CN107438666A - 重组益生菌 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及重组益生菌，尤其是该重组益生菌在治疗炎性皮肤功能障碍中的应用，本发明还涉及治疗炎性皮肤功能障碍的方法。

Description

重组益生菌
本发明涉及重组益生菌，特别是在治疗炎性皮肤功能障碍中的应用，以及治疗炎性皮肤功能障碍的方法。
本申请要求国际申请PCT/EP2015/052345的优先权，其公开内容通过引用并入本文。
巨噬细胞是一种基本上可以在所有组织中发现的白细胞。巨噬细胞在非特异性防御中发挥关键作用并且也通过招募诸如淋巴细胞的其他免疫细胞来帮助启动特异性防御机制。
巨噬细胞作为能恢复的(resilient)组织特异性巨噬细胞存在，或者衍生自分化成巨噬细胞的循环血液单核细胞。
巨噬细胞展示各种活化状态。两种相反的活化状态被称为经典活化的巨噬细胞(其也被称为M1极化巨噬细胞)，和备选活化的巨噬细胞(也被称为M2极化巨噬细胞)。
M1极化巨噬细胞包含具有活性炎性表型的免疫效应细胞。M1极化巨噬细胞的特征在于表达高水平的促炎性细胞因子、高的活性氮和氧中间体的产生、促进Th1应答、以及强的杀微生物和杀肿瘤活性。
M2极化巨噬细胞是一种抗炎性表型。M2极化巨噬细胞被认为参与寄生虫遏制和促进组织重塑和肿瘤进展并且具有免疫调节功能。M2巨噬细胞的特征还在于有效的吞噬活性，清除分子的高表达。
可塑性和灵活性是单核吞噬细胞处于其活化状态的特征。例如，M1极化或M2极化巨噬细胞的表型可以在体外和体内逆转。
取决于微环境中的刺激，巨噬细胞可以多次改变细胞因子和趋化因子的分泌模式。例如，人类初级M1极化巨噬细胞可以在体外和体内通过来自其自身对应物的分泌因子被复极化成M2极化巨噬细胞，反之亦然。
除了呈现出针对病原体的第一道防线之外，单核吞噬细胞有助于在稳态和损伤条件下重塑和修复组织。
此外，巨噬细胞是控制炎症的关键因素，M1极化巨噬细胞涉及启动和维持炎症而M2极化巨噬细胞与慢性炎症的控制有关。
例如，巨噬细胞在创伤愈合的不同阶段经历动态变化。M1极化巨噬细胞介导组织损伤并引发炎性反应。此外，在创伤的修复反应的早期阶段，皮肤浸润的巨噬细胞显示出M2极化表型并且支持高度血管化的细胞肉芽组织的形成。
炎症可以表征为急性炎症，例如败血症、外伤和创伤愈合，或表征为慢性炎症，例如在类风湿性关节炎、溃疡性结肠炎、克罗恩病等疾病中。许多其他疾病，例如癌症、糖尿病、动脉硬化、阿尔茨海默病和肥胖也与失调的炎症有关。
急性炎性反应涉及由大量细胞和分子介导的一系列事件，其定位入侵病原体或受损的组织，警示和募集其他细胞和分子，消除攻击性药剂，最终使身体恢复平衡。
在败血症和外伤中，这种反应伴随着诸如发热和心率升高的宏观表现。在其他组织中，炎症表现为发红、肿胀和疼痛。
导致损伤的炎症/导致炎症的功能障碍的前馈循环会导致持续的、失调的炎症，其促进器官功能障碍和死亡。良好调节的炎性反应对于适当的组织愈合是必需的。
损伤后皮肤完整性和体内稳态的恢复需要上皮细胞和间充质细胞与组织移植以及募集的造血细胞一起的复杂且动态的相互作用，以完成修复反应的连续阶段：炎症，组织形成和成熟。修复反应的早期阶段由炎性阶段主导，其特征在于先天免疫系统的局部活化，导致嗜中性白细胞立即流入，随后血液单核细胞侵入，其分化成巨噬细胞。
修复反应的中期阶段包括组织形成的阶段，其特征在于重新填充皮肤创伤空间的肉芽组织的发展。肉芽组织形成包含了导致血管发生的内皮细胞的侵入，成纤维细胞的流入和其他巨噬细胞的积累。
临时性细胞创伤基质的沉积促进细胞粘附、迁移和增殖。此外，在创伤边缘，复杂的表皮-间质相互作用刺激角质形成细胞增殖和迁移以恢复表皮屏障。
肉芽组织形成持续到创伤空间被重新填充并恢复覆盖表皮。在完成表皮屏障后，修复反应进入后期阶段，其特征在于组织成熟。在组织成熟阶段，肉芽组织转化为瘢痕组织。
在皮肤修复期间，常驻细胞的先天免疫反应以及募集的炎性细胞对抗入侵的微生物，有助于清创，但也可以通过释放一系列生长因子来支持修复过程。
然而，由于促炎和细胞毒性介质的释放，巨噬细胞的不受控制的活性也会不利于组织修复。
以增加巨噬细胞数量为特征的失衡的炎症是人类疾病中导致形成非愈合性慢性创伤的减毒修复反应的标志。造成非愈合性慢性创伤的其他因素例如糖尿病、静脉或动脉疾病、感染以及老年代谢缺陷。
存在用于治疗慢性创伤的多种方法，包括使用抗生素治疗感染、清创、真空辅助闭合和氧合。
其他方法包括例如生长因子的应用。
例如，贝卡普勒明(becaplermin)是重组人血小板衍生的生长因子BB。贝卡普勒明以商品名Regranex出售，并且用于治疗延伸至皮下组织或其以外，并具有足够血液供应的下肢糖尿病性神经性溃疡。
贝卡普勒明被进一步适用于辅助，而不是替代，足部溃疡护理实践，包括初步外科清创、压力释放和感染控制。
然而，在上市后回顾性队列研究中，在用三管或更多管Regranex凝胶治疗的患者中观察到继发于恶性肿瘤的死亡率增加。
使用的另一种生长因子是重组人表皮生长因子，其以商品名REGEN-D凝胶销售，并用于治疗慢性糖尿病足溃疡。
此外，曲弗明(trafermine)是重组形式的人成纤维细胞生长因子2，以商品名“Fiblast Spray”出售。曲弗明用于治疗压力性溃疡以及包括烧伤性溃疡和黑色溃疡的其他皮肤溃疡。
在六周时间内对罹患慢性糖尿病性神经性溃疡患者每日施用曲弗明或安慰剂后，通过每周临床检查和计算机化照片评估足部溃疡大小。溃疡周长和面积的每周减少，以及从进入第六周治疗的线性进展速率在两组中是相同的。此外，研究结束时治愈面积的百分比没有显著差异。根据Richards等人(1995)在治愈足部慢性神经性糖尿病性溃疡上，局部施用曲弗明没有优于安慰剂。
市售的还有两种含有人胚胎细胞的皮肤替代物，其在施用于患病的创伤区域之后分泌多种生长因子。
皮肤替代物Dermagraft由成纤维细胞、细胞外基质和生物可吸收支架组成。Dermagraf是由衍生自捐赠的新生包皮组织的人成纤维细胞制成。
在制造过程中，将人成纤维细胞接种到生物可吸收的聚乳糖(polyglactin)支架上。
市售的皮肤替代物Apligraf含有来自新生儿包皮的两种细胞类型。活的人角质形成细胞和成纤维细胞嵌入创伤1型胶原基质。
上述皮肤替代物的缺点是由于制造过程的相当高的价格。例如，检测孕妇血液中人类病毒感染的证据，该人类病毒例如1型和2型免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、梅毒、1型和2型人淋巴细胞病毒以及Epstein Barr病毒。
其他市售产品以商品名Procuren出售。Procuren是一种用于治疗非愈合创伤的血小板衍生性创伤愈合制剂。Procuren是从患者血液样品制备的自体血小板衍生产品。
然而，关于自体血小板衍生产品(包括自体血小板衍生生长因子)治疗慢性非愈合创伤或治疗诸如急性手术创伤的其他病症的有效性的证据不足。
此外，由上述皮肤替代物以及自体血小板衍生产品提供的生长因子的量根据起始材料的质量而显著变化。
本发明的目的是使炎性皮肤功能障碍，特别是慢性炎症性皮肤功能障碍的替代治疗成为可能，其允许容易地将有益因子应用于优选慢性炎性皮肤功能障碍。
此外，应提供一定数量的有助于愈合的有益因子以治疗炎性皮肤功能障碍。
本发明的目的通过提供根据权利要求1的重组益生菌得以解决，其包括编码第一异源因子的核酸序列，编码第二异源因子的核酸序列，以及优选地编码第三异源因子的核酸序列，条件是所述第一因子、所述第二因子和所述第三因子在功能上彼此不同，
其中所述第一因子是生长因子，其中所述第二因子选自M2极化因子，并且其中优选地所述第三因子选自M2极化因子和生长因子。
优选地，根据权利要求1的所述重组益生菌包括：编码第一异源因子的至少一条核酸序列，编码第二异源因子的至少一条核酸序列和编码第三异源因子的至少一条核酸序列，条件是所述第一因子、所述第二因子和所述第三因子在功能上彼此不同，
其中所述第一因子是生长因子，其中所述第二因子选自M2极化因子，并且其中所述第三因子选自M2极化因子和生长因子。
在从属权利要求2至22中公开了重组益生菌的优选的实施方案。
本发明的目的进一步通过提供根据权利要求17的重组益生菌用于治疗炎性皮肤功能障碍，优选慢性炎性皮肤功能障碍得到解决，所述重组益生菌包括：
编码第一异源因子的至少一条核酸序列和编码第二异源因子的至少一条核酸序列，
其中所述第一因子是生长因子并且其中所述第二因子选自M2极化因子。
优选地，根据权利要求17的所述重组益生菌包括：
编码第一异源因子的至少一条核酸序列，编码第二异源因子的至少一条核酸序列和编码第三异源因子的至少一条核酸序列，条件是所述第一因子，所述第二因子和所述第三因子在功能上彼此不同，
其中所述第一因子是生长因子，其中所述第二因子选自M2极化因子，并且其中所述第三因子选自M2极化因子和生长因子。
本发明的目的进一步通过提供根据权利要求23的治疗炎性皮肤功能障碍，优选慢性炎性皮肤功能障碍的方法得到解决，其中所述方法包括向罹患该皮肤功能障碍的个体施用权利要求1至22中任一项所述的重组益生菌。
发明人惊奇地发现，包含上述核酸序列的重组益生菌可用于治疗炎性皮肤功能障碍，优选治疗慢性炎性皮肤功能障碍。
在从属权利要求中公开了本发明的优选实施方案。
根据本发明，术语“功能上不同的因子”或“功能上彼此不同”是指各因子优选地结合靶细胞中的不同的受体和/或活化不同的第二信使。第二信使是由细胞释放的触发生理变化的细胞内信号分子。
根据本发明，术语因子的“功能类似物”是指作为相应因子结合相同受体，并优选活化靶细胞中相同的第二信使的试剂。
例如，乳链菌肽的功能类似物结合NisK，发挥与成熟乳链菌肽分子或其功能类似物的作用，并且优选导致NisR的随后的磷酸化。磷酸化的NisR诱导从相应的乳链菌肽启动子的转录。
优选地，所述第一、第二和第三异源因子的“功能类似物”具有至少80％，进一步优选至少90％，进一步优选至少93％，进一步优选至少95％，进一步优选至少97％的氨基酸序列的序列同一性。
根据本发明，术语“异源因子”是指不是天然存在或由所用益生菌表达的因子，优选蛋白质。
“功能类似物”也可以指定为生物相似物。
当一般提及“异源因子”或当提及具体的“异源因子”，例如，如FGF-2、IL-4、CSF-1等时，意指该术语还包括其功能性类似物。
包含上述核酸序列的重组益生菌能够经常和/或在诱导后通过转录和翻译相应的核酸序列产生相应的第一、第二和优选第三异源因子的独特组合。
这种因子的独特组合包括至少一种生长因子和至少一种M2极化因子。
优选地，这种因子的独特组合包括生长因子，第一M2极化因子和不同于所述第一M2极化因子的第二M2极化因子。或者，这种因子的独特组合包括第一生长因子，M2极化因子和不同于所述第一生长因子的第二生长因子。
重组益生菌优选地将如权利要求1所述的多种至少两种，优选至少三种异源因子递送至患病组织，从而调控局部免疫系统并使愈合。
优选地，在应用于所述炎性皮肤功能障碍，优选所述慢性炎性皮肤功能障碍之后，重组益生菌释放相应的第一异源因子和第二异源因子，以及优选第三异源因子。
此外，根据本发明使用的重组益生菌优选地在应用于炎性皮肤功能障碍(优选慢性炎性皮肤功能障碍)部位之后提供相应的第一异源因子和第二异源因子，以及优选第三异源因子的恒定释放。
由此，对于罹患所述炎症性皮肤功能障碍，优选所述慢性炎性皮肤功能障碍的受试者，可获得大大改进的、更安全且更具成本效益的治疗选择。
优选地，相应的第一、第二和第三异源因子在从细菌释放后发挥支持所述炎性皮肤功能障碍，优选慢性炎性皮肤功能障碍愈合的生物活性功能。
第一异源因子是生长因子。
优选地，所述生长因子选自成纤维细胞生长因子(FGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、表皮生长因子(EGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、转化生长因子β(TGF-β)、神经生长因子(NGF)、活化素，其功能类似物、其生物相似物及其混合物。
当然，上述或下述提及的因子或其类似物的功能类似物也可以在所要求保护的本发明的范围内使用。
成纤维细胞生长因子是参与血管发生、创伤愈合和各种内分泌信号通路的生长因子家族。
在人类中，已经鉴定了FGF家族的22个成员，FGF-1至FGF-14和FGF-16至FGF-23，其可用于本发明。
FGF-1至FGF-10结合成纤维细胞生长因子受体(FGFR)。
成纤维细胞生长因子1也称为酸性成纤维细胞生长因子。成纤维细胞生长因子2也称为碱性成纤维细胞生长因子。此外，成纤维细胞生长因子7也称为角质形成细胞生长因子(KGF)，成纤维细胞生长因子10也称为角质形成细胞生长因子2(KGF-2)。
在优选的实施方案中，成纤维细胞生长因子选自FGF-1、FGF-2、FGF-3、FGF-4、FGF-5、FGF-6、FGF-7、FGF-8、FGF-9、FGF-10及其混合物，进一步优选FGF-1、FGF-2、FGF-7、FGF-10及其混合物，进一步优选FGF-2、FGF-7，其功能类似物及其混合物，进一步优选FGF-2。
例如，FGF-1和FGF-2可以刺激血管发生，并且对存在于炎性皮肤功能障碍部位的几种细胞类型(包括成纤维细胞和角质形成细胞)是促细胞分裂的。此外，FGF-7可以以旁分泌的方式刺激创伤再上皮化(reepithelization)。
成纤维细胞生长因子2(FGF-2)，优选人成纤维细胞生长因子2(hFGF-2)涉及不同的生物过程，包括创伤愈合和肿瘤生长。
该基因的mRNA含有多个多聚腺苷酸化位点，并且从非AUG和AUG起始密码子交替翻译，产生具有不同性质的五种不同同种型。非AUG同种型位于细胞核中，并且负责胞内分泌作用，而AUG起始的形式主要是胞质的，并且负责FGF-2的旁分泌和自分泌作用。
人成纤维细胞生长因子2(hFGF-2)的mRNA的核酸序列可以以NCBI登录号NM_002006.4中获得。AUG-同种型的对应的氨基酸序列可以以NCBI登录号NP_001997.5以及UniProt登录号P09038-版本182获得，并且也在图22a中示出。
前蛋白原包括跨前蛋白原的氨基酸1至142的前肽和跨前蛋白原的氨基酸143至288的成熟的人成纤维细胞生长因子2肽。
在优选的实施方案中，成纤维细胞生长因子2包含SEQ ID 26至30的氨基酸序列中的一个或至少一个，更优选SEQ ID 28的氨基酸序列。SEQ ID 28的氨基酸序列如图22B所示。
胰岛素样生长因子(IGF)是与胰岛素具有高度相似性的蛋白质。胰岛素样生长因子包括可以用于本发明的两种蛋白质IGF-1和IGF-2。
表皮生长因子(EGF)家族是具有高度相似结构和功能特征的蛋白质，包括蛋白质表皮生长因子(EGF)、肝素结合EGF样生长因子(HB-EGF)、转化生长因子-α(TGF-α)、双调蛋白(amphiregulin，AR)、表皮调节素(epiregulin，EPR)、上皮细胞有丝分裂蛋白(epigen，EPGN)、β细胞生长因子(betacellulin，BTC)、神经调节蛋白1(NRG1)、神经调节蛋白2(NRG2)、神经调节蛋白3(NRG3)和神经调节蛋白4(NRG4)，优选表皮生长因子(EGF)、肝素结合EGF样生长因子(HB-EGF)、转化生长因子-α(TGF-α)、双调蛋白(AR)、表皮调节素(EPR)、上皮细胞有丝分裂蛋白(EPGN)和β细胞生长因子(BTC)，进一步优选表皮生长因子(EGF)，肝素结合EGF样生长因子(HB-EGF)和转化生长因子-α(TGF-α)，其可以用于本发明。
表皮生长因子(EGF)，优选人表皮生长因子(hEGF)，刺激各种表皮和上皮组织的体内和体外生长以及一些成纤维细胞在细胞培养中的生长。此外，hEGF对体内特异性细胞的分化具有深远的影响，并且是外胚层和中胚层来源的多种培养细胞的有力的促细胞分裂因子。
人表皮生长因子以通过选择性剪接产生的至少三种同种型存在。
人表皮生长因子同种型1前蛋白原的氨基酸序列可以NCBI登录号NP_001954.1获得。mRNA的相应核酸序列可以NCBI登录号NM_001963.2获得。
同种型1的前蛋白原包括跨越前蛋白原的氨基酸1至22的信号肽，跨越前蛋白原的氨基酸23至1207的前肽和跨越前蛋白原的氨基酸971到1023的成熟的人表皮生长因子肽。
人表皮生长因子同种型2前蛋白原的氨基酸序列可以NCBI登录号NP_001171601.1获得。mRNA的相应核酸序列可以NCBI登录号NM_001178130.1获得。人表皮生长因子同种型3前蛋白原的氨基酸序列可以NCBI登录号NP_001171602.1获得。mRNA的相应核酸序列可以NCBI登录号NM_001178131.1获得。人表皮生长因子同种型1至3的氨基酸序列也可以UniProt登录号P01133-版本180获得，并且也在图25a至25c中示出。成熟人表皮生长因子的氨基酸序列如图25d所示。
肝素结合EGF样生长因子(HB-EGF)，优选人肝素结合EGF样生长因子(hHB-EGF)是皮肤创伤愈合所需的上皮形成中的重要生长因子。hHB-EGF对角质形成细胞和成纤维细胞具有促细胞分裂和迁移作用。hHB-EGF进一步促进创伤愈合所需的皮肤修复和血管新成。hHB-EGF是创伤液的主要成分。hHB-EGF由巨噬细胞、单核细胞和角质形成细胞释放。此外，与肝素硫酸蛋白聚糖结合的hHB-EGF细胞表面增强促细胞分裂原促进能力，增加皮肤创伤愈合速率，减少人皮肤移植物愈合时间，并且促进溃疡、烧伤和表皮裂纹厚度创伤(epidermal split thickness wound)的快速愈合。
人肝素结合EGF样生长因子前蛋白原的氨基酸序列可以NCBI登录号NP_001936.1获得。mRNA的相应核酸序列可以NCBI登录号NM_001945.2获得。
人肝素结合EGF样生长因子的前体包括跨越前体的氨基酸1至19的信号肽，跨越前体的氨基酸20至208的前肝素结合EGF样生长因子，跨越前体的氨基酸63至148的成熟人表皮生长因子肽。
人肝素结合EGF样生长因子的氨基酸序列也可以UniProt登录号Q99075-版本151获得，并且也在图26a中示出。成熟人肝素结合EGF样生长因子的氨基酸序列示于图26b中。
可以在巨噬细胞、脑细胞和角质形成细胞中产生转化生长因子-α(TGF-α)，优选人转化生长因子-α(hTGF-α)。hTGF-α诱导上皮发育。hTGF-α和hEGF结合相同的受体，表皮生长因子受体(EGFR；ErbB-1；人类中的HER1)。当TGF-α与EGFR结合时，其可以引发包括创伤愈合的多种细胞增殖事件。
人转化生长因子α以通过选择性剪接产生的至少五种同种型存在。
人转化生长因子α同种型1前蛋白原的氨基酸序列可以NCBI登录号NP_003227.1获得。mRNA的相应核酸序列可以NCBI登录号NM_003236.2获得。
人转化生长因子α同种型1的前体包括跨越前体的氨基酸1至23的信号肽，跨越前体的氨基酸24至160的前转化生长因子α同种型1，和跨越前体的氨基酸40至89的成熟转化生长因子α肽。
人转化生长因子α同种型2前蛋白原的氨基酸序列可以NCBI登录号NP_001093161.1获得。mRNA的相应核酸序列可以NCBI登录号NM_001099691.1获得。
人转化生长因子α同种型3前蛋白原的氨基酸序列可以NCBI登录号NP_001295087.1获得。mRNA的相应核酸序列可以NCBI登录号NM_001308158.1获得。
人转化生长因子α同种型4前蛋白原的氨基酸序列可以NCBI登录号NP_001295088.1获得。mRNA的相应核酸序列可以NCBI登录号NM_001308159.1获得。
人转化生长因子α同种型5前蛋白原的氨基酸序列可以NCBI登录号AAF05090.1获得。mRNA的相应核酸序列可以NCBI登录号AF149097.1获得。
人转化生长因子α同种型1至5的前体的氨基酸序列也可以UniProt登录号P01135-版本168获得，并且在图27a至27e中示出。成熟的人转化生长因子α的氨基酸序列在图27f中示出。
双调蛋白(amphiregulin，AREG)，优选人双调蛋白(hAREG)是EGF受体的另一种配体。人双调蛋白是一种自分泌生长因子，也是包括星形胶质细胞、神经膜细胞和成纤维细胞在内的广泛靶细胞的促细胞分裂原。人双调蛋白促进上皮细胞的生长。
人双调蛋白前蛋白原的氨基酸序列可以NCBI登录号NP_001648.1获得。mRNA的相应核酸序列可以NCBI登录号NM_001657.3获得。
人双调蛋白前蛋白原的前体包括跨越前蛋白原的氨基酸1至19的信号肽，跨越前蛋白原的氨基酸20至100的前肽和跨越前蛋白原的氨基酸101至187的成熟转化生长因子α肽。
人双调蛋白前蛋白原的氨基酸序列也可以UniProt登录号P15514-版本147中获得，并且也在图28a中示出。成熟的人双调蛋白的氨基酸序列如图28b所示。
表皮调节素(EPR)，优选人表皮调节素(hEPR)是能够刺激细胞增殖和/或血管发生的EGF受体的配体。
人表皮调节素前蛋白原的氨基酸序列可以NCBI登录号NP_001423.1获得。mRNA的相应核酸序列可以NCBI登录号NM_001432.1获得。
人表皮调节素前蛋白原包括跨越前蛋白原的氨基酸1至29的信号肽，跨越前蛋白原的氨基酸30至169的前表皮调节素和跨越前蛋白原的氨基酸60至108的成熟表皮调节素。
人表皮调节素前蛋白原的氨基酸序列也可以UniProt登录号O14944-版本146获得，并且也在图29a中示出。成熟的人表皮调节素的氨基酸序列如图29b所示。
上皮细胞有丝分裂蛋白(EPGN)，优选人上皮细胞有丝分裂蛋白(hEPGN)促进上皮细胞的生长。人上皮细胞有丝分裂蛋白以通过选择性剪接产生的至少七种同种型存在。
人上皮细胞有丝分裂蛋白同种型1前体的氨基酸序列可以NCBI登录号NP_001257918.1获得。mRNA的相应核酸序列可以NCBI登录号NM_001270989.1获得。
人上皮细胞有丝分裂蛋白同种型1前体包括跨越前体的氨基酸1至22的信号肽，和跨越前体的氨基酸23至154的成熟的上皮细胞有丝分裂蛋白。
人上皮细胞有丝分裂蛋白同种型1至7前体的氨基酸序列也可以UniProt登录号Q6UW88-版本101获得，并且也在图30a至30g中示出。成熟的人上皮细胞有丝分裂蛋白的氨基酸序列如图30h所示。
β细胞生长因子(BTC)，优选人β细胞生长因子(hBTC)是一种生长因子，其也可结合表皮生长因子受体，并且由广泛的成体组织以及在许多培养细胞(包括平滑肌细胞和上皮细胞)中合成。人前β细胞生长因子前体的氨基酸序列可以NCBI登录号NP_001720.1获得。mRNA的相应核酸序列可以NCBI登录号NM_001729.1获得。
人前β细胞生长因子前体包括跨越前体的氨基酸1至31的信号肽，跨越前体的氨基酸32至178的前β细胞生长因子和跨越前体的氨基酸32至111的成熟的β细胞生长因子。
人前β细胞生长因子前体的氨基酸序列也可以UniProt登录号P35070-版本139获得，并且也在图31a中示出。成熟的人β细胞生长因子的氨基酸序列如图31b所示。
胰岛素样生长因子1(IGF-1)也称为生长因子C。人IGF-1的mRNA的核酸序列可以NCBI登录号NM_000618.2获得。相应的氨基酸序列可以NCBI登录号NP_000609.1以及UniProt登录号P05019-版本178获得。
前蛋白原包括跨越前蛋白原的氨基酸1至21的信号肽和跨越前蛋白原的氨基酸49至118的人胰岛素样生长因子1肽。
人胰岛素样生长因子2(hIGF-2)的mRNA的核酸序列可以NCBI登录号NM_000612.4获得。人胰岛素样生长因子2前蛋白原的相应的氨基酸序列可以NCBI登录号NP_000603.1以及UniProt登录号P01344-版本192获得。
前蛋白原包括跨越前蛋白原的氨基酸1至24的信号肽和跨越前蛋白原的氨基酸25至91的胰岛素样生长因子2的成熟链。
血管内皮生长因子(VEGF)家族是一组可以用于本发明的生长因子，包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D和胎盘生长因子(PGF)。
在优选的实施方案中，血管内皮生长因子是血管内皮生长因子A(VEGF-A)。
VEGF-A可以诱导血管发生(angiogenesis)、血管新生(vasculogenesis)和内皮细胞生长。
人血管内皮生长因子A(hVEGF-A)的mRNA的核酸序列可以NCBI登录号NM_001025366.1获得。人血管内皮生长因子A的对应的氨基酸序列可以NCBI登录号NP_001020537.2以及UniProt登录号P15692-版本197获得。
人血管内皮生长因子A的前体蛋白质包括跨越前体蛋白质的氨基酸1至26的信号肽，以及跨越前体蛋白质的氨基酸27至232的成熟的人血管内皮生长因子A。
血小板衍生生长因子(PDGF)调节细胞生长和分裂。人血小板衍生生长因子(hPDGF)具有四个亚基，PDGF-A、PDGF-B、PDGF-C和PDGF-D，其形成各亚基的同源二聚体或异二聚体，它们可以用于本发明。
优选地，血小板衍生生长因子是PDGF-AA、PDGF-BB、PDGF-AB、PDGF-CC、PDGF-DD或其混合物。
进一步优选地，血小板衍生生长因子是由两个PDGF-A亚基组成的二聚体蛋白，由两个PDGF-B亚基组成的二聚糖蛋白，由PDGF-A亚基和PDGF-B亚基组成的二聚糖蛋白，或它们的混合物。
人血小板衍生生长因子亚基A(hPDGF-A)的mRNA的核酸序列可以NCBI登录号NM_002607.4获得。相应的氨基酸序列可以NCBI登录号NP_002598.4以及UniProt登录号P04085-版本159获得。
人PDGF-A亚基的各自的前蛋白原编码跨越前蛋白原的氨基酸1至20的信号肽和跨越前蛋白原的氨基酸87至211的成熟人血小板衍生生长因子亚基A。
人血小板衍生生长因子亚基B(hPDGF)的mRNA的核酸序列可以NCBI登录号NM_002608.1获得。人血小板衍生生长因子亚基前蛋白原的对应的氨基酸序列可以NCBI登录号NP_002599.1以及UniProt登录号P01127-版本181获得。
人PDGF-B亚基的前蛋白原编码跨越前蛋白原的氨基酸1至20的信号肽，以及跨越前蛋白原的氨基酸82至190的成熟形式的人血小板衍生生长因子亚基B。
肝细胞生长因子(HGF)是一种由间充质细胞分泌的生长因子，主要作用于上皮细胞和内皮细胞，但也作用于血细胞祖细胞(hemapoeitic progenitor cell)，并且可以用于本发明。
HGF作为单一前蛋白原分泌，并被丝氨酸蛋白酶切割成69-kGaα链和34-kDaβ链。前蛋白原以及相应的α和β链的氨基酸序列如图23a至23c所示。
人肝细胞生长因子(hHGF)的mRNA的核酸序列可以NCBI登录号NM_000601.3获得。人肝细胞生长因子前蛋白原的对应的氨基酸序列可以NCBI登录号NP_000592.3以及UniProt登录号P14210-版本186获得。
前蛋白原包括跨越前蛋白原的氨基酸1至31的信号肽，跨越前蛋白原的氨基酸32至494的人肝细胞生长因子α链和跨越前蛋白原的氨基酸495至728的人肝细胞生长因子β链。
