KR20170090549A - 성체줄기세포를 사용한 인체유래 배양액의 기능성 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 인간 지방유래 줄기세포 배양액을 함유한 기능성 화장료 조성물에 관한 것으로서, 인간의 지방세포를 추출한 지방유래 줄기세포를 배양하는 과정중 세포배양에 필요한 배양 미디어액을 통해 생성된 배양액의 주름개선 및 노화완화에 근거한 화장료 조성물로서, 수득한 줄기세포 배양액은 기능성 화장품의 주원료로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

성체줄기세포를 사용한 인체유래 배양액의 기능성 화장료 조성물{Functional cosmetic composition of human derived culture media using adult stem cells}

본 발명은 줄기세포 배양액을 함유하는 기능성 화장료 조성물에 관한 것이다.

보다 상세하게는 (ａ) 포유동물의 지방세포로부터 추출한 지방유래의 성체줄기세포를 단리하는 단계: 및 (ｂ) 줄기세포를 혈청배지에서 배양한 다음 무혈청배지에서 계대배양하는 단계를 포함하거나 이에 더하여 (ｃ) 지방유래 성체 줄기세포에 저산소 배양, 자외선 조사등에서 선택되는 하나 이상의 물리적 자극을 가하는 단계: 또는 (ｄ) 비타민 Ａ, 비타민 Ｂ5, 비타민 Ｃ에서 선택되는 하나 이상의 비타민을 배양액에 첨가하는 단계를 포함하는 방법으로 수득한 것을 특징으로 하는 줄기세포 배양액을 함유하는 화장료 조성물을 제공한다.

줄기세포란 특정한 세포로 분화가 진행되지 않은 채 유지되다가, 필요한 경우 신경, 혈액, 연골 등 신체를 구성하는 모든 종류의 세포로 분화할 능력을 가진 세포를 말한다. 이러한 줄기세포를 얻을 수 있는 방법은 크게 두가지가 있는데, 첫째는 수정란으로부터 발생한 태아로부터 얻는 것(배아줄기세포)이고 둘째는 성인이 된 우리몸의 각 부분에 간직되어 있는 줄기세포(성체줄기세포)를 회수하는 것이다. 기능적인 면에서 차이는 있지만 배아줄기세포나 성체줄기세포는 모두 여러 종류의 세포로 분화할 수 있는 특징을 가지고 있다.

배아줄기세포는 분화능력이 매우 뛰어나고 텔로머가 긴 강점이 있으나, 윤리적인 문제를 안고 있고 세포를 다량획득하는 것이 어려운 단점이 있는 반면, 성체줄기세포는 세포수를 많이 얻을 수 있으나 타인에게 이식할 때 감염의 위험이나 분화능력이 상대적으로 떨어지는 단점을 가지고 있다.

상기한 단점에도 불구하고 성체줄기세포는 의학적으로 적용하기에 대단히 안전한 것이 특징이다. 구체적으로 장기재생을 위해 몸 안에 이식하여도 암이 발생되지 않으며, 성인의 몸속에 있었기 때문에 면역거부반응이 발생하지 않아 자기 자신의 세포를 사용하는 자가 이식(autologous transplantation)이 가능하다.

또한, 주변조직의 특성에 자신을 맞추어 분화하는 조직 특이적 분화능력(site-specific differentation)이 있고, 미분화 상태에서 주입하여도 암을 유발하지 않기 때문에 이식된 이후 당장 필요한 세포를 만들어내는 것 이외에도 나중에 필요한 미분화 상태의 줄기세포를 다시 만들어서 저장하는 자가 재생산(self-renewal) 능력이 있는 장점이 있다.

상기한 장점에 따라 성체줄기세포는 최근에 그 중요성이 부각되어지고 있으며 성체줄기세포를 생체 내에서 구하기 위한 여러 가지 연구가 진행 중에 있다.

지방조직은 생체 내에서 정상적인 성장과 생리작용에 있어서 중요한 역할을 하고 있지만 지금까지는 그 중요성이 간과되어지고 있었다. 가장 일반적인 지방의 형태는 피부의 아래(피하지방)에 위치하며 복강내(내장지방)에 위치하거나 생식기관 주위(생식선지방)에 위치하는 백색지방 조직이다. 성인에게서의 다소 덜 일반적인 형태는 갈색 지방조직이며 신생아 시기에 열을 생선하는 중요한 여할을 한다.

그러나 사실, 생식능력과 성숙과정은 개체의 지방조직 저장과 밀접하게 연관되어 있다. 여성과 남성의 사춘기는 지방조직 유래 호르몬의 생성과 분비와 밀접하게 관련되며 체지방 조성에 밀접하게 관련된다. 또한 포도당대사와 에너지 균형에 있어서도 중요한 역할을 한다.

과거 수년 동안 생물질 분야에서 상당한 진보가 있어 왔다. 현재 이를 근거로 많은 물질이 개발되고 있으며 사용되어 있다. 이러한 진보에도 불구하고 사람의 지방조직의 이용에 대해서는 많은 연구가 진행되지 않은 것이 사실이다. 그러나 최근 들어 지방의 조직 안에 성체줄기세포가 존재한다는 것이 확인되면서 지방 유래의 줄기세포의 활용에 대한 여러 가지 연구들이 진행되어 지기 시작하였다.

또한, 최근 들어 생화학 및 분자생물학의 발전을 기반으로 우리 생체 내에 존재하는 소량의 신호물질(성장인자)들을 발견하게 되었으며 이를 기반으로 한 생체 노화이론이 재정립되고 있는 중이다(Stanley Cohen, Nobel Lecture 1986, Dec, 8). 또한 이 신호물질(성장인자)은 나이가 증가함에 따라 생체 내에서 감소하게 되는데 바로 이 성장인자의 감소가 우리의 노화와 밀접한 관계가 있다는 것이 밝혀지고 있다(Sporn M and Roberts A, Handbook of Experimental Pharmacology, Vol. 1, Bol. 95/1, 1990, Springer-Verlag, DE, Berlin., pp. 667-698).

따라서 생체의 성장인자를 외부에서 공급하게 되면 생체의 노화를 억제할 수 있다는 것이 연구되고 있으며, 그 물질의 구체적인 효과에 대해서도 연구가 진행되고 있다. 구체적으로 이 신호물질(성장인자)의 구조와 합성에 대한 연구가 진행되었지만 대부분의 성장인자는 단백질의 구조를 가지고 있으며 그 구조가 3차원적으로 복잡하여 화학적으로 합성하는데 여러 가지 문제점이 발생되고 있으며 그러한 합성에 들어간 비용 또한 매우 고가인 것이 현실이다.

이에 본 발명자들은 활성형의 인간 성장인자를 획득하는 방법에 대해서 연구하던 중, 지방유래 성체줄기세포가 성장인자를 분비한다는 사실에 입각하여 이를 근거로 화장물 조성에 사용될 배양물을 생산하기로 하였다.

