に通用する手段によって実施可能である。宿主細胞を形質転換するための適切な方法は、Sambrook et al (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press (1989))およびその他の研究室の教科書に記載されている。
適切なEGFP−NumbおよびEGFP−Numblike、およびEGFP−Xレンチウイルスベクター(ここでXは本発明で説明した任意の導入遺伝子)は適切なウイルスベクターにクローニングによって生成されることができる(例えば、二つの遺伝子HIV−EGFP−HSAベクター)(ライザーら、2000))。アダプタプライマーは、NumblikeとNumbアイソフォームcDNAのPCR増幅のためおよび遺伝的ベクター中へのクローニングのために選択することができる。クローニングのための準備では、遺伝子ベクターは酵素で消化される。その後、各導入遺伝子のcDNAは、先にHSAのcDNAで占められたネフコーディングに挿入される。EGFP(強化緑色蛍光たんぱく質)と細胞集団に適切なプロモーター(すなわちCMVまたはEFlアルファなど)は、その前に、ウイルスコード領域に挿入された。遺伝子構築物は、ベクターバックボーンを含むおよび異種核酸配列に作動可能に連結するプロモーターを調節するトランスアクチベーターを含むことができる。
例2:他の適したベクターの例は、レトロウィルスベクターである。レトロウィルスは、RNAゲノムを含むRNAウィルスである。Gag、pol、env遺伝子は、末端長反復(LTR)配列によって隣接される。5’ と3’ LTR配列は、mRNAの転写とポリアデルニ化を促進する。
例3:本発明のNumb/Numblikeコードベクター、および/または他のトランスジェニックベクターの生成のための例示の方法
本発明の、得られるNumb/Numblikeコードベクター、および/または他のトランスジェニックベクターは、Invitrogen社のウイルスパワーレンチウイルス発現システムマニュアル、2007年に教えているものを含む。簡潔には、EmGFPに基づくカセットPmlI−BIpIフラグメントとしてpLenti6/R4R2/V5−DESTベクターにクローン化され、一方、miR−長(PRR+)numbアイソフォームかまたはmiR−短numbアイソフォーム/ numblikeカセットは、同時にBP反応によってpDONR221に移入される。その後、調節可能なプロモーターとmiR −アイソフォームカセットは、改変されたpLenti6/EmGFPに基づく/R4R2−DESTベクター中にマルチサイトLR交差される。複数のベクターは、合成オリゴヌクレオチドと導入遺伝子カセットのさまざまな組み合わせを含むこの方法で生成することができる。
「パッケージ細胞株」は、ウィルスのgag、 pol、 env構造遺伝子によって、正常細胞株にトランスフェクトしたまたは感染させて生じたヒトおよび/あるいは動物の繊維芽細胞株から得られる。その一方で、パッケージ細胞株は、psi配列のRNA欠陥を生む。従って、パッケージ細胞から生成されたウィルス粒子は、gag、pol、またはenv遺伝子を含まない。一度、psi配列を含む治療用ベクターのDNAが、トランスフェクションまたは感染によって、パッケージ細胞に導入されると(治療用遺伝子とともに)、パッケージ細胞は治療用のRNAを最終標的細胞(例:CD4+細胞)へ移送する様々な能力を生成することができる。
治療用ベクターの上清を生成する例のプルコトルは以下の方法で得られる。
2.70マイクロリットルの2MCaCl2が、ゆるやかなタッピングを繰り返しながら混合液に入れられる。
3.チューブの中に、青い沈殿が初めて起こったら、生成物はパッケージ細胞(商業用ベンダーのいくつからでも)の30%の密集した層にゆるやかに適用すべきであるDNA混合物は、パッケージ細胞から最初に培地を除いた後にのみ適用すべきである。
4.パッケージ細胞は、室温(25℃)に置いて20−30分培養してから、36‐38度のインキュベーターに3.5時間入れられる。
5.3.5−4ミリリットルの15%グリセロールを含むヘペス緩衝化生理食塩水を3分間加えて、次に細胞をDulbeccoの改変Eagle培地(DMEM)+10% FBS x2で洗浄する。
6.DMEM+10% FBSをもどして加え、37度で20時間細胞を培養する。
7.取り除き、治療用のウィルス粒子を含む培養液を取り除いてろ過する。
8.安定的な生産ラインは、分割パッケージ細胞株を1から20、または1から40に分割し、その後に、これらの細胞を最大10日間(3日ごとに培地を交換する)選択薬(トランスフェクトした耐性遺伝子に対応する特定の抗生物質)を含む培地中で培養することによって確立することができる。
コロニー形成単位/ml=同定されたコロニーXの0.5(分割因子)/ウイルスの液量(ml)
この推定値の精度は、“テスト”細胞の多くのプレートにわたり大液量の上清を試験することによって上昇する。
選択された細胞は、グルタミン、β−メルカプトエタノール、10%(体積で)ウマ血清、ヒト遺伝子組換え白血病抑制因子(LIF)で補充したダルベッコの改変最小必須培地(DMEM)で増殖/成長させることができる。LIFによって、細胞のフィーダー層上で選択した細胞を維持する必要がなくなり、(それもまた使用してもよく)、さらに、未分化、多能、または多能性の状態にある選択された細胞を維持するために必須であり、このような細胞をグルタミン、β−メルカプトエタノール、10%(体積で)ウマ血清、およびヒト遺伝子組換え白血病抑制因子(LIF)を補充したダルベッコの改変最小必須培地(DMEM)で維持することができる。LIFにより、細胞のフィーダー層上で細胞を維持する必要がなくなり、(それもまた使用してもよく)、さらに未分化状態にある細胞を維持するために必須である(米国特許6432711によって)。
選択した細胞(例:臍帯血、またはその他の適する供給源および/あるいはそれらの子孫細胞からの細胞.)は検査され、遺伝子が改変され(オプション)、増殖させられ、望まれる細胞タイプ(オプション)への分化開始のために誘導することができる。それら細胞は、標準的な幹細胞移植プロコトルに従って移植される。特定の例として、細胞はHLAマッチングなしに移植してよい。
