ES2673007T3 - Bacterias probióticas recombinantes - Google Patents

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Abstract

Bacterias probióticas recombinantes, que comprenden (a) secuencia o secuencias de ácido nucleico que codifican un primer factor heterólogo, (a) secuencia o secuencias de ácido nucleico que codifican un segundo factor heterólogo y preferiblemente (a) secuencia o secuencias de ácido nucleico que codifican un tercer factor heterólogo, con la condición de que dicho primer factor, dicho segundo factor y dicho tercer factor son funcionalmente diferentes entre sí, en las que dicho primer factor es un factor de crecimiento, en las que dicho segundo factor se selecciona del grupo que consiste en factores polarizantes de M2, y en las que preferiblemente dicho tercer factor se selecciona del grupo que consiste en factores polarizantes de M2 y factores de crecimiento.

Description

DESCRIPCIÓN
Bacterias probióticas recombinantes
[0001] La presente invención se refiere a bacterias probióticas recombinantes, especialmente para uso en el tratamiento de una disfunción inflamatoria de la piel, así como a un procedimiento para tratar una disfunción inflamatoria de la piel.
[0002] La presente solicitud reivindica la prioridad de la solicitud internacional PCT/EP2015/052345.
[0003] Los macrófagos son un tipo de glóbulo blanco que se puede encontrar esencialmente en todos los tejidos. Los macrófagos juegan un papel crítico en la defensa no específica y también ayudan a iniciar mecanismos de defensa específicos al reclutar otras células inmunitarias, tales como los linfocitos.
[0004] Los macrófagos existen como macrófagos resistentes específicos de tejido o derivan de monocitos sanguíneos circulantes que se diferencian en macrófagos.
[0005] Los macrófagos muestran varios estados de activación. Dos estados de activación opuestos se conocen como macrófagos activados clásicamente, que también se designan como macrófagos polarizados M1, y alternativamente macrófagos activados, que también se designan como macrófagos polarizados M2.
[0006] Los macrófagos polarizados M1 comprenden células efectoras inmunitariass con un fenotipo inflamatorio activo. Los macrófagos polarizados M1 se caracterizan por la expresión de altos niveles de citocinas pro­ inflamatorias, alta producción de intermedios de nitrógeno y de oxígeno reactivos, la promoción de la respuesta de Th1 respuesta, y fuerte actividad microbicida y tumoricida.
[0007] Los macrófagos polarizados M2 son un fenotipo antiinflamatorio. Se considera que los macrófagos polarizados M2 están involucrados en la contención de parásitos y la promoción de la remodelación de tejidos y la progresión tumoral y tienen funciones inmunorreguladoras. Los macrófagos M2 también se caracterizan por una actividad fagocítica eficiente y una alta expresión de las moléculas atrapadoras.
[0008] La plasticidad y la flexibilidad son características de los fagocitos mononucleares de sus estados de activación. Por ejemplo, el fenotipo de los macrófagos polarizados M1 o polarizados M2 puede invertirse in vitro e in vivo.
[0009] Los macrófagos pueden cambiar, dependiendo del estímulo en el microentorno, el patrón de secreción de citocinas y quimiocinas varias veces. Por ejemplo, los macrófagos polarizados M1 primarios humanos pueden ser repolarizados por factores secretados de sus propios homólogos, a macrófagos polarizados M2, y viceversa in vitro e in vivo.
[0010] Además de presentar una primera línea de defensa contra los patógenos, los fagocitos mononucleares contribuyen a la remodelación y reparación de tejidos en condiciones homeostáticas y dañadas.
[0011] Además, los macrófagos son contribuyentes esenciales hacia el control de la inflamación con macrófagos polarizados M1 implicados en la iniciación y mantenimiento de la inflamación y los macrófagos polarizados M2 están asociados con el control de la inflamación crónica.
[0012] Por ejemplo, los macrófagos experimentan cambios dinámicos durante diferentes fases de la cicatrización de heridas. Los macrófagos polarizados M1 median el daño tisular e inician respuestas inflamatorias. Además, durante las primeras etapas de la respuesta de reparación de una herida, los macrófagos infiltrantes de la piel muestran un fenotipo polarizado M2 y apoyan la formación de un tejido de granulación celular altamente vascularizado.
[0013] La inflamación puede caracterizarse como inflamación aguda, en entornos tales como sepsis, trauma y cicatrización de heridas, o como inflamación crónica, por ejemplo en enfermedades, tales como artritis reumatoide, colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn, etc. Muchas otras enfermedades, como el cáncer, la diabetes, la arteriosclerosis, el Alzheimer y la obesidad también están asociadas con la inflamación desregulada.
[0014] La respuesta inflamatoria aguda implica una cascada de eventos, mediada por una gran variedad de células y moléculas que localizan los patógenos invasores o tejido dañado, alerta y reclutan otras células y moléculas, eliminar los agentes ofensivos y finalmente restaurar el cuerpo al equilibrio.
[0015] En la sepsis y el trauma, esta respuesta se acompaña de manifestaciones macroscópicas, tales como fiebre y ritmo cardíaco elevado. En otros tejidos, la inflamación se manifiesta como enrojecimiento, hinchazón y dolor.
[0016] Un bucle de prealimentación de la inflamación que conduce al daño/disfunción que conduce a la inflamación puede dar como resultado una inflamación persistente y desregulada que promueve la disfunción orgánica y la muerte. Una respuesta inflamatoria bien regulada es necesaria para la curación adecuada del tejido.
[0017] La restauración de la integridad de la piel y la homeostasis después de las lesiones requiere una interacción compleja y dinámica de las células epiteliales y mesenquimales junto con las células hematopoyéticas reclutadas y residentes en los tejidos para lograr las fases secuenciales de la respuesta de reparación: inflamación, formación de tejido y maduración. La etapa temprana de la respuesta de reparación está dominada por la fase inflamatoria, que se caracteriza por la activación local del sistema inmunitario innato que da lugar a un influjo inmediato de neutrófilos seguido de la posterior invasión de monocitos sanguíneos, que se diferencian en macrófagos.
[0018] La etapa media de la respuesta de reparación incluye la fase de formación de tejido, que se caracteriza por el desarrollo de tejido de granulación que rellena el espacio de la herida dérmica. La formación de tejido de granulación abarca la invasión de células endoteliales que da lugar a angiogénesis, la entrada de fibroblastos y la acumulación de macrófagos adicionales.
[0019] La deposición de la matriz extracelular provisional de la herida facilita la adhesión celular, la migración y la proliferación. Además, en el borde de la herida, las complejas interacciones epidérmicas-mesenquimales estimulan la proliferación y migración de los queratinocitos para restaurar la barrera epidérmica.
[0020] La formación de tejido de granulación continúa hasta que se rellena el espacio de la herida y se restaura la epidermis suprayacente. Una vez completada la barrera epidérmica, la respuesta de reparación entra en la etapa tardía, que se caracteriza por la maduración del tejido. Durante la fase de maduración del tejido, el tejido de granulación se transforma en tejido cicatricial.
[0021] Durante la reparación de la piel, la respuesta inmunitaria innata de las células residentes, así como las células inflamatorias reclutadas, combaten los microbios invasores, contribuyen al desbridamiento, pero también pueden apoyar el proceso de reparación al liberar un espectro de factores de crecimiento.
[0022] Sin embargo, debido a la liberación de mediadores proinflamatorios y citotóxicos, la actividad incontrolada de macrófagos también puede ser perjudicial para la reparación de tejidos.
[0023] Una inflamación desequilibrada caracterizada por un aumento del número de macrófagos es una característica de una respuesta de reparación atenuada en enfermedades humanas que conduce a la formación de heridas crónicas que no se curan. Los factores adicionales que contribuyen a las heridas crónicas que no se curan son, por ejemplo, diabetes, enfermedades venosas o arteriales, infección y deficiencias metabólicas en la vejez.
[0024] Existen varios procedimientos para el tratamiento de heridas crónicas, incluyendo el uso de antibióticos para el tratamiento de infecciones, desbridamiento, cierre asistido por vacío, y la oxigenación.
[0025] Otros procedimientos incluyen, por ejemplo, la aplicación de factores de crecimiento.
[0026] Por ejemplo, la becaplermina es un factor de crecimiento derivado de plaquetas humanas recombinante BB. La becaplermina se vende con el nombre comercial Regranex y está indicada para el tratamiento de úlceras neuropáticas diabéticas de las extremidades inferiores que se extienden hacia el tejido subcutáneo o más allá y tienen un suministro sanguíneo adecuado.
[0027] La becaplermina se indica además como un complemento y no como un sustituto de las prácticas de cuidado de la úlcera del pie, que incluyen desbridamiento agudo inicial, liberación de presión y control de infecciones.
[0028] Sin embargo, se observó una mayor tasa de mortalidad secundaria a tumores malignos en pacientes tratados con tres o más tubos de Regranex gel en un estudio de cohorte retrospectivo post-comercialización.
[0029] Otro factor de crecimiento utilizado es un factor de crecimiento epidérmico humano recombinante que se vende bajo el nombre comercial REGEN-D gel y que se utiliza para el tratamiento de úlceras crónicas diabéticas del pie.
[0030] Además, la trafermina es una forma recombinante de factor de crecimiento de fibroblastos humanos 2, que se vende bajo el nombre comercial "Fiblast spray". La trafermina se usa para el tratamiento de úlceras por presión y otras úlceras cutáneas, incluidas las úlceras por quemaduras y las úlceras negras.
[0031] Después de la aplicación diaria de trafermina o placebo durante el periodo de seis semanas a pacientes que sufren de úlcera neuropática diabética crónica de la úlcera del pie, se evaluó el tamaño mediante examen clínico semanal y fotografías computarizadas. La reducción semanal en el perímetro y el área de la úlcera fue idéntica en ambos grupos, al igual que la tasa de avance lineal desde la entrada hasta la sexta semana de tratamiento. Además, el porcentaje del área curada al final del estudio no difirió significativamente. De acuerdo con Richards et al. (1995) la aplicación tópica de trafermina no presentó ventajas sobre el placebo para curar la úlcera diabética neuropática crónica del pie.
[0032] En el mercado también hay dos sustitutos dérmicos que contienen células embrionarias humanas, que secretan diversos factores de crecimiento después de la aplicación en el área de la herida enferma.
[0033] El sustituto dérmico Dermagraft se compone de fibroblastos, matriz extracelular y un armazón bioabsorbible. Dermagraf se fabrica a partir de células de fibroblastos humanos derivadas de tejido de prepucio de recién nacido donado.
[0034] Durante el proceso de fabricación, los fibroblastos humanos se siembran en un armazón de poliglactina bioabsorbible.
[0035] El sustituto dérmico disponible comercialmente Apligraf contiene dos tipos de células derivados de prepucio neonatal. Los queratinocitos y fibroblastos humanos vivos se incrustan en una matriz de colágeno tipo 1 de la herida.
[0036] La desventaja de los sustitutos dérmicos antes mencionados es un alto precio comparable que resulta del proceso de fabricación. Por ejemplo, se analiza la sangre materna para detectar evidencia de infección con virus humanos, tales como el virus de inmunodeficiencia de tipo 1 y 2, virus de hepatitis B, virus de hepatitis C, sífilis, virus linfotrópico T humano tipo 1 y 2, así como el virus de Epstein Barr.
[0037] Otro producto disponible comercialmente se vende bajo el nombre comercial Procuren. Procuren es una fórmula de curación de heridas derivada de plaquetas para el tratamiento de heridas que no se curan. Procuren es un producto autólogo derivado de plaquetas que se prepara a partir de una muestra de sangre del paciente.
[0038] Sin embargo, no existen evidencias suficientes en cuanto a la eficacia de los productos autólogos derivados de plaquetas, incluyendo el factor de crecimiento derivado de plaquetas autólogo, para el tratamiento de heridas crónicas que no cicatrizan o el tratamiento de otras afecciones, tales como heridas quirúrgicas agudas.
[0039] Además, la cantidad de factores de crecimiento suministrada por los sustitutos dérmicos mencionados anteriormente, así como el producto autólogo derivado de plaquetas varía significativamente dependiendo de la calidad del material de partida.
[0040] El documento WO 2011/150127 A2 describe un sistema para el suministro de moléculas a una célula eurakyotic. El documento WO 2011/159880 A1 describe un Lactobacillus recombinante con ácido lipoteicoico disminuido para reducir las respuestas inflamatorias. El documento WO 2008/155120 A2 describe procedimientos y composiciones para tratar la mucositis. El documento WO 2009/114702A2 describe producciones recombinantes de proteínas humanas auténticas usando sistemas de expresión de células humanas. Steidler L. y Rottiers P., Ann. NY Acad. Sci. 1072: 176-178 (2006) se dirige a un suministro de fármacos terapéuticos mediante Lactococcus lactis modificados genéticamente.
[0041] Un objetivo de la presente invención es permitir un tratamiento alternativo de una disfunción inflamatoria crónica de la piel, lo que permite una aplicación fácil de factores beneficiosos para la disfunción inflamatoria crónica de la piel.
[0042] Por otra parte, una cantidad controlada de factores beneficiosos que apoyan la curación debe proporcionarse para el tratamiento de una disfunción inflamatoria crónica de la piel.
[0043] El objetivo de la presente invención se resuelve proporcionando bacterias probióticas recombinantes de acuerdo con la reivindicación 1 que comprende (a) una secuencia o secuencias de ácido nucleico que codifican un primer factor heterólogo, (a) una secuencia o secuencias de ácido nucleico que codifican un segundo factor heterólogo, y preferiblemente (a) una secuencia o secuencias de ácido nucleico que codifican un tercer factor heterólogo, con la condición de que dicho primer factor, dicho segundo factor y dicho tercer factor sean funcionalmente diferentes entre sí,
en las que dicho primer factor es un factor de crecimiento, en las que dicho segundo factor se selecciona del grupo que consiste en factores de polarización M2, y en las que preferiblemente dicho tercer factor se selecciona del grupo que consiste en factores de polarización M2 y factores de crecimiento,
en las que dicho factor de polarización M2 se selecciona del grupo que consiste en interleucina 4 (IL-4), interleucina 10 (IL-10), interleucina 13 (IL-13), factor estimulante de colonias-1 (CSF1), interleucina 34 (IL34) y mezclas de los mismos, y
en las que dicho factor de crecimiento se selecciona del grupo que consiste en factores de crecimiento de fibroblastos (FGF), factores de crecimiento endotelial vascular (VEGF), factores de crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento similar a EGF de unión a heparina (HB-EGF), factor de crecimiento transformante-a (TGF-a), factores de crecimiento similares a la insulina (IGF), factores de crecimiento derivados de plaquetas (PDGF), factor de crecimiento transformante beta (TGF-p) y mezclas de los mismos.
[0044] Preferiblemente, dichas bacterias probióticas recombinantes, según la reivindicación 1, comprenden al menos una secuencia de nucleico que codifica un primer factor heterólogo, al menos una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un segundo factor heterólogo, y al menos una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un tercer factor heterólogo, con la condición de que dicho primer factor, dicho segundo factor y dicho tercer factor sean funcionalmente diferentes entre sí,
en las que dicho primer factor es un factor de crecimiento, en las que dicho segundo factor se selecciona del grupo que consiste en factores de polarización M2 y en las que dicho tercer factor se selecciona del grupo que consiste en factores de polarización M2 y factores de crecimiento.
[0045] Las realizaciones preferidas de las bacterias probióticas recombinantes se describen en las reivindicaciones dependientes 2 a 17.
[0046] El objetivo de la presente invención se resuelve adicionalmente proporcionando bacterias probióticas recombinantes, según la reivindicación 18, para uso en el tratamiento de una herida crónica, en las que dichas bacterias probióticas recombinantes son bacterias probióticas recombinante, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en las que dicho primer, segundo y tercer factor heterólogo es una combinación de factor de crecimiento de fibroblastos 2, factor estimulante de colonias-1 e interleucina 4.
[0047] Las realizaciones preferidas de las bacterias probióticas recombinantes para uso, según la reivindicación 18, se describen en la reivindicación dependiente 19.
[0048] Los inventores descubrieron sorprendentemente que las bacterias probióticas recombinantes que comprenden las secuencias de ácido nucleico mencionadas anteriormente podrían ser utilizados en el tratamiento de una herida crónica.
[0049] Las realizaciones preferidas de la presente invención se describen en las reivindicaciones dependientes.
[0050] Según la presente invención, el término "factor funcionalmente diferente" o "funcionalmente diferentes entre sí" significa que los factores respectivos se unen preferentemente a diferentes receptores y/o activan diferentes segundos mensajeros en una célula diana. Los segundos mensajeros son moléculas de señalización intracelular liberadas por la célula para provocar cambios fisiológicos.