그러나 지방유래 성체 줄기세포에 관한 연구는 대부분 그 세포 자체를 이용하는 것이나 분화에 관한 연구가 있을 뿐 이를 이용한 성장인자의 합성법에 대한 방법에 대해서는 연구가 거의 전무한 상태였다.

한국특허공개 제2004-94910호 개선된 지방세포 분화된 지방유래 성체 줄기세포 및 이의 용도에서 지방유래 성체 줄기세포를 사용해 생체의 생착율을 증가시킬 수 있는 방법이 제시되었지만 성장인자의 의미있는 합성에 대해서는 제시하지 못하였으며, 한국특허공개 제2005-6408호 “지방세포 분화 조절기능을 갖는 PBR리간드 및 그 유도체 화합물, 및 이를 함유하는 지방세포 분화 조절용조성물”에서는 지방세포를 다른 특정세포로 분화하는 방법에 관한 내용을 개시하고 있을 뿐이다.

이와 같이 지방유래 성체 줄기세포를 이용한 성장인자의 합성에 대한 연구가 미진한 것은 성체줄기세포의 활용방법이 다른 세포로의 분화를 통한 이용에 그 초점이 맞춰져 있으며 줄기세포의 세포적 차이점에 대해서는 그 연구가 미진한 부분이 있었기 ‹š문으로 판단된다.

한 앞에서 기술한 것과 같이 성장인자를 합성한 방법에 대해서는 한국특허등록 제 101436호“재조합된 사람의 내피세포성장인자의 제조방법”, 한국특허등록 제 62551호 “유전자 재조합기술에 의한 인간상피 성장인자의 제조방법”, 한국특허공개 제 2003-45032호 “생물학적으로 활성인 인간 산성 섬유아세포 성장인자의 제조방법과 맥관형성 촉진을 위한 그 용도” 등 유전자 재조합기술에 의한 성장인자의 제조방법에 대해서만 연구되어져 왔다.

이에 본 연구자는 지방유래 성체줄기세포를 통한 성장인자의 대량 생산 방법에 대해서 다년간 연구하였으며 그 성과로 적절한 배양조건의 확립, 물리적 및/또는 화학적 자극을 통해 지방유래 성체줄기세포가 특정한 자극을 가하지 않은 지방유래 성체줄기세포와 비교할 때 현저하게 유효한 양으로 성장인자를 합성하여 분비한다는 것을 발견하였다.

또한, 줄기세포를 배양하여 수득한 배양액(조건 배지)은 피부의 주름개선이나 노화완화에 현저한 효과가 있음을 발견하였다.

한국공개특허 10-2004-0094910호(2004.11.10.공개, 개선된 지방세포 분환된 지방 유래 성체 줄기세포 및 이의용도) 한국공개특허 10-2005-0006408호(2005.01.17.공개, 지방세포 분화 조절기능을 갖는 PBR리간드 및 그 유도체 화합물, 및 이를 함유하는 지방세포 분화 조절용조성물) 한국등록특허 10-0101436호(1996.07.01.등록, 제조합된 사람의 내피세포성장인자의 제조방법) 한국등록특허 10-0062551호(1993.06.09.등록, 유전자 재조합기술에 의한 인간상피 성장인자의 제조방법) 한국공개특허 10-2003-0045032호(2003.06.09.공개, 생물학적으로 활성인 인간 산성 섬유아세포 성장인자의 제조방법과 맥관형성 촉진을 위한 그 용도)

Sporn M and Roberts A, Handbook of Experimental Pharmacology, Vol. 1, Bol. 95/1, 1990, Springer-Verlag, DE, Berlin., pp. 667-698

본 발명은 지방유래 줄기세포 배양액을 포함하는 안전하고 효과적은 화장품을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 포유동물의 지방세포로부터 추출한 지방유래의 성체 줄기세포를 단리하는 단계: 및 (b) 줄기세포를 혈청배지에서 배양한 다음 무혈청배지에서 계대배양하는 단계를 포함하거나 이에 더하여 (c) 지방유래 성체 줄기세포에 저산소 배양, 자외선 조사, 영양분결핍 및 기계적 마찰에서 선택되는 어느 하나 이상의 물리적 자극을 가하는 단계: 또는 (d) 비타민A, 비타민 B, 비타민 C 및 비타민 D에서 선택되는 하나 이상의 비타민을 배양액에 첨가하는 단계를 포함하는 방법으로 수득한 것을 특징으로 하는 줄기세포 배양액을 함유하는 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 화장료 조성물은 지방 유래 줄기세포 배양액을 함유하는 것으로 피부의 주름개선과 노화완화에 탁월한 효과가 있다.

또한 본 발명에 따라 지방유래 성체줄기세포를 이용하여 수득한 배양액은 최종적으로 무혈청 배지에서 수득된 것으로서, 이를 화장료 조성물에 적용할 경우 혈청에 의한 면역반응 등의 부작용의 염려가 없으므로 안전성이 확보된 기능성 화장품을 제조할 수 있고, 일반 피부과나 성형외과 등에서 행해지는 지방흡입시술 등을 통해 입수가 용이한 지방유래 성체 줄기세포를 이용함으로써, 경제적인 효과가 있다.

도면 1은 지방유래 줄기세포의 배양시 배양액에 분비된 bFGF와 VEGF의 농도를 확인한 그래프이고,
도면 2는 지방유래 줄기세포 배양액의 농도별 섬유아세포 세포수를 나타낸 그래프이고,
도면 3은 지방유래 줄기세포 배양배지와 재조합성장인자 첨가 배지와의 세포 증식력을 비교한 그래프이고,
도면4 는 본 발명에 따른 물리적, 화학적 조건에 따라 배양한 성체지방세포 유래 줄기세포의 염기성 섬유아세포 성장인자(bFGF)의 분비량을 비교한 그래프이고,
도면5 는 본 발명에 따른 물리적, 화학적 조건에 따라 배양한 성체지방세포 유래 줄기세포의 맥관 내피세포 성장인자(VEGF)의 분비량을 비교한 그래프이다.

본 발명의 제1 형태는 지방유래 줄기세포를 이용한 성장인자의 대량 생산 방법에 관한 것이다.

지방유래 줄기세포가 함유하고 있는 성장인자는 산성 섬유아세포 성장인자(acidic FGF). 염기성 섬유아세포 성장인자(basic FGF), 인슐린-유사 성장인자-1(IGF-1), 인슐린-유사 성장인자-2(IGF-2), 각질형성세포 성장인자(EGF), 혈소판유래 성장인자(FDGF), 인간형질전환 성장인자-알파(TGF-α), 인간형질전환 성장인자-베타(TGF-β), 맥관내피세포 성장인자(VEGF), 표피세포 성장인자(EGF), 신경세포 성자인자(NGF) 또는 이들의 혼합물로 이루어진 그룹 중에서 선택된 성장인자가 포함된다.

