KR102283127B1

KR102283127B1 - 류코노스톡속 균주를 포함하는 간 기능 개선용 조성물

Info

Publication number: KR102283127B1
Application number: KR1020180143027A
Authority: KR
Inventors: 김윤근; 염규진
Original assignee: 주식회사 엠디헬스케어; (주)코엔바이오
Priority date: 2018-06-19
Filing date: 2018-11-19
Publication date: 2021-07-29
Also published as: JP2021527415A; KR20190143336A; CN112351692A

Abstract

본 발명은 간 기능 개선용 류코노스톡 홀잡펠리(Leuconostoc holzapfelii) 균주 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 류코노스톡 홀잡펠리 균주는 간의 기능을 효과적으로 개선할 수 있으므로, 다양한 식품 조성물, 약학 조성물, 동물 사료용 조성물, 기능성 식품 조성물 등 다양한 분야에 적용이 가능할 것으로 기대된다.

Description

류코노스톡속 균주를 포함하는 간 기능 개선용 조성물{A composition for improving liver function comprising genus Leuconostoc}

본 발명은 류코노스톡속 균주, 이의 배양액, 이의 농축물, 이의 소포 또는 이의 건조물을 포함하는 간 기능 개선용 조성물 등에 관한 것이다.

간(liver)은 체내의 해독, 담즙 배설, 지질 등의 대사 작용, 각종 영양소의 저장, 조혈 또는 혈액 응고, 순환 혈액량의 조절 등 많은 기능에서 중요한 역할을 담당하고 있는 기관 중의 하나로, 간의 기능이 저하되면 다양한 질병이 야기된다. 최근 발표된 바에 따르며, 한국인의 간암에 의한 사망률은 10만 명당 23.4 명으로 세계 1 위이고, 만성 간질환의 경우에도 10만 명당 28.8 명으로 세계 3 위로 확인되었다. 또한 국내 통계청에서 발표된 바에 따르면, 우리나라 40대의 경우 10만 명당 56.1 명이 간 관련 질병을 가지고 있으며, 이는 국내 사망 원인의 주요 원인으로 발표되었다. 대표적인 간 관련 질병으로는 지방간, 알코올성 간염, 알코올성 간경변증, 간암 등이 있으며, 최근 증가되고 있는 정신적 스트레스와 흡연은 간 손상을 가중시켜 인체의 해독 작용을 억제하여 다른 질병의 원인이 되기도 한다.

이러한 간 관련 질병에 의한 폐해가 커짐에 따라 최근에는 질병 치료제 시장뿐만 아니라, 간의 기능을 개선해줄 수 있는 기능 개선용 제품에 대한 관심과 소비자의 요구도가 높아지고 있는 실정이다.

국내출원특허 10-2016-0103803

본 발명은 상기와 같은 종래 기술상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 류코노스톡속 균주, 이의 배양액, 이의 농축물, 이의 소포 또는 이의 건조물을 포함하는 간 기능 개선용 조성물 등을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명은 류코노스톡 홀잡펠리(Leuconostoc holzapfelii) 균주, 이의 배양액, 이의 농축물, 이의 소포(extracellular vesicle) 또는 이의 건조물을 포함하는 간 기능 개선용 식품 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 류코노스톡 홀잡펠리(Leuconostoc holzapfelii) 균주, 이의 배양액, 이의 농축물, 이의 소포(extracellular vesicle) 또는 이의 건조물을 유효성분으로 포함하는, 간 관련 질병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 배양액은 류코노스톡 홀잡펠리 균주를 포함하는 배양액일 수도 있고, 균주를 배양한 후에 균주를 제거한 상층액일 수도 있으며, 류코노스톡 홀잡펠리 유래 소포(extracellular vesicle)를 포함할 수 있으며, 이는 류코노스톡 홀잡펠리에서 자연적으로 분비된 것일 수 있으며, 또는 추가로 첨가할 수 있는 것을 특징으로 한다. 상기 소포는 류코노스톡 홀잡펠리의 배양액, 또는 류코노스톡 홀잡펠리를 포함하는 식품, 또는 류코노스톡 홀잡펠리를 가열 또는 초음파 등으로 사멸시킨 후에 획득된 상층액에서 분리될 수 있으며, 자연적으로 또는 인공적으로 분비된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 다른 구체예에 있어서, 상기 조성물은 간 관련 질병의 예방 또는 개선 효과를 가질 수 있으며, 상기 간 관련 질병은 바람직하게는 간암, 간염, 간경변, 간부전 등이다.