[0051] Según la presente invención, el término "análogo funcional" de un factor sginifica un agente que se une al receptor o receptores idénticos como el factor respectivo y preferiblemente activa segundos mensajeros idénticos en una célula diana.
[0052] Por ejemplo, un análogo funcional de nisina se une a NisK, que actúa como un receptor para la molécula madura de nisina o un análogo funcional de la misma, y, preferiblemente, conduce a una fosforilación posterior de NisR. La NisR fosforilada induce la transcripción del promotor de nisina respectivo.
[0053] Preferiblemente, "un análogo funcional" de dicho primer, segundo y tercer factor heterólogo tiene una identidad de secuencia de la secuencia de aminoácidos de al menos el 80%, aún más preferiblemente de al menos 90%, aún más preferiblemente de al menos 93%, más preferiblemente de al menos 95%, más preferiblemente de al menos 97%.
[0054] Según la presente invención, el término "factor heterólogo" significa un factor, preferiblemente una proteína, que no se produce naturalmente en o es expresado por dichas bacterias probióticas utilizadas.
[0055] Un "análogo funcional" puede también ser designado como biosimilar.
[0056] Cuando se hace referencia a "factor o factores heterólogos" en general o cuando se refiere a un "factor o factores heterólogos" específicos, tales como, por ejemplo, FGF-2, IL-4, CSF-1, etc., se pretende que este término incluya también análogos funcionales del mismo.
[0057] Las bacterias probióticas recombinantes que comprenden las secuencias de ácidos nucleicos mencionadas anteriormente son capaces de producir constantemente y/o después de la inducción una combinación única de los respectivos primer, segundo y, preferiblemente, tercer factor heterólogo mediante la transcripción y la traducción de las respectivas secuencias de ácido nucleico.
[0058] Esta única combinación de factores comprende al menos un factor de crecimiento y al menos un factor de polarización M2.
[0059] Preferiblemente, esta combinación única de factores comprende un factor de crecimiento, un primer factor de polarización M2 y un segundo factor de polarización M2 diferente de dicho primer factor de polarización M2. Alternativamente, esta combinación única de factores comprende un primer factor de crecimiento, un factor de polarización M2 y un segundo factor de crecimiento diferente de dicho primer factor de crecimiento.
[0060] Las bacterias probióticas recombinantes suministran preferiblemente una variedad de al menos dos; preferiblemente al menos tres, factores heterólogos, según la reivindicación 1, al tejido enfermo, modulando así el sistema inmunológico local y permitiendo la curación.
[0061] Preferiblemente, las bacterias probióticas recombinantes suministran el respectivo primer factor heterólogo y segundo factor heterólogo, y, preferiblemente, tercer factor heterólogo, después de la aplicación a dicha herida crónica.
[0062] Además, las bacterias probióticas recombinantes utilizadas de acuerdo con la presente invención proporcionan preferiblemente una liberación constante de los respectivos primer factor heterólogo y segundo factor heterólogo y, preferiblemente, tercer factor heterólogo, después de la aplicación al sitio de la herida crónica.
[0063] De esta manera, está disponible una opción de tratamiento muy mejorada, más segura y más rentable para los sujetos que sufren de dicha herida crónica.
[0064] Preferiblemente, el respectivo primer, segundo y tercer factor heterólogo, después de la liberación de las bacterias, ejercen una función activa biológica que apoya la curación de dicha herida crónica.
[0065] El primer factor heterólogo es un factor de crecimiento seleccionado del grupo citado en la reivindicación 1.
[0066] Preferiblemente, dicho factor de crecimiento se selecciona del grupo que consiste en factores de crecimiento de fibroblastos (FGF), factores de crecimiento endotelial vascular (VEGF), factores de crecimiento epidérmico (EGF), factores de crecimiento similares a la insulina (IGF), factores de crecimiento derivados de plaquetas (PDGF), factor de crecimiento transformante beta (TGF-beta) y mezclas de los mismos.
[0067] Por supuesto, los análogos funcionales de los factores o biosimilares de los mismos mencionados anteriormente o mencionados a continuación pueden utilizarse también dentro del alcance de la invención, tal como se reivindica. Los factores de crecimiento de fibroblastos son una familia de factores de crecimiento, que están involucrados en la angiogénesis, la cicatrización de heridas y diversas vías de señalización endocrina.
[0068] En los seres humanos, se han identificado 22 miembros de la familia de FGF, FGF-1 a FGF-14 y FGF-16 a FGF-23, que se puede utilizar en la presente invención.
[0069] Los FGF-1 a FGF-10 se unen a los receptores del factor de crecimiento de fibroblastos (FGFR).
[0070] El factor de crecimiento de fibroblastos 1 también se conoce como factor de crecimiento de fibroblastos ácido. El factor de crecimiento de fibroblastos 2 también se conoce como factor de crecimiento de fibroblastos básico. Además, el factor de crecimiento de fibroblastos 7 también se conoce como factor de crecimiento de queratinocitos (KGF) y el factor de crecimiento de fibroblastos 10 también se conoce como factor de crecimiento de queratinocitos 2 (KGF-2).
[0071] En una realización preferida, los factores de crecimiento de fibroblastos se seleccionan del grupo que consiste en FGF-1, FGF-2, FGF-3, FGF-4, FGF-5, FGF-6, FGF-7, FGF-8 , FGF-9, FGF-10 y mezclas de los mismos, más preferiblemente FGF-1, FGF-2, FGF-7, FGF-10, y mezclas de los mismos, más preferiblemente, FGF-2, FGF-7, análogos funcionales de los mismos, biosimilares de los mismos, y mezclas de los mismos, más preferiblemente FGF-2.
[0072] Por ejemplo, FGF-1 y FGF-2 pueden estimular la angiogénesis y son mitogénicos para varios tipos de células presentes en el sitio de una disfunción inflamatoria de la piel, incluyendo fibroblastos y queratinocitos. Además, FGF-7 puede estimular la reepitelización de heridas de forma paracrina.
[0073] El factor de crecimiento de fibroblastos 2 (FGF-2), preferiblemente el factor de crecimiento de fibroblastos 2 humano (hFGF-2), está implicado en diversos procesos biológicos, incluyendo la cicatrización de heridas y el crecimiento tumoral.
[0074] El ARNm para este gen contiene múltiples sitios de poliadenilación y se traduce de forma alternativa desde codones no AUG a de iniciación AUG, dando lugar a cinco isoformas diferentes con distintas propiedades. Las isoformas no AUG se localizan en el núcleo y son responsables del efecto intracrino, mientras que la forma iniciada por AUG es principalmente citosólica y es responsable de los efectos paracrinos y autocrinos del FGF-2.
[0075] La secuencia de ácidos nucleicos del ARNm del factor de crecimiento de fibroblastos humano 2 (hFGF-2) se encuentra disponible bajo el número de aceso de NCBI NM_002006.4. La secuencia de aminoácidos correspondiente del isómero AUG está disponible con el número de acceso de NCBI NP_001997.5, así como el número de acceso UniProt P09038 - versión 182 y también se muestra en la Figura 22a.
[0076] La preproproteína incluye un propéptido, que abarca los aminoácidos 1 a 142 de la preproteína, y el péptido factor de crecimiento de fibroblastos humanos 2, que abarca los aminoácidos 143 a 288 de la preproteína.
[0077] En una realización preferida, el factor de crecimiento de fibroblastos 2 comprende una o al menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ IDs 26 a 30, más preferiblemente la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID 28. La secuencia de aminoácidos de SEQ ID 28 está representada en la figura 22b.
[0078] Los factores de crecimiento similares a la insulina (IGF) son proteínas con una alta similitud de secuencia con la insulina. Los factores de crecimiento similares a la insulina comprenden dos proteínas IGF-1 e IGF-2, que pueden usarse en la presente invención.
[0079] La familia de factores de crecimiento epidérmico (EGFs) son proteínas con características estructurales y funcionales muy similares y comprenden las proteínas factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento similar a EGF de unión a heparina (HB-EGF), factor de crecimiento transformante a (TGF-a), anfiregulina (AR), epiregulina (EPR), epigeno (EPGN), betacelulina (BTC), neuregulina-1 (NRG1), neuregulina-2 (NRG2), neuregulina-3 (NRG3) y neuregulina-4 (NRG4), preferiblemente factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento similar a EGF de unión a heparina (HB-EGF), factor de crecimiento transformante-a (TGF-a), anfiregulina (AR), epiregulina (EPR), epigeno (EPGN) y betacelulina (BTC), más preferiblemente factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento similar a EGF de unión a heparina (HB-EGF) y factor de crecimiento transformante a (TGF-a), que puede usarse en la presente invención.
[0080] El factor de crecimiento epidérmico (EGF), preferiblemente el factor de crecimiento epidérmico humano (hEGF), estimula el crecimiento de diversos tejidos epidérmicos y epiteliales in vivo e in vitro y de algunos fibroblastos en cultivo celular. Además, el hEGF tiene un efecto profundo en la diferenciación de células específicas in vivo y es un potente factor mitogénico para una variedad de células cultivadas de origen tanto ectodérmico como mesodérmico.
[0081] El factor de crecimiento epidérmico humano existe en al menos tres isoformas producidas por corte y empalme alternativo.
[0082] La secuencia de aminoácidos de la preproteína del factor de crecimiento epidérmico humano, isoforma 1, está disponible bajo el número de acceso de NCBI NP_001954.1. La secuencia de ácidos nucleicos respectiva del ARNm está disponible con el número de acceso de NCBI NM_001963.2.
[0083] La preproteína de la isoforma 1 incluye un péptido señal, que abarca los aminoácidos 1 a 22 de la preproteína, un propéptido que abarca los aminoácidos 23 a 1207 de la preproteína y el péptido maduro del factor de crecimiento epidérmico humano, que abarca los aminoácidos 971 a 1023 de la preproproteína.
[0084] La secuencia de aminoácidos de la preproteína del factor de crecimiento epidérmico humano, isoforma 2, está disponible bajo el número de acceso de NCBI NP_001171601.1. La secuencia de ácidos nucleicos respectiva del ARNm está disponible con el número de acceso de NCBI NM_001178130.1. La secuencia de aminoácidos de la preproproteína del factor de crecimiento epidérmico humano, isoforma 3, está disponible con el número de acceso de NCBI NP_001171602.1. La secuencia de ácidos nucleicos respectiva del ARNm está disponible con el número de acceso de NCBI NM_001178131.1. Las secuencias de aminoácidos de las isoformas 1 a 3 del factor de crecimiento epidérmico humano también están disponibles con el número de acceso UniProt P01133 - versión 180 y también se muestran en las Figuras 25a a 25c. La secuencia de aminoácidos del factor de crecimiento epidérmico humano maduro se muestra en la Figura 25d.
[0085] El factor de crecimiento similar a EGF de unión a heparina (HB-EGF), preferiblemente el factor de crecimiento similar al EGF de unión a heparina humana (hHB-EGF), es un factor de crecimiento importante en la epitelización requerida para la curación de heridas cutáneas. El hHB-EGF tiene efectos mitogénicos y migratorios sobre los queratinocitos y fibroblastos. El hHB-EGF promueve además la reparación dérmica y la angiogénesis que es necesaria para la curación de heridas. El hHB-EGF es un componente principal de los líquidos de las heridas. El hHB-EGF es liberado por macrófagos, monocitos y queratinoctos. Además, la unión de la superficie celular de hHB-EGF a los proteoglicanos de heparán sulfato mejora las capacidades de promoción de mitógenos, aumentando la tasa de curación de heridas en la piel, disminuyendo los tiempos de curación del injerto de piel humana, y promueve la curación rápida de úlceras, quemaduras y heridas epidérmicas de grosor dividido.
[0086] La secuencia de aminoácidos de la preproteína del factor de crecimiento similar a EGF de unión a heparina humano se encuentra disponible bajo el número de acceso de NCBI NP_001936.1. La secuencia de ácidos nucleicos respectiva del ARNm está disponible con el número de acceso de NCBI NM_001945.2.
[0087] El precursor del factor de crecimiento similar a EGF de unión a heparina humano incluye un péptido señal, que abarca los aminoácidos 1 a 19 del precursor, el pro-factor de crecimiento similar similar a EGF de unión a heparina que abarca los aminoácidos 20 a 208 del precursor y el péptido del factor de crecimiento epidérmico humano maduro, que abarca los aminoácidos 63 a 148 del precursor.
[0088] La secuencia de aminoácidos del factor de crecimiento similar a EGF de unión a heparina humano también está disponible bajo el número de acceso Q99075 UniProt - versión 151 y también se muestra en las Figuras 26a. La secuencia de aminoácidos del factor de crecimiento similar a EGF de unión a heparina humano maduro se muestra en la Figura 26b.
[0089] El factor de crecimiento transformante a (TGF-a), preferiblemente el factor de crecimiento transformante humano a (hTGF-a), puede producirse en macrófagos, células cerebrales y queratinocitos. hTGF-a induce el desarrollo epitelial. hTGF-a y hEGF se unen al mismo receptor, el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR; ErbB-1; HER1 en humanos). Cuando el TGF-a se une al EGFR, puede iniciar múltiples eventos de proliferación celular, incluida la cicatrización de heridas.
[0090] El factor de crecimiento transformante-a humanos existe en al menos cinco isoformas producidas por corte y empalme alternativo.
[0091] La secuencia de aminoácidos de la preproteína del factor de crecimiento transformante alfa, isoforma 1, humana se encuentra disponible bajo el número de acceso de NCBI NP_003227.1. La secuencia de ácidos nucleicos respectiva del ARNm está disponible con el número de acceso de NCBI NM_003236.2.
[0092] El precursor de del factor de crecimiento transformante alfa humano, isoforma 1, incluye un péptido señal, que abarca los aminoácidos 1 a 23 del precursor, pro-factor de crecimiento transformante alfa, isoforma 1, que abarca los aminoácidos 24 a 160 del precursor y el péptido maduro del factor de crecimiento transformante alfa, que abarca los aminoácidos 40 a 89 del precursor.
[0093] La secuencia de aminoácidos de la preproteína del factor de crecimiento transformante alfa, isoforma 2, humana se encuentra disponible bajo el número de NCBI NP_001093161.1. La secuencia de ácidos nucleicos respectiva del ARNm está disponible con el número de acceso de NCBI NM_001099691.1.
[0094] La secuencia de aminoácidos de la preproteína del factor de crecimiento transformante alfa, isoforma 3, humana se encuentra disponible bajo el número de NCBI NP_001295087.1. La secuencia de ácidos nucleicos respectiva del ARNm está disponible con el número de acceso de NCBI NM_001308158.1.
[0095] La secuencia de aminoácidos de la preproteína del factor de crecimiento transformante alfa, isoforma 4, se encuentra disponible bajo el número de NCBI NP_001295088.1. La secuencia de ácidos nucleicos respectiva del ARNm está disponible con el número de acceso de NCBI NM_001308159.1.
[0096] La secuencia de aminoácidos de la preproteína del factor de crecimiento transformante alfa, isoforma 5, se encuentra disponible bajo el número de NCBI AAF05090.1. La secuencia de ácidos nucleicos respectiva del ARNm está disponible con el número de acceso de NCBI AF149097.1.
[0097] Las secuencias de aminoácidos de los precursores de factor de crecimiento transformante alfa humanos, isoformas 1 a 5, también están disponibles bajo número de acceso UniProt P01135 - versión 168 y se muestran en las Figuras 27a a 27e. La secuencia de aminoácidos del factor de crecimiento transformante alfa humano maduro se muestra en la Figura 27f. La anfiregulina (AREG), preferiblemente la anfiregulina humana (hAREG), es otro ligando del receptor de EGF. La anfiregulina humana es un factor de crecimiento autocrino, así como un mitógeno para una amplia gama de células diana, incluidos los astrocitos, las células de Schwann y los fibroblastos. La anfiregulina humana promueve el crecimiento de células epiteliales.
[0098] La secuencia de aminoácidos de la preproteína de anfirregulina humana se encuentra disponible bajo el número de acceso de NCBI NP_001648.1. La secuencia de ácidos nucleicos respectiva del ARNm está disponible con el número de acceso de NCBI NM_001657.3.
[0099] El precursor de preproproteína de anfirregulina humana incluye un péptido señal, que abarca los aminoácidos 1 a 19 de la preproteína, un propéptido que abarca los aminoácidos 20 a 100 de la preproteína y el péptido del factor de crecimiento transformante alfa maduro, que abarca los aminoácidos 101 a 187 de la preproproteína.
[0100] La secuencia de aminoácidos de la preproproteína de anfiregulina humana también está disponible con el número de acceso UniProt P15514 - versión 147 y también se muestra en la Figura 28a. La secuencia de aminoácidos de la anfiregulina humana madura se muestra en la Figura 28b.
[0101] La epiregulina (EPR), preferiblemente la epiregulina humana (hEPR), es un ligando del receptor EGF que puede estimular la proliferación celular y/o la angiogénesis.