본 발명에서는 지방 유래의 줄기세포를 사용하여 특이적으로 하기 성장인자의 합성 촉진을 도모하고자 하였다.

1) 염기성 섬유아세포 성장인자(basic Fibrobiast Growth Factor, 이하 “bFGF”)

bFGF 혹은 헤파린이 결합된 성장인자2(HBGF-2)는 7개의 종류로 아미노산 수준에서 약 30-50%의 상동성을 가지는 요소들로 구성되어 있다. bFGF는 신경 조직, 뇌하수체, 부신피질, 황체, 태반에서 분리된다.

일반적인 재조합 혹은 화학적 방법에 의해 생산되는 bFGF 단백질은 18kDa 부위를 위주로 하여 생산된다. 이는 bFGF가 형태학적으로 소수성 신호 펩티드 열기서열이 결핍되어 있는 상태이기에 종례의 방법과 다르게 표출될 수 있다.

2) 맥관내피세포 성장인자(Vascular Endothelial Growth Factor, 이하 “VEGF")

이는 혈관형성 요소를 가지고 있어 내피세포의 유사분열 촉진과 혈관 투과성 능력을 향상시킬 수 있다.

VEGF는 제한된 염기서열로 아려진 일차구조로 표현되며 이는 혈소판유래 성장인자(FDGF)의 A, B사슬과 상동성을 가진다. 이러한 성장인자들은 보존된 3개의 시스레인 잔기를 가지며 황화 결합 외내부 사슬에 포함된다. VEGF단백질이 암호화 하고 있는 cDNA 라이브러리에서 분리한 것이다. 이 단백질을 태반 성장인자(FGF)로 부르며, 현재에는 VEGF의 패밀리 중 하나로 인식되고 있다. VEGF와의 상동성을 기반으로, 태반 성장인자(FGF)는 혈관형성 요소로 제안되고 있다.

3)인간형질전환 성장인자-베타(Transforming Growth Factor-β, 이하 "TGF-β")

종양 유사성 표현형으로 분화되는 배양성인 섬유아세포의 형질전환을 촉진하는 요인인 인간 형질전환 성장인자(TGF)는 TGF-α와 TGF-β의 두 단백질의 혼합체로 구성되며, 종양 촉진요소보다 억제요소와 수반되어 발견된다.

이 두 분자들은 골격형성단밸질인 5 종류의 활성체와 불활성체를 가진 TGF-β1을 포함하고 있는 수퍼패밀리의 한 구성요소이다.

신호전달과정에 관여하는 TGF 수용체는 모든 세포에서 발현되며, 거의 대부분의 생리학적인 작용에 영향을 미친다. 그것이 체계적이고 세포 특이적인 활성화는 대단히 복잡한 기작이지만, 세 가지의 기초적 활성을 띠고 있다. TGF-β1은 일반적으로 억제요소같은 세포의 증식을 조절하고, 단백질 분해의 저해와 합성의 반복에 따라 세포막 외에 단백질 분해물들의 침전을 꾀하며, 면역억제반응을 다양한 기작을 통해 촉진한다.

종전의 방법인 재조합 혹은 화학적 합성에 의해 생산되는 TGF-β1 단백질은 25kDa의 크기를 가진 활성화 상태의 단백질이기에 in vitro 상에서 본래의 TGF-β1 단백질과 유사한 생물학적 활성을 가지고 있지만 이는 TGF-β1 단백질 고유의 성질 일부만을 포함한다.

본 발명의 제1 형태에 따른 방법은 (a) 포유동물의 지방세포로부터 추출한 지방유래의 성체 줄기세포를 단리하는 단계: (b) 선택적으로 줄기세포를 혈청배지에서 배양한 다음 무혈청배지에서 계대배양하는 단계: (c) 지방유래 줄기세포에 저산서 배양, 자외선 조사, 어느 하나의 물리적 자극을 가하는 단게: 및 (d) 선택적으로 비타민A, 비타민B, 비타민C에서 선택되는 하나 이상의 비타민을 배양액에 첨가하는 단계를 포함하고, 이 때 (c)단계와 (d)단계는 인간 성장인자의 최대 생산이 일어나는 조건으로 조합하여 진행한다.

줄기세포의 수득

본 발명에 따른 지방유래의 성체줄기세포는 지방조직 내에 존재하는 세포 중에서 경제과정을 거쳐서 수득하는 것이 가능하다. 바람직하게는 사람의 지방유래의 성체줄기세포를 수득하는 것이고, 이를 위하여 사람의 지방조직으로부터 지방유래 줄기세포를 분리한다.

지방조직은 피하, 그물막, 내장, 유방 생식선 또는 그 밖의 지방 조직 부위로부터 유래된 갈색 또는 백색 지방조직이며, 피부 아래에 있는 백색 지방조직을 지방흡입술로부터 편리하게 얻을 수 있다. 지방조직은 통상적으로 흔히 시행되는 지방흡입의 과정에서 폐기되었던 지방조직을 이용하는 것이 가능하므로 추가적으로 침습적 시술을 할 필요가 없다는 점에도 그 유용성이 배가되는 이점이 있다.

분리한 지방흡입물을 세척하여 지방조직만을 분리하고 지방조직의 세포외기질(extracellular marrix)을 콜라게나아제로 효소처리 한 다음 원심분리시켜 고밀도의 줄기세포를 포함한 스트로마성 혈관 분획을 수득한다. 이렇게 얻은 펠렛을 세척한 다음 세포 여과기를 통과시켜 기타 조직을 제거하고 단핵구 분리 용액으로 적혈구를 포함한 세포파편과 단핵세포만을 분리한다. 분리된 단핵세포를 비유도성 배양액으로 배양 후 비접착성 세포들을 제거해준다.

줄기세포의 배양

본 발명에서는 상기 과정으로 획드한 지방유래 줄기세포를 이용한 후속 작업인 시험관 내에서의 배양을 위해 고유의 배양배지를 확립하였다.

세포배양의 시작에 앞서 공급천으로부터 추출한 생검은 일반적인 항생제를 포함한 세척배지를 이용한 반복적인 세척과정을 통해 후속배양에 있을 오염의 가능성을 최소한으로 감소시킬 수 있다.

본 발명에서는 지방유래 줄기세포에서 성장인자의 최대 합성과 분비를 유도하도록 배양 배지를 최적화한다.

구체적으로, 지방유래 줄기세포의 시험관 내 배양은 혈청배지에서 배양한 다음 무혈청배지에서 계대배양하는 단계를 순차진행함으로써 성장인자의 합성량을 극대화한다.

혈청을 포함한 초기단계 세포배양을 위한 배지는 지방유래 줄기세포와 같은 세포형을 유지하고 보관하는데 적합한 목적의 배지인 것이 바람직하다.

