WO2013032102A1 - 귀비탕 유산균 발효물 및 이의 용도 - Google Patents

귀비탕 유산균 발효물 및 이의 용도 Download PDF

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WO
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tang
lactic acid
acid bacteria
guibi
present
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마진열
이재훈
조원경
김태수
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한국한의학연구원
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    • A61K2236/10—Preparation or pretreatment of starting material
    • A61K2236/19—Preparation or pretreatment of starting material involving fermentation using yeast, bacteria or both; enzymatic treatment

Definitions

  • the present invention relates to a fermented lactic acid bacteria and its use, and more particularly, the present invention relates to a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of vascular diseases comprising the lactic acid bacteria fermented product of the Guibitang as an active ingredient, a vascular disease comprising the fermented products It relates to a preventive or improved health functional food and a method for preventing or treating vascular diseases using the composition.
  • Vascular disease refers to a disease caused by narrowing of blood vessels, and includes diseases caused by poor flow of gas and nutrients to tissues due to obstruction of blood flow by accumulation of blood clots or fats such as blood clots. .
  • the narrowing of blood vessels may include inflammation and necrosis of the arteries and sudden dense vasospasm.
  • Hypertension is the most frequent disease among chronic circulatory diseases, and it is estimated that about 15% of Korean adult population has hypertension.
  • Hypertension refers to an abnormally high pressure inside the aorta, and is often dangerous in itself, but it also includes coronary artery disease, sudden death, cerebral infarction and peripheral vascular disease, including malignant hypertension, heart failure, cerebral hemorrhage, neurological disease, and aortic disease. Secondary complications such as back are often more dangerous.
  • Many anti-hypertensive agents, including vascular disease agents have been developed, but most of them control symptoms rather than fundamental treatments, and they have different pharmacological effects and side effects. .
  • antihypertensive drugs are used at home and abroad, and many new drug candidates are being studied.
  • Drugs such as diuretics, alpha-beta blockers, calcium antagonists, angiotensin converting enzyme inhibitors, central nervous system suppressors, vasodilators, etc. are being researched to develop antihypertensive drugs.
  • Highly mature technology has already been secured in related technologies for the development of anti-hypertensive drugs, such as measurement of antihypertensive activity through animal testing and measurement of antihypertensive activity through animal testing.
  • Drugs that are currently leading the hypertension market are calcium antagonists, angiotensin converting enzyme inhibitors (ACEIs or ACE inhibitors), and angiotensin II receptor blockers (ARBs).
  • ACEIs or ACE inhibitors angiotensin converting enzyme inhibitors
  • ARBs angiotensin II receptor blockers
  • About 50% of the domestic hypertension market Calcium antagonists occupy the market of about 250 billion won, and angiotensin receptor blockers account for about 22% (92 billion won), which is continuing rapid growth.
  • angiotensin converting enzyme inhibitors form a market of 80 billion won.
  • Currently available calcium antagonists include Novasque, Zanidip of LG Life Sciences, and GSK, Ph.D., and ARB include Koza of MSC, Aprobel of Sanofycinderabo, and ACE inhibitors.
  • There are 'Tate' of Handok Pharmaceuticals 'Monopril' of BMS, 'Unibasque' of Hanmi Pharmaceutical, and 'Ace
  • the present inventors conducted a number of studies to find a substance that can prevent and treat vascular diseases by relaxing blood vessels, and as a result, the fermentation product obtained by inoculating lactic acid bacteria in Guibi-tang shows excellent vascular relaxation effect, and uses the fermentation product. It was confirmed that the vascular disease can be prevented or treated, and completed the present invention.
  • Another object of the present invention to provide a health functional food for the prevention or improvement of vascular diseases comprising the fermented product.
  • Still another object of the present invention is to provide a method for preventing or treating vascular diseases in animals other than humans using the composition.
  • Lactic acid bacteria fermented product of Guibi-tang promotes the production of nitric oxide in vascular endothelial cells and inhibits angiotensin converting enzyme, thereby relaxing the blood vessels. It may be widely used for prevention or treatment.
  • 1 is a graph showing the angiotensin converting enzyme inhibitory effect of Guibi-tang and its lactic acid bacteria fermentation.
  • Figure 2 is a graph showing the vascular relaxation of Guibi-tang and its lactic acid bacteria fermentation.
  • Figure 3 is a graph showing the angiotensin converting enzyme inhibitory effect according to the concentration of the GB166 sample.
  • Figure 4 is a graph showing the vasorelaxant efficacy of GB166 samples.
  • FIG. 5 is a graph showing NO production ability in the extracted thoracic artery section treated with the GB166 sample.
  • FIG. 6 is a graph showing changes in blood pressure during 24 hours in SHR (Spontaneous Hypertension Rat) administered with a single dose of GB166.
  • Figure 7 is a graph showing the blood pressure change in SHR long-term administration of the GB166 sample.
  • Figure 8 is a graph showing the change in heart weight in SHR long-term administration of GB166 sample.
  • 9 is a graph showing the amount of NO produced in serum in SHR administered long-term GB166 samples.
  • 10 is a graph showing blood pressure change and heart rate change according to concentration by direct blood pressure measurement.
  • 11 is a graph showing the degree of phosphorylation of eNOS in vascular endothelial cells and ICH results.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of vascular diseases, including lactic acid bacteria fermented product of Guibi-tang as an active ingredient.
  • the term "guibi-tang” refers to herbal decoctions that are used for anxiety or severe hardship, or for forgetfulness and sperm.
  • the guibi-tang was completed by adding Um Yong-hwa (Um Yong-hwa, Je Saengbang, 117, 1980) to Songdae, and setting up Myeong-dae (Seolgi, medical brief, 41-42, 1985) by adding donkey and tangji. (Ho Jun, Dong Bogam, 47, 1966)
  • a newspaper on the inner diameter introduces the treatment of forgetfulness and spermatozoa caused by the heartburn of Symbi as a result of barn.
  • Guibi-tang has been widely used in cerebral nervous system diseases and psychogenic diseases (Kang, Soon-Soo, Right Control Science, 190-191, 1996; Dong-Eui Institute of Science, Dong-Eup Prescription War, 114, 1993; 635, 2002; Yoon, Gil-Young, Clinical Clinical Preservation, 516, 1992).
  • Guibi-tang may include Astragalus, Ginseng, Baekchul, Bokryeong, Angelica, Wonji, Sanjoin, Longan meat, Ginger, Jujube, Licorice, and Mohyang, and the prescription contents are, for example, Angelica, Longan meat, Sanjoin, Wonji, Ginseng, Astragalus, 4g each of Baekchul, Baekbokryeong and 2g of Mokhyang, 1.2g of licorice, 5g of ginger, and 2 jujubes, and can be drunk. Roasted healthy 4-8 g can be added. Bungru and lobster go long, double the ginseng, and apply fat oil, hyunggae, windbreak, horse riding. Insomnia may be added 20 to 24 g of sucrose.
  • the lactic acid bacteria used in the present invention are not particularly limited thereto, but are not limited thereto, the genus Lactobacillus, Streptococcus, Streptococcus, Bifidobacterium, Lactococcus and Pediococcus ), Or microorganisms of the genus Leuconostoc may be used, and preferably, microorganisms of the genus Lactobacillus may be used, and more preferably, Lactobacillus corbatus.
  • curvatus ) Strain can be used, most preferably Lactobacillus curvatus ) KFRI 166 may be used.
  • lactic acid bacteria fermentation product means a culture result obtained from a culture inoculated and cultured with lactic acid bacteria in a medium in which lactic acid bacteria can grow. In the present invention, it means a culture supernatant or a dried product of the culture supernatant obtained from the culture cultured by inoculating lactic acid bacteria in Guibi-tang.
  • vascular disease may include a disease caused by narrowing of blood vessels.
  • the composition of the present invention can be used without limitation for the prevention or treatment of vascular diseases, which are diseases caused by narrowing blood vessels.
  • vascular diseases which are diseases caused by narrowing blood vessels.
  • blood clots such as blood clots, atherosclerotic plaques, and arterial embolism accumulate in the blood vessels.
  • Other causes include fat deposits along the artery walls, thickening and hardening, and ultimately blocking arteries.
  • Arteriosclerosis another cause is arteritis, including cerebral arteritis, giant cell arteritis, and arteritis, which occurs when one or more arteries have inflammation and necrosis.
  • the vascular diseases treatable by the present invention include ischemic coronary artery disease such as hypertension, angina pectoris, myocardial infarction and unstable angina pectoris, cerebral artery occlusion such as stroke, arteriosclerosis, peripheral arterial disease such as Burgers disease, thromboembolism and diabetes mellitus. Glandular lesions, venous ulcers, deep vein thrombosis, arteriosclerosis of the carotid arteries, vasospasm, arteritis, but are not limited to these. Preferably it may be hypertension.
  • the term "hypertension” refers to a case where the systolic blood pressure, which is the blood pressure that appears during heart contraction, is 160 mmHg or more, and the diastolic blood pressure, which is the blood pressure that appears during heart expansion, is 95 mmHg or more.
  • normal blood pressure is 120/80 mmHg, that is, systolic blood pressure is 120 mmHg and diastolic blood pressure is 80 mmHg.
