CN108977463A - 一种用于抑制生产用干细胞分化的技术方法 - Google Patents

一种用于抑制生产用干细胞分化的技术方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种利用常规分离获得的干细胞，经分子克隆技术“过表达”能抑制干细胞分化，从而达到长期维持该类干细胞生长特性和分泌细胞因子特性的方法。用该方法建立的细胞株将能长期稳定的生长繁殖和分泌各种细胞因子。

Description

一种用于抑制生产用干细胞分化的技术方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及利用克隆技术“过表达”抑制干细胞分化。
背景技术
干细胞具有独特的分化潜能，能治愈组织难以自愈的创伤，能治疗临床上难以治愈的疾病，甚至可以使人返老还童、让青春永驻时，人们便开始企盼着于细胞时代的到来。
干细胞是一种具有自我复制功能和多分化潜能的早期未分化细胞，医学界称之为“万用细胞”。按照干细胞的分化潜能，分化层次及其所具有的功能，大致可分为三种类型：胚胎干细胞、组织干细胞和专能干细胞。胚胎干细胞又称全能干细胞，是从哺乳动物包括人的早期胚胎分离培养出来的。其分化潜能大、增殖能力强，既是胚胎发育的基础，又是机体各种细胞最早的祖先，由它可形成完整的生物个体，如早期的卵裂球细胞、胚泡中的内细胞群中的细胞、早期生殖嵴的胚芽细胞等。从某种意义上说受精卵也可视为特殊的全能干细胞。胚胎干细胞在进一步的分化中，可形成各种组织干细胞，又称多能干细胞，它具有分化出多种细胞组织的潜能，但不能发育成完整的个体，如多能造血干细胞、神经干细胞、表皮干细胞等均属于此类。这些多能干细胞在一定条件下可分化成定向发育的、多系列的专能干细胞。专能干细胞只能分化成某一类型的细胞.专能干细胞的分裂是不对称性的，即在其所形成的2个子代细胞中，1个仍保留原来干细胞的全部特征，以维持机体内干细胞在数量上和质量上的稳定；而另一子细胞却开始分化，发育，最终形成新的具有特定形态和功能的体细胞，以对正常相应组织细胞加以补充，维持细胞器官生长与衰亡之间的动态平衡。由于全能干细胞分化发育成体细胞的过程，是一个连续的过程，也是细胞数量上由少到多，功能上由幼稚到成熟的增殖、放大的过程。
干细胞的生物学特性
干细胞具有多种生物学特性，最主要的是具有自我更新和多向分化潜能及无限增殖能力。
干细胞还具有分泌多种细胞因子的能力，人表皮生长因子(EGF)、人角质细胞生长因子(KGF)、人成纤维细胞生长因子(FGF)、人血小板样衍生生长因子(PDGF)、纤维连接蛋白(FN)等。该细胞培养上清已被用于美容产品等的开发。各种细胞因子的生理学功能如下：
一、表皮细胞生长因子-EGF的生理功能
1.研究发现，EGF能促进上皮细胞、成纤维细胞的增殖；
2.增强表皮细胞的活力；
3.延缓表皮细胞的老化，使肌肤各组成成份保持最佳生理状态；
4..刺激细胞外一些大分子(如透明质酸和胶原白等)的合成与分泌、滋润皮肤，是决定肌肤活力和健康的源泉。
二、人血小板样衍生生长因子(PDGF)的生理功能
1.血小板衍生生长因子PDGF是祛皱抗衰的新秀，作用于真皮层的成纤维母细胞法，达到很好抗衰除皱效果。其作为祛皱抗衰成分在国外早已使用，如美国Reluma蕴涵丰富PDGF等生长因子成分的眼霜和润肤霜产品已成功上市，并取得消费者的一致好评。
2.诱导受损的上皮细胞与内皮细胞分裂增殖；
3.促进血管的形成与再生，为创伤修复提供保证。对于延缓衰老有明显疗效；
4.能刺激血管平滑肌细胞、成纤维细胞、胶质细胞的分裂增生；
5.能够促进肌纤维母细胞产生胶原，尤其是I型及Ⅲ型胶原；
6.促进皮肤细胞的生长与更新，提升皮肤组织的生理活性与新陈代谢水平，增强皮肤细胞的免疫力与自我修复能力，修复由于日光、严寒、化学物质与机械磨损伤害造成的红血丝与敏感肌肤，使皮肤细胞更加白皙润泽，鲜活饱满，让面部色斑暗沉，枯黄干燥的衰老面貌焕然一新。
三、成纤维细胞生长因子(FGF)的生理功能
1.日常摩擦、刮伤、烫伤、摔伤等所致的新鲜创面快速修复；
2.日光照射和滥用低值化妆品及环境污染引起的皮肤发红、褪皮、变薄、敏感等快速修复；
3.皮肤早衰、萎黄、皱纹、松弛等快速修复；
4.皮肤粗糙，气候变化使皮肤干燥、皮肤灰黄、晦暗无光、脱屑等修复。
四、角质细胞生长因子(KGF)的生理功能
1.能特异刺激上皮细胞的新陈代谢等生理过程，包括细胞的再生、分化和迁移等；