转化生长因子β(TGF-β)，优选人转化生长因子β(hTGF-β)是由包括巨噬细胞的许多细胞类型分泌的细胞因子。
TGF-β以可以用于本发明的至少三种同种型TGF-β1、TFG-β2和TGF-β3存在。相应的前体蛋白质和成熟蛋白质的氨基酸序列如图21a至21g所示。
人转化生长因子β1是分割成潜伏期相关肽(latency-associated peptide，LAP)和成熟TGF-β1肽的分泌蛋白。成熟肽可以与其他TGF-β家族成员形成TGF-β1同源二聚体或异源二聚体。
人转化生长因子β1前体的mRNA的核酸序列可以通过NCBI登录号NM_000660.4获得。对应的氨基酸序列可以NCBI登录号NP_000651.3或UniProt登录号P01137-版本199获得。
人TGF-β1前体的氨基酸序列包括跨越前体蛋白质的氨基酸1至29的信号肽，跨越前体蛋白质的氨基酸30至278的潜伏期相关肽，以及跨越前体蛋白质的氨基酸279至390的成熟的转化生长因子β1。
转化生长因子β2(TGF-β2)，优选人转化生长因子β2(hTGF-β2)是调节许多细胞类型的增殖、分化、粘附和迁移的多功能细胞因子。
已经鉴定出人转化生长因子β2基因的可选剪接转录本变体，其编码两种不同的同种型。
人转化生长因子β2同种型1前体的mRNA的核酸序列可以NCBI登录号NM_001135599.3获得。对应的氨基酸序列可以NCBI登录号NP_001129071.1获得。
人转化生长因子β2同种型1前体包括跨越前体蛋白质的氨基酸1至20的信号肽，跨越前体蛋白质的第21至302氨基酸的潜伏期相关肽，以及跨越前体蛋白质的氨基酸303至414的成熟的转化生长因子β2。
人转化生长因子β2同种型2前体的mRNA的核酸序列可以NCBI登录号NM_003238.3获得。对应的氨基酸序列可以NCBI登录号NP_003229.1获得。前体蛋白质包括跨越前蛋白原的氨基酸1至20的信号肽，跨越前体蛋白质的氨基酸21至302的潜伏期相关肽和跨越前体蛋白质的氨基酸303至414的成熟TGF-β2肽前蛋白原。
转化生长因子β2的氨基酸序列可进一步以UniProt登录号P61812-版本128获得。
转化生长因子β3(TGF-β3)，优选人转化生长因子β3(hTGF-β3)是参与胚胎发生和细胞分化的分泌细胞因子。
人转化生长因子β3前体蛋白质的mRNA的核酸序列可以NCBI登录号NM_003239.3获得。相应的氨基酸序列可以NCBI登录号NP_003230.1以及UniProt登录号P10600-版本170获得。
前体蛋白质包括包含前体蛋白质的氨基酸1至23的信号肽，包含前体蛋白质的氨基酸24至30的潜伏期相关肽和跨越前体蛋白质的氨基酸301至412的成熟转化生长因子β3肽。
优选地，转化生长因子β包含SEQ ID NO：19至25的氨基酸序列中的一个或至少一个。
活化素是最初从性腺液中纯化的二硫键连接的二聚体蛋白，作为刺激垂体促卵泡激素(FSH)释放的蛋白质。活化素蛋白具有广泛的生物活性，包括中胚层诱导、神经细胞分化、骨重建、造血以及在生殖生理学中的作用。
活化素是各种β亚基同种型的同源二聚体或异源二聚体，而抑制素是独特的α亚基和各种β亚基之一的异源二聚体。
已知四种β亚基，βA、βB、βC和βE。
第二异源因子选自M2极化因子。
优选地，M2极化因子作用于非极化巨噬细胞，M1极化巨噬细胞以及未分化的单核细胞和其他巨噬细胞祖细胞。
更优选地，所述M2极化因子诱导非极化巨噬细胞、M1极化巨噬细胞以及未分化的单核细胞和其他巨噬细胞祖细胞的M2极化。
本领域技术人员知道，巨噬细胞可以根据局部组织环境进行特异性分化。类似于辅助型T1型(TH1)和辅助型T2型(TH2)极化，已经定义了巨噬细胞的两种不同的极化状态：经典活化(M1-极化)的巨噬细胞表型和备选活化(M2-极化)的巨噬细胞表型。
基于基因表达谱，M2极化巨噬细胞表型可以进一步划分为M2a极化、M2b极化和M2c极化表型亚组。
M1极化和M2极化巨噬细胞具有不同的趋化因子和趋化因子受体谱。
M1极化巨噬细胞优选分泌TH1细胞吸引趋化因子趋化因子(C-X-C基序)配体9(CXCL9)和C-X-C基序趋化因子10(CXCL10)。M2极化巨噬细胞优选分泌趋化因子趋化因子(C-C基序)配体17(CCL17)，C-C基序趋化因子22(CCL22)和趋化因子(C-C基序)配体24(CCL24)。
异源因子的M2极化效应可以，例如通过将非极化巨噬细胞、M1极化巨噬细胞或巨噬细胞祖细胞(优选单核细胞)与至少一种M2极化因子接触，随后测定M2极化标记的表达和/或分泌来确定。
例如，鼠非极化巨噬细胞细胞系、鼠M1极化巨噬细胞系，或鼠巨噬细胞祖细胞系，优选鼠单核细胞系，可以与至少一种产生鼠M2极化巨噬细胞细胞系的M2极化因子相接触。例如，可以通过测定以下因素的表达来检测鼠巨噬细胞细胞系的M2极化：精氨酸酶1(Arg1)，白介素10(IL-10)，甘露糖受体C型1(Mrc1)和Ym1，其也称为T淋巴细胞衍生的嗜酸性粒细胞趋化因子(ECF-L)或几丁质酶样蛋白3(Chil3)。例如，可以通过测定以下因素的表达和/或释放来检测鼠巨噬细胞细胞系的M1极化：肿瘤坏死因子α(TNFalpha，TNFα)，白介素6(IL-6)，趋化因子(CC基序)配体2(CCL2)和趋化因子(CC基序)配体4(CCL4)。
优选地，人M2极化巨噬细胞衍生自人单核细胞，其与至少一种M2极化因子一起孵育。衍生自人单核细胞的巨噬细胞的M2极化可以例如通过测定以下因子的表达和/或释放来检测：白介素1受体拮抗剂(IL1RA)，前列腺素E2(PGE2)，白介素10(IL-10)和转化生长因子β(TGF-β)。
最近已经证明，在体外，响应于细胞因子环境的变化，巨噬细胞能够从M2到M1反向极化，反之亦然(Davis等人(2013))。此外，极化的变化迅速并且发生在基因表达、蛋白质、代谢物和杀微生物活性的水平。
此外，巨噬细胞是与实体瘤相关的浸润性白细胞的主要群体之一。肿瘤相关的巨噬细胞(TAM)在肿瘤免疫中起重要作用，并显示出与M2极化相似的功能，也称为M2d TAM极化。
刺激和/或活化相应极化(M1、M2a、M2b、M2c和M2d TAM)所需的各因素是本领域技术人员已知的，并且例如在Hao等人(2012)或Duluc等人(2007)中公开。
优选地，相应的第二异源因子以及任选的第三异源因子在所述重组益生菌中表达后诱导M2极化，并从细菌释放到炎性(优选慢性炎性)皮肤功能障碍的部位。
抗炎M2极化巨噬细胞然后优选促进血管发生、结缔组织沉积和创伤修复，其导致所述待治疗的炎性(优选慢性炎性)皮肤功能障碍的改善，优选治愈。
在优选的实施方案中，所述M2极化因子选自M2极化细胞因子，M2极化趋化因子及其混合物。优选地，所述M2极化因子诱导M2c极化。
进一步优选地，所述M2极化因子选自白介素4(IL-4)，白介素10(IL-10)，白介素13(IL-13)，集落刺激因子-1(CSF1)，白介素34(IL34)，其功能类似物，其生物相似物及其混合物，优选白介素4(IL-4)，白介素10(IL-10)，白介素13(IL-13)，集落刺激因子-1(CSF1)，白介素34(IL34)及其混合物，进一步优选集落刺激因子-1(CSF1)，白介素34(IL34)，白介素4(IL-4)，白介素13(IL-13)，其功能类似物，其生物相似物和混合物，进一步优选集落刺激因子-1(CSF1)，白介素34(IL34)，白介素4(IL-4)，白介素13(IL-13)及其混合物。
白介素4(IL-4)，优选人白介素4(hIL-4)是多效细胞因子。白介素4是白介素4受体的配体。白介素4受体还结合白介素13(IL-13)，这可能有助于白介素4和白介素13的许多重叠功能。
白介素4(IL-4)也显示出具有增殖诱导性质。此外，白介素4(IL-4)诱导胶原蛋白的产生。
人白介素4同种型1前体的mRNA的核酸序列可以NCPI登录号NM_000589.3获得。对应的氨基酸序列可以NCBI登录号NP_000580.1获得，并且在图18a中示出。
人白介素4同种型2前体的mRNA的核酸序列可以NCBI登录号NM_172348.2获得。对应的氨基酸序列可以NCBI登录号NP_758858.1获得，并且在图18b中示出。
人类白介素4的氨基酸序列也可以UniProt登录号P05112-版本178获得。
氨基酸序列包含跨越白介素4同种型1和同种型2前体的氨基酸1至24的信号肽。
优选地，人白介素4包含SEQ ID 10至14的氨基酸序列中的一个或至少一个。
白介素13(IL-13)，优选人白介素13(hIL-13)是主要由活化的TH2细胞产生的免疫调节细胞因子。
人白介素13前体的mRNA的核酸序列可以NCBI登录号NM_002188.2获得。对应的氨基酸序列可以NCBI登录号NP_002179.2以及UniProt登录号P35225-版本157获得，并且在图20a中示出。
白介素13前体包含跨越以UniProt登录号P35225-版本157保藏的白介素13前体蛋白质的氨基酸1至24的信号肽。
优选地，白介素13包含SEQ ID 17和18的氨基酸序列中的一个或至少一个。
白介素10(IL-10)，优选人白介素10(hIL-10)是主要由单核细胞产生并且被淋巴细胞较少延伸的细胞因子。白介素10在免疫调节和炎症中具有多效性。例如白介素10下调TH1细胞因子的表达。
人白介素10前体的mRNA的核酸序列可以NCBI登录号NM_000572.2找到。相应的氨基酸序列可以NCBI登录号NP_000563.1以及UniProt登录号P22301-版本156找到，并在图19a中示出。
人白介素10前体的氨基酸序列包括跨越人白介素10前体蛋白质的氨基酸1至18的信号肽。
优选地，白介素10包含SEQ ID 15至16的氨基酸序列中的一个或至少一个。
集落刺激因子-1(CSF-1)也称为巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)，是控制巨噬细胞的产生、分化和功能的细胞因子。
由于可选择的剪接，人CSF-1以不同的同种型存在，可以用于本发明。
人CSF-1同种型1，也被称为巨噬细胞集落刺激因子1同种型A前体的mRNA的核酸序列可以NCBI登录号NM_000757.5获得。相应的氨基酸序列可以NCBI登录号NP_000748.3获得，并且在图16a中示出。
人CSF-1同种型2前体，也被称为人巨噬细胞集落刺激因子1同种型B前体的mRNA的核酸序列可以NCBI登录号NM_172210.2获得。相应的氨基酸序列可以NCBI登录号NP_757349.1获得，并在图16b中示出。
人CSF-1同种型3前体，也被称为巨噬细胞集落刺激因子1同种型C前体的mRNA的核酸序列可以NCBI登录号NM_172211.3获得。相应的氨基酸序列可以NCBI登录号NP_757350.1获得，并在图16c中示出。
对应的氨基酸序列也可以UniProt登录号P09603-版本158获得。同种型1已被选择作为规范的UniProt序列。
人CSF-1前体同种型1至3的各自的蛋白质序列包括跨越各氨基酸序列的氨基酸数1至氨基酸数32的N-端信号肽。
人CSF-1的活性形式可以在细胞外作为二硫键连接的同源二聚体发现。活性形式是通过膜结合前体的蛋白水解切割产生的，导致N-端信号肽的丧失。
优选地，集落刺激因子1包含SEQ ID NO：1至6中的一个或至少一个氨基酸序列。
白介素34(IL-34)是促进单核细胞和巨噬细胞分化和生存力的细胞因子。
由于可选择的剪接，人白介素34以两种同种型存在，可以用于本发明。
人白介素34同种型1前体的mRNA的核酸序列可以NCBI登录号NM_001172772.1获得。相应的氨基酸序列可以NCBI登录号NP_001166243.1获得，并且在图17a中示出。
人白介素34同种型2前体的mRNA的核酸序列可以NCBI登录号NM_001172771.1获得。相应的氨基酸序列可以NCBI登录号NP_001166242.1获得，并在图17b中示出。
相应的氨基酸序列也可以UniProt登录号Q6ZMJ4-版本80获得。
人白介素34前体包括跨越前体蛋白质的相应氨基酸序列的氨基酸1至20的信号肽。
优选地，白介素34包含SEQ ID 7至9的氨基酸序列的一个或至少一个。
在优选的实施方案中，所述M2极化因子通过结合到集落刺激因子-1受体来促进单核细胞和巨噬细胞的分化和生存力。
集落刺激因子-1受体(CSF1R)也称为巨噬细胞集落刺激因子受体，是酪氨酸蛋白激酶，其作为细胞表面受体发挥作用，并在调节巨噬细胞和单核细胞生存、增殖和分化的中发挥重要作用。
CSF1R响应于CSF1R配体的结合促进例如促炎症趋化因子释放，从而在先天免疫和炎性过程中起重要作用。
优选地，所述M2极化因子是至少一种集落刺激因子-1受体(CSF1R)配体。
CSF1R配体是本领域技术人员已知的，并且包括白介素34(IL-34)和集落刺激因子1(CSF-1)。优选地，所述集落刺激因子-1受体配体选自集落刺激因子-1(CSF-1)、白介素34(IL-34)、其功能类似物及其生物相似物。
进一步优选地，所述集落刺激因子-1受体配体是人集落刺激因子-1受体配体，进一步优选选自人集落刺激因子-1(hCSF-1)、人白介素34(hIL-34)、其功能类似物及其生物相似物。
在另一优选实施方案中，所述集落刺激因子-1受体配体是具有SEQ ID No.1至9的氨基酸序列之一或至少一个的蛋白质。
在优选的实施方案中，所述第一、第二和/或第三异源因子用分泌信号序列，优选N末端信号肽或前肽表达。在表达各个因子后，可以通过翻译后修饰来去除分泌信号序列，优选N末端信号肽或前肽。或者，所述第一、第二和/或第三异源因子可以成熟形式表达，优选没有分泌信号序列，优选N末端信号肽或前肽。
在优选的实施方案中，根据权利要求1的重组益生菌包含至少一个编码第一异源因子的核酸序列，至少一个编码第二异源因子的核酸序列，和至少一个编码第三异源因子的核酸序列，条件是所述第一因子、所述第二因子和所述第三因子在功能上彼此不同，
其中所述第一因子是生长因子，其中所述第二因子选自M2极化因子，并且其中所述第三因子选自M2极化因子和生长因子。
在优选的实施方案中，所述第二异源因子和所述第三异源因子选自M2极化因子，其中所述第二因子和所述第三因子是功能上不同的M2极化因子。
也就是说，所述第二异源因子是第一M2极化因子，所述第三异源因子是与所述第一M2极化因子在功能上不同的第二M2极化因子。
优选地，所述第一M2极化因子是选自集落刺激因子-1(CSF-1)、白介素34(IL-34)、白介素4(IL-4)和白介素13(IL-13)的M2极化因子，所述第二M2极化因子是选自集落刺激因子-1(CSF-1)、白介素34(IL-34)、白介素4(IL-4)、白介素10(IL-10)和白介素13(IL-13)的M2极化因子，条件是所述第二M2极化因子与所述第一M2极化因子在功能上是不同的。
更优选地，所述第一M2极化因子是集落刺激因子-1受体(CSF1R)配体，所述第二M2极化因子是选自白介素4(IL-4)、白介素10(IL-10)、白介素13(IL-13)、其功能类似物，其生物相似物及其混合物的M2极化因子。
M2极化因子的进一步优选的组合是：
·集落刺激因子-1和白介素4，
·集落刺激因子-1和白介素13，
·集落刺激因子-1和白介素10，
·白介素34和白介素4，
·白介素34和白介素13，
·白介素34和白介素10，
·白介素4和白介素10，或
·白介素13和白介素10。
上述M2极化因子的更优选组合与至少一种上述生长因子组合，优选与选自下组的生长因子组合，所述生长因子选自成纤维细胞生长因子1、成纤维细胞生长因子2、成纤维细胞生长因子7、成纤维细胞生长因子10、肝细胞生长因子、转化生长因子β(TGF-β)、表皮生长因子(EGF)、肝素结合EGF样生长因子(HB-EGF)、转化生长因子-α(TGF-α)和血小板衍生生长因子BB。
优选地，所述第一、第二和第三异源因子是下述的组合
·成纤维细胞生长因子2，集落刺激因子-1和白介素4，
·成纤维细胞生长因子2，白介素34和白介素4，
·成纤维细胞生长因子2，集落刺激因子-1和白介素13，
·成纤维细胞生长因子2，白介素34和白介素13，
·成纤维细胞生长因子2，集落刺激因子-1和白介素10，
·成纤维细胞生长因子2，白介素34和白介素10，
·成纤维细胞生长因子7，集落刺激因子-1和白介素4，
·成纤维细胞生长因子7，白介素34和白介素4，
·成纤维细胞生长因子7，集落刺激因子-1和白介素13，
·成纤维细胞生长因子7，白介素34和白介素13，
·成纤维细胞生长因子7，集落刺激因子-1和白介素10，
·成纤维细胞生长因子7，白介素34和白介素10，
·转化生长因子β，集落刺激因子-1和白介素4，
·转化生长因子β，白介素34和白介素4，
·转化生长因子β，集落刺激因子-1和白介素13，
·转化生长因子β，白介素34和白介素13
·转化生长因子β，集落刺激因子-1和白介素10，
·转化生长因子β，白介素34和白介素10，
·转化生长因子α，集落刺激因子-1和白介素4，
·转化生长因子α，白介素34和白介素4，
·转化生长因子α，集落刺激因子-1和白介素13，
·转化生长因子α，白介素34和白介素13
·转化生长因子α，集落刺激因子-1和白介素10，
·转化生长因子α，白介素34和白介素10
·血小板衍生生长因子BB，集落刺激因子-1和白介素4，
·血小板衍生生长因子BB，白介素34和白介素4，
·血小板衍生生长因子BB，集落刺激因子-1和白介素13，
·血小板衍生生长因子BB，白介素34和白介素13
·血小板衍生生长因子BB，集落刺激因子-1和白介素10，或
·血小板衍生生长因子BB，白介素34和白介素10。
进一步优选地，所述第一、第二和第三异源因子是成纤维细胞生长因子2、集落刺激因子-1和白介素4，其功能类似物及其生物相似物的组合。
优选地，通过从本发明的益生菌中释放两个或更多个M2极化因子，进一步促进了非极化巨噬细胞、M1极化巨噬细胞以及未分化的单核细胞和其他巨噬细胞祖细胞的M2极化。
在替代实施方案中，所述第一因子是选自上述生长因子的第一生长因子，并且所述第三因子是选自上述生长因子且功能上不同于所述第一生长因子的第二生长因子。优选地，所述第二生长因子是转化生长因子β(TGF-β)。
生长因子的进一步优选组合是：
·成纤维细胞生长因子1和转化生长因子β，
·成纤维细胞生长因子2和转化生长因子β，
·成纤维细胞生长因子7和转化生长因子β，
·成纤维细胞生长因子10和转化生长因子β，
·血小板衍生生长因子BB和转化生长因子β，
·转化生长因子α和转化生长因子β，
·表皮生长因子和转化生长因子β，
·肝素结合EGF样生长因子和转化生长因子β，
·肝细胞生长因子和转化生长因子β，或
·血管内皮生长因子A和转化生长因子β。
上述进一步优选的生长因子组合优选与选自集落刺激因子-1(CSF-1)、白介素34(IL-34)、白介素4(IL-4)、白介素10(IL-10)、白介素13(IL-13)及其混合物，优选集落刺激因子-1(CSF-1)、白介素34(IL-34)、白介素4(IL-4)、13(IL-13)及其混合物组合。
本发明的重组益生菌将应用于炎性皮肤功能障碍治疗，优选应用于慢性炎性皮肤功能障碍治疗。
在优选的实施方案中，所述炎性皮肤功能障碍，优选所述慢性炎性皮肤功能障碍，是炎性皮肤疾病，优选慢性炎性皮肤疾病，或炎性结缔组织疾病，优选慢性炎性结缔组织疾病。所述炎症性皮肤疾病可以是冻伤、湿疹、银屑病、皮炎、溃疡、创伤、红斑狼疮(lupuseritematosus)、神经性皮炎(neurodermitis)及其组合，优选冻伤、皮炎、溃疡、创伤及其组合，进一步优选创伤、溃疡及其组合，进一步优选溃疡。
所述炎性，优选慢性炎性皮肤疾病还可以包括可能进展为慢性炎性状态的炎性(优选慢性炎性)皮肤外伤。
冻伤是由于冻结而导致皮肤和其他组织局部损伤并且可能会涉及组织破坏的医学状况。所述冻伤也可以是由暴露于寒冷和潮湿而导致的皮肤表面溃疡的冻疮(chilblains)(冻疮(perniones))。皮肤毛细血管床的损伤会引起发红、瘙痒、炎症，以及有时发生水疱。更优选地，所述冻伤是冻疮。
所述创伤可以是烧伤创伤、化学创伤、辐射诱发的创伤、缺血性创伤或机械创伤。
所述溃疡可以是褥疮性溃疡或小腿(cruris)溃疡。所述溃疡也可以是静脉性溃疡、动脉性溃疡、糖尿病性溃疡或压力性溃疡。
所述溃疡也可以是上述溃疡没有任何明显迹象的开放式皮肤创伤的溃疡前期。没有医疗干预，溃疡前期可能进展为溃疡。
所述创伤也可以是急性创伤或慢性创伤，优选慢性创伤。
慢性创伤是本领域技术人员已知的，包括例如慢性静脉性溃疡、慢性动脉性溃疡、慢性糖尿病性溃疡和慢性压力性溃疡。慢性创伤也可能由放射线中毒或缺血引起。优选地，所述慢性创伤是慢性静脉性溃疡、慢性动脉性溃疡、慢性压力性溃疡和慢性溃疡前期，优选慢性静脉性溃疡，、慢性动脉性溃疡和慢性压力性溃疡中的至少一种。
慢性静脉性溃疡通常可能发生在腿部，约占慢性创伤的70％至90％，主要影响老年患者。
慢性创伤的另一个主要原因是糖尿病。患有糖尿病的患者由于慢性溃疡而比一般人群的截肢风险高15％。糖尿病导致神经病变，其抑制伤害感和疼痛感。因此，患者可能不会注意到腿部和足部的小创伤，因此可能无法预防感染或反复受伤。
另一个问题是糖尿病导致免疫妥协和对小血管的损伤，导致组织的氧合减少。防止组织充分氧合显著增加慢性创伤的患病率。
压力性溃疡，也称为褥疮性溃疡或床疮，可能伴有糖尿病状况或没有糖尿病状况发生。压力性溃疡是作为压力或压力与剪切或摩擦相结合的结果，可能在骨性隆起上发生的皮肤和/或潜在组织的局部损伤。
糖尿病是一种具有接近世界范围的流行病的扩大的比例的主要的内分泌代谢紊乱。下肢溃疡，例如糖尿病足溃疡，是与糖尿病相关的严重的长期并发症之一，其可能由于组织再生的潜在失效而持续并放大。
美国、欧盟和日本约有1300万慢性创伤患者，其中约280万患有下肢溃疡，如糖尿病足溃疡。
下肢溃疡，例如糖尿病足溃疡，在没有确定的常规的非侵入性治疗存在的情况下是具有挑战性的。下肢溃疡需要大量的医疗关照并且使与生活质量基本丧失相关的患者极度虚弱。
大约有24％罹患下肢溃疡的患者将需要截肢，导致长期残疾。
罹患下肢溃疡的患者的年度医疗护理费用在1000亿美元的范围内。此外，下肢溃疡患者的五年死亡率约为45％，高于许多癌症。
目前，包括诸如下肢溃疡的糖尿病性创伤在内的慢性创伤的标准治疗管理主要集中在控制感染和促进血管重建。尽管有这些策略，但在罹患下肢溃疡的患者中，截肢率仍然高得令人无法接受。
此外，在改善和/或治疗诸如糖尿病或慢性静脉功能不全的基础疾病状况或溃疡的原因时，例如分别通过控制血糖水平或施用血压药物，现有的溃疡可能仍然存在很长时间才能愈合。
因此，为了克服缺乏对包括诸如下肢溃疡的糖尿病创伤在内的慢性创伤的确定性、非侵入性治疗，迫切需要在罹患慢性创伤的患者中重新活化并促进创伤愈合的新策略。
优选地，在慢性创伤的情况下，优选从所述益生菌释放的因子的独特组合允许将所述慢性创伤重新编程成急性创伤，其随后经历创伤闭合。
在优选的实施方案中，重组益生菌应将局部施用和/或通过皮下注射施用，进一步优选局部施用。
重组益生菌优选局部施用至待治疗的炎性，优选慢性炎性皮肤功能障碍。
重组益生菌可以局部施用至炎性，优选慢性炎性，皮肤功能障碍和/或通过皮下注射到皮肤功能障碍附近，优选进入炎症性，优选慢性炎性皮肤功能障碍的边缘或空腔。
在应用本发明的重组益生菌后，细菌表达所述第一和第二异源因子，优选所述第一、第二和第三异源因子。
此外，通过将本发明的重组益生菌溃疡局部应用或皮下注射到溃疡前期的部位，可以避免溃疡前期向开放性创伤的进展。
优选通过用编码所述第一异源因子的至少一条核酸序列和编码所述第二异源因子的至少一条核酸序列转化益生菌获得重组益生菌，优选用编码所述第三异源因子的至少一条核酸序列。
用于获得本发明的重组益生菌的合适的益生菌是非病原菌。优选地，非病原菌是非侵入性细菌。在另一个优选的实施方案中，重组益生菌是革兰氏阳性细菌，优选革兰氏阳性非孢子形成细菌。进一步优选地，所述益生菌是在人类胃肠道中不具有繁殖能力的非定殖细菌。
在另一优选实施方案中，重组益生菌包括革兰氏阳性食品级细菌菌株。
根据本发明的优选实施方案，重组益生菌可以来自相同的细菌菌株或不同细菌菌株的混合物。
在另一个实施方案中，美国食品和药品管理局(FDA)将益生菌分类为“通常被认为是安全的”(GRAS)。
在另一个实施方案中，益生菌具有由欧洲食品安全局(EFSA)定义的“合格推定安全性”(QPS状态)。在EFSAJournal Vol.587,2007,第1-16页中描述了对所选择的微生物进行评估的合格推定安全性(QPS)方法。
在另一优选实施方案中，益生菌是属于厚壁菌门(Phylum Firmicutes)或放线菌的非致病细菌。优选地，益生菌是选自双歧杆菌属(bifidobacterium)、棒杆菌属(corynebacterium)、肠球菌属(enterococcus)、乳杆菌属(lactobacillus)、乳球菌属(lactococcus)、明串珠菌属(leuconostoc)、片球菌属(pediococcus)、丙酸杆菌属(propionibacterium)和链球菌属(streptococcus)中的至少一种属的非致病细菌。
在另一个优选实施方案中，益生菌是乳酸菌(LAB)。乳酸菌是具有共同的代谢和生理特征的革兰氏阳性，耐酸，通常非孢子形成的非呼吸细菌的进化枝。这些细菌产生乳酸作为糖类形成的主要代谢终产物。
乳酸菌是长期公知的，并且用于例如食品发酵。此外，蛋白质细菌素由几种乳酸菌菌株产生。
此外，乳酸菌由于其在食物中普遍存在的外观及其对人体粘膜表面的健康微生物区系的贡献而是通常被认为是安全的(GRAS)状态。
在另一优选实施方案中，益生菌不包括病原菌和/或机会菌。