본 발명의 또 다른 구체예에 있어서, 상기 류코노스톡 홀잡펠리는 바람직하게는 1일 투여량이 5 X 10⁴ 내지 5 X 10¹⁰ CFU(colony forming unit)/mL일 수 있으나, 투여에 의한 부작용을 유도하지 않을 수 있는 투여량이라면 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구체예에 있어서, 상기 조성물은 바람직하게는 류코노스톡(Leuconostoc) 속, 락토바실러스(Lactobacillus) 속, 엔테로코커스(Enterococcus) 속, 브레비바실러스(Brevibacillus) 속, 락토코코스(Lactococcus) 속, 프로피오니박티륨(Propionibacterium) 속, 비피도박테륨(Bifidobacterium) 속 등의 균주를 추가로 포함할 수 있으나, 식품 조성물에 포함될 수 있다고 알려져 있는 균주라면 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구체예에 있어서, 상기 조성물은 식품학적으로 허용가능한 담체 또는 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 류코노스톡 홀잡펠리(Leuconostoc holzapfelii) 균주, 이의 배양액, 이의 농축물, 이의 소포(extracellular vesicle) 또는 이의 건조물을 유효성분으로 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 간 관련 질병의 치료 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 류코노스톡 홀잡펠리(Leuconostoc holzapfelii) 균주, 이의 배양액, 이의 농축물, 이의 소포(extracellular vesicle) 또는 이의 건조물을 유효성분으로 포함하는 조성물의 간 관련 질병의 치료 용도를 제공한다.

본 발명은 간 기능 개선용 류코노스톡 홀잡펠리(Leuconostoc holzapfelii) 균주 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 류코노스톡 홀잡펠리 균주는 부작용 없이 간의 기능을 효과적으로 개선할 수 있을 뿐만 아니라 섭취를 통하여 염증을 효과적으로 감소시킬 수 있으므로 간 염증 관련 질병의 예방 또는 치료 효과를 가지므로 식품 조성물, 약학 조성물, 동물 사료용 조성물, 기능성 식품 조성물 등 다양한 조성물로의 적용이 가능할 것으로 기대된다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 간경변 또는 간암 환자의 혈청 세균 메타게놈 결과를 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 류코노스톡 홀잡펠리 균주의 간 기능 개선 효과를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 류코노스톡 홀잡펠리 균주의 간 세포 사멸 억제 효과를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 류코노스톡 홀잡펠리 배양액 유래 소포의 세포 독성 여부를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 류코노스톡 홀잡펠리 배양액 유래 소포의 염증반응을 유도하는지 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 류코노스톡 홀잡펠리 배양액 유래 소포의 항염증 효과를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.

본 발명의 류코노스톡 홀잡펠리 균주는 균주의 섭취 또는 투여를 통하여 체내 유익균의 증가 및 간 세포 사멸을 억제하여 부작용 없이 간의 기능을 효과적으로 개선할 뿐만 아니라, 섭취를 통하여 염증 유발을 효과적으로 억제하므로, 간 관련 질병의 예방 또는 치료 효과를 나타내므로, 의약, 식품, 사료 등 다양한 분야에 효과적으로 사용될 수 있을 것으로 기대된다.