例7:ごくまれな例では、生体内における細胞分裂または細胞分化を刺激するか抑制する目的で、導入遺伝子をコードするベクターを患者に導入することは適切であろう。
体外では外因性の細胞や、患者の内因性の細胞の遺伝子改変のいずれかを当技術分野で公知の公表されたか未公表の方法(米国特許第6,432,711、同第05593875、同第05783566、同第5928944、同第05910488、同第05824547など)または、他の一般に受け入れられた手順によって実施することができる。宿主細胞を形質転換するために適した方法をSambrookら(Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nd Edition,Cold Spring Harbor Laboratory press(1989))、および他の研究室の教科書に発見することができる。うまくトランスフェクトした細胞はRNAの発現アッセイと形態学的解析に加えて、抗生物質耐性遺伝子などのマーカーを含む選択プロトコルによって識別される。適切なレベルで適切な外因性のDNAを発現するうまくトランスフェクトした細胞からクローンは、凍結保存(当技術分野で公知の任意の適切な凍結保存方法を用いて)によって細胞株として凍結保存することができる。
選択マーカー(例えば、抗生物質耐性遺伝子)として、G418、ハイグロマイシンとメトトレキサートなどの薬に耐性を与えるものなどを挙げることができる。関心のある遺伝子を含む細胞を、選択可能なマーカー遺伝子を組み込んだ細胞は生き残るが、そうでない細胞は死滅する薬剤選択によって識別することができる。
例9:遺伝子ベクターの宿主への導入
選択した細胞(成長培池または分化培池の何れか由来)の胎児神経系への移植または遺伝子ベクターを用いる内因性胎児細胞の遺伝子改変は、以下の様式で実施することができる:無菌状態の下では、子宮や胎児を超音波や放射線学の指針によって視覚化される。あるいは、胎児の頭蓋骨のランドマークの直接の識別を容易にするため、子宮が手術で露出されることがある。次に選択された細胞を注射によって(適切な大きさに作られたカテーテルまたは針を用いて)、脳室のシステム、胚ゾーンまたは神経系の物質に導入することができる。注射は、特定の場合では、母親の腹壁、子宮壁と胎児の膜を介して胎児になされることがある。注射の精度を直接観察、超音波、コントラスト、または放射性同位体に基づく方法、または当技術分野で公知の放射線学の指針のその他の任意の手段によって監視する。
1つの器官系の病気は、別々の器官系から遺伝子改変細胞で治療できる可能性がある。また、いくつかの場合、選択した細胞を、成長培地および/または分化培地で培養した後、血流(動脈、静脈または肝のいずれか)に注入されるならば、その選択した細胞はインビボで十分な量組み込んでそれら自身で分化し得ることが明らかになるだろう。このアプローチは、本発明により包含される。びまん性筋(例えば、筋ジストロフィー)、器官、組織または血液障害(例えば、遺伝性球状赤血球症、鎌状赤血球貧血、他のhemoglobinopathies等)は、例えば、成長培地または分化培地から分離された細胞の患者への、特に患者の循環への注入を伴う。このアプローチは、また、心筋梗塞、脳卒中などの虚血性傷害を改善するだけでなく、脳や他の組織への外傷を改善すると考えられている。針やカテーテルによる血流中に本発明によって生成したそのような細胞の直接の注入により、細胞が骨髄、筋肉、腎臓、肺、および/またはその他の他の任意の器官系に「帰る」ことが可能となり、同様に、骨髄空間に直接注射することは、本発明の実施に適している。同様に、超音波、放射線または蛍光透視指針を用いるか用いないで、損傷部位に細胞を直接注射することも本発明の実施に適している。
カナバン病(ASP);テイサックス病(HEXA);レッシュナイハン症候群(HRPT);ハンチントン病(HTT);スライ症候群;タイプAとBのニーマンピック病;サンドホフ病(HEXB)、ファブリー病(GLA); C型ニーマンピック病(NPCl);ゴーシェ病(GBA);パーキンソン病(PARK2等)フォンヒッペルリンダウ病、鎌状赤血球貧血(HBB)およびその他のサラセミアならびに同じような病気を含むが、これらに限定されない数百の病気や臨床状態が、本発明の方法によって治療および/あるいは改善することができる。これらの導入遺伝子は、正常遺伝子のコーディング領域、またはコーディング領域の一部を表すことがある。しかしながら、本発明の範囲は、特定の実施態様および、上記の例に限定されないことが理解されるべきである。本発明は、具体的に記載したものとは別のように実施してもよく、それらは添付の特許請求の範囲内である。
例14 一回もしくは複数回、ここに記された方法(またはその他の公表された方法)により生成された多能性の幹細胞の、静脈内投与および他の投与は、体に細胞の置換を提供し、そのような投与が加齢性老化の患者において寿命を延ばすかまたは健康増進に役立ち得ることが期待される。
本発明は、ここで記されている方法(またはその他の公表された方法による)により生成された多能、多能性、および/または自己再生できる幹細胞からの生殖細胞の誘導を包含する。このような生殖細胞の生成は、不妊の治療ならびに生体外での胎芽の生成に適するであろう。(例: Hubner et al., 2003; Kehler et al., 2005;Nayernia et al., 2006a; Nayernia et al., 2006b; Drusenheimer et al., 2007;Moore et al., 2007; など)
例16:トランスジェニック動物の形成
本発明は、トランスジェニック動物の形成を包含する。他の多能性細胞を用いる場合、ここで記されている方法(またはその他の公表された方法)により生成された多能性細胞は、当技術分野で知られている任意の方法によりトランスジェニック動物を生成するために利用することができる。