  • hypertension levels that require actual treatment are determined by considering various conditions such as the individual's weight and age.
  • Hypertension is classified into renal vascular hypertension, endocrine hypertension, cardiovascular hypertension, hypertension due to increased cerebral pressure, hypertension due to pregnancy poisoning, and other factors, such as genetic hypertension or excessive intake of salt. Overworking, obesity, stress, cold, overwork, surroundings, races. It is usually left without symptoms.In this case, various cardiovascular diseases and cerebrovascular diseases such as heart failure, stable and heterogeneous angina, myocardial infarction, arteriosclerosis, renal failure, coronary artery disease, peripheral vascular disease, aortic disease, stroke, cerebral hemorrhage, It often leads to fatal and difficult-to-treat complications such as cerebral infarction, neurological disease, blindness or sudden death.
  • cardiovascular diseases and cerebrovascular diseases such as heart failure, stable and heterogeneous angina, myocardial infarction, arteriosclerosis, renal failure, coronary artery disease, peripheral vascular disease, aortic disease, stroke, cerebral hemorrhage. It often leads to fatal and difficult-to-treat complications such as cerebral
  • prevention refers to any action that inhibits or delays the development of vascular diseases by using lactic acid bacteria fermentation product of Guibi-tang according to the present invention.
  • treatment refers to any action that improves or advantageously changes the symptoms of vascular diseases using the lactic acid bacteria fermentation product of Guibi-tang.
  • Lactobacillus Lactobacillus (Cactus) Lactobacillus in Guibintang curvatus ) Lactic acid bacteria fermented by inoculation with KFRI 166 exhibited angiotensin converting enzyme inhibitory effect (FIGS. 1 and 3), and has an excellent vascular relaxation effect not seen in unfermented Guibi-tang (FIGS. 2 and 4), and in vascular endothelial cells. It was confirmed that the production of vascular relaxation factor NOS and increased the phosphorylation of eNOS (Figs. 5, 9 and 11), the blood pressure lowering effect in the normal blood pressure and congenital hypertensive rat model (Figs. 6, 7 and Fig. 10).
  • Lactobacillus Kerbatus in the VIP bath In the case of lactic acid bacteria fermented product inoculated with KFRI 166, angiotensin converting enzyme inhibitory ability was increased by about 20% compared to Guibi-tang (FIG. 1).
  • Lactobacillus Corbatus By fermentation using KFRI 166, it was confirmed that the components of the Guibi-tang changed the basic physiological activity through the fermentation of lactic acid bacteria, and by this change, the prevention of hypertension or the lactic acid bacteria fermented product of Guibi-tang according to the present invention as an active ingredient
  • the therapeutic pharmaceutical composition may be usefully used for the prevention or treatment of hypertension rather than raw fermented Guibi-tang.
  • the pharmaceutical composition for preventing or treating vascular diseases of the present invention may further include a pharmaceutically acceptable carrier, excipient or diluent.
  • Examples of pharmaceutically acceptable carriers, excipients and diluents that may be used in the therapeutic compositions of the invention include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, Gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, calcium carbonate, cellulose, methyl cellulose, polyvinylpyrrolidone, water, methylhydroxy benzoate, propylhydroxy benzoate, talc, magnesium stearate, mineral oil and the like.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be used in the form of powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols, oral dosage forms, external preparations, suppositories, and sterile injectable solutions according to conventional methods.
  • diluents or excipients such as fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrating agents and surfactants are usually used.
  • Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, and the like, and such solid preparations may include at least one excipient such as starch, calcium carbonate, sucrose or lactose, It is prepared by mixing gelatin and the like.
  • Liquid preparations for oral administration include suspensions, liquid solutions, emulsions, and syrups, and various excipients, such as wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives, may be included in addition to commonly used simple diluents such as water and liquid paraffin. have.
  • Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized preparations, suppositories.
  • non-aqueous solvent and suspending agent propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, injectable ester such as ethyl oleate and the like can be used.
  • base of the suppository witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin butter, glycerogelatin and the like can be used.
  • the present invention provides a method for producing the lactic acid bacteria fermentation.
  • the method for producing a lactic acid bacteria fermented product of Guibi-tang includes inoculating lactic acid bacteria into Guibi-tang and fermenting it.
  • the lactic acid bacteria is not particularly limited to, but may be used in the microorganisms of the genus Lactobacillus, Streptococcus, Bifidobacterium, Lactococcus, Pediococcus, Leukonostock, preferably Lactobacillus More preferably, Lactobacillus Corbatus curvatus ) Strain, most preferably Lactobacillus curvatus KFRI 166 can be used.
  • the fermentation conditions of the lactic acid bacteria is not particularly limited, but is preferably carried out under an aerobic atmosphere for a temperature of 35 to 45 °C and a time of 1 to 3 days. More preferably, lactic acid bacteria are inoculated into Guibi-tang and incubated for 48 hours at 37 ° C under aerobic atmosphere.
  • the lactic acid bacteria fermentation product of Guibi-tang in order to prepare the lactic acid bacteria fermentation product of Guibi-tang according to the present invention after adjusting the water extract of Guibi-tang with pH 8.0 using 1 M sodium hydroxide, after autoclaving 15 minutes at 121 °C, Inoculate 1% (v / v) of Lactobacillus curvatus KFRI 166 at a concentration of 1 to 5 x 10 7 CFU / ml and incubate for 48 hours at 37 ° C. to obtain a culture, from which the culture supernatant is separated, and then frozen. To dry lactic acid bacteria fermented product was prepared.
  • the present invention provides a health functional food for the prevention or improvement of vascular diseases, including lactic acid bacteria fermented product of Guibi-tang.
  • the lactic acid bacterium fermentation product according to the present invention may be added to food or beverage for the purpose of preventing or improving vascular disease
  • the food type is not particularly limited, for example, various kinds such as confectionery, bread, noodles, etc.
  • the amount of the lactic acid bacteria fermented product in the food or beverage is generally in the case of the health functional food composition of the present invention can be added to 0.01 to 15% by weight, preferably 0.1 to 5% by weight of the total food weight, It may be added in a ratio of 0.01 to 5.0 g, preferably 0.01 to 1.0 g based on 100. Since the health functional food of the present invention thus obtained contains the lactic acid bacteria fermented product of the present invention, it is a food which can fully utilize the prevention or treatment effect of the vascular disease possessed by the lactic acid bacteria fermented product.
  • the health functional food of the present invention can be easily prepared by the step of adding the lactic acid bacteria fermentation product of the present invention as described above during the manufacturing process of the base food or by the step of adding the lactic acid bacteria fermentation product of the present invention described above after the production of the food. Can be. At this time, a taste and odor correction agent may be added as needed.
  • the health functional food is a variety of nutrients, vitamins, minerals (electrolytes), flavors such as synthetic flavors and natural flavors, coloring and neutralizing agents (such as cheese, chocolate), pectic acid and salts thereof, alginic acid and its Salts, organic acids, protective colloidal thickeners, pH adjusters, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohols, carbonation agents used in carbonated drinks, and the like.
  • the health functional food of the present invention may contain fruit flesh for the production of natural fruit juices and fruit juice drinks and vegetable drinks. Such components may be used independently or in combination. The proportion of such additives is generally selected within the range of about 20 parts by weight or less per 100 parts by weight of the health functional food of the present invention.
  • the present invention provides a method for preventing or treating vascular disease.
  • the method comprises administering a pharmaceutically effective amount of Guibi-tang lactobacillus fermentation to a subject in need thereof.
  • the subject includes both humans and animals except humans.
  • the term "individual” in the present invention refers to horses, sheep, pigs, goats, camels, including humans, having vascular diseases whose symptoms can be improved by administration of a therapeutic pharmaceutical composition according to the present invention having a vascular relaxation effect. , Mammals such as antelope, dogs and cats, but is not limited thereto.
  • a therapeutic pharmaceutical composition according to the present invention having a vascular relaxation effect Mammals such as antelope, dogs and cats, but is not limited thereto.
  • administration means introducing a predetermined substance into the animal by any suitable method, the route of administration of the therapeutic composition according to the present invention is oral or via any general route as long as it can reach the target tissue. Parenteral administration.
  • the lactic acid bacterium fermentation product of the present invention may be administered by any device in which the active ingredient can move to the target cell.
  • the term "pharmaceutically effective amount” means an amount sufficient to treat a disease at a reasonable benefit / risk ratio applicable to medical treatment, and the effective dose level may be the sex, age, type of disease, severity, It may be determined according to the activity of the drug, sensitivity to the drug, the time of administration, the route of administration and the rate of release, the duration of treatment, factors including the concurrent drug and other factors well known in the medical field.
  • the lactic acid bacteria fermentation product of the present invention may be administered as an individual therapeutic agent or in combination with other therapeutic agents and may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents. In addition, the lactic acid bacteria fermentation product of the present invention may be administered in a single or multiple doses.
  • the therapeutic composition of the present invention is preferably oral administration or intravenous administration.
  • the preferred dosage of the lactic acid bacterium fermentation according to the present invention depends on the condition and weight of the patient, the extent of the disease, the form of the drug, the route of administration and the duration, and may be appropriately selected by those skilled in the art.