본 명세서에 있어서, “류코노스톡 홀잡펠리(Leuconostoc holzapfelii)”란 형태학적으로 그람 양성균이며, 류코노스톡 홀잡펠리 Ceb-kc-003으로서, 2016년 04월 11일 한국미생물보존센터에 KCCM11830P로 기탁되었으며, 16s rDNA 결과 기존의 류코노스톡 홀잡펠리와 99% 상동성을 가진다. 본 발명의 류코노스톡 홀잡펠리는 통상적으로 바실러스 또는 류코노스톡 속 균주의 배양 방법을 통해서 배양할 수 있으며, 배지는 천연 배지 또는 합성 배지를 사용할 수 있다. 배지의 탄소원으로는 예를 들어, 글루코오즈, 수크로오즈, 덱스트린, 글리세롤, 녹말 등이 사용될 수 있고, 질소원으로는 펩톤, 육류 추출물, 효모 추출물, 건조된 효모, 대두, 암모늄염, 나이트레이트 및 기타 유기 또는 무기 질소 함유 화합물이 사용될 수 있으나, 이러한 성분에 한정되는 것은 아니다. 배지에 포함되는 무기염으로는 마그네슘, 망간, 칼슘, 철, 칼륨 등이 사용될 수 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 상기 탄소원, 질소원 및 무기염의 성분 이외에 아미노산, 비타민, 핵산 및 그와 관련된 화합물들이 배지에 첨가될 수 있다. 본 발명의 균주는 배양온도 조건은 20 ~ 40 ℃의 온도 범위에서 12 시간 내지 4 일간 배양할 수 있다. 또한, 배양 배지에 쥐눈이콩, 숙지황, 감초, 천궁, 두충, 계피, 당귀, 석창포, 하수오, 측백엽, 생강, 백자인, 천초, 승마, 만형자 등의 생약 제제, 이의 추출물, 또는 이의 혼합물을 첨가하여 배양하고, 이 배양물을 사용함으로써 본 균주의 간 또는 장 기능 개선의 효과를 보다 개선할 수 있다.

본 명세서에 있어서, “배양액(culture broth)”이란 균체를 포함한 배양 원액일 수 있으며, 또한 배양 상등액을 제거하거나 농축한 균체(농축물)일 수 있다. 또는 균체가 제거된 류코노스톡 균주 유래 소포를 포함하는 배양 상등액일 수 있다. 상기 배양액의 조성은 통상의 류코노스톡 균주 배양에 필요한 성분뿐만 아니라, 류코노스톡 균주의 생장에 상승적으로 작용하는 성분을 추가적으로 포함할 수 있으며, 이에 따른 조성은 당 업계의 통상의 기술을 가진 자에 의하여 용이하게 선택될 수 있다. 상기 소포(extracellular vesicle)는 다양한 세균에서 분비되는 나노 크기의 막으로 된 구조물을 의미하며, 본 발명에서는 류코노스톡 균주의 배양액 또는 류코노스톡 균주를 포함하는 식품에서 분리될 수 있으며, 자연적으로 또는 인공적으로 분비된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 배양액 또는 식품에서 소포를 분리하는 방법은 소포를 분리할 수 있다면 특별히 제한되지 않는다. 예컨대 원심분리, 초고속 원심분리, 필터에 의한 여과, 겔 여과 크로마토그래피, 프리-플로우 전기영동, 또는 모세관 전기영동 등의 방법, 및 이들의 조합을 이용하여 소포를 분리할 수 있으며, 또한 불순물의 제거를 위한 세척, 수득된 소포의 농축 등의 과정을 추가로 포함할 수 있다.

본 명세서에 있어서, “조성물(composition)”이란 류코노스톡 홀잡펠리 또는 이의 소포를 유효성분으로 포함하는 의약, 식품, 동물 사료용, 약학적, 음료용, 유산균 제제 등일 수 있으나, 본 발명의 류코노스톡 홀잡펠리 균주 또는 이의 소포를 포함하는 조성물이라면 이에 제한되지 않는다. 상기 의약용 조성물은 의약외품 또는 의약적 제제일 수 있으며, 상기 식품 조성물은 식품, 건강식품, 건강보조식품, 또는 건강기능성식품일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한 균주의 상태는 액상 상태 또는 건조 상태일 수 있으며, 건조 방법은 통풍 건조, 자연 건조, 분무 건조, 동결 건조 등이 가능하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에 있어서, “예방(prevention)”이란 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 간 관련 질병 등의 질환을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 명세서에 있어서, “치료(treatment)“란 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 간 관련 질병 등의 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

본 명세서에 있어서, “개선(improvement)”이란 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미한다.

본 명세서에 있어서, “개체(individual)”란 질병의 예방 또는 치료를 필요로 하는 대상을 의미하며, 구체적으로는 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 쥐(rat), 개, 고양이, 말, 소 등의 포유류를 의미한다.