[0102] La secuencia de aminoácidos de la preproproteína de epiregulina humana está disponible con el número de acceso de NCBI NP_001423.1. La secuencia de ácidos nucleicos respectiva del ARNm está disponible con el número de acceso de NCBI NM 001432.1.
[0103] La preproproteína de la epiregulina humana incluye un péptido señal, que abarca los aminoácidos 1 a 29 de la preproproteína, la proepiregulina que abarca los aminoácidos 30 a 169 de la preproproteína y la epiregulina madura, que abarca los aminoácidos 60 a 108 de la preproproteína.
[0104] La secuencia de aminoácidos de la preproproteína de epiregulina humana también está disponible con el número de acceso UniProt O14944 - versión 146 y también se muestra en la Figura 29a. La secuencia de aminoácidos de la epiregulina humana madura se muestra en la Figura 29b.
[0105] El epigeno (EPGN), preferiblemente epigeno humano (hEPGN), promueve el crecimiento de células epiteliales. El epigeno humano existe en al menos siete isoformas producidas por cortes y empalmes alternativos.
[0106] La secuencia de aminoácidos del precursor de epigeno humano, isoforma 1, se encuentra disponible bajo el número de NCBI NP_001257918.1. La secuencia de ácidos nucleicos respectiva del ARNm está disponible con el número de acceso de NCBI NM_001270989.1.
[0107] El precursor de epigeno humano, isoforma 1, incluye un péptido señal, que abarca los aminoácidos 1 a 22 del precursor y la epirregulina madura, que abarca los aminoácidos 23 a 154 del precursor.
[0108] La secuencia de aminoácidos de los precursores de isoformas 1 a 7 de epígenos humanos también está disponible con el número de acceso UniProt Q6UW88 - versión 101 y también se muestra en las Figuras 30a a 30g. La secuencia de aminoácidos del epígeno humano maduro se muestra en la Figura 30h.
[0109] La betacelulina (BTC), preferiblemente la betacelulina humana (hBTC), es un factor de crecimiento que también se une al receptor del factor de crecimiento epidérmico y que es sintetizado por una amplia gama de tejidos adultos y en muchas células cultivadas, que incluyen células de músculo liso y células epiteliales. La secuencia de aminoácidos del precursor de probetacelulina humana está disponible con el número de acceso de NCBI NP_001720.1. La secuencia de ácidos nucleicos respectiva del ARNm está disponible con el número de acceso de NCBI NM_001729.1.
[0110] El precursor de la probetacelulina humana incluye un péptido señal, que abarca los aminoácidos 1 a 31 del precursor, la probetacelulina, que abarca los aminoácidos 32 a 178 del precursor, y la betacelulina madura, que abarca los aminoácidos 32 a 111 del precursor.
[0111] La secuencia de aminoácidos del precursor de probetacelulina humana también está disponible con el número de acceso UniProt P35070 - versión 139 y también se muestra en la Figura 31a. La secuencia de aminoácidos de la betacelulina humana madura se muestra en la Figura 31b.
[0112] El factor de crecimiento similar a la insulina 1 (IGF-1) también se llama somatomedina C. La secuencia de ácidos nucleicos del ARNm del IGF-1 humano está disponible con el número de acceso de NCBI NM_000618.2. La secuencia de aminoácidos correspondiente está disponible con el número de acceso de NCBI NP_000609.1, así como con el número de acceso UniProt P05019 - versión 178.
[0113] La preproproteína incluye un péptido señal, que abarca los aminoácidos 1 a 21 de la preproproteína, y el péptido del factor de crecimiento similar a la insulina humana 1, que abarca los aminoácidos 49 a 118 de la preproproteína.
[0114] La secuencia de ácidos nucleicos del ARNm del factor de crecimiento similar a la insulina humano 2 (hIGF-2) está disponible bajo el número de acceso de NCBI NM_000612.4. La secuencia de aminoácidos respectiva de la preproproteína del factor de crecimiento similar a la insulina humano 2 está disponible con el número de acceso de NCBI Np_000603.1, así como el número de acceso UniProt P01344 - versión 192.
[0115] La preproproteína incluye un péptido señal, que abarca los aminoácidos 1 a 24 de la preproproteína, y la cadena madura del factor de crecimiento similar a la insulina 2, que abarca los aminoácidos 25 a 91 de la preproproteína.
[0116] La familia de factores de crecimiento endotelial vascular (VEGF) es un grupo de factores de crecimiento, que incluyen VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D y el factor de crecimiento placentario (PGF), que pueden utilizarse en la presente invención.
[0117] En una realización preferida, el factor de crecimiento endotelial vascular es el factor de crecimiento endotelial vascular A (VEGF-A).
[0118] El VEGF-A puede inducir angiogénesis, vasculogénesis y crecimiento de células endoteliales.
[0119] La secuencia de ácidos nucleicos del ARNm del factor de crecimiento endotelial vascular humano A (hVEGF-A) está disponible con el número de acceso de NCBI NM_001025366.1. La secuencia de aminoácidos correspondiente del factor de crecimiento endotelial vascular humano A está disponible con el número de acceso de NCBI NP_001020537.2, así como con el número de acceso UniProt P15692 - versión 197.
[0120] La proteína precursora del factor de crecimiento endotelial vascular humano A incluye un péptido señal, que abarca los aminoácidos 1 a 26 de la proteína precursora, así como el factor de crecimiento endotelial vascular A humano maduro, que abarca los aminoácidos 27 a 232 de la proteína precursora.
[0121] El factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) regula el crecimiento y la división celular. El factor de crecimiento derivado de plaquetas humano (hPDGF) tiene cuatro subunidades, PDGF-A, PDGF-B, PDGF-C y PDGF-D, que forman homodímeros o heterodímeros de las respectivas subunidades, que pueden usarse en la presente invención.
[0122] Preferiblemente, el factor de crecimiento derivado de plaquetas es PDGF-AA, PDGF-BB, PDGF-AB, PDGF-CC, PDGF-DD, o una mezcla de los mismos.
[0123] Más preferiblemente, el factor de crecimiento derivado de plaquetas es una proteína dimérica compuesta por dos subunidades PDGF-A, una glicoproteína dimérica compuesta por dos subunidades PDGF-B, una glicoproteína dimérica compuesta por una subunidad PDGF-A y una subunidad PDGF-B, o una mezcla de los mismos.
[0124] La secuencia de ácidos nucleicos del ARNm de la subunidad A del factor de crecimiento derivado de plaquetas humano (hPDGF-A) está disponible con el número de acceso de NCBI NM_002607.4. La secuencia de aminoácidos correspondiente está disponible con el número de acceso de NCBI NP_002598.4, así como con el número de acceso UniProt P04085 - versión 159.
[0125] La preproproteína respectiva de la subunidad PDGF-A humana codifica un péptido señal, que abarca los aminoácidos 1 a 20 de la preproproteína, y la subunidad A del factor de crecimiento derivado de plaquetas humano maduro que abarca los aminoácidos 87 a 211 de la preproproteína.
[0126] La secuencia de ácidos nucleicos del ARNm de la subunidad B del factor de crecimiento derivado de plaquetas humano (hPDGF) está disponible con el número de acceso de NCBI NM_002608.1. La secuencia de aminoácidos respectiva de la preproproteína de la subunidad del factor de crecimiento derivado de plaquetas humano está disponible con el número de acceso de NCBI NP_002599.1, así como el número de acceso UniProt P01127 - versión 181.
[0127] La preproproteína de la subunidad PDGF-B humana codifica un péptido señal, que abarca los aminoácidos 1 a 20 de la preproproteína, y la forma madura de la subunidad B del factor de crecimiento derivado de plaquetas humano, que abarca los aminoácidos 82 a 190 de la preproproteína.
[0128] El factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) es un factor de crecimiento que es secretado por las células mesenquimales y actúa principalmente sobre las células epiteliales y las células endoteliales, pero también sobre las células progenitoras hemapoéticas y puede usarse en la presente invención.
[0129] El HGF se secreta como una preproproteína única y es dividida por la serina proteinasa en una cadena alfa de 69 kGa y una cadena beta de 34 kDa. La secuencia de aminoácidos de la preproproteína, así como la cadena alfa y beta respectiva, se representan en las Figuras 23a a 23 c.
[0130] La secuencia de ácidos nucleicos del ARNm del factor de crecimiento de hepatocitos humano (hHGF) está disponible bajo el número de acceso de NCBI NM_000601.3. La secuencia de aminoácidos respectiva de la preproproteína del factor de crecimiento de hepatocitos humano está disponible con el número de acceso de NCBI NP_000592.3, así como el número de acceso UniProt P14210 - versión 186.
[0131] La preproproteína incluye un péptido señal, que abarca los aminoácidos 1 a 31 de la preproproteína, la cadena alfa del factor de crecimiento de hepatocitos humano, que abarca los aminoácidos 32 a 494 de la preproproteína, y la cadena beta del factor de crecimiento de hepatocitos humano, que abarca los aminoácidos 495 a 728 de la preproproteína.
[0132] El factor de crecimiento transformante p (TGF-p), preferiblemente el factor de crecimiento transformante p humano (hTGF-p), es una citocina que es secretada por muchos tipos de células, incluidos los macrófagos.
[0133] El TGF-p existe en al menos tres isoformas, TGF-p1, TFG-p2 y TGF-p3, que pueden usarse en la presente invención. Las secuencias de aminoácidos de las proteínas precursoras respectivas y de las proteínas maduras se representan en las Figuras 21a a 21g.
[0134] El factor de crecimiento transformante p1 humano es una proteína secretada que se escinde en un péptido asociado con latencia (LAP) y un péptido de TGF-p1 maduro. El péptido maduro puede formar homodímeros de TGF-p1 o heterodímeros con otros miembros de la familia de TGF-p.
[0135] La secuencia de ácidos nucleicos del ARNm del precursor del factor de crecimiento transformante p1 humano se puede obtener mediante el número de acceso de NCBI NM_000660.4. La secuencia de aminoácidos correspondiente está disponible con el número de acceso de NCBI NP_000651.3 o el número de acceso UniProt P01137 - versión 199.
[0136] La secuencia de aminoácidos del precursor de TGF-p1 humano incluye un péptido señal, que abarca los aminoácidos 1 a 29 de la proteína precursora, el péptido asociado a la latencia, que abarca los aminoácidos 30 a 278 de la proteína precursora, y el factor de crecimiento transformante p1 maduro, que abarca los aminoácidos 279 a 390 de la proteína precursora.
[0137] El factor de crecimiento transformante p2 (TGF-p2), preferiblemente el factor de crecimiento transformante p2 humano (hTGF-p2), es una citocina multifuncional que regula la proliferación, diferenciación, adhesión y migración de muchos tipos de células.
[0138] Alternativamente, se han identificado variantes de transcripción empalmadas del gen del factor de crecimiento transformante p2 humano, que codifican dos isoformas diferentes.
[0139] La secuencia de ácidos nucleicos del ARNm del precursor del factor de crecimiento transformante beta 2 isoforma 1 humano se encuentra disponible bajo el número de acceso de NCBI NM_001135599.3. La secuencia de aminoácidos respectiva está disponible con el número de acceso de NCBI NP_001129071.1.
[0140] El precursor del factor de crecimiento transformante beta 2 isoforma 1 humano incluye un péptido señal que abarca los aminoácidos 1 a 20 de la proteína precursora, un péptido asociado a la latencia, que abarca los aminoácidos 21 a 302 de la proteína precursora, y el factor de crecimiento transformante beta 2 maduro, que abarca los aminoácidos 303 a 414 de la proteína precursora.
[0141] La secuencia de ácidos nucleicos del ARNm del precursor de la isoforma 2 del factor de crecimiento transformante p2 humano está disponible con el número de acceso de NCBI NM_003238.3. La secuencia de aminoácidos respectiva está disponible con el número de acceso de NCBI NP_003229.1. La proteína precursora incluye un péptido señal, que abarca los aminoácidos 1 a 20 de la proteína precursora, un péptido asociado a la latencia, que abarca los aminoácidos 21 a 302 de la proteína precursora, y el péptido TGF-p2 maduro, que abarca el aminoácidos 303 a 414 de la proteína precursora.
[0142] La secuencia de aminoácidos del factor de crecimiento transformante p2 también está disponible con el número de acceso UniProt P61812 - versión 128.
[0143] El factor de crecimiento transformante p3 (TGF-p3), preferiblemente el factor de crecimiento transformante p3 humano (hTGF-p3), es una citocina secretada que participa en la embriogénesis y la diferenciación celular.
[0144] La secuencia de ácidos nucleicos del ARNm de la proteína precursora del factor de crecimiento transformante p3 humano está disponible con el número de acceso de NCBI NM_003239.3. La secuencia de aminoácidos correspondiente está disponible con el número de acceso de NCBI NP_003230.1, así como con el número de acceso UniProt P10600 - versión 170.
[0145] La proteína precursora incluye un péptido señal, que incluye los aminoácidos 1 a 23 de la proteína precursora, un péptido asociado a la latencia, que incluye los aminoácidos 24 a 30 de la proteína precursora, y el péptido del factor de crecimiento transformante p3 maduro, que abarca los aminoácidos 301 a 412 de la proteína precursora.
[0146] Preferiblemente, el factor de crecimiento transformante p comprende una o al menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ IDs 19 a 25
[0147] Las activinas son proteínas diméricas unidas por disulfuro originalmente purificadas de líquidos gonadales como proteínas que estimulan la liberación de la hormona estimulante del folículo hipofisario (FSH). Las proteínas de activina tienen una amplia gama de actividades biológicas, incluida la inducción del mesodermo, la diferenciación de las células neurales, la remodelación ósea, la hematopoyesis y los roles en la fisiología reproductiva.
[0148] Las activinas son homodímeros o heterodímeros de varias isoformas de subunidades beta, mientras que las inhibinas son heterodímeros de una subunidad alfa única y una de las diversas subunidades beta.
[0149] Se conocen cuatro subunidades beta, beta A, beta B, beta C, y beta E.
[0150] El segundo factor heterólogo se selecciona del grupo que consiste en factores de polarización M2.
[0151] Preferiblemente, los factores de polarización M2 actúan sobre macrófagos no polarizados, macrófagos polarizados M1 así como también monocitos indiferenciados y otras células progenitoras de macrófagos.
[0152] Más preferiblemente, dichos factores de polarización M2 inducen la polarización M2 de macrófagos no polarizados, macrófagos polarizados M1 así como monocitos indiferenciados y otras células progenitoras de macrófagos.
[0153] El experto en la materia sabe que los macrófagos pueden experimentar una diferenciación específica dependiendo del entorno del tejido local. Similar a la polarización T-colaboradora tipo 1 (Th1) y T-colaboradora tipo 2 (Th2), se han definido dos estados distintos de polarización de los macrófagos: el fenotipo de macrófagos activado clásicamente (polarizado M1) y el alternativamente fenotipo de macrófago activado (polarizado M2).
[0154] El fenotipo de macrófagos polarizados M2 se puede dividir adicionalmente en subconjuntos: fenotipo polarizado M2a, polarizado M2b y polarizado M2c basado en perfiles de expresión génica.
[0155] Los macrófagos polarizados M1 y polarizados M2 tienen distintos perfiles de quimiocinas y receptores de quimiocinas.
[0156] Los macrófagos polarizados M1 secretan preferiblemente las quimiocinas que atraen células Th1 quimiocina (motivo C-X-C) ligando 9 (CXCL9) y la quimiocina 10 motivo C-X-C (CXCL10). Los macrófagos polarizados M2 secretan preferiblemente las quimiocinas quimiocina (motivo C-C) ligando 17 (CCL17), motivo C-C quimiocina 22 (CCL22) y quimiocina (motivo C-C) ligando 24 (CCL24).
[0157] Un efecto de polarización M2 de un factor heterólogo puede determinarse, por ejemplo, poniendo en contacto los macrófagos no polarizados, los macrófagos polarizados M1, o células progenitoras de macrófagos, preferentemente monocitos, con al menos un factor de polarización M2, y, posteriormente, determinando la expresión y/o secreción de marcadores de polarización M2.
[0158] Por ejemplo, una línea celular de macrófagos no polarizados murinos, una línea celular de macrófagos polarizados M1 murinos, o una línea celular progenitora de macrófagos murinos, preferiblemente una línea celular de monocitos murinos, pueden ponerse en contacto con al menos un factor de polarización M2 que genera un línea celular de macrófagos polarizados M2 murina. La polarización M2 de las líneas celulares de macrófagos murinos se puede detectar, por ejemplo, determinando la expresión de los siguientes factores: arginasa 1 (Arg1), interleucina 10 (IL-10), receptor de manosa C tipo 1 (Mrc1) e Ym1, que es también llamado factor quimiotáctico de eosinófilos derivado de linfocitos T (ECF-L) o proteína 3 similar a quitinasa (Chil3). La polarización M1 de las líneas celulares de macrófagos murinos se puede detectar, por ejemplo, determinando la expresión y/o liberación de los siguientes factores: factor de necrosis tumoral alfa (TNFalfa, TNFa), interleucina 6 (IL-6), quimiocina (motivo C-C) ligando 2 (CCL2) y quimiocina (motivo C-C) ligando 4 (CCL4).