  • the lactic acid bacteria fermentation product of the present invention may be administered at 50 to 1000 mg / kg, preferably at 100 to 500 mg / kg. Administration may be administered once a day or may be divided several times.
  • lactic acid bacteria fermentation product of Guibi-tang showed vascular relaxation effect in blood vessels in which vascular endothelial cells exist, and this relaxation effect was not found in raw material of Guibi-tang, but a new effect appeared in lactic acid bacteria fermentation product of Guibi-tang. (Example 5 and Fig. 4).
  • lactic acid bacteria fermented product of Guibi-tang extract To prepare lactic acid bacteria fermented product of Guibi-tang extract according to the present invention, lactic acid bacteria and Guibi-tang were prepared, respectively.
  • the lactic acid strain was inoculated in the prepared medium at a concentration of 1% (v / v), incubated for 48 hours at 37 ° C. under aerobic conditions, and then centrifuged to obtain a culture supernatant, and the obtained culture supernatant was lyophilized. By doing so, the lactic acid bacteria fermented product of the present invention was prepared.
  • Example 2 Inhibitory ability of angiotensin converting enzyme
  • the angiotensin converting enzyme inhibitory effect was evaluated at a single concentration (3 mg / ml) for the Guibi-tang raw material and lactic acid bacteria fermented product prepared in Example 1. This experiment is to show the inhibitory ability of angiotensin converting enzyme, an enzyme that converts angiotensin I to angiotensin II. When the production of angiotensin II is inhibited, the blood pressure drop appears.
  • Angiotensin converting enzyme (ACE) inhibitory activity is produced by the action of ACE isolated from rabbit lung acetone powder and its substrate, hyppuryl-L-histidyl-L-leucine (Hip-His-Leu). absorbance measurement of hippuric acid).
  • the substrate solution was obtained by mixing 3 mM Hip-His-Leu in 100 mM sodium borate buffer containing 300 mM NaCl. Add 50 ⁇ l of the extraction sample and pre-incubate at 37 ° C. for 5 minutes, then add 50 ⁇ l of ACE (100 mU / ml) and perform enzymatic reaction for one hour. After the reaction was completed, 250 ⁇ l of 1 M HCl was added to stop the reaction.
  • ACE angiotensin converting enzyme
  • ethyl acetate ethyl acetate
  • Inhibitory Activity (%) ⁇ 1- (Sa-Sb) / C ⁇ ⁇ 100
  • FIG. 1 is a graph showing the angiotensin converting enzyme inhibitory effect of Guibi-tang and its lactic acid bacteria fermentation. As shown in Figure 1, it was confirmed that the angiotensin converting enzyme inhibitory effect is increased by about 20% in lactic acid bacteria fermentation product of Guibi-tang rather than Guibi-tang. Therefore, it was confirmed that the change in the basic physiological activity through the biotransformation, which confirmed the efficacy as a basic step to confirm the antihypertensive activity, as well as confirmed that the bioconversion by the microorganism was made well.
  • Figure 2 is a graph showing the vascular relaxation of Guibi-tang and its lactic acid bacteria fermentation. As shown in FIG. 2, vascular relaxation did not appear in Guibi-tang, but relatively strong vascular relaxation was observed in lactic acid bacteria fermented product (GB166) of Guibi-tang, which was analyzed as a result of physiological activity increase due to bioconversion.
  • GB166 lactic acid bacteria fermented product
  • Example 3 the angiotensin converting enzyme inhibitory ability was measured at a concentration of concentration (0.1875, 0.375, 0.75, 1.5, 3 mg / ml) for the GB166 sample newly showing vascular relaxation at a single concentration (Fig. 2). 3).
  • Figure 3 is a graph showing the angiotensin converting enzyme inhibitory effect according to the concentration of the GB166 sample. As shown in Figure 3, when compared with Guibi-tang raw material (GBcon) it was confirmed that the IC50 (mg / ml) value in the bioconverted GB166 was 1.011 significantly reduced compared to 1.729 of the raw material.
  • Example 4 the concentration of (166, 0.375, 0.75, 1.5, 3 mg / ml) was administered to the thoracic aortic section extracted by the method of Example 3, the GB166 samples showing activity at a single concentration The result was obtained (FIG. 4).
  • FIG. 4 is a graph showing the vasorelaxant efficacy of GB166 samples.
  • GB166 showed a vascular relaxation effect in a concentration-dependent vessel in the presence of vascular endothelial cells.
  • vascular endothelial cells have been relatively decreased in blood vessels from which vascular endothelial cells have been removed
  • L-NAME a substance that inhibits nitric oxide synthase (NOS) in endothelial cells
  • vasorelaxant effect of the GB166 sample has a vascular endothelium-dependent effect and was involved in the formation of nitric oxide (NO), a potent vasorelaxant secreted from vascular endothelial cells through L-NAME experiments. .
  • NO nitric oxide
  • the blood vessel sections extracted by the method of Example 3 were incubated in DMEM medium for 1 hour and the amount of NO secreted into the medium was measured using Griess reagent (FIG. 5). At this time, the blood vessel sections were constantly prepared to about 5 mm each, the sample was processed and incubated in a carbon dioxide incubator.
  • FIG. 5 is a graph showing NO production ability in the extracted thoracic artery section treated with the GB166 sample. As shown in Figure 5, there is almost no amount of NO by each sample while the amount of NO produced when cultured by treating the GB166 in blood vessels can be seen that the concentration-dependent significant increase. Compared with the vascular relaxation test, the GB166 sample was involved in the production of NO in vascular endothelial cells and promoted the increase of NO in the medium.
  • Example 7 24 hour blood pressure change in congenital hypertension model rats by single dose
  • the change in blood pressure was observed over time for 24 hours after the single administration in Spontaneous Hypertension Rat (SHR) for the GB166 sample shown to increase vascular relaxation and NO production in Examples 5 and 6.
  • Blood pressure was measured using the indirect method (tail cuff method) in the tail artery of SHR.
  • a tailband and pulse transducer (MLT1050, AD instrument, U.S.A.) were placed on the tail, and the pulse transducer was connected to a fingerprint recorder to measure blood pressure.
  • the experimental animals were stabilized in a heating box controlled at 36 ° C. for 10 minutes, and then systolic blood pressure was measured.
  • Heart rate was analyzed by Chart 7 (AD instrument, U.S.A.) for the Windows program (Fig. 6). In this case, amlodipine, a calcium ion channel antagonist, was used as a positive control group.
  • FIG. 6 is a graph showing blood pressure change during 24 hours in SHR administered with a single dose of GB166.
  • the blood pressure is lowered to the normal level within 2 hours after amlodipine (3 mg / kg, P.O.) administration.
  • hypertension was shown up to 4 hours after administration (200 mg / kg, P.O.), but blood pressure was lowered by more than 40% after 6 hours.
  • Amlodipine; 2 hours, Guibi-tang; 6 hours the blood pressure gradually increases in the positive control group and the experimental group over time.
  • the GB166 sample was weaker than amlodipine, a positive control group, but it was confirmed that it has a significant blood pressure lowering effect as a natural substance.
  • Figure 7 is a graph showing the blood pressure change in SHR long-term administration of the GB166 sample.
  • the blood pressure of WKR remained normal until 49 days after the start of the experiment, and in the group of amlodipine, the blood pressure was continuously dropped to maintain normal blood pressure from 14 days.
  • the group treated with the GB166 sample was weaker than amlodipine, but showed a blood pressure lowering effect of about 50% during the experimental period.
  • FIG. 8 is a graph showing the change in heart weight in SHR long-term administration of GB166 sample.
  • the weight of the heart was significantly increased in the SHR compared to the WKR indicating normal blood pressure.
  • the oral administration of Guibi-tang raw materials there was no change in heart as there was no blood pressure-lowering effect.
  • the heart weight was decreased in the group treated with amlodipine, a positive control group, and indirectly that the group administered with the GB166 sample, which showed the effect of lowering blood pressure, reduced the burden on the heart and reduced cardiac hypertrophy. Confirmed.
  • nitric oxide production in serum after necropsy was measured using Griess reagent (FIG. 9). The measurement was performed after the protein component of serum was precipitated with methanol.
  • FIG. 9 is a graph showing the amount of NO produced in serum in SHR administered long-term GB166 samples. As shown in FIG. 9, it was confirmed that the amount of nitric oxide in the blood was increased in the SHR group compared to the WKR indicating normal blood pressure.
  • Example 9 Blood pressure change according to direct blood pressure measurement of bioconverted Guibi-tang
  • SD-rat was anesthetized with zoletil (50 mg / kg) and xylazine (3 mg / kg), and then drug and blood pressure catheter was applied to the right jugular and left carotid arteries. Each was inserted.
  • the left carotid catheter was connected to a blood pressure transducer (MTL1050, AD instrument, U.S.A.) to measure average arterial pressure with a fingerprint recorder (Powerlab / 400, AD instrument, U.S.A.).
  • Heart rate (HR) was analyzed using the chart 7 (AD instrument, U.S.A.) for Windows programs.