본 발명에 있어서 상기 식품 조성물은, 각종 식품류, 예를 들어, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 유산균 복합제, 건강보조 식품류, 기능성 식품류 등에 사용할 수 있으며, 환제, 분말, 과립, 침제, 정제, 캡슐 또는 음료의 형태로 사용할 수 있다. 이때, 식품 또는 음료 중의 상기 류코노스톡 홀잡펠리 균주, 이의 배양액, 이의 농축물, 이의 소포 또는 이의 건조물의 양은, 일반적으로 본 발명의 식품 조성물의 경우 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물의 경우 100 mL를 기준으로 0.02 내지 10 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명의 식품 조성물은 당업계에 통상적인 식품첨가제, 예를 들어 향미제, 풍미제, 착색제, 충진제, 안정화제 등을 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 식품 조성물은 필수 성분으로서, 상기 류코노스톡 홀잡펠리 균주, 이의 배양액, 이의 농축물, 이의 소포 또는 이의 건조물 외에 첨가되는 성분에는 특별한 제한은 없으며 통상의 식품과 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 예로는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린; 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제 (타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등)) 및 합성 향미제 (사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100mL당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 바람직하게는 약 5 내지 12 g이다.

상기 외에 본 발명의 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

본 명세서에 있어서, “약학적 조성물(pharmaceutical composition)”이란 캡슐, 정제, 과립, 주사제, 연고제, 분말 또는 음료 형태임을 특징으로 할 수 있으며, 상기 약학적 조성물은 인간을 대상으로 하는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 약학적 조성물은 이들로 한정되는 것은 아니지만, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 캡슐, 정제, 수성 현탁액 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 약제적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는 경구투여시에는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서(elixir), 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. 기타, 용액, 현탁액, 정제, 캡슐, 서방형 제제 등으로 제형할 수 있다.

한편, 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말디톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등이 사용될 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장이 포함된다. 경구 또는 비경구 투하가 바람직하다. 본원에 사용된 용어 "비경구"는 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 관절내, 활액낭내, 흉골내, 경막내, 병소내 및 두개골내 주사 또는 주입기술을 포함한다. 본 발명의 약학적 조성물은 또한 직장 투여를 위한 좌제의 형태로 투여될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 사용된 특정 화합물의 활성, 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 정식, 투여시간, 투여경로, 배출율, 약물 배합 및 예방 또는 치료될 특정 질환의 중증을 포함한 여러 요인에 따라 다양하게 변할 수 있고, 상기 약학적 조성물의 투여량은 환자의 상태, 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있고, 1일 0.0001 내지 50 mg/kg 또는 0.001 내지 50 mg/kg으로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 본 발명에 따른 의약 조성물은 환제, 당의정, 캡슐, 액제, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁제로 제형화될 수 있다.

본 발명의 류코노스톡 홀잡펠리의 투여량 또는 섭취량은 예를 들어, 5 x 10⁴ 내지 5 x 10⁸ CFU/mL의 류코노스톡 홀잡펠리 Ceb-kc-003(KCCM11830P) 균주, 바람직하게는 1 x 10⁶ 내지 1 x 10⁸ CFU/ml의 류코노스톡 홀잡펠리 Ceb-kc-003(KCCM11830P)의 양으로 회당 30 mL 내지 100 mL를 1 일 1 회 내지 4 회 투여할 수 있다. 일 예에서, 1 x 10⁶ 내지 1 x 10⁸ CFU/ml의 류코노스톡 홀잡펠리 Ceb-kc-003(KCCM11830P)의 양으로 회당 50 mL를 1 일 2 회 내지 4 회 투여할 수 있다. 보다 구체적으로는 1 x 10⁶ 내지 1 x 10⁸ CFU/mL의 류코노스톡 홀잡펠리 Ceb-kc-003(KCCM11830P)의 양을 회당 50 mL 내지 100 mL를 1 일 1 회 내지 2 회 투여할 수 있다. 보다 더욱 구체적으로는 1 x 10⁶ 내지 1 x 10⁸ CFU/mL의 류코노스톡 홀잡펠리 Ceb-kc-003(KCCM11830P)를 아침 식전 30 분에 50 mL 내지 100 mL 1 회 투여하고, 저녁 식전 30 분 또는 취침 전에 50 mL 내지 100 mL 1 회 투여할 수 있다. 그러나 이러한 투여량 또는 섭취량은 개개인의 체중, 연령, 성별, 건강 상태, 치료, 예방, 또는 개선하고자 하는 주요 증상, 투여 시간, 투여 방법, 중증도 등에 따라 달라질 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 하기 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예