用いることができるレトロウイルスベクターの例は、Moloneyマウス白血病ウイルス、Moloneyマウス肉腫ウイルスとラウス肉腫ウイルス、FIVや、HIVに由来するベクターを含むがそれらに限定されない。適切な発現ベクターは、真核生物の細胞にDNAまたはRNAのトランスフェクションに用いることができるものである。このようなベクターには、原核生物のベクター(例えば、細菌のベクターなど;真核生物のベクター(例えば、酵母のベクターと真菌のベクターなど、およびウイルスベクター(限定されないが、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターおよび、レトロウイルスベクターなど)が含まれるが、これらに限定されない。
miRNA)の発現が可能である。これらのベクターには、より長いpolIIの転写産物(プレmiRNA)由来の操作されたmiRNAの切除を誘導するための内因性miRNA由来の隣接配列およびループ配列がふくまれる。
治療用ベクターを生成する方法は、Invitrogen’s Viral Power Lentiviral Expression Systems Manualに記されている通りのものを含む。簡潔に言えば、EmGFPに基づくカセットは、PmlI−BlpI断片としてpLenti6/R4R2/V5−DESTベクター中にクローン化され、一方、miRデコイカセットが同時にBP反応によってpDONR221に輸送される。それから、EF1aプロモータとmiRデコイは、改変されたpLenti6/EmGFP−bsd/R4R2−DESTベクターに交差するMultisite LRである。
pLenti6/R4R2/V5−DESTベクター配列(配列番号1):
1)HIV感染症、2)HIVの複製および/または3)HIVの転写に比較的耐性のある多数の標的細胞を取得するため、前駆細胞/幹細胞をグルタミン、β−メルカプトエタノール、10%(体積で)ウマ血清、およびヒト組換え白血病抑制因子(LIF)を補充したダルベッコの改変最小必須培地(DMEM)で成長させることができる。LIFにより、前駆細胞/幹細胞を細胞のフィーダー層(使用しても構わない)上で維持する必要がなくなるが、LIFは、未分化状態の前駆細胞/幹細胞を維持するために必須である。
例22:治療用ベクターに含有させるのに適する合成オリゴヌクレオチド配列の例
70%を超える標的配列のたんぱく質発現をうまく減少させるいかなる合成オリゴヌクレオチド配列も本発明に包含される。
標的細胞がHIV複製を維持する能力を70%を超えるかそれよりも少ないが治療的程度にまで、または、標的細胞がHIVのウイルス活性を維持する能力を70%を超えるかそれよりも少ないが治療的程度にまでうまく減じる任意のデコイ配列もまた本発明に包含される。
RNAデコイに適したフランキング配列の例は以下に挙げられる:
好ましい実施の形態としては、血液幹細胞/前駆細胞、および標的細胞は、治療用ベクター(または随伴の治療用ウイルス)の宿主血液や組織、または骨髄などへの導入により、生体内において治療用ベクターを用いてトランスフェクトされる。最大の利点は、多くの内因性標的細胞および幹細胞/子孫細胞を改変することによって得られる。これは、適したサイズのカテーテルのような装置またはニードルを用いて、治療用ベクターを静脈循または動脈循環に注入することによって達成することができる。好ましい実施形態において、ウイルスはVSV−Gエンベロープ糖たんぱく質および天然HLV−1 envたんぱく質でシュードタイプされる。
成熟した末梢血Tリンパ球、単球、マクロファージ、T細胞前駆細胞、マクロファージ単球前駆細胞、および/あるいは多能性の造血幹細胞(臍帯血および占有骨髄空間にみられるものなど)などの血液細胞は、他の幹細胞/前駆細胞と同様に、生体外において治療用ベクターを用いてトランスフェクトすることができる。治療用ベクターの適切な濃度は、Browning et al., 1999と一致したものであってよい。その後、細胞は、生体外で拡張(増殖)され、続いて、細胞は、静脈内用針またはカテーテルを用いて静脈循環または動脈循環に細胞を導入することを介して宿主に移入される。その後、治療用ベクターによってトランスフェクトされた細胞は、骨髄や他の組織に「帰る」ことができる。
本発明を実行するのに有効な任意の導入遺伝子配列は、本発明における利用に適切である。適したヌクレオチド配列は、望まれる細胞または性質が得られる限り、どの種からも採取されてよい。このような配列の呼称方法は、同様に、本明細書において小文字または大文字のいずれも、特別な種類は表わさない。NCBIデータベース(アクセッション番号で列挙される)に保存される以下の配列は、本出願で上記で引用した配列の例を表わす。これらは、本発明に用いるのに適した配列(cds)をコードする特定遺伝子の例でもあるが、いずれの場合であっても、本発明の実施を制限するものではない。
Claims (135)
- HIV共受容体に対して向けられたデコイ、合成オリゴヌクレオチド配列および、合成ヌクレオチドを含む、HIV−lおよび/あるいはHIV−2の感染を阻止することができるベクター。
- 前記合成オリゴヌクレオチドは、siRNA配列、miRNA配列、shRNA配列群から選択されるオリゴヌクレオチドを含む、請求項1に記載のベクター。
- 合成オリゴヌクレオチドクラスの組み合わせを含む、請求項1に記載のベクターは分類される。
- ウィルスベクターである、請求項1に記載のベクター。
- 合成オリゴヌクレオチドはまた、HIV酵素を標的にする、請求項1に記載のベクター。
- 前記合成オリゴヌクレオチドは、標的細胞において活性なプロモータによって駆動される、請求項1に記載のベクター。
- 前記合成オリゴヌクレオチドは、EF−1 alphaプロモータによって駆動される、請求項1に記載のベクター。
- 抗生物質耐性たんぱく質または蛍光たんぱく質に対してコードするマーカー遺伝子のようなマーカー遺伝子を含む、請求項1に記載のベクター。
- HIV共受容体に向けられたデコイ合成オリゴヌクレオチド配列と合成オリゴヌクレオチドを含む、HIV−1および/あるいはHIV−2の感染を阻止することができるベクターであって、ここで該デコイ配列は、HIV RRE配列および/あるいはTARデコイ配列を含む、ベクター。
- 前記合成オリゴヌクレオチドは、siRNA配列、miRNA配列またはshRNA配列を含む、請求項9に記載のベクター。
