KR101128002B1

KR101128002B1 - 갈근탕 또는 갈근탕 유산균 발효물을 유효성분으로 함유하는 간 독성 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR101128002B1
Application number: KR1020090088617A
Authority: KR
Inventors: 마진열; 이재훈; 엄영란; 이지혜
Original assignee: 한국 한의학 연구원
Priority date: 2009-09-18
Filing date: 2009-09-18
Publication date: 2012-03-29
Also published as: US9549961B2; WO2011034225A1; CN102639138A; US20130287761A1; CN102639138B; US20120183526A1; KR20110030939A

Abstract

본 발명은 갈근탕 유산균 발효물, 및 상기 발효물 또는 갈근탕을 유효성분으로 함유하는 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 갈근탕에 유산균을 접종, 배양, 발효시켜 제조한 갈근탕 유산균 발효물 및 상기 발효물 또는 갈근탕을 함유하는 간 독성 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 간 독성을 치료하는 효과가 있으므로 간 기능 회복제 또는 간 기능 회복용 건강식품으로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

갈근탕 또는 갈근탕 유산균 발효물을 유효성분으로 함유하는 간 독성 예방 또는 치료용 조성물{Composition for prevention or treatment of liver toxicity comprising Galgeuntang or lactic acid bacteria fermented Galgeuntang}

본 발명은 갈근탕 유산균 발효물 및 상기 발효물 또는 갈근탕 자체를 유효성분으로 함유하는 간 독성 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

갈근탕은 갈근, 마황, 생강, 대추, 감초, 작약 및 계지를 포함하는 생약을 달여 마시는 한의학 처방의 하나로, 목과 등허리가 당기고 오슬오슬 춥고, 땀이 나지 않고 바람기가 싫은 감기 증세가 나타나며, 추위를 싫어하고 열이 나며 충혈 증세가 있고, 땀이 나지 않고 몸과 등이 뻣뻣한 감기에, 또한 눈, 귀, 코에 염증이 있을 때나 두드러기, 천식 등의 증세에 처방된다.

한편, 한약재에 미생물을 첨가하여 발효시켜 인간에 유용한 물질을 얻는 기술로는 한약재의 중탕 착즙액에 성장이 좋고 풍미가 우수한 유산균을 선발하여 혼합 배양, 발효시킴으로써 정장작용의 시너지 효과를 얻는 기술 (대한민국 등록특허 제185619호), 곡물과 한약재 일부를 선별하여 발효한 메주콩을 이용하여 저온 속성 기법으로 원료 전부를 발효시켜 각 원료가 소유하고 있는 고유성질을 그대로 유지 하고 효과를 배가시킨 기술 (대한민국 공개특허 제2004-0078030호) 등의 예가 있으나 갈근탕 발효 약재와 관련하여 알려진 문헌은 없는 실정이다.

이에, 본 발명자들은 랫트에 사염화탄소를 처리하여 간 독성을 유발한 후, 본 발명의 갈근탕 유산균 발효물 또는 갈근탕 자체를 투여하여 간 독성이 치료됨을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 갈근탕 유산균 발효물 및 상기 발효물을 유효성분으로 함유하는 간 독성 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 우선, 갈근, 마황, 생강, 대추, 감초, 작약 및 계지를 포함하는 생약을 혼합하여 열수 추출한 갈근탕에 유산균을 접종하여 발효시킴으로써 제조되는 갈근탕 유산균 발효물을 제공한다.

상기 갈근탕은 갈근 12 중량부에 대하여, 마황 2 내지 10 중량부, 생강 2 내지 10 중량부, 대추 2 내지 10 중량부, 감초 1 내지 7 중량부, 작약 1 내지 7 중량부 및 계지 1 내지 7 중량부를 혼합하여 제조된다.

상기 유산균은 비피도박테리움, 락토바실러스, 스트렙토코커스, 류코노스톡, 페디오코카스 및 락토코커스 속의 미생물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하며, 비피도박테리움 속의 미생물인 것이 더욱 바람직하다.

본 발명은 또한

갈근, 마황, 생강, 대추, 감초, 작약 및 계지를 포함하는 생약을 혼합하여 열수 추출함으로써 갈근탕을 제조하는 단계;

배지에 접종하여 배양된 유산균 균사체 배양액을 상기에서 제조된 갈근탕에 접종하는 단계;

상기에서 얻어진 갈근탕 배양액을 혐기 배양하며 액체 발효하는 단계를 포함 하는 상기 갈근탕 유산균 발효물의 제조방법을 제공한다.