2.组织特异性强，稳定，安全性好。KGF只作用于上皮细胞，通过其特异性受体在刺激上皮细胞生长的同时，能启动上皮细胞对皮下间质组织的协调信号反馈，促进新组织的形成，安全性好，无潜在的副作用；
3.对新生或老化的上皮细胞均有刺激生长分裂作用；
4.具有明显的除疤痕和抗辐射损伤的作用。
五、纤维连接蛋白(FN)的生理功能
1.大量的研究和临床应用已证明，FN在伤口的修复和愈合中起着十分重要的作用，是促进伤口愈合的关键物质；
2.国外已进行了人血浆FN在烧伤、创伤、败血症、感染等方面的应用研究。Nishida通过动物实验证明：将FN涂到大鼠皮肤的伤口表面其愈合速度明显加快。
3.对患有营养型角膜溃疡的病人，以眼药形式对病人进行治疗，用药2天后，表皮便开始大量增生。三周后，溃疡完全消失，未产生疤痕及副作用。
4.向溃疡处涂了FN，可以与伤口处胶原结合形成FN防护层，既有利于上皮细胞的迁移和增殖来修复伤口，又防止病菌的感染。
5.我国对FN的应用研究起步较晚，中国医学科学院基础医学研究所等单位的研究结果也证明：将FN与一些介质配合作为外用药膏治疗受机械创伤和烧伤，伤口愈合时间比对照组减少1/3—1/2，无感染、无疤痕、无任何副作用。
六、血管内皮细胞生长因子(VEGF)的生理学功能
1.VEGF通过增强小血管内皮细胞内的囊泡、细胞器、囊状结构的活性来促进血管腔内和腔外血浆成分代谢，以及通过对钙粘蛋白/链蛋白复合体的作用使单层内皮细胞之间的粘附连接松解，从而提高循环代谢中小血管通透性。血管通透性增加可使血浆蛋白外渗并形成细胞外基质，引起内皮细胞和基质细胞的转移。
2.VEGF刺激内皮细胞产生纤溶酶原激活物(upa和tpa)、纤溶酶原激活物抑制剂-1(pai-1)和胶原酶，并使蛋白分解增加而引起血管外基质成分改变，为内皮细胞迁移创造条件。
3.VEGF刺激内皮细胞增殖(VEGF仅可刺激内皮细胞增殖，而不能刺激其他类型细胞，如角膜内皮细胞、晶状体上皮细胞、纤维母细胞及肾上腺皮质细胞的增殖)。
4.VEGF促进内皮细胞的迁移，这是从血管前体形成内皮分支重要的一步。
5.VEGF抑制内皮细胞的凋亡。
干细胞培养技术发展日新月异。但干细胞培养过程中维持其干细胞特性，避免干细胞分化成为阻碍学界的技术瓶颈(LIF和bFGF对脐带间充质干细胞体外自我维持和更新的影响。中国实验血液学杂志，2016；24(1):184-190)。通常采用添加抑制干细胞分化的抑制剂，如以重组人白血病抑制因子(hLIF)、重组人碱性成纤维细胞生长因子(FGF2)为代表的细胞因子组合。来解决干细胞的分化，延长其干细胞的特性。但该类抑制因子需要外购，不仅需要成本，并且存在由于供应商的不同或批间的差异、冷链运输等不确定性问题，可能导致干细胞的分化。影响利用该干细胞所生产的某些干细胞制剂稳定性，甚至导致其分化为终末细胞而逐步死亡。最后不得不采用重新分离纯化获得干细胞，这样将导致生产用细胞的产生批间差异，无法保障产品的均一性和稳定性。
发明内容
本发明提供了一种用于抑制生产用干细胞分化的技术方法，该方法利用间充质干细胞，经分子克隆技术“过表达”抑制干细胞分化的人白血病抑制因子(hLIF)，从而达到长期维持该类干细胞的生长特性和分泌细胞因子特性的方法。
本发明还提供了由根据上述的用于抑制生产用干细胞分化的技术方法所得到的细胞株在表面局部外用细胞培养上清产品的生产中的应用。
本发明还提供了根据上述的应用所获得的产品在美容或创伤修复中的应用。
本发明还提供了根据上述的细胞株在表面局部外用细胞培养上清产品的生产中的应用所获得的产品在制备美容或创伤修复产品中的应用。
本发明提供了一种用于抑制生产用干细胞分化的技术方法，该方法包括：往目标干细胞中转入如SEQ ID NO.1所示的用于过表达出人白血病抑制因子(hLIF)的核酸片段。
其中，目标干细胞为间充质干细胞。
本发明涉及一种利用常规分离获得的干细胞，经分子克隆技术“过表达”能抑制干细胞分化，从而达到长期维持该类干细胞生长特性和分泌细胞因子特性的方法。用该方法建立的细胞株将能长期稳定的生长繁殖和分泌各种细胞因子。
该发明简便易行，适用于不同来源的干细胞产物的大规模生产，制备各种产品。由于其能长期维持干细胞特性，将为产品的均一性和可重复性提供保障。减少干细胞产品的批间差异，为干细胞应用于医学转化事业提供一条新的路径。
本发明的有益效果是：
