CN113073081B - bFGF间充质干细胞外泌体及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种bFGF间充质干细胞外泌体及其制备方法和应用，所述bFGF间充质干细胞外泌体是间充质干细胞分泌的、在间充质干细胞膜上能表达bFGF融合蛋白的外泌体。本发明首次将bFGF以融合蛋白的形式表达到间充质干细胞和间充质干细胞外泌体的膜上，能都大量表达bFGF蛋白，而且能增强间充质干细胞外泌体的特异靶向性，显著提高了伤口修复的作用，减少瘢痕的形成。本发明提供了一种新的安全高效的促组织修复的药物或者医用制剂或医美产品。

Description

bFGF间充质干细胞外泌体及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，更具体地，涉及bFGF间充质干细胞外泌体及其制备方法和应用。
背景技术
皮肤是人体最大的器官，是抵御外界病原体的天然屏障，在急慢性皮肤损伤，烧伤，高血压，严重糖尿病等情况下，皮肤的完整性被破坏，影响了皮肤的屏障功能，增加了感染风险，并且引起疼痛以及触觉感知下降，因此伤口快速正常无痕的愈合对机体十分重要。成年人伤口一般是通过纤维化和疤痕形成而愈合，愈合的生理终点是疤痕的形成，许多无法愈合的伤口，长期保持在慢性炎症状态，容易引起肥大性瘢痕或瘢痕，影响皮肤组织的正常生理功能。组织修复由复杂且受到严格控制的生物学过程组成，涉及多种细胞类型，生长因子，细胞因子以及ECM等的相互协作。肌成纤维细胞被认为是伤口愈合过程中导致瘢痕形成的主要细胞，肥厚性瘢痕和瘢痕以及心脏或肾脏纤维化中积聚的胶原蛋白主要源于肌成纤维细胞，伤口愈合过程中的炎症也被认为与瘢痕形成有关。
间充质干细胞在再生医学领域具有重大前景，用于包括肝，心脏，骨骼，软骨，神经和皮肤在内的多种组织再生和治疗。有文献报道，间充质干细胞可以在损伤组织中分化并替换受损细胞，调节炎症反应，促进血管生成，形成良好的肉芽基质，促进皮肤细胞的增殖和迁移，从而加速皮肤修复再生(Stem Cells Transl Med.2012Jan；1(1):44-50.doi:10.5966/sctm.2011-0024)。但是直接使用间充质干细胞进行治疗可能存在引起肿瘤和免疫反应等风险，有研究表明动脉内注射间充质干细胞有可能会引起心肌微梗死(Lancet.2004Mar 6；363(9411):783-4.doi:10.1016/S0140-6736(04)15695-X)。因此寻找能够替代并具备间充质干细胞作用的无细胞治疗方法对于皮肤修复再生是具备治疗应用前景。我们知道间充质干细胞的再生能力主要是通过旁分泌信号介导，间充质干细胞能够分泌一些生物活性分子来影响周围细胞的增殖、迁徙和生存。因此MSC和靶细胞之间起作用的关键旁分泌介质--外泌体被认为是细胞疗法的潜在替代疗法。MSC衍生的外泌体，能够携带间充质干细胞中的细胞因子和生长因子、信号脂质、mRNA和调节miRNA，外泌体将这些内容物转运到受体细胞后能够调节细胞状态和行为。间充质干细胞来源的外泌体被证实也具有再生特性，能够促进受损组织中的血管生成，皮肤细胞增殖，上皮再生，并且能够抑制瘢痕形成。
bFGF是一种多功能生长因子，可促进多种细胞类型的生长和分化，包括真皮成纤维细胞，角质形成细胞和内皮细胞，促进组织重塑，新血管形成，伤口愈合。有研究表明bFGF在瘢痕形成过程中发挥着重要的作用，bFGF能够显著抑制肌成纤维细胞的分化，可能在真皮来源的祖细胞培养物中充当神经、外胚层稳定性的有效启动子，是抑制中胚层分化和内皮、上皮向间质转化的潜在有用且新颖的工具，在预防和治疗组织纤维化，特别是在消除肥厚性瘢痕和瘢痕疙瘩方面能够发挥重要的作用(Ann Anat.2009Jan；191(1):33-44.doi:10.1016/j.aanat.2008.10.001)。
间充质干细胞分泌的外泌体中的bFGF主要是在膜内，这类外泌体通过递送到损伤组织，作用于该部位的多种细胞，虽然能发挥着调节细胞生理功能的作用，但是由于间充质干细胞分泌的外泌体中携带的内容物bFGF含量较少，因此不能针对受损部位的肌成纤维细胞、真皮成纤维细胞等发挥靶向作用，特异性较低，不能很好地发挥修复组织以及减少瘢痕形成的作用。目前主要是通过使用bFGF生长因子与细胞孵育后增加细胞中该生长因子的包载量，但是经过共孵育后细胞所分泌外泌体中携带的bFGF不一定会随着细胞中该因子的携带量的升高而升高。
现在还未出现将bFGF融合蛋白高表达至间充质干细胞外泌体用于加速伤口愈合的制剂，因此本发明能够对于皮肤创伤修复的治疗提供相关的理论和实验支持。
发明内容
本发明的目的之一提供一种bFGF间充质干细胞外泌体，明显地增加bFGF的分泌量，且能应用于加速伤口愈合并改善瘢痕形成。
实现上述目的的技术方案如下。
一种bFGF间充质干细胞外泌体，其是间充质干细胞分泌的、在间充质干细胞膜上能表达bFGF融合蛋白的外泌体。