  • the catheter of the carotid artery was filled with physiological saline containing heparin, and the catheter of the jugular vein was connected to a sterile syringe to administer the sample. After about 1 hour of blood pressure measurement, it was confirmed that the blood pressure was stabilized, and the herbal prescription was administered once by intravenous doses of 5, 25, 50, 100, 250 mg / kg, and the control group was administered the same amount of single saline intravenously. The change in blood pressure and heart rate before and after drug administration was measured, and the change rate was calculated, and the result was compared with the control group (FIG. 10).
  • FIG. 10 is a graph showing blood pressure change and heart rate change according to concentration by direct blood pressure measurement. As shown in Figure 10, when the administration of GB166 in the jugular vein concentration-dependent (25, 100 mg / kg) was confirmed that the blood pressure is reduced by more than 20%, 35% or more. Heart rate was also confirmed to decrease with concentration.
  • eNOS endothelial nitric oxide synthase
  • ICH Western blot and immunocytochemistry
  • FIG. 11 is a graph showing the degree of phosphorylation of eNOS in vascular endothelial cells and ICH results. As shown in FIG. 11, it was confirmed that when the GB166 sample was administered, phosphorylation of eNOS increased in a concentration-dependent manner (50, 100, 200 ⁇ g / ⁇ l) on a western blot. In addition, in the ICH treated with GB166, the phosphorylated eNOS increased in the cytoplasm (Green; phospho-eNOS, Red; nuclei). Phosphorylation of Ser1177 group of eNOS activates eNOS, and the increase of eNOS phosphorylation increases NO production in vascular endothelial cells.

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Abstract

본 발명은 귀비탕의 유산균 발효물을 유효성분으로 포함하는 혈관질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 상기 발효물을 포함하는 혈관질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 및 상기 발효물을 이용한 인간을 제외한 동물의 혈관질환을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 귀비탕의 유산균 발효물은 혈관 내피세포의 일산화질소 생성을 촉진하고 안지오텐신 전환효소를 억제하여 혈관을 이완시키는 효과를 나타내므로, 약학적 조성물 또는 건강기능식품의 형태로 제조되어 혈관질환의 예방 또는 치료에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Description

귀비탕 유산균 발효물 및 이의 용도
본 발명은 귀비탕 유산균 발효물 및 그의 용도에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 본 발명은 귀비탕의 유산균 발효물을 유효성분으로 포함하는 혈관질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 상기 발효물을 포함하는 혈관질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 및 상기 조성물을 이용한 혈관질환을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다.
혈관질환은 혈관이 좁아져 발생하는 질환을 의미하는 것으로, 혈전 등의 혈액응고 덩어리 또는 지방의 축적으로 혈류가 방해를 받아 조직으로의 가스 및 영양공급이 원활하게 이루어지지 못해 발생하는 질환들을 포함한다. 이외에도 혈관이 좁아지는 원인으로는 동맥의 염증 및 괴사와 갑작스럽게 조밀해지는 혈관연축 등이 있다.
이러한 혈관질환 중 가장 대표적인 것이 고혈압이다. 고혈압은 만성 순환기계질환 중 가장 발생빈도가 높은 질환으로, 우리나라 성인인구의 약 15%가 고혈압을 가지고 있는 것으로 추정되고 있다. 고혈압은 대동맥 내부의 압력이 비정상적으로 높아졌을 때를 일컬으며, 그 자체로도 위험한 경우가 많지만 악성고혈압, 심부전, 뇌출혈, 신경질환, 대동맥질환 등을 비롯하여 관상동맥질환, 급사, 뇌경색, 말초혈관질환 등의 2차 합병증 등이 더욱 위험한 경우가 많다. 많은 항고혈압 제제를 비롯한 혈관질환 제제가 개발되었지만 근본적인 치료보다 증상을 조절하는 것이 대부분이며, 서로 다른 약리작용과 부작용을 가지므로 사용상에 주의를 기해야 함은 물론이며, 특히 평생 복용해야 하는 문제가 있다. 이와 같은 장기복용은 간장 및 신장에 많은 부담을 주며 심장 등 순환기계와 소화기계, 피부 등에 부작용을 일으키는 경우가 빈번하다. 따라서 탁월한 혈압 강하효과를 가지면서 부작용이 없는 새로운 고혈압 치료제가 필요하다. 이러한 맥락에서 역사적으로 풍부한 임상경험이 축적되어 있고, 상대적으로 낮은 부작용을 갖는 한방처방을 이용하여 항고혈압 활성을 규명하고 제제를 개발하는 것은 매우 의미있는 일이다. 또한 국내 항고혈압 제제는 대부분이 제네릭(generic)제제로 이미 과포화상태에 이르렀으며 80년대 이후 물질 특허제도가 도입됨에 따라 국내에서의 독창적인 신약 및 신소재 개발 필요성이 대두되었다. 특히 환경친화적 건강증진관련 제품의 선호도가 높아지고 있는 실정으로 의약품 또한 그 소재를 천연 식물자원으로부터 찾고자 노력하고 있다. 한편 전통적으로 오랜 기간 약리적 효과를 검증받고 다방면에서 치료제로 사용되어 온 한방제제는 과학적 검증의 미비로 그 효능 뿐 아니라 잠재적 활용가치도 폄하되는 경향이 있다. 따라서 약효가 검증된 한방제제에 과학적 발효기술을 접목하는 BT의 융합기술로 한층 강화된 효능과 안전성을 지닌 의약품으로 개발하는 원천기술을 확보하여 국민보건향상에 기여할 수 있을 것이다.
현재 국내외에서 다양한 항고혈압 약물들이 사용되고 있으며, 또한 많은 신약 후보물질들에 대한 연구가 진행되고 있다. 이뇨제, 알파·베타차단제, 칼슘길항제, 안지오텐신 전환효소 저해제, 중추신경에 작용하는 강압제, 혈관확장제, 등의 약제들에 대하여 항고혈압 약물 개발을 위한 연구들이 진행되고 있으며, 국내외에서 시험관 내 실험을 통한 항고혈압활성의 측정기술, 동물시험을 통한 항고혈압활성 측정기술 등 고혈압 치료제 개발을 위한 관련 기술에 있어서도 완성도 높은 기술력이 이미 확보되어 있다.
최근 들어 미국에서도 천연자원으로부터 항고혈압활성이 있는 신약후보물질 도출에 관한 연구가 NIH 등의 주도하에 대규모로 이루어지고 있다. 국내에서도 1990년대 초부터 보건복지부, 농림부, 산자부 등의 집중적인 지원으로 천연자원으로부터 의료용 신물질 개발에 관한 연구들이 활발하게 진행되어 왔다. 특히 서울대학교 천연물과학 연구소, 생명공학연구소 등에서 국내 자생식물을 이용한 치료용 신물질 발굴을 위한 연구들이 꾸준하게 진행되고 있으나 아직 연구개발 결과가 상업화된 예는 거의 없는 실정이다. 즉, 안전성과 유효성이 확보된 우수한 신약후보물질의 도출, 더욱이 천연물에서 유래한 후보물질의 발굴에 있어서는 아직 성공한 예를 찾아볼 수 없으며 대부분이 합성화합물들을 대상으로 연구를 진행하고 있는 상황이다.
현재 고혈압치료제 시장을 주도하고 있는 약물은 칼슘길항제, 안지오텐신 전환효소 저해제(angiotensin converting enzyme inhibitors, ACEIs 또는 ACE 저해제), 안지오텐신 수용체 차단제(angiotensin II receptor blockers, ARBs)로, 국내 고혈압치료제 시장의 약 50% 정도로 2,500억원대의 시장을 칼슘길항제가 점유하고 있으며 안지오텐신 수용체 차단제가 약 22% 정도(920억원대)로 최근 급격한 성장을 지속하고 있다. 더불어 안지오텐신 전환효소 저해제는 800억원대 규모의 시장을 형성하고 있다. 현재 판매되고 있는 칼슘길항제로는 '노바스크'와 LG생명과학의 '자니딥', GSK의 '박사르' 등이 있으며, ARB는 MSC의 '코자', 사노피신데라보의 '아프로벨'등이, ACE 저해제로는 한독약품의 '트리테이스', BMS의 '모노프릴', 한미약품의 '유니바스크', LG생명과학의 '에이스콜'이 있다.
본 발명자들은 혈관을 이완시켜서 혈관질환을 예방 및 치료할 수 있는 물질을 찾고자 많은 연구를 수행하였으며, 그 결과로 귀비탕에 유산균을 접종하여 수득한 발효물이 우수한 혈관 이완효과를 나타내어, 상기 발효물을 이용하여 혈관질환을 예방 또는 치료할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 주된 목적은 귀비탕의 유산균 발효물을 유효성분으로 포함하는 혈관질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 발효물을 포함하는 혈관질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물을 이용하여 인간을 제외한 동물의 혈관질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명에 따른 귀비탕의 유산균 발효물은 혈관 내피세포의 일산화질소 생성을 촉진하고 안지오텐신 전환효소를 억제하여 혈관을 이완시키는 효과를 나타내므로, 약학적 조성물 또는 건강기능식품의 형태로 제조되어 혈관질환의 예방 또는 치료에 널리 활용될 수 있을 것이다.