본 발명에서는 당업계에서 일반적으로 세포배야에 사용하는 Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM)을 기본으로 하고, 세포배양에 통상적으로 사용되는 혈청을 포함한다.

이 때 초기 배지에 7~10%의 디메틸 술폭시도(DMSO : dimethyl sulfoxide)를 첨가하면 동결 배지일 수도 있고, 따라서 줄기세포를 동결한 다음 필요한 경우 해동하여 사용할 수 있따.

혈청은 0.1 내지 20%의 소 태아 혈청(륜)을 첨가하는 것이 바람직하고, 항생제, 항진균제 및 오염을 야기하는 마이코플라스마의 성장을 예방하는 시제를 첨가하는 것이 더욱 바람직하다.

항생제로는 페니실린-스트렙토마이신 등 통상 세포배양에 사용되는 항생제를 모두 이용가능하며, 항진균제로는 알포레리신 B, 마이코플라스마 억제제로는 타일로신을 이용하는 것이 바람직하며 겐타마이신, 시프로플록사신, 아지트로마이신등으로 마이코플라스마 오염을 방지할 수 있으며, 필요에 따라 글루타민 등의 산화영양소와 소디움 피루베이트등 에너지 대사물질을 더 첨가할 수 있다.

더욱 바람직한 배지는 1~2mM 의 글루타민, 0.5-1mM의 소디움 피루베이트, 0.1~10% 륜, 1%의 항생제(100IU/ml)로 보충된 글루코오스 및 DMEM을 함유하는데 이를 완전배지라 한다. 이 때 글루코스의 농도범주는 대략적으로 1g/L ~ 4.5g/L 이다. 상기 완전혈청배지는 지방유래 줄기세포의 보관과 유지 및 시험관내 안정된 기본배양조건을 제공해 주며 효과적인 세포의 안정화를 보여준다.

초기 배양의 일반적 배양조건은 세포배양에 가장 적합한 조건을 적용하여 습도 80~95%, 온도 34.5~39℃, 6~10% CO2 배양기에서 배양하고, 6~10% CO2 배양시에는 최종농도가 0.16~0.24%가 되게 소디움 바이카보네이트 등의 탄소 조절원을 첨가해준다.

초기배양 단계동안 조직단편은 배양 용기 바닥에 부착된 상태를 유지시키는 것이 바람직하며, 세포 배양의 표준기술에 따라 트립신-EDTA 처리로 인한 짧은 자극으로 성장을 촉진할 수 있다.

누적집단배증시간(doubling time)은 플라스크 내 배양중인 세포가 75~90% 합류(confluence)때까지 유지하고 바람직하게 85% 합류시기에 세포를 채취하여 후기 배양인 무혈청배지에서 계대배양을 한다.

성장인자 분화용 무혈청배지를 이용한 계대배양은 배양액을 제거한 플라스크를 인산화 완충 용액으로 세척하고 트립신-EDTA로 세포를 떨어뜨린 후 세포부유액을 원심분리하며 획득한 펠펫을 인산화 완충 용액으로 세척하는데 세척 과정은 2~3번 반복하는 것이 바람직하다. 세척된 펠펫은 무혈청 배지에 의해 부유시키고 세포 배양 플라스크에 대략 3배로 계대시킨다.

본 발명에서 개발된 무혈청배지는 페놀 레드 등의 PH 지시약이 첨가되지 않은 DMEM을 기본으로 하고 Ham's F-11영양소 혼합액(SIGMA, Cancer Research Vol 47, Issue 1 275-280)을 대략 1:0.5~2.3의 비율로 첨가한다. 이때 L-글루타민 등의 산화영양원, 소디움 피루베이트 등의 에너지 대사물질, 소디움 바이카보네이트 등의 탄소조절원을 첨가하는 것이 가능하고, 그 외에 본 발명에서 목격하고자 하는 성장인자가 아닌 다른 성장인자들과 성장호르몬 등도 첨가할 수 있다.

본 발명에서 개발된 무혈청배지의 고유성은 Ham's F-11 영양소 혼합액에서 찾아볼 수 있다. 본 혼합액은 세포의 성장과 항상성 유지를 돕고 지방유래 줄기세포의 초기배양 후 후기배양에 있어 세포의 안정성과 유지력 증진에 관여되는 여러 가지의 무기질과 아미노산을, 지방유래 줄기세포에서 분비되는 성장인자의 더 높은 생산을 촉진할 수 있는 비타민 계열의 영양소들과 다른 인자들이 일정한 비율로 혼합하여 형성한다. 본 발명에서 확립화된 Ham's F-11 혼합액을 포함한 무혈청배지에서 지방유래 줄기세포의 배양과 성장인자의 생산력은 일반적은 동물혈청을 포함하고 있는 혈청배지의 조건과 비교하였을 경우 전혀 감소된 현상 혹은 부정적인 효과를 볼 수 없으며, 일부 성장인자는 무혈청 배지에서 더 높은 생산력을 보이며, 혈청에 의한 미지의 성분을 가진 혈청배지와는 달리 배양 배지의 모든 성분 함량을 확인할 수 있다.

하기 표 1은 본 발명에서 확립한 무혈청배지에 혼합되는 Ham's F-11 영양 혼합액 각 구성성분들의 성분과 함량을 표시한 것이다.

Components	Concentration (mg/L)	Morality (mM)	Components	Concentration (mg/L)	Morality (mM)
Amino acid			Vitamins
Glycine	18.75	0.25	Choline Chloride	8.98	0.0641
L-Arginine hydrochloride	147.5	0.699	Folic Acid	2.65	0.00601
L-Cystine hydrochloride	17.56	0.0996	myo-Inositol	12.6	0.07
L-Histidine hydrochloride - H2O	31.48	0.15	Niacinamide	2.02	0.0166
L-Isoleucine	54.47	0.416	D-Pantothenic Acid(hemicalcium)	2.24	0.00895
L-Leucine	59.05	0.451	Pyridoxal	0.68	0.000502
L-Lysine hydrochloride	91.25	0.499	Pyridoxine hydrochloride	2.031	0.00986
L-Methionine	17.24	0.116	Riboflavin	0.219	0.000582
L-Phenylalanine	35.48	0.216	Thiamine hydrochloride	2.031	0.00986
L-Serine	26.25	0.25	Inorganic Salts
L-Threonine	53.45	0.449	Calcium Chloride	116.5	1.06
L-Tryptophan	9.02	0.0442	Ferric Nitrate-9H2O	0.05	0.0000052
L-Tyrosine-2Na-2H20	55.79	0.214	Magnesium Sulfate(anhydrous)	28.64	0.301
L-Valine	52.85	0.452	Potassium Chloride	311.8	4.16
D-Glucose	52.85	0.452	Sodium Bicarbonate	71.02	0.5
Pyruvic acid-Na	55.79	0.214	Sodium Chloride	6995.5	120.61
L-Glutamine	365	2.5	Sodium Phosphate Monobasic(anhydrous)	54.3	0.45257

상기 무혈청배지의 아미노산, 비타민, 무기염의 성분과 함량은 본 발명의 목적을 해하지 않는 조건하에서 당업자에 의하여 변형가능함을 자명한 일이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 상기 방법으로 배양한 지방유래 성체줄기세포를 특정 자극을 통해 활성화시킴으로써 목적하는 성장인자의 합성을 촉진하는 것이 가능하다. 이 때 성장 및 자극조건에 있어서 물리적 조건과 화학적 조건으로 구분항려 자극하는 것이 가능하다.