在另一个实施方案中，益生菌来自双歧杆菌属，包括但不限于放线菌双歧杆菌(Bifidobacterium actinocoloniiforme)、青春双歧杆菌(Bifidobacteriumadolescentis)、Bifidobacterium aesculapii、角形双歧杆菌(Bifidobacteriumangulatum)、双歧杆菌动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)，例如动物双歧杆菌动物亚种(Bifidobacterium animalis subsp.animalis)或动物双歧杆菌乳菌亚种(Bifidobacterium animalis subsp.lactis)、星状双歧杆菌(Bifidobacteriumasteroides)、Bifidobacterium biavatii、两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)、Bifidobacterium bohemicum、Bifidobacterium bombi、Bifidobacterium boum、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、Bifidobacterium callitrichos、Bifidobacteriumcatenulatum、豚双歧杆菌(Bifidobacterium choerinum)、棒状双歧杆菌(Bifidobacterium coryneforme)、Bifidobacterium crudilactis、家兔双歧杆菌(Bifidobacterium cuniculi)、链状双歧杆菌(Bifidobacterium denticolens)、齿状双歧杆菌(Bifidobacterium dentium)、Bifidobacterium faecale、没食子双歧杆菌(Bifidobacterium gallicum)、鸡双歧杆菌(Bifidobacterium gallinarum)、球形双歧杆菌(Bifidobacterium globosum)、尤双歧杆菌(Bifidobacterium indicum)、婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)、殊形双歧杆菌(Bifidobacterium inopinatum)、Bifidobacterium kashiwanohense、乳酸双歧杆菌(Bifidobacterium lactis,,forexample,)、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)，例如长双歧杆菌婴儿亚种(Bifidobacterium longum subsp.infantis)、长双歧杆菌长形亚种(Bifidobacteriumlongum subsp.longum)或Bifidobacterium longum subsp.suis、巨大双歧杆菌(Bifidobacterium magnum)、瘤胃双歧杆菌(Bifidobacterium merycicum)、微小双歧杆菌(Bifidobacterium minimum)、蒙古双歧杆菌(Bifidobacterium mongoliense)、Bifidobacterium moukalabense、假性双歧杆菌(Bifidobacterium pseudocatenulatum)、假长双歧杆菌(Bifidobacterium pseudolongum)，例如假长双孢杆菌球状亚种(Bifidobacterium pseudolongum subsp.globosum)或假长双歧杆菌假单胞亚种(Bifidobacterium pseudolongum subsp.pseudolongum)、嗜冷双歧杆菌(Bifidobacterium psychraerophilum)、小鸡双歧杆菌(Bifidobacterium pullorum)、Bifidobacterium reuteri、反刍双歧杆菌(Bifidobacterium ruminantium)、波伦亚双歧杆菌(Bifidobacterium saeculare)、Bifidobacterium saguini、史卡杜维双歧杆菌(Bifidobacterium scardovii)、Bifidobacterium stellenboschense、纤细双歧杆菌(Bifidobacterium subtile)、Bifidobacterium stercoris、猪双歧杆菌(Bifidobacterium suis)、热嗜酸性双歧杆菌(Bifidobacterium thermacidophilum)，例如热嗜酸性双歧杆菌猪亚种(Bifidobacterium thermacidophilum subsp.porcinum)或热嗜酸性双歧杆菌热嗜酸亚种(Bifidobacterium thermacidophilumsubsp.thermacidophilum)、嗜热双歧杆菌(Bifidobacterium thermophilum)或Bifidobacterium tsurumiense。
优选地，益生菌不是齿状双歧杆菌(Bifidobacterium dentium)。
优选地，益生菌是双歧杆菌属种中具有“合格推定安全性”(QPS)状态的细菌，包括但不限于青春双歧杆菌、动物双歧杆菌、长双歧杆菌、短双歧杆菌或两歧双歧杆菌。
在一个实施方案中，益生菌属于棒杆菌属，包括但不限于，拥挤棒杆菌(Corynebacterium accolens)、非发酵棒杆菌(Corynebacterium afermentans)，例如非发酵棒杆菌非发酵亚种(Corynebacterium afermentans subsp.afermentans或Corynebacterium afermentans subsp.lipophilum、产氨棒杆菌(Corynebacteriumammoniagenes)、无枝菌酸棒杆菌(Corynebacterium amycolatum)、Corynebacteriumappendices、Corynebacterium aquatimens、Corynebacterium aquilae、银色棒杆菌(Corynebacterium argentoratense)、Corynebacterium atypicum、Corynebacteriumaurimucosum、耳棒杆菌(Corynebacterium auris)、Corynebacterium auriscanis、菾菜棒杆菌(Corynebacterium betae)、Corynebacterium beticola、牛棒杆菌(Corynebacteriumbovis)、美棒杆菌(Corynebacterium callunae)、Corynebacterium camporealensis、犬棒杆菌(Corynebacterium canis)、Corynebacterium capitovis、乳酪棒杆菌(Corynebacterium casei)、Corynebacterium caspium、Corynebacterium ciconiae、Corynebacterium confusum、科伊尔棒杆菌(Corynebacterium coyleae)、膀胱炎棒杆菌(Corynebacterium cystitidis)、Corynebacterium deserti、白喉棒杆菌(Corynebacterium diphtheriae)、Corynebacterium doosanense、硬棒状棒杆菌(Corynebacterium durum)、Corynebacterium efficiens、Corynebacteriumepidermidicanis、马棒杆菌(Corynebacterium equi)、Corynebacterium falsenii、缠绕棒杆菌(Corynebacterium fascians)、猫科棒杆菌(Corynebacterium felinum)、萎蔫棒杆菌(Corynebacterium flaccumfaciens)，例如，Corynebacterium flaccumfacienssubsp.Betae、Corynebacterium flaccumfaciens subsp.Flaccumfaciens、Corynebacterium flaccumfaciens subsp.oortii或Corynebacterium flaccumfacienssubsp.poinsettiae、微黄棒杆菌(Corynebacterium flavescens)、Corynebacteriumfrankenforstense、Corynebacterium freiburgense、Corynebacterium freneyi、深紫棒杆菌(Corynebacterium glaucum)、解葡萄糖苷棒杆菌(Corynebacteriumglucuronolyticum)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、耐盐棒杆菌(Corynebacterium halotolerans)、汉氏棒杆菌(Corynebacterium hansenii)、Corynebacterium hoagie、Corynebacterium humireducens、Corynebacterium ilicis、Corynebacterium imitans、诡谲棒杆菌(Corynebacterium insidiosum)、伊朗棒杆菌(Corynebacterium iranicum)、杰氏棒杆菌(Corynebacterium jeikeium)、Corynebacterium kroppenstedtii、库氏棒杆菌(Corynebacterium kutscheri)、球菌棒杆菌(Corynebacterium lactis)、百合棒杆菌(Corynebacterium lilium)、Corynebacteriumlipophiloflavum、液化棒杆菌(Corynebacterium liquefaciens)、Corynebacteriumlubricantis、麦氏棒杆菌(Corynebacterium macginleyi)、Corynebacterium marinum、Corynebacterium maris、Corynebacterium massiliense、乳腺炎棒杆菌(Corynebacterium mastitidis)、马氏棒杆菌(Corynebacterium matruchotii)、密执安棒杆菌(Corynebacterium michiganense)，例如Corynebacterium michiganensesubsp.Insidiosum、Corynebacterium michiganense subsp.michiganense、Corynebacterium michiganense subsp.Nebraskense、Corynebacterium michiganensesubsp.sepedonicum或Corynebacterium michiganense subsp.tessellarius、极小棒杆菌(Corynebacterium minutissimum)、Corynebacterium mooreparkense、Corynebacteriummucifaciens、Corynebacterium mustelae、类菌棒杆菌(Corynebacterium mycetoides)、尼布拉斯加棒杆菌(Corynebacterium nebraskense)、Corynebacterium nigricans、Corynebacterium nuruki、奥氏棒杆菌(Corynebacterium oortii)、稍变棒杆菌(Corynebacterium paurometabolum)、海棒杆菌(Corynebacterium phocae)、Corynebacterium pilbarense、多毛棒杆菌(Corynebacterium pilosum)、猩猩棒杆菌(Corynebacterium poinsettiae)、丙酸棒杆菌(Corynebacterium propinquum)、假白喉棒杆菌(Corynebacterium pseudodiphtheriticum)、假结核棒杆菌(Corynebacteriumpseudotuberculosis)、化脓棒杆菌(Corynebacterium pyogenes)、Corynebacteriumpyruviciproducens、拉氏棒杆菌(Corynebacterium rathayi)、牛肾盂炎棒杆菌(Corynebacterium renale)、抗药性棒杆菌(Corynebacterium resistens)、Corynebacterium riegelii、Corynebacterium seminale、Corynebacteriumsepedonicum、模仿棒杆菌(Corynebacterium simulans)、单独棒杆菌(Corynebacteriumsingulare)、Corynebacterium sphenisci、Corynebacterium spheniscorum、Corynebacterium sputi、Corynebacterium stationis、纹带棒杆菌(Corynebacteriumstriatum)、Corynebacterium suicordis、Corynebacterium sundsvallense、Corynebacterium terpenotabidum、Corynebacterium testudinoris、Corynebacteriumthomssenii、Corynebacterium timonense、小麦棒杆菌(Corynebacterium tritici)、结核硬脂酸棒状杆菌(Corynebacterium tuberculostearicum)、Corynebacteriumtuscaniense、溃疡棒杆菌(Corynebacterium ulcerans)、Corynebacterium ulceribovis、Corynebacterium urealyticum、Corynebacterium ureicelerivorans、Corynebacteriumuterequi、变异棒杆菌(Corynebacterium variabile)、Corynebacterium vitaeruminis或干燥棒杆菌(Corynebacterium xerosis)。
优选地，益生菌不是白喉棒杆菌、Corynebacterium amicolatum、纹带棒杆菌、杰氏棒杆菌、Corynebacterium urealyticum、干燥棒杆菌、假结核棒杆菌、Corynebacteriumtenuis、纹带棒杆菌或极小棒杆菌。
优选地，益生菌是在棒杆菌属中分类为“通常被认为是安全的”(GRAS)的细菌，包括但不限于产氨棒杆菌、乳酪棒杆菌、微黄棒杆菌或变异棒杆菌。
在另一个实施方案中，细菌来自肠球菌属，包括但不限于Enterococcusalcedinis、Enterococcus aquimarinus、驴肠球菌(Enterococcus asini)、鸟肠球菌(Enterococcus avium)、Enterococcus caccae、Enterococcus camelliae、Enterococcuscanintestini、Enterococcus canis、铅黄肠球菌(Enterococcus casseliflavus)、盲肠肠球菌(Enterococcus cecorum)、哥伦比亚肠球菌(Enterococcus columbae)、Enterococcusdevriesei、Enterococcus diestrammenae、殊异肠球菌(Enterococcus dispar)、耐久肠球菌(Enterococcus durans)、Enterococcus eurekensis、粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、Enterococcus flavescens、鹑鸡肠球菌(Enterococcus gallinarum)、Enterococcus gilvus、Enterococcus haemoperoxidus、Enterococcus hermanniensis、海氏肠球菌(Enterococcus hirae)、Enterococcusitalicus、Enterococcus lactis、Enterococcus lemanii、病臭肠球菌(Enterococcusmalodoratus)、Enterococcus moraviensis、芒地肠球菌(Enterococcus mundtii)、Enterococcus olivae、Enterococcus pallens、Enterococcus phoeniculicola、Enterococcus plantarum、Enterococcus porcinus、类鸟肠球菌(Enterococcuspseudoavium)、Enterococcus quebecensis、棉子糖肠球菌(Enterococcus raffinosus)、Enterococcus ratti、Enterococcus rivorum、Enterococcus rotai、解糖肠球菌(Enterococcus saccharolyticus)，例如Enterococcus saccharolyticussubsp.saccharolyticus或Enterococcus saccharolyticus subsp.taiwanensis、Enterococcus saccharominimus、Enterococcus seriolicida、Enterococcussilesiacus、Enterococcus solitarius、硫磺肠球菌(Enterococcus sulfureus)、Enterococcus termitis、Enterococcus thailandicus、Enterococcus ureilyticus、Enterococcus viikkiensis、Enterococcus villorum或Enterococcus xiangfangensis。
优选地，益生菌是在肠球菌属中被分类为“通常被认为是安全的”(GRAS)的细菌，包括但不限于耐久肠球菌、粪肠球菌或屎肠球菌。
在另一个实施方案中，益生菌来自乳杆菌属，包括但不限于Lactobacillusacetotolerans、Lactobacillus acidifarinae、Lactobacillus acidipiscis、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、敏捷乳杆菌(Lactobacillus agilis)、双叉乳杆菌(Lactobacillus algidus)、消化乳杆菌(Lactobacillus alimentarius)、嗜淀粉乳杆菌(Lactobacillus amylolyticus)、Lactobacillus amylophilus、Lactobacillusamylotrophicus、食淀粉乳杆菌(Lactobacillus amylovorus)、动物乳杆菌(Lactobacillus animalis)、Lactobacillus antri、Lactobacillus apinorum、Lactobacillus apis、Lactobacillus apodemi、Lactobacillus aquaticus、Lactobacillus arizonensis、鸟乳杆菌(Lactobacillus aviaries)，例如鸟乳杆菌不解棉子糖亚种(Lactobacillus aviarius subsp.araffinosus)或鸟乳杆菌鸟亚种(Lactobacillus aviarius subsp.aviarius)、Lactobacillus backii、Lactobacillusbavaricus、双发酵乳杆菌(Lactobacillus bifermentans)、Lactobacillus bobalius、Lactobacillus bombi、Lactobacillus brantae、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、布赫内氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、Lactobacillus cacaonum、Lactobacillus camelliae、Lactobacillus capillatus、Lactobacillus carnis、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、例如干酪乳杆菌alactosus亚种、干酪乳杆菌干酪亚种(Lactobacillus casei subsp.casei)、干酪乳杆菌pseudoplantarum亚种、干酪乳杆菌rhamnosus亚种或干酪乳杆菌tolerans亚种、Lactobacillus catenaformis、纤维二糖乳杆菌(Lactobacillus cellobiosus)、Lactobacillus ceti、Lactobacillus coleohominis、丘状乳杆菌(Lactobacilluscollinoides)、Lactobacillus composti、Lactobacillus concavus、Lactobacillusconfusus、棒状乳杆菌(Lactobacillus coryniformis)、例如棒状乳杆菌棒状亚种(Lactobacillus coryniformis subsp.coryniformis)或棒状乳杆菌torquens亚种、卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)、Lactobacillus crustorum、Lactobacilluscurieae、弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)、例如弯曲乳杆菌弯曲亚种(Lactobacillus curvatus subsp.curvatus)或弯曲乳杆菌melibiosus亚种、Lactobacillus cypricasei、德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)、例如德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)、德氏乳杆菌德氏亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.delbrueckii)、德氏乳杆菌indicus亚种、德氏乳杆菌jakobsenii亚种、德氏乳杆菌乳酸亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.lactis)或德氏乳杆菌sunkii亚种、糊精乳杆菌(Lactobacillus dextrinicus)、Lactobacillusdiolivorans、歧异乳杆菌(Lactobacillus divergens)、Lactobacillus durianis、Lactobacillus equi、Lactobacillus equicursoris、Lactobacillus equigenerosi、Lactobacillus fabifermentans、Lactobacillus faecis、香肠乳杆菌(Lactobacillusfarciminis)、Lactobacillus farraginis、Lactobacillus ferintoshensis、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)、Lactobacillus floricola、Lactobacillus florum、Lactobacillus fornicalis、食果糖乳杆菌(Lactobacillus fructivorans)、果糖乳杆菌(Lactobacillus fructosus)、Lactobacillus frumenti、Lactobacillus fuchuensis、Lactobacillus furfuricola、Lactobacillus futsaii、鸡乳杆菌(Lactobacillusgallinarum)、戈氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)、Lactobacillus gastricus、Lactobacillus ghanensis、Lactobacillus gigeriorum、草乳杆菌(Lactobacillusgraminis)、Lactobacillus halotolerans、Lactobacillus hammesii、哈氏乳杆菌(Lactobacillus hamsteri)、Lactobacillus harbinensis、Lactobacillushayakitensis、Lactobacillus heilongjiangensis、Lactobacillus helsingborgensis、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、异型腐酒乳杆菌(Lactobacillusheterohiochii)、希尔加德氏乳杆菌(Lactobacillus hilgardii)、Lactobacillushokkaidonensis、Lactobacillus hominis、同型腐酒乳杆菌(Lactobacillushomohiochii)、Lactobacillus hordei、惰性乳杆菌(Lactobacillus iners)、Lactobacillus ingluviei、肠乳杆菌(Lactobacillus intestinalis)、Lactobacillusiwatensis、詹氏乳杆菌(Lactobacillus jensenii)、约氏乳杆菌(Lactobacillusjohnsonii)、Lactobacillus kalixensis、Lactobacillus kandleri、高加索酸奶粒乳杆菌(Lactobacillus kefiranofaciens)、例如高加索酸奶粒乳杆菌kefiranofaciens亚种或高加索酸奶粒乳杆菌kefirgranum亚种、开菲尔乳杆菌(Lactobacillus kefiri)、Lactobacillus kefirgranum、Lactobacillus kimbladii、Lactobacillus kimchicus、Lactobacillus kimchiensis、泡菜乳杆菌(Lactobacillus kimchii)、Lactobacilluskisonensis、Lactobacillus kitasatonis、Lactobacillus koreensis、Lactobacilluskullabergensis、Lactobacillus kunkeei、乳酸乳杆菌(Lactobacillus lactis)、Lactobacillus leichmannii、林氏乳杆菌(Lactobacillus lindneri)、坏发酵乳杆菌(Lactobacillus malefermentans)、马里乳杆菌(Lactobacillus mali)、Lactobacillusmaltaromicus、Lactobacillus