[0159] Preferiblemente, los macrófagos polarizados M2 humanos se derivan de monocitos humanos, que son incubados con al menos un factor de polarización M2. La polarización M2 de macrófagos derivados de monocitos humanos puede, por ejemplo, detectarse determinando la expresión y/o liberación de los siguientes factores: antagonista del receptor de interleucina 1 (IL1RA), prostaglandina E2 (PGE2), interleucina 10 (IL-10) y factor de crecimiento transformante beta (TGF-p).
[0160] Recientemente, se ha demostrado que, in vitro, los macrófagos son capaces de invertir la polarización de M2 a M1, y viceversa, en respuesta a los cambios en el entorno de las citocinas (Davis et al. (2013)). Además, el cambio en la polarización es rápido y tiene lugar a nivel de expresión génica, proteína, metabolito y actividad microbicida.
[0161] Además, los macrófagos son una de las principales poblaciones de leucocitos infiltrantes asociados con tumores sólidos. Los macrófagos asociados a tumores (TAM) juegan un papel importante en la inmunidad tumoral y muestran funciones similares a la polarización M2, también denominada polarización TAM M2d.
[0162] Los factores respectivos necesarios para la estimulación y/o activación de la polarización respectiva (M1, M2a, M2b, M2c, y M2D TAM) son conocidos para el experto y, por ejemplo, se describen en Hao et al. (2012) o Duluc et al. (2007)
[0163] Preferiblemente, los respectivos segundos factores heterólogos y, opcionalmente, el tercer factor heterólogo inducen polarización M2 después de la expresión en dichas bacterias probióticas recombinantes y se liberan de las bacterias en el sitio de la disfunción inflamatoria crónica de la piel.
[0164] Los macrófagos antiinflamatorios polarizados M2 entonces promueven preferiblemente la angiogénesis, el depósito de tejido conectivo y la reparación de heridas, lo que conduce a una mejora, preferiblemente curación, de dicha disfunción inflamatoria crónica de la piel a tratar.
[0165] Preferiblemente, dicho factor de polarización M2 induce la polarización M2c.
[0166] Dicho factor de polarización M2 se selecciona del grupo que consiste en interleucina 4 (IL-4), interleucina 10 (IL-10), interleucina 13 (IL-13), factor estimulante de colonias-1 (CSF1), interleucina 34 (IL34), análogos funcionales de los mismos, biosimilares de los mismos y mezclas de los mismos, preferiblemente interleucina 4 (IL-4), interleucina 10 (IL-10), interleucina 13 (IL-13), factor estimulante de colonias-1 (CSF1), interleucina 34 (Il34), y mezclas de los mismos, más preferiblemente factor estimulante de colonias-1 (CSF1), interleucina 34.
[0167] (IL34) interleucina 4 (IL-4), interleucina 13 (IL-13), análogos funcionales de los mismos, biosimilares de los mismos y mezclas de los mismos, más preferiblemente factor estimulante de colonias-1 (CSF1), interleucina 34 (IL34) interleucina 4 (IL-4), interleucina 13 (IL-13) y mezclas de los mimsmos.
[0168] La interleucina 4 (IL-4), preferiblemente la interleucina 4 humana (hIL-4), es una citocina pleiotrópica. La interleucina 4 es un ligando para el receptor de interleucina 4. El receptor de interleucina 4 también se une a la interleucina 13 (IL-13), lo que puede contribuir a muchas funciones superpuestas de la interleucina 4 y la interleucina 13.
[0169] La interleucina 4 (IL-4) también ha demostrado tener propiedades inductoras de la proliferación. Además, la interleucina 4 (IL-4) induce la producción de colágeno.
[0170] La secuencia de ácidos nucleicos del ARNm del precursor de la interleuquina 4, isoforma 1, se encuentra disponible bajo el número de acceso de NCPI NM_000589.3. La secuencia de aminoácidos respectiva está disponible con el número de acceso de NCBI NP_000580.1 y se representa en la Figura 18a.
[0171] La secuencia de ácidos nucleicos del ARNm del precursor de la interleuquina 4, isoforma 2, se encuentra disponible bajo el número de de NCBI NM_172348.2. La secuencia de aminoácidos respectiva está disponible con el número de acceso de NCBI NP_758858.1 y se representa en la Figura 18b.
[0172] La secuencia de aminoácidos de la interleucina 4 humana también está disponible con el número de acceso UniProt P05112 - versión 178.
[0173] Las secuencias de aminoácidos comprenden un péptido señal que abarca los aminoácidos 1 a 24 de los precursores de la isoforma 1 y la isoforma 2 de la interleucina 4.
[0174] Preferiblemente, la interleucina 4 humana comprende una o al menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ IDs 10 a 14.
[0175] La interleucina 13 (IL-13), preferiblemente la interleucina 13 humana (hIL-13), es una citocina inmunorreguladora producida principalmente por células Th2 activadas.
[0176] La secuencia de ácidos nucleicos del ARNm del precursor de interleucina 13 humana está disponible con el número de acceso de NCBI NM_002188.2. La secuencia de aminoácidos correspondiente está disponible con el número de acceso de NCBI NP_002179.2, así como con el número de acceso UniProt P35225 - versión 157 y se representa en la Figura 20a.
[0177] El precursor de interleucina 13 comprende un péptido señal que abarca los aminoácidos 1 a 24 de la proteína precursora de la interleucina 13 depositada con el número de acceso UniProt P35225 - versión 157.
[0178] Preferiblemente, la interleucina 13 comprende una o al menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ IDs 17 y 18.
[0179] La interleucina 10 (IL-10), preferiblemente la interleucina 10 humana (hIL-10), es una citocina producida principalmente por monocitos y, en menor medida, por linfocitos. La interleucina 10 tiene efectos pleiotrópicos en la inmunorregulación y la inflamación. Por ejemplo, la interleucina 10 regula por disminución la expresión de citocinas Th1.
[0180] La secuencia de ácidos nucleicos del ARNm del precursor de interleucina 10 humana se puede encontrar con el número de acceso de NCBI NM_000572.2. La secuencia de aminoácidos respectiva se puede encontrar bajo el número de acceso de NCBI NP_000563.1, así como el número de acceso UniProt P22301 - versión 156 y se representa en la Figura 19a.
[0181] La secuencia de aminoácidos del precursor de la interleucina 10 incluye un péptido señal que abarca los aminoácidos 1 a 18 de la proteína precursora de la interleucina 10.
[0182] Preferiblemente, la interleucina 10 comprende una o al menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ IDs 15 a 16.
[0183] El factor estimulante de colonias 1 (CSF-1), que también se conoce como factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF), es una citocina que controla la producción, diferenciación y función de los macrófagos.
[0184] Debido al corte y empalme alternativo, el CSF-1 humano existe en diferentes isoformas, que pueden usarse en la presente invención.
[0185] La secuencia de ácidos nucleicos del ARNm de la isoforma 1 del CSF-1 humano, que también se designa como precursor de la isoforma A del factor estimulante de colonias de macrófagos 1, está disponible con el número de acceso de NCBI NM_000757.5. La secuencia de aminoácidos correspondiente está disponible con el número de acceso de NCBI NP_000748.3 y se representa en la Figura 16a.
[0186] La secuencia de ácidos nucleicos del ARNm del precursor de la isoforma 2 del CSF-1 humano, que también se designa como precursor de la isoforma B del factor estimulante de colonias de macrófagos 1 humano, se encuentra disponible bajo el número de acceso de NCBI NM_172210.2 NCBI. La secuencia de aminoácidos correspondiente está disponible con el número de acceso de NCBI NP_757349.1 y se representa en la Figura 16b.
[0187] La secuencia de ácidos nucleicos del ARNm del precursor de la isoforma 3 de CSF-1 humano, que también se designa como precursor de la isoforma C del factor estimulante de colonias de macrófagos 1, se encuentra disponible bajo el número de acceso de NCBI NM_172211.3. La secuencia de aminoácidos correspondiente está disponible con el número de acceso de NCBI NP_757350.1 y se representa en la Figura 16c.
[0188] Las secuencias de aminoácidos respectivas también están disponibles con el número de acceso UniProt P09603 - versión 158. La isoforma 1 se ha elegido como secuencia UniProt canónica.
[0189] Las respectivas secuencias de proteínas de las isoformas 1 a 3 del precursor de CSF-1 humano incluyen un péptido señal N-terminal, que abarca del número de aminoácido 1 al número de aminoácido 32 de las secuencias de aminoácidos respectivas.
[0190] La forma activa de CSF-1 humano se puede encontrar extracelularmente como un homodímero unido por disulfuro. La forma activa se produce mediante la escisión proteolítica de un precursor unido a la membrana que resulta en la pérdida del péptido señal N-terminal.
[0191] Preferiblemente, el factor estimulante de colonias 1 comprende una o al menos una de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID 1 a 6.
[0192] La interleucina 34 (IL-34) es una citocina que también promueve la diferenciación y la viabilidad de monocitos y macrófagos.
[0193] Debido al corte y empalme alternativo, la interleucina 34 humana existe en dos isoformas, que pueden usarse en la presente invención.
[0194] La secuencia de ácidos nucleicos del ARNm del precursor de la isoforma 1 de la interleuquina 34 humana se encuentra disponible bajo el número de acceso de NCBI NM_001172772.1. La secuencia de aminoácidos correspondiente está disponible con el número de acceso de NCBI NP_001166243.1 y se representa en la Figura 17a.
[0195] La secuencia de ácidos nucleicos del ARNm del precursor de la isoforma 2 de la interleuquina 34 humana se encuentra disponible bajo el número de acceso de NCBI NM_001172771.1. La secuencia de aminoácidos correspondiente está disponible con el número de acceso de NCBI NP_001166242.1 y se representa en la Figura 17b.
[0196] La secuencia de aminoácidos correspondiente también está disponible bajo el número de UniProt Q6ZMJ4 -versión 80.
[0197] El precursor de interleuquina 34 humana incluye un péptido señal, que abarca los aminoácidos 1 a 20 de las respectivas secuencias de aminoácidos de las proteínas precursoras.
[0198] Preferiblemente, la interleucina 34 comprende una o al menos una de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID 7 a 9.
[0199] En una realización preferida, dicho factor de polarización M2 promueve la diferenciación y viabilidad de monocitos y macrófagos a través de la unión al receptor del factor estimulante de colonias-1.
[0200] El receptor del factor estimulante de colonias 1 (CSF1R), que también se conoce como receptor del factor estimulante de colonias de macrófagos, es una proteína tirosina-quinasa que actúa como un receptor de la superficie celular y desempeña un papel esencial en la regulación de la supervivencia, la proliferación y diferenciación de macrófagos y monocitos.
[0201] CSF1R promueve, por ejemplo, la liberación de quimiocinas proinflamatorias en respuesta a la unión del ligando CSF1R y por lo tanto juega un papel importante en la inmunidad innata y en procesos inflamatorios.
[0202] Preferiblemente, dicho factor de polarización M2 es al menos un ligando del receptor del factor estimulante de colonias 1 (CSF1R).
[0203] Los ligandos CSF1R son conocidos por el experto en la materia e incluyen la interleucina 34 (IL-34) y factor estimulante de colonias 1 (CSF-1). Preferiblemente, dicho ligando del receptor del factor estimulante de colonias 1 se selecciona del grupo que consiste en factor estimulante de colonias 1 (CSF-1), interleucina 34 (IL-34), análogos funcionales de los mismos y biosimilares de los mismos.
[0204] Además, preferiblemente, dicho ligando del receptor del factor estimulante de colonias 1 es un ligando del receptor del factor estimulante de colonias 1 humano, más preferiblemente seleccionado del grupo que consiste en factor estimulante de colonicas-1 humano (HCSF-1), interleucina 34 (hIL -34), análogos funcionales de los mismos y biosimilares de los mismos.
[0205] En una realización más preferida, dicho ligando del receptor del factor estimulante de colonias 1 es una proteína que tiene una o al menos una de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID N° 1 a 9.
[0206] En una realización preferida, dicho primer, segundo y/o tercer factor heterólogo se expresa con una secuencia señal secretora, preferiblemente péptido o propéptido señal N-terminal. Después de la expresión del factor respectivo, la secuencia señal secretora, preferiblemente el péptido o propéptido señal N-terminal, puede eliminarse mediante modificación postraduccional. Alternativamente, dicho primer, segundo y/o tercer factor heterólogo podría expresarse en forma madura, preferiblemente sin una secuencia señal secretora, preferiblemente péptido o propéptido señal N-terminal.
[0207] En una realización preferida, dichas bacterias probióticas recombinantes, según la reivindicación 1, comprenden al menos una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un primer factor heterólogo, al menos una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un segundo factor heterólogo y al menos una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un tercer factor heterólogo, con la condición de que dicho primer factor, dicho segundo factor y dicho tercer factor sean funcionalmente diferentes entre sí,
en las que dicho primer factor es un factor de crecimiento, en las que dicho segundo factor se selecciona del grupo que consiste en factores de polarización M2 y en las que dicho tercer factor se selecciona del grupo que consiste en factores de polarización M2 y factores de crecimiento.
[0208] En una realización preferida, dicho segundo factor heterólogo y dicho tercer factor heterólogo se seleccionan del grupo que consiste en factores de polarización M2, en el que dicho segundo factor y dicho tercer factor son factores de polarización M2 funcionalmente diferentes.
[0209] Es decir, dicho segundo factor heterólogo es un primer factor de polarización M2 y dicho tercer factor heterólogo es un segundo factor de polarización M2 funcionalmente diferente de dicho primer factor de polarización M2.
[0210] Preferiblemente, dicho primer factor de polarización M2 es un factor de polarización M2 seleccionado del grupo que consiste en factor estimulante de colonias-1 (CSF-1), interleucina 34 (IL-34), interleucina 4 (IL-4), e interleucina 13 (IL-13), y dicho segundo factor de polarización M2 es un factor de polarización M2 seleccionado del grupo que consiste en factor estimulante de colonias-1 (CSF-1), interleucina 34 (IL-34), interleucina 4 (IL-4), interleucina 10 (IL-10) e interleucina 13 (IL-13), con la condición de que dicho segundo factor de polarización M2 sea funcionalmente diferente de dicho primer factor de polarización M2.
[0211] Más preferiblemente, dicho primer factor de polarización M2 es un ligando del receptor del factor estimulante de colonias 1 (CSF1R) y dicho segundo factor de polarización M2 es un factor de polarización M2 seleccionado del grupo que consiste en interleucina 4 (IL-4), interleucina 10 (IL-10), interleucina 13 (IL-13), análogos funcionales de la misma, biosimilares de los mismos y mezclas de los mismos.
[0212] Otras combinaciones preferidas de factores de polarización M2 son:
- factor estimulante de colonias 1 e interleucina 4,
- factor estimulante de colonias 1 e interleucina 13,
- factor estimulante de colonias 1 e interleucina 10,
- interleucina 34 e interleucina 4,
- interleucina 34 e interleucina 13,
- interleucina 34 e interleucina 10,
- interleucina 4 e interleucina 10 o
- interleucina 13 e interleucina 10.
[0213] Las combinaciones más preferidas mencionadas anteriormente de factores de polarización M2 se combinan con al menos uno de los factores de crecimiento mencionados anteriormente, preferiblemente con un factor de crecimiento seleccionado del grupo que consiste en factor de crecimiento de fibroblastos 1, factor de crecimiento de fibroblastos 2, factor de crecimiento de fibroblastos 7, factor de crecimiento de fibroblastos 10, factor de crecimiento de hepatocitos, factor de crecimiento transformante beta (TGF-beta), factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento similar a EGF de unión a heparina (HB-EGF), factor de crecimiento transformante-a (TGF -a), y el factor de crecimiento derivado de plaquetas BB.