물리적 자극으로서는 자외선, 영양분, 산소 등을 그 예로 들을 수 있으며, 화학적 조건으로는 세포 배양 배지조성물에 있어서 비타민과 그 외 활성화 화합물 등을 그 예로 들 수 있다.

물리적 자극

기존의 지방유래 성체줄기세포 배양 방법에 비하여 현저히 많은 양의 성장인자를 수득하기 위하여, 물리적은 스트레스로는 저산소반응 (Circulation. 2004 Mar 16:109(10):1292-8), 자외선조사(FASEB J. 2003 Mar:17(3):446-8). 이러한 물리적 자극으로 본 발명에서 목적하는 성장인자를 선택적 혹은 종합적으로 증가시킬 수 있다.

화학적 자극

화학적인 조건으로는 일반적으로 널리 알려진 다양한 활성화 화합물들을 개체에 직접적 혹은 간접적으로 노출시키는 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 지방유래 줄기세포에 첨가할 수 있는 활성화 화합물에는 세포 노화와 관련된 레티노산과 그 전단계 산물인 빈포세틴과 이러한 사이클의 보조역할을 하는 피카밀론이 있으며, 단백질 키나아제의 역할을 수행하는 퀀산과 퀀산염이 있다. 그 외에 아데닌 디뉴클레오티드, 아세틸-L-카르니틴 등 신진대사에 관여하는 탄수화물 합성의 인자들은 세포에 중요한 영양 작용을 하며, 아포토시스(appotosis) 증지 역할을 하는 디메틸아니모 에탄올, 세포 증식에 관여하는 L-리포산, L-하이드록시산 그리고 아미노산 생산에 관여하는 보조효소 Q-10 같은 다른 촉진성 첨가제 등을 포함한다. 상기한 바와 같이 이들 활성화 화합물들은 지방유래 줄기세포 배양시에 동시에 또는 개별적으로 첨가될 수 있다.

다양한 활성화 화합물 중에서, 본 발명에서는 비타민 계열을 이용한 자극 효과에 초점을 맞추었다.

본 발명에서는 화학적인 조건으로 비타민A, 비타민B, 비타민C, 비타민D를 각각 혹은 혼합하여 세포독성이 없는 이하의 유효수준에서 배양액에 첨가하여 배양하였다.

비타민을 이용한 화학적 자극이 성장인자의 합성 및 분비를 촉진하는지 확인하기 위하여, 본 발명에서는 상기한 바와 같이 지방유래 줄기세포를 혈청 배지 및 무혈청 배지를 순차적으로 이용하여 시험관 내 배양한 다음, 세포를 잘 수거하여 인산화 완충 용액을 이용한 세척과정으로 배양액을 완전히 제거하고 페놀 레드 등의 pH지시약이 첨가되지 않은 DMEM에 Ham's F-12영양소 혼합액을 대략 1:1의 비율로 첨가하여 혼합하고, 선택적으로 L-글루타민 등의 산화영양원, 소디움 피루베이트 등 에너지 대사물질, 소디움 바이카보네이트 등의 탄소조절원을 첨가한 배지에 적량의 비타민A, 비타민B, 비타민C, 비타민D를 각각 혹은 혼합하여 배양액에 첨가한 다음 지방유래 줄기세포의 배양액에 분비된 성장인자의 농도를 측정하였다.

구체적으로, 비타민A의 최적농도는 2~5uM, 비타민B2의 최적농도는 50~100uM, 비타민C의 최적농도는 10~100uM, 비타민D의 최적농도는 5~10uM이며, 비타민을 첨가하며 48시간 이상 배양하는 것이 바람직하다. 비타민을 성분별로 혼합ㅈ하는 경우에도 최적농도는 동일하다.

그 결과, bFGF의 경우 비타민A의 경우 1.62배 증가하였고, 비타민B의 경우 1.33배 증가하였고, 비타민C의 경우 2.33배 증가하였고, 비타민D의 경우 2.80배 증가하는 것을 확인하였다.

VEGF의 경우는 비타민A의 경우 1.59배 증가하였고, 비타민C의 경우 1.65배 증가하였고, 비타민D의 경우 1.30배 증가하는 것을 확인하였다.

자극의 결합

bFGF의 경우 물리적 자극과 화학적인 자극을 같이 주었을 경우에는, 자외선의 광량을 주고 곧바로 비타민A, 비타민B, 비타민C, 비타민D의 농도를 최적화한 DMEM에 Ham's F-12 영양소 혼합 배지로 교체하고 저산소 자극을 최적화 배양시간 하에 배양하면 4.11배로 증가되었다.

VEGF의 경우 자외선의 광량을 준 다음 스크래치 자극을 주고 곧바로 비타민A, 비타민B, 비타민C, 비타민D의 농도를 최적화한 DMEM에 Ham's F-12 영양소 혼합 배지로 교체하고 저산소 자극을 최적화 배양시간 하에 배양하면 3.92배로 증가되었다.

본 발명의 제2 형태는 지방유래 성체 줄기세포의 배양액을 함유하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

구체적으로 본 발명에 따른 화장료 조성물은, 포유동물의 지방세포로부터 추출한 지방유래의 성체 줄기세포를 단리하고 줄기세포를 혈청배지에서 배양한 다음 무혈청배지로 옮겨 무혈청배지에서 계대배양하여 수득한 배양액을 포함한다.

또한, 본 발명에 따른 화장료 조성물은 (a) 포유동물의 지방세포로부터 추출한 지방유래의 성체 줄기세포를 단리하는 단계: 및 (b) 줄기세포를 혈청배지에서 배양한 다음 무혈청배지에서 계대배양하는 단계를 포함하거나 이에 더하여 (c) 지방유래 성체 줄기세포에 저산소 배양, 자외선 조사, 영양분결핍 및 기계적 마찰에서 선택되는 어느 하나 이상의 물리적 자극을 가하는 단계: 또는 (d) 비타민A, 비타민 B, 비타민 C 및 비타민 D에서 선택되는 하나 이상의 비타민을 배양액에 첨가하는 단계를 포함하는 방법으로 수득한 것을 특징으로 하는 줄기세포 배양액을 포함한다.