- 合成オリゴヌクレオチドクラスの組み合わせを含む、請求項9に記載のベクター。
- ウィルスベクターである、請求項9に記載のベクター。
- 合成オリゴヌクレオチドは、HIV酵素も標的とする、請求項9に記載のベクター。
- 前記合成オリゴヌクレオチドは、標的細胞において活性なプロモータによって駆動される、請求項9に記載のベクター。
- 前記合成オリゴヌクレオチドがEF−1 alphaプロモータによって駆動される、請求項9に記載のベクター。
- 抗生物質耐性たんぱく質または蛍光たんぱく質に対してコードするマーカー遺伝子のようなマーカー遺伝子を含む、請求項9に記載のベクター。
- HIV−1および/あるいはHIV−2感染を阻止することができ、デコイ配列がHIV−1デコイ配列とHIV−2デコイ配列の組み合わせを表わす、ベクター。
- 合成オリゴヌクレオチドがsiRNA配列、miRNA配列またはshRNA配列を含む、請求項17に記載のベクター。
- 合成オリゴヌクレオチドクラスの組み合わせを含む、請求項17に記載のベクター。
- ウィルスベクターである、請求項17に記載のベクター。
- 合成オリゴヌクレオチドが、HIV酵素も標的とする、請求項17に記載のベクター。
- 前記合成オリゴヌクレオチドは、標的細胞において活性なプロモータによって駆動される、請求項17に記載のベクター。
- 前記合成オリゴヌクレオチドがEF−1 alphaプロモータによって駆動される、請求項17に記載のベクター。
- 抗生物質耐性たんぱく質また蛍光たんぱく質に対しコードするマーカー遺伝子のようなマーカー遺伝子を含む、請求項17に記載のベクター。
- HIV共受容体に対して向けられたデコイ合成オリゴヌクレオチド配列および合成オリゴヌクレオチドを含む、HIV−1および/あるいはHIV−2感染を阻止することができるベクターであって、該デコイ配列がHIV−2 RREデコイ配列およびHIV−2 TARデコイ配列を含む、ベクター。
- 前記合成オリゴヌクレオチドがsiRNA配列、miRNA配列あるいはshRNA配列を含む、請求項25に記載のベクター。
- 合成オリゴヌクレオチドクラスの組み合わせを含む、請求項25に記載のベクター。
- ウィルスベクターである、請求項25に記載のベクター。
- 合成オリゴヌクレオチドは、HIV酵素も標的とする、請求項25に記載のベクター。
- 前記合成オリゴヌクレオチドは、標的細胞において活性なプロモータによって駆動される、請求項25に記載のベクター。
- 前記合成オリゴヌクレオチドがEF−1 alphaプロモータによって駆動される請求項25に記載のベクター。
- 抗生物質耐性たんぱく質または蛍光たんぱく質に対しコードするマーカー遺伝子のようなマーカー遺伝子を含む、請求項25に記載のベクター。
- HIV−1および/あるいはHIV−2の感染を阻止することのできるベクターであって、HIV共受容体に対して向けられた合成オリゴヌクレオチドおよび、HIV RREデコイ配列、HIV TARデコイ配列を含む、ベクター。
- 前記合成オリゴヌクレオチドがsiRNA配列、miRNA配列またはshRNA配列を含む、請求項33に記載のベクター。
- 合成オリゴヌクレオチドクラスの組み合わせを含む、請求項34に記載のベクター。
- ウィルスベクターである、請求項34に記載のベクター。
- 合成オリゴヌクレオチドはHIV酵素も標的とする、請求項34に記載のベクター。
- 前記合成オリゴヌクレオチドは標的細胞において活性なプロモータによって駆動される、請求項34に記載のベクター。
- 前記合成オリゴヌクレオチドがEF−1 alphaプロモータによって駆動される、請求項34に記載のベクター。
- 抗生物質耐性たんぱく質または蛍光たんぱく質に対しコードするマーカー遺伝子のようなマーカー遺伝子を含む、請求項34に記載のベクター。
- HIV共受容体に対し向けられた合成オリゴヌクレオチドを含むHIV−1および/あるいはHIV−2の感染を阻止することのできるベクターであって、複数の合成オリゴヌクレオチドが単一HIV共受容体に対し向けられる、ベクター。
- 前記合成オリゴヌクレオチドは、siRNA配列、miRNA配列あるいはshRNA配列を含む、請求項41に記載のベクター。
- 合成オリゴヌクレオチドクラスの組み合わせを含む、請求項41に記載のベクター。
- ウイルスベクターである、請求項41に記載のベクター。
- 合成オリゴヌクレオチドは、HIV酵素も標的とする、請求項41に記載のベクター。
- 前記合成オリゴヌクレオチドは標的細胞において活性なプロモータによって駆動される、請求項41に記載のベクター。
- 前記合成オリゴヌクレオチドがEF−1アルファプロモータによって駆動される、請求項41に記載のベクター。
- 抗生物質耐性たんぱく質あるいは蛍光たんぱく質に対しコードするマーカー遺伝子などのマーカー遺伝子を含む、請求項41に記載の方法。
- CXCR4およびCCR5を含むHIV共受容体を標的とする合成ヌクレオチドを含むHIV−1および/あるいはHIV−2感染を阻止することができるベクター。
- 合成オリゴヌクレオチドはsiRNA配列、miRNA配列あるいはshRNA配列を含む、請求項49に記載のベクター。
- 合成オリゴヌクレオチドクラスの組み合わせを含む、請求項49に記載のベクター。
- ウイルスベクターである、請求項49に記載のベクター。
- 合成オリゴヌクレオチドは、HIV酵素も標的とする、請求項49に記載のベクター。
- 前記合成オリゴヌクレオチドは、標的細胞において活性なプロモーターによって駆動される、請求項49に記載のベクター。
- 前記合成オリゴヌクレオチドはEF−1アルファプロモーターによって駆動される、請求項49に記載のベクター。
- 抗生物質耐性たんぱく質または蛍光たんぱく質に対しコードするマーカー遺伝子などのマーカー遺伝子を含む、請求項49に記載のベクター。
- HIV共受容体に対し向けられた合成オリゴヌクレオチドを含むHIV−1および/あるいはHIV−2感染を阻止することができるベクターであって、HIV共受容体に対し向けられた合成オリゴヌクレオチドがmiRNA配列である、ベクター。