manihotivorans、Lactobacillus mellifer、Lactobacillus mellis、Lactobacillus melliventris、Lactobacillus mindensis、微小乳杆菌(Lactobacillus minor)、小小乳杆菌(Lactobacillus minutus)、黏液乳杆菌(Lactobacillus mucosae)、鼠乳杆菌(Lactobacillus murinus)、Lactobacillusnagelii、Lactobacillus namurensis、Lactobacillus nantensis、Lactobacillusnasuensis、嫩江乳杆菌(Lactobacillus nenjiangensis)、Lactobacillus nodensis、Lactobacillus odoratitofui、Lactobacillus oeni、寡发酵乳杆菌(Lactobacillusoligofermentans)、口乳杆菌(Lactobacillus oris)、Lactobacillus oryzae、Lactobacillus otakiensis、Lactobacillus ozensis、面包乳杆菌(Lactobacilluspanis)、Lactobacillus pantheris、Lactobacillus parabrevis、类布赫内氏乳杆菌(Lactobacillus parabuchneri)、类干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)、例如类干酪乳杆菌类干酪亚种(Lactobacillus paracasei subsp.paracasei)或类干酪乳杆菌tolerans亚种、类丘状乳杆菌(Lactobacillus paracollinoides)、Lactobacillusparafarraginis、Lactobacillus parakefiri、Lactobacillus paralimentarius、类食品乳杆菌(Lactobacillus paraplantarum)、Lactobacillus pasteurii、Lactobacilluspaucivorans、戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)、Lactobacillus perolens、Lactobacillus piscicola、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、例如植物乳杆菌argentoratensis亚种或植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillus plantarumsubsp.plantarum)、Lactobacillus pobuzihii、桥乳杆菌(Lactobacillus pontis)、Lactobacillus porcinae、Lactobacillus psittaci、Lactobacillus rapi、Lactobacillus rennini、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、Lactobacillus rimae、Lactobacillus rodentium、Lactobacillus rogosae、Lactobacillus rossiae、瘤胃乳杆菌(Lactobacillusruminis)、Lactobacillus saerimneri、清酒乳杆菌(Lactobacillus sakei)、例如清酒乳杆菌Carnosus亚种或清酒乳杆菌清酒亚种(Lactobacillus sakei subsp.sakei)、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)、例如唾液乳杆菌salicinius亚种或唾液乳杆菌唾液亚种(Lactobacillus salivarius subsp.salivarius)、旧金山乳杆菌(Lactobacillussanfranciscensis)、Lactobacillus saniviri、Lactobacillus satsumensis、Lactobacillus secaliphilus、Lactobacillus selangorensis、Lactobacillussenioris、Lactobacillus senmaizukei、夏普乳杆菌(Lactobacillus sharpeae)、Lactobacillus shenzhenensis、Lactobacillus sicerae、Lactobacillus silagei、Lactobacillus siliginis、Lactobacillus similes、猪肠道乳酸杆菌(Lactobacillussobrius)、松花江乳杆菌(Lactobacillus songhuajiangensis)、Lactobacillusspicheri、Lactobacillus sucicola、Lactobacillus suebicus、Lactobacillus sunkii、Lactobacillus suntoryeus、台湾乳杆菌(Lactobacillus taiwanensis)、Lactobacillusthailandensis、Lactobacillus thermotolerans、Lactobacillus trichodes、Lactobacillus tucceti、Lactobacillus uli、乌尔蒂纳乳杆菌(Lactobacillusultunensis)、Lactobacillus uvarum、牛痘乳杆菌(Lactobacillus vaccinostercus)、阴道乳杆菌(Lactobacillus vaginalis)、费斯莫尔德乳杆菌(Lactobacillusversmoldensis)、Lactobacillus vini、Lactobacillus viridescens、Lactobacillusvitulinus、Lactobacillus xiangfangensis、木糖乳杆菌(Lactobacillus xylosus)、山梨乳杆菌(Lactobacillus yamanashiensis)、例如山梨乳杆菌Mali亚种或山梨乳杆菌山梨亚种(Lactobacillus yamanashiensis subsp.yamanashiensis)、Lactobacillusyonginensis、玉米乳杆菌(Lactobacillus zeae)或Lactobacillus zymae。
优选地，益生菌是在乳杆菌属中分类为“通常被认为是安全的”(GRAS)的细菌，包括但不限于嗜酸乳杆菌NP 28菌株、嗜酸乳杆菌NP51菌株、乳杆菌乳酸亚种NP7菌株、罗伊氏乳杆菌NCIMB 30242菌株、干酪乳杆菌Shirota菌株、罗伊氏乳杆菌DSM 17938菌株、罗伊氏乳杆菌NCIMB 30242菌株、嗜酸乳杆菌NCFM菌株、鼠李糖乳杆菌HN001菌株、鼠李糖乳杆菌HN001菌株、罗伊氏乳杆菌DSM 17938菌株、干酪乳杆菌鼠李糖亚种GG菌株、嗜酸乳杆菌、乳酸乳杆菌、Lactobacillus acetotolerans、Lactobacillus acidifarinae、Lactobacillusacidipiscis、嗜酸乳杆菌、消化乳杆菌、嗜淀粉乳杆菌、食淀粉乳杆菌、短乳杆菌、布赫内氏乳杆菌、Lactobacillus cacaonum、干酪乳杆菌干酪亚种、丘状乳杆菌、Lactobacilluscomposti、棒状乳杆菌棒状亚种、卷曲乳杆菌、Lactobacillus crustorum、弯曲乳杆菌弯曲亚种、德氏乳杆菌保加利亚亚种、德氏乳杆菌德氏亚种、德氏乳杆菌乳酸亚种、糊精乳杆菌、Lactobacillus diolivorans、Lactobacillus fabifermentans、香肠乳杆菌、发酵乳杆菌、食果糖乳杆菌、Lactobacillus frumenti、戈氏乳杆菌、Lactobacillus ghanensis、Lactobacillus hammesii、Lactobacillus harbinensis、瑞士乳杆菌、希尔加德氏乳杆菌、同型腐酒乳杆菌、Lactobacillus hordei、詹氏乳杆菌、约氏乳杆菌、开菲尔乳杆菌、高加索酸奶粒乳杆菌kefiranofaciens亚种、高加索酸奶粒乳杆菌kefirgranum亚种、泡菜乳杆菌、Lactobacillus kisonensis、马里乳杆菌、Lactobacillus manihotivorans、Lactobacillus mindensis、黏液乳杆菌、Lactobacillus nagelii、Lactobacillusnamurensis、Lactobacillus nantensis、Lactobacillus nodensis、Lactobacillus oeni、Lactobacillus otakiensis、面包乳杆菌、Lactobacillus parabrevis、类布赫内氏乳杆菌、类干酪乳杆菌类干酪亚种、Lactobacillus parakefiri、Lactobacillusparalimentarius、类食品乳杆菌、戊糖乳杆菌、Lactobacillus perolens、植物乳杆菌植物亚种、Lactobacillus pobuzihii、桥乳杆菌、Lactobacillus rapi、罗伊氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、Lactobacillus rossiae、清酒乳杆菌Carnosus亚种、清酒乳杆菌清酒亚种、唾液乳杆菌唾液亚种、旧金山乳杆菌、Lactobacillus satsumensis、Lactobacillussecaliphilus、Lactobacillus senmaizukei、Lactobacillus siliginis、Lactobacillusspicheri、Lactobacillus suebicus、Lactobacillus sunkii、Lactobacillus tucceti、牛痘乳杆菌、费斯莫尔德乳杆菌或山梨乳杆菌。
优选地，益生菌是在乳杆菌属中被分类为“通常被认为是安全的”(GRAS)的细菌，包括但不限于嗜酸乳杆菌、嗜淀粉乳杆菌、食淀粉乳杆菌、消化乳杆菌、鸟乳杆菌、短乳杆菌、布赫内氏乳杆菌、干酪乳杆菌、卷曲乳杆菌、弯曲乳杆菌、德氏乳杆菌、香肠乳杆菌、发酵乳杆菌、鸡乳杆菌、戈氏乳杆菌、瑞士乳杆菌、希尔加德氏乳杆菌、约氏乳杆菌、高加索酸奶粒乳杆菌、开菲尔乳杆菌、黏液乳杆菌、面包乳杆菌、类干酪乳杆菌、类食品乳杆菌、戊糖乳杆菌、植物乳杆菌、桥乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、清酒乳杆菌、唾液乳杆菌、旧金山乳杆菌或玉米乳杆菌。
在另一个实施方案中，益生菌来自乳球菌属，包括但不限于中华乳球菌(Lactococcus chungangensis)、Lactococcus formosensis、Lactococcus fujiensis、Lactococcus garvieae、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、例如乳酸乳球菌cremoris亚种、乳酸乳球菌hordniae亚种、乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactissubsp.lactis)、或乳酸乳球菌tructae亚种、Lactococcus piscium、植物乳球菌(Lactococcus plantarum)、棉子糖乳球菌(Lactococcus raffinolactis)或台湾乳球菌(Lactococcus taiwanensis)。
优选地，益生菌是在乳球菌属中被分类为“通常被认为是安全的”(GRAS)的细菌，包括但不限于乳酸乳球菌cremoris亚种,乳酸乳球菌乳酸亚种和棉子糖乳球菌。
优选地，益生菌是乳酸乳球菌，优选乳酸乳球菌乳酸菌亚种、乳酸乳球菌乳酸菌生物变异体二乙酰乳糖亚种或乳酸乳球菌cremoris亚种，进一步优选乳酸乳球菌cremoris亚种。
在另一个实施方案中，益生菌属于明串珠菌属，包括但不限于：Leuconostocamelibiosum、Leuconostoc argentinum、肉色明串珠菌(Leuconostoc carnosum)、柠檬明串珠菌(Leuconostoc citreum)、Leuconostoc cremoris、葡萄聚明串珠菌(Leuconostocdextranicum)、Leuconostoc durionis、Leuconostoc fallax、Leuconostoc ficulneum、Leuconostoc fructosum、Leuconostoc gasicomitatum、冷生明串珠菌(Leuconostocgelidum)、例如冷生明串珠菌aenigmaticum亚种、冷生明串珠菌gasicomitatum亚种、或冷生明串珠菌gelidum亚种、贺氏明串珠菌(Leuconostoc holzapfelii)、仁海明串珠菌(Leuconostoc inhae)、泡菜明串珠菌(Leuconostoc kimchii)、乳明串珠菌(Leuconostoclactis)、肠膜状明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)、例如肠膜状明串珠菌cremoris亚种、肠膜状明串珠菌dextranicums亚种、肠膜状明串珠菌mesenteroides亚种、或肠膜状明串珠菌suionicum亚种、Leuconostoc miyukkimchii、酒明串珠菌(Leuconostoc oeni)、类肠系膜明串珠菌(Leuconostoc paramesenteroides)、Leuconostoc pseudoficulneum或假肠膜明串珠菌(Leuconostoc pseudomesenteroides)。
优选地，细菌是在明串珠菌属中分类为“通常被认为是安全的”(GRAS)的细菌，包括但不限于肉色明串珠菌、柠檬明串珠菌、Leuconostoc fallax、贺氏明串珠菌、仁海明串珠菌、泡菜明串珠菌、乳明串珠菌、肠膜状明串珠菌cremoris亚种、肠膜状明串珠菌dextranicums亚种、肠膜状明串珠菌mesenteroides亚种、Leuconostoc palmae或假肠膜明串珠菌。
优选地，益生菌是在明串珠菌属中具有“合格推定安全性”(QPS)状态的细菌，包括但不限于柠檬明串珠菌、乳明串珠菌、肠膜状明串珠菌cremoris亚种、肠膜状明串珠菌dextranicums亚种或肠膜状明串珠菌mesenteroides亚种。
在另一个实施方案中，细菌是来自片球菌(Pediococcus)属，包括但不限于乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)、阿根廷片球菌(Pediococcus argentinicus)、Pediococcus cellicola、克劳森片球菌(Pediococcus claussenii)、有害片球菌(Pediococcus damnosus)、糊精片球菌(Pediococcus dextrinicus)、乙醇片球菌(Pediococcus ethanolidurans)、嗜盐片球菌(Pediococcus halophilus)、意外片球菌(Pediococcus inopinatus)、Pediococcus lolii、小片球菌(Pediococcus parvulus)、戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)、暹罗片球菌(Pediococcus siamensis)、斯氏片球菌(Pediococcus stilesii)或马尿片球菌(Pediococcus urinaeequi)。
优选地、益生菌是在片球菌中具有“合格推定安全性”(QPS)状态的细菌，其包括但不限于乳酸片球菌、糊精片球菌或戊糖片球菌。
在另一个实施方案中，益生菌属于丙酸杆菌属，包括但不限于产酸丙酸杆菌(Propionibacterium acidifaciens)、丙酰酸丙酸杆菌(Propionibacteriumacidipropionici)、痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)、澳大利亚丙酸杆菌(Propionibacterium australiense)、贪婪丙酸杆菌(Propionibacterium avidum)、Propionibacterium cyclohexanicum、Propionibacterium damnosum、费氏丙酸杆菌(Propionibacterium freudenreichii)、例如费氏丙酸杆菌费氏亚种(Propionibacteriumfreudenreichii subsp.freudenreichii)、费氏丙酸杆菌谢尔曼亚种(Propionibacteriumfreudenreichii subsp.shermanii)、颗粒丙酸杆菌(Propionibacterium granulosum)、Propionibacterium innocuum、詹氏丙酸杆菌(Propionibacterium jensenii)、嗜淋巴丙酸杆菌(Propionibacterium lymphophilum)、微需氧丙酸杆菌(Propionibacteriummicroaerophilum)、橄榄丙酸杆菌(Propionibacterium olivae)、丙酸丙酸杆菌(Propionibacterium propionicum)或特氏丙酸杆菌(Propionibacterium thoenii)。
根据一个实施方案，益生菌不是痤疮丙酸杆菌。
进一步优选地，益生菌是在丙酸杆菌属中分类为“通常被认为是安全的”(GRAS)的细菌，包括但不限于丙酰酸丙酸杆菌、费氏丙酸杆菌费氏亚种、费氏丙酸杆菌谢尔曼亚种、詹氏丙酸杆菌或者特氏丙酸杆菌。
进一步优选地，益生菌是弗氏丙酸杆菌，进一步优选费氏丙酸杆菌费氏亚种、费氏丙酸杆菌谢尔曼亚种。
在另一个实施方案中，益生菌属于链球菌属，包括但不限于少酸链球菌(Streptococcus acidominimus)、毗邻链球菌(Streptococcus adjacens)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、非解乳糖链球菌(Streptococcus alactolyticus)、咽峡炎链球菌(Streptococcus anginosus)、澳大利亚链球菌(Streptococcus australis)、牛链球菌(Streptococcus bovis)、驯马链球菌(Streptococcus caballi)、狗链球菌(Streptococcus canis)、山丰链球菌(Streptococcus caprinus)、Streptococcuscastoreus、Streptococcus cecorum、星座链球菌(Streptococcus constellatus)、例如星座链球菌星座亚种(Streptococcus constellatus subsp.constellatus)、星座链球菌咽炎亚种(Streptococcus constellatus subsp.pharynges)或星座链球菌viborgensis亚种、Streptococcus cremoris、仓鼠链球菌(Streptococcus criceti)、嵴链球菌(Streptococcus cristatus)、兔链球菌(Streptococcus cuniculi)、Streptococcusdanieliae、缺陷链球菌(Streptococcus defectivus)、Streptococcus dentapri、蝙蝠齿链球菌(Streptococcus dentirousetti)、Streptococcus dentasini、Streptococcusdentisani、Streptococcus devriesei、负鼠链球菌(Streptococcus didelphis)、难辨链球菌(Streptococcus difficilis)、汗毛链球菌(Streptococcus downei)、Streptococcusdurans、停乳链球菌(Streptococcus dysgalactiae)、例如停乳链球菌停乳亚种(Streptococcus dysgalactiae subsp.dysgalactiae)或停乳链球菌似马亚种(Streptococcus dysgalactiae subsp.equisimilis)、Streptococcus entericus、马链球菌(Streptococcus equi)、例如马链球菌马亚种(Streptococcus equi subsp.equi)、马链球菌ruminatorum亚种或马链球菌兽瘟亚种(Streptococcus equisubsp.zooepidemicus)、马肠链球菌(Streptococcus equinus)、Streptococcusfaecalis、Streptococcus faecium、野鼠链球菌(Streptococcus ferus)、Streptococcusgallinaceus、Streptococcus gallinarum、解没食子酸链球菌(Streptococcusgallolyticus)、例如解没食子酸链球菌解没食子酸亚种(Streptococcus gallolyticussubsp.gallolyticus)、解没食子酸链球菌macedonicus亚种或解没食子酸链球菌pasteurianus亚种、Streptococcus garvieae、格氏链球菌(Streptococcus gordonii)、Streptococcus halichoeri、Streptococcus hansenii、Streptococcus henryi、Streptococcus hongkongensis、Streptococcus hyointestinalis、Streptococcushyovaginalis、Streptococcus ictaluri、婴儿链球菌(Streptococcus infantarius)、例如婴儿链球菌coli亚种或婴儿链球菌婴儿亚种(Streptococcus infantariussubsp.infantarius)、Streptococcus infantis、海豚链球菌(Streptococcus iniae)、中间链球菌(Streptococcus intermedius)、Streptococcus intestinalis、Streptococcuslactarius、Streptococcus lactis、例如Streptococcus lactis subsp.cremoris、Streptococcus lactis subsp.diacetilactis、或Streptococcus lactis subsp.lactis、Streptococcus loxodontisalivarius、巴黎链球菌(Streptococcus lutetiensis)、猕猴链球菌(Streptococcus macacae)、马其顿链球菌(Streptococcus macedonicus)、Streptococcus marimammalium、玛斯里链球菌(Streptococcus massiliensis)、Streptococcus merionis、Streptococcus minor、缓症链球菌(Streptococcus mitis)、Streptococcus morbillorum、Streptococcus moroccensis、变形链球菌(Streptococcusmutans)、寡发酵链球菌(Streptococcus oligofermentans)、口腔链球菌(Streptococcusoralis)、Streptococcus orisasini、Streptococcus orisuis、羊链球菌(Streptococcusovis)、副溶血链球菌(Streptococcus parasanguinis)、副乳房链球菌(Streptococcusparauberis)、极小链球菌(Streptococcus parvulus)、Streptococcus pasteurianus、栖口腔链球菌(Streptococcus peroris)、海豹链球菌(Streptococcus phocae)、例如海豹链球菌海豹亚种(Streptococcus phocae subsp.phocae)或海豹链球菌salmonis亚种、植物链球菌(Streptococcus plantarum)、多形链球菌(Streptococcus pleomorphus)、多动物链球菌(Streptococcus pluranimalium)、Streptococcus plurextorum、肺炎链球菌(Streptococcus pneumonia)、Streptococcus porci、Streptococcus porcinus、Streptococcus porcorum、假肺炎链球菌(Streptococcus pseudopneumoniae)、Streptococcus pseudoporcinus、化脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、Streptococcusraffinolactis、鼠链球菌(Streptococcus ratti)、Streptococcus rifensis、Streptococcus rubneri、Streptococcus rupicaprae、Streptococcus saccharolyticus、唾液链球菌(Streptococcus salivarius)、例如唾液链球菌唾液亚种(Streptococcussalivarius subsp.salivarius)或唾液链球菌嗜热亚种(Streptococcus salivariussubsp.thermophilus)、Streptococcus saliviloxodontae、Streptococcus sanguinis、Streptococcus shiloi、虫草链球菌(Streptococcus sinensis)、表兄链球菌(Streptococcus sobrinus)、猪链球菌(Streptococcus suis)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、托尔豪特链球菌(Streptococcus thoraltensis)、Streptococcus tigurinus、Streptococcus troglodytae、乳房链球菌(Streptococcusuberis)、脲链球菌(Streptococcus urinalis)、Streptococcus ursoris、前庭链球菌(Streptococcus vestibularis)或Streptococcus waius。