도 1은 귀비탕과 그의 유산균 발효물의 안지오텐신 전환효소 억제효능을 나타낸 그래프이다.
도 2는 귀비탕과 그의 유산균 발효물의 혈관이완성을 나타낸 그래프이다.
도 3은 GB166 시료의 농도에 따른 안지오텐신 전환효소 억제효능을 나타낸 그래프이다.
도 4는 GB166 시료의 혈관이완성 효능을 나타낸 그래프이다.
도 5는 GB166 시료를 처리한 적출 흉대동맥 절편에서의 NO 생성능을 나타낸 그래프이다.
도 6은 GB166 시료 단회 투여한 SHR(Spontaneous Hypertension Rat)에서 24시간 동안의 혈압변화를 나타낸 그래프이다.
도 7은 GB166 시료를 장기투여한 SHR에서의 혈압변화를 나타낸 그래프이다.
도 8은 GB166 시료를 장기투여한 SHR에서의 심장무게 변화를 나타낸 그래프이다.
도 9는 GB166 시료를 장기투여한 SHR에서 혈청 내 NO 생성량을 나타낸 그래프이다.
도 10은 직접 혈압측정으로 농도에 따른 혈압변화와 심박수 변화를 나타낸 그래프이다.
도 11은 혈관 내피세포에서 eNOS의 인산화 정도를 나타낸 그래프와 ICH 결과이다.
상기 본 발명의 목적을 달성하기 위한 일 실시양태로서, 본 발명은 귀비탕의 유산균 발효물을 유효성분으로 포함하는 혈관질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서 용어 "귀비탕"이란, 근심걱정 또는 심한 고생으로 마음이 상하였을 때, 또는 건망, 정충에 사용되는 한방유래의 탕약을 의미한다. 상기 귀비탕은 송대에 엄용화(엄용화, 제생방, 117, 1980)가 처음 창방하고, 명대에 설기(설기, 내과적요, 41-42, 1985)가 당귀와 원지를 첨가하여 완성된 것으로, 동의보감(허준, 동의보감, 47, 1966) 내경편의 신문에 우사로 인하여 심비의 이장을 노상하여 발생한 건망과 정충을 치료한다고 소개되어 있다. 최근들어, 귀비탕은 뇌신경계 질환, 심인성 질환에 광범위하게 활용되고 있다(강순수, 바른방제학, 190-191, 1996; 동의과학원, 동의처방대전, 114, 1993; 윤용갑, 동의방제와 처방해설, 631-635, 2002; 윤길영, 동의임상방제학, 516, 1992). 또한, 귀비탕에 대해서 귀비탕 및 그 구성 약물군이 항산화 효과에 미치는 영향(박선동 외, 귀비탕 및 그 구성약물군이 항산화 효과에 미치는 영향, 16: 1, 11-27, 2001), 비기능이 학습과 기억에 미치는 영향에 대한 실험적 연구(박찬원 외, 비기능이 학습과 기억에 미치는 영향에 대한 실험적 연구, 20:4, 39-49, 2000), 귀비탕이 글루타메이트에 의한 C6 신경아교세포의 세포자멸사에 미치는 영향(강익현, 귀비탕이 Glutamate에 의한 C6 glial cell 의 apoptosis에 미치는 영향, 원광대 대학원, 2001), 귀비탕이 글루타메이트에 의한 성상세포의 손상에 미치는 영향(전희준, 귀비탕이 Glutamate에 의한 성상세포의 손상에 미치는 영향, 원광대 대학원, 2002), 귀비탕이 흰쥐의 기억력 향상과 해마부위의 세포증식에 미치는 영향에 대한 연구(오명숙 외, 귀비탕이 흰쥐의 기억력 향상과 해마부위의 세포증식에 미치는 영향에 대한 연구, 의림, 320: 46-49, 2005) 등의 항산화 효과 및 뇌기능 관련 연구가 있었다. 귀비탕은 황기, 인삼, 백출, 복령, 당귀, 원지, 산조인, 용안육, 생강, 대추, 감초 및 목향을 원료로 포함할 수 있으며, 처방내용은 일예로 당귀, 용안육, 산조인, 원지, 인삼, 황기, 백출, 백복령 각 4 g에 목향 2 g, 감초 1.2 g과 생강 5쪽과 대추 2개를 넣어 달여 마실 수 있으며, 기가 승강하지 못할 때는 변향부자를 가하고, 허화로 인하여 토혈하면 숙지황 20 내지 28 g 및 검게 볶은 건강 4 내지 8 g을 가할 수 있다. 붕루, 대하가 오래가면 인삼을 배로하고, 지유, 형개, 방풍, 승마 등을 가한다. 불면증에는 숙지황 20 내지 24 g을 가할 수 있다.
한편, 본 발명에서 사용한 유산균은 특별히 이에 제한되지 않으나, 락토바실러스 속(Lactobacillus), 스트렙토코커스 속(Streptococcus), 비피도박테리움 속(Bifidobacterium), 락토코커스 속(Lactococcus), 페디오코커스 속(Pediococcus), 또는 류코노스톡 속(Leuconostoc)의 미생물 등을 사용할 수 있고, 바람직하게는 락토바실러스 속 미생물을 사용할 수 있으며, 보다 바람직하게는 락토바실러스 커바투스(Lactobacillus curvatus) 균주를 사용할 수 있으며, 가장 바람직하게는 락토바실러스 커바투스(Lactobacillus curvatus) KFRI 166을 사용할 수 있다.
본 발명에서 용어 "유산균 발효물"이란, 유산균이 성장할 수 있는 배지에 유산균을 접종하고 배양한 배양물로부터 수득한 배양결과물을 의미한다. 본 발명에서는 귀비탕에 유산균을 접종하여 배양한 배양물로부터 수득한 배양상등액 또는 배양상등액의 건조물을 의미한다.
본 발명에서 용어 "혈관질환"은 혈관이 좁아져 발생하는 질환을 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물은 혈관이 좁아져 발생하는 질환인 혈관질환의 예방 또는 치료에 제한없이 사용될 수 있다. 혈관이 좁아지는 이유 중 한가지는 혈전, 죽상동맥경화반, 동맥색전 등의 혈액응고 덩어리가 혈관내에 축적되는 경우, 다른 원인으로는 동맥 벽을 따라 지방이 침적되어 비후 및 경화하고 궁극적으로 동맥이 차단되는 동맥경화증, 또 다른 원인은 하나 이상의 동맥에 염증 및 괴사가 있을 때 발생하는 뇌동맥염, 거대세포 동맥염, 관자 동맥염을 포함하는 동맥염이다. 마지막으로 혈관이 갑작스럽고 간단하게 조밀하게 되는 혈관연축이 있다. 따라서, 본 발명에 의해 치료가능한 혈관질환은 고혈압, 협심증, 심근경색, 불안정성 협심증 등의 허혈성 관상동맥질환, 중풍 등의 대뇌동맥폐색, 동맥경화증, 버거스병 등의 말초동맥폐색질환, 혈전색전증, 당뇨병성족부병변, 정맥성궤양, 심부정맥혈전증, 경동맥의 동맥경화증, 혈관연축, 동맥염이 포함되나 이들로 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는 고혈압일 수 있다.
본 발명에서 용어 "고혈압"이란 심장 수축시 나타나는 혈압인 수축기 혈압이 160 mmHg 이상, 심장 확장시 나타나는 혈압인 확장기 혈압이 95 mmHg 이상인 경우를 말한다. 반면 정상 혈압은 120/80 mmHg, 즉 수축기 혈압이 120 mmHg, 확장기 혈압이 80 mmHg이다. 그러나 실제 치료를 요하는 고혈압 수치는 개인의 체중, 나이 등 여러 가지 조건을 고려하여 결정한다. 고혈압은 그 발생원인에 따라 신장혈관성 고혈압, 내분비성 고혈압, 심혈관성 고혈압, 뇌압상승에 의한 고혈압, 임신 중독에 의한 고혈압 등으로 분류되며 유발 요인은 유전적 고혈압인자나 소금의 과잉섭취 등의 생활습과, 비만, 스트레스, 추위, 과로, 주위환경, 종족의 차이 등이 있다. 보통 증상이 없어 방치되는 경우가 많고 그 경우 각종 심혈관계 질환 및 뇌혈관 질환 즉 심부전, 안정형 및 이형 협심증, 심근경색증, 동맥경화증, 신부전증, 관상동맥질환, 말초혈관질환, 대동맥질환, 뇌졸중, 뇌출혈, 뇌경색, 신경질환, 실명 또는 급사 등 치명적이고 치료가 어려운 합병증을 유발하는 경우가 많다.
본 발명에서 용어 "예방"이란 본 발명에 따른 귀비탕의 유산균 발효물을 이용하여 혈관질환의 발병을 저해 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 용어 "치료"란 본 발명에 따른 귀비탕의 유산균 발효물을 이용하여 혈관질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 귀비탕에 락토바실러스 커바투스(Lactobacillus curvatus) KFRI 166을 접종하여 발효시킨 유산균 발효물이 안지오텐신 전환효소 억제효능을 나타내고(도 1 및 3), 발효시키지 않은 귀비탕에서는 나타나지 않았던 탁월한 혈관 이완효과가 있으며(도 2 및 도 4), 혈관내피세포에서 혈관이완인자인 NOS의 생성 및 eNOS의 인산화 증가효과를 나타내고(도 5, 도 9 및 도 11), 정상혈압 및 선천성 고혈압쥐 모델에서 혈압강하 효과를 나타냄을 확인하였다(도 6, 도 7 및 도 10).