在其中一些实施例中，所述bFGF融合蛋白构建时包括有间充质干细胞表面标记物CD44的信号肽和跨膜区作为bFGF融合蛋白的信号肽和跨膜区，目的bFGF蛋白，以及连接目的bFGF蛋白和跨膜区的连接肽。
在其中一些实施例中，所述信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，或如SEQ IDNO.1所示且经取代、缺失和/或添加一个或多个核苷酸，且能编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。
在其中一些实施例中，所述目的bFGF蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，或SEQ ID NO.2所示且经取代、缺失和/或添加一个或多个核苷酸，且能编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。
在其中一些实施例中，所述跨膜区的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，或SEQ IDNO.4所示且经取代、缺失和/或添加一个或多个核苷酸，且能编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。
本发明还提供了一种bFGF融合蛋白，其从N端起，依次是N端信号肽，目的bFGF蛋白，连接肽和跨膜区。
本发明的另一目的是提供上述bFGF间充质干细胞外泌体的制备方法。
上述bFGF间充质干细胞外泌体的制备方法，包括以下步骤：
构建含有bFGF融合蛋白基因的慢病毒表达载体；
所述慢病毒表达载体感染间充质干细胞；
所述间充质干细胞分泌bFGF间充质干细胞外泌体。
本发明为了研究bFGF间充质干细胞外泌体在治疗组织损伤，减少瘢痕形成中的作用，采用间充质干细胞表面标记物CD44的信号肽和跨膜区作为融合蛋白的信号肽和跨膜区，设计将生长因子bFGF重组为膜融合蛋白表达至间充质干细胞的细胞膜上，获取间充质干细胞分泌的在膜上高表达bFGF融合蛋白的外泌体。在细胞水平和动物水平上证明bFGF间充质干细胞外泌体在伤口愈合过程中的作用。实验结果证明，bFGF间充质干细胞外泌体能够实现特异性地促进表皮细胞的增殖，缩短伤口愈合所需的时间，减少瘢痕形成。
本发明的另一目的是提供所述bFGF间充质干细胞外泌体的应用。
实现上述目的的技术方案如下。
所述bFGF间充质干细胞外泌体在制备治疗组织损伤疾病的药物或者产品中的应用，优选地，所述组织是皮肤组织。
所述bFGF间充质干细胞外泌体在制备治疗由于皮肤慢性炎症导致的组织损伤的药物或者产品中的应用。
所述bFGF间充质干细胞外泌体在制备减少瘢痕形成的药物或者产品中的应用。
所述bFGF间充质干细胞外泌体在制备通过促进表皮细胞增殖的药物或者产品中的应用。
所述bFGF间充质干细胞外泌体在制备促进伤口愈合的药物或者产品中的应用，优选地，所述伤口是皮肤组织的伤口。
本发明的另一目的是提供一种药物或者产品，其活性成分包括有上述bFGF间充质干细胞外泌体。
在其中一些实施例中，所述药物或者产品的剂型为注射剂和经皮给药制剂。通过将上述制剂注射或涂抹于伤口处，可以加速伤口愈合和减少瘢痕形成。
在其中一些实施例中，所述产品可以是医美用品，护肤品，或者美容产品。
在其中一些实施例中，所述产品是液体制剂或者是霜剂或者是凝露剂等相关剂型，只要能施与皮肤或者皮下组织即可。
本发明所述制备得到的间充质干细胞来源的外泌体，从细胞实验和动物实验水平证明，该bFGF间充质干细胞外泌体能够通过促进表皮细胞的增殖来加速伤口愈合，减少瘢痕形成。
本发明首次将bFGF以融合蛋白的形式表达到间充质干细胞和间充质干细胞外泌体的膜上，增强了间充质干细胞外泌体的特异靶向性，显著提高了伤口修复的作用，减少瘢痕的形成。本发明提供了一种新的安全高效的促组织修复的药物或者医用制剂或医美产品。
附图说明
图1为bFGF的慢病毒载体的基本结构。
图2是间充质干细胞表达bFGF膜融合蛋白的验证情况，其中，图2A为实时荧光定量多聚核苷酸链式反应检测间充质干细胞中bFGF的转录情况；图2B为酶联免疫吸附试验检测间充质干细胞中的bFGF的表达水平；图2C为蛋白免疫印迹检测间充质干细胞中bFGF的表达水平。
图3为bFGF间充质干细胞外泌体的表征情况，其中，图3A为透射电镜下野生型间充质干细胞、与bFGF生长因子共孵育的间充质干细胞和bFGF慢病毒感染的间充质干细胞来源的外泌体的形态和大小，标尺为100nm；图3B为检测野生型间充质干细胞和表达bFGF间充质干细胞来源的外泌体的Zeta电位；图3C为动态光散射检测野生型间充质干细胞、与bFGF生长因子共孵育的间充质干细胞和bFGF慢病毒感染的间充质干细胞来源的外泌体的粒径；图3D为蛋白免疫印迹检测野生型间充质干细胞、与bFGF生长因子共孵育的间充质干细胞和bFGF慢病毒感染的间充质干细胞来源的外泌体的外泌体标记物和bFGF的表达情况。