실시예 1: 간 관련 질병 환자의 혈청 세균 메타게놈 분석

간 관련 질병을 가진 환자의 혈청 내 세균의 메타게놈 분석을 위하여, 간경변 환자 99 명 및 간암 환자 94 명의 혈청을 획득하였다. 대조군으로는 정상인 99 명의 혈청을 이용하였다. 혈청으로부터 세균 유래 소포를 분리하고, 소포로부터 DNA를 분리하기 위하여, 10 mL 튜브에 획득한 혈청을 담은 후에 4 ℃에서 3,500 X g로 10 분간 원심분리하여 펠렛(pellet)과 상등액(supernatant)을 분리하고, 분리된 펠렛과 상등액은 각각 새로운 10 mL 튜브에 첨가하였다. 상등액은 0.22 μm 필터를 이용하여 세균과 이물질을 제거한 후에 Centrifugal filter 50 kD에 옮겨서 4 ℃에서 1,500 X g로 15 분간 원심분리하여 50 kD 보다 작은 크기의 물질은 제거한 후에 총 용량이 10 mL이 되도록 농축시켰다. 그리고 다시 0.22 μm 필터를 이용하여 세균과 이물질을 깨끗이 제거한 후에 Type 90ti 로터를 이용하여 4 ℃에서 150,000 X g로 3 시간 동안 초고속원심분리를 실시하였다. 초고속원심분리 후에 상등액은 제거하고 펠렛은 인산염완충용액(phosphate buffered saline, PBS)으로 재부유시켜 보관하였다. 이후 재부유된 펠렛 100 μL를 새로운 튜브에 첨가한 후에 100 ℃ 가열 블록(heat block)에서 가열시켜 소포 내부의 DNA가 지질 외부로 방출되도록 하였다. 그리고 얼음을 이용하여 냉각시킨 후에, 4 ℃에서 10,000 X g로 30 분 동안 원심분리하여 상등액 만을 분리한 후에 나노드롭(Nanodrop)을 이용하여 상등액 내의 DNA 양을 정량하였다. 혈청으로부터 분리된 DNA에 세균 유래 DNA가 존재하는지 확인하기 위하여, 표 1에 기재된 16s rDNA 프라이머를 이용하여 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction)을 실시하여 DNA를 증폭하였다.

프라이머		서열	서열번호
16S rDNA	16S_V3_F	5'-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG-3'	1
16S rDNA	16S_V4_R	5'-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC-3	2

증폭된 DNA는 Illumina MiSeq sequencer를 이용하여 염기서열 분석을 실시하였고, 결과는 Standard Flowgram Format(SFF) 파일로 출력하였다. 출력된 SFF 파일은 GS FLX 소프트웨어(v2.9)를 이용하여 염기서열 파일(fasta)과 뉴클레오타이드 품질 점수(nucleotide quality score) 파일로 변환하여 리드의 신용도 평가를 확인하였다. 윈도우(window 20 bps) 평균 base call 정확도(accuracy)가 99 % 미만(프레드 품질 점수(Phred quality score) < 20)인 부분은 제외하고, 리드의 길이가 300 bps 이상인 것만을 이용하였다(Sickle version 1.33). 결과 분석을 위하여 UCLUST 및 USEARCH를 이용하여 염기서열 유사도에 따른 클러스터링을 실시하고, BLASTN 및 GreenGenes의 16s rDNA 염기서열 데이터베이스(108,453 개의 염기서열)를 이용하여 97 % 이상의 염기서열 유사도를 가지고 있는 세균을 분석하여(QIIME), 운영분류단위(operational Taxonomy Unit; OTU)를 분석하였다. 통계 분석을 위하여, t-test를 이용하였으며 각 군의 평균 분포 비율이 2배 이상 다르며, p 값이 0.05 이하인 경우로 하여 대조군과 실험군에서 유의성 있게 다른 비율로 존재하는 세균을 선정하였다. 그 결과는 도 1 및 표 2에 나타내었다.