本发明利用分子克隆技术将hLIF基因克隆至生产用干细胞中，经筛选亚克隆后，获得稳定表达分泌人白血病抑制因子的干细胞株。加上该细胞株本身可自分泌FGF2，从而维持细胞的干细胞特性，避免其发生横向或纵向分化，使之成为具有长期传代和稳定表达细胞因子能力的工程细胞株。以保障生产用干细胞的稳定性和可持续性，从而达到产品质量的稳定。同时由于该产品是其表达产物，经后续工艺处理纯化后，无活体细胞进入。且作为外用制剂应用于美容等产品开发，将是安全、可行和有效的。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1是本发明实施例2提供的hLIF-pEGFp-N1质粒载体图；
图2是本发明实施例2提供的EGFP荧光图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
常规间充质干细胞分离(以人脐带间充质细胞分离为例)
采用改良组织块贴壁法制备人脐带间充质干细胞。具体方法参考相关文献(改良组织块贴壁法制备人脐带间充质干细胞.《中国生物制品学杂志》,2014；27(3):415-418)。具体过程略。
实施例2
利用分子克隆技术，将人LIF基因(碱基序列如SEQ ID NO.1所示)导入“实施例1”获得的间充质干细胞。人LIF基因编码出的人白血病抑制因子蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。
(1)委托构建hLIF-pEGFP-N1真核表达质粒(见图1)；
(2)通过脂质体20000包裹已构建好的hLIF-pEGFP-N1真核表达质粒，按实验室常规用“实施例1”获得的脐带间充质干细胞进行转染；
(3)次日，换新鲜的opti-MEM换液；
(4)大约48小时置倒置显微镜下观察，发现有大约70％左右的细胞表达EGFP，有绿色荧光(见图2)。
实施例3
利用有限稀释法进行亚克隆，建立长期稳定表达人LIF的生产用干细胞。
(1)将“实施例2”、“步骤(4)”的细胞，用0.25％胰蛋白酶进行常规消化、收集细胞悬液；
(2)用血球计数板进行计数；
(3)用有限稀释法将细胞稀释为10个/ml，每孔接种100μl于96孔细胞培养板中，用含1600μg/ml G418选择培养基100μl/孔，进行选择培养；
(4)7天后，再次倒置显微镜下观察，选择具有绿色荧光，并且是单克隆来源(即镜下观察，每孔中仅有一致密细胞克隆)的细胞孔；
(5)用0.25％胰蛋白酶进行消化，并扩增至24孔板；
(6)适时进行扩增传代，并逐步减少G418用量至10μg/ml，继续培养；
(7)直至扩增量达到所需数量；
(8)常规收集，洗涤，加入干细胞冻存液，分装并作好标记；
(9)采用程序降温法冻存细胞于-196℃液氮中。
实施例4
稳定性考察。
(1)于冻存后不同时间段，将冻存细胞复苏并培养；
(2)于不同时间段检测其增殖活性及收集培养上清。并同时进行长期传代培养；
(3)用培养上清检测其抑制人髓样白血病细胞K562增殖的活性(以商品化rhLIF为对照)。
结果：复苏细胞经过长达9个月的传代，其增殖活性未见降低；未转染对照组，仅传代了两个月，即发现增殖活力明显下降，无法进一步传代；LIF抑制K562活性达128U/ml。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 伯仕利生物科技发展（盐城）有限公司
<120> 一种用于抑制生产用干细胞分化的技术方法
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 608
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atgaaggtct tggcggcagg agttgtgccc ctgctgttgg ttctgcactg gaaacatggg 60
gcggggagcc ccctccccat cacccctgtc aacgccacct gtgccatacg ccacccatgt 120
cacaacaacc tcatgaacca gatcaggagc caactggcac agctcaatgg cagtgccaat 180
gccctcttta ttctctatta cacagcccag ggggagccgt tccccaacaa cctggacaag 240
ctatgtggcc ccaacgtgac ggacttcccg cccttccacg ccaacggcac ggagaaggcc 300
aagctggtgg agctgtaccg catagtcgtg taccttggca cctccctggg caacatcacc 360