[0214] Preferiblemente, dichos primer, segundo y tercer factor heterólogo es una combinación de
- factor de crecimiento de fibroblastos 2, factor de estimulación de colonias 1 e interleucina 4,
- factor de crecimiento de fibroblastos 2, interleucina 34 e interleucina 4,
- factor de crecimiento de fibroblastos 2, factor de estimulación de colonias 1 e interleucina 13,
- factor de crecimiento de fibroblastos 2, interleucina 34 e interleucina 13,
- factor de crecimiento de fibroblastos 2, factor de estimulación de colonias 1 e interleucina 10,
- factor de crecimiento de fibroblastos 2, interleucina 34 e interleucina 10,
- factor de crecimiento de fibroblastos 7, factor de estimulación de colonias 1 e interleucina 4,
- factor de crecimiento de fibroblastos 7, interleucina 34 e interleucina 4,
- factor de crecimiento de fibroblastos 7, factor de estimulación de colonias 1 e interleucina 13,
- factor de crecimiento de fibroblastos 7, interleucina 34 e interleucina 13,
- factor de crecimiento de fibroblastos 7, factor de estimulación de colonias 1 e interleucina 10,
- factor de crecimiento de fibroblastos 7, interleucina 34 e interleucina 10,
- factor de crecimiento transformante beta, factor estimulante de colonias-1 e interleucina 4,
- factor de crecimiento transformante beta, interleucina 34 e interleucina 4,
- factor de crecimiento transformante beta, factor estimulante de colonias 1 e interleucina 13,
- factor de crecimiento transformante beta, interleucina 34 e interleucina 13
- factor de crecimiento transformante beta, factor estimulante de colonias 1 e interleucina 10,
- factor de crecimiento transformante beta, interleucina 34 e interleucina 10,
- factor de crecimiento transformante alfa, factor estimulante de colonias 1 e interleucina 4,
- factor de crecimiento transformante alfa, interleucina 34 e interleucina 4,
- factor de crecimiento transformante alfa, factor estimulante de colonias 1 e interleucina 13,
- factor de crecimiento transformante alfa, interleucina 34 e interleucina 13,
- factor de crecimiento transformante alfa, factor estimulante de colonias 1 e interleucina 10,
- factor de crecimiento transformante alfa, interleucina 34 e interleucina 10
- factor de crecimiento derivado de plaquetas BB, factor estimulante de colonias 1 e interleucina 4,
- factor de crecimiento derivado de plaquetas BB, interleucina 34 e interleucina 4,
- factor de crecimiento derivado de plaquetas BB, factor estimulante de colonias-1 e interleucina 13,
- factor de crecimiento derivado de plaquetas BB, interleucina 34 e interleucina 13,
- factor de crecimiento derivado de plaquetas BB, factor estimulante de colonias-1 e interleucina 10, o
- factor de crecimiento derivado de plaquetas BB, interleucina 34 e interleucina 10.
[0215] Más preferiblemente, dicho primer, segundo y tercer factor heterólogo es una combinación de factor de crecimiento de fibroblastos 2, factor estimulante de colonias-1 e interleucina 4, análogos funcionales de los mismos y biosimilares de los mismos.
[0216] Preferiblemente, mediante la liberación de dos o más factores de polarización M2 de las bacterias probióticas de la presente invención, se fomenta aún más la polarización M2 de macrófagos no polarizados, macrófagos polarizados M1 así como monocitos indiferenciados y otras células progenitoras de macrófagos.
[0217] En una realización alternativa, dicho primer factor es un primer factor de crecimiento seleccionado del grupo que consiste en los factores de crecimiento mencionados anteriormente, y dicho tercer factor es un segundo factor de crecimiento seleccionado del grupo que consiste en los factores de crecimiento mencionados anteriormente y que es funcionalmente diferente de dicho primer factor de crecimiento. Preferiblemente, dicho segundo factor de crecimiento es el factor de crecimiento transformante beta (TGF-beta).
[0218] Otras combinaciones preferidas de factores de crecimiento son:
- factor de crecimiento de fibroblastos 1 y factor de crecimiento transformante beta,
- factor de crecimiento de fibroblastos 2 y factor de crecimiento transformante beta,
- factor de crecimiento de fibroblastos 7 y factor de crecimiento transformante beta,
- factor de crecimiento de fibroblastos 10 y factor de crecimiento transformante beta,
- factor de crecimiento derivado de plaquetas BB y factor de crecimiento transformante beta,
- factor de crecimiento transformante alfa y factor de crecimiento transformante beta,
- factor de crecimiento epidérmico y factor de crecimiento transformante beta,
- factor de crecimiento similar a EGF de unión a heparina y factor de crecimiento transformante beta,
- factor de crecimiento hepatocitario y factor de crecimiento transformante beta, o
- factor de crecimiento endotelial vascular A y factor de crecimiento transformante beta.
[0219] Las combinaciones más preferidas mencionadas anteriormente de factores de crecimiento se combinan preferiblemente con un factor de polarización M seleccionado del grupo que consiste en factor estimulante de colonias-1 (CSF-1), interleucina 34 (IL-34), interleucina 4 (IL -4), interleucina 10 (IL-10), interleucina 13 (IL-13) y mezclas de los mismos, preferiblemente factor estimulante de colonias-1 (CSF-1), interleucina 34 (IL-34), interleucina 4 (IL-4) ), interleucina 13 (IL-13) y mezclas de los mismos.
[0220] Las bacterias probióticas recombinantes de la invención deben usarse en el tratamiento de una disfunción inflamatoria crónica de la piel.
[0221] Preferiblemente, una disfunción inflamatoria crónica de la piel es una enfermedad inflamatoria crónica de la piel o una enfermedad inflamatoria crónica del tejido conectivo. Dicha enfermedad inflamatoria de la piel es preferiblemente una herida, úlcera o combinaciones de las mismas, más preferiblemente úlcera.
[0222] Dicha enfermedad inflamatoria crónica de la piel también puede incluir un traumatismo cutáneo inflamatorio, preferiblemente inflamatorio crónico, que puede progresar a un estado inflamatorio crónico.
[0223] La congelación es la afección médica en la que se produce daño localizado en la piel y otros tejidos debido a la congelación y puede implicar la destrucción del tejido. Dicha congelación también pueden ser sabañones (perniones), que son úlceras superficiales de la piel que resultan de la exposición al frío y la humedad. El daño a los lechos capilares en la piel causa enrojecimiento, picazón, inflamación y, a veces, ampollas. Más preferiblemente, dichas congelaciones son sabañones.
[0224] Dicha úlcera puede ser una úlcera de decúbito o un ulcus cruris. Dicha úlcera también puede ser una úlcera venosa, una úlcera arterial, una úlcera diabética o una úlcera por presión.
[0225] Dicha úlcera también puede ser una etapa de preulceración de las úlceras mencionadas anteriormente sin ningún signo visible de herida abierta en la piel. Sin intervención médica, la etapa de preulceración puede progresar a ulceración.
[0226] Dicha herida es una herida crónica.
[0227] Las heridas crónicas son conocidas por el experto en la materia e incluyen, por ejemplo, úlceras venosas crónicas, úlceras arteriales crónicas, úlceras diabéticas crónicas y úlceras por presión crónicas. Las heridas crónicas también pueden ser causadas por intoxicación por radiación o isquemia. Preferiblemente, dicha herida crónica es al menos una de una úlcera venosa crónica, una úlcera arterial crónica, una úlcera por presión crónica y una etapa de preulceración crónica de la misma, preferiblemente una úlcera venosa crónica, una úlcera arterial crónica y una úlcera por presión crónica.
[0228] Las úlceras venosas crónicas generalmente pueden aparecer en las piernas y representan aproximadamente del 70% al 90% de las heridas crónicas, que afectan principalmente a pacientes de edad avanzada.
[0229] Otra causa importante de heridas crónicas es la diabetes. Los pacientes que padecen diabetes tienen un 15% más de riesgo de amputación que la población general debido a las úlceras crónicas. La diabetes causa neuropatía, que inhibe la nocicepción y la percepción del dolor. Por lo tanto, los pacientes pueden no notar pequeñas heridas en las piernas y los pies y, por lo tanto, no pueden prevenir infecciones o lesiones repetidas.
[0230] Un problema adicional es que la diabetes causa un compromiso inmunitario y daño a los vasos sanguíneos pequeños, dando como resultado una oxigenación reducida del tejido. La prevención de la oxigenación adecuada del tejido aumenta significativamente la prevalencia de heridas crónicas.
[0231] Las úlceras por presión, que también se conocen como úlceras de decúbito o “bed sore”, pueden aparecer o no con la afección de diabetes. Las úlceras por presión son lesiones localizadas en la piel y/o el tejido subyacente que pueden aparecer sobre una prominencia ósea como resultado de la presión, o presión en combinación con cizallamiento o fricción.
[0232] La diabetes es un trastorno metabólico endocrino principal con una proporción en expansión que se ha acercado a un estado de pandemia mundial. La ulceración de las extremidades inferiores, por ejemplo, las úlceras diabéticas del pie, es una de las complicaciones graves a largo plazo asociadas con la diabetes que puede ser prolongada y amplificada por el fracaso subyacente de la regeneración tisular.
[0233] Hay aproximadamente 13 millones de pacientes con heridas crónicas en los EE. UU., la UE y Japón, de los cuales aproximadamente 2,8 millones sufren de ulceración de las extremidades inferiores, tales como úlceras del pie diabético.
[0234] La ulceración de las extremidades inferiores, por ejemplo, las úlceras del pie diabético, son difíciles de tratar sin una terapia definitiva no invasiva convencional. La ulceración de las extremidades inferiores necesita mucha atención médica y es extremadamente debilitante para los pacientes asociados con una pérdida sustancial de calidad de vida.
[0235] Aproximadamente, el 24% de los pacientes que sufren de ulceración de las extremidades inferiores requerirá una amputación que conduce a una discapacidad a largo plazo.
[0236] El coste anual de la atención médica para pacientes que sufren de ulceración de las extremidades inferiores es del orden de $100 mil millones de dólares. Además, la tasa de mortalidad a cinco años de los pacientes que sufren de ulceración de las extremidades inferiores es de aproximadamente el 45%, que es más alta que la de muchos tipos de cáncer.
[0237] Actualmente, el tratamiento terapéutico estándar de heridas crónicas que incluyen heridas diabéticas, tales como la ulceración de las extremidades inferiores, se centra principalmente en controlar la infección y promover la revascularización. A pesar de estas estrategias, la tasa de amputación sigue siendo inaceptablemente alta en pacientes que sufren de ulceración de las extremidades inferiores.
[0238] Además, cuando una afección de enfermedad subyacente o causa de una ulceración, tal como diabetes mellitus o insuficiencia venosa crónica, se mejora y/o trata, por ejemplo, controlando los niveles de azúcar en sangre o administrando medicamentos para la presión arterial, respectivamente, las úlceras existentes pueden todavía tardar mucho tiempo en curar.
[0239] Por lo tanto, para superar la falta de tratamientos definitivos y no invasivos de heridas crónicas que incluyen heridas diabéticas, tales como ulceración de las extremidades inferiores, se necesitan urgentemente nuevas estrategias para reactivar y promover la curación de heridas en pacientes que sufren heridas crónicas.
[0240] Preferiblemente, en el caso de una herida crónica, la combinación única de factores, preferiblemente liberados de dichas bacterias probióticas, permite una reprogramación de dicha herida crónica en una herida aguda, que posteriormente se cierra.
[0241] En una realización preferida, las bacterias probióticas recombinantes se administrarán por vía tópica y/o mediante inyección subcutánea, más preferiblemente por vía tópica.
[0242] Las bacterias probióticas recombinantes se administrarán preferiblemente por vía tópica a la disfunción inflamatoria crónica de la piel a tratar.
[0243] Las bacterias probióticas recombinantes se pueden administrar tópicamente a la disfunción inflamatoria crónica de la piel y/o mediante inyección subcutánea en la vecindad de la disfunción cutánea, preferiblemente en los bordes o la cavidad de la disfunción inflamatoria crónica de la piel.
[0244] Después de la aplicación de las bacterias probióticas recombinantes de la presente invención, las bacterias expresan dicho primer y segundo factor heterólogo, preferiblemente dicho primer, segundo y tercer factor heterólogo.
[0245] Además, mediante aplicación tópica o inyección subcutánea de las bacterias probióticas recombinantes de la presente invención a y/o en el sitio de la preulceración, se puede evitar una progresión de la preulceración a una herida abierta.
[0246] Las bacterias probióticas recombinantes se obtienen preferiblemente mediante la transformación de bacterias probióticas con al menos una secuencia de ácidos nucleicos que codifica dicho primer factor heterólogo y al menos una secuencia de ácidos nucleicos que codifica dicho segundo factor heterólogo y, preferiblemente, con al menos una secuencia de ácidos nucleicos que codifica dicho tercer factor heterólogo.
[0247] Las bacterias probióticas adecuadas para la obtención de las bacterias probióticas recombinantes de la presente invención son bacterias no patógenas. Preferiblemente, las bacterias no patógenas son bacterias no invasivas. En una realización más preferida, las bacterias probióticas recombinantes son bacterias grampositivas, preferiblemente bacterias grampositivas no esporulantes. Más preferiblemente, dichas bacterias probióticas son bacterias no colonizadoras que carecen de la capacidad de multiplicarse en el tracto gastrointestinal humano.
[0248] En una realización más preferida, las bacterias probióticas recombinantes comprenden una cepa bacteriana de grado alimenticio gram positiva.
[0249] De acuerdo con una realización preferida de la presente invención, las bacterias probióticas recombinantes pueden ser de la misma cepa bacteriana o una mezcla de diferentes cepas bacterianas.
[0250] En otra realización, las bacterias probióticas se clasifican como "generalmente reconocidas como seguras" (GRAS) por la Administración de Fármacos y Alimentos de los Estados Unidos (FDA).
[0251] En otra realización, las bacterias probióticas tienen una "presunción de seguridad calificada" (estado QPS) según lo definido por la Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria (EFSA). Una introducción del enfoque de presunción de seguridad calificada (QPS) para la evaluación de microorganismos seleccionados se describe en el EFSA Journal, vol. 587, 2007, páginas 1-16.
[0252] En una realización más preferida, las bacterias probióticas son bacterias no patógenas que pertenecen a los phylum firmicutes o actinobacterias. Preferiblemente, las bacterias probióticas son bacterias no patógenas de al menos un género seleccionado del grupo que consiste en bifidobacterias, corinebacterias, enterococos, lactobacilos, lactococos, leuconostoc, pediococos, propionibacterias y estreptococos.
[0253] En otra realización preferida, las bacterias probióticas son bacterias de ácido láctico (LAB). Las bacterias del ácido láctico son un grupo de bacterias grampositivas, tolerantes a los ácidos, generalmente no esporulantes, que no respiran y que comparten características metabólicas y fisiológicas comunes. Estas bacterias producen ácido láctico como un importante producto final metabólico de la formación de carbohidratos.
[0254] Las bacterias de ácido láctico se conocen desde hace tiempo y se utilizan, por ejemplo, en la fermentación de alimentos. Además, las bacteriocinas proteicas son producidas por varias cepas de bacterias del ácido láctico.
[0255] Además, las bacterias del ácido láctico tienen un estado de generalmente reconocidas como seguras (GRAS) debido a su presencia ubicua en los alimentos y su contribución a la microflora saludable de superficies mucosas humanas.
[0256] En una realización más preferida, las bacterias probióticas excluyen bacterias patógenas y/u oportunistas.
[0257] En otra realización, las bacterias probióticas son del género Bifidobacterium sp., que incluyen, pero no se limitan a, Bifidobacterium actinocoloniiforme, Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium aesculapii, Bifidobacterium angulatum, Bifidobacterium Bifidobacterium animalis, por ejemplo, Bifidobacterium animalis subsp. animalis or Bifidobacterium animalis subsp. lactis, Bifidobacterium asteroides, Bifidobacterium biavatii, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium bohemicum, Bifidobacterium bombi, Bifidobacterium boum, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium callitrichos, Bifidobacterium catenulatum, Bifidobacterium choerinum, Bifidobacterium coryneforme, Bifidobacterium crudilactis, Bifidobacterium cuniculi, Bifidobacterium denticolens, Bifidobacterium dentium, Bifidobacterium faecale, Bifidobacterium gallicum, Bifidobacterium gallinarum, Bifidobacterium globosum, Bifidobacterium indicum, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium inopinatum, Bifidobacterium kashiwanohense, Bifidobacterium lactis, Bifidobacterium longum, por ejemplo, Bifidobacterium longum subsp. infantis, Bifidobacterium longum subsp. longum, o Bifidobacterium longum subsp. suis, Bifidobacterium magnum, Bifidobacterium merycicum, Bifidobacterium minimum, Bifidobacterium mongoliense, Bifidobacterium moukalabense, Bifidobacterium pseudocatenulatum, Bifidobacterium pseudolongum, por ejemplo Bifidobacterium pseudolongum subsp. globosum o Bifidobacterium pseudolongum subsp. pseudolongum, Bifidobacterium psychraerophilum, Bifidobacterium pullorum, Bifidobacterium reuteri, Bifidobacterium ruminantium, Bifidobacterium saeculare, Bifidobacterium saguini, Bifidobacterium scardovii, Bifidobacterium stellenboschense, Bifidobacterium subtile, Bifidobacterium stercoris, Bifidobacterium suis, Bifidobacterium thermacidophilum, por ejemplo, Bifidobacterium thermacidophilum subsp. porcinum o Bifidobacterium thermacidophilum subsp. thermacidophilum, Bifidobacterium thermophilum, o Bifidobacterium tsurumiense.