또한, 귀비탕에 락토바실러스 커바투스 KFRI 166을 접종하여 발효시킨 유산균 발효물의 경우, 귀비탕보다도 안지오텐신 전환효소 억제능이 20%가량 증가한 것을 확인할 수 있었다(도 1).
따라서, 이와 같은 결과를 근거로 락토바실러스 커바투스 KFRI 166을 이용한 발효에 의해 귀비탕의 성분이 유산균 발효를 통하여 기본적인 생리활성에 변화가 생겼음을 확인할 수 있었고, 이러한 변화에 의해 본 발명에 따른 귀비탕의 유산균 발효물을 유효성분으로 포함하는 고혈압의 예방 또는 치료용 약학적 조성물이 발효시키지 않은 귀비탕 원시료 보다 고혈압의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있을 것이다.
본 발명의 혈관질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 추가로 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다.
본 발명의 치료용 조성물에 사용될 수 있는 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 칼슘 카보네이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시 벤조에이트, 프로필하이드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 광물유 등을 들 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 제형화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 치료용 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트, 수크로즈 또는 락토즈, 젤라틴 등을 혼합하여 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 유산균 발효물을 제조하는 방법을 제공한다. 구체적으로 본 발명의 귀비탕의 유산균 발효물을 제조하는 방법은 귀비탕에 유산균을 접종하여 발효시키는 단계를 포함한다. 이때, 유산균은 특별히 이에 제한되지 않으나, 락토바실러스 속, 스트렙토코커스 속, 비피도박테리움 속, 락토코커스 속, 페디오코커스 속, 류코노스톡 속의 미생물을 사용할 수 있고, 바람직하게는 락토바실러스 속 미생물, 보다 바람직하게는 락토바실러스 커바투스(Lactobacillus curvatus) 균주, 가장 바람직하게는 락토바실러스 커바투스(Lactobacillus curvatus) KFRI 166을 사용할 수 있다. 유산균의 발효조건은 특별히 이에 제한되지 않으나, 호기성 대기하에, 35 내지 45℃의 온도 및 1 내지 3일의 시간동안 수행함이 바람직하다. 보다 바람직하게는, 귀비탕에 유산균을 접종하여 호기성 대기 하에, 37℃에서 48시간 배양하는 것이다.
본 발명의 일 실시예에서는, 본 발명에 따른 귀비탕의 유산균 발효물을 제조하기 위해 귀비탕 물 추출물을 1 M 수산화나트륨을 이용하여 pH 8.0으로 조절한 후, 121℃에서 15분간 고압 멸균 처리한 후, 1 내지 5 ×107 CFU/ml 농도의 Lactobacillus curvatus KFRI 166을 1%(v/v) 접종하여 37 ℃에서 48시간 배양하여 발효시켜 배양물을 수득하고, 이로부터 배양상등액을 분리한 다음, 동결건조하여 유산균 발효물을 제조하였다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 귀비탕의 유산균 발효물을 포함하는 혈관질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
구체적으로, 본 발명에 따른 상기 유산균 발효물은 혈관질환의 예방 또는 개선을 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있는데, 식품 종류는 특별히 제한되지 않으며, 예를 들어, 과자류, 빵류, 면류 등과 같은 각종 식품류, 물, 청량음료, 과실음료 등의 드링크류, 껌, 차, 비타민 복합제, 조미료류, 건강기능 식품류 등이 있다. 이때, 식품 또는 음료 중의 상기 유산균 발효물의 양은 일반적으로 본 발명의 건강기능식품 조성물의 경우는 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%, 바람직하게는 0.1 내지 5 중량%로 가할 수 있으며, 건강음료 조성물에는 100을 기준으로 0.01 내지 5.0 g, 바람직하게는 0.01 내지 1.0 g의 비율로 첨가할 수 있다. 이와 같이 하여 얻어지는 본 발명의 건강기능식품은, 본 발명의 유산균 발효물을 함유하고 있기 때문에, 상기 유산균 발효물이 지닌 혈관질환의 예방 또는 치료 효과를 충분히 활용할 수 있는 식품이다.
본 발명의 건강기능식품은 기재로 되는 식품의 제조공정 중에 상술한 본 발명의 유산균 발효물을 첨가하는 공정 또는 식품의 제조 후에 상술한 본 발명의 유산균 발효물을 첨가하는 공정에 의하여 용이하게 제조될 수 있다. 이때, 필요에 따라 맛과 냄새 교정제를 첨가할 수도 있다.
아울러, 상기 건강기능식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 중점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 건강기능식품은 천연 과일 주스 및 과일 주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이 같은 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 본 발명의 건강기능식품 100 중량부 당 약 20 중량부 이하의 범위 내에서 선택되는 것이 일반적이다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 혈관질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다. 상기 방법은 약학적으로 유효한 양의 귀비탕 유산균 발효물을, 치료를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함한다. 상기 개체는 인간, 인간을 제외한 동물 모두를 포함한다.
본 발명에서 용어 "개체"는 혈관 이완 효과를 갖는 본 발명에 따른 치료용 약학적 조성물의 투여에 의해 증상이 호전될 수 있는 혈관질환을 가진, 인간을 포함하여 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양, 개, 고양이 등의 포유동물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 혈관 이완 효과를 갖는 본 발명의 유산균 발효물을 개체에게 투여함으로써, 혈관질환을 효과적으로 예방 및 치료할 수 있다.
본 발명에서 용어 "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 동물에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명에 다른 치료용 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 경구 또는 비경구 투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 유산균 발효물은 유효성분이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
본 발명에서 용어 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 성별, 연령, 질병의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 유산균 발효물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있다. 또한 본 발명의 유산균 발효물은 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 구체적으로 본 발명의 치료용 조성물은 경구투여 또는 정맥투여가 바람직하다.
본 발명에 따른 유산균 발효물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여 경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 유산균 발효물은 1일 50 내지 1000 mg/kg으로, 바람직하게는 100 내지 500 mg/kg으로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 귀비탕의 유산균 발효물은 혈관 내피세포가 존재하는 혈관에서 혈관 이완효과를 나타냈고, 이러한 이완효과는 귀비탕 원시료에서는 나타나지 않았으나, 귀비탕의 유산균 발효물에서는 나타나는 새로운 효과이다(실시예 5 및 도 4).
이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: 본 발명에 따른 귀비탕 및 귀비탕의 유산균 발효물의 제조
본 발명에 따른 귀비탕 추출물의 유산균 발효물을 제조하기 위해 유산균주와 귀비탕을 각각 준비하였다.
먼저, MRS 배지에서 37℃에서 24시간씩 2회 계대배양하여 준비한 1 내지 5 ×107 CFU/ml 농도의 락토바실러스 커바투스(Lactobacillus curvatus) KFRI 166 균주를 유산균주로 사용하였다.
다음으로, 황기, 인삼, 백출, 복령, 당귀, 원지, 산조인, 용안육, 생강, 대추, 감초 및 목향을 이용하여 귀비탕을 제조한 후, 1 M 수산화나트륨을 이용하여 pH 8.0으로 조절하고, 이를 121℃에서 15분간 고압 멸균 처리하여 실온에서 냉각하여, 상기 유산균주를 접종할 배지를 준비하였다.
상기 준비된 배지에 상기 유산균주를 1 %(v/v) 농도로 접종하고, 호기조건하에서 37℃에서 48시간 동안 배양한 후, 원심분리하여 배양상등액을 수득하고, 상기 수득한 배양상등액을 동결건조함으로써, 본 발명의 유산균 발효물을 제조하였다.
실시예 2: 안지오텐신 전환효소 억제능
상기 실시예 1에서 제조한 귀비탕 원시료와 유산균 발효물에 대하여 단일농도(3 mg/ml)에서 안지오텐신 전환효소 억제 효능을 평가하였다. 본 실험은 안지오텐신 I을 안지오텐신 II로 전환시켜주는 효소인 안지오텐신 전환효소의 억제능을 나타내기 위한 실험이며, 안지오텐신 II의 생성이 억제되면 혈압강하가 나타난다.