图4为验证bFGF间充质干细胞外泌体的体外生物功能，图4A为HaCaT细胞的划痕实验，检测野生型间充质干细胞和表达bFGF间充质干细胞来源的外泌体处理后，人类永生化表皮细胞HaCaT细胞在24小时后的迁移情况；图4B为24h后各组细胞的迁移率；图4C为细胞增殖实验，检测野生型间充质干细胞和表达bFGF间充质干细胞来源的外泌体处理后，人类永生化表皮细胞HaCaT细胞在24小时后的增殖情况。
图5是检测小鼠皮肤创伤模型中bFGF间充质干细胞外泌体的作用，图5A为伤口面积图，分为3组，Ctrl组，MSC-Exo组，bFGF MSC-Exo组，分别记录各组第0天，第3天，第7天，第10天的伤口情况；图5B为各组的伤口面积变化率；图5C为Ctrl组，MSC-Exo组，bFGF MSC-Exo组，第10天取样后伤口组织的HE染色结果和Ki67的IHC结果；图5D为实时荧光定量多聚核苷酸链式反应检测Ctrl组，MSC-Exo组，bFGF MSC-Exo组中伤口组织处mmp9，TGF-β1的mRNA表达水平；图5E为利用ELISA实验来检测各组小鼠血液中的bFGF表达情况。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
在整个说明书和权利要求书中，以下术语具有与本文明确相关的含义，除非上下文另有明确规定。在本发明中使用的短语“在一个实施方案中”不一定指代相同的实施方案，尽管其可能是。此外，在本发明中使用的短语“在另一实施方案中”不一定指代不同的实施方案，尽管其可能是。因此，如下所述，可以容易地组合本发明的各个实施方案，而不脱离本发明的范围或精神。
本发明针对间充质干细胞设计了bFGF质粒，将bFGF过表达在间充质干细胞的细胞膜上，实现间充质干细胞分泌的外泌体也能够在膜上高表达bFGF，这样能够实现高表达bFGF的外泌体特异性地识别并到达结合受损部位的细胞，调节相关的修复机制，促进伤口的愈合，减少瘢痕的产生。
本发明的一些实施例中，还涉及到一种慢病毒表达载体，其是含有bFGF融合蛋白基因的慢病毒表达载体。
在其中一个实施例中，所述表达载体为pcDNA3.1载体。
在其中一个实施例中，构建所述慢病毒表达载体所用的引物包括SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6，SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8。
以下结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。
实施例1慢病毒载体的构建
1.设计bFGF融合蛋白的序列，采用间充质干细胞表面标记物CD44的信号肽和跨膜区作为融合蛋白的信号肽和跨膜区，连接目的蛋白和跨膜区的linker选择了柔性链。信号肽，目的基因bFGF，linker，跨膜区的序列如下所示：N端信号肽：
ATGGACAAGTTTTGGTGGCACGCAGCCTGGGGACTCTGCCTCGTGCCGCT GAGCCTGGCG(SEQ IDNO.1)
目的蛋白bFGF的核苷酸序列：
CTGGTGGGTGTGGGGGGTGGAGATGTAGAAGATGTGACGCCGCGGCCCGGCGGGTGCCAGATTAGCGGACGCGGTGCCCGCGGTTGCAACGGGATCCCGGGCGCTGCAGCTTGGGAGGCGGCTCTCCCCAGGCGGCGTCCGCGGAGACACCCATCCGTGAACCCCAGGTCCCGGGCCGCCGGCTCGCCGCGCACCAGGGGCCGGCGGACAGAAGAGCGGCCGAGCGGCTCGAGGCTGGGGGACCGCGGGCGCGGCCGCGCGCTGCCGGGCGGGAGGCTGGGGGGCCGGGGCCGGGGCCGTGCCCCGGAGCGGGTCGGAGGCCGGGGCCGGGGCCGGGGGACGGCGGCTCCCCGCGCGGCTCCAGCGGCTCGGGGATCCCGGCCGGGCCCCGCAGGGACCATGGCAGCCGGGAGCATCACCACGCTGCCCGCCTTGCCCGAGGATGGCGGCAGCGGCGCCTTCCCGCCCGGCCACTTCAAGGACCCCAAGCGGCTGTACTGCAAAAACGGGGGCTTCTTCCTGCGCATCCACCCCGACGGCCGAGTTGACGGGGTCCGGGAGAAGAGCGACCCTCACATCAAGCTACAACTTCAAGCAGAAGAGAGAGGAGTTGTGTCTATCAAAGGAGTGTGTGCTAACCGTTACCTGGCTATGAAGGAAGATGGAAGATTACTGGCTTCTAAATGTGTTACGGATGAGTGTTTCTTTTTTGAACGATTGGAATCTAATAACTACAATACTTACCGGTCAAGGAAATACACCAGTTGGTATGTGGCACTGAAACGAACTGGGCAGTATAAACTTGGATCCAAAACAGGACCTGGGCAGAAAGCTATACTTTTTCTTCCAATGTCTGCTAAGAGCTGA(SEQ ID NO.2)