[0258] Preferiblemente, las bacterias probióticas no son Bifidobacterium dentium.
[0259] Preferiblemente, las bacterias probióticas son bacterias que tienen un estado de "presunción de seguridad calificada" (QPS) en el género Bifidobacterium sp., que incluyen, pero no se limitan a, Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium breve o Bifidobacterium bifidum.
[0260] En una realización, las bacterias probióticas son del género Corynebacterium sp., que incluyen pero no se limitan a, Corynebacterium accolens, Corynebacterium afermentans, por ejemplo Corynebacterium afermentans subsp. Afermentans o Corynebacterium afermentans subsp. lipophilum, Corynebacterium ammoniagenes, Corynebacterium amycolatum, Corynebacterium appendices, Corynebacterium aquatimens, Corynebacterium aquilae, Corynebacterium argentoratense, Corynebacterium atypicum, Corynebacterium aurimucosum, Corynebacterium auris, Corynebacterium auriscanis, Corynebacterium betae, Corynebacterium beticola, Corynebacterium bovis, Corynebacterium callunae, Corynebacterium camporealensis, Corynebacterium canis, Corynebacterium capitovis, Corynebacterium casei, Corynebacterium caspium, Corynebacterium ciconiae, Corynebacterium confusum, Corynebacterium coyleae, Corynebacterium cystitidis, Corynebacterium deserti, Corynebacterium diphtheriae, Corynebacterium doosanense, Corynebacterium durum, Corynebacterium efficiens, Corynebacterium epidermidicanis, Corynebacterium equi, Corynebacterium falsenii, Corynebacterium fascians, Corynebacterium felinum, Corynebacterium flaccumfaciens, por ejemplo Corynebacterium flaccumfaciens subsp. betae, Corynebacterium flaccumfaciens subsp. flaccumfaciens, Corynebacterium flaccumfaciens subsp. oortii, o Corynebacterium flaccumfaciens subsp. poinsettiae, Corynebacterium flavescens, Corynebacterium frankenforstense, Corynebacterium freiburgense, Corynebacterium freneyi, Corynebacterium glaucum, Corynebacterium glucuronolyticum, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium halotolerans, Corynebacterium hansenii, Corynebacterium hoagie, Corynebacterium humireducens, Corynebacterium ilicis, Corynebacterium imitans, Corynebacterium insidiosum, Corynebacterium iranicum, Corynebacterium jeikeium, Corynebacterium kroppenstedtii, Corynebacterium kutscheri, Corynebacterium lactis, Corynebacterium lilium, Corynebacterium lipophiloflavum, Corynebacterium liquefaciens, Corynebacterium lubricantis, Corynebacterium macginleyi, Corynebacterium marinum, Corynebacterium maris, Corynebacterium massiliense, Corynebacterium mastitidis, Corynebacterium matruchotii, Corynebacterium michiganense, por ejemplo Corynebacterium michiganense subsp. insidiosum, Corynebacterium michiganense subsp. michiganense, Corynebacterium michiganense subsp. nebraskense, Corynebacterium michiganense subsp. sepedonicum, o Corynebacterium michiganense subsp. tessellarius, Corynebacterium minutissimum, Corynebacterium mooreparkense, Corynebacterium mucifaciens, Corynebacterium mustelae, Corynebacterium mycetoides, Corynebacterium nebraskense, Corynebacterium nigricans, Corynebacterium nuruki, Corynebacterium oortii, Corynebacterium paurometabolum, Corynebacterium phocae, Corynebacterium pilbarense, Corynebacterium pilosum, Corynebacterium poinsettiae, Corynebacterium propinquum, Corynebacterium pseudodiphtheriticum, Corynebacterium pseudotuberculosis, Corynebacterium pyogenes, Corynebacterium pyruviciproducens, Corynebacterium rathayi, Corynebacterium renale, Corynebacterium resistens, Corynebacterium riegelii, Corynebacterium seminale, Corynebacterium sepedonicum, Corynebacterium simulans, Corynebacterium singulare, Corynebacterium sphenisci, Corynebacterium spheniscorum, Corynebacterium sputi, Corynebacterium stationis, Corynebacterium striatum, Corynebacterium suicordis, Corynebacterium sundsvallense, Corynebacterium terpenotabidum, Corynebacterium testudinoris, Corynebacterium thomssenii, Corynebacterium timonense, Corynebacterium tritici, Corynebacterium tuberculostearicum, Corynebacterium tuscaniense, Corynebacterium ulcerans, Corynebacterium ulceribovis, Corynebacterium urealyticum, Corynebacterium ureicelerivorans, Corynebacterium uterequi, Corynebacterium variabile, Corynebacterium vitaeruminis, o Corynebacterium xerosis.
[0261] Preferiblemente, las bacterias probióticas no son Corynebacterium diphtheriae, Corynebacterium amicolatum, Corynebacterium striatum, Corynebacterium jeikeium, Corynebacterium urealyticum, Corynebacterium xerosis, Corynebacterium pseudotuberculosis, Corynebacterium tenuis, Corynebacterium striatum, o Corynebacterium minutissimum
[0262] Preferiblemente, las bacterias probióticas son bacterias clasificadas como "generalmente consideradas seguras" (GRAS) en el género Corynebacterium, que incluyen pero no se limitan a Corynebacterium ammoniagenes, Corynebacterium casei, Corynebacterium flavescens o Corynebacterium variabile.
[0263] En otra realización, las bacterias son del género Enterococcus sp., que incluyen, pero no se limitan a, Enterococcus alcedinis, Enterococcus aquimarinus, Enterococcus asini, Enterococcus avium, Enterococcus caccae, Enterococcus camelliae, Enterococcus canintestini, Enterococcus canis, Enterococcus casseliflavus, Enterococcus cecorum, Enterococcus columbae, Enterococcus devriesei, Enterococcus diestrammenae, Enterococcus dispar, Enterococcus durans, Enterococcus eurekensis, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Enterococcus flavescens, Enterococcus gallinarum, Enterococcus gilvus, Enterococcus haemoperoxidus, Enterococcus hermanniensis, Enterococcus hirae, Enterococcus italicus, Enterococcus lactis, Enterococcus lemanii, Enterococcus malodoratus, Enterococcus moraviensis, Enterococcus mundtii, Enterococcus olivae, Enterococcus pallens, Enterococcus phoeniculicola, Enterococcus plantarum, Enterococcus porcinus, Enterococcus pseudoavium, Enterococcus quebecensis, Enterococcus raffinosus, Enterococcus ratti, Enterococcus rivorum, Enterococcus rotai, Enterococcus saccharolyticus, por ejemplo Enterococcus saccharolyticus subsp. saccharolyticus o Enterococcus saccharolyticus subsp. taiwanensis, Enterococcus saccharominimus, Enterococcus seriolicida, Enterococcus silesiacus, Enterococcus solitarius, Enterococcus sulfureus, Enterococcus termitis, Enterococcus thailandicus, Enterococcus ureilyticus, Enterococcus viikkiensis, Enterococcus villorum, o Enterococcus xiangfangensis.
[0264] Preferiblemente, las bacterias probióticas son bacterias clasificadas como "generalmente reconocidas como seguras" (GRAS) en el género Enterococcus, que incluyen, pero no se limitan a, Enterococcus durans, Enterococcus faecalis o Enterococcus faecium.
[0265] En otra realización, las bacterias probióticas son del género Lactobacillus sp., que incluyen, pero no se limitan a, Lactobacillus acetotolerans, Lactobacillus acidifarinae, Lactobacillus acidipiscis, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus agilis, Lactobacillus algidus, Lactobacillus alimentarius, Lactobacillus amylolyticus, Lactobacillus amylophilus, Lactobacillus amylotrophicus, Lactobacillus amylovorus, Lactobacillus animalis, Lactobacillus antri, Lactobacillus apinorum, Lactobacillus apis, Lactobacillus apodemi, Lactobacillus aquaticus, Lactobacillus arizonensis, Lactobacillus aviaries, por ejemplo, Lactobacillus aviarius subsp. araffinosus o Lactobacillus aviarius subsp. aviarius, Lactobacillus backii, Lactobacillus bavaricus, Lactobacillus bifermentans, Lactobacillus bobalius, Lactobacillus bombi, Lactobacillus brantae, Lactobacillus brevis, Lactobacillus buchneri, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus cacaonum, Lactobacillus camelliae, Lactobacillus capillatus, Lactobacillus carnis, Lactobacillus casei, por ejemplo Lactobacillus casei subsp. alactosus, Lactobacillus casei subsp. casei, Lactobacillus casei subsp. pseudoplantarum, Lactobacillus casei subsp. rhamnosus, o Lactobacillus casei subsp. tolerans, Lactobacillus catenaformis, Lactobacillus cellobiosus, Lactobacillus ceti, Lactobacillus coleohominis, Lactobacillus collinoides, Lactobacillus composti, Lactobacillus concavus, Lactobacillus confusus, Lactobacillus coryniformis, por ejemplo Lactobacillus coryniformis subsp. coryniformis o Lactobacillus coryniformis subsp. torquens, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus crustorum, Lactobacillus curieae, Lactobacillus curvatus, por ejemplo Lactobacillus curvatus subsp. curvatus o Lactobacillus curvatus subsp. melibiosus, Lactobacillus cypricasei, Lactobacillus delbrueckii, por ejemplo Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, Lactobacillus delbrueckii subsp. delbrueckii, Lactobacillus delbrueckii subsp. indicus, Lactobacillus delbrueckii subsp. jakobsenii, Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis, o Lactobacillus delbrueckii subsp. sunkii, Lactobacillus dextrinicus, Lactobacillus diolivorans, Lactobacillus divergens, Lactobacillus durianis, Lactobacillus equi, Lactobacillus equicursoris, Lactobacillus equigenerosi, Lactobacillus fabifermentans, Lactobacillus faecis, Lactobacillus farciminis, Lactobacillus farraginis, Lactobacillus ferintoshensis, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus floricola, Lactobacillus florum, Lactobacillus fornicalis, Lactobacillus fructivorans, Lactobacillus fructosus, Lactobacillus frumenti, Lactobacillus fuchuensis, Lactobacillus furfuricola, Lactobacillus futsaii, Lactobacillus gallinarum, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus gastricus, Lactobacillus ghanensis, Lactobacillus gigeriorum, Lactobacillus graminis, Lactobacillus halotolerans, Lactobacillus hammesii, Lactobacillus hamsteri, Lactobacillus harbinensis, Lactobacillus hayakitensis, Lactobacillus heilongjiangensis, Lactobacillus helsingborgensis, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus heterohiochii, Lactobacillus hilgardii, Lactobacillus hokkaidonensis, Lactobacillus hominis, Lactobacillus homohiochii, Lactobacillus hordei, Lactobacillus iners, Lactobacillus ingluviei, Lactobacillus intestinalis, Lactobacillus iwatensis, Lactobacillus jensenii, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus kalixensis, Lactobacillus kandleri, Lactobacillus kefiranofaciens, por ejemplo Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefiranofaciens o Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefirgranum, Lactobacillus kefiri, Lactobacillus kefirgranum, Lactobacillus kimbladii, Lactobacillus kimchicus, Lactobacillus kimchiensis, Lactobacillus kimchii, Lactobacillus kisonensis, Lactobacillus kitasatonis, Lactobacillus koreensis, Lactobacillus kullabergensis, Lactobacillus kunkeei, Lactobacillus lactis, Lactobacillus leichmannii, Lactobacillus lindneri, Lactobacillus malefermentans, Lactobacillus mali, Lactobacillus maltaromicus, Lactobacillus manihotivorans, Lactobacillus mellifer, Lactobacillus mellis, Lactobacillus melliventris, Lactobacillus mindensis, Lactobacillus minor, Lactobacillus minutus, Lactobacillus mucosae, Lactobacillus murinus, Lactobacillus nagelii, Lactobacillus namurensis, Lactobacillus nantensis, Lactobacillus nasuensis, Lactobacillus nenjiangensis, Lactobacillus nodensis, Lactobacillus odoratitofui, Lactobacillus oeni, Lactobacillus oligofermentans, Lactobacillus oris, Lactobacillus oryzae, Lactobacillus otakiensis, Lactobacillus ozensis, Lactobacillus panis, Lactobacillus pantheris, Lactobacillus parabrevis, Lactobacillus parabuchneri, Lactobacillus paracasei, por ejemplo Lactobacillus paracasei subsp. paracasei o Lactobacillus paracasei subsp. tolerans, Lactobacillus paracollinoides, Lactobacillus parafarraginis, Lactobacillus parakefiri, Lactobacillus paralimentarius, Lactobacillus paraplantarum, Lactobacillus pasteurii, Lactobacillus paucivorans, Lactobacillus pentosus, Lactobacillus perolens, Lactobacillus piscicola, Lactobacillus plantarum, por ejemplo Lactobacillus plantarum subsp. argentoratensis o Lactobacillus plantarum subsp. plantarum, Lactobacillus pobuzihii, Lactobacillus pontis, Lactobacillus porcinae, Lactobacillus psittaci, Lactobacillus rapi, Lactobacillus rennini, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus rimae, Lactobacillus rodentium, Lactobacillus rogosae, Lactobacillus rossiae, Lactobacillus ruminis, Lactobacillus saerimneri, Lactobacillus sakei, por ejemplo Lactobacillus sakei subsp. carnosus o Lactobacillus sakei subsp. sakei, Lactobacillus salivarius, por ejemplo Lactobacillus salivarius subsp. salicinius o Lactobacillus salivarius subsp. salivarius, Lactobacillus sanfranciscensis, Lactobacillus saniviri, Lactobacillus satsumensis, Lactobacillus secaliphilus, Lactobacillus selangorensis, Lactobacillus senioris, Lactobacillus senmaizukei, Lactobacillus sharpeae, Lactobacillus shenzhenensis, Lactobacillus sicerae, Lactobacillus silagei, Lactobacillus siliginis, Lactobacillus similes, Lactobacillus sobrius, Lactobacillus songhuajiangensis, Lactobacillus spicheri, Lactobacillus sucicola, Lactobacillus suebicus, Lactobacillus sunkii, Lactobacillus suntoryeus, Lactobacillus taiwanensis, Lactobacillus thailandensis, Lactobacillus thermotolerans, Lactobacillus trichodes, Lactobacillus tucceti, Lactobacillus uli, Lactobacillus ultunensis, Lactobacillus uvarum, Lactobacillus vaccinostercus, Lactobacillus vaginalis, Lactobacillus versmoldensis, Lactobacillus vini, Lactobacillus viridescens, Lactobacillus vitulinus, Lactobacillus xiangfangensis, Lactobacillus xylosus, Lactobacillus yamanashiensis, por ejemplo Lactobacillus yamanashiensis subsp. mali o Lactobacillus yamanashiensis subsp. yamanashiensis, Lactobacillus yonginensis, Lactobacillus zeae, o Lactobacillus zymae.