안지오텐신 전환효소(angiotensin converting enzyme; ACE) 억제능은 토끼의 폐 아세톤 분말로부터 분리한 ACE와 그 기질인 hyppuryl-L-histidyl-L-leucine (Hip-His-Leu)과 작용하여 생성된 히푸르산(hippuric acid)의 흡광도 측정으로 이루어진다. 기질용액은 300 mM NaCl을 포함한 100 mM 나트륨 붕산염 완충액(sodium borate buffer)에 3 mM Hip-His-Leu를 혼합하여 수득하였다. 여기에 추출시료 50 μl를 첨가하여 37℃에서 5분간 전배양한 후 ACE(100 mU/ml) 50 μl를 넣고 한 시간 동안 효소반응시킨다. 반응시간이 끝난 후 반응을 정지시키기 위해 1 M HCl 250 μl을 첨가하였다. 반응정지 후 히푸르산을 추출하기 위해 1.7 ml 에틸아세테이트(ethyl acetate; EtOAc)를 넣고 잘 섞어주었다. 앞의 반응물을 2,000 g에서 10분간 원심분리한 후 상층액 1 ml를 깨끗한 마이크로튜브에 옮기고 약 60분 정도 원심농축기에서 에틸아세테이트를 모두 휘발시킨 후 1 ml의 증류수를 첨가하여 잘 섞은 후 228 nm에서 흡광도를 측정하였다. ACE 억제능은 다음과 같이 계산하였다.
억제능 (%) = {1-(Sa-Sb)/C}×100
Sa = 시료의 흡광도
Sb = 맹검액의 흡광도
C = 대조 반응의 흡광도
도 1은 귀비탕과 그의 유산균 발효물의 안지오텐신 전환효소 억제효능을 나타낸 그래프이다. 도 1에서 보듯이, 귀비탕 보다도 귀비탕의 유산균 발효물에서 전반적으로 안지오텐신 전환효소 억제 효능이 약 20% 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 생물전환을 통하여 기본적인 생리활성의 변화가 생겼음을 확인할 수 있었고, 이것은 항고혈압 활성을 확인하는 기초단계로서 효능을 확인한 것뿐만 아니라 미생물에 의한 생물전환이 잘 이루어졌는지 확인할 수 있었다.
실시예 3: 혈관이완성 평가
SD-rat(11 내지 13 주령)을 이산화탄소로 치사시킨 후 흉부를 절개하여 즉시 흉대동맥을 적출하였다. Krebs 용액(NaCl 120 mM, KCl 4.75 mM, glucose 6.4 mM, NaHCO3 25 mM, KH2PO4 1.2 mM, MgSO4 1.2 mM, CaCl2 1.7 mM)으로 채운 페트리 접시로 옮긴 후 결합조직과 지방 등 혈관 주변조직을 제거하고, 3 내지 5 mm의 흉대동맥 환상절편(aortic ring)을 만들었다. 산소로 포화시킨 Krebs 용액으로 채운 기관수조(organ bath) 내에 특수 제작된 스테인리스 조직 고정기로 현수하였다. organ bath 내의 온도는 37℃로 유지하였으며, 실험이 진행되는 동안 계속 카보겐(carbogen; 95% 산소, 5% 이산화탄소)을 공급하여 용액의 pH를 7.4로 유지시켰다. 적출대동맥에 1.5 g의 안정장력(resting tension)을 준 후 15분마다 수조 용액을 바꾸어 주면서 1시간 동안 안정시켰다. 혈관의 수축이완반응은 고정된 흉대동맥 환상절편의 다른 한쪽을 등장성 힘-전위 변환기(isometric force-displacement transducer; FT03. Grass, AD instrument, U.S.A.)에 연결시켜, 지문학 기록기(physiograph recorder;Powerlab/400, AD instrument, U.S.A.)로 기록하고, 윈도우즈 프로그램용 차트7(Chart7 for windows program, AD instrument, U.S.A.)으로 분석하였다. 적출 혈관에 대하여 귀비탕 원시료와 각각의 발효물에 대하여 단일농도(0.5 및 1.0 mg/ml)에서 혈관 반응성을 평가하였다(도 2).
도 2는 귀비탕과 그의 유산균 발효물의 혈관이완성을 나타낸 그래프이다. 도 2에서 보듯이, 귀비탕에서는 혈관이완성이 나타나지 않았으나, 귀비탕의 유산균 발효물(GB166)에서는 상대적으로 강한 혈관이완성이 나타났으며, 이는 생물전환에 따른 생리활성증가의 결과라고 분석되었다.
실시예 4: 생물전환 귀비탕(GB166)의 안지오텐신 전환효소 억제능
상기 실시예 3(도 2)에서 단일농도에서 혈관이완성이 새롭게 나타난 GB166 시료에 대하여 안지오텐신 전환효소 억제능을 농도 누적(0.1875, 0.375, 0.75, 1.5, 3 mg/ml)의 농도로 측정하였다(도 3). 도 3은 GB166 시료의 농도에 따른 안지오텐신 전환효소 억제효능을 나타낸 그래프이다. 도 3에서 보듯이, 귀비탕 원시료(GBcon)와 비교해 보았을 때 생물전환시킨 GB166에서 IC50 (mg/ml) 값이 1.011로 원시료의 1.729에 비하여 크게 감소한 것을 확인하였다.
실시예 5: 생물전환 귀비탕(GB166)의 혈관이완성 평가
상기 실시예 4에서 보인 바와 같이, 단일농도에서 활성을 보인 GB166 시료를 상기 실시예 3의 방법으로 적출한 흉대동맥 절편에 농도 누적적으로 (0.1875, 0.375, 0.75, 1.5, 3 mg/ml) 투여하여 결과를 얻었다(도 4).
도 4는 GB166 시료의 혈관이완성 효능을 나타낸 그래프이다. 도 4에서 보듯이, GB166은 혈관 내피세포가 존재하는 혈관에서는 농도 의존적으로 혈관 이완 효과를 나타내었다. 반면, 혈관 내피세포가 제거된 혈관에서는 상대적으로 혈관 이완 효과가 감소하는 것으로 나타났으며, 내피세포에서 산화질소 합성효소(Nitric oxide synthase; NOS)를 억제하는 물질인 L-NAME을 혈관 내피세포가 존재하는 혈관에 전처리 후 GB166을 투여하였을 때 혈관 내피세포가 제거된 혈관과 비슷한 혈관이완성을 나타내었다. 이로서 GB166 시료의 혈관이완성은 혈관내피 의존적인 효과를 나타낸다고 할 수 있으며 L-NAME 실험을 통하여 혈관 내피세포에서 분비되는 강력한 혈관이완인자인 산화질소(Nitric oxide; NO) 형성에 관여하는 것으로 분석되었다.
실시예 6: 적출 혈관 절편에서 Nitric Oxide(NO) 생성능
상기 실시예 3의 방법으로 적출한 혈관 절편을 DMEM 배지에서 1시간 배양하여 배지로 분비되는 NO의 양을 Griess 시약을 이용하여 측정하였다(도 5). 이때, 혈관 절편은 각각 약 5 mm로 일정하게 준비하였고 시료를 처리하고 이산화탄소 배양기에서 배양하였다.
도 5는 GB166 시료를 처리한 적출 흉대동맥 절편에서의 NO 생성능을 나타낸 그래프이다. 도 5에서 보듯이, 각 시료에 의한 NO 양은 거의 없는 반면 GB166을 혈관에 처리하여 배양한 경우 생성되는 NO 양이 농도의존적으로 유의적인 증가를 나타냄을 볼 수 있다. 혈관이완성 실험과 비교하여 보았을 때 GB166 시료가 혈관 내피세포에서 NO의 생성에 관여를 하고 이를 촉진시킴으로 배지에서도 생성된 NO 양이 증가하는 것으로 분석되었다.
실시예 7: 단회 투여에 의한 선천적 고혈압 모델 쥐에서 24시간 혈압 변화
상기 실시예 5와 6에서 혈관이완성 및 NO 생성을 증가시키는 것으로 보여진 GB166 시료에 대하여 선천성 고혈압쥐(Spontaneous Hypertension Rat; SHR)에서 단회 투여 후 24시간 동안 경시별로 혈압 변화추이를 관찰하였다. 혈압은 간접법(tail cuff method)을 사용하여 선청성 고혈압쥐(SHR)의 꼬리동맥에서 수축기 혈압을 측정하였다. 꼬리띠와 맥박 변환기(MLT1050, AD instrument, U.S.A.)를 꼬리에 위치시키고, 맥박 변환기는 지문학 기록기에 연결하여 혈압을 측정하였다. 혈압측정 전 실험동물을 36℃로 조절된 난방상자 내에서 10분간 안정화한 후 수축기 혈압을 측정하였다. 심박동수는 윈도우즈 프로그램을 위한 차트7(AD instrument, U.S.A.)으로 분석하였다(도 6). 이때, 양성대조군으로는 칼슘이온채널 길항제인 암로디핀(Amlodipine)을 사용하였다.
도 6은 GB166 시료 단회 투여한 SHR에서 24시간 동안의 혈압변화를 나타낸 그래프이다. 도 6에서 보듯이, 암로디핀(3 mg/kg, P.O.) 투여 후 2시간 만에 혈압이 정상 수준으로 낮아지는 것을 확인할 수 있었다. GB166의 경우 투여(200 mg/kg, P.O.) 후 4시간까지는 고혈압을 나타내다가 6시간 경과 후 40% 이상 혈압이 낮아지는 것을 확인할 수 있었다. 최저 혈압을 나타내는 시간(암로디핀; 2시간, 귀비탕; 6시간)이 지나고 시간이 지남에 따라 양성대조군와 실험군에서 서서히 혈압이 상승하는 것을 볼 수 있다. 다음의 결과로서 GB166 시료가 양성대조군인 암로디핀에 비하여 약하기는 하지만 천연물질로서 상당한 혈압강하 효과가 있음을 확인하였다.