구체적으로 본 발명에 따라 수득한 지방유래 줄기세포 배양액은 주름개선 및 치료, 상처치료, 흉터개선 및 치료를 위한 용도로 사용되는 의약품, 의약부외품, 의약보조품, 화장품 등에 이용될 수 있다.

상기한 바와 같이, 본 발명에 따른 지방유래 줄기세포 배양액은 최종적으로 무혈청 배지에서 배양된 것이다. 세포 배양액들을 화장품이나 의약품의 원료로 사용하기 위하여는 혈청이 포함된 배지에서 세포를 배양한 경우 혈청에 의한 면역반응 등의 부작용이 발생할 우려가 크기 때문에, 본 발명에서는 혈청을 배제한 배지를 사용하면서도 세포의 특성에 맞추어 그 성장이나 활성이 유지되는 새로운 배양 조건 및 방법을 제공한 것이다.

또한, 본 발명에 따른 배양액은 다종의 인간 성장인자를 포함하고 이러한 지방유래 성체줄기세포로부터 생산된 성장인자는 기존의 합성방법 즉, 화학적 합성법으로 아미노산을 사용한 성장인자의 합성, 유전자 재조합방법에 의한 성장인자의 합성과 구별되며, 이러한 유전자재조합 방법이나 화학적인 합성법으로 생산된 성장인자와 비교할 때 생체 내의 본래 성장인자와 구조적으로 더 유사하기 때문에 피부적합성이 우수하며 안전성이 확보되는 이점이 있다.

<실시예1>

지방유래 줄기세포의 활성화된 성장인자의 확인

지방유래 줄기세포가 성장인자를 합성하는지 확인하기 위하여, 우선 지방유래 줄기세포를 배양한 후 역전사-핵산 중합효소 증폭반응을 통해 줄기세포 안에 있는 RNA를 확인하였다.

구체적으로, 지방유래의 줄기세포의 전체 RNA를 RNeasy Plus Mini kit(QIAFEN Corp., Valencia, California)로 추출하고 RNA를 MMLV-reverse transferase(Promega Corp., U.S.A)를 사용하여 FCR로 37℃에서 45분간 반응한후 65℃에서 15분간 MMLV-역전사 효소를 불활성화시켰다. 특이검출 FCR반응액은 총 부피 50㎕로 하였으며 각 시약들의 농도는 1.5mM NgCI2와 0.25mM dNTF, 2.5unit Taq polymerase (QIAGEN) 이었다. FCR 반응은 TGRADIENT(BOIMETRA)에서 수행하였으며 cDNA의 변성을 위해 94℃ 3분을 수행한 후 94℃ 30초 (DNA 변성), 60℃ 30초 (풀림), 72℃ 30초 (신장반응)를 30회 반복한 후 최종 신장을 위하여 72℃ 5분을 더 주어 증폭 수행하였다. 위와 같이 역전사 반응을 수행하여 cDNA를 합성하고 VEGF-β, bEGF, TGFβ-1의 primer(표 2)를 이용하여 역전사 FCR을 수행하였다.

성장인자별 검출가능 특이적 염기서열
	Forward primer	Reverse primer
VEGF	5-TACCTCCACCATGCCAAGT G-3; 서열목록1	5-TGATGATTCDTGCCCTCCTCC-3; 서열목록 2
bFGF	5-GACGGCAGAGTTGACGG-3; 서열목록3	5-CTCTCTCTTCTGCTTGAAGTTGTAGC-3;서열목록4
TGFβ-1	5-GCTGAGCGCTTTCTGATCC T-3; 서열목록5	5-CGAGTGTGCTGCAGGTAGACA-3;서열목록6

또한 배양액 중에도 성장인자가 존재하는지 확인하기 위해 면역효소중합반응(Enzyme-linked immunosorbentassay)을 실시하였다.

구체적으로, 지방유래 줄기세포를 배양한 배양액 1ml을 1200g에서 5분동안 원심분리한 뒤 0.22mm 필터로 여과하여 세포 잔여물을 여과한 뒤, 여과물을 단계별로 희석하여 비특이반응이 일어나지 않는 최적 조건을 설정한 뒤 VEGF, bFGF, TGFβ-1 각각을 샌드위치 ELISA kit (Quantikine Human FGF basic Immunoassay R&D systems)를 이용하여 배양액에 분비된 성장인자의 농도를 측정하였다.

지방유래 줄기세포 배양액의 섬유아세포의 증식 촉진 확인

지방조직으로부터 분리된 줄기세포를 3계대 후

개의 세포를 T175 플라스크 (면적 175㎠, 용량500㎖)에 도포하고 3일 동안 배양 후 배양액을 수득하여 섬유아세포 4계대 세포가 25,000개씩 분주된 6웰 플레이트에 줄기세포배양액을 10%, 25%, 50%, 100%가 되게 배양액을 첨가하였다.

3일 경과 후 섬유아세포의 증식정도를 세포생존력 측정키트(cell counting kit-5, Dojindo Molecular Technologies, Inc.)로 반응시킨 후 ELISA reader로 450nm 흠광도를 측정하였다.

분석 결과 표 3에 나타낸 바와 같이, 지방유래 줄기세포에서 분비된 성장인자가 섬유아세포의 증식을 촉진한다는 것을 입증하였으며, 지방유래 줄기세포에서 분비된 성장인자의 농도가 높아질수록, 이러한 섬유아세포의 증식은 비례하여 촉진된다는 것을 확인하였다(도 2 참조).

지방유래 줄기세포에서 분비된 성장인자 함유된 배양액 농도별 섬유아세포 세포수
구분	세포수(cells)
Normal media(control)	35000
ADSC 3passage 3일 배양액 10%처리	45000
ADSC 3passage 3일 배양액 25%처리	93000
ADSC 3passage 3일 배양액 50%처리	180000
ADSC 3passage 3일 배양액 100%처리	240000

<실시예 2>

지방유래 줄기세포에서 분비된 성장인자와 E. coli에서 발현된 재조합 성장인자의 비교

지방조직으로부터 분리된 줄기세포를 3계대 후 개의 세포를 T175플라스크(면적 175㎠, 용량500㎖)에 도포하고 3일 동안 배양 후 배양액을 수거하여 9살 남자 피부조직 섬유아세포 4계대 세포가 5000개씩 분주된 6웰 플레이트에 줄기세포배양액 100%를 첨가하였고, 대조군으로 E.coli에서 발현된 같은 농도의 재조합 성장인자 VEGF, bFGF(Santa Cruz.)를 첨가한 배지와 섬유아세포의 세포생존력 측정키트로 비교해보았다.

그 결과 유전자 재조합법을 이용한 대장균 내 성장인자 유전자의 과발현과 순수분리를 통해 얻어진 성장인자와 성체줄기세포를 이용하여 합성한 성장인자를 비교할 때 지방유래 성체줄기세포를 이용하여 합성한 성장인자가 기존의 합성방법을 통해 만들어진 성장인자보다 그 효과가 우수하다는 것이 입증되었다. 분석 결과는 표 4와 같다.