상기 제조방법에 있어서, 갈근탕을 제조한 후, 유산균 균사체 배양액을 접종하기 전에 갈근탕의 pH를 6~8로 조정하는 단계를 추가로 포함하는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명에서는 갈근탕 및 갈근탕 유산균 발효물 중 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 간 독성 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

상기 갈근탕은 전술한 바와 같이, 갈근, 마황, 생강, 대추, 감초, 작약 및 계지를 포함하는 생약을 혼합하여 열수 추출한 것이며, 갈근탕 유산균 발효물 역시 전술한 바와 같이 제조된 유산균 발효물인 조성물인 것이 바람직하다.

상기 조성물은 손상된 간에서 AST (aspartate aminotransferase), ALT (alanine aminotransferase) 및 LDH (lactate dehydrogenase)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 효소의 활성을 낮추는 것이다.

또한, 본 발명은 갈근탕 및 갈근탕 유산균 발효물 중 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 간 기능 회복용 건강식품을 제공한다.

본 발명의 바람직한 실시예에서는 대표적인 간 독성 유발물질인 사염화탄소를 랫트에 처리한 후 일반 갈근탕 및 본 발명의 갈근탕 유산균 발효물을 투여하여 랫트의 상태를 살펴보았다.

그 결과, 갈근탕 또는 유산균 발효갈근탕 투여에 의해 어떠한 독성 증상도 관찰되지 않았다.

이어서, 본 발명자들은 상기 투여방법에 따라 사염화탄소 처리 후 AST, ALT 및 LDH의 활성도를 측정한 결과, 사염화탄소 투여시 증가된 상기 효소의 활성이 갈근탕 유산균 발효물 투여에 의해 감소됨을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 갈근탕 유산균 발효물은 간 독성 치료효과를 나타냄을 확인하였다.

본 발명의 조성물은 갈근탕 유산균 발효물을 유효성분으로 함유하고 갈근탕 유산균 발효물은 임상 투여시에 경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다. 바람직한 약제학적 제제는 정제, 경질 또는 연질 캡슐제, 액제, 현탁제 등과 같은 경구투여용 제제가 있으며 이들 약제학적 제제는 약제학적으로 허용 가능한 통상의 담체, 예를 들어 경구투여용 제제의 경우에는 부형제, 결합제, 붕해제, 활택제, 가용화제, 현탁화제, 보존제 또는 증량제 등을 사용하여 조제할 수 있다.

본 발명의 조성물에서, 갈근탕 유산균 발효물의 투여용량은 환자의 상태, 연령, 성별 및 합병증 등의 다양한 요인에 따라 결정될 수 있지만 일반적으로는 성인 1kg/day 당 1 내지 40 ㎖, 바람직하게는 10 내지 30 ㎖의 용량으로 투여될 수 있다. 또, 단위 제형당 상기 갈근탕 유산균 발효물의 1일 용량 또는 이의 1/2, 1/3 또는 1/4의 용량이 함유되도록 하며, 하루 1 내지 6회 투여될 수 있다. 그러나 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있음은 확실하다.

아울러, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 간 기능 회복용 건강식품을 제공 한다.

본 발명의 갈근탕 유산균 발효물을 식품으로 사용할 경우, 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용되고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합량은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 갈근탕 유산균 발효물을 식품 또는 음료의 제조시에 원료에 대하여 5 내지 30 중량%, 바람직하게는 10 내지 20 중량%의 양으로 첨가할 수 있다. 건강식품 내의 갈근탕 유산균 발효물의 유효용량은 상기 약학적 조성물의 유효용량에 준해서 사용할 수 있으나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있음은 확실하고 건강식품의 종류에는 특별한 제한은 없다.

본 발명의 조성물은 간 독성을 치료하는 효과가 있으므로 간 기능 회복제 또는 간 기능 회복용 건강식품으로 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예 등에 의해 상세히 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 내용을 한정하는 것은 아니다.

제조예 1. 갈근탕의 제조

갈근 120g, 마황 60g, 생강 60g, 대추 60g, 감초 40g, 작약 40g 및 계지 40g 을 열수 추출하여 갈근탕을 제조하였다.