	정상인		간경변			간암
	mean	SD	mean	SD	p	mean	SD	p
Streptococcus	0.0568	0.0553	0.0177	< 0.05	0.0000	0.0124	0.0124	< 0.0001

도 1 및 표 2에 나타난 바와 같이, 대조군과 비교하여 간 관련 질병을 보유하고 있는 환자, 즉, 간경변 및 간암 환자에서 연쇄상구균(Streptococcus) 세균이 유의성 있게 감소된 것을 확인하였다.

실시예 2: 류코노스톡 홀잡펠리 균주의 분말 및 배양액 제조

류코노스톡 홀잡펠리(Leuconostoc holzapfelii) 균주의 장 또는 간 기능의 개선능을 확인하기 위하여, 한국 미생물 보존센터에 기탁되어 있는 류코노스톡 홀잡펠리 Ceb-kc-003(KCCM11830P) 균주를 분양받아 3 % 염화나트륨이 첨가된 BHI 고체 배지에서 배양하였다. 류코노스톡 홀잡펠리의 분말은 배양된 균주를 동결건조하여 제조하였으며, 배양액 제조를 위해서는 정제수 100 L에 덱스트로즈 2 kg, 전지분유 1.5 kg, 및 효모 추출액 0.05 kg을 첨가한 후에 121 ℃에서 15 내지 30 분 동안 고온 및 고압으로 멸균한 후에 실온에서 냉각시켰다. 그리고 류코노스톡 홀잡펠리 Ceb-kc-003 균주를 무균 상태에서 0.2 내지 0.4 L 접종한 후에 35 ℃ 내외에서 2 내지 3 일간 배양하여 류코노스톡 홀잡펠리 배양액을 제조하였다.

실시예 3: 류코노스톡 홀잡펠리 균주의 간 기능 개선 효과 확인

류코노스톡 홀잡펠리 균주의 간 기능 개선 효과를 확인하기 위하여, 총 20 명(남성 8 명 및 여성 12 명)의 지원자를 모집하였으며, 지원자 평균 연령은 32.0 ± 5.4세였으며, 남성의 평균 연령은 31.8 ± 3.6세(26세 내지 37세) 였으며, 여성의 평균 연령은 32.2 ± 6.3세(21세 내지 47세)였다. 대상자들에게는 류코노스톡 홀잡펠리 Ceb-kc-003 균주 배양액을 1 X 10⁶ 내지 1 X 10⁸ CFU(colony forming unit)/mL이 되도록 총 4 주간 1일 2회 매일 경구 투여하였다. 그리고 실시예 1과 동일한 방법으로 임상시험 시작 당일(섭취 전)과 4주 후(섭취 후)에 지원자의 혈청을 채취하고, 혈청 내에 포함되어 있는 연쇄상구균의 변화를 확인하였다. 그 결과는 도 2 및 표 3에 나타내었다.

	섭취전		섭취후		p value
Streptococcus	0.0302	0.0332	0.0626	0.0396	< 0.05

도 2 및 표 3에 나타난 바와 같이, 류코노스톡 균주 섭취 후에 연쇄상구균의 수가 유의성있게 증가되어 있는 것을 확인하였다.

또한, 추가적으로 간 기능 개선 효과를 확인하기 위하여 혈액 내의 간 관련 질병의 지표인 아스파르테이트아미노 전달효소(aspartate aminotransferase; AST)의 수치를 확인하였다. 아스파르테이트아미노 전달효소는 간 세포(hepatocyte)에 존재하며, 세포가 괴사되면 혈중으로 유출되어 혈액 내의 수치가 증가되게 된다. 그 결과는 도 3에 나타내었다.

도 3에 나타난 바와 같이, 아스파르테이트아미노 전달효소의 수치가 섭취 전에는 34.4 ± 22.8 IU/L였는데, 섭취 후에는 21.7 ± 8.2 IU/L로 유의성있게 감소된 것을 확인하였다. 상기 결과를 통하여, 류코노스톡 균주의 섭취를 통하여 간 세포 사멸을 감소시킬 수 있으며, 이를 통하여, 간 관련 질병을 예방할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.