优选地，益生菌是在链球菌属中被分类为“通常被认为是安全的”(GRAS)的细菌，包括但不限于嗜热链球菌菌株Th4、解没食子酸链球菌macedonicus亚种、唾液链球菌唾液亚种或唾液链球菌嗜热亚种。
优选地，益生菌是属于链球菌属中具有“合格推定安全性”(QPS)状态的细菌，包括但不限于嗜热链球菌。
在优选的实施方案中，所述益生菌不产生内毒素或其他潜在有毒物质。因此，所述益生菌在使用后是安全的并且对受试者无害。
优选地，所述益生菌不产生孢子。细菌孢子不是性周期的一部分，而是在不利条件下用于存活的抗性结构。由于所述益生菌优选不产生孢子，因此所述重组益生菌在例如没有营养物质或缺少营养缺陷型因子时不能存活。
优选地，所述益生菌不产生包涵体。包涵体通常含有过表达的蛋白质，并且所述过表达的蛋白质在包涵体中的聚集可以是不可逆的。
由于所述益生菌优选不产生包涵体，所以在转录和翻译相应的核酸序列之后，所述第一、第二和第三异源因子的量不会因包涵体内的细胞内积累而减少。
更优选地，所述益生菌也不产生细胞外蛋白酶。细胞外蛋白酶可以从细菌分泌以破坏细胞外结构(如蛋白质)，以产生营养物质，如碳、氮或硫。细胞外蛋白酶也可以作为外毒素，并且是细菌发病机理中毒力因子的例子。
由于不存在细胞外蛋白酶，优选增加所述益生菌在应用于受试者之后的安全性。此外，所述益生菌优选在从所述重组益生菌释放后不会降解相应的第一、第二和第三异源因子。
优选地，所述益生菌没有所有天然存在的质粒。由于不存在所有天然存在的质粒，所述益生菌优选不具有抗生素抗性。
更优选地，所述益生菌缺乏接合转座所需的宿主因子。
天然存在的质粒可以大致分为接合质粒和非接合质粒。接合质粒含有一组促进不同细胞之间性结合的转录或转(tra)基因。在接合的复杂过程中，质粒可以通过一些tra基因编码的性毛从一种细菌转移到另一种细菌。非接合质粒不能引发接合，因此它们只能在接合转座所需的宿主因子如接合质粒的帮助下转移。
由于不存在接合转座所需的宿主因子，所以将编码相应的第一、第二和第三异源因子的所述核酸从所述益生菌基因转移到其他微生物是非常不可能的，优选抑制基因转移。
在另一优选实施方案中，所述重组益生菌是乳酸菌，优选乳杆菌属或乳球菌属物种。在另一优选实施方案中，所述乳球菌属种是乳酸乳球菌亚种cremoris。
乳酸菌进一步释放乳酸作为糖类发酵的主要代谢终产物。已知乳酸也刺激内皮生长和增殖。此外，乳酸具有降低在皮肤功能障碍部位的细菌感染的可能性的抗菌作用。
用于转化上述益生菌的技术是本领域技术人员已知的，并且例如描述于Green和Sambrook(2012)：“Molecular cloning：a laboratory manual”，第4版，Cold SpringHarbor Laboratory Press(Cold Spring Harbor，NY，USA)。
转化后，重组益生菌包含编码所述第一异源因子的至少一条核酸序列和编码所述第二异源因子的至少一条核酸序列，以及优选至少一个编码所述第三异源因子的核酸序列。
在一个实施方案中，编码所述第一异源因子的至少一条核酸序列和编码所述第二异源因子的至少一条核酸序列，优选地和编码所述第三异源因子的至少一条核酸序列位于不同亚群的重组益生菌。
例如，各个核酸序列各自位于单独的益生菌的亚群中，其被组合以获得本发明的重组益生菌。
包含相应核酸序列的各个亚群可以例如来自与上述益生菌相同的种类或来自不同的种类。
例如，可以使用表达不同异源因子的不同种类的重组益生菌适应来自益生菌的相应异源因子的表达，优选释放。
在本发明的优选实施方案中，各核酸序列以不同拷贝数存在于重组益生菌中。例如，重组益生菌包含至少一个拷贝的编码所述第一、所述第二和/或优选所述第三因子的相应核酸序列。
可以增加各个核酸序列的拷贝数，以增强相应异源因子的表达。
优选地，编码所述第一、所述第二和/或所述第三因子的各个核酸序列的拷贝数的比例为1:1:1。
可以通过提供由重组益生菌转录的核酸序列的额外拷贝来增强翻译效率。
在本发明的另一个实施方案中，重组益生菌的亚群包含至少一个编码三种异源因子中的两种的核酸序列，其中优选地，第三异源因子由位于第二亚群的重组益生菌的核酸序列编码。
在优选的实施方案中，编码所有三种异源因子的核酸序列位于重组益生菌的一个群体中。
在另一个优选的实施方案中，各个核酸序列位于所述重组益生菌的染色体和质粒中的至少一个上。
在重组益生菌的染色体上或在所述重组益生菌的质粒上定位核酸序列尤其决定了由细菌翻译的蛋白质的量，因为质粒上的表达水平比染色体上的表达水平更高。
在本发明的另一优选实施方案中，在该菌的染色体上提供编码相应异源因子的至少一条核酸序列，并且在所述重组益生菌的质粒上提供编码另一异源因子的至少一条核酸序列。
然后可以在重组益生菌的染色体上或质粒上提供编码第三因子的相应核酸序列。
在本发明的另一个实施方案中，相应的核酸序列提供在重组益生菌的染色体的各个部分上或者在所述重组益生菌的不同质粒上。
在本发明的特别优选的实施方案中，编码所述异源因子的所有核酸序列都提供在单个质粒上，例如各控制且功能性连接到不同的启动子。
在本发明的另一个特别优选的实施方案中，编码相应异源因子的相应核酸序列位于单个操纵子中，所述操纵子有效地连接到单个启动子并由其控制。
操纵子是含有在单个启动子控制下的一组基因的DNA的功能单位。基因在mRNA链中一起转录，并且或者一起在细胞质中翻译，或者进行反式剪接以产生单独翻译的单顺反子mRNA。
优选地，编码位于所述单个操纵子中的各个异源因子的相应核酸序列具有编码用于翻译起始的核糖体结合位点的核酸序列。
优选地，编码核糖体结合位点的核酸序列位于起始密码子的上游，其位于待转录的相同链的5'区。该序列优选与16S核糖体RNA的3'端互补。
优选地，编码位于所述单个操纵子中的各个异源因子的各个核酸序列具有编码在异源因子的开放阅读框(ORF)的5'端的分泌信号序列的核酸序列，产生包含分泌信号序列和异源因子的融合蛋白。
在另一个优选的实施方案中，核酸序列由组成型启动子或诱导型启动子，优选诱导型启动子控制并与其功能性连接。
例如，编码相应异源因子的核酸序列可以受个体启动子控制并与其功能性连接，所述启动子其可以是组成型启动子或诱导型启动子，更优选诱导型启动子。
在所有情况下，组成型启动子在细胞中是有活性的，而诱导型启动子响应于特异性诱导物而变得活跃。
启动子是引发特定基因转录的核酸序列。启动子位于基因的转录起始侧附近，位于DNA的相同链及上游，其朝向待转录的相同链的5'区。
优选地，所用的各个启动子是来自益生菌的自体启动子，其表达相应的核酸序列。
或者，相应的启动子是异源启动子，优选原核启动子，更优选来自细菌的启动子。
在另一个优选的实施方案中，至少一条核酸序列的表达由诱导型启动子控制，所述至少一条核酸序列在至少一种诱导物存在下是可表达的。
优选地，由诱导物可诱导的所述诱导型启动子是至少一个编码羊毛硫抗菌肽(lantibiotic peptide)的微生物基因的启动子。
羊毛硫抗菌肽是本领域技术人员已知的。羊毛硫细菌素是一类含有特征性多环硫醚氨基酸羊毛硫氨酸以及不饱和氨基酸脱氢丙氨酸和2-氨基异丁酸的肽。
例如，羊毛硫氨酸是半胱氨酸的单硫化物类似物，并且由两个丙氨酸残基组成，它们通过硫醚键在其β-碳原子上交联。
羊毛硫细菌素由大量的革兰氏阳性细菌产生。
在优选的实施方案中，所述诱导型启动子是来自乳酸乳球菌的乳链菌肽nisin启动子，来自双歧杆菌的bisin启动子，来自枯草芽孢杆菌的optiline启动子，来自唾液链球菌的salvarizine启动子，来自表皮表皮葡萄球菌的epidermin启动子，来自鸡葡萄球菌的gallidermin启动子，来自变形链球菌的mutacin启动子，来自化脓链球菌的streptin启动子，来自化脓性链球菌的streptococcinum启动子，来自乳酸乳球菌的lacticin启动子，来自表皮葡萄球菌的epidermin启动子，来自表皮葡萄球菌的epilanzine启动子，来自表皮葡萄球菌的pep5启动子，来自米酒乳酸杆菌的lactocin-s启动子，来自唾液链球菌或化脓性链球菌的salvaricin启动子，来自植物乳杆菌的plantarizine启动子，来自链球菌的thermophilin启动子，来自链球菌的bovicine启动子或其组合。
进一步优选地，所述诱导型启动子是乳酸乳球菌的PnisA、PnisZ、PnisQ、PnisF、PnisU或其组合。
在优选的实施方案中，诱导物是至少一种羊毛硫抗菌肽或其功能类似物，优选选自乳链菌肽A、乳链菌肽Z、乳链菌肽Q、乳链菌肽F、乳链菌肽U、其功能类似物及其混合物。
乳链菌肽控制的基因表达系统例如可从MoBiTec GmbH(德国)以商品名购得，其在NIZO FoODResearch(Ede，Netherlands)开发。
本技术领域熟知的乳链菌肽是具有广泛宿主谱的34个氨基酸的羊毛硫抗菌肽。例如，乳酸乳球菌乳链菌肽可从Sigma-Aldrich Chemie GmbH(Munich，德国)购得。
乳链菌肽广泛用作食品中的防腐剂。最初，乳链菌肽被核糖体合成为前体。在随后的酶促修饰后，经修饰的分子被转移穿过细胞质膜并加工成其成熟形式。
乳链菌肽诱导其自身的表达。当靶基因随后基于乳链菌肽系统的诱导型启动子后时，目的核酸序列的表达可以通过添加次抑制量的乳链菌肽来诱导，所述量优选为0.01至50ng/ml培养基，进一步优选为0.1至5ng/ml培养基。
此外，NICE系统已经转移到其他革兰氏阳性细菌，例如乳明串珠菌，短乳杆菌，瑞士乳杆菌，植物乳杆菌，化脓链球菌，无乳链球菌，肺炎链球菌，兽疫链球菌，粪肠球菌或枯草芽孢杆菌。
优选选自PnisA、PnisZ、PnisQ、PnisF、PnisU及其组合的诱导型乳链菌肽启动子可以整合到与编码所述第一异源因子、所述第二异源因子、和/或优选所述第三异源因子的至少一条核酸序列一起使用的益生菌的染色体中。
优选地，所述诱导型启动子是PnisA。
或者，将各自的启动子连同至少一条核酸序列一起提供在质粒上，然后将其转化到益生菌中。
各自的核酸序列在乳链菌肽存在下是可表达的。
合适的质粒可从例如MoBiTec GmbH(德国)商购获得如pNZ8008、pNZ8148、pNZ8149和pNZ8150。
在另一个优选的实施方案中，基因NisR和NisK也提供在所使用的益生菌的染色体或质粒上。相应的蛋白质NisR和NisK属于细菌双组分信号转导系统家族。NisK是位于胞质膜中的组氨酸蛋白激酶，其优选充当成熟乳链菌肽分子的受体。在乳链菌肽与NisK结合后，其自磷酸化并将磷酸基团转移到NisR，NisR是被NisK磷酸化后变为活化的反应调节物。
活化的NisR诱导来自PnisA启动子、PnisF启动子、PnisZ启动子、PnisQ启动子和/或PnisU启动子的转录。
例如，可以在益生菌的染色体上和/或质粒上提供乳链菌肽基因NisR和NisK的表达的相应调节物。
合适的质粒是市售的并且包括例如质粒pNZ9530(MoBiTec GmbH，德国)。质粒pNZ9530携带NisR和NisK基因，优选用于在乳球菌菌株和不具有整合到染色体中的调控基因的其他乳酸菌属的菌株中克隆。例如，对于粪肠球菌中的乳链菌肽诱导的表达，Brian等人(2000)已经描述了质粒pMSP3535，并且其例如可以获自AddGene，一个非营利质粒库(Plasmid No.46886)。
质粒pMSP3535的核酸序列可以NCBI登录号AY303239.1获得。
在另一优选实施方案中，使用益生菌，其含有乳链菌肽受控基因表达NisR和NisK的调控基因。
合适的菌株是市售的，例如购自MoBiTec GmbH(德国)。合适的菌株是例如乳酸乳球菌菌株NZ9000，乳酸乳球菌菌株NZ9100，乳酸乳球菌菌株NZ3900。
合适的菌株也是乳酸乳球菌菌株NZ3000，其可从例如MoBiTec GmbH商购获得。乳酸乳球菌菌株NZ3000是没有NisR和NisK的菌株。当所述核酸序列的表达由组成型启动子控制时，可以使用乳酸乳球菌菌株NZ3000。
在另一优选实施方案中，益生菌是乳酸乳球菌菌株NZ3900，其是食品级菌株。乳酸乳球菌菌株NZ3900包括不基于抗生素抗性但具有在乳糖上生长能力的质粒筛选系统。
乳酸乳球菌菌株NZ3900不产生内毒素或其他潜在有毒物质。此外，乳酸乳球菌菌株NZ3900不产生包涵体，也不产生孢子。此外，乳酸乳球菌菌株NZ3900不产生细胞外蛋白酶。
在另一优选实施方案中，修饰编码相应异源因子的核酸序列以增加所编码的异源因子的表达、分泌和/或稳定性。
合适的修饰是本领域技术人员已知的，并且包括例如使至少一种核酸序列的密码子使用适应所使用的益生菌。
例如，可以将至少一条核酸序列设计成适合所用益生菌的密码子使用模式。此外，除了一般的密码子优化之外，可以使用特定的密码子表，例如用于相应益生菌的高度表达的核糖体蛋白基因的密码子表，以进一步增加编码因子的翻译。
合适的修饰还包括，例如，将编码分泌信号序列的核酸序列并入产生包含分泌信号序列和异源因子的融合蛋白的异源因子的开放阅读框(ORF)的5'端。分泌信号序列优选地布置在相应异源因子的N末端侧。
分泌信号序列优选将新合成的蛋白质引导至质膜。在分泌信号序列端，优选信号肽或前肽，存在优选由信号肽酶识别并切割的一段氨基酸，以产生自由分泌信号序列(优选信号肽或前肽)以及成熟的异源因子(其在细胞外分泌)。
在细菌中，存在两条主要途径以通过细胞质膜分泌蛋白质。称为Sec途径的一般分泌途径催化蛋白质以其未折叠构象的跨膜易位，于是它们在膜的外侧折叠成其天然结构。
称为Tat途径的双精氨酸易位途径催化分泌蛋白以折叠状态的易位。
合适的分泌信号序列包括例如信号肽。
优选地，分泌信号序列是由核酸序列编码的相应异源因子的天然信号肽或前肽，其优选是相应因子的前体和/或前蛋白原。
在另一个优选的实施方案中，所述分泌信号序列是来自所述重组益生菌的同源分泌序列，优选所述分泌信号序列是乳球菌属的泛素特异性肽酶45(Usp 45)信号序列。Usp45分泌信号具有非常高分泌效率。其他分泌信号是本领域技术人员已知的，并且包括例如乳球菌属SP310、SPEXP4和AL9。
例如，异源因子的天然信号肽可以由来自用于表达所述异源因子的益生菌的同源分泌信号序列替代。
分泌信号序列优选提高各异源因子的分泌效率。例如，在乳酸乳球菌中，大多数蛋白质通过Sec途径分泌。合成蛋白质作为具有N-端信号肽的含有蛋白质的成熟部分的前体。信号肽将蛋白质靶向细胞质膜。在信号肽切割后，成熟蛋白质在细胞外释放。
进一步优选地，分泌信号包含SEQ ID No.34的氨基酸序列。
在另一个优选的实施方案中，相应的异源因子被表达为具有或不具有分泌增强因子的前肽。前肽可被蛋白酶切割以释放成熟的异源因子。
在进一步优选的实施方案中，重组益生菌包括至少一种编码所述益生菌生存力所需的必需蛋白质的失活基因。
在优选的实施方案中，所述益生菌生存力所需的必需蛋白质是用于合成所述益生菌生存力所必需的有机化合物所必需的蛋白质，更优选为酶。
在所述必需蛋白质，优选酶失活后，相应的有机化合物是重组益生菌存生存力所需的营养缺陷型因子，并且必须补充以便维持重组益生菌的生存力。
优选地，所述营养缺陷型因子是维生素、氨基酸、核酸和/或脂肪酸。
例如，氨基酸和核苷酸是生物重要的有机化合物，分别是蛋白质和核酸的前体。
在另一优选实施方案中，益生菌生存力所必需的至少一种基因选自丙氨酸消旋酶(alaR)、胸苷酸合酶(thyA)、天冬酰胺合酶(asnH)、CTP合酶(pyrG)、色氨酸合酶(trbBA)及其组合。
例如，丙氨酸消旋酶是催化L-丙氨酸转化为D-丙氨酸的酶。由丙氨酸消旋酶产生的D-丙氨酸用于肽聚糖合成。肽聚糖在所有细菌的细胞壁上发现。
技术人员已知在细菌中失活丙氨酸消旋酶(alaR)基因导致细菌需要使用外源的D-丙氨酸来维持细胞壁完整性。
技术人员已知，例如，乳酸乳球菌和植物乳杆菌含有单个alaR基因。该基因的失活影响D-丙氨酸掺入细胞壁。
例如具有失活的丙氨酸消旋酶(alaR)基因的乳酸乳球菌细菌，依赖于外源供应D-丙氨酸，能够合成肽聚糖并将D-丙氨酸掺入脂磷壁酸(LTA)中。当去除D-丙氨酸时，例如在指数生长中期，这些细菌迅速溶解。
丙氨酸消旋酶缺陷型乳酸菌株可以例如通过本领域已知的方法产生。
胸苷酸合酶是催化脱氧尿苷单磷酸(dUMP)转化为脱氧胸苷酸单磷酸(dTMP)的酶。dTPM是形成胸腺嘧啶(dTMP、dTDP和dTTP)的三种核苷酸之一。胸苷是DNA中的核酸。
技术人员已知，胸苷酸合酶在DNA生物合成的早期阶段起关键作用。例如，由于内源因素和环境因素，每天都会发生DNA损伤或缺失。
此外，对于益生菌的增殖，有必要合成DNA。
细菌中胸苷酸合酶(thyA)基因的失活导致细菌需要使用外源的胸苷来保持DNA的完整性。
天冬酰胺合酶是从天冬氨酸产生氨基酸天冬酰胺的酶。天冬酰胺合酶(asnH)基因的失活导致无法合成各自的氨基酸，其成为营养缺陷型因子。
CTP合酶是参与嘧啶合成的酶。CTP合酶使尿苷-5'-三磷酸(UTP)和胞苷三磷酸(CTP)相互转化。CTP-合酶(pyrG)基因的失活使得细菌既不能从从头合成也不能通过尿苷细胞壁途径合成胞嘧啶核苷酸。
CTP成为营养缺陷因子，必须补充用以RNA和DNA的合成。
色氨酸合酶是催化氨基酸色氨酸生物合成中最后两个步骤的酶。
色氨酸合酶(trpBA)基因的失活使得细菌不能合成对应的氨基酸，其成为营养缺陷型因子。
失活对于益生菌生存力所必需的所述基因的方法是技术人员已知的，包括基因的缺失、基因的突变、所述基因的外遗传修饰、所述基因的RNA干扰(RNAi)介导的基因沉默、所述基因的翻译抑制或其组合。
在另一优选实施方案中，相应的营养缺陷型因子与所述益生菌一起提供。
在本发明的另一个优选实施方案中，用于益生菌生存力所必需的所述失活基因用于环境保护(environmental containment)。
在应用包含至少一种对所述益生菌生存力所必需的失活基因的重组益生菌后，必须在外部提供相应的营养缺陷型因子，例如与应用培养基或生长培养基一起提供。
如果重组益生菌释放到环境中，则营养缺陷型因子缺失，优选重组益生菌死亡。
此外，外部补充的营养缺陷型因子的应用能够控制各种异源因子的生物合成和释放。
优选地，所述第一因子、所述第二因子和所述第三因子中的至少一种可从所述重组益生菌释放。进一步优选地，所述重组益生菌分泌所述第一因子、所述第二因子和所述第三因子中的至少一种。
例如，在革兰氏阳性细菌如乳酸菌中，优选由细菌分泌的蛋白质作为含有N-端信号肽和蛋白质成熟部分的前体被合成。前体被细菌的分泌机制识别，并被转移穿过细胞质膜。然后信号肽被切割和降解，并且成熟蛋白质从细菌分泌，例如分泌到培养物上清中或进入炎性皮肤功能障碍的区域。
例如，乳酸乳球菌能够通过Sec依赖性途径分泌从低分子量(例如小于10kDa)到高分子量(例如分子量高于160kDa)范围的蛋白质。
或者，所述第一因子、所述第二因子和所述第三因子中的至少一种通过渗漏的细胞质膜从所述重组益生菌中释放。
例如，当在所述重组益生菌中使用乳链菌肽作为蛋白质合成的诱导物时，乳链菌肽也在细胞质膜内形成孔，所述第一因子、所述第二因子和第三因子中的至少一种通过该孔从益生菌释放。
或者，由于细胞壁组分的合成受损，所述重组益生菌的细胞质膜变得渗漏。
例如，所述重组益生菌包含失活的丙氨酸消旋酶(alaR)基因。在不存在D-丙氨酸时，所述重组益生菌不能维持细胞质膜的完整性，并随后从所述重组益生菌中释放所述第一因子、所述第二因子和所述第三因子中的至少一种。
在所述炎性皮肤功能障碍的愈合过程期间，所释放的第一异源因子、第二异源因子和/或第三异源因子可以经历(例如通过蛋白酶切割)降解，这可能导致所述异源因子的生物活性丧失。
所述异源因子的降解或消耗可以通过所述重组益生菌的所述异源因子的持续释放来补偿。优选地，所述重组益生菌以恒定的方式表达所述第一异源因子、所述第二异源因子和所述第三异源因子中的至少一种。优选地，所述重组益生菌恒定地释放所述异源因子。
在优选的实施方案中，所述益生菌在提供用于治疗所述炎性皮肤功能障碍的药物组合物中提供。
优选地，所述药物组合物包括至少一种药学上可接受的载体或赋形剂，其进一步优选适于预期给药途径。
优选地，所述药学上可接受的载体或所述药学上可接受的赋形剂包括至少一种聚合物载体，优选选自多糖、聚酯、甲基丙烯酰胺及其混合物。例如，所述药学上可接受的载体是水凝胶，其例如为促进创伤愈合额外提供最佳的湿性环境。此外，药学上可接受的载体有助于所述重组益生菌在施用后粘附于所述炎性皮肤功能障碍的部位。
优选地，所述药物组合物还包括至少一种用于所述重组益生菌的营养物，优选选自糖类、维生素、矿物质、氨基酸、微量元素及其混合物。
进一步优选地，所述药物组合物还包括用于稳定所述第一因子、所述第二因子和所述第三因子中的至少一种的至少一种成分。
所述稳定化合物优选选自抗微生物剂、冷冻保护剂、蛋白酶抑制剂、还原剂、金属螯合剂及其混合物。
在另一优选实施方案中，所述重组益生菌处于溶液中，冷冻或干燥，优选冻干或喷雾干燥。
优选地，所述重组益生菌将例如以所述药物组合物的形式应用于溶液中。
在替代实施方案中，将所述重组益生菌冷冻或干燥，优选冻干或喷雾干燥。重组益生菌可在使用前重新配制。
应用后，重组益生菌可能与所述至少一种诱导物接触，优选诱导表达所述第一因子、所述第二因子和所述第三因子中的至少一种。
进一步优选地，在诱导表达后，所述第一因子、所述第二因子和所述第三因子中的至少一种从所述细菌释放。
文献
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序列
SEQ ID No.1至3分别对应于人CSF-1同种型1至3前体，包括信号肽。
SEQ ID No.4对应于成熟的人CSF-1。
SEQ ID No.5对应于实施例1中使用的CSF-1的合成构建体，包括跨越蛋白质的1至27个氨基酸的、来自乳酸乳球菌的Usp45分泌信号，跨越蛋白质的氨基酸28至185的成熟的人CSF-1。
SEQ ID No.6对应于表达pCSF1的乳酸乳球菌分泌后产生的CSF-1的合成构建体。
SEQ ID NO.7和8分别对应于人IL-34同种型1和2前体，包括信号肽。
SEQ ID No.9对应于成熟的人IL-34。
SEQ ID NO：10和11分别对应于包含信号肽的人IL-4同种型1和2前体。
SEQ ID No.12对应于成熟的人IL-4。
SEQ ID No.13对应于实施例1中使用的人IL-4的合成构建体，包括跨越蛋白质的1至27个氨基酸的、来自乳酸乳球菌的Usp45分泌信号，以及跨越蛋白质的氨基酸28至185的成熟的人IL-4。
SEQ ID NO.14对应于表达pIL4的乳酸乳球菌分泌后产生的IL-4的合成构建体。
SEQ ID No.15对应于包含信号肽的人IL-10前体。
SEQ ID No.16对应于成熟的人IL-10。
SEQ ID No.17对应于包含信号肽的人IL-13前体。
SEQ ID No.18对应于成熟的人IL-13。
SEQ ID No.19对应于包含信号肽的人TGF-β1前体。
SEQ ID No.20对应于成熟的人TGF-β1。
SEQ ID No.21和22分别对应于人TGF-β2同种型1和2前体，包括信号肽。
SEQ ID No.23对应于成熟的人TGF-β2。
SEQ ID No.24对应于包含信号肽的人TGF-β3前蛋白原。
SEQ ID No.25对应于成熟的人TGF-β3。
SEQ ID No.26对应于人FGF-2前蛋白原，包括前肽。
SEQ ID No.27对应于分泌后的成熟的人FGF-2(hFGF2-155)。
SEQ ID No.28对应于成熟的人FGF-2的部分序列。
SEQ ID No.29对应于实施例1中使用的人FGF-2的合成构建体，包括跨越蛋白质的1至27个氨基酸的、来自乳酸乳球菌的Usp45分泌信号，对应于涉及SEQ ID No.26的氨基酸136至288的成熟的人FGF-2。
SEQ ID NO：30对应于来自表达pFGF的乳酸乳球菌分泌后实施例1中使用的人FGF-2变体hFGF2-153。
SEQ ID No.31对应于人HGF。
SEQ ID No.32对应于人HGFα链。
SEQ ID No.33对应于人HGFβ链。
SEQ ID No.34对应于来自乳酸乳球菌的Usp45分泌信号。
SEQ ID No.35对应于质粒pNZ8149的核酸序列。
SEQ ID No.36至43对应于实施例中使用的引物。
SEQ ID No 44对应于乳酸乳球菌乳链菌肽A启动子的核酸序列。
SEQ ID No.45对应于含有乳链菌肽A启动子、Usp45信号序列和hFGF2-153基因的合成构建体ssUsp45-FGF2-153的核酸序列。
SEQ ID No 46对应于质粒pFGF2的核酸序列。
SEQ ID No.47对应于含有乳链菌肽A启动子、Usp45信号序列和hIL4基因的合成构建体ssUsp45-hIL4的核酸序列。
SEQ ID No 48对应于质粒pIL4的核酸序列。
SEQ ID No.49对应于含有乳链菌肽A启动子、Usp45信号序列和hCSF1基因的合成构建体ssUsp45-hCSF1的核酸序列。
SEQ ID No.50对应于质粒pCSF1的核酸序列。
SEQ ID No.51至SEQ ID No.53对应于提供各自的核糖体结合位点的核酸序列，包括实施例中使用的各个开放阅读框的起始密码子(ATG)。
SEQ ID No.54对应于乳酸乳球菌的16S核糖体RNA(rRNA)的3'端的核酸序列。
SEQ ID No.55对应于图24b所示的合成构建体CSF-RBS1-FGF-RBS2-IL4的核酸序列。SEQ ID No.56对应于图24c所示的合成构建体FGF-RBS1-IL4-RBS2-CSF的核酸序列。SEQID No.57对应于图24d所示的合成构建体IL4-RBS1-CSF-RBS2-FGF的核酸序列。
SEQ ID No.58对应于来自人的表皮生长因子同种型1前蛋白原的氨基酸序列。SEQID No.59对应于来自人的表皮生长因子同种型2前蛋白原的氨基酸序列。SEQ ID No.60对应于来自人的表皮生长因子同种型3前蛋白原的氨基酸序列。SEQ ID No.61对应于来自人的成熟表皮生长因子的氨基酸序列。SEQ ID No.62对应于来自人的肝素结合EGF样生长因子前体的氨基酸序列。SEQ ID No.63对应于来自人的成熟肝素结合EGF样生长因子的氨基酸序列。