[0266] Preferiblemente, las bacterias probióticas son bacterias clasificadas como "generalmente reconocidas como seguras" (GRAS) en el género Lactobacillus sp., que incluyen, pero no se limitan a, Lactobacillus acidophilus cepa NP 28, Lactobacillus acidophilus cepa NP51, Lactobacillus subsp. lactis cepa NP7, Lactobacillus reuteri cepa NCIMb 30242, Lactobacillus casei cepa Shirota, Lactobacillus reuteri cepa DSM 17938, Lactobacillus reuteri cepa NCIMB 30242, Lactobacillus acidophilus cepa NCFM, Lactobacillus rhamnosus cepa HN001 , Lactobacillus rhamnosus cepa HN001, Lactobacillus reuteri cepa DSM 17938, Lactobacillus casei subsp. rhamnosus cepa GG, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus lactis, Lactobacillus acetotolerans, Lactobacillus acidifarinae, Lactobacillus acidipiscis, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus alimentarius, Lactobacillus amylolyticus, Lactobacillus amylovorus, Lactobacillus brevis, Lactobacillus buchneri, Lactobacillus cacaonum, Lactobacillus casei subsp. casei, Lactobacillus collinoides, Lactobacillus composti, Lactobacillus coryniformis subsp. coryniformis, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus crustorum, Lactobacillus curvatus subps. curvatus, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, Lactobacillus delbrueckii subsp. delbrueckii, Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis, Lactobacillus dextrinicus, Lactobacillus diolivorans, Lactobacillus fabifermentans, Lactobacillus farciminis, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus fructivorans, Lactobacillus frumenti, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus ghanensis, Lactobacillus hammesii, Lactobacillus harbinensis, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus hilgardii, Lactobacillus homohiochii, Lactobacillus hordei, Lactobacillus jensenii, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus kefiri, Lactobacillus kefiranofadens subsp. kefiranofaciens, Lactobacillus kefiranofadens subsp. kefirgranum, Lactobacillus kimchii, Lactobacillus kisonensis, Lactobacillus mail, Lactobacillus manihotivorans, Lactobacillus mindensis, Lactobacillus mucosae, Lactobacillus nagelii, Lactobacillus namurensis, Lactobacillus nantensis, Lactobacillus nodensis, Lactobacillus oeni, Lactobacillus otakiensis, Lactobacillus panis, Lactobacillus parabrevis, Lactobacillus parabuchneri, Lactobacillus paracasei subsp. paracasei, Lactobacillus parakefiri, Lactobacillus paralimentarius, Lactobacillus paraplantarum, Lactobacillus pentosus, Lactobacillus perolens, Lactobacillus plantarum subsp. plantarum, Lactobacillus pobuzihii, Lactobacillus pontis, Lactobacillus rapi, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus rossiae, Lactobacillus sakei subsp carnosus, Lactobacillus sakei subsp. sakei, Lactobacillus sali varius subsp. salivarius, Lactobacillus sanfranciscensis, Lactobacillus satsumensis, Lactobacillus secaliphilus, Lactobacillus senmaizukei, Lactobacillus siliginis, Lactobacillus spicheri, Lactobacillus suebicus, Lactobacillus sunkii, Lactobacillus tucceti, Lactobacillus vaccinostercus, Lactobacillus versmoldensis o Lactobacillus yamanashiensis.
[0267] Preferiblemente, las bacterias probióticas son bacterias que tienen un estado de "Presunción de seguridad calificada" (QPS) en el género Lactobacillus sp., que incluyen, pero no se limitan a, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus amylolyticus, Lactobacillus amylovorus, Lactobacillus alimentarius, Lactobacillus aviaries Lactobacillus brevis, Lactobacillus buchneri, Lactobacillus casei, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus farciminis, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus gallinarum, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus hilgardii, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus kefiranofaciens, Lactobacillus kefiri, Lactobacillus mucosae, Lactobacillus panis, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus paraplantarum, Lactobacillus pentosus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus pontis, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus sakei, Lactobacillus salivarius, Lactobacillus sanfranciscensis o Lactobacillus seae.
[0268] En otra realización, las bacterias probióticas son del género Lactococcus sp., que incluyen pero no se limitan a Lactococcus chungangensis, Lactococcus formosensis, Lactococcus fujiensis, Lactococcus garvieae, Lactococcus lactis, por ejemplo, Lactococcus lactis subsp. cremoris, Lactococcus lactis subsp. hordniae, Lactococcus lactis subsp. lactis, o Lactococcus lactis subsp. tructae, Lactococcus piscium, Lactococcus plantarum, Lactococcus raffinolactis, o Lactococcus taiwanensis.
[0269] Preferiblemente, las bacterias probióticas son bacterias clasificadas como "generalmente reconocidas como seguras" (GRAS) en el género Lactococcus, que incluyen, pero no se limitan a, Lactococcus lactis subsp. cremoris, Lactococcus lactis subsp. lactis y Lactococcus raffinolactis.
[0270] Preferiblemente, las bacterias probióticas son Lactococcus lactis, preferiblemente Lactococcus lactis subsp. lactis, Lactococcus lactis subsp. Lactis biovariant diacetylactis, o Lactococcus lactis subsp. cremoris, más preferiblemente Lactococcus lactis subsp. Cremoris.
[0271] En otra realización, las bacterias probióticas son del género Leuconostoc sp., que incluyen, pero no se limitan a, Leuconostoc amelibiosum, Leuconostoc argentinum, Leuconostoc carnosum, Leuconostoc citreum, Leuconostoc cremoris, Leuconostoc dextranicum, Leuconostoc durionis, Leuconostoc fallax, Leuconostoc ficulneum, Leuconostoc fructosum, Leuconostoc gasicomitatum, Leuconostoc gelidum, por ejemplo, Leuconostoc gelidum subsp. aenigmaticum, Leuconostoc gelidum subsp. gasicomitatum, o Leuconostoc gelidum subsp. gelidum, Leuconostoc holzapfelii, Leuconostoc inhae, Leuconostoc kimchii, Leuconostoc lactis, Leuconostoc mesenteroides, por ejemplo, Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris, Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranicums, Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides, o Leuconostoc mesenteroides subsp. suionicum, Leuconostoc miyukkimchii, Leuconostoc oeni, Leuconostoc paramesenteroides, Leuconostoc pseudoficulneum, o Leuconostoc pseudomesenteroides.
[0272] Preferiblemente, las bacterias son bacterias clasificadas como "generalmente reconocidas como seguras" (GRAS) en el género Leuconostoc sp., que incluyen, pero no se limitan a, Leuconostoc carnosum, Leuconostoc citreum, Leuconostoc fallax, Leuconostoc holzapfelii, Leuconostoc inhae, Leuconostoc kimchii, Leuconostoc lactis, Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris, Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranicums, Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides, Leuconostoc palmae o Leuconostoc pseudomesenteroides.
[0273] Preferiblemente, las bacterias probióticas son bacterias que tienen un estado de "Presunción de seguridad calificada" (QPS) en el género Leuconostoc sp., que incluyen, pero no se limitan a, Leuconostoc citreum, Leuconostoc lactis, Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris, Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranicum o Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides.
[0274] En otra realización, las bacterias son del género Lactobacillus sp., que incluyen, pero sin limitación, Pediococcus acidilactici, Pediococcus argentinicus, Pediococcus cellicola, Pediococcus claussenii, Pediococcus damnosus, Pediococcus dextrinicus. Pediococcus ethanolidurans, Pediococcus halophilus, Pediococcus inopinatus, Pediococcus lolii, Pediococcus parvulus, Pediococcus pentosaceus, Pediococcus siamensis, Pediococcus stilesii, o Pediococcus urinaeequi.
[0275] Preferiblemente, las bacterias probióticas son bacterias que tienen un estado de "Presunción de seguridad calificada" (QPS) en el género Pediococcus sp., que incluyen, pero no se limitan a, Pediococcus acidilactici, Pediococcus dextrinicus o Pediococcus pentosaceus.
[0276] En otra realización, las bacterias probióticas son del género Propionibacterium sp., que incluyen, pero no se limitan a, Propionibacterium acidifaciens, Propionibacterium acidipropionici, Propionibacterium acnes, Propionibacterium australiense, Propionibacterium avidum, Propionibacterium cyclohexanicum, Propionibacterium damnosum, Propionibacterium freudenreichii, por ejemplo, Propionibacterium freudenreichii subsp. freudenreichii o Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii, Propionibacterium granulosum, Propionibacterium innocuum, Propionibacterium jensenii, Propionibacterium lymphophilum, Propionibacterium microaerophilum, Propionibacterium olivae, Propionibacterium propionicum, o Propionibacterium thoenii.
[0277] Según una realización, las bacterias probióticas no son Propionibacterium acnes.
[0278] Más preferiblemente, las bacterias probióticas son bacterias clasificadas como "generalmente consideradas seguras" (GRAS) en el género Propionibacterium sp., Que incluyen pero no se limitan a Propionibacterium acidipropionici, Propionibacterium freudenreichii subsp. Freudenreichii, Propionibacterium freudenreichii subsp. Shermanii, Propionibacterium jensenii o Propionibacterium thoenii.
[0279] Más preferiblemente, las bacterias probióticas son Propionibacterium freudenreichii, más preferiblemente Propionibacterium freudenreichii subsp. freudenreichii o Propionibacterium freudenreichii subsp. Shermanii.
[0280] En otra realización, las bacterias probióticas son del género Streptococcus sp., que incluyen, pero no se limitan a, Streptococcus acidominimus, Streptococcus adjacens, Streptococcus agalactiae, Streptococcus alactolyticus, Streptococcus anginosus, Streptococcus australis, Streptococcus bovis, Streptococcus caballi, Streptococcus canis, Streptococcus caprinus, Streptococcus castoreus, Streptococcus cecorum, Streptococcus constellatus, por ejemplo Streptococcus constellatus subsp. constellatus, Streptococcus constellatus subsp. pharynges, o Streptococcus constellatus subsp. viborgensis, Streptococcus cremoris, Streptococcus criceti, Streptococcus cristatus, Streptococcus cuniculi, Streptococcus danieliae, Streptococcus defectivus, Streptococcus dentapri, Streptococcus dentirousetti, Streptococcus dentasini, Streptococcus dentisani, Streptococcus devriesei, Streptococcus didelphis, Streptococcus difficilis, Streptococcus downei, Streptococcus durans, Streptococcus dysgalactiae, por ejemplo Streptococcus dysgalactiae subsp. dysgalactiae o Streptococcus dysgalactiae subsp. equisimilis, Streptococcus entericus, Streptococcus equi, por ejemplo, Streptococcus equi subsp. equi, Streptococcus equi subsp. ruminatorum, o Streptococcus equi subsp. zooepidemicus, Streptococcus equinus, Streptococcus faecalis, Streptococcus faecium, Streptococcus ferus, Streptococcus gallinaceus, Streptococcus gallinarum, Streptococcus gallolyticus, por ejemplo Streptococcus gallolyticus subsp. gallolyticus, Streptococcus gallolyticus subsp. macedonicus, o Streptococcus gallolyticus subsp. pasteurianus, Streptococcus garvieae, Streptococcus gordonii, Streptococcus halichoeri, Streptococcus hansenii, Streptococcus henryi, Streptococcus hongkongensis, Streptococcus hyointestinalis, Streptococcus hyovaginalis, Streptococcus ictaluri, Streptococcus infantarius, por ejemplo, Streptococcus infantarius subsp. coli o Streptococcus infantarius subsp. infantarius, Streptococcus infantis, Streptococcus iniae, Streptococcus intermedius, Streptococcus intestinalis, Streptococcus lactarius, Streptococcus lactis, por ejemplo Streptococcus lactis subsp. cremoris, Streptococcus lactis subsp. diacetilactis, o Streptococcus lactis subsp. lactis, Streptococcus loxodontisalivarius, Streptococcus lutetiensis, Streptococcus macacae, Streptococcus macedonicus, Streptococcus marimammalium, Streptococcus massiliensis, Streptococcus merionis, Streptococcus minor, Streptococcus mitis, Streptococcus morbillorum, Streptococcus moroccensis, Streptococcus mutans, Streptococcus oligofermentans, Streptococcus oralis, Streptococcus orisasini, Streptococcus orisuis, Streptococcus ovis, Streptococcus parasanguinis, Streptococcus parauberis, Streptococcus parvulus, Streptococcus pasteurianus, Streptococcus peroris, Streptococcus phocae, por ejemplo Streptococcus phocae subsp. phocae o Streptococcus phocae subsp. salmonis, Streptococcus plantarum, Streptococcus pleomorphus, Streptococcus pluranimalium, Streptococcus plurextorum, Streptococcus pneumonia, Streptococcus porci, Streptococcus porcinus, Streptococcus porcorum, Streptococcus pseudopneumoniae, Streptococcus pseudoporcinus, Streptococcus pyogenes, Streptococcus raffinolactis, Streptococcus ratti, Streptococcus rifensis, Streptococcus rubneri, Streptococcus rupicaprae, Streptococcus saccharolyticus, Streptococcus salivarius, por ejemplo Streptococcus salivarius subsp. salivarius o Streptococcus salivarius subsp. thermophilus, Streptococcus saliviloxodontae, Streptococcus sanguinis, Streptococcus shiloi, Streptococcus sinensis, Streptococcus sobrinus, Streptococcus suis, Streptococcus thermophilus, Streptococcus thoraltensis, Streptococcus tigurinus, Streptococcus troglodytae, Streptococcus uberis, Streptococcus urinalis, Streptococcus ursoris, Streptococcus vestibularis, o Streptococcus waius.
[0281] Preferiblemente, las bacterias probióticas son bacterias clasificadas como "generalmente reconocidas como seguras" (GRAS) en el género Streptococcus sp., que incluyen, pero no se limitan a, Streptococcus thermophilus cepa Th4, Streptococcus gallolyticus subsp. macedonicus, Streptococcus salivarius subsp. salivarius o Streptococrus salivarius subsp. Thermophilus.
[0282] Preferiblemente, las bacterias probióticas son bacterias que tienen un estado de "Presunción de seguridad calificada" (QPS) en el género Streptococcus sp., que incluye, pero no se limita a, Streptococcus thermophilus.
[0283] En una realización preferida, dichas bacterias probióticas no producen endotoxinas u otras sustancias potencialmente tóxicas. Por lo tanto, dichas bacterias probióticas son seguras de usar y no son perjudiciales para un sujeto después de la aplicación.
[0284] Preferiblemente, dichas bacterias probióticas no producen esporas. Las esporas bacterianas no son parte de un ciclo sexual, pero son estructuras resistentes que se utilizan para sobrevivir en condiciones desfavorables. Dado que dichas bacterias probióticas preferiblemente no producen esporas, dichas bacterias probióticas recombinantes no pueden sobrevivir, por ejemplo, sin nutrientes o si falta un factor auxotrófico.
[0285] Preferiblemente, dichas bacterias probióticas no producen cuerpos de inclusión. Los cuerpos de inclusión a menudo contienen proteínas sobreexpresadas y la agregación de dichas proteínas sobreexpresadas en los cuerpos de inclusión puede ser irreversible.
[0286] Dado que dichas bacterias probióticas preferiblemente no producen cuerpos de inclusión, la cantidad de dicho primer, segundo y tercer factor heterólogo después de transcribir y traducir las secuencias de ácido nucleico respectivas no se ve disminuida por la acumulación intracelular en los cuerpos de inclusión.
[0287] Más preferiblemente, dichas bacterias probióticas tampoco producen proteinasas extracelulares. Las bacterias pueden secretar proteinasas extracelulares para destruir las estructuras extracelulares, tales como las proteínas, para generar nutrientes, tales como el carbono, el nitrógeno o el azufre. Las proteinasas extracelulares también pueden actuar como una exotoxina y ser un ejemplo de factor de virulencia en la patogénesis bacteriana.
[0288] Debido a la ausencia de proteinasas extracelulares, la seguridad de dichas bacterias probióticas después de la aplicación a un sujeto preferiblemente aumenta. Además, dichas bacterias probióticas preferiblemente no degradan el primer, segundo y tercer factor heterólogo respectivos después de la liberación de dichas bacterias probióticas recombinantes.
[0289] Preferiblemente, dichas bacterias probióticas carecen de todos los plásmidos naturales. Debido a la ausencia de todos los plásmidos naturales, dichas bacterias probióticas preferiblemente no poseen resistencia a los antibióticos.
[0290] Más preferiblemente, dichas bacterias probióticas carecen de los factores del huésped requeridos para la transposición conjugativa.
[0291] Los plásmidos naturales se pueden clasificar ampliamente en plásmidos conjugativos y plásmidos no conjugativo. Los plásmidos conjugativos contienen un conjunto de genes de transferencia o tra que promueven la conjugación sexual entre diferentes células. En el complejo proceso de conjugación, el plásmido puede transferirse de una bacteria a otra a través de pili sexuales codificados por algunos de los genes tra. Los plásmidos no conjugativos son incapaces de iniciar la conjugación, por lo tanto, solo se pueden transferir con la ayuda de los factores del huésped necesarios para la transposición conjugativa, tales como los plásmidos conjugativos.
[0292] Debido a la ausencia de factores del huésped requeridos para la transposición conjugativa, la transferencia génica de dicho ácido o ácidos nucleicos que codifican el primer, segundo y tercer factor heterólogo respectivo de dicha bacteria probiótica a otros microorganismos es altamente improbable, preferiblemente la transferencia génica está suprimida.
[0293] En una realización más preferida, dichas bacterias probióticas recombinantes son bacterias de ácido láctico, preferiblemente un lactobacilo o una especie de lactococo. En una realización más preferida, dicha especie de lactococo es lactococcus lactis subsp. Cremoris.
[0294] Las bacterias de ácido láctico liberan además ácido láctico como el principal producto final metabólico de la fermentación de carbohidratos. Se sabe que el ácido láctico también estimula el crecimiento y la proliferación endotelial. Además, el ácido láctico tiene un efecto antibacteriano que reduce la probabilidad de una infección bacteriana en el sitio de la disfunción de la piel.
[0295] Las técnicas para transformar las bacterias probióticas mencionadas anteriormente son conocidas por la persona experta y, por ejemplo, se describen en Green y Sambrook (2012): "Molecular cloning: a laboratory manual", cuarta edición, Cold Spring Harbor Laboratory Prensa (Cold Spring Harbor, Nueva York, EE. UU.).