실시예 8: 장기 투여에 의한 선천적 고혈압 쥐에서 혈압 변화
선천적 고혈압쥐(SHR)에 GB166 시료를 장기간 투여 후 혈압 변화를 7일 간격으로 8주간 측정하였다(도 7). 이때, 실험군은 시료를 200 mg/kg 농도로 경구투여하고, 대조군에는 시료를 녹인 용매만 같은 부피로 경구투여하였으며, 양성대조군은 암로디핀을 3 mg/kg 농도로 경구투여한 것을 사용하였다. SHR의 유전적 대조군으로 정상혈압을 나타내는 Wister Kyoto rat(WKR)을 사용하였다.
도 7은 GB166 시료를 장기투여한 SHR에서의 혈압변화를 나타낸 그래프이다. 도 7에서 보듯이, 실험 시작 0일 후 49일까지 WKR의 혈압은 정상을 유지하였고 암로디핀을 투여한 군에서는 지속적으로 혈압이 떨어져서 14일부터 정상혈압을 유지하였다. 실험군으로 GB166시료를 투여한 군은 암로디핀과 비교하여서는 약하지만 약 50% 정도의 혈압 강하효과를 실험기간동안 지속적으로 나타내었다.
또한, 8주간 장기투여 후 부검하여 고혈압에 따른 심비대정도를 간접적으로 확인하기 위하여 적출한 심장의 무게를 측정하였다(도 8).
도 8은 GB166 시료를 장기투여한 SHR에서의 심장무게 변화를 나타낸 그래프이다. 도 8에서 보듯이, 정상혈압을 나타내는 WKR과 비교하여 SHR에서 심장의 무게가 유의적으로 증가하는 것을 볼 수 있었다. 귀비탕 원시료를 경구투여한 군에서는 혈압 강하효과가 없는 것처럼 심장의 변화도 찾아볼 수 없었다. 하지만, 양성대조군인 암로디핀을 투여한 군에서 심장무게가 감소하는 것을 확인할 수 있었으며, 혈압 강하효과를 나타내는 GB166 시료를 투여한 군에서도 심장의 부담을 줄여주어 심비대를 감소시켜주는 효과가 있음을 간접적으로 확인하였다.
끝으로, 부검 후 혈청에서 산화질소 생성량은 Griess 시약을 이용하여 측정하였다(도 9). 측정은 메탄올로 혈청의 단백질성분을 침전시킨 후 진행하였다.
도 9는 GB166 시료를 장기투여한 SHR에서 혈청 내 NO 생성량을 나타낸 그래프이다. 도 9에서 보듯이, 정상혈압을 나타내는 WKR에 비하여 SHR 군에서 혈중 산화질소 양이 상승하는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 9: 생물전환 귀비탕의 직접 혈압 측정에 따른 혈압 변화
직접 혈압측정을 위하여 SD-rat을 졸레틸(Zoletil)(50 mg/kg)과 자일라진(xylazine)(3 mg/kg)으로 마취시킨 후 우측 경정맥과 좌측 경동맥에 약물투여용과 혈압측정용 카테터를 각각 삽입하였다. 좌측 경동맥 카테터는 혈압 변환기(MTL1050, AD instrument, U.S.A.)에 연결시켜 지문학 기록기(Powerlab/400, AD instrument, U.S.A.)로 평균 동맥압을 측정하였다. 심박동수(heart rate; HR)는 혈압에서 나온 신호를 윈도우즈 프로그램을 위한 차트7(AD instrument, U.S.A.)을 사용하여 분석하였다. 경동맥의 카테터 안에는 헤파린이 들어있는 생리식염수로 연결부위를 채웠고, 경정맥의 카테터는 멸균된 주사기와 연결하여 시료를 투여하였다. 혈압측정 약 1시간 후 혈압이 안정된 것을 확인한 후 한방처방 제제를 5, 25, 50, 100, 250 mg/kg 등 용량별로 단회 정맥 내 투여하였고 대조군에는 생리식염수를 동일한 양으로 단회 정맥 내 투여하였다. 약물투여 전과 후의 혈압 및 심박동수의 변화를 측정하여 그 변화율을 계산하여 그 결과를 대조군과 비교하였다(도 10).
도 10은 직접 혈압측정으로 농도에 따른 혈압변화와 심박수 변화를 나타낸 그래프이다. 도 10에서 보듯이, GB166을 경정맥에 투여한 경우 농도의존적(25, 100 mg/kg)으로 혈압이 20%, 35% 이상 감소하는 것을 확인하였다. 심박수 역시 농도에 따라 감소하는 것을 확인하였다.
실시예 10: 생물전환 귀비탕의 혈관내피세포에서 eNOS의 인산화
혈관 이완성의 기전적 해석을 위해 혈관내피세포에서 NO 생성을 촉진시키는 내피 산화질소 합성효소(endothelium Nitric Oxide Synthase; eNOS)의 인산화정도를 웨스턴 블랏과 면역세포화학(immunocytochemistry; ICH)을 통하여 확인하였다. 혈관내피세포는 EA.hy 926 cell(인간 내피 세포)를 사용하여 10% DMEM에 FBS(fetal bovine serum)를 2% 첨가한 배지를 사용하여 계대배양하여 실험에 사용하였으며 실험 하루 전에 혈청 유리 상태인 10% DMEM 배지로 교체 후 시료를 처리하였다(도 11).
도 11은 혈관 내피세포에서 eNOS의 인산화 정도를 나타낸 그래프와 ICH 결과이다. 도 11에서 보듯이, GB166 시료를 투여한 경우 웨스턴 블랏 상에서 농도의존적(50, 100, 200 μg/μl)으로 eNOS의 인산화가 증가한다는 것을 확인하였다. 또한 ICH에서도 GB166 시료를 처리한 경우 세포질에서 인산화된 eNOS가 증가하는 것을 확인할 수 있었다(Green; phospho-eNOS, Red; nuclei). eNOS의 Ser1177 기의 인산화는 eNOS를 활성화 시키며 eNOS의 인산화가 증가하면 혈관 내피세포에서 NO 생성이 증가한다고 분석되었다.

Claims (8)

  1. 귀비탕의 유산균 발효물을 유효성분으로 포함하는 혈관질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 혈관질환은 고혈압인 것인 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 유산균 발효물은 귀비탕에 유산균을 접종하고, 호기성 대기하에, 35 내지 45℃의 온도에서 1 내지 3일의 시간 동안 발효시켜서 수득하는 것인 조성물.
  4. 제1항 또는 제3항에 있어서,
    상기 유산균은 락토바실러스 속(Lactobacillus), 스트렙토코커스 속(Streptococcus), 비피도박테리움 속(Bifidobacterium), 락토코커스 속(Lactococcus), 페디오코커스 속(Pediococcus), 및 류코노스톡 속(Leoconostoc) 미생물로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 유산균은 락토바실러스 커바투스(Lactobacillus curvatus) KFRI 166인 것을 특징으로 하는 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    약학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 또는 희석제를 추가로 포함하는 것인 조성물.
  7. 귀비탕의 유산균 발효물을 포함하는 혈관질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
  8. 귀비탕의 유산균 발효물의 약학적으로 유효한 양을, 치료를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 개체의 혈관질환을 예방 또는 치료하는 방법.
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20030080709A (ko) * 2002-04-10 2003-10-17 이능기 약리활성이 우수하고 풍미가 개선된 탕약의 제조방법
KR20110030939A (ko) * 2009-09-18 2011-03-24 한국 한의학 연구원 갈근탕 또는 갈근탕 유산균 발효물을 유효성분으로 함유하는 간 독성 예방 또는 치료용 조성물
KR20110068889A (ko) * 2009-12-15 2011-06-22 동국대학교 산학협력단 한약재 발효물을 유효성분으로 포함한 비만 또는 고지혈증의 예방 및 치료용 조성물

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20030080709A (ko) * 2002-04-10 2003-10-17 이능기 약리활성이 우수하고 풍미가 개선된 탕약의 제조방법
KR20110030939A (ko) * 2009-09-18 2011-03-24 한국 한의학 연구원 갈근탕 또는 갈근탕 유산균 발효물을 유효성분으로 함유하는 간 독성 예방 또는 치료용 조성물
KR20110068889A (ko) * 2009-12-15 2011-06-22 동국대학교 산학협력단 한약재 발효물을 유효성분으로 포함한 비만 또는 고지혈증의 예방 및 치료용 조성물

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KIM, MI HYEON ET AL.: "Search of Gwibitang Lactic Acid Bacteria and Search of Component Change of Gwibitang", JOURNAL OF INDUSTRIAL SYMPOSIUM IN KOREAN SOCIETY OF FOOD AND NUTRITION, 2010, pages 5 - 23 *
ROH,J.-H. ET AL.: "Experimental study on the effect of Guibitanggamibang on blood pressure and hyperlipidemia", JOUNAL OF KOREAN ORIENTAL MEDICAL SOCIETY, vol. 18, no. 2, 1997, pages 245 - 266, XP053015863 *

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