또한, 상기 류코노스톡 홀잡펠리 균주 이외에 추가로 류코노스톡 메센테로이데스 KCCM11827P, 락토바실러스 사케이 KCCM11841P, 엔테로코커스 페시움 KCCM11909P, 브레비바실러스 레우스제리 KCCM11911P, 및 락토바실러스 퍼멘텀 KCCM11910P를 포함하는 혼합 균주 배양액을 동일하게 지원자 20 명에게 4 주간 1 일 2 회 경구투여하고, 혈청 내에 포함되어 있는 세균의 변화를 확인하였다. 그 결과, 류코노스톡 홀잡펠리 균주의 단독 투여 시와 비교하여 혈청 내의 포도상구균의 수가 좀더 증가된 것을 확인할 수 있었다.

실시예 4: 류코노스톡 홀잡펠리 배양액 유래 소포의 항염증 효과 확인

4.1. 류코노스톡 홀잡펠리 배양액 유래 소포의 세포 독성 확인

류코노스톡 홀잡펠리 배양액 유래 소포의 세포 독성을 확인하기 위하여, 실시예 2와 동일한 방법으로 준비된 류코노스톡 홀잡펠리 Ceb-kc-003 균주 배양액을 준비하였다. 그리고 공극 크기가 0.45 μm인 Bottle Top Vacuum Filter(Corning)를 이용하여 배양액으로부터 세포가 제거된 상층액을 획득하였다. 획득된 상층액은 다시 0.22 μm Bottle Top Vacuum Filter(Corning)를 통과시켜 상층액에 남아있는 세포의 잔여물은 제거하고, 류코노스톡 홀잡펠리 배양액 유래 소포를 분리하였다. 분리된 소포는 인산염완충용액을 이용하여 0.01, 0.1, 1, 및 10 μg/mL의 농도로 제조한 후에 마우스 복강대식세포(Raw264.7)에 처리하고 12 시간 동안 배양한 후에 세포 생존율(cell viability)을 측정하였다. 세포 생존율은 배양된 세포를 트리판 블루로 염색한 후에 Neubauer chamber를 이용하여 살아있는 세포의 수를 측정하고, 음성 대조군의 살아있는 세포 수에 대한 백분율로서 세포 생존율을 계산하였다. 음성 대조군(negative control; NC)으로는 인산염완충용액을 첨가하고 배양하였으며, 양성 대조군(positive control; PC)으로는 대장균(Escherichia coli) 유래 소포(E. coli EV) 1 μg/mL를 첨가하고 배양하였다. 소포를 분리하기 위해서는, 대장균을 LB(Luria-Bertani) 배지에 접종하고 37 ℃에서 200 rpm으로 24 시간 동안 배양하였다. 그리고 공극 크기가 0.45 μm인 Bottle Top Vacuum Filter(Corning)를 이용하여 세포가 제거된 상층액을 획득하였다. 획득된 상층액은 다시 0.22 μm Bottle Top Vacuum Filter(Corning)를 통과시켜 상층액에 남아있는 세포의 잔여물은 제거하고, 대장균의 소포를 분리하여 준비하였다. 그 결과는 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타난 바와 같이, 류코노스톡 홀잡펠리 배양액 유래 소포는 고농도에서도 세포 독성을 나타내지 않아, 안정적으로 사용할 수 있다는 것을 확인하였다.

4.2. 류코노스톡 홀잡펠리 유래 소포의 염증반응 유도 확인

류코노스톡 홀잡펠리 배양액 유래 소포가 세포의 염증반응을 유도하는지 확인하기 위하여, 실시예 4.1과 동일한 방법으로 준비된 류코노스톡 홀잡펠리 배양액 유래 소포를 인산염완충용액을 이용하여 0.01, 0.1, 1, 및 10 μg/mL의 농도로 제조한 후에 Raw264.7 세포주에 처리하고 12 시간 동안 배양한 후에 염증성 사이토카인인 IL-6 및 TNF-α의 분비량를 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)를 이용하여 확인하였다. 음성 대조군으로는 인산염완충용액을 첨가하고 배양하였으며, 양성 대조군으로는 대장균 유래 소포(E. coli EV) 1 μg/mL를 첨가하고 배양하였다. 그 결과는 도 5에 나타내었다.

도 5에 나타난 바와 같이, 양성 대조군인 대장균 유래 소포는 Raw264.7 세포주의 염증성 사이토카인의 분비량을 현저히 증가시켰으나, 류코노스톡 홀잡펠리 배양액 유래 소포의 경우에는 10 μg/mL의 고농도로 처리한 경우에만 약간 증가되는 것을 확인하였다.