지방유래 줄기세포 배양배지와 재조합성장인자 첨가 배지와의 세포 증식력 비교
구 분	세포수(cells)
Normal media + rFGF(50ng)	8215.3
Normal media + rVEGF(500ng)	4408.9
Normal media + rFGF+rVEGF	6727.1
ADSC 3passage 3일 배양액 100%처리	17215

<실시예 3>

성장인자 분비량을 증가시킨 지방유래 줄기세포의 배양 방법

물리적 자극

지방조직유래 줄기세포를 3계대한 후, 배양한 세포가 80% 합류되었을 시 트립신/EDTA로 세포를 잘 수거한 다음 25,000개씩의 세포를 6웰 플레이트에 정확히 분구하였다.

분주 후 24시간 뒤 세포가 모두 부착되었을 시 배양액을 완전히 제거하고 물리적인 조건으로 이산화탄소 5%에 산소 1% 멀티가스배양기(Sanyo)에서 배양시켰고, 자외선B에 해당되는 280~320nm (model BEX-800: Ultra-Lum, Inc.)의 파장으로 90mJ/㎠의 열량을 조사하였다.

영양분결핍반응으로는

와

이 첨가된 Dulbecco's phosphate buffered saline로 세포가 떨어지기 직전 상태인 최대 4시간까지 배양한 후 무혈청배지로 교체하였다.

기계적인 마찰을 이용한 스크래치는 접착되어 배양되는 세포배지에 블레이드를 이용하여 가로, 세로 1mm의 격자모양으로 긁어주는 스크래치 자극을 가하였다.

화학적인 조건

무혈청배지 즉, 페놀 레드등의 pH지시약이 첨가되지 않은 DMEM에 Ham's F-11 영양소 혼합액을 1:1의 비율로 첨가하여 혼합하고, 2nM L-글루타민, 1mM소디움 피루베이트, 0.17% 소디움 바이카보네이트가 첨가된 무혈청 배지에 비타민A, 비타민B, 비타민C, 비타민D를 세포특성이 없는 이하의 유효수준으로 첨가하여 배양하였다.

조건별로 37℃,5%이산화탄소 배양기에서 48시간 이상 배양 후 배양액 상등액 200㎕를 3,000rpm에서 원심분리후 0.22㎛여과지에 여과 후 실시예 2의 효소면역측정법(ELISA)으로 bFGF, VEGF, TGFβ-1의 농도를 확인하였다.

자극의 병합

bFGF의 경우 물리적 자극과 화학적인 자극을 같이 주었을 경우에는, 자외선의 광량을 주고 곧바로 비타민A 2㎛, 비타민B 50㎛, 비타민C 10㎛, 비타민D 10㎛의 농도로 최적화한 DMEM에 Ham's F-12 영양소 혼합 배지로 교체하고 1%산소, 5% 이산화탄소의 저산소 자극을 48시간 동안 배양하였다.

VEGF의 경우 자외선의 광량을 준 다음 스크래치 자극을 주고 곧바로 비타민A 2㎛, 비타민B 50㎛, 비타민C 10㎛, 비타민D 10㎛의 농도로 최적화한 DMEM에 Ham's F-12 영양소 혼합 배지로 교체하고 1%산소, 5% 이산화탄소의 저산소 자극을 48시간 동안 배양하였다.

TGFβ1의 경우 자외선의 광량 자극과 스크래치 자극을 주고 영양분 결핍자극을 준 다음 비타민A 2㎛, 비타민B 50㎛, 비타민C 10㎛, 비타민D 10㎛의 농도로 최적화한 DMEM에 Ham's F-12 영양소 혼합 배지로 교체하고 1%산소, 5% 이산화탄소의 저산소 자극을 48시간 동안 배양하였다.

또한 bFGF, VEGF, TGFβ-1의 총괄적 최대량을 얻기 위하여 자외선 광량을 준 다음 비타민A 2㎛, 비타민B 50㎛, 비타민C 10㎛, 비타민D 10㎛의 농도로 최적화한 DMEM에 Ham's F-12 영양소 혼합 배지로 교체하고 1%산소, 5% 이산화탄소의 저산소 자극을 48시간 동안 배양하였다.

결과

bFGF의 경우에는 도 3에 도시한 바와 같이 대조군과 비교하였을 때 저산소 자극을 주는 경우 1.74배 증가하였고, 자외선 자극을 주는 경우 2.71배 증가하였다. 화학적인 자극의 경우에는 비타민A의 경우에는 1.62배 증가하였고, 비타민B의 경우 1.33배 증가하였고, 비타민C의 경우 2.33배 증가하였고, 비타민D의 경우 2.80배 증가하는 것을 확인하였다.

상기 자극 중에서 자극효과가 뛰어난 물리적 자극원인 저산소 자극과 자외선 자극을 병행하였을 경우에는 그 상승효과가 증가되었으며, 화학적인 자극의 경우에도 비타민들의 농도를 최적화한 상태에서 비타민A, 비타민B, 비타민C, 비타민D가 혼합된 배양액 하에서는 3.62배로 증가하는 것을 확인하였다.

물리적 자극과 화학적인 자극을 같이 주었을 경우에는 저산소 자극을 최적화하여 투여하면서, 자외선의 광량과 비타민A, 비타민B, 비타민C, 비타민D의 농도를 최적화한 경우에는 4.11배로 증가할 수 있었다.

VEGF의 경우에는 도 4에 도시한 바와 같이 대조군과 비교하였을 때 저산소 자극을 주는 경우 2.53배 증가하였고, 자외선 자극을 주는 경우 1.36배 증가하였으며 기계적인 마찰을 이용한 스크래치 자극을 주는 경우 1.30배 증가하였다. 맥관 내피세포 성장인자(VEGF)의 경우 화학적인 자극의 경우에는 비타민A의 경우 1.59배 증가하였고, 비타민C의 경우 1.68배 증가하였고, 비타민D의 경우 1.30배 증가하는 것을 확인하였다.

상기 자극 중에서 자극효과가 뛰어난 물리적 자극원인 저산소 자극과 스크래치 자극을 병행하였을 경우에는 그 상승효과가 증가되었으며, 화학적인 자극의 경우에도 비타민들의 농도를 최적화한 상태에서 비타민A, 비타민B, 비타민C, 비타민D가 혼합된 배양액 하에서는 2.03배로 증가하는 것을 확인하였다.

물리적 자극과 화학적인 자극을 같이 주었을 경우에는 저산소 자극을 최적화하여 투여하면서, 자외선의 광량과 비타민A, 비타민B, 비타민C, 비타민D의 농도를 최적화한 경우에는 3.92배로 증가할 수 있었다.