Linker(连接肽)：
TCCGCTTGTTACTGTGAGCTTTCC(SEQ ID NO.3)
连接肽可以是常规用于连接多肽的接头序列，其能够连接两个多肽并将其自然折叠成所期望结构，通常其是具有一段有疏水性和一定伸展性的短肽。所述连接肽可以是柔性的，在其中一些实施例中，柔性的连接肽是有利的，其能够连接两种蛋白，并且保持其各自的活性和功能。
跨膜区：
TGGCTGATCATCTTGGCATCCCTCTTGGCCTTGGCTTTGATTCTTGCAGTTTGCATTGCAGTC(SEQID NO.4)
2.为了得到融合蛋白的序列，采用tritol法提取人间充质干细胞的mRNA，逆转录得到人间充质干细胞的cDNA，根据bFGF的PCR引物进行扩增，获得bFGF的cDNA，bFGF的PCR引物设计如下：
正向引物F：5’-ggatcttccagagatCTGGTGGGTGTGGGGGGT(SEQ ID NO.5)
反向引物R：5’-ctgccgttcgacgatTCAGCTCTTAGCAGACATTGGAAG(SEQ ID NO.6)。
获取bFGF的cDNA之后，按照N端信号肽，bFGF的cDNA，linker和跨膜区的顺序在bFGF的cDNA基础上交由公司合成信号肽，linker和跨膜区序列，组成完整的融合蛋白序列。
3.获取含目的基因的慢病毒表达载体，采用的慢病毒表达载体为pcDNA3.1载体，参见图1。选择NhcI和NotI为酶切位点，根据融合蛋白的基因片段和酶切位点序列，设计的引物序列如下：
正向引物F：5’-tgaaccgtcagatccgctagcCGATGGACAAGTTTTGGTGGC(SEQ ID NO.7)
反向引物R：5’-aactctagaggatccgcggccgcGACTGCAATGCAAACTGCAAGA(SEQ IDNO.8)
采用限制性核酸内切酶试剂盒进行目的基因的慢病毒表达载体制备，再使用凝胶电泳纯化获得的bFGF质粒，测量浓度后4℃冰箱暂存。
实施例2间充质干细胞感染病毒后的表征
1.间充质干细胞的慢病毒感染，取950μL 1×HBS至EP管中，加入10ug bFGF质粒，混匀，缓慢滴加50μL CaCl2溶液(2M)，混匀之后静置20min，加至细胞状态良好密度约60％-70％的293T细胞中，轻轻混匀，放入37℃，5％CO2的细胞培养箱，12h后，更换培养基为10mL30％FBS完全培养基，48h后取细胞上清，常温4000rpm离心15min。取上清加至生长至50％-60％的间充质干细胞中，加入终浓度为8ug/mL的polybrene，混匀，放入37℃，5％CO2的细胞培养箱，12h后换成10％FBS完全培养基。
2.bFGF间充质干细胞筛选，向感染后的间充质干细胞中，加入终浓度2ug/mL的嘌呤霉素，存活下来的间充质干细胞被认为能够表达bFGF。
3.在mRNA水平检测间充质干细胞的bFGF表达情况，β-actin为实验设置的内参：
实时荧光定量多聚核苷酸链式反应检测内参β-actin的PCR引物序列为：
正向引物F:5’-AGAAAATCTGGCACCACACC(SEQ ID NO.9)
反向引物R:5’-AGAGGCGTACAGGGATAGCA(SEQ ID NO.10)
实时荧光定量多聚核苷酸链式反应检测bFGF的PCR引物序列为:
正向引物F：5’-AAGAGCGACCCTCACATCAA(SEQ ID NO.11)
反向引物R:5’-TCGTTTCAGTGCCACATACC(SEQ ID NO.12)。
实时荧光定量多聚核苷酸链式反应结果如图2A所示，使用含有bFGF生长因子(2.5ng/mL)的完全培养基培养的间充质干细胞(MSC+bFGF)比野生型间充质干细胞(MSC)能够在mRNA水平上高表达bFGF。而与MSC和MSC+bFGF相比，本发明所述导入bFGF融合蛋白基因的间充质干细胞(bFGF MSC)更加明显地上调了bFGF的mRNA水平，具有显著性的差异。
4.酶联免疫吸附实验检测间充质干细胞表达bFGF的情况。实验采用bFGF酶联免疫分析测定试剂盒进行实验。取野生型间充质干细胞(MSC)，与bFGF生长因子共孵育的间充质干细胞(MSC+bFGF)和整合bFGF基因的间充质干细胞(bFGF MSC)的培养基上清，离心1000×g，5min，取出上清作为待测样品溶液。取标准溶液和待测样品溶液各100μL加入微孔板中，混匀，加盖，37℃孵育120min。弃去液体，加入100μL检测液A，37℃孵育60min，弃去检测液A，洗涤，加入检测液B，37℃孵育60min，洗涤，加入90μL底物，37℃避光显色，加入50μL终止溶液终止反应，450nm波长检测OD值。