실시예 1. 갈근탕 유산균 발효물의 제조

<1> 유산균분양

한국식품연구원 (Korea Food Research Institute: KFRI) 식품미생물 유전자은행에서 비피도박테리움 브레브 (Bifidobacterium breve, KFRI 744, ATCC 15700)를 분양받아 실험에 이용하였다.

<2> 유산균 종균배양

위의 분양받은 균주는 사면 배지와 액체 배지에서 계대하여 실험에 이용하였다. 유산균을 사면 배지에 접종하여 37℃ 인큐베이터에서 24시간 배양하여 균의 콜로니가 형성되면 파라핀 필름으로 산소를 차단하여 냉장실에서 보존하고, 균의 활성이 떨어지거나 잡균의 오염이 염려되므로 2~3주에 한 번씩 새로운 사면 한천 배지에 이식시켰다. 액체 배지에 접종하여 37℃ 인큐베이터에서 24시간 배양하였다.

종균배양에 사용된 배지는 RCM (Reinforced Clostridial Medium: 10 g/L Bacto-tryptose, 10 g/L Bacto-beef extract, 3 g/L Bacto-yeast extract, 5 g/L Bacto-dextrose, 5 g/L Sodium chloride, 1 g/L Soluble starch, 0.5 g/L L-cystein hydrochloride, 3 g/L Sodium acetate, 0.5 g/L Bacto-agar, pH 7.6) 또는 Gam broth 이다.

<3> 유산균을 이용한 갈근탕 액체 발효

1 M NaOH로 상기 제조예 1에서 제조한 갈근탕의 pH를 7.0으로 조정한 후, 121℃, 1.5 기압에서 15분간 가압멸균 후, 상온까지 냉각시킨 후 유산균을 접종 37℃의 항온실에서 48시간 동안 혐기 배양하며 액체 발효하였다. 이때 접종량은 1%(v/v)로 하여 실험하였으며 48시간 발효 후 pH의 변화를 관찰하였다.

비피도박테리아를 이용한 채소와 곡물류 등의 발효에서 낮은 pH로 인해 토마토에서는 발효 후 균 증식을 관찰할 수 없었으나 pH 7.2로 조정했을 때 균수 증식이 되었음을 언급된 바 있다. 따라서, 본 실험에서는 pH가 조정되지 않은 상태의 갈근탕의 pH가 4.9 정도로 낮았기 때문에 1 M NaOH 용액을 이용하여 갈근탕의 pH를 높게 조정하여 발효에 사용하였다. 갈근탕을 1 M NaOH 용액으로 pH 7.0으로 조정하여 멸균하였을 때, 발효 전 대조구의 pH가 7.0에서 5.9까지 낮아졌다. 이것은 121℃, 1.5 기압에서 15분간 멸균되는 고온?고압 조건에서 갈근탕에 존재하는 식이 섬유 성분들이 일부 유기산으로 분해되어 pH가 저하하는 것으로 추정되었다. KFRI 744 (B. breve) 균주를 pH 조정된 갈근탕에 접종하여 48시간 후 pH의 변화를 관찰한 결과 발효에 의해 갈근탕의 pH가 4.3으로 내려가는 등의 활발한 산 생산능력을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.

<4> 발효 대사산물의 분석

1) HPLC 분석용 시료준비

원심분리기를 이용하여 발효 갈근탕의 잔사를 제거하고 0.45 ㎛ 필터를 이용하여 여과한 후 HPLC 분석을 실시하였다.

2) HPLC에 의한 대사물질 분석

갈근탕의 발효 전?후에 유산균에 의해 대사되는 물질의 변화를 분석하기 위하여 HPLC를 이용하여 발효 전?후의 성분 변화를 비교 분석하였다.

HPLC를 이용한 발효 갈근탕의 대사물질 분석은 아래와 같은 조건에 따라 분석하였다.

갈근탕 발효 대사물 분석을 위한 HPLC 시스템의 운용 조건

칼럼: 역-상 칼럼 (C₁₈, 250×4.6 mm, 5 ㎛)

검출기: UV 254 nm

용매: A; 물, B; 아세토니트릴

런 타임: 70분

주입 부피: 20 ㎕

유속: 1.0 ㎖/분

칼럼 온도: 30℃

농도 구배표는 하기 표 1과 같다.