SEQ ID No.64对应于来自人的转化生长因子α同种型1前蛋白原的氨基酸序列。SEQ ID No.65对应于来自人的转化生长因子α同种型2前蛋白原的氨基酸序列。SEQ IDNo.66对应于来自人的转化生长因子α同种型3前蛋白原的氨基酸序列。SEQ ID No.67对应于来自人的转化生长因子α同种型4前蛋白原的氨基酸序列。SEQ ID No.68对应于来自人的转化生长因子α同种型5前蛋白原的氨基酸序列。SEQ ID No.69对应于来自人的成熟转化生长因子α的氨基酸序列。
SEQ ID No.70对应于来自人的双调蛋白前蛋白原的氨基酸序列。SEQ ID No.71对应于来自人的成熟双调蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID No.72对应于来自人的表皮调节素前蛋白原的氨基酸序列。SEQ ID No.73对应于来自人的成熟表皮调节素的氨基酸序列。
SEQ ID No.74对应于来自人的上皮细胞有丝分裂蛋白同种型1前体的氨基酸序列。SEQ ID No.75对应于来自人的上皮细胞有丝分裂蛋白同种型2前体的氨基酸序列。SEQID No.76对应于来自人的上皮细胞有丝分裂蛋白同种型3前体的氨基酸序列。SEQ IDNo.77对应于来自人的上皮细胞有丝分裂蛋白同种型4前体的氨基酸序列。SEQ ID No.78对应于来自人的上皮细胞有丝分裂蛋白同种型5前体的氨基酸序列。SEQ ID No.79对应于来自人的上皮细胞有丝分裂蛋白同种型6前体的氨基酸序列。SEQ ID No.80对应于来自人的上皮细胞有丝分裂蛋白同种型7前体的氨基酸序列。SEQ ID No.81对应于来自人的成熟上皮细胞有丝分裂蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID No.82对应于来自人的β细胞生长因子前体的氨基酸序列。SEQ ID No.83对应于来自人的成熟β细胞生长因子的氨基酸序列。
以下附图和实施例仅用于说明目的。本发明不应被解释为限于以下实施例：
附图说明
图1示出了人FGF2参考蛋白的SDS-PAGE。
图2示出了表达载体pNZ8149的质粒图。“lacF”是宿主菌株NZ3900在乳糖上生长的筛选标记；“Pnis”是乳酸乳球菌乳链菌肽操纵子的乳链菌肽A启动子；“T”是终止子；“repC”和“repA”是复制基因。核酸序列也在SEQ ID No.35中示出。
图3示出了乳酸乳球菌的乳链菌肽A启动子的核酸序列，其也在SEQ ID No.44中示出。
图4a、4b和4c分别示出了用SEQ ID No.29、SEQ ID No.13和SEQ ID No.5所示的氨基酸序列获得的SignalP 4.1的读数。
图5a、5b和5c示出了实施例1中使用的合成插入物以及相应的氨基酸序列。“FGF2-153”表示人FGF-2编码插入物。“hIL4”表示人IL4编码插入物。“hCSF1”表示人CSF1编码插入物。“PnisA”表示乳酸乳球菌乳链菌肽操纵子的乳链菌肽A启动子。“ssUsp45”表示乳酸乳球菌的usp45基因的信号序列。星号表示终止密码子。相应的核酸序列也在SEQ ID No.45、SEQID No.47和SEQ ID No.49中示出。
图6a、6b和6c分别示出了具有pFGF2、pIL4和pCSF1的乳酸乳球菌NZ3900的潜在菌落的菌落PCR分析结果。
图7a、7b和7c分别示出了在乳酸乳球菌中分别表达和分泌hFGF2、hIL4和hCSF1的质粒pFGF2、pIL4和pCSF1的质粒图以及核酸序列。“Pnis”是乳酸乳球菌乳链菌肽操纵子的乳链菌肽A启动子；“T”是终止子；“repC”和“repA”是复制基因。质粒pFGF2、pIL4和pCSF1的核酸序列分别在SEQ ID No.46、SEQ ID No.48和SEQ ID No.50中示出。
图8示出了在不同诱导条件下表达NZ3900(pFGF2)的乳球菌的发酵样品的Western印迹分析。“0.5/5”表示在OD600＝0.5下用5ng/mL乳链菌肽诱导；“3/5”表示在OD600＝3下用5ng/mL乳链菌肽诱导，“T”表示从发酵物中取出样品的时间点。
图9示出了考马斯(Coom)染色后的受控发酵运行的上清(Sup)样品的SDS-PAGE分析和表达NZ3900(pIL4)的乳球菌发酵样品的Western印迹(WB)分析。0.5/5“表示在OD600＝0.5下用5ng/mL乳链菌肽诱导；“3/5”表示在OD600＝3下用5ng/mL乳链菌肽诱导，“T”表示从发酵物中取出样品的时间点。
图10示出了考马斯(Coom)染色后表达NZ3900(pCSF1)的乳球菌发酵样品后，受控发酵运行的上清(Sup)样品的SDS-PAGE分析。0.5/5“表示在OD600＝0.5下用5ng/mL乳链菌肽诱导；“3/5”表示在OD600＝3下用5ng/mL乳链菌肽诱导，“T”表示从发酵物中取出样品的时间点。
图11示出了表达NZ3900(pCSF1)的乳球菌的发酵样品的Western印迹(WB)分析。0.5/5“表示在OD600＝0.5下用5ng/mL乳链菌肽诱导；“3/5”表示在OD600＝3下用5ng/mL乳链菌肽诱导，“T”表示从发酵物中取出样品的时间点。
图12示出了在类似创伤愈合情况的条件下，用于诱导实验的酸化培养物的生长。
图13示出了在pH 5或在OD600＝3诱导后上清中hFGF2产生的SDS-PAGE和Western印迹分析。
图14a示出了用表达hFGF2的重组益生菌或市售产品Fiblast暴露72小时后实施例4a中描述的人成纤维细胞迁移测定的结果。
图14b示出了用表达hIL4或重组人IL4的重组益生菌暴露72小时后，实施例4a中描述的人成纤维细胞迁移测定的结果。
图14c示出了在NHDF细胞中通过含有0.4-80ng/ml FGF2的AUP-10培养基和通过rhFGF2诱导ERK 1+2磷酸化的结果。
图14d示出了在M-NFS-60细胞中通过含有0.2-40ng/ml CSF1的AUP-14培养基和通过rhCSF1诱导ERK 1+2磷酸化的结果。
图14e示出了在实施例4c中描述的人THP-1细胞中LPS诱导的TNFαmRNA产生的抑制。
图14f示出了在实施例4d中描述的THP1衍生的巨噬细胞中用于巨噬细胞甘露糖受体1(Mrc1)和Kruppel样因子4(KLF4)的M2基因的RNA表达的诱导。
图14g示出了在实施例4e中描述的人胶质细胞杂交系MO3.13中AUP-12和rhIL-4的STAT-6的转录活性。
图14h示出了在实施例4e中描述的人胚胎肾293T细胞中的AUP-12和rhIL-4的STAT-6的转录活性。
图15a示出了在实施例5中描述的创伤愈合实验的结果。
图15b示出了在实施例5中描述的指定时间点之后对照组、阳性对照组和AUP-16处理组织的创伤愈合状态的比较。
图15c示出了在实施例5中描述的阳性对照(治疗组17)和AUP-16处理组织(处理组18)第8天和第12天之后的剩余创伤面积的比较。
图16a示出了来自人的巨噬细胞集落刺激因子1同种型前体的氨基酸序列。图16示出了来自人的巨噬细胞集落刺激因子1同种型b前体的氨基酸序列。图16c示出了来自人的巨噬细胞集落刺激因子1同种型c前体的氨基酸序列。图16d示出了成熟的人巨噬细胞集落刺激因子1的氨基酸序列。
图17a示出了来自人的白介素-34同种型1前体的氨基酸序列。图17b示出了来自人的白介素-34同种型2前体的氨基酸序列。图17c示出了来自人的白介素-34的氨基酸序列。
图18a示出了来自人的白介素-4同种型1前体的氨基酸序列。图18b示出了来自人的白介素-4同种型2前体的氨基酸序列。图18c示出了来自人的白介素-4的氨基酸序列。
图19a示出了来自人的白介素-10前体的氨基酸序列。图19b示出了来自人的白介素-10的氨基酸序列。
图20a示出了来自人的白介素-13前体的氨基酸序列。图20b示出了来自人的白介素-13的氨基酸序列。
图21a示出了来自人的转化生长因子β-1前体的氨基酸序列。图21b示出了来自人的转化生长因子β-1的氨基酸序列。图21c示出了来自人的转化生长因子β-2同种型1前体的氨基酸序列。图21d示出了来自人的转化生长因子β-2同种型2前体的氨基酸序列。图21e示出了来自人的转化生长因子β-2的氨基酸序列。图21f示出了来自人的转化生长因子β-3前蛋白原的氨基酸序列。图21g示出了来自人的转化生长因子β-3的氨基酸序列。
图22a示出了来自人的成纤维细胞生长因子2前体的氨基酸序列。图22b示出了来自人的成纤维细胞生长因子2的片段的氨基酸序列。
图23a：来自人的肝细胞生长因子的氨基酸序列。图23b：来自人的肝细胞生长因子α链的氨基酸序列。图23c：来自人的肝细胞生长因子β链的氨基酸序列。
图24a示出了实施例2d中使用的三个核糖体结合位点的概述。图24b至24d中描述了实施例2d中使用的合成的DNA序列CSF-RBS1-FGF-RBS2-IL4、FGF-RBS1-IL4-RBS2-CSF和IL4-RBS-CSF-RBS2-FGF的各序列，分别为SEQ ID No.55、SEQ ID No.56和SEQ ID No.57。图24e至24g示出了用实施例2d)中使用的单个操纵子构建体获得的各自的SDS-PAGE凝胶以及Western印迹。
图25a示出了来自人的表皮生长因子同种型1前蛋白原的氨基酸序列。图25b示出了来自人的表皮生长因子同种型2前蛋白原的氨基酸序列。图25c示出了来自人的表皮生长因子同种型3前蛋白原的氨基酸序列。图25d示出了来自人的成熟表皮生长因子的氨基酸序列。
图26a示出了来自人的肝素结合EGF样生长因子前体的氨基酸序列。图26b示出了来自人的成熟肝素结合EGF样生长因子的氨基酸序列。
图27a示出了来自人的转化生长因子α同种型1前蛋白原的氨基酸序列。图27b示出了来自人的转化生长因子α同种型2前蛋白原的氨基酸序列。图27c示出了来自人的转化生长因子α同种型3前蛋白原的氨基酸序列。图27d示出了来自人的转化生长因子α同种型4前蛋白原的氨基酸序列。图27e示出了来自人的转化生长因子α同种型5前蛋白原的氨基酸序列。图27f示出了来自人的成熟转化生长因子α的氨基酸序列。
图28a示出了来自人的双调蛋白前蛋白原的氨基酸序列。图28b示出了来自人的成熟双调蛋白的氨基酸序列。
图29a示出了来自人的表皮调节素前蛋白原的氨基酸序列。图29b示出了来自人的成熟表皮调节素的氨基酸序列。
图30a示出了来自人的人上皮细胞有丝分裂蛋白同种型1前体的氨基酸序列。图30b示出了来自人的人上皮细胞有丝分裂蛋白同种型2前体的氨基酸序列。图30c示出了来自人的人上皮细胞有丝分裂蛋白同种型3前体的氨基酸序列。图30d示出了来自人的人上皮细胞有丝分裂蛋白同种型4前体的氨基酸序列。图30e示出了来自人的人上皮细胞有丝分裂蛋白同种型5前体的氨基酸序列。图30f示出了来自人的人上皮细胞有丝分裂蛋白同种型6前体的氨基酸序列。图30g示出了来自人的人上皮细胞有丝分裂蛋白同种型7前体的氨基酸序列。图30h示出了来自人的成熟上皮细胞有丝分裂蛋白的氨基酸序列。
图31a示出了来自人的β细胞生长因子前体的氨基酸序列。图31b示出了来自人的成熟β细胞生长因子的氨基酸序列。
图32a示出了来自人的成熟成纤维细胞生长因子2的氨基酸序列。图32b示出了在实施例中使用的成纤维细胞生长因子2变体hFGF2-153的氨基酸序列。
图33示出了在实施例中使用的人白介素4(hIL-4)变体的氨基酸序列。
图34示出了在实施例中使用的人集落刺激因子1(hCSF-1)变体的氨基酸序列。
图35示出了在实施例中使用的乳球菌蛋白质Usp45的分泌信号的氨基酸序列。
实施例：
1.一般实验程序：
除非另有说明，否则按照分析系统制造商的方案进行实施例。除非另有说明，指示的化学品可从Sigma-Aldrich Chemie Gmbh(Munich，DE)，Merck KGaA(Darmstadt，DE)，Thermo Fisher Scientific Inc.(Waltham，MA，USA)或Becton，Dickinson and Company(Franklin Lakes，NJ，USA)。
1.1生长培养基
为了不同目的，细胞在不同的培养基中生长。对于一般克隆程序，使用含有0.5％葡萄糖或乳糖的M17培养基(Oxoid Deutschland GmbH，Wesel，DE)。
为了监测食品级别选择，使用Elliker培养基，在其上，当乳酸菌群落在乳糖上生长时，呈黄色。黄色着色是一种pH效应，其改变指示剂染料溴甲酚紫在生长菌落和菌落本身附近的颜色。
Elliker培养基的配方如下：
20g/L胰蛋白胨
5g/L酵母提取物
4g/L NaCl
1.5g/L乙酸钠(无水)
0.5g/L L(+)抗坏血酸
15g/L琼脂
pH 6.8
灭菌：121℃，15分钟
灭菌和冷却后，从20％加热或过滤灭菌的储备液和0.004％溴甲酚紫(0.4％储备溶液，过滤灭菌)中加入1％乳糖。
对于发酵和其他功能生长实验，使用IM1培养基，其不含动物衍生成分。唯一剩下的动物来源成分乳糖，可以药物质量获得。
IM1培养基的配方如下：
5％乳糖一水合物(Scharlab S.L.，Barcelona，ES)
1.5％大豆蛋白胨
1％酵母提取物
1mM MgSO4×7H2O
0.1mM MnSO4×4H2O
pH 6.7
灭菌：110℃，15分钟
在发酵过程中不加入缓冲液，因为使用2.5M NaOH自动调节pH。对于酸化试管培养，将2％Na-β-甘油磷酸酯加入培养基中。
该缓冲液中和所产生的乳酸盐并允许培养物达到OD600＝4-5的细胞密度。
在含有乳糖和Na-β-甘油磷酸酯的IM1培养基中加入甘油至终浓度为20％后，制备最终构建体NZ3900(pFGF2)、NZ3900(pIL4)和NZ3900(pCSF1)的储备液。储备液储存在-80℃。
1.2使用NICE系统诱导蛋白质生产
使用乳链菌肽浓度为0.1-10ng/ml乳链菌肽诱导NICE系统。来自乳酸乳球菌的乳链菌肽获自Sigma(商品号N5764)。
1.3分子克隆技术
对于分子克隆，使用例如Green和Sambrook(2012)：“Molecular cloning：alaboratory manual”，第四版，Cold Spring Harbor Laboratory Press(Cold SpringHarbor，NY，USA)中描述的标准技术。
核苷酸测序、基因合成和引物合成外包给BaseClear(Leiden，NL)。
1.4发酵
发酵在0.5升Multifors 6发酵罐阵列(Infors Benelux，Velp，NL)中进行。在IM-1培养基中用1％预培养物进行接种；搅拌速度为200转/分钟，培养温度为30℃。在运行期间，使用2.5M NaOH控制pH。连续监测pH、温度和NaOH的加入。
在生长周期的不同时间点用不同量的乳链菌肽进行诱导，如结果部分所示。也按结果部分所示取样。
1.5Cinac发酵
为了监测酸化培养物，使用Cinac pH监测单元(AMS France，Frepillion，FR)连续测量pH变化。为了确保均匀的pH，培养物以200转/分钟的磁力搅拌器混合。
1.6样品处理
对于SDS-PAGE和Western印迹，处理样品以产生三个级分：(i)上清级分，(ii)总细胞提取物(含无细胞提取物、细胞壁片段和其他颗粒物质)和(iii)无细胞提取物。
通过将1mL发酵上清与150μL TCA混合并在4℃下孵育至少1小时来制备上清级分。通过以20,000×g离心收集沉淀物。沉淀物或者立即使用或者储存于-20℃；在另外的离心步骤中除去痕量的TCA后，将其重悬浮于15μL的5mM Tris-HCl pH7.5中。
随后，加入5μL 4x样品缓冲液(含有75mM DTT)，将悬浮液在70℃下加热20分钟。在所有情况下，将20μL的体积应用于凝胶。
总细胞提取物制备如下：将10mL批次培养物样品或1ml发酵培养物的沉淀溶解在1mL 5mM Tris-HCl pH7.5中，并转移到具有500mg锆珠的研磨珠管中并在-20℃冷冻直到进一步加工。解冻后，将该悬浮液与速度为4×30秒的FastPrep(MP Biomedicals LLP，SantaAna，CA，USA)珠研磨器以速度4一起摇动，在冰上间歇冷却1分钟。珠沉淀1分钟后，将15μL上清与5μL上样缓冲液混合并如上所述进行处理。
通过以20,000×g离心总细胞提取物1分钟制备无细胞提取物。如上所述进行用于SDS-PAGE的进一步制备。
1.7十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)
按照制造商的方案，用市售的NuPage系统(Life Technologies GmbH，Darmstadt，DE)进行SDS-PAGE。
人FGF2参考蛋白获自Sigma Aldrich，将50μg溶于25μl 5mM Tris pH7.5中以得到2μg/μl的终浓度。在试验运行中，将5和10μg施用于与4×浓缩的上样缓冲液混合后的SDS-PAGE凝胶，得到1×上样缓冲液浓度。
如图1所示，凝胶显示出单体，少量二聚体和非常少量的hFGF2三聚体。泳道1和4＝SeeBlue标记；泳道＝25μg FGF2和泳道3＝10μg hFGF2。在不加入DTT至上样缓冲液和凝胶缓冲液的情况下运行该凝胶。
人IL4参考蛋白获自R&D系统(Minneapolis，MN，USA)。将人IL4溶解于PBS(5.8mMNa2HPO4，4.2mM NaH2PO4，145mM NaCl)中，得到终浓度为100μg/mL。作为参考，每个泳道施用1μg用于考马斯染色，以及0.1μg用于银染和Western印迹。
人CSF1参考蛋白获自Abcam PLC(Cambridge，GB)。将人CSF1溶解于无菌水中，得到终浓度为100μg/mL。作为参考，每个泳道施用1μg用于考马斯染色，以及0.1μg用于银染和Western印迹。
1.8Western印迹
还使用NuPage系统(XCell印迹模块)根据LifeTechnologies的方案进行蛋白质印迹。印迹膜是来自Thermo Fisher Scientific Inc的预切硝酸纤维素膜。转移缓冲液是来自Life Technologies的NuPage Transfer缓冲液(20x)。蛋白质的转移在35V下进行1小时。
为了检测人FGF2，以1:250的稀释度使用纯化的小鼠抗人FGF2单克隆抗体(BDTransduction laboratories，Heidelberg，DE)。第二抗体是获自BiokéB.V.(Leiden，NL)的稀释度为1：10,000的辣根过氧化物酶(HRP)连接的抗小鼠IgG抗体。
为了检测人IL4，以1:500的稀释度使用来自R&D系统的单克隆小鼠抗人IL4IgG1(克隆#3007)。第二抗体是获自BiokéB.V.(Leiden，NL)的稀释度为1：10,000的HRP连接的抗体抗小鼠IgG。
为了检测人CSF1，以1:2000的稀释度使用来自Abcam PLC(克隆ab9693)的人MCSF的兔多克隆抗体。第二种抗体是获自BiokéB.V.(Leiden，NL)的稀释度为1:2000的HRP连接的抗兔IgG抗体。
用获自Thermo Fisher Scientific Inc的SuperSignal West Pico化学发光底物开发了Western印迹。
1.9N-端氨基酸测序
对于来自受控发酵培养物上清的hFGF2、hIL4和hCSF1的N末端氨基酸测序，切割考马斯染色的SDS-PAGE的两条泳道，并送至Eurosequence(Groningen，NL)。
实施例1：表达质粒的产生
1.1质粒pNZ8149的测序
质粒pNZ8149用作乳酸乳杆菌(L.lactis)中人成纤维细胞生长因子2(hFGF2)、人白介素4(hIL4)和人集落刺激因子1(hCSF1)表达的载体。通过基于乳糖上生长的食物级别机制，在宿主细胞中选择质粒pNZ8149。
为了参考，分离并测序质粒DNA(对于引物参见表1)。没有发现与目前可用序列有关的差异。pNZ8149的序列在SEQ ID No.35中提供。
1.1.1人成纤维细胞生长因子2(hFGF-2)
hFGF-2的成熟形式含有155个氨基酸，并在下文中指定为hFGF2-155。其分子量为17.3kDa，pI为9.85。该分子含有4个半胱氨酸残基。
用于在乳酸乳球菌中克隆和表达的hFGF-2变体缺乏前两个氨基酸甲硫氨酸和丙氨酸，并因此含有153个氨基酸。因此，该变体在下文中指定为hFGF2-153。hFGF2-153的分子量为17.1kDa，pI为9.85。该变体还含有四个半胱氨酸残基。
人FGF2-155的相应氨基酸序列如下图32a和SEQ ID No.27所示：
下划线的氨基酸表示在变体hFGF2-153中缺失的前两个氨基酸甲硫氨酸和丙氨酸。变体hFGF2-153的氨基酸序列描绘于图32b和SEQ ID No.300中。
FGF2-155的序列是分泌后成熟的人FGF2序列。在体内，该序列被进一步加工。然而，各种现有的重组产物已经使用具有或不具有N末端甲硫氨酸残基的该155个氨基酸序列。
1.1.2人白介素4(hIL-4)
hIL-4的成熟蛋白含有129个氨基酸，其对应于NCBI登录号为NP_000580.1的氨基酸序列的氨基酸25至153。成熟蛋白质的分子量为14.96kDa，pI为9.36。该分子含有6个半胱氨酸残基。
成熟人IL-4的氨基酸序列如下图18c和SEQ ID NO：12所示。
用于在乳酸乳球菌中克隆和表达的hIL-4变体在成熟蛋白质的N末端含有额外的丙氨酸残基，因此含有130个氨基酸。其分子量为15.03kDa，pI为9.36。该变体还含有6个半胱氨酸残基。
用于克隆和表达的人hIL-4变体的相应氨基酸序列如下图33和SEQ ID NO：14所示：
在上述氨基酸序列中，N-端附加的丙氨酸残基有下划线。
1.1.3人类集落刺激因子1(hCSF1)
用于表达的氨基酸序列来源于NCBI登录号为NP_000748.3的人CSF1前体的554个氨基酸序列。所用的序列从作为成熟hCSF1的第一个氨基酸的氨基酸33(E)开始，并以氨基酸181(Q)结束。
此外，在C-端添加另外9个氨基酸，其占据天然蛋白质的位置480-488(GHERQSEGS)。为了改善由信号肽酶对信号肽的去除，在N-端加入额外的丙氨酸残基。所得的氨基酸序列如下图34所示，SEQ ID No.6：
在上述氨基酸序列中，N-端添加的丙氨酸残基有下划线。在C末端添加的另外9个氨基酸以粗体显示。由该序列编码的蛋白质含有159个氨基酸，分子量为18.5kDa，pI为4.72。该蛋白质含有7个半胱氨酸残基。
1.2在乳酸乳球菌中表达hFGF2、hIL4和hCSF1的质粒的构建
对于乳酸乳球菌，其目的是将hFGF2、hIL4和hCSF1表达并分泌到例如生长培养基的上清中。为此，使用用于转录、翻译和蛋白质分泌的信号。用于转录和翻译的信号存在于乳酸乳球菌并且源自乳酸乳球菌的乳链菌肽A启动子的NICE表达系统中。乳酸乳球菌的乳链菌肽A启动子描绘于图3和SEQ ID No.44中，例如描述于de Ruyter等人(1996)。
图3还示出了启动子的-10个元件和-35元件以及核糖体结合位点(RBS)。各个目标蛋白的ATG起始密码子直接在序列3’端的两个半胱氨酸残基后。
分泌信号来源于例如van Asseldonk等人(1993)和van Asseldonk等人(1990)描述的乳球菌蛋白质Usp45。
下面的乳球菌蛋白质Usp45的分泌信号如图35和SEQ ID No.34所示：
MKKKIISAIL MSTVILSAAAPLSGVYA
在细胞中存在一种机制，其确保在蛋白质分泌后，该信号序列与目标蛋白质分离。该反应由信号肽酶催化，其在切割位点周围的位置具有特定的某些氨基酸的偏好。
为了优化切割位点，使用基于Web的程序SignalP 4.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)。
对于hFGF2的氨基酸序列，该程序表明，当去除hFGF2-155的前两个氨基酸时，发生最佳切割，留下从Ala残基开始的总长度为153个氨基酸的hFGF2-155蛋白(变体hFGF2-153)。
用于由程序SignalP 4.1分析的hFGF2-153前体蛋白质的对应的氨基酸序列如下所示，且在SEQ ID No.29所示：
下划线的氨基酸表示乳球菌蛋白质Usp45的分泌信号。
对于hIL4的氨基酸序列，该程序显示当将丙氨酸残基添加到成熟IL4蛋白的N末端时，发生最佳切割，得到130个氨基酸的蛋白质。
用于由程序SignalP 4.1分析的hIL4前体蛋白质的对应的氨基酸序列如下所示，且在SEQ ID No.13所示：
下划线的氨基酸表示乳球菌蛋白质Usp45的分泌信号。
对于hCSF1的氨基酸序列，该程序显示当将丙氨酸残基添加到成熟hCSF1蛋白的N末端时，发生最佳切割，得到159个氨基酸的蛋白质。
用于由程序SignalP 4.1分析的hCSF1前体蛋白质的对应的氨基酸序列如下所示，且在SEQ ID No.5所示：
下划线的氨基酸表示乳球菌蛋白质Usp45的分泌信号。
图4a示出了使用SEQ ID No.29所示的氨基酸序列获得的SignalP 4.1的读数，其中Usp45蛋白的分泌信号与hFGF2-153的N-端融合。读数显示了hFGF2-153前体的氨基酸27和28之间清楚的切割位点以及该切割位点的得分。
图4b示出了使用SEQ ID No.13所示氨基酸序列获得的SignalP 4.1的读数，其中Usp45蛋白的分泌信号与hIL4的N-端融合。读数显示了hIL4前体的氨基酸27和28之间的清楚的切割位点以及该切割位点的得分。
图4c示出了使用SEQ ID No.5所示的氨基酸序列获得的SignalP 4.1读数，其中Usp45蛋白的分泌信号与hCSF1的N-端融合。读数显示了hCSF1前体的氨基酸27和28之间的清楚的切割位点以及该切割位点的得分。
编码hFGF2-153、hIL4和hCSF1的各基因的密码子使用适应乳酸乳球菌的一般密码子使用。这是基因合成供应商的常规程序。
此外，所有三种蛋白质都使用相同的Usp45信号序列。从而改善了同一细菌细胞中所有三种蛋白质的表达和信号肽翻译后加工。
对于hFGF2，合成含有乳链菌肽A启动子、Usp45信号序列和hFGF2-153基因的片段。人工构建体ssUsp45-FGF2-153的核酸序列示于SEQ ID No.45和图5a中。密码子使用被优化为乳酸乳球菌的一般密码子使用。
图5a示出了合成的插入物以及转录和翻译后获得的相应氨基酸序列。FGF2-153表示人FGF-2编码插入物。PnisA表示乳酸乳球菌乳链菌肽操纵子的乳链菌肽A启动子。ssUsp45表示乳酸乳球菌的usp45基因的信号序列。星号表示终止密码子。此外，在核酸序列中，内切核酸酶BamHI(位置1-6)和XbaI(位置751-756)的限制性识别位点用下划线表示。
对于hIL4，合成了含有nisinA启动子、Usp45信号序列和hIL4基因的片段。人工构建体ssUsp45-hIL4的核酸序列描绘于SEQ ID No：47和图5b中。密码子使用被优化为乳酸乳球菌的一般密码子使用。