实验结果如图2B所示，与野生型间充质干细胞(MSC)相比，与bFGF生长因子共孵育的间充质干细胞(MSC+bFGF)不能显著性地提高bFGF的分泌量。而与MSC和MSC+bFGF相比，整合bFGF基因的间充质干细胞(bFGF MSC)能明显地增加bFGF的分泌量，具有显著性差异。
5.蛋白免疫印迹的检测bFGF的表达情况。分别将间充质干细胞(MSC)(1×106)、与bFGF生长因子共孵育的间充质干细胞(MSC+bFGF)(1×106)和导入了bFGF融合蛋白基因的间充质干细胞(bFGF MSC)(1×106)，加入RIPA裂解液，冰上裂解30min，4℃，离心12000×g，15min，取上清，利用Bradford法检测蛋白浓度，三种细胞的蛋白浓度无显著差异。在获取的三组蛋白中加入5×loading buffer，100℃煮20min，冷却后，各取20ug的蛋白样加至10％的SDS-PAGE凝胶中，电泳，60V，蛋白条带超过浓缩胶之后改为120V，当蛋白条带到达凝胶底部时，停止电泳，进行转膜，采用PEVF膜，330mA,90min，用5％浓度的脱脂奶粉作为封闭液，封闭1h，加入按照说明书的稀释比例稀释的bFGF一抗以及β-actin内参一抗孵育，4℃孵育过夜。用一抗对应的二抗孵育2h后，对膜进行曝光。结果如图2C显示，与间充质干细胞(MSC)相比，和bFGF生长因子共孵育的间充质干细胞(MSC+bFGF)能稍微在蛋白质水平上增加bFGF的表达量，而导入bFGF融合蛋白基因的间充质干细胞(bFGF MSC)的bFGF表达水平明显高于MSC和MSC+bFGF。
以上实验结果证实了与野生型间充质干细胞(MSC)相比，bFGF生长因子共孵育的间充质干细胞(MSC+bFGF)稍微能增加bFGF的表达量。而与MSC以及MSC+bFGF相比，我们通过设计bFGF质粒并导入到间充质干细胞(bFGF MSC)，成功实现了显著性高表达bFGF。
实施例3整合bFGF融合蛋白基因的间充质干细胞来源的外泌体的表征
1.提取野生型间充质干细胞、和bFGF生长因子共孵育的间充质干细胞以及整合bFGF融合蛋白基因的间充质干细胞的外泌体(bFGF间充质干细胞外泌体)。用10％FBS完全培养基培养三种细胞，当细胞密度到达70％后，更换为0.5％EV Free FBS培养基，48h之后，收获细胞培养基上清，离心500×g，10min，取上清，离心2000×g，20min，再取上清，离心10000×g，40min，取上清，超速离心100000×g，90min，取沉淀，适量PBS重悬，超速离心100000×g，90min，收集沉淀，少量PBS重悬，储存于超低温冰箱。上述所有离心操作均在4℃的条件下进行。
2.TEM表征外泌体。取出储存的外泌体，解冻后取少量外泌体滴加到铜网上，再用醋酸双氧铀负染，用去离子水洗涤铜网两次，晾干，用透射电镜检测获取的外泌体形态和大小，实验结果如图3A所示，获取的三种外泌体都具有双层膜结构，直径在100nm左右，符合外泌体的形态特征。
3.DLS方法表征外泌体。取出储存的外泌体，解冻后稀释到2mL，放入检测槽，进行检测外泌体Zeta电位和粒径，检测结果如图3B和3C所示，获取的三种外泌体的Zeta电位都在-10mV～-30mV之间，粒径分布都集中100nm左右。
4.蛋白免疫印迹检测bFGF间充质干细胞外泌体标志性蛋白及其中的bFGF表达。取出储存的外泌体,解冻后加入适量的RIPA进行裂解，采用Bradford法检测蛋白浓度，三组外泌体蛋白浓度相似。取20ug蛋白量进行上样，电泳，转膜，封闭的步骤与细胞蛋白免疫印迹相同，一抗采用β-actin，CD81以及bFGF抗体，并用相应的二抗进行孵育，最后用显影液进行曝光。蛋白免疫印迹结果如图3D显示，三组外泌体都表达外泌体特异性蛋白CD81。相比于野生型的间充质干细胞分泌的外泌体(MSC Exo)，和bFGF生长因子共孵育的间充质干细胞分泌的外泌体(MSC+bFGF Exo)能够稍微增加bFGF的表达量，条带稍微较黑一些。而感染bFGF慢病毒的间充质干细胞来源的外泌体(bFGF MSC-Exo)相比于MSC Exo和MSC+bFGF Exo能够显著性地高表达bFGF，条带更加粗黑。
综上所述，我们能够从野生型间充质干细胞、和bFGF生长因子共孵育的间充质干细胞以及感染bFGF慢病毒的间充质干细胞中成功获取外泌体，但是只有感染bFGF慢病毒的间充质干细胞分泌的外泌体中的bFGF能够高表达，和bFGF生长因子共孵育的间充质干细胞分泌的外泌体并不能显著性地增加bFGF的表达量。
实施例4bFGF间充质干细胞外泌体的体外生物功能