- 前記合成オリゴヌクレオチドは、siRNA配列、miRNA配列あるいはshRNA配列を含む、請求項57に記載のベクター。
- 合成オリゴヌクレオチドクラスの組み合わせを含む、請求項57に記載のベクター。
- ウイルスベクターである、請求項57に記載のベクター。
- 合成オリゴヌクレオチドは、HIV酵素も標的とする、請求項57に記載のベクター。
- 前記合成オリゴヌクレオチドは、標的細胞において活性なプロモーターによって駆動される、請求項57に記載のベクター。
- 前記合成オリゴヌクレオチドは、EF−1アルファプロモーターによって駆動される、請求項57に記載のベクター。
- 抗生物質耐性たんぱく質または蛍光たんぱく質に対しコードするマーカー遺伝子などのマーカー遺伝子を含む、請求項57に記載のベクター。
- デコイ合成ヌクレオチド配列およびHIV共受容体に対して向けられた合成オリゴヌクレオチドを含むHIV−1および/あるいはHIV−2感染を阻止することができるベクターであって、HIV共受容体に対して向けられた合成オリゴヌクレオチドがmiRNA配列である、ベクター。
- 前記合成オリゴヌクレオチドは、siRNA配列、miRNA配列あるいはshRNA配列を含む、請求項65に記載のベクター。
- 合成オリゴヌクレオチドクラスの組み合わせを含む、請求項65に記載のベクター。
- ウイルスベクターである、請求項65に記載のベクター。
- 合成オリゴヌクレオチドは、HIV酵素も標的とする、請求項65に記載のベクター。
- 前記合成オリゴヌクレオチドは、標的細胞において活性なプロモーターによって駆動される、請求項65に記載のベクター。
- 前記合成オリゴヌクレオチドは、EF−1アルファプロモーターによって駆動される、請求項65に記載のベクター。
- 抗生物質耐性たんぱく質または蛍光たんぱく質に対しコードするマーカー遺伝子などのマーカー遺伝子を含む、請求項65に記載のベクター。
- CXCR4に対して向けられた複数のmiRNA配列と、CCR5に対して向けられた複数のmiRNA配列と、HIV−2 RREデコイ配列と、HIV−2 TARデコイ配列とを含むHIV−1および/あるいはHIV−2感染を阻止することができるベクターであって、前記ベクターがウイルスベクターである、ベクター。
- 合成オリゴヌクレオチドは、siRNA配列、miRNA配列あるいはshRNA配列を含む、請求項73に記載のベクター。
- 合成オリゴヌクレオチドクラスの組み合わせを含む、請求項73に記載のベクター。
- ウイルスベクターである、請求項73に記載のベクター。
- 合成オリゴヌクレオチドは、HIV酵素も標的にする、請求項73に記載のベクター。
- 前記合成オリゴヌクレオチドは、標的細胞において活性なプロモーターによって駆動される、請求項73に記載のベクター。
- 前記合成オリゴヌクレオチドは、EF−1アルファプロモーターによって駆動される、請求項73に記載のベクター。
- 抗生物質耐性たんぱく質または蛍光たんぱく質に対しコードするマーカー遺伝子などのマーカー遺伝子を含む、請求項73に記載のベクター。
- HIV−2 RREデコイ配列および/あるいはHIV−2 TAR配列を含む免疫不全ウイルスによる感染を阻止することができるベクター。
- 合成オリゴヌクレオチドは、siRNA配列、miRNA配列あるいはshRNA配列を含む、請求項81に記載のベクター。
- 合成オリゴヌクレオチドクラスの組み合わせを含む、請求項81に記載のベクター。
- ウイルスベクターである、請求項81に記載のベクター。
- 合成オリゴヌクレオチドは、HIV酵素も標的とする、請求項81に記載のベクター。
- 前記合成オリゴヌクレオチドは、標的細胞において活性なプロモーターによって駆動される、請求項81に記載のベクター。
- 前記合成オリゴヌクレオチドは、EF−1アルファプロモーターによって駆動される、請求項81に記載のベクター。
- 抗生物質耐性たんぱく質または蛍光たんぱく質に対しコードするマーカー遺伝子などのマーカー遺伝子を含む、請求項81に記載のベクター。
- 患者の感染を改善するための方法であって、
1)免疫不全ウイルス感染を阻止することができるベクターを生成するステップと、
2)臍帯血細胞、造血細胞、末梢血、骨髄、精原細胞、始原生殖細胞、CD4+T細胞、マクロファージ、T細胞の前駆細胞、マクロファージ単球前駆細胞、CD34+幹細胞/前駆細胞および/または体外あるいは体内でHIV標的細胞に分化できる任意の細胞から選択される自己のまたはドナーの幹細胞/前駆細胞をトランスフェクトするステップと、
3)トランスフェクトした細胞を患者の血行または骨髄に導入するステップとを含む方法
。 - 前記幹細胞/前駆細胞は、成長促進培地で培養され、前記患者の血行に導入する前に前記細胞を拡張する、請求項89に記載の方法。
- マーカーたんぱく質の発現により、成功したトランスフェクションが監視される請求項89に記載の方法。
- 前記選択された幹細胞/前駆細胞はドナーの臍帯前駆細胞である、請求項89に記載の方法。
- 前記選択された幹細胞/前駆細胞が自己の末梢血の幹細胞/前駆細胞である、請求項89に記載の方法。
- 前記選択された幹細胞/前駆細胞が自己由来の、誘発した、あるいは再プログラミングされた多能あるいは多能性幹細胞である、請求項89に記載の方法。
- 患者のHIV感染を阻止する方法であって、ウイルスベクターを生成するステップと、前記ベクターから生成されたウイルスを該患者の血行に導入するステップとを含む、方法。
- デコイ合成オリゴヌクレオチド配列と、HIV共受容体に対して向けられた合成オリゴヌクレオチドとを含む免疫不全ウイルスによる感染を阻止することができるベクターであって、前記デコイ配列は、HIV RREデコイ配列および/あるいはTARデコイ配列とを含み、前記ベクターは、HIV−1配列およびHIV−2配列に対して向けられたリボザイム配列も含む、ベクター。
- デコイ合成オリゴヌクレオチド配列と、HIV共受容体に対して向けられた合成オリゴヌクレオチドとを含む免疫不全ウイルスによる感染を阻止することができるベクターであって、前記デコイ配列は、HIV RREデコイ配列および/あるいはTARデコイ配列とを含み、前記デコイ配列は、U6プロモーターにより駆動される、ベクター。