시간 (분)	A/B
0	85/15
10	85/15
50	65/35
55	20/80
58	20/80
63	80/20
70	85/15

그 결과, 도 1에서 볼 수 있듯이 유산균에 의해 발효된 갈근탕의 경우 (도 1 (B)) 발효되지 않은 갈근탕 (도 1 (A))과 비교 시 38.2분 위치의 피크가 발효에 의해 6.4배 증가함을 확인할 수 있었다. 갈근탕의 주요 지표물질 중 하나인 다이드진 (daidzin, 24.3분)은 모든 시료에서 검출됨을 확인할 수 있었다.

[실험예 1] 간 독성 치료 효과 확인

<1> 실험 동물

(주)오리엔트 (서울시 금천구 가산동 459-24)로부터 8주령 수컷 랫트를 입수하여, 한국한의학연구원 동물실에서 2주간 검역?순화하였다. 그 중 건강한 동물을 골라 실험에 사용하였다.

<2> 투여량 설정

본 시험은 한방 처방 갈근탕, 유산균 발효 갈근탕에 의한 간 보호 효과를 검색하기 위하여, 사염화탄소 (CCl₄) 처리 24시간 후에 간의 손상 정도를 검색하는 것이다. 투여 용량은 임상 1일 섭취량 (3회, 3첩) 15 ㎖/㎏을 기준으로 갈근탕을 설정하고, 발효갈근탕은 7.5, 15 및 30 ㎖/㎏로 선정하였다.

<3> 군 분리 및 동물 식별

동물의 군 분리는 다음과 같이 실시하였다. 우선, 순화기간 중 건강하다고 판정된 랫트의 체중을 측정한 후 5 g 간격으로 구분하여 각각의 평균 체중에 가까운 동물을 각각 60마리를 선택하였다. 이렇게 선택된 60마리를 각 군에 10마리씩 균등한 체중으로 분배되도록 순위화한 체중과 난수를 이용한 무작위법으로 분배하였다 (표 2 참조). 랫트의 개체식별은 피모의 색소염색법과 개체식별카드 표시법으로 실시하였다.

<4> 통계학적 방법

본 실험에 있어서, 음성 대조군과 시험물질 투여군 사이의 통계학적 유의차는 던넷 테스트 (Dunnett test)에 의하여 평균과 표준편차를 구하고 통계처리 (*p<0.05, **p<0.01) 하였다.

<5> 간 독성 치료 및 예방 효과

사염화탄소 (CCl₄)는 대표적인 간 독성 유발물질로서 간에 대한 독성 연구를 하는데 널리 사용되고 있다. 사염화탄소의 간 독성 기작은 사염화탄소가 간에서 대사되어 CCl₃와 Cl 프리 라디칼을 형성하여 이 프리 라디칼이 세포막의 불포화 지방산에 작용하여 지질 과산화 (lipid peroxidation)를 일으킨다고 알려져 있다.

갈근탕 및 유산균 발효 갈근탕의 간 보호 효능을 평가하기 위하여 간 독성 유발 30분 전에 갈근탕 또는 유산균 발효 갈근탕을 투여하여 각각의 처치군으로 설정하였다.

SD (rat) 수컷에 사염화탄소 (1.0 ㎖/㎏)를 복강주사하여 간 독성을 유발하였으며, 24시간 후에 혈액을 채취하여 AST, ALT 및 LDH 활성도를 각각 측정하였다. 방혈후 간의 무게 및 혈구 검사를 실시하였으며 간조직을 형태학적으로 관찰하였다.

그 결과, 모든 실험군에서 사망 동물도 관찰되지 않았으며 (표 3 참조), 갈근탕 및 유산균 발효 갈근탕 투여에 의한 어떠한 독성 증상도 관찰되지 않았다 (표 4 참조).

<6> 혈구 검사

혈액학적 검사는 WBC, RBC, HGB, HCT, PLT를 EDTA-2K로 처리후, 자동측정 장치 (JT Counter, Coulter Co., Miami, USA)를 이용하여 측정하였다.

실험동물 SD (랫트)를 16시간 절식시킨 후, 시험물질 갈근탕 1일 임상용량 (15 ㎖/㎏) 및 발효 갈근탕 7.5, 15 및 30 ㎖/㎏ 용량으로 경구투여 한다. 시험물질 투여 30분 후 사염화탄소 (1.0 ㎖/㎏/day)를 1회 복강주사한 후, 24시간 지난 다음 혈액을 채취하여 혈구를 분석하였다. 분석 결과, 시험물질에 의한 혈구의 이상 변화는 관찰되지 않았다. GFT₂군의 적혈구 감소 및 GFT₃군 혈소판 증가는 정상범위 내의 변화이므로 시험물질에 의한 변화로 생각되지 않는다 (표 5 참조).