1.细胞划痕实验。将状态良好的2×104个人永生化表皮细胞HaCaT细胞均匀铺到24孔板中，用10％FBS完全培养基进行培养，长到60％后用200μL的枪头在孔中进行划痕，PBS洗去脱落的细胞，在孔里加入无血清培养基。设置对照组，实验组中分别加入野生型间充质干细胞来源的外泌体和bFGF间充质干细胞外泌体。划痕后以及24h后拍摄划痕愈合情况，实验结果如图4A所示，bFGF间充质干细胞外泌体处理后人永生化表皮细胞的划痕愈合情况明显优于野生型间充质干细胞外泌体组和对照组。图4B为细胞迁徙率也进一步证实了高表达bFGF的间充质干细胞能显著促进表皮细胞的迁移。
2.CCK-8实验检测细胞增殖情况。将状态良好的人永生化表皮细胞HaCaT均匀铺到96孔板中，待细胞贴壁之后，分别在孔里加入野生型间充质干细胞来源的外泌体，bFGF间充质干细胞来源的外泌体。48h后加入10μL CCK8试剂，37℃孵育2h后用酶标仪检测450nm波长处的吸光度。实验结果如图4C显示，bFGF间充质干细胞外泌体处理后的人永生化表皮细胞增殖速度与对照组和野生型间充质干细胞处理后的人永生化表皮细胞增殖速度有显著性差异，bFGF间充质干细胞外泌体确实能显著促进表皮细胞的增殖。
实施例5bFGF间充质干细胞外泌体对于皮肤创伤的作用
1.构建动物模型。动物实验采用的是6-8周体重在20-25g的BALB/c小鼠,来源为中山大学动物中心。使用1％的戊巴比妥钠麻醉小鼠，待小鼠麻醉之后，先用脱毛膏给小鼠背部脱毛，再在脱毛处用75％乙醇进行擦拭，之后剪去小鼠背部皮肤制造直径为1cm的圆形伤口。
2.分组情况及给药方式。将5只小鼠分为一组，分为给予等体积PBS的对照组，间充质干细胞外泌体给药组(25mg/kg)，bFGF间充质干细胞外泌体给药组三组(25mg/kg)。给药方式是在伤口形成的第三天开始给药，每天通过伤口皮下给药的方式进行给药，在第10天停止给药。每天都需要记录小鼠的体重和伤口变化情况，小鼠伤口随时间的愈合情况如图5A显示，bFGF间充质干细胞外泌体组的伤口面积明显小于其余两组，小鼠的背部伤口面积变化率如5B所示，进一步说明了相比于ctrl组和野生型间充质干细胞来源的外泌体组，bFGF间充质干细胞外泌体组对于皮肤愈合收缩有明显的提升作用。
3.病理组织学检查方法
在第10天采用颈椎脱臼的方法处死小鼠，取下小鼠背部伤口组织，取其中一部分组织用4％多聚甲醛浸泡24h后取出用石蜡包埋，切片，再用苏木素和伊红进行染色，以及用Ki67的抗体孵育，HE染色的结果和Ki67的IHC结果显示如图5C所示。
4.qPCR方法
将剩余的伤口组织剪碎，用匀浆器研磨后加入700μLTRIzol，再加入140μL三氯甲烷，震荡15min后4℃离心12000×g，15min，取上层澄清溶液，加入等体积异丙醇，混匀后4℃离心12000×10min，取沉淀，用75％乙醇洗涤两次，风干后，检测RNA浓度。用逆转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA，再进行荧光定量PCR检测MMP9，TGF-β1在组织中的RNA水平。
荧光定量PCR检测β-actin内参基因的PCR引物序列为：
正向引物F：5’-GGCTGTATTCCCCTCCATCG；(SEQ ID NO.13)；
反向引物R：5’-CCAGTTGGTAACAATGCCATGT；(SEQ ID NO.14)。
荧光定量PCR检测MMP9的转录水平的引物为：
正向引物F：5’-GGACCCGAAGCGGACATTG；(SEQ ID NO.15)
反向引物R：5’-CGTCGTCGAAATGGGCATCT(SEQ ID NO.16)。
荧光定量PCR检测TGF-β1的转录水平的引物为：
正向引物F：5’-CCACCTGCAAGACCATCGAC(SEQ ID NO.17)；
反向引物R：5’-CTGGCGAGCCTTAGTTTGGAC(SEQ ID NO.18)。
实验结果如图5D显示，相比于ctrl组和野生型间充质干细胞来源的外泌体组，bFGF间充质干细胞外泌体组的伤口组织中MMP9，TGF-β1的mRNA水平显著上升。
5.ELISA
实验采用bFGF酶联免疫分析测定试剂盒进行实验。取小鼠心脏血液，室温静置5h，离心12000×g，10min，取上层血清作为待测溶液，取标准溶液和血清溶液各100μL加入微孔板中，混匀，加盖，37℃孵育120min。弃去液体，加入100μL检测液A，37℃孵育60min，弃去检测液A，洗涤，加入检测液B，37℃孵育60min，洗涤，加入90μL底物，37℃避光显色，加入50μL终止溶液终止反应，450nm波长检测OD值。实验结果如图5E所示，bFGF间充质干细胞外泌体能提高小鼠血液中的bFGF的表达情况。