TGFβ-1의 경우에는 도 5에 도시한 바와 같이 대조군과 비교하였을 때 저산소 자극을 주는 경우 1.64배 증가하였고, 자외선 자극을 주는 경우 1.75배 증가하였으며 기계적인 마찰을 이용한 스크래치 자극을 주는 경우 2.13배 증가하였고, 영양분결핍 자극을 주는 경우 2.01배 증가하였다. 인간형질전환 성장인자-베타(TGFβ-1)의 경우 화학적인 자극의 경우에는 비타민A의 경우 1.20배 증가하였고, 비타민B의 경우 1.56배 증가하여고, 비타민C의 경우 1.20배 증가하였고, 비타민D의 경우 1.16배 증가하는 것을 확인하였다.

상기 자극 중에서 자극효과가 뛰어난 물리적 자극원인 저산소 자극과 스크래치 자극을 병행하였을 경우에는 그 상승효과가 증가되었으며, 화학적인 자극의 경우에도 비타민들의 농도를 최적화한 상태에서 비타민A, 비타민B, 비타민C, 비타민D가 혼합된 배양액 하에서는 1.68배로 증가하는 것을 확인하였다.

물리적 자극과 화학적인 자극을 같이 주었을 경우에는 저산소 자극을 최적화하여 투여하면서, 자외선의 광량과 비타민A, 비타민B, 비타민C, 비타민D의 농도를 최적화한 경우에는 2.35배로 증가할 수 있었다.

또한 bFGF, VEGF, TGFβ-1의 총괄적 최대량을 얻기 위하여는 저산소자극과 자외선 자극 비타민A,B,C,D를 첨가배지 조합하는 경우가 가장 바람직하다. 구체적으로 자외선 광량을 준 다음 비타민A, 비타민B, 비타민C, 비타민D의 농도를 최적화한 DMEM에 Ham's F-12 영양소 혼합 배지로 교체하고 저산소 자극을 최적화 배양시간 하에 배양하면 대조군과 비교하였을 때 bFGF 4.11배 VEGF 3.8배, TGFβ-1 1.9배가 생산된다.

<실시예 4>

지방유래 줄기세포 성장인자의 자외선에 대한 각질형성세포 방어효과

지방유래 줄기세포에서 분비된 성장인자의 자외선에 대한 각질형성세포 방어효과는 다음과 같은 방법으로 시험하였다.

각질형성세포를 적정세포농도로 6웰 플레이트에 분주하고 37℃, 5% 이산화탄소의 농도로 맞춘 배양기에서 KGM(karatinocyte growth media: Clonetics.)의 배지 조건하에, ADSC 3passage 3일 배양액 100% 2.5cc를 첨가하여 5cc로 맞추고, 레티놀 2㎛을 KGM 5cc에 첨가하거나, KGM 5cc만을 각각 투여하고 4시간동안 안정화시켜 원료가 충분히 분산되게 하였다. 원료를 충분히 분산시킨 후 무균실험실에서 40W 더블램프로 8분 동안 자외선을 조사하였다. 24시간 후에 아무것도 처리하지 않고 8분 동안 조사한 음성대조군과 비교하여 세포의 생존율을 구하여 원료에 대한 자외선 방어기능을 측정하였다.

측정결과 아래 표 5과 같이 배양하여 bFGF, VEGF, TGFβ-1를 함유한 배양액을 투여한 세포군은 67%, 레티놀을 투여한 세포군은 54%, 그리고 음성대조군은 55%로 나타났다. 이것은 레티놀은 자외선에 대한 방어효과가 떨어지는 것에 반해 지방유래 줄기세포에서 분비된 성장인자는 자외선 방어효과가 더 높은 것을 보여주고 있다.

노화완화 효과 측정결과
시험물질	방어효과
ADSC 3passage 3일 배양액 100%	67%
레티놀	54%
음성대조군	55%

<실시예 5>

사람에게 있어서 자가지방유래 줄기세퐁서 분비된 성장인자의 주름 개선 효 과

30~50세의 여성을 대상으로 지방유래 성체줄기세포를 통해 합성된 성장인자의 주름 완화 효과를 검증하기 위하여 각 실험군당 20명을 선택하여 다음과 같은 실험을 실시하였다.

1일 2회 빈도로 8주간 여성의 미간 혹은 눈 주위에 지방유래 줄기세포 배양액에서 VEGF 30ng, bFGF 30ng, TGFβ-1 70ng 함량으로 정제한 배양액 1cc를 도포해 주었으며 다른 쪽 눈 주위에는 비교를 위해 음성대조군(기존 용액으로서 생리식염수1cc)을 도포해 주었다. 4주 후 및 8 주 후, 주름 완화효과를 육안관찰하고 그 결과를 다음과 같이 정리하였다.

주름완화 효과 측정결과
	현저한 효과	완화효과	효과없음
성장인자함유배양액	8	12	0
음성대조군	2	4	14

상기 표와 도 5 내지 6의 결과로부터 알 수 있듯이, 성체줄기세포를 이용하여 합성한 성장인자를 적용한 경우 주름완화 효과가 우수한 것으로 확인하였다.

본 발명에 따른 방법으로 수득한 지방유래 줄기세포 배양액은 안정성과 생리활성이 확보된 물질로써, 이를 이용하여 주름개선 및 치료, 상처 치료, 흉터 개선 및 치료 등을 목적으로 하는 의약품, 의약부외품, 화장품 등을 개발할 수 있다.

Claims (3)

1. 줄기세포 배양액을 함유하는 기능성 화장료 조성물에 있어서, 줄기세포 배양액은
   (ａ) 포유동물의 지방세포로부터 추출한 지방유래의 성체 줄기세포를 단리하는 단계:
   (ｂ) 줄기세포를 혈청배지에서 배양한 다음 무혈청배지에서 계대배양하는 단계:
   (ｃ) 지방유래 성체 줄기세포에서 저산소 배양,자외선 조사등에서 선택되는 하나이상의 물리적 자극을 가하는 단계: 및
   (ｄ) 선택적으로 비타민 Ａ, 비타민 Ｂ5, 비타민 Ｃ등에서 선택되는 하나 이상을 배양액에 첨가하는 단계를 포함하는 방법으로 수득한 것을 특징으로 하는 조성물.
2. 제1항에 있어서, 기능성은 주름개선 및 또는 노화완화 활성인 화장료 조성물.
3. 주름개선 및 또는 노화완화 기능성 화장료 조성물에 있어서,
   줄기세포 배양액을 포함하고
   이 때 줄기세포 배양액은 (ａ) 포유동물의 지방세포로부터 추출한 지방유래의 성체 줄기세포를 단리하는 단계: 및
   (ｂ) 줄기세포를 혈청배지에서 배양한 다음 무혈청배지에서 계배양하는 단계를 포함하는 방법으로 수득한 것을 특징으로 하는 조성물.
   

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