图5b示出合成的插入物以及转录和翻译后获得的相应氨基酸序列。hIL4表示人IL4编码插入物。PnisA表示乳酸乳球菌乳链菌肽操纵子的乳链菌肽A启动子。ssUsp45表示乳酸乳球菌的usp45基因的信号序列。星号表示终止密码子。此外，在核酸序列中，内切核酸酶BamHI(位置1-6)和XbaI(位置682-687)的限制性识别位点用下划线表示。
对于hCSF1，合成了含有nisinA启动子、Usp45信号序列和hCSF1基因的片段。人工构建体ssUsp45-hCSF2的核酸序列描绘于SEQ ID No.49和图5c中。密码子使用被优化为乳酸乳球菌的一般密码子使用。
图5c示出了合成的插入物以及转录和翻译后获得的相应氨基酸序列。hCSF1表示人CSF1编码插入物。PnisA表示乳酸乳球菌乳链菌肽操纵子的乳链菌肽A启动子。ssUsp45表示乳酸乳球菌的usp45基因的信号序列。星号表示终止密码子。此外，在核酸序列中，内切核酸酶BamHI(位置1-6)和XbaI(位置769-774)的限制性识别位点用下划线表示。
从BaseClear获得完成的基因合成产物，其各作为在大肠杆菌载体pUC57中克隆的片段。
通过用限制酶BamHI和XbaI消化具有相应基因合成产物的pUC57质粒，将片段克隆到质粒pNZ8149中。分离含有各基因合成产物的BamHI和XbaI片段，并连接到PsuI和XbaI切割质粒pNZ8149中，得到相应的质粒pFGF2、pIL4和pCSF1。各自的限制性内切酶获自ThermoFisher Scientific Inc。
将各自的连接混合物转化到乳酸乳球菌NZ3900中。通过菌落PCR分析进行质粒的验证。所用引物各自的核酸序列如下表1所示。结果示于图6a至6c中。
图6a示出了具有pFGF2的乳酸乳球菌菌株NZ3900的潜在菌落的菌落PCR分析的结果。泳道1：用HindIII消化的λDNA；泳道2：用引物nis2和seqlacF扩增的pNZ8149(空载体)(预期片段大小为391bp)；泳道3和4：用引物nis2和seqlacF扩增的分离菌落(预期片段大小为907bp)。
图6b示出了具有pIL4的乳酸乳球菌菌株NZ3900的潜在菌落的菌落PCR分析的结果。泳道1：用HindIII消化的λDNA；泳道2：用引物nis2和seqlacF扩增的pNZ8149(空载体)(预期片段大小为391bp)；泳道11和12：用引物nis2和seqlacF扩增的分离的菌落(预期片段大小838bp)。
图6c示出了具有pCSF1的乳酸乳球菌菌株NZ3900的潜在菌落的菌落PCR分析的结果。泳道1：用HindIII消化的λDNA；泳道2：用引物nis2和seqlacF扩增的pNZ8149(空载体)(预期片段大小为391bp)；泳道3：用引物nis2和seqlacF扩增的分离的菌落(预期片段大小为925bp)。表1：使用的引物。
图7a示出了用于在乳酸乳球菌中表达和分泌hFGF2的质粒pFGF2的质粒图和核酸序列。lacF表示用于在乳糖上生长宿主菌株NZ3900的筛选标记；PnisA表示乳酸乳球菌乳链菌肽操纵子的乳链菌肽A启动子；ssUSP45表示乳酸乳球菌的usp45基因的信号序列。T表示终止子；repC和repA表示复制基因。质粒pFGF2的核酸序列也描绘在SEQ ID No.46中。
图7b示出了用于在乳酸乳球菌中表达和分泌hIL4的质粒pIL4的质粒图和核酸序列。lacF表示用于在乳糖上生长宿主菌株NZ3900的筛选标记；PnisA表示乳酸乳球菌乳链菌肽操纵子的乳链菌肽A启动子；ssUSP45表示乳酸乳球菌的usp45基因的信号序列。T表示终止子；repC和repA表示复制基因。质粒pIL4的核酸序列也描绘在SEQ ID No.48中。
图7c示出了用于在乳酸乳球菌中表达和分泌hCSF1的质粒pCSF1的质粒图和核酸序列。lacF表示用于在乳糖上生长宿主菌株NZ3900的筛选标记；PnisA表示乳酸乳球菌乳链菌肽操纵子的乳链菌肽A启动子；ssUSP45表示乳酸乳球菌的usp45基因的信号序列。T表示终止子；repC和repA表示复制基因。质粒pCSF1的核酸序列也描绘在SEQ ID No.50中。
实施例2：测试乳酸乳球菌中重组因子的生产。
为了测试各种重组因子hFGF2、hIL4或hCSF1是否在乳酸乳球菌中产生和分泌，选择初始转化的五个菌落用于进一步分析。首先通过铺板和单菌落分离纯化这些菌落。将五个菌落分别接种到M17乳糖培养基中并生长至OD600≈0.5，并用1ng/ml乳链菌肽诱导。
在添加乳链菌肽后2小时终止培养物并收获。所有培养物在添加乳链菌肽和一定量的生长迟缓物质后，显示相同的行为(数据未示出)。
a)在受控发酵条件下，在乳酸乳球菌NZ3900(pFGF2)中生产hFGF2
为了确定NZ3900(pFGF2)培养物的产量，进行受控发酵操作。
进行以下五个发酵操作：
1.NZ3900(pFGF2)不诱导
2.用5ng/mL乳链菌肽在OD600＝0.5下诱导NZ3900(pFGF2)
3.用5ng/mL乳链菌肽在OD600＝3下诱导NZ3900(pFGF2)
4.用5ng/mL乳链菌肽在OD600＝0.5下诱导NZ3900(pNZ8149)
5.用5ng/mL乳链菌肽在OD600＝3处诱导NZ3900(pNZ8149)
在用指定量的乳链菌肽诱导后t＝0(诱导前)，t＝2小时，t＝4小时，t＝6小时，取样。
培养物4和5进行确定5ng/mL乳链菌肽是否由于乳链菌肽启动子的活化而对培养物的生长有影响，在这种情况下该启动子后面不是靶基因。没有观察到对生长的影响(数据未示出)。
用两个诱导条件下的样品进行Western印迹。使用上述项目1.8所述的抗体进行hFGF2的检测。
图8示出了泳道3和4中的Western印迹，没有乳链菌肽诱导的FGF2的基线表达。
此外，图8示出，在OD600＝0.5诱导培养后，hFGF2产生强烈诱导，并且在诱导时刻后增加多达6小时。
从SDS-PAGE凝胶分离hFGF2条带(在OD600＝0.5，以5ng/mL乳链菌肽诱导，时间点t＝4和t＝6)，并运送到Eurosequence BV(Groningen，NL)，用于N-端氨基酸测序。
在清洗样品后，确定了一个暂定的N-端氨基酸序列。所确定的序列是：Ala-Gly-Ser-Ile-Thr-Thr。
该序列在信号序列被切除之后与预期序列完全匹配。预期序列是：AGSITTLPAL。这意味着hFGF2在乳酸乳球菌中表达、分泌并正确加工。
在以下实施例中使用在OD600＝0.5下用5ng/mL乳链菌肽诱导的NZ3900(pFGF2)的培养物上清。培养物被指定为AUP-10。
b)在受控发酵条件下，在乳酸乳球菌NZ3900(pIL4)中生产hIL4
为了确定NZ3900(pIL4)培养物的产量，用以下发酵操作进行受控发酵操作：
1.NZ3900(pIL4)不诱导
2.用5ng/mL乳链菌肽在OD600＝0.5下诱导NZ3900(pIL4)
3.用5ng/mL乳链菌肽在OD600＝3下诱导NZ3900(pIL4)
在用指定量的乳链菌肽诱导后t＝0(诱导前)，t＝2小时，t＝4小时，t＝6小时，取样。
通过上清部分和无细胞提取物的SDS-PAGE结合Western印迹分析hIL4的产生。使用上述项目1.8下的抗体进行hIL4的检测。
在SDS-PAGE过程中，将DTT加入到样品缓冲液和运行缓冲液中，以促进二硫键的解离。还使用这些相同的SDS-PAGE凝胶进行Western印迹以用于hIL4的特异性检测。
添加DTT的效果是hIL4在考马斯染色凝胶和Western印迹中形成单个蛋白条带(参见图9)。
此外，使用没有载体蛋白质的hIL4参考蛋白制剂。参考蛋白质条带与乳酸乳球菌NZ3900(pIL4)细胞产生的蛋白质具有相同的高度。
Western印迹示出了乳酸乳球菌NZ3900(pIL4)中hIL4的表达的进一步细节。
当在OD600＝0.5下用5ng/mL乳链菌肽诱导培养物时，发生诱导，而当在OD600＝3用600ng/mL乳链菌肽诱导培养物时，不发生诱导。hIL4的产生持续多达至少6小时。在这一时期，上清中的IL4浓度增加。
从SDS-PAGE凝胶分离hIL4条带(OD600＝0.5，5ng/mL乳链菌肽诱导，时间点t＝4和t＝6)，并运送到Eurosequence B.V.进行N-端氨基酸测序。
在清洗样品后，确定了一个暂定的N-端氨基酸序列。所确定的序列是：Ala-His-Lys-Cys。
该序列在信号序列被切除之后与预期序列完全匹配。预期序列是：AHKCDITLQE。
这意味着hIL4在乳酸乳杆菌中表达、分泌并正确加工。
在以下实施例中使用在OD600＝0.5下用5ng/mL乳链菌肽诱导的NZ3900(pIL4)的培养物上清。培养物被指定为AUP-12。
c)在受控发酵条件下，在乳酸乳球菌NZ3900(pCSF1)中生产hCSF1
为了确定NZ3900(pCSF1)培养物的产量，进行受控发酵操作。进行以下三个发酵操作。
1.NZ3900(pCSF1)不诱导
2.用5ng/mL乳链菌肽在OD600＝0.5下诱导NZ3900(pCSF1)
3.用5ng/mL乳链菌肽在OD600＝3下诱导NZ3900(pCSF1)
NZ3900(pCSF1)培养物被指定为AUP-14。
在用指定量的乳链菌肽诱导后t＝0(诱导前)，t＝2小时，t＝4小时，t＝6小时，取样。
通过上清部分和无细胞提取物的SDS-PAGE结合Western印迹分析hCSF1的产生。使用上述项目1.8所述的抗体进行hCSF1的检测。
在SDS-PAGE过程中，将DTT加入到样品缓冲液和运行缓冲液中，以促进二硫键的解离。还使用这些相同的SDS-PAGE凝胶进行Western印迹以用于hCSF1的特异性检测。
在Western印迹中(参见图11)，具有参考蛋白的泳道仍然显示出少量的二聚体。此外，考马斯染色的凝胶(参见图10)还显示出与参考蛋白相同大小的条带。
在未诱导的培养物中，几乎没有任何基线产生可以被检测出来。在OD600＝0.5，用5ng/mL乳链菌肽诱导的培养物中，CSF1产生随时间增加至多达至少6小时。只能观察到少量的降解产物。
从SDS-PAGE凝胶分离hCSF1条带(OD600＝0.5，5ng/mL乳链菌肽诱导，时间点t＝4和t＝6)，进行N-端氨基酸测序。
在清洗样品后，确定了一个暂定的N-端氨基酸序列。所确定的序列是：Ala-Glu-Glu-Val-Ser。
该序列在信号序列被切除之后与预期序列完全匹配。预期序列是：AEEVSEYCSH。
这意味着hCSF1在乳酸乳杆菌中表达、分泌并正确加工。
在以下实施例中使用在OD600＝0.5下用5ng/mL乳链菌肽诱导的NZ3900(pCSF1)的培养物上清。培养物被指定为AUP-14。
d)在受控发酵条件下在乳酸乳球菌NZ3900中从单个操纵子生产hFGF2、hIL4和hCSF1
用3个基因(FGF2，IL4，CSF1)的6个排列中的3个来构建3个构建体：
a)hFGF2，hIL4，hCSF1，
b)hCSF1，hFGF2，hIL4，
c)hIL4，hCSF1，hFGF2。
对于操纵子的设计，每个基因被提供有其自身的用于翻译起始的核糖体结合位点和其自身的信号肽用于蛋白质分泌。关于信号肽，早先已经决定对所有三个基因使用相同信号序列(ssUsp45)。为了避免在质粒上大量相同的核苷酸区域极为接近(质粒内重组/缺失的可能性)，基于密码子简并性和乳酸乳球菌的密码子使用，通过不同密码子编码相同的信号肽。
对于3个构建体中每个的第一个基因，使用乳链菌肽A(nisA)基因的核糖体结合位点。对于3个构建中每个的其他两个基因，基于与乳酸乳球菌的16S rRNA的3'端的良好配合，选择ATP合酶亚基γ(atpG)基因和半乳糖苷O-乙酰基转移酶(lacA)基因的核糖体结合位点，如Bolotin等人(2001)所述(“The complete genome sequence of the lactic acidlactase ssp.lactis IL1403”，Genome Res。第11卷，第731至753页)。乳酸乳球菌IL1403基因组的核苷酸序列可以登录号AE005176.1从NCBI获得。
在图24a中提供了所有三种核糖体结合位点的概述。此外，提供包括相应开放阅读框的起始密码子(ATG)的相应核糖体结合位点的核酸序列也在SEQ ID No.51至SEQ IDNo.53中示出。
乳酸乳球菌的16S rRNA的3'端(5'GGAUCACCUCCUUUCU 3')在SEQ ID No.54中示出。在图24a中，16S rRNA显示为16S rDNA，其中尿嘧啶(U)被胸腺嘧啶(T)替代)。
图24a还示出了Shine-Dalgarno序列(5'AGGAGG 3')的六碱基共有序列。Shine-Dalgarno序列是原核信使RNA中的核糖体结合位点，通常位于起始密码子上游约8个碱基。RNA序列有助于将核糖体募集到mRNA中，以通过使核糖体与起始密码子相一致来启动蛋白质合成。
以使用载体的PsuI和NcoI位点(BamHI和PsuI相容)，将合成的序列一步克隆到质粒pNZ8149中的方式设计三个操纵子。此外，将MluI位点引入到基因二和三前面的核糖体结合位点前面。由此，使用质粒的NcoI和XbaI位点，通过缺失中间基因和PCR克隆第三基因来创建剩余的三个操纵子。
合成的核酸的各序列描绘于图24b至24d和SEQ ID No.55至SEQ ID No.57中。三种基因的密码子使用已经适用于乳酸乳球菌。
来自3个构建体的表达各自受单个乳链菌肽A启动子和上述编码实施例1中获得的hFGF2-153前体蛋白质、hIL4前体蛋白质和hCSF1前体蛋白质的核酸序列控制。
完成的基因合成产物从BaseClear获得，各作为在大肠杆菌载体pUC57中克隆的片段。
通过用限制酶BamHI和NcoI消化含有各基因合成产物的pUC57质粒，将片段克隆到质粒pNZ8149中。分离含有各自基因合成产物的BamHI/NcoI片段，并连接到PsuI和NcoI切割质粒pNZ8149中以产生相应的质粒
·pC-F-I(含有CSF-RBS1-FGF-RBS2-IL4基因合成产物的BamHI/NcoI片段)
·pF-I-C(含有FGF-RBS1-IL4-RBS2-CSF基因合成产物的BamHI/NcoI片段)，和
·pI-C-F(含有IL4-RBS-CSF-RBS2-FGF基因合成产物的BamHI/NcoI片段)。
所用的各种限制性内切酶获自Thermo Fisher Scientific Inc。
各自的构建体转化乳酸乳球菌NZ3900。
三个构建体中的每5个菌落在pH调节的发酵操作中生长，并在OD600＝0.5下用5ng/ml乳链菌肽诱导并在4小时后收获。
用TCA沉淀1ml上清，并施加到SDS-PAGE凝胶的一个孔中。一块凝胶用考马斯蓝染色，另一块作为三个靶蛋白的Western印迹。
如上所述处理相应的SDS-PAGE凝胶以及Western印迹，并在图24e至24g中描绘。
从图24e可以看出，构建体a)pF-I-C(FGF2、hIL4、hCSF1)导致许多的FGF2，少量IL4以及少量CSF1的表达和分泌。
从图24f可以看出，构建体b)pC-F-I(hCSF1、hFGF2、hIL4)导致许多CSF1和FGF2以及中等IL4的表达和分泌。
从图24g可以看出，构建体c)pI-C-F(hIL4、hCSF1、hFGF2)导致许多IL4和少量CSF1和FGF2的表达和分泌。考马斯染色的凝胶显示出所有三种蛋白质的最佳生产和诱导。
可以将三种靶蛋白克隆到操纵子结构中并从操纵子结构中表达，导致相应的蛋白hIL4、hCSF1和hFGF2释放到上清中。
实施例3：在类似创伤愈合情况的条件下诱导FGF2产生
创伤中的生理条件与试管或发酵罐中的生理条件不同。
因此，建立了一个实验来测试NICE系统的诱导，以及因此测试在菌株NZ3900不生长或仅生长最少的条件下的hFGF2产生。当培养物的pH达到5.0并且培养进入静止阶段时，存在这些条件。
实验在200mL瓶中搅拌进行并且pH监测。使用具有2％(重量/体积)Na-β-甘油磷酸盐和0.5％(重量/体积)乳糖的生长培养基IM1培养基。进行以下发酵：
1.NZ3900(pFGF2)-无诱导
2.NZ3900(pFGF2)-当培养物达到pH＝5时用1ng/mL乳链菌肽诱导
3.NW3900(pFGF2)-当培养物达到pH＝5时用0.1ng/mL乳链菌肽诱导
4.NZ3900(pFGF2)-当培养物达到OD600＝3时用1ng/mL乳链菌肽诱导
5.NZ3900(pFGF2)-当培养物达到OD600＝3时用0.1ng/mL乳链菌肽诱导。
诱导后3h收获培养物。与在pH5.0下诱导的培养物同时收获对照培养物。结果如图11所示。
图12示出了生长和pH显色在所有五种培养物中是相同的，并且用乳链菌肽的诱导对生长或pH显色没有影响。
使用SDS-PAGE和Western印迹测量在1ml培养物上清中的hFGF2形成。图13示出，在细胞不生长或处于生长减缓阶段的条件下，乳链菌肽不诱导基因表达。关于FGF2的背景生产(无诱导)，培养物上清中FGF2的量几乎没有或没有增加。
Western印迹分析显示hFGF2在所有五种培养物的培养物上清中均可检测到。此外，hFGF2的两种分解产物是可检测的。
这意味着在细胞中产生的具有信号序列的所有FGF2被加工并分泌。
人FGF2的基因已被克隆到食品级的乳酸乳球菌的NICE表达载体中。
可以通过加入乳链菌肽来诱导FGF2基因的表达。hFGF2以约100-200ng/mL分泌到上清中。分泌的FGF2的N-端氨基酸序列的测定显示蛋白质被正确加工。
诱导FGF2的产生导致有限的生长迟缓，但不阻止生长。
在受控发酵中，FGF2在生长曲线的宽窗口(OD600＝0.5-3)之间诱导产生。在OD600＝0.5用5ng/ml乳链菌肽诱导后，观察到最高的FGF2产生。
在非选择性条件下，如葡萄糖生长，质粒pFGF2在菌株NZ3900中稳定至少100代。
实施例4a：人成纤维细胞迁移试验
通过测量正常人皮肤成纤维细胞(NHDF)向人工迁移区的迁移，评估从乳酸乳球菌NZ3900(pFGF2)释放的FGF2和从乳酸乳球菌NZ3900(pIL4)释放的IL4对创伤愈合的生物活性。使用创伤恢复的图像分析来评价测试化合物的效果。
来自实施例2a的乳酸乳球菌NZ3900(pFGF2)和来自实施例2b的乳酸乳球菌NZ3900(pIL4)各自在OD600＝0.5以5ng/mL乳链菌肽诱导。6小时发酵后，如上所述分离各培养物上清，冷冻干燥，并在-20℃保存。
为了进一步测试，通过将粉末与tris HCl(5mM，pH 7.6)重新配制，以1mg/ml的浓度从冷冻干燥上清制备储备溶液。从实施例2a的乳酸乳球菌NZ3900(pFGF2)的培养物上清中获得AUP-10储备溶液。从实施例2b的乳酸乳球菌NZ3900(pIL4)的培养物上清中获得AUP-12储备溶液。
将储备溶液用测定培养基n°1稀释至终浓度分别为0.5ng/ml、1ng/ml、2.5ng/ml和5ng/ml，用于AUP-10(FGF2)；和终浓度分别为0.1ng/ml、1ng/ml、5ng/ml和10ng/ml，用于AUP-12(IL4)。
储备溶液的指示浓度以及稀释度是指各自溶液中存在的蛋白质的总量，其主要对应于来自实施例2a的乳酸乳球菌NZ3900(pFGF2)和来自实施例2b的乳酸乳球菌NZ3900(pIL4)的培养物上清中的FGF2和IL4的量。
此外，将购自Kaken Pharmaceutical Co.，Inc(Tokyo，日本)的重组人bFGF(Fiblast，)，用测定培养基n°1稀释至终浓度分别为0.5ng/ml、1ng/ml、2.5ng/ml和5ng/ml。
将购自R&D系统(Minneapolis，MN，USA)的重组人IL4用Tris HCl(5mM，pH 7.6)稀释至终浓度分别为0.1ng/ml、1ng/ml、5ng/ml和10ng/ml。
正常人皮肤成纤维细胞(NHDF)获自Lonza Group AG(Basel，CH)。
将成纤维细胞接种到用于迁移分析的96孔微孔板中并孵育24小时。
·培养条件：37℃，5％CO2。
·培养基：补充有L-谷氨酰胺2mM，青霉素50U/ml，链霉素50μg/ml，10％体积的胎牛血清(FCS)的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)。
在这些板中，用胶原溶液涂覆孔，并将细胞接种塞子(cell seeding stopper)置于孔的中心，以限制细胞接种到孔的外部环形区，从而产生人工创伤(迁移区)。然后使用从Thermo Fisher Scientific获得的钙黄绿素-AM标记细胞。
钙黄绿素AM是一种细胞渗透性染料，可以用于确定大多数真核细胞的细胞生存力。在活细胞中，通过细胞内酯酶水解乙酰氧基甲酯后，非荧光钙黄绿素AM转化为绿色荧光的钙黄绿素。
孵育30分钟后，取出塞子，并将培养基用含有测试化合物(FGF2、Fiblast、IL4或重组hIL4)的测定培养基n°1或仅测定培养基n°1(对照)或参考(在10％的FCS)替代。然后将细胞孵育72小时。所有实验条件在n＝5中进行。
·测定培养基n°1：补充有2mM的L-谷氨酰胺，50U/ml的青霉素和50μg/ml的链霉素的DMEM。
使用NIKON Diaphot 300显微镜(透镜x 4)，在孵育0、24、48和72小时后观察到细胞迁移至迁移区，并使用NIKON DX-1200相机拍摄图像。
在每个时间点测量人工创伤的表面，并与T0测量的迁移前面积进行比较，以便可视化和定量创伤恢复。将试验化合物对细胞迁移的影响与未处理的对照进行比较。
对于hFGF2，施用的各浓度为0.5ng/ml、1.0ng/ml、2.5ng/ml和5.0ng/ml，对于hIL4，施用的各浓度为0.1ng/ml、1ng/ml、5ng/ml和10ng/ml。将72小时的纤维板暴露迁移与用生长培养基(对照)孵育的成纤维细胞进行比较。
人工创伤的恢复面积％在图14a和14b中示出。
图14a示出用表达hFGF2的重组益生菌孵育后迁移成纤维细胞的显著增加。在测定的实验条件下，购自Kaken Pharmaceutical Co.，Inc(Tokyo，日本)的重组人bFGF(Fiblast)不调节NHDF迁移和增殖。
在实施例2a中获得的重组益生菌AUP-10中表达的hFGF2具有生物活性。
图14b示出了含有0.1-10ng/ml hIL4的AUP-12培养基诱导NHDF增殖类似于rhIL4。
在实施例2b中获得的重组益生菌AUP-12中表达的hIL4具有生物活性。
实施例4b：正常人真皮成纤维细胞和小鼠淋巴母细胞中的ERK1和ERK2-磷酸化。
通过测量正常人真皮成纤维细胞(NHDF)中细胞外信号调节激酶1(ERK1)和细胞外信号调节激酶2(ERK2)的磷酸化，进一步评估从乳酸乳球菌NZ3900(pFGF2)释放的FGF2的生物学活性。
通过测量小鼠淋巴母细胞M-NFS-60细胞中细胞外信号调节激酶1(ERK1)和细胞外信号调节激酶2(ERK2)的磷酸化，评估乳酸乳球菌NZ3900(pCSF1)释放的CSF1的生物学活性。
如实施例4a中所述制备AUP-10储备溶液。
此外，在OD600＝0.5下用5ng/mL乳链菌肽诱导来自实施例2c(AUP-14)的乳酸乳球菌NZ3900(pCSF1)。6小时发酵后，分离培养物上清，冷冻干燥，保存在-20℃。为了进一步测试，通过将粉末与Tris HCl(5mM，pH 7.6)重新配制获得AUP-14储备溶液，从冷冻干燥的上清制备浓度为1mg/ml总蛋白的储备溶液。
将储备液用各自的无血清培养基进一步稀释，对于AUP-10(FGF2)稀释到终浓度分别为0.4ng/ml、4ng/ml、40ng/ml和80ng/ml，对于AUP-14(CSF1)稀释到终浓度分别为0.2ng/ml、2ng/ml、20ng/ml和40ng/ml。
将来自Kaken Pharmaceutical Co.的重组人bFGF用无血清培养基(Assay mediumn°1)稀释至终浓度分别为0.5ng/ml、5ng/ml、50ng/ml和100ng/ml。
将购自Abcam PLC(Cambridge，GB)的重组人CSF1用无血清培养基(Assay mediumn°2)稀释至终浓度分别为0.2ng/ml、2ng/ml、20ng/ml和40ng/ml。
将正常人真皮成纤维细胞(NHDF)接种在96孔微孔板中，并在上述实施例4a所述的条件下孵育24小时。
从LGC Standards GmbH(Wesel，德国)获得小鼠M-NFS-60细胞(ATCC CRL-1838TM)。将细胞接种在96孔微孔板中并在以下条件下孵育24小时：
·培养条件：37℃。
·培养基：补充有0.05mM 2-巯基乙醇、62ng/ml人重组巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、青霉素50U/ml、链霉素50μg/ml和胎牛血清至终浓度为10体积％的转/分钟I-1640培养基(Life Technologies Corporation，Carlsbad，CA，USA)。
·测定培养基n°2：转/分钟I-1640培养基，补充有0.05mM 2-巯基乙醇、50U/ml青霉素和50μg/ml链霉素。
指数生长的NHDF在无血清培养基(Assay medium n°1)中孵育24小时，转移到移液管(0.5×105个细胞/管)中，并如上所述在37℃下，在含有0.5ng/ml、5ng/ml、50ng/ml和100ng/ml的rhFGF2或AUP-10储备溶液的稀释液的无血清培养基中孵育15分钟(测定培养基n°1)。然后用PBS洗涤细胞，并重悬于裂解缓冲液中。
将指数生长的小鼠M-NFS-60细胞在无血清培养基(测定培养基n°2)中孵育24小时，转移到移液管(2×106个细胞/管)中，并以1μM浓度的Ki-20227孵育1小时。从Abcam PLC得到的c-fms抑制剂Ki-20227作为对CSF-1受体(CSF-1R)特异性的对照。
用Ki-20227预孵育1小时后，按上所示，在含有0.2、2、20和40ng/ml的rhCSF1或者如所示的终浓度的AUP-14储备溶液的稀释液的测定培养基n°2中孵育15分钟。然后用PBS洗涤细胞，并重悬于裂解缓冲液中。
裂解缓冲液的配方如下：0.5体积％Surfact-Amps NP-40(PierceBiotechnology，Rockford，IL，USA)、20mM Hepes(pH 8.0)、0.35M NaCl、0.1mM EGTA、0.5mMEDTA、1mM MgCl2、20体积％甘油、1mM DTT、1μg/ml抑蛋白酶醛肽、0.5μg/ml胃蛋白酶抑制剂、0.5μg/ml牛胰蛋白酶抑制剂(apronitin)和1mM苯甲基磺酰氟。
将细胞各自在冰中孵育15分钟，并通过离心获得细胞蛋白质。通过Bradford测定(Bio-Rad)来测定蛋白质浓度，将50μg蛋白质在Laemmli缓冲液中煮沸，并在10％十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶中电泳。将分离的蛋白质转移到硝酸纤维素膜(24V)上30分钟。将印迹在含有0.1％吐温20和5％脱脂奶粉的Tris缓冲盐水溶液中封闭，并使用以下特异性抗体测定磷酸化ERK 1+2和总ERK 1+2的表达。