<7> 혈액 생화학 검사

사염화탄소로 간 손상을 유발하고 시험물질 갈근탕 (15 ㎖/㎏) 및 발효 갈근탕 (7.5, 15 및 30 ㎖/㎏)을 경구투여 한다. 시험물질 투여 30분후 사염화탄소 (1.0 ㎖/㎏/day)를 1회 복강주사한 후, 24시간 지난 다음 간 기능 손상 정도를 평가하였다.

혈액 생화학적 분석은 후대정맥에서 5 ㎖의 혈액을 채취하였으며 실온에서 응고시킨 후, 냉장 고속 원심분리기 (Avanti 30, Beckman Co., USA)를 사용하여 5000 rpm으로 10분간 원심 분리하였다. 생화학 분석기 (Advia 1650, Shimaz Co., Japan)를 이용하여 AST, ALT 및 LDH의 함량을 측정하였다.

측정 결과를 표 6 및 도 2에 나타내었다. 이에 따르면, 음성 대조군의 AST 활성은 1648.0 IU/L로 정상군 (175.2 IU/L)에 비해 940.6% 증가하였고, 음성 대조군에 비해 GGT군 57.6%, GFT₁군 81.9%, GFT₂군 51.9% 및 GFT₃군 37.5%로 각각 나타났다. 따라서 SD (랫트)에서 사염화탄소 처리시 혈장내 AST 함량은 약 9.4배 정도 증가하는 것으로 나타났으며 여기에 갈근탕 및 발효 갈근탕 (Bifidobacterium breve) 경구투여시, 발효 갈근탕은 복용량 의존적 (Dose dependent)으로 감소되었다. 또한, GGT (p<0.05), GFT₁ (p<0.05), GFT₂ (p<0.05) 및 GFT₃ (p<0.01)군은 통계적으로 유의한 차이가 나타났다.

ALT는 정상군이 37.5 IU/L이며 음성대조군은 583.11 IU/L로 1,554.9% 증가하였다. 그러나 사염화탄소 처리후 갈근탕 및 유산균 발효 갈근탕 투여시 ALT 농도의 변화는 음성대조군에 비해 GGT군 54.8%, GFT₁군 90.6%, GFT₂군 41.9% 및 GFT₃군 35.4%로 ALT량은 각각 감소되었다. 또한, GFT2 (p<0.05) 및 GFT₃ (p<0.05)군은 통계적으로 유의한 차이가 나타났다.

갈근탕 및 유산균 발효 갈근탕 투여군의 혈장내 LDH 양은, 정상군에 비해 사염화탄소 처리시 2.04배 증가하였다. 사염화탄소가 처리된 실험동물에 유산균 발효 갈근탕 등을 경구투여시, GGT군 69.1%, GFT₁군 74.6%, GFT₂군 71.3% 및 GFT₃군 54.6%로 각각 감소되었다. 또한, GGT (p<0.05), GFT₁ (p<0.05), GFT₂ (p<0.05) 및 GFT₃ (p<0.01)군은 통계적으로 유의한 차이가 나타났다.

<8> 간의 장기 중량 및 조직 소견

실험동물 SD (랫트, 수컷)을 완전히 방혈한 후, 간의 무게를 측정하였다. 간의 중간엽 중심부를 트레밍하여 10% 중성 포르말린에 고정하였으며 H&E 염색 후 조직을 형태학적으로 관찰하였다.

구체적으로, 사염화탄소로 간 손상을 유발하고 부검시 체중을 측정하고, 부검시 완전히 방혈한 후 간 장기를 적출하여 간의 무게를 측정하여 그 결과를 표 7 및 도 3에 나타내었다. 이에 따르면, 사염화탄소 처리시 체중이 통계적으로 유의성 있게 감소되었다. 그러나 갈근탕 및 발효 갈근탕 투여시 NCT군에 비해 통계적으로 유의하게 증가하였다 (p<0.01).