综合以上的实验结果，通过采用间充质干细胞表面标记物CD44的信号肽和跨膜区作为融合蛋白的信号肽和跨膜区，以及连接目的蛋白和跨膜区的linker选择了柔性链，设计了bFGF融合蛋白的序列，在重组为膜融合蛋白后，将其表达至间充质干细胞的细胞膜上，能够获取在膜上高表达bFGF的间充质干细胞，并且该间充质干细胞来源的外泌体能够在膜上高表达bFGF，甚至比和bFGF生长因子共孵育的间充质干细胞分泌的外泌体相比能显著性地增加bFGF的表达量。在体外实验中验证了bFGF间充质干细胞外泌体能够促进人永生化表皮细胞的增殖和迁移，在体内实验中进一步表明bFGF间充质干细胞外泌体能升高伤口处mmp9，TGF-β1的水平，加速小鼠伤口愈合。因此bFGF间充质干细胞外泌体在促进皮肤修复方面具有较大的应用前景。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 广州远想生物科技有限公司
<120> bFGF间充质干细胞外泌体及其制备方法和应用
<160> 18
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
atggacaagt tttggtggca cgcagcctgg ggactctgcc tcgtgccgct gagcctggcg 60
<210> 2
<211> 867
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
ctggtgggtg tggggggtgg agatgtagaa gatgtgacgc cgcggcccgg cgggtgccag 60
attagcggac gcggtgcccg cggttgcaac gggatcccgg gcgctgcagc ttgggaggcg 120
gctctcccca ggcggcgtcc gcggagacac ccatccgtga accccaggtc ccgggccgcc 180
ggctcgccgc gcaccagggg ccggcggaca gaagagcggc cgagcggctc gaggctgggg 240
gaccgcgggc gcggccgcgc gctgccgggc gggaggctgg ggggccgggg ccggggccgt 300
gccccggagc gggtcggagg ccggggccgg ggccggggga cggcggctcc ccgcgcggct 360
ccagcggctc ggggatcccg gccgggcccc gcagggacca tggcagccgg gagcatcacc 420
acgctgcccg ccttgcccga ggatggcggc agcggcgcct tcccgcccgg ccacttcaag 480
gaccccaagc ggctgtactg caaaaacggg ggcttcttcc tgcgcatcca ccccgacggc 540
cgagttgacg gggtccggga gaagagcgac cctcacatca agctacaact tcaagcagaa 600
gagagaggag ttgtgtctat caaaggagtg tgtgctaacc gttacctggc tatgaaggaa 660
gatggaagat tactggcttc taaatgtgtt acggatgagt gtttcttttt tgaacgattg 720
gaatctaata actacaatac ttaccggtca aggaaataca ccagttggta tgtggcactg 780
aaacgaactg ggcagtataa acttggatcc aaaacaggac ctgggcagaa agctatactt 840
tttcttccaa tgtctgctaa gagctga 867
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
tccgcttgtt actgtgagct ttcc 24
<210> 4
<211> 63
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
tggctgatca tcttggcatc cctcttggcc ttggctttga ttcttgcagt ttgcattgca 60
gtc 63
<210> 5
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
ggatcttcca gagatctggt gggtgtgggg ggt 33
<210> 6
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
ctgccgttcg acgattcagc tcttagcaga cattggaag 39
<210> 7
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
tgaaccgtca gatccgctag ccgatggaca agttttggtg gc 42