为了检测ERK1和ERK2，以1:10000的稀释度使用兔抗人ERK1和ERK2多克隆抗体(全抗血清，获自Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Munich，德国，产品编号M5670)。第二抗体是获自BiokéB.V.(Leiden，NL)的稀释度为1：10,000的辣根过氧化物酶(HRP)连接的抗体兔IgG。
为了检测磷酸化ERK1和ERK2，使用纯化的小鼠抗人p-ERK(E-4)单克隆抗体(SantaCruz Biotechnology，Inc.，Heidelberg，德国，产品编号sc-7383)，稀释度为1：1000。p-ERK(E-4)是对应于含有人来源的Tyr 204磷酸化ERK的序列的小鼠单克隆抗体表位。单克隆抗体检测在Tyr 204磷酸化的ERK1，和小鼠、大鼠及人源的相应的磷酸化ERK2。
第二抗体是获自BiokéB.V.(Leiden，NL)的稀释度为1：10,000的辣根过氧化物酶(HRP)连接的抗体抗小鼠IgG。
使用Image J软件(National Institutes of Health，Bethesda，MD，USA)量化ERK1+2磷酸化的诱导。
从图14c可以看出，含有0.4-80ng/ml FGF2的AUP-10培养基诱导在NHDF中的ERK 1+2磷酸化类似于rhFGF2。
从图14d可以看出，含有0.2-40ng/ml CSF1的AUP-14培养基诱导在小鼠M-NFS-60细胞中的ERK 1+2磷酸化类似于rhCSF1。
实施例4c：脂多糖(LPS)诱导的人外周血单核细胞(PBMC)的M1的活化的抑制
人类THP-1细胞(ATCC TIB-202TM)获自LGC Standards GmbH。将细胞接种在96孔微孔板中并在以下条件下孵育24小时：
·培养条件：37℃，5％CO2。
·培养基：补充有0.05mM 2-巯基乙醇、50μg/ml青霉素、50μg/ml链霉素和胎牛血清终浓度为10体积％的转/分钟I-1640培养基(Life Technologies Corporation，Carlsbad，CA，USA)。
·测定培养基n°2：转/分钟I-1640培养基，补充有0.05mM 2-巯基乙醇、50U/ml青霉素和50μg/ml链霉素。
THP1是来自急性单核细胞白血病患者的人单核细胞系。THP-1细胞分化为巨噬细胞，并根据既定方案极化。使用从U-Cytech(Utrecht，The Netherlands)获得的源自大肠杆菌的脂多糖(LPS)(血清型026：B6-获自Sigma-Aldrich)和干扰素γ(IFN-γ)用于极化。
简言之，在3-mL DMEM培养基加100ng/mL佛波醇-12-肉豆蔻酸-13-乙酸酯(PMA)(得自Sigma-Aldrich)中，将1百万个THP1细胞接种在6孔板中，24小时诱导分化为非极化巨噬细胞(非极化THP-1衍生的巨噬细胞)。
分化后，用DMEM培养基中的非极化THP-1衍生的巨噬细胞用LPS(1μg/ml)和IFN-γ(100U/ml)处理48小时以诱导M1表型，产生M1极化的THP-1衍生的巨噬细胞。
对于M1极化的抑制，非极化的THP-1巨噬细胞首先用在实施例4a中获得的AUP-12储备溶液的稀释液或用重组人IL4(rhIL4)的储备液的稀释液孵育18小时，然后如上所述用LPS和IFN-γ刺激额外的48小时。
将总蛋白浓度为1mg/ml的AUP-12储备溶液用DMEM培养基稀释至浓度为0.1％、1％、10％和20体积％。用DMEM培养基将rhIL4的储备溶液稀释至按体积计0.1ng/ml、1ng/ml、10ng/ml和20ng/ml的浓度。
收集细胞，并使用High Pure RNA Isolation试剂盒(Roche Diagnostics)提取总RNA。使用iScriptTM cDNA Synthesis Kit(Bio-Rad；Hercules，CA，USA)对总RNA(1μg)进行反转录(retrotranscribed)，并使用iQTM SYBR Green Supermix(Bio-Rad；Hercules，CA，USA)，通过实时PCR分析所产生的cDNA。使用CFX96实时PCR Detection System(Bio-Rad；Hercules，CA，USA)进行实时PCR。使用HPRT基因对每个样品中的mRNA表达进行标准化，并使用2-ΔΔCt方法定量基因表达。M1极化的标记是肿瘤坏死因子α(TNF-α)mRNA的产生。
图14e示出了人THP-1细胞中LPS诱导的TNFαmRNA产生的抑制。
从图14e可以看出，AUP-12培养基抑制人THP-1细胞中LPS诱导的TNFαmRNA产生类似于rhIL4。rhIL4的有效剂量在1-20ng/ml之间。
图14e中的*表示与单独的LPS相比p值P<0.05。误差条代表标准偏差。
实施例4d：Thp1衍生的巨噬细胞中M2极化的诱导
为了诱导M2极化，将实施例4c中获得的非极化THP-1衍生的巨噬细胞与实施例4a中获得的AUP-12储备溶液的稀释液，或终浓度为20ng/ml的重组人IL4(rhIL4)储备溶液的稀释液一起孵育18小时。
将总蛋白浓度为1mg/ml的AUP-12储备溶液用DMEM培养基稀释至0.1％和1体积％的浓度。
如上所述分析细胞。收集极化细胞后，提取总RNA。反转录总RNA，通过实时PCR分析产生的cDNA。使用CFX96实时PCR Detection System进行实时PCR。使用HPRT基因对每个样品中的mRNA表达进行标准化，并使用2-ΔΔCt方法定量基因表达。M2极化的标记物是巨噬细胞甘露糖受体1(Mrc1)和Kruppel样因子4(KLF4)。
图14f示出了THP1衍生的巨噬细胞中巨噬细胞甘露糖受体1(Mrc1)和Kruppel样因子4(KLF4)的M2基因的RNA表达的诱导。
从图14f可以看出，AUP-12培养基诱导THP1衍生的巨噬细胞中的巨噬细胞甘露糖受体1(Mrc1)和Kruppel样因子4(KLF4)的M2基因的RNA表达与rhIL4相似。rhIL4的有效剂量在2-20ng/ml之间。
图14f中的*表示与M0(M0＝PMA诱导的THP1)和Mn＝非诱导THP1相比，p值P<0.05。图14f中的**表示与Mn＝非诱导THP1相比，p值P<0.05。误差条代表标准偏差。
实施例4e：在各种细胞系中AUP-12的STAT-6转录活性。
为了确定重组IL-4和AUP-12的生物学活性对STAT6转录活性的影响，使用用STAT-6和STAT6-Luc质粒瞬时共转染的MO3.13(人)和HEK293T(人)细胞(Addgene Inc，Cambridge，MA，USA)。
人类胚胎肾293T细胞HEK293T(CRL-3216TM)获自LGC Standards GmbH。将细胞接种在96孔微孔板中并在以下条件下孵育24小时：
·培养条件：37℃，5％CO2。
·培养基：DMEM培养基、青霉素50U/ml、链霉素50μg/ml、胎牛血清至终浓度为10体积％。
人类胶质细胞(少突胶质细胞)杂交细胞系MO3.13获自tebu-bio GmbH(Offenbach，德国)。将细胞接种在96孔微孔板中并在以下条件下孵育24小时：
·培养条件：37℃。
·培养基：DMEM培养基、青霉素50U/ml、链霉素50μg/ml、胎牛血清至终浓度为10体积％。
根据制造商的建议，使用RotiFectTM试剂(Carl Roth GmbH+Co.KG，Karlsruhe，德国)进行用STAT-6和STAT6-Luc质粒的转染。细胞用0.1ng/ml、1ng/ml、10ng/ml、20ng/ml和100ng/ml的重组人IL4(rhIL-4)和AUP-12储备溶液的稀释液处理6小时。将AUP-12储备溶液用DMEM培养基稀释至0.1％、1％、10％和20体积％的浓度。
然后将细胞在25mM Tris-磷酸盐pH 7.8，8mM MgCl2，1mM DTT，1％Triton X-100和7％甘油中裂解。
按照荧光素酶测定试剂盒(Promega，Madison，WI，USA)的说明书，使用AutolumatLB 953(EG&G Berthold，USA)测定荧光素酶活性。特异性反式激活的结果表示为在未处理细胞上的成倍诱导。
图14g示出了人胶原杂交细胞系(MO3.13)中AUP-12和rhIL-4的STAT-6转录活性。
图14h示出了人胚胎肾293细胞中AUP-12和rhIL-4的STAT-6转录活性。
从图14g和14h可以看出，AUP-12培养基在人胶质细胞杂交细胞系(MO3.13)以及人类胚胎肾293细胞中诱导STAT-6转录活性类似于rhIL4。rhIL4的有效剂量在0.1至20ng/ml之间。
实施例5：创伤闭合实验
在联合药动学(PK)/药效学(PD))-疗效研究中检查单独或组合表达人FGF-2、CSF-1和IL-4的益生菌应用于db/db糖尿病小鼠的全厚度切除创伤的结果。其中，将表达FGF2(AUP-10)、IL4(AUP-12)和CSF1(AUP-14)的细菌单独评估或组合为三部分组合(即AUP-10+AUP-12+AUP14)评估，并比较阳性对照的功效(即重组蛋白TGF-α+PDGF-BB的组合)。此外，评估在单个细菌细胞(AUP-16)中表达FGF2、IL4和CSF1的细菌，并与运载体处理(即盐水+膜敷料或IM1培养基+膜敷料)和阳性对照(TGF-α+PDGF-BB)相比较。
糖尿病患者容易创伤愈合受损，足部溃疡尤为普遍。创伤愈合的这种延迟也延伸到糖尿病动物，包括自发性糖尿病(db/db)小鼠，其从The Jackson Laboratory(BarHarbor，ME，USA)商购。
在第一项研究和随后的第二项研究中，使用所有雄性和约10周龄的99只糖尿病小鼠(株系名称BKS.Cg-Dock7m+/+Leprdb/J-储存代码00642)。
在创伤当天(第0天)，将在单个次细菌细胞中单独表达人FGF-2、CSF-1或IL-4或以三部分组合表达的重组益生菌以及表达FGF2、IL4和CSF1的重组益生菌应用于创伤，并在施用6小时后检查其存活。为了便于通过施用于创伤的细菌对FGF-2、CSF-1和/或IL-4的产生进行测定，在6小时以及1、2和7天后从创伤取出创伤液样品。在6和24小时以及7天后收集全身血液和关键器官以促进PK/PD分析。将单独接受IM1培养基的创伤作为本研究的PK/PD成分的对照。
为了检查这些重组益生菌对创伤愈合过程的影响，在创伤当天(第0天)，将表达人FGF-2、CSF-1和IL-4的细菌以及分别表达人FGF-2、CSF-1或IL-4的细菌施用创伤并每日一次，直到创伤第6天为止。将接受这些重组益生菌的创伤愈合与仅暴露于新鲜IM1培养基的类似创伤的愈合进行比较。
此外，本研究中使用重组人血小板衍生的生长因子-BB(rh-PDGF-BB)与重组人转化生长因子-α(rh-TGF-α)的组合作为“阳性对照”。在0.25％羟丙基甲基纤维素(HPMC)载体中制备阳性对照，其通过将0.5g获自Sigma Aldrich(St.Louis，MO，USA)的羟丙基甲基纤维素溶解在100ml蒸馏水中并加入氢氧化钠使pH值达到7.0来制备。
PDGF-BB和TGF-β的组合是基于Brown RL等人完成的研究(Brown RL，Breeden MP，Greenhalgh DG.:“PDGF and TGF-alpha act synergistically to improve woundhealing in the genetically diabetic mouse.J.Surg.Res.56(6)，1994，第562至570页)。Brown等人描述了与单独生长因子的治疗相比，用PDGF-BB和TGF-α的组合观察到创伤闭合的改善。
在宏观和组织学水平上研究创伤愈合。在宏观水平上针对(i)新皮肤修复反应的开始和(ii)创伤闭合研究创伤愈合。
从在创伤后第0、4和7天拍摄的数码照片确定创伤闭合及其组分创伤收缩和创伤再上皮化。在常规(H&E)染色切片上进行肉芽组织形成(深度)和创伤宽度(头尾向收缩)的组织学评估。这些组织学评估是在创伤后7天收获的组织上进行的。
对不良影响的发展进行监测和充分记录。
全厚度实验创伤和治疗应用的创建
实验性创伤后，将动物放置在保持环境温度为23℃，12小时光/暗循环的环境中的单个笼(笼尺寸为500cm2，具有锯屑床，每周更换三次)中。向它们提供食物(CRM-P，产品代码801722，SDS饮食，UK)和随意饮用水。为了使动物适应周围环境，在实验之前，将它们安置5-7天，不受干扰，只是更新它们的床并补充食物和水供给。在所有麻醉事件之后，将动物放置在温暖的环境中并进行监测，直到其完全从手术中恢复。所有动物在手术后接受适当的镇痛(丁丙诺啡)，并根据需要接受额外的镇痛药。
所有动物手术均在英国内政部许可证机构根据英国内政部执照(PCD：50/2505；PPL：40/3614；PIL：IBCEFDF55；PIL：I34817249)进行。整个研究中每天监测动物的健康状况。
将动物随机分配到根据表2a和2b的18种治疗方案之一。
在第0天，将动物麻醉(异氟醚(isofluorane)和空气)，将背部刮去并用盐水浸泡的纱布清洁。然后用70％EtOH擦拭皮肤，并用无菌纱布擦干。在每个实验动物的左背侧皮肤中产生单个标准化的全厚度创伤(10.0mm×10.0mm)。
所有组中的动物创伤随后都穿着透明膜敷料Bioclusive(Systagenix WoundManagement，Gatwick，UK)的周边带(circumferential band)；之后它们接受了以下描述的治疗方法之一(参见表2a和2b)，其通过使用27号针头的Bioclusive膜注射施用。
对于每种处理，将各自的未诱导的重组益生菌以10ml具有以下细胞密度(每ml培养基的菌落形成单位(CFU)))的IM1培养基中提供：
治疗方案“组合”表示由实施例2a中获得的未诱导的NZ3900(pFGF2)，实施例2c中获得的未诱导的NZ3900(pCSF1)和实施例2b中获得的未诱导的NZ3900(pIL4)的混合物产生的三部分组合。该混合物的总细胞密度为3×108CFU/ml。
在施用处理之前，将在10ml IM1培养基中提供的各自的未诱导的重组益生菌在30℃孵育而不摇动，并通过分光光度法测定在波长600nm(OD600)下的光密度。
在OD600为0.5时，加入浓度为5ng/ml的乳链菌肽。另外孵育30分钟后。在30℃下将诱导培养物转移到10℃。随后，通过使用27号针的Bioclusive膜通过注射施加各自的诱导培养物。
按照表2a和2b中描述的方案进行处理。治疗组1至9的动物在第0天接受单次施用50μl。治疗组10至18的动物在第0、1、2、3、4、5和6天接受连续7次施用，作为每天50μl的单次施用。
在第一次施用处理6小时后，从组1至组4中的所有动物收获创伤液。从组合组(grp1)收获的创伤液以允许重组益生菌的CFU计数的方式进行处理。从其余组取出的创伤液保存在湿冰上，然后转移至-80℃以进行长期储存。在收集创伤液后，这些组中的所有动物都被处死(通过英国内政部批准的方法)。在处死前，通过心脏穿刺将全身血液摄入EDTA处理的管中。将血液样品的一半离心以得到血浆；剩下的一半在4℃下保存过夜，然后装运到Langford Veterinary Services Ldt。(Bristol,UK)，在那里进行全血和差异血细胞计数。从所有动物(血浆和组织被放置在冷冻在液氮中的冷冻管中-之后将它们储存在-80℃下)收获的肝脏、肾脏、脾脏、心脏、肺组织和引流淋巴结的死后样品)。
在第一次施用治疗24小时后，从组5至9的所有动物收获创伤液，并如上所述储存。收集血液并储存血液，然后处死动物。如上所述收获并储存创伤液、全血、血浆和组织样品。
第一次施用后的第一天以及在此后每天一次，直到第6天，将治疗重新施用于组10至组15中的所有创伤。
在第一次施用(第二次施用后1天)2天后，从10至15组的所有动物收获创伤液，并如上所述储存。
在第一次施用后第7天(在第6天最后一次施用后1天)，从10至15组的所有动物收获创伤液，并按上述方式储存。收集血液并储存血液，然后处死动物。处死后，收获创伤和边缘组织进行组织学检查(参见3.7节)。如上所述收获并储存创伤液、全血、血浆和组织样品。
在创伤后第4天和第7天，将组10至15中的动物再次麻醉，并对其创伤进行评估，并与校准/身份牌一起进行数字拍照。在第4天，这是与Bioclusive膜敷料一起进行的。在第7天，取出敷料和任何游离的碎屑，然后用盐水浸泡的无菌纱布清洗创伤，并用无菌纱布擦干。对创伤进行评估，并与校准/身份牌一起进行数字拍照。
表2a：研究1的实验组
表2b：研究2的实验组
创伤闭合的图像分析
Image Pro图像分析软件(版本4.1.0.0，Media Cybernetics，USA)用于测量从10至15和16至18组的创伤图像得到的，随着时间的创伤闭合。对于每个时间点的每个创伤(10至15组的第4天和第7天以及16至18组的第4、7、8和12天)，测量开放创伤面积并以相对于第0天的创伤面积％表示。
施用6小时后重组益生菌的存活。
将表达FGF2、IL4和CSF1的细菌的组合引入创伤后6小时，提取创伤液，计数细菌菌落形成单位(CFU)。来自5例创伤的CFU计数结果在表3给出。
结果证实，细菌在创伤中是存活的，并且在创伤中仍旧能够增殖6小时，突出了上述重组益生菌可以用于向创伤递送治疗性蛋白质组合的事实。表3：CFU计数的结果
不同治疗组的创伤愈合反应
开始治疗后4天和7天，通过目视检查创伤后不同治疗组的创伤愈合反应。
通过肉眼目视检查以及通过Image Pro图像分析软件对10至15组进行定量分析，显示创伤愈合即使早在治疗开始后四天就已发生。此外，在第七天，与表达FGF2的益生菌(AUP-10)，表达IL4的益生菌(AUP-12)和表达CSF1的益生菌(AUP-14)的单独处理组相比，以及与阳性对照(即TGF-α和PDGF-BB)相比，用表达FGF2、IL4和CSF1(治疗组1、5和10)的重组益生菌的三部分组合处理的小鼠显示出优异的愈合反应(证明粉红/红色肉芽组织沉积以及上皮化的创伤)。结果如图15a所示。
图15a示出了不同治疗组中的创伤愈合反应。
各治疗组显示出相当的治疗反应，其优于IM1培养基处理组(运载体处理组)。结果表明，FGF2、IL4和CSF1在创伤愈合中的协同作用。
FGF2(AUP-10)处理的小鼠进一步显示出肉芽组织形成，以及血管形成，但不是上皮化。也可以看出，当单独使用表达FGF2的益生菌时，存在血管渗漏。表达IL4的益生菌(AUP-12)和表达CSF1的益生菌(AUP-14)主要显示出创伤的上皮化，而不是肉芽，而用重组益生菌的三部分组合(AUP-10+AUP-12+AUP-14)处理的创伤显示出肉芽组织形成以及创伤上皮化。不能看到血管渗漏。
重要的是要知道，在糖尿病足溃疡(人)中，上皮化依赖于肉芽组织形成。无肉芽组织形成，不能发生上皮化，创伤不会闭合。
在组16至18中将AUP-16(在单个细菌细胞中表达FGF2、IL4和CSF1的重组细菌)与运载体处理(盐水+敷料)和阳性对照(即TGF-α+PDGF-BB)进行比较。在第4、8和12天，与阳性对照组(TGF-α+PDGF-BB)相比，AUP-16在创伤愈合中表现出优越性。结果如图15b所示。
对照组(盐水治疗组16)，阳性对照组(治疗组17)和AUP-16治疗组织(治疗组18)在创伤后和在第4、8和12天后的创伤愈合状态的比较在图15b中示出。
第0天代表创伤后立即发生的原始创伤。在第4、8和12天也显示出相同的创伤。各照片大致相等地被缩放，以便可视化创伤闭合。每张照片中的黑条代表1cm。
阳性对照(治疗组17)和AUP-16处理组织(处理组18)的第8天和第12天之后的剩余创伤面积的比较如图15c所示。
使用Image Pro图像分析软件测量在创伤图像中的剩余创伤面积，并以相对于第0天的创伤面积％表示。
在组合(AUP-16)治疗的创伤中，在第12天观察到创伤几乎完全闭合。这通过创伤后立即第0天，相对于创伤面积为1,37％剩余创伤面积来反映。
此外，从图15a和15b可以看出，与用重组人血小板衍生生长因子-BB组合重组人转化生长因子-α(阳性对照)治疗的创伤相比，在用三部分组合以及AUP-16治疗的创伤中观察到显著更好的创伤闭合，特别是在第12天。
在本实验中研究的所有细菌治疗方案，发现单独使用或作为三部分组合施用的AUP-10、AUP-12和AUP-14，以及AUP-16促进糖尿病db/db小鼠的创伤修复，该小鼠是被广泛接受的并且是人类延迟创伤愈合的最佳验证动物模型之一。
在db/db小鼠中的切除创伤显示出创伤闭合的显著延迟，肉芽组织形成减少，创伤床血管供应减少以及显著减少的增殖，如Michaels等人所述。(2007)(“db/db miceexhibit severe wound-healing impairments compared with other murine diabeticstrains in a silicone-splinted excisional wound model”，Wound Rep.Reg.15，第665至670页)。
实验结果清楚地表明，本发明的重组益生菌的应用提供了对人的创伤，特别是慢性创伤中治疗的显著改善。
本发明的重组益生菌的应用诱导肉芽组织形成，增加创伤床血管供应和增殖，从而即使在表现出严重创伤愈合障碍的模型中也能改善及加速创伤闭合。
因此，这些结果显示炎症，优选慢性炎性皮肤功能障碍如冻伤、湿疹、银屑病、皮炎、溃疡、创伤、红斑狼疮、神经性皮炎及其组合，优选皮炎、溃疡、创伤及其组合，进一步优选溃疡，从本发明的重组益生菌的应用中获益。
例如，通过施用本发明的重组益生菌可以治疗诸如慢性静脉性溃疡、慢性动脉性溃疡、慢性糖尿病性溃疡和慢性压力性溃疡等慢性创伤，因为在各个慢性创伤中观察到创伤愈合损伤在施用本发明的重组益生菌后得以克服。

Claims (23)

1.重组益生菌，包括：
编码第一异源因子的核酸序列，编码第二异源因子的核酸序列，以及优选编码第三异源因子的核酸序列，条件是所述第一因子、所述第二因子和所述第三因子在功能上彼此不同，
其中所述第一因子是生长因子，其中所述第二因子选自M2极化因子，并且其中优选地所述第三因子选自M2极化因子和生长因子。
2.根据权利要求1的重组益生菌，其中所述核酸序列位于所述重组益生菌的染色体和质粒中的至少一种上。
3.根据权利要求1或2中任一项所述的重组益生菌，其中所述核酸序列的表达由组成型启动子或诱导型启动子控制。
4.根据权利要求3的重组益生菌，其中所述核酸序列的表达由诱导型启动子控制，所述核酸序列在至少一种诱导物存在下是可表达的。
5.根据权利要求3或4中任一项所述的重组益生菌，其中所述诱导型启动子是诱导物可诱导的，所述诱导型启动子是编码羊毛硫抗菌肽、其功能类似物的微生物基因的启动子，其中优选所述诱导型启动子是乳酸乳球菌PnisA、乳酸乳球菌PnisZ、乳酸乳球菌PnisQ、乳酸乳球菌PnisF、乳酸乳球菌PnisU或其组合。
6.根据权利要求4或5中任一项所述的重组益生菌，其中所述诱导物是至少一种羊毛硫抗菌肽或其功能类似物，优选选自乳链菌肽A、乳链菌肽Z、乳链菌肽Q、乳链菌肽F、乳链菌肽U、其功能类似物及其混合物。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的重组益生菌，其中所述益生菌还包含至少一种编码所述益生菌生存所需的必需蛋白质的失活基因。
8.根据权利要求7所述的重组益生菌，其中所述至少一种所述益生菌生存所需的失活基因选自丙氨酸消旋酶(alaR)、胸苷酸合酶(thyA)、天冬酰胺合酶(asnH)、CTP合酶(pyrG)、色氨酸合酶(trpBA)及其组合。
9.根据权利要求7或8中任一项所述的重组益生菌，其中所述基因是通过以下失活：所述基因的缺失、所述基因的突变、所述基因的外遗传修饰、所述基因的RNA干扰(RNAi)介导的基因沉默、所述基因的翻译抑制或其组合。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的重组益生菌，其中所述第一因子、所述第二因子和所述第三因子中的至少一种可从所述重组益生菌释放。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的重组益生菌，其中所述M2极化因子选自细胞因子、趋化因子及其混合物。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的重组益生菌，其中所述M2极化因子选自白介素4(IL-4)、白介素10(IL-10)、白介素13(IL-13)、集落刺激因子-1(CSF1)、白介素34(IL34)及其混合物。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的重组益生菌，其中所述生长因子选自成纤维细胞生长因子(FGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、表皮生长因子(EGF)、肝素结合EGF样生长因子(HB-EGF)、转化生长因子-α(TGF-α)、胰岛素样生长因子(IGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、转化生长因子β(TGF-β)及其混合物，优选成纤维细胞生长因子2(FGF-2)。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的重组益生菌，其中所述重组益生菌是乳酸菌，优选乳杆菌属物种或乳球菌属物种。
15.根据权利要求14所述的重组益生菌，其中所述乳球菌属物种是乳酸乳球菌，优选是乳酸乳球菌亚种Cremoris。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的重组益生菌，其中所述重组益生菌在处于溶液中、是冷冻的或是干燥的，优选是冻干或喷雾干燥的。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的重组益生菌，其中所述重组益生菌通过局部施用和/或通过皮下注射施用。
18.重组益生菌，用于治疗炎性皮肤功能障碍，其中所述重组益生菌是根据权利要求1至17中任一项所述的重组益生菌。
19.根据权利要求18所述的重组益生菌，其中所述炎性皮肤功能障碍是炎性皮肤疾病或炎性结缔组织疾病。
20.根据权利要求19所述的重组益生菌，其中所述炎性皮肤疾病是冻伤、湿疹、银屑病、皮炎、溃疡、创伤、红斑狼疮、神经性皮炎或其组合。
21.根据权利要求20所述的重组益生菌，其中所述创伤是烧伤创伤、化学创伤、辐射诱导的创伤、缺血性创伤或机械创伤。
22.根据权利要求20所述的重组益生菌，其中所述溃疡是褥疮性溃疡或小腿溃疡。
23.治疗炎性皮肤功能障碍的方法，其中所述方法包括向罹患所述炎性皮肤功能障碍的个体施用权利要求1-22中任一项的重组益生菌的步骤。
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