간의 무게는 체중 백분율로 환산하여 분석해 본 결과, 대조군에 비해 사염화탄소 처리군에서 유의성 (p<0.01) 있게 증가하였으며 이에 발효 갈근탕 (30 ㎖/㎏) 경구투여시 감소 (p<0.05)되는 것을 알 수 있었다.

상기와 같은 체중 및 간의 무게 변화를 분석한 결과, 갈근탕과 발효 갈근탕은 사염화탄소 처리 후 간의 염증을 완화시키는 물질로 작용하는 것으로 판단된다.

[실험예 2] 간 조직에 대한 조직 병리학적 검사

본 시험은 SD 랫트에 사염화탄소 투여로 유발된 간 독성 모델에서 시험물질에 따른 조직병리학적 완화 여부를 알아보고자 수행하였다. 검체는 총 30 마리 수컷 랫트의 간으로 10% 중성 완충 포르말린 용액에 고정하여 검사되었다. 시험군은 정상 대조군을 포함하여 총 6개 군으로 하기 표 8과 같다.

본 검사는 사염화탄소를 처리한 동물에서 나타나는 간세포의 소엽중심성괴사 (centrilobular necrosis), 괴사부위 주변 간세포의 공포변성 (vacuolar degeneration) 및 염증세포침윤 (inflammatory cells infiltration)을 기준으로 각 동물을 평가하였다. 그리고 시험군의 완화 정도를 비교하기 위하여 각 군의 소견마다 평점을 계산하였다.

조직병리학적 검사 결과, CON군에서는 모든 동물의 간에서 주목할만한 병변을 확인하지 못하였으나 (도 4 참조), 그 외 다른 군에서는 사염화탄소 처리에 의한 소견이 다양하게 관찰되었다. NCT군에서는 다른 군에 비하여 소엽중심성괴사 (N) 및 공포변성 (←)의 정도가 가장 심하게 관찰되었으며, 염증세포침윤 (▲) (도 5 참조).

갈근탕 관련 시험군 (GGT, GFT₁, GFT₂ 및 GFT₃) 또한 소엽중심성괴사 및 공포변성은 NCT군에 비해 전반적으로 낮게 관찰되었으나, GGT군의 염증세포침윤은 NCT군에 비해 다소 높았다. 병변의 정도는 GGT 및 GFT₁군에서 서로 유사한 수준으로 감소하였으며 (도 6 및 도 7 참조), GFT₂군에서는 보다 낮은 정도로 관찰되었다 (도 8 참조). GFT₃군은 중등도의 염증세포침윤 1예를 제외하면 모두 경도 이하로만 관찰되어 갈근탕 관련 시험군 중에서 NCT군과 가장 큰 차이를 보였다 (도 9 참조).

도 4 내지 도 9를 참조로 계산한 각 군의 평점을 하기 표 9에 나타내었다. 평점 계산시 소견 중 +는 최소, ++는 가벼움, +++는 중간 정도, ++++는 현저함을 나타낸다.

사염화탄소로 유발된 랫트의 간 조직에서 시험물질의 효능을 평가하기 위하여 조직병리학적인 검사를 실시하여 군간 결과를 비교하였다.

본 검사 결과, 사염화탄소를 투여한 시험군에서는 기존에 알려진 사염화탄소 투여에 의한 조직병리학적 변화를 확인할 수 있었다^1-3). 사염화탄소에 의한 병변은 조직학적으로 간의 중심정맥 (CV; central vein) 주변의 간세포에 주로 형성되어 있었으며, 본 시험에서는 괴사에 비하여 공포변성이 보다 현저하게 관찰되는 경향을 나타내었다. 또한, NCT군에서도 사염화탄소로 유발된 독성 병변이 동물마다 일정하지 않아 각 동물별로 병변의 완화 여부를 비교하기에는 무리가 있었다. 따라서 각 군에 해당하는 동물의 병변 형성 정도를 합산하여 평균한 후, 본 수치를 기준으로 전반적인 완화 경향을 비교할 수 있었다.