- Sox2たんぱく質、Oct4たんぱく質、NANOGたんぱく質、HOXB4たんぱく質、FGF4たんぱく質、LIF活性を有するたんぱく質、Notch活性を有するたんぱく質をコードする配列から選択された配列を含む追加のヌクレオチド配列の他、哺乳類numbたんぱく質の「長」(PRR挿入+)アイソフォームをコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子ベクター。
- 短NumbアイソフォームおよびNumblikeを標的とする合成オリゴヌクレオチドも含む、請求項98に記載のベクター。
- 哺乳類のnumbたんぱく質の「長」(PRR挿入+)アイソフォームをコードする前記ヌクレオチド配列ならびに、Nanog、Oct3/4、Sox2、Hoxb4、FGF−4、LIF、LIFR、CNTF、オンコスタチン(OSM)、オンコスタチン受容体(OSMR)カーディオトロフィン−l、IL−6、IL6R、 hyper IL−6、 IL−11、 gpl30、LIF活性を有する他のたんぱく質および/あるいはNotch活性を有するたんぱく質をコードする配列から選択される配列を含む追加のヌクレオチド配列が、条件付きで発現され、テトラサイクリン感受性プロモーターなどの条件付きプロモーターによって駆動される、請求項98に記載のベクター。
- 多能、多能性、及び/または選択した細胞から自己再生できる細胞を製造する方法は、以下のものを含む:骨髄、末梢血、胎盤の血液、羊水、臍帯血、皮膚、脂肪組織、ヒト以外の胚細胞、造血細胞、精原細胞、精巣の始原生殖細胞、上皮細胞、循環白血球、単球マクロファージ、その他の体細胞、遺伝子改変臍帯血細胞、遺伝子改変羊水幹細胞、遺伝子改変骨髄細胞、遺伝子改変末梢血細胞、遺伝子改変脂肪細胞、遺伝子改変胎盤細胞、遺伝子改変造血細胞、遺伝子改変皮膚細胞、遺伝子改変精原細胞、遺伝子改変精巣の始原生殖細胞、遺伝子改変末梢血幹細胞、遺伝子改変上皮細胞、遺伝子改変白血球、遺伝子改変ヒト以外の胚細胞、その他の遺伝子改変幹細胞/前駆細胞と選択した細胞を提供するための体細胞に由来する細胞などの幹細胞/前駆細胞および体細胞型の群から細胞を選択する;Notch活性を有する蛋白質とLIF活性を有する蛋白質、FGF4蛋白質、HOXB4蛋白質、NANOG蛋白質、Oct4蛋白質、Sox2蛋白質をコードするヌクレオチド配列から選択した追加のヌクレオチド配列と哺乳類のnumb蛋白質の「長」(PRR挿入+)アイソフォームをコードするヌクレオチド配列で選択した細胞をトランスフェクトする;EGF, bFGF, LIF, スチールファクター、IL−6, hyper IL−6, IL−7, オンコスタチン−M, カーディオトロフィン−1、および選択した細胞がある速度で拡張するのに効率的な他の成長を高めるサイトカインから選択したサイトカインを含む成長培地中で選択した細胞を成長させるがここで前記速度は前記成長培地中で選択した細胞の倍加時間から決定される;そして目的の細胞数になるまで、これらの培養条件下で細胞を維持する。
- 前記成長培地が条件つきの導入遺伝子発現を誘導するための誘導剤をさらに含む、請求項101に記載の方法。
- 生体内でさらなる分化が可能な所望の分化細胞集団を提供する方法であって、前記所望の細胞は、分化造血細胞、神経細胞、ドーパミン作動性ニューロン、セロトニン作動性ニューロン、コリン作動性ニューロン、ノルアドレナリン作動性ニューロン、GABA作動性ニューロン、筋細胞、心筋細胞、内胚葉と膵臓ランゲルハンス島の細胞、生殖細胞または他の所望の細胞を含み、該方法は、骨髄、末梢血幹、胎盤の血液、羊水、臍帯血、皮膚、脂肪組織、ヒト以外の胚、造血細胞、精原細胞、精巣の始原生殖細胞、上皮細胞、循環白血球、単球マクロファージ、その他の体細胞、遺伝子改変臍帯血細胞、遺伝子改変羊水幹細胞、遺伝子改変骨髄細胞、遺伝子改変末梢血細胞、遺伝子改変脂肪細胞、遺伝子改変胎盤細胞、遺伝子改変造血細胞、遺伝子改変皮膚細胞、遺伝子改変精原細胞、遺伝子改変精巣の始原生殖細胞、遺伝子改変末梢血幹細胞、遺伝子改変上皮細胞、遺伝子改変白血球、遺伝子改変ヒト以外の胚細胞、選択された細胞を提供するためのその他の遺伝子改変幹細胞/前駆細胞および体細胞由来の細胞などの幹細胞/前駆細胞および体細胞型の群から細胞を選択するステップと、
Sox2たんぱく質、Oct4たんぱく質、NANOGたんぱく質、HOXB4たんぱく質、FGF4たんぱく質、LIF活性を有するたんぱく質および、Notch活性を有するたんぱく質をコードする配列から選択された配列を含む付加的なヌクレオチド配列の他、哺乳類のnumbたんぱく質の「長」(PRR 挿入+)アイソフォームをコードするヌクレオチド配列で前記細胞をトランスフェクトするステップと、前記選択された細胞が第1の成長速度で成長するのに有効な成長培地で前記選択された細胞を成長させるステップであって、前記第1の成長速度は前記成長培地内で前記選択された細胞の倍加時間から決定されるステップと、
目的の細胞数を達成するまで、これらの培養条件下で前記細胞を維持するステップと、前記選択された細胞が分化培地の中で第2の成長速度で成長する有効な前記分化培地で前記選択された細胞を培養するステップであって、前記第2の成長速度は、前記分化培地内で前記選択された細胞の倍加時間から決定され、前記第2の成長速度は前記第1の成長速度の約10%から約90%の間の成長速度であり、
前記分化培地は、前記選択された細胞を前記所望の分化細胞への分化又は改変を促進する上で効果的な少なくとも1つの分化作用物質を含み、さらに
前記分化作用物質はレチノイン酸、神経成長因子、ジメチルスルホキシド、およびヘキサメチレンビスアクリルアミド、または前記所望の細胞型に適切なその他の分化作用物質からなる群から選択される、方法。 - 請求項103に記載の方法であって、
i)前記細胞をヌクレオチド配列、特に転写因子でトランスフェクトすることによって該細胞のいくつかを望まれる細胞への分化を開始するよう促すステップと、
ii)前記細胞を最も短い(Prr−/PTB−)NumbアイソフォームまたはNumblikeをコードするヌクレオチド配列でトランスフェクトするステップと、