<210> 8
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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aactctagag gatccgcggc cgcgactgca atgcaaactg caaga 45
<210> 9
<211> 20
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<213> Artificial Sequence
<400> 9
agaaaatctg gcaccacacc 20
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agaggcgtac agggatagca 20
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aagagcgacc ctcacatcaa 20
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tcgtttcagt gccacatacc 20
<210> 13
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ggctgtattc ccctccatcg 20
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 14
ccagttggta acaatgccat gt 22
<210> 15
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 15
ggacccgaag cggacattg 19
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 16
cgtcgtcgaa atgggcatct 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 17
ccacctgcaa gaccatcgac 20
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 18
ctggcgagcc ttagtttgga c 21

Claims (13)

1.一种bFGF间充质干细胞外泌体，其特征是，其是间充质干细胞分泌的、在间充质干细胞膜上能表达bFGF融合蛋白的外泌体；
所述bFGF融合蛋白构建时包括有间充质干细胞表面标记物CD44的信号肽和跨膜区作为bFGF融合蛋白的信号肽和跨膜区，目的bFGF蛋白，以及连接目的bFGF蛋白和跨膜区的连接肽；
所述信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，
所述目的bFGF蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，
所述跨膜区的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
2.权利要求1所述的bFGF间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征是，包括以下步骤：
构建含有权利要求1中所述的bFGF融合蛋白的基因的慢病毒表达载体；
所述慢病毒表达载体感染间充质干细胞；
所述间充质干细胞分泌bFGF间充质干细胞外泌体。
3.权利要求1所述的bFGF间充质干细胞外泌体在制备治疗组织损伤疾病的药物或者产品中的应用。
4.权利要求1所述bFGF间充质干细胞外泌体在制备治疗由于皮肤慢性炎症导致的组织损伤的药物或者产品中的应用。
5.权利要求1所述bFGF间充质干细胞外泌体在制备减少瘢痕形成的药物或者产品中的应用。
6.权利要求1所述bFGF间充质干细胞外泌体在制备通过促进表皮细胞增殖的药物或者产品中的应用。
7.权利要求1所述bFGF间充质干细胞外泌体在制备促进伤口愈合的药物或者产品中的应用。
8.一种药物或者产品，其特征是，其活性成分包括有权利要求1所述bFGF间充质干细胞外泌体。
9.根据权利要求8所述的药物或者产品，其特征是，所述药物或者产品的剂型为注射剂或经皮给药制剂。
10.根据权利要求8或9所述的药物或者产品，其特征是，所述产品是医美用品。
11.根据权利要求8或9所述的药物或者产品，其特征是，所述产品是护肤品。
12.根据权利要求8或9所述的药物或者产品，其特征是，所述产品是美容产品。
13.根据权利要求8或9所述的药物或者产品，其特征是，所述产品是液体制剂或者是霜剂或者是凝露剂。
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