평점 계산 결과는 CON < GFT₃ < GFT₂ < GFT₁ < GGT < NCT 의 순서로 나타나, 본 시험에서 사염화탄소로 유발된 독성 병변에 대한 완화 정도는 대체로 시험물질인 발효갈근탕의 용량이 증가할수록 높아지는 것으로 판단되었다. 시험물질의 고용량 투여군이라도 병변이 완전히 개선되지 않았고 간소엽을 중심으로 세포질내 미세한 원형의 공포를 함유하고 있었으나, 전반적인 소견은 고용량군에서 가장 적게 관찰되었음을 확인하였다. 본 군에서 추가적으로 관찰된 세포질내 미세공포는 병변이 완화되는 경향에 대한 일련의 반응인지 시험물질의 고용량 투여에 의한 다른 반응인지 다른 실험의 결과 및 추가적인 시험을 수행하여 종합적으로 판단하는 것이 보다 정확할 것으로 사료된다.

본 시험에서는 사염화탄소를 투여한 동물 중, 간의 장막 (serosa)에 섬유소 및 염증세포의 침윤과 인접한 간세포의 괴사가 관찰되기도 하였다. 본 병변과 관련하여 시험물질의 투여와 관련된 정보가 없으므로 정확한 판단에는 한계가 있었으며, 시험물질의 복강내주사 (intraperitoneal injection) 여부가 본 병변과 관련이 있을 것으로 추정하였다.

위의 검사 결과를 토대로, 본 시험에서 사염화탄소에 의한 독성 병변이 가장 현저한 군은 NCT군이었으며, 시험물질 투여에 따른 병변의 완화가 가장 현저한 군은 GFT₃군인 것으로 확인되었다.

1) Hassan, N.S., Abbas, N.F., and Sharaf, H.A. (2003). Histopathological and histochemical studies on the taurine in preventing carbon tetrachloride-induced hepatic injury in the albino rat, Egypt. J. Hosp. Med., 10: 52-65

2) 김형춘, 박언섭, 유재형, 송계용. (1989). 만성 사염화탄소 및 에탄올 중독 간에서 Malotilate (Diisopropyl-1.3-dithiol-2-ylidene malonate)의 효과에 관한 혈청화학적 및 병리조직학적 관찰, 대한병리학회지, 23(2): 223-234.

3) Gopinath, C., Prentice, D.E., and Lewis, D.J. (2001). 독성병리학도감(강진석 외 역). 청구문화사.

이상의 실험결과에서 갈근탕 및 발효 갈근탕의 급성염증에 대한 효능을 검색하기 위하여, 본 연구에서는 실험동물 SD (래트)에 사염화탄소 처리 후, 급성간염을 유발하였으며 시험물질 갈근탕과 발효 갈근탕 (Bifidobacterium breve) 투여 후, 혈액생화학수치를 분석한 결과 AST, ALT 및 LDH의 혈장내 농도가 음성대조군 보다 현저히 감소하는 경향을 보였다. 특히 발효갈근탕은 농도 의존성이 관찰되었다. 그리고 사염화탄소에 의한 체중감소 및 간의 무게 증가의 변화를 시험물질이 감소시키는 것으로 나타났다. 시험물질 투여시, 간의 병리소견에서도 소엽중심성 괴사, 괴사부위 주변 간세포의 공포변성 및 염증세포침윤에 대한 개선 효과가 뚜렷이 확인되었다. 이는 갈근탕의 염증완화에 관련된 새로운 효능 발굴과 발효갈근탕이 생물 전환되어 생체내 흡수율이 증가하여 급성염증 완화에 그 효과가 더 발현된 것으로 사료된다.

<제제예 1> 약학적 조성물의 제조

<1-1> 연질 캡슐의 제조

실시예 1에서 제조된 갈근탕 유산균 발효물 100.0mg, 콩기름 175.0mg, 황납 45.0mg, 야자경화유 127.5mg, 대두인지질 21.0mg, 젤라틴 212.0mg, 글리세린 (비중 1.24) 50.0mg, 디-소르비톨 76.0mg, 파라옥시안식향산메칠 0.54mg, 파라옥시안식향산프로필 0.90mg, 메칠바닐린 0.56mg, 황색 203호 적량의 성분이 1 캡슐 중에 함유되도록 약전 제제 총칙 중 연질 캡슐의 제법에 따라 제조하였다.

<1-2> 정제의 제조

실시예 1에서 제조된 갈근탕 유산균 발효물 100.0mg, 옥수수전분 90.0mg, 유당 175.0mg, 엘-하이드록시프로필셀룰로오스 15.0mg, 폴리비닐피롤리돈90 5.0mg 및 에탄올 적량의 원료를 균질하게 혼합하여 습식과립법으로 과립화하고 스테아린산 마그네슘 1.8mg을 가하여 혼합한 후 1정이 400mg이 되도록 타정하였다.