4.3. 류코노스톡 홀잡펠리 유래 소포의 항염증 효과 확인

류코노스톡 홀잡펠리 배양액 유래 소포의 항염증 효과를 확인하기 위하여, 실시예 4.1과 동일한 방법으로 준비된 류코노스톡 홀잡펠리 배양액 유래 소포를 인산염완충용액을 이용하여 0.01, 0.1, 1, 및 10 μg/mL의 농도로 제조하여 Raw264.7 세포주에 처리하고 12 시간 동안 배양한 후에, 대장균 유래 소포를 1 μg/mL의 농도로 추가로 처리하고 6시간 동안 배양하고 IL-6 및 TNF-α의 분비량를 ELISA를 이용하여 확인하였다. 대조군(Cont)으로는 기존에 항염증 효과를 나타낸다고 알려져 있는 Lactococcus plantarum 유래 소포 1 μg/mL를 이용하여 동일한 방법으로 실험을 진행하였다. 그 결과는 도 6에 나타내었다.

도 6에 나타난 바와 같이, 류코노스톡 홀잡펠리 배양액 유래 소포의 전처리는 염증성 반응을 효과적으로 예방 및 억제할 수 있다는 것을 확인하였다.

상기 결과들을 통하여, 본 발명의 류코노스톡 홀잡펠리 균주는 세포 독성을 나타내지 않으므로 안정적으로 사용가능할 뿐만 아니라, 간 기능 개선 효과를 통하여 관련 질병의 유발을 효과적으로 예방 또는 억제할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 류코노스톡 홀잡펠리 균주, 배양액, 또는 배양액 유래 소포의 섭취는 간의 염증 유발을 효과적으로 예방할 수 있으므로, 간염, 간경변, 간암 등의 염증성 간질환의 발병률을 현저히 낮출 수 있다는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 류코노스톡 홀잡펠리 균주 외에 기존에 알려져 있는 다른 효능을 가진 물질, 화합물, 균주 등의 혼합을 통하여 좀더 개선된 효과를 획득할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.

상기 진술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

<110> MD Healthcare Inc. CoenBio Co.,LTD <120> A composition for improving liver function comprising genus Leuconostoc <130> MP18-104 <150> KR 10-2018-0070289 <151> 2018-06-19 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 16S_V3_F <400> 1 tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cagcctacgg gnggcwgcag 50 <210> 2 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 16S_V4_R <400> 2 gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acaggactac hvgggtatct aatcc 55

Claims

류코노스톡 홀잡펠리(Leuconostoc holzapfelii) Ceb-kc-003 (KCCM11830P) 균주, 이의 배양액, 이의 농축물, 이의 소포(extracellular vesicle), 또는 이의 건조물을 포함하는, 간 기능 개선용 식품 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 배양액은 류코노스톡 홀잡펠리 Ceb-kc-003 (KCCM11830P) 유래 소포(extracellular vesicle)를 포함하는 것을 특징으로 하는, 식품 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 조성물은 간염, 간암, 간경변, 또는 간부전의 예방 효과를 가지는 것을 특징으로 하는, 식품 조성물.
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제 1 항에 있어서,
상기 조성물은 류코노스톡(Leuconostoc) 속, 락토바실러스(Lactobacillus) 속, 엔테로코커스(Enterococcus) 속, 브레비바실러스(Brevibacillus) 속, 락토코코스(Lactococcus) 속, 프로피오니박티륨(Propionibacterium) 속, 또는 비피도박테륨(Bifidobacterium) 속의 균주를 추가로 포함하는, 식품 조성물.
류코노스톡 홀잡펠리(Leuconostoc holzapfelii) Ceb-kc-003 (KCCM11830P) 균주, 이의 배양액, 이의 농축물, 이의 소포(extracellular vesicle), 또는 이의 건조물을 포함하는, 간 관련 질병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서,
상기 간 관련 질병은 간염, 간암, 간경변, 또는 간부전인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
제 7 항에 있어서,
상기 배양액은 류코노스톡 홀잡펠리 Ceb-kc-003 (KCCM11830P) 유래 소포(extracellular vesicle)를 포함하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
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