cgggaccaga agatcctcaa ccccagtgcc ctcagcctcc acagcaagct caacgccacc 420
gccgacatcc tgcgaggcct ccttagcaac gtgctgtgcc gcctgtgcag caagtaccac 480
gtgggccatg tggacgtgac ctacggccct gacacctcgg gtaaggatgt cttccagaag 540
aagaagctgg gctgtcaact cctggggagt ataagcagat catcgccgtg ttggcccagg 600
ccttctag 608
<210> 2
<211> 202
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Met Lys Val Leu Ala Ala Gly Val Val Pro Leu Leu Leu Val Leu His
1 5 10 15
Trp Lys His Gly Ala Gly Ser Pro Leu Pro Ile Thr Pro Val Asn Ala
20 25 30
Thr Cys Ala Ile Arg His Pro Cys His Asn Asn Leu Met Asn Gln Ile
35 40 45
Arg Ser Gln Leu Ala Gln Leu Asn Gly Ser Ala Asn Ala Leu Phe Ile
50 55 60
Leu Tyr Tyr Thr Ala Gln Gly Glu Pro Phe Pro Asn Asn Leu Asp Lys
65 70 75 80
Leu Cys Gly Pro Asn Val Thr Asp Phe Pro Pro Phe His Ala Asn Gly
85 90 95
Thr Glu Lys Ala Lys Leu Val Glu Leu Tyr Arg Ile Val Val Tyr Leu
100 105 110
Gly Thr Ser Leu Gly Asn Ile Thr Arg Asp Gln Lys Ile Leu Asn Pro
115 120 125
Ser Ala Leu Ser Leu His Ser Lys Leu Asn Ala Thr Ala Asp Ile Leu
130 135 140
Arg Gly Leu Leu Ser Asn Val Leu Cys Arg Leu Cys Ser Lys Tyr His
145 150 155 160
Val Gly His Val Asp Val Thr Tyr Gly Pro Asp Thr Ser Gly Lys Asp
165 170 175
Val Phe Gln Lys Lys Lys Leu Gly Cys Gln Leu Leu Gly Lys Tyr Lys
180 185 190
Gln Ile Ile Ala Val Leu Ala Gln Ala Phe
195 200

Claims (5)

1.一种用于抑制生产用干细胞分化的技术方法，其特征在于，利用间充质干细胞，经分子克隆技术“过表达”抑制干细胞分化的人白血病抑制因子(hLIF)，从而达到长期维持该类干细胞的生长特性和分泌细胞因子特性的方法。
2.由根据权利要求1所述的用于抑制生产用干细胞分化的技术方法所得到的细胞株在表面局部外用细胞培养上清产品的生产中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用所获得的产品在美容或创伤修复中的应用。
4.根据权利要求2所述的应用所获得的产品在制备美容或创伤修复产品中的应用。
5.一种用于抑制生产用干细胞分化的技术方法，其特征在于，往目标干细胞中转入如SEQ ID NO.1所示的用于过表达出人白血病抑制因子(hLIF)的核酸片段。
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CN113717933A (zh) * 2021-07-05 2021-11-30 浙江大学 Fgf7在制备干细胞扩增与表型维持试剂中的应用
CN113717933B (zh) * 2021-07-05 2023-10-13 浙江大学 Fgf7在制备干细胞扩增与表型维持试剂中的应用

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