<제제예 2> 건강식품의 제조

<2-1> 캡슐제의 제조

실시예 1에서 제조된 갈근탕 유산균 발효물 100.0mg, 옥수수전분 83.2mg, 유당 175.0mg 및 스테아린산 마그네슘 1.8mg의 원료를 균질하게 혼합하여 1 캡슐에 360mg이 함유되도록 충전하였다.

<2-2> 음료의 제조

실시예 1에서 제조된 갈근탕 유산균 발효물 0.48 ~ 1.28㎎, 꿀 522㎎, 치옥토산아미드 5㎎, 니코틴산아미드 10㎎, 염산리보플라빈나트륨 3㎎, 염산피리독신 2㎎, 이노시톨 30㎎, 오르트산 50㎎ 및 물 200㎖의 조성 및 함량으로 하여 통상적인 방법을 사용하여 음료를 제조하였다.

<2-3> 산제의 제조

실시예 1에서 제조된 갈근탕 유산균 발효물 2g 및 유당 1g을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.

도 1의 (A)는 갈근탕의 크로마토그램, (B)는 갈근탕 유산균 발효물의 그로마토그램이다.

도 2는 실험예 1의 <7> 혈액 생화학 검사 결과를 나타낸 그래프이다.

도 3은 실험예 1의 <8>에서 간의 중량을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.

도 4 내지 도 9는 실험예 2의 간 조직에 대한 조직 병리학적 검사 결과를 보여주는 사진이다.

부호의 설명

CV: 중심정맥

N: 소엽중심성괴사

← (화살표 모양): 공포변성

▲ (화살촉 모양): 염증세포침윤

Claims

갈근탕 및 갈근탕 유산균 발효물 중 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 간 독성 예방 또는 치료용 조성물.
청구항 1에 있어서,

갈근탕은 갈근, 마황, 생강, 대추, 감초, 작약 및 계지를 포함하는 생약을 혼합하여 열수 추출한 것을 특징으로 하는 조성물.
청구항 1에 있어서,

갈근탕은 갈근 12 중량부에 대하여, 마황 2 내지 10 중량부, 생강 2 내지 10 중량부, 대추 2 내지 10 중량부, 감초 1 내지 7 중량부, 작약 1 내지 7 중량부 및 계지 1 내지 7 중량부를 혼합하여 열수 추출한 것을 특징으로 하는 조성물.
청구항 1에 있어서,

갈근탕 유산균 발효물은 갈근탕에 유산균을 접종하여 발효시킴으로써 제조되는 것을 특징으로 하는 조성물.
청구항 1에 있어서,

유산균은 비피도박테리움, 락토바실러스, 스트렙토코커스, 류코노스톡, 페디오코카스 및 락토코커스 속의 미생물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
청구항 1에 있어서,

유산균은 비피도박테리움 속의 미생물인 것을 특징으로 하는 조성물.
청구항 1에 있어서,

갈근탕 유산균 발효물은 갈근, 마황, 생강, 대추, 감초, 작약 및 계지를 포함하는 생약을 혼합하여 열수 추출함으로써 갈근탕을 제조하는 단계;

배지에 접종하여 배양된 유산균 균사체 배양액을 상기에서 제조된 갈근탕에 접종하는 단계;

상기에서 얻어진 갈근탕 배양액을 혐기 배양하며 액체 발효하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조되는 것을 특징으로 하는 조성물.
청구항 7에 있어서,

갈근탕을 제조한 후, 유산균 균사체 배양액을 접종하기 전에 갈근탕의 pH를 6~8로 조정하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
청구항 1에 있어서,

상기 조성물은 손상된 간에서 AST (aspartate aminotransferase), ALT (alanine aminotransferase) 및 LDH (lactate dehydrogenase)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 효소의 활성을 낮추는 조성물.
갈근탕 및 갈근탕 유산균 발효물 중 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 간 기능 회복용 건강식품.
청구항 10에 있어서,

갈근탕은 갈근, 마황, 생강, 대추, 감초, 작약 및 계지를 포함하는 생약을 혼합하여 열수 추출한 것을 특징으로 하는 건강식품.
청구항 10에 있어서,

갈근탕 유산균 발효물은 갈근탕에 유산균을 접종하여 발효시킴으로써 제조되는 것을 특징으로 하는 건강식품.
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