iii)前記細胞をPRR+numbアイソフォームを標的にした合成オリゴヌクレオチド配列によりトランスフェクトするステップのうち1つまたは複数のステップをさらに含む、方法。 - 前記望まれる細胞が心筋細胞であり、その細胞がDMSOやNBS、レチノイン酸、および/または心筋細胞の訓化培地を含む分化培地の中で培養される、請求項103に記載の方法。
- 前記望まれる細胞が神経細胞であり、その細胞が神経成長因子やレチノイン酸から選択された分化作用物質を含む分化培地の中で培養される、請求項103に記載の方法。
- 前記望まれる細胞が筋細胞であり、その細胞がヘキサメチレンビスアクリルアミド、またはジメチルスルホキシドを含む分化培地の中で培養される、請求項103に記載の方法。
- 生体内でさらなる分化が可能な所望の細胞集団を提供する方法であって、
骨髄、末梢血幹、胎盤の血液、羊水、臍帯血、皮膚、脂肪組織、ヒト以外の胚、造血細胞、精原細胞、精巣の始原生殖細胞、上皮細胞、循環白血球、単球マクロファージ、その他の体細胞、遺伝子改変臍帯血細胞、遺伝子改変羊水幹細胞、遺伝子改変骨髄細胞、遺伝子改変末梢血細胞、遺伝子改変脂肪細胞、遺伝子改変胎盤細胞、遺伝子改変造血細胞、遺伝子改変皮膚細胞、遺伝子改変精原細胞、遺伝子改変精巣の始原生殖細胞、遺伝子改変末梢血幹細胞、遺伝子改変上皮細胞、遺伝子改変白血球、遺伝子改変ヒト以外の胚細胞、選択した細胞を提供するためのその他の遺伝子改変幹細胞/前駆細胞および体細胞に由来する細胞などの幹細胞/前駆細胞および体細胞型の群から細胞を選択するステップと、目的の細胞数を達成するまで、成長培地で前記細胞を維持するステップと、前記細胞をヌクレオチド配列、特に転写因子でトランスフェクトして、前記細胞の所望の細胞への分化開始を促進するステップと、
前記細胞を最も短い(Prr−/PTB−) NumbアイソフォームあるいはNumblikeをコードするヌクレオチド配列でトランスフェクトするステップと、前記選択された細胞を望まれる分化をした細胞へと、分化または改変を促進するのに効果的な少なくとも1つの分化作用物質を含む分化培地中で培養するステップとを含み、さらに前記分化作用物質はレチノイン酸、神経成長因子、ジメチルスルホキシド、ヘキサメチレンビスアクリルアミド、または前記望まれる細胞タイプに適した他の分化作用物質からなる群から選択される、方法。 - 前記細胞が、前記最も短い(Prr−/PTB−) NumbアイソフォームまたはNumblikeをコードするヌクレオチド配列でトランスフェクトされない、請求項108に記載の方法。
- 前記望まれる細胞が筋細胞であり、該細胞がMyoD,ミオゲニン、ミオカルディン、Myf5、Myf6、Mef2A、Gata4、Gata5、およびGata6から選択される因子を含む転写因子でトランスフェクトされる方法であって、該望まれる細胞が骨格筋細胞、平滑筋、または心筋であるか否かに依存する、請求項108に記載の方法。
- ドーパミン作動性ニューロンが前記望まれる細胞であり、その細胞が前記分化培地の中で培養する前に、Mash1、Ngn2、Nurr1、Lmxlb、および/またはPtx3から選択された因子を含む転写因子でトランスフェクトされる、請求項108に記載の方法。
- セロトニン作動性ニューロンが前記望まれる細胞であり、その細胞が前記分化培地の中で培養する前に転写因子でトランスフェクトされる、請求項108に記載の方法。
- 前記転写因子は、Mashl、 Phox2b、 Lmxlb、Nkx2.2、 Gat
a2、Gata3およびPetl を含む、請求項112に記載の方法。 - コリン作動性のニューロンが前記望まれる細胞であり、その細胞が前記分化培地の中で培
養する前に、MASHl、 Phox2aおよびREST4から選択される因子を含む転
写因子でトランスフェクトされる、請求項108に記載の方法。 - GABA作動性ニューロンが前記望まれる細胞であり、その細胞がLIF、NT3、およ
びNGFから選択される分化作用物質を含む分化培地の中で培養する前に、MASHl、Phox2a、およびREST4から選択される因子を含む転写因子でトランスフェクトされる、請求項108に記載の方法。 - ノルアドレナリン作動性ニューロンが前記望まれる細胞であり、その細胞が、Mashl、Hand(HAND2)、Phox2a、Phox2b、Gata2およびGata3から選択される因子を含む転写因子でトランスフェクトされる、請求項108に記載の方法。
- GABA作動性ニューロンが前記望まれる細胞であり、その細胞が、PITX2、Dlx2、Dlx5、およびHes1をターゲットとするRNAから選択される因子を含む転写因子でトランスフェクトされる請求項108に記載の方法。
- ニューロンが前記望まれる細胞であり、その細胞がPITX2、Dlx2、Dlx5、Nurr1、REN、ニューロゲニン1、ニューロゲニン2、ニューロゲニン3、Mashl、Phox2b、Phox2a、dHand、Gata3、Shh、FGF8、Lmx1b、Nkx2.2、Pet1、Lbx1、Rnxおよび/またはアンチセンスHes1 RNAから選択される因子を含む転写因子でトランスフェクトされる、請求項108に記載の方法。
- 膵臓ランゲルハンス島細胞、または内胚葉細胞が前記望まれる細胞であり、前記選択された細胞はFoxa2、Soxl7、HLXB9およびPdxlから選択される因子を含む転写因子でトランスフェクトされ;そして追加の分化作用物質は酪酸ナトリウム、アクチビンA、レチノイン酸、上皮細胞増殖因子、塩基性線維芽細胞増殖因子、ノギン、インスリン様成長因子II、ニコチンアミドから選ばれる、請求項108に記載の方法。
- 前記望まれる細胞は造血細胞であり、前記細胞はRunxl/AMLlをコードするヌクレオチド配列でトランスフェクトされ、前記分化作用物質は、望まれる細胞型に適したVEGF、トロンボポエチン、およびコロニー刺激因子から選択される、請求項108に記載の方法。