[0296] Después de la transformación, las bacterias probióticas recombinantes comprenden al menos una secuencia de ácidos nucleicos que codifica dicho primer factor heterólogo y al menos una secuencia de ácidos nucleicos que codifica dicho segundo factor heterólogo, y preferiblemente al menos una secuencia de ácidos nucleicos que codifica dicho tercer factor heterólogo .
[0297] En una realización, la al menos una secuencia de ácidos nucleicos que codifica dicho primer factor heterólogo y la al menos una secuencia de ácidos nucleicos que codifica dicho segundo factor heterólogo, preferiblemente y la al menos una secuencia de ácidos nucleicos que codifica dicho tercer factor heterólogo, están ubicadas en diferentes subpoblaciones de bacterias probióticas recombinantes.
[0298] Por ejemplo, las secuencias de ácidos nucleicos respectivas están ubicadas en subpoblaciones separadas de las bacterias probióticas, que se combinan para obtener las bacterias probióticas recombinantes de la presente invención.
[0299] La respectiva subpoblación individual que comprende las secuencias de ácidos nucleicos respectivas puede ser, por ejemplo, de la misma especie o de diferentes especies de las bacterias probióticas mencionadas anteriormente.
[0300] Por ejemplo, se pueden usar diferentes especies de bacterias probióticas recombinantes que expresan diferentes factores heterólogos para adaptar la expresión y, preferiblemente, liberar los respectivos factores heterólogos de las bacterias probióticas.
[0301] En una realización preferida de la presente invención, las secuencias de ácidos nucleicos respectivas están presentes en las bacterias probióticas recombinantes en varios números de copias. Por ejemplo, las bacterias probióticas recombinantes comprenden al menos una copia de las secuencias de ácidos nucleicos respectivas que codifican dicho primer, dicho segundo y/o preferiblemente dicho tercer factor.
[0302] El número de copias de la secuencia de ácidos nucleicos respectiva puede aumentarse para mejorar la expresión del factor heterólogo respectivo.
[0303] Preferiblemente, la proporción de copias de las secuencias de ácidos nucleicos respectivas que codifican dicho primer, dicho segundo y/o dicho tercer factor es 1:1:1.
[0304] La eficacia de la traducción se puede mejorar proporcionando copias adicionales de una secuencia de ácidos nucleicos para ser transcritas por las bacterias probióticas recombinantes.
[0305] En una realización adicional de la presente invención, una subpoblación de las bacterias probióticas recombinantes comprende al menos una secuencia de ácidos nucleicos que codifica dos de los tres factores heterólogos en los que preferiblemente el tercer factor heterólogo está codificado por una secuencia de ácidos nucleicos localizada en una segunda subpoblación de bacterias probióticas recombinantes.
[0306] En una realización preferida, las secuencias de ácidos nucleicos que codifican los tres factores heterólogos se localizan en una población de bacterias probióticas recombinantes.
[0307] En una realización más preferida, las secuencias de ácidos nucleicos respectivas se localizan en al menos uno de un cromosoma y un plásmido de dichas bacterias probióticas recombinantes.
[0308] La localización de la secuencia de ácidos nucleicos en un cromosoma de la bacteria probiótica recombinante o en un plásmido de dicha bacteria probiótica recombinante determina, entre otras cosas, la cantidad de proteína traducida por la bacteria, ya que los niveles de expresión en un plásmido son mayores en comparación con los niveles de expresión en un cromosoma.
[0309] En una realización más preferida de la presente invención, se proporciona al menos una secuencia de ácidos nucleicos que codifica el factor heterólogo respectivo en un cromosoma de la bacteria y se proporciona al menos una secuencia de ácidos nucleicos que codifica otro factor heterólogo en un plásmido de dichas bacterias probióticas recombinantes.
[0310] La secuencia de ácidos nucleicos respectiva que codifica el tercer factor podría entonces proporcionarse en un cromosoma o en un plásmido de la bacteria probiótica recombinante.
[0311] En una realización alternativa de la presente invención, las secuencias de ácidos nucleicos respectivas se proporcionan en porciones individuales del cromosoma de las bacterias probióticas recombinantes o en diferentes plásmidos de dichas bacterias probióticas recombinantes.
[0312] En una realización preferida particular de la invención, todas las secuencias de ácido nucleico que codifican dichos factores heterólogos se proporcionan en un único plásmido, por ejemplo, cada una controlada y acoplada funcionalmente a un promotor distinto.
[0313] En otra realización preferida particular de la invención, las secuencias de ácido nucleico respectivas que codifican los factores heterólogos respectivos están ubicadas en un único operón que está operativamente unido y controlado por un único promotor.
[0314] Un operón es una unidad funcional de ADN que contiene un grupo de genes bajo el control de un único promotor. Los genes se transcriben juntos en cadenas de ARNm y se traducen juntos en el citoplasma, o se someten a un empalme trans para crear ARNm monocistrónicos que se traducen por separado.
[0315] Preferiblemente, las secuencias de ácidos nucleicos respectivas que codifican los factores heterólogos respectivos localizados en dicho operón único están provistas de secuencias de ácidos nucleicos que codifican un sitio de unión a ribosomas para el inicio de la traducción.
[0316] Preferiblemente, las secuencias de ácido nucleico que codifican un sitio de unión a ribosomas se encuentran en dirección 5' del codón de inicio, que está hacia la región 5' de la misma cadena que se va a transcribir. La secuencia es preferiblemente complementaria al extremo 3' del ARN ribosómico 16S.
[0317] Preferiblemente, las secuencias de ácido nucleico respectivas que codifican los factores heterólogos respectivos ubicados en dicho operón único se proporcionan con una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una secuencia señal secretora en el extremo 5' del marco de lectura abierto (ORF) del factor heterólogo que genera una proteína de fusión que comprende la secuencia señal secretora y el factor heterólogo.
[0318] En una realización más preferida, las secuencias de ácido nucleico se controlan y se acoplan funcionalmente a un promotor constitutivo o un promotor inducible, preferiblemente a un promotor inducible.
[0319] Por ejemplo, las secuencias de ácido nucleico que codifican los factores heterólogos respectivos pueden controlarse y acoplarse funcionalmente a promotores individuales, que podrían ser un promotor constitutivo o un promotor inducible, más preferiblemente un promotor inducible.
[0320] Un promotor constitutivo está activo en una célula en todas las circunstancias, mientras que un promotor inducible se vuelve activo en respuesta a un inductor específico.
[0321] Un promotor es una secuencia de ácidos nucleicos que inicia la transcripción de un gen particular. Los promotores se encuentran cerca de la parte de inicio de la transcripción del gen, en la misma cadena y en dirección 5' del ADN, que está hacia la región 5' de la misma cadena que se va a transcribir.
[0322] Preferiblemente, el promotor respectivo usado es un promotor autólogo de la bacteria probiótica, que expresa la secuencia de ácidos nucleicos respectiva.
[0323] Alternativamente, el promotor respectivo es un promotor heterólogo, preferiblemente un promotor procariota, más preferiblemente un promotor de bacterias.
[0324] En una realización más preferida, la expresión de al menos una secuencia de ácidos nucleicos está controlada por un promotor inducible, siendo dicha al menos una secuencia de ácidos nucleicos expresable en presencia de al menos un inductor.
[0325] Preferiblemente, dicho promotor inducible, que es inducible por inductor, es un promotor para al menos un gen microbiano que codifica un péptido lantibiótico.
[0326] Los péptidos lantibióticos son conocidos por el experto. Los lantibióticos son una clase de péptidos que contienen el característico aminoácido tioéter policíclico lantionina, así como los aminoácidos insaturados deshidroalanina y ácido 2-aminoisobutírico.
[0327] La lantionina, por ejemplo, es un análogo de monosulfuro de una cisteína y está compuesta de dos residuos de alanina que están reticulados en sus átomos de carbono beta por un enlace tioéter.
[0328] Los lantibióticos son producidos por una gran cantidad de bacterias gram positivas.
[0329] En una realización preferida, dicho promotor inducible es un promotor de nisina de lactococcus lactis, un promotor de bisina de bifidobacterium longum, un promotor de optilina de bacillus subtilis, un promotor de salvarizina de streptococcus salivarius, un promotor de epidermina de staphylococcus epidermidis, un promotor de galidermina de staphylococcus gallinarum, un promtoor de mutacina de Streptococcus mutans, un promotor de estreptina de Streptococcus pyogenes, un promotor de Streptococcinum de Streptococcus pyogenes, un promotor de lacticina de Lactococcus lactis, un promotor de epidermina de Staphylococcus epidermidis, un promotor de epilancina de de Staphylococcus epidermidis, un promotor pep5 de Staphylococcus epidermidis, un promotor de lactocina-s de Lactobacillus sakei, un promotor de salvaricina de Streptococcus salivarius o Streptococcus pyogenes, un promotor de plantarizina de Lactobacillus plantarum, un promotor de termofilina de Streptococcus, un promotor de bovicina de streptococcus o combinaciones de los mismos.
[0330] Más preferiblemente, dicho promotor inducible es PnisA, PnisZ, PnisQ, PnisF, PnisU o combinaciones de los mismos de lactococcus lactis.
[0331] En una realización preferida, el inductor es al menos un péptido lantibiótico o análogo funcional del mismo, preferiblemente seleccionado del grupo que consiste en nisina A, nisina Z, nisina Q, nisina F, nisina U, análogos funcionales del mismo y mezclas de los mismos.
[0332] Un sistema de expresión génica controlado por nisina está, por ejemplo, disponible comercialmente en MoBiTec GmbH (Gottingen, Alemania) con el nombre comercial NICE®, que se desarrolló en NIZO Food Research (Ede, Países Bajos).
[0333] La nisina, que es bien conocida por el experto, es un péptido lantibiótico de 34 aminoácidos con un amplio espectro de huéspedes. Por ejemplo, la nisina de Lactococcus lactis está disponible comercialmente en Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Munich, Alemania).
[0334] La nisina se usa ampliamente como conservante en los alimentos. Inicialmente, la nisina se sintetiza ribosómicamente como precursor. Después de modificaciones enzimáticas posteriores, la molécula modificada se transloca a través de la membrana citoplasmática y se procesa en su forma madura.
[0335] La nisina induce su propia expresión. La expresión de una secuencia de ácidos nucleicos de interés puede inducirse mediante la adición de una cantidad subinhibitoria de nisina, que es preferiblemente de 0,01 a 50 ng/ml de medio de cultivo, más preferiblemente de 0,1 a 5 ng/ml de medio de cultivo, cuando el gen de interés se basa posteriormente en los promotores inducibles del sistema de nisina.
[0336] Además, el sistema NICE se ha transferido a otras bacterias grampositivas, por ejemplo, leuconostoc lactis, lactobacillus brevis, lactobacillus helveticus, lactobacillus plantarum, streptococcus pyogenes, streptococcus agalactiae, streptococcus pneumoniae, streptococcus zooepidemicus, enterococcus faecalis o lactobacillus subtilis.
[0337] Un promotor de nisina inducible, que se selecciona preferiblemente de PnisA, PnisZ, PnisQ, PnisF, PnisU, y combinaciones de los mismos, puede integrarse en un cromosoma de las bacterias probióticas usadas junto con al menos una secuencia de ácidos nucleicos que codifica dicho primer factor heterólogo, dicho segundo factor heterólogo, y/o preferiblemente dicho tercer factor heterólogo.
[0338] Preferiblemente, dicho promotor inducible es PnisA.
[0339] Alternativamente, los respectivos promotores junto con al menos una secuencia de ácidos nucleicos se proporcionan en un plásmido que a continuación se transforma en las bacterias probióticas.
[0340] La secuencia de ácidos nucleicos respectiva es expresable en presencia de nisina.
[0341] Los plásmidos adecuados están disponibles comercialmente, por ejemplo, de MoBiTec GmbH, (Gottingen, Alemania) tales como pNZ8008, pNZ8148, pNZ8149 y pNZ8150.
[0342] En una realización más preferida, los genes NisR y NisK también se proporcionan en un cromosoma o un plásmido de las bacterias probióticas utilizadas. Las proteínas NisR y NisK respectivas pertenecen a la familia de los sistemas de transducción de señales bacterianas de dos componentes. NisK es una histidina-proteína quinasa que reside en la membrana citoplasmática, donde preferiblemente actúa como un receptor para la molécula de nisina madura. Al unirse la nisina a NisK, se autofosforila y transfiere el grupo fosfato a NisR, que es el regulador de respuesta que se activa tras la fosforilación por NisK.
[0343] El NisR activado induce la transcripción del promotor PnisA, el promotor PnisF, el promotor PnisZ, el promotor PnisQ y/o el promotor PnisU.
[0344] Los respectivos reguladores de la expresión de los genes de nisina NisR y NisK pueden, por ejemplo, proporcionarse en un cromosoma de las bacterias probióticas y/o en un plásmido.
[0345] Los plásmidos adecuados están disponibles comercialmente e incluyen, por ejemplo, el plásmido pNZ9530 (MoBiTec GmbH, Gottingen, Alemania). El plásmido pNZ9530 transporta los genes NisR y NisK y se usa preferiblemente para la clonación en cepas de lactococos y en cepas de otros géneros de bacterias de ácido láctico que no tienen los genes reguladores integrados en el cromosoma. Por ejemplo, para la expresión inducida por nisina en enterococos faecalis, Brian et al han descrito un plásmido pMSP3535. (2000) y, por ejemplo, está disponible en AddGene, un depósito de plásmidos sin fines de lucro (Plásmido N ° 46886).
[0346] La secuencia de ácidos nucleicos del plásmido pMSP3535 está disponible con el número de acceso de NCBI AY303239.1.
[0347] En una realización más preferida, se usan bacterias probióticas que contienen los genes reguladores para la expresión génica controlada por nisina NisR y NisK.
[0348] Las cepas adecuadas están disponibles comercialmente, por ejemplo, de MoBiTec GmbH (Gottingen, Alemania). Las cepas adecuadas son, por ejemplo, la cepa de lactococcus lactis NZ9000, la cepa de lactococcus lactis NZ9100, la cepa de lactococcus lactis NZ3900.
[0349] Una cepa adecuada es también la cepa de Lactococcus lactis NZ3000, que está disponible comercialmente; por ejemplo, de MoBiTec GmbH. La cepa de Lactococcus lactis NZ3000 es una cepa sin NisR y NisK. La cepa de Lactococcus lactis NZ3000 puede usarse cuando la expresión de dicha o dichas secuencias de ácido nucleico está controlada por un promotor constitutivo.
[0350] En una realización más preferida, las bacterias probióticas son la cepa de lactococcus lactis NZ3900, que es una cepa de calidad alimentaria. La cepa de Lactococcus lactis NZ3900 incluye un sistema de selección de plásmidos que no se basa en la resistencia a los antibióticos, sino en la capacidad de crecer en lactosa.
[0351] La cepa de Lactococcus lactis NZ3900 no produce endotoxinas u otras sustancias potencialmente tóxicas. Además, la cepa de lactococcus lactis NZ3900 no produce cuerpos de inclusión ni esporas. Además, la cepa de lactococcus lactis NZ3900 no produce proteinasas extracelulares.
[0352] En una realización más preferida, las secuencias de ácido nucleico que codifican los factores heterólogos respectivos se modifican para aumentar la expresión, secreción y/o estabilidad del factor heterólogo codificado.
[0353] Las personas expertas conocen modificaciones adecuadas e incluyen, por ejemplo, adaptar el uso de codones de la al menos una secuencia de ácidos nucleicos a las bacterias probióticas utilizadas.
[0354] Por ejemplo, la al menos una secuencia de ácidos nucleicos puede diseñarse para ajustarse al patrón de uso de codones de las bacterias probióticas utilizadas. Adicionalmente, además de una optimización general de codones, se pueden usar tablas de codones específicos, tales como una tabla de codones para los genes de proteínas ribosomales altamente expresadas de las respectivas bacterias probióticas, para aumentar aún más la traducción de los factores codificados.
[0355] Las modificaciones adecuadas incluyen también, por ejemplo, la incorporación de una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una secuencia señal de secreción en el extremo 5' del marco de lectura abierto (ORF) del factor heterólogo que genera una proteína de fusión que comprende la secuencia señal de secreción y el factor heterólogo. La secuencia señal secretora está preferiblemente dispuesta en la cara N-terminal del factor heterólogo respectivo.
[0356] La secuencia señal secretora dirige preferentemente la proteína recién sintetizada a la membrana plasmática. Al final de la secuencia señal secretora, preferiblemente péptido o propéptido señal, preferiblemente hay un tramo de aminoácidos que es reconocido y escindido por una peptidasa de señal para generar una secuencia señal secretora libre, preferiblemente péptido o propéptido señal, y el factor heterólogo maduro, que se secreta extracelularmente.
[0357] En las