- 内臓器官、筋系、心臓、中枢神経系、血液、他の組織の障害を患っていて、治療が必要な患者に処置する方法であって、骨髄、末梢血液幹、胎盤の血液、羊水、臍帯血、皮膚、脂肪組織、ヒト以外の胚、造血細胞、精原細胞、精巣の始原生殖細胞、上皮細胞、循環白血球、単球マクロファージ、他の体細胞、遺伝子改変臍帯血細胞、遺伝子改変羊水幹細胞、遺伝子改変骨髄細胞、遺伝子改変末梢血細胞、遺伝子改変脂肪細胞、遺伝子改変胎盤細胞、遺伝子改変造血細胞、遺伝子改変皮膚細胞、遺伝子改変精原細胞、遺伝子改変精巣の始原生殖細胞、遺伝子改変末梢血幹細胞、遺伝子改変上皮細胞、遺伝子改変白血球、遺伝子改変ヒト以外の胚細胞、選択した細胞を提供するための他の遺伝子改変幹細胞/前駆細胞および体細胞に由来する細胞などの幹細胞/前駆細胞および体細胞型の群から細胞を選択するステップと、前記細胞を哺乳類のnumbたんぱく質の「長」(PRR挿入+)アイソフォームならびに、Nanog、Oct3/4、Sox2、Hoxb4、FGF−4、LIF、LIFR、CNTF、オンコスタチン、カーディオトロフィン−1,IL−6,IL−6R,hyper IL−6、IL−11、gp130、LIF活性を有する他のたんぱく質、およびNotch活性を有するたんぱく質をコードする配列から選択される配列を含む追加のヌクレオチド配列でトランスフェクトするステップと、
前記選択された細胞が分化培地中で第2の成長速度で成長するのに有効な分化培地の中で培養し、ここで該第2の成長速度は該分化培地の中での該選択された細胞の倍加時間から決定され、さらに該第2の成長速度は第1の成長速度の約10%から約90%の間の成長速度であり、該分化培地は、該選択された細胞の分化または改変を促進して分化細胞にするのに効果的なジメチルスルホキシド、およびヘキサメチレンビスアクリルアミドからなる群から選択される少なくとも1つの分化作用物質を含むステップと、該分化細胞を前記患者の血行、器官、神経系、または他の組織に注入し、それにより前記障害が改善または治療されるステップとを含む、方法。 - 請求項121に記載の方法であって、前記細胞を前記望まれる細胞へと分化を開始するよう促進するヌクレオチド配列、特に転写因子で該細胞をトランスフェクトするステップと前記細胞を最も短い(Prr−/PTB−) NumbアイソフォームまたはNumblikeをコードするヌクレオチド配列またはPRR+ numbアイソフォームを標的にする配列でトランスフェクトするステップから選択されるステップを更に含む、請求項12に記載の方法。
- 選択された細胞は望まれる細胞数を達成した後に前記成長培地から単離され、前記患者の血行、器官、神経系、または他の組織に注入され、それによって前記障害が改善されるか治療される、請求項121に記載の方法。
- 核酸またはたんぱく質が選択した細胞の中で過剰発現するかまたは導入されており、これらの核酸またはたんぱく質は、長(Prr+) numbアイソフォーム、Nanog、Oct3/4、Sox2、Notch活性を有する導入遺伝子、Hoxb4,FGF−4、LIF、LIFR、CNTF、オンコスタチン、オンコスタチン受容体、カーディオフィリン−1、IL−6、IL6R、hyper IL−6、IL−11、gpl30およびLIF活性を有する他の導入遺伝子をコードするものから選択されたものを含む自己再生、多能、および/または多能性細胞の集団を獲得する方法。
- 請求項124に記載の方法であって、用いるトランスフェクションの方法は、電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび/あるいはレトロウィルス/レンチウィルスの組込み、または他の細胞のゲノムのランダムな変換を避ける別の方法である方法。
- 自己再生、多能、および/または多能性細胞の集団を獲得する方法であって、単一の遺伝子あるいはその一部に対応する核酸あるいはたんぱく質が選択された細胞の中に過剰発現あるいは導入され、これらの核酸あるいはたんぱく質が長(Prr+) Numbアイソフォーム、Nanog、Oct3/4、Sox2、Notch活性を有する導入遺伝子、Hoxb4、FGF−4、LIF、LIFR、CNTF、OSM、OSMR、カーディオトロフィン−1、IL−6、IL6R、hyperIL−6、IL−11、gpl30をコードするものから選択された1つに対応する方法。
- 用いるトランスフェクションの方法は、電気穿孔法、リポソーム、ナノカプセル、ナノヴォールトおよび/あるいはレトロウィルス/レンチウィルスの組込みまたは他の細胞のゲノムのランダムな変換を避けるもう1つのアプローチである、請求項121に記載の方法。
- 遺伝子的に生産した自己再生細胞、多能細胞、多能性細胞および/あるいは分化細胞を、組織工学の目的で、3次元または2次元の足場で培養する、請求項121に記載の方法。
- 遺伝子的に生産した自己再生細胞、多能細胞、多能性細胞、および/または分化細胞を、組織工学の目的で、脱細胞化器官か脱細胞化組織中で培養する、請求項121に記載の方法。
- 遺伝子的に生産した自己再生細胞、多能細胞、多能性細胞、および/または分化細胞を、組織工学の目的で、インクジェット印刷の技術と合わせ利用する、請求項121に記載の方法。
- 遺伝子的に生産した自己再生細胞、多能細胞、多能性細胞、および/または分化細胞をハンギングドロップで培養する、請求項121に記載の方法。
- 生殖細胞を遺伝子的に生産した自己再生細胞、多能細胞、および/または、多能性細胞から生産する、請求項121に記載の方法。
- 核酸が多能、多能性、自己再生を誘導する能力、および/または分化を開始する能力について、核酸をスクリーニングするための、請求項121に記載の方法であって、その配列は電気穿孔法、ナノカプセルまたナノヴォールトを利用して選択された細胞に導入される、方法。
- 多能、多能性、自己再生を誘導する能力、および/または分化を開始する能力について核酸をスクリーニングするための、請求項108に記載の方法であって、その配列が電気穿孔法、ナノカプセル、またはナノヴォールトを利用して選択された細胞に導入される、方法。
- 分化細胞が、所望な分化細胞中に通常存在する一つまたは一つより多い転写因子に対応する核酸またはタンパク質の過剰発現または導入による、遺伝子的に生産された、自己再生細胞、多能細胞、および/または多能性細胞から所望され産生される、請求項121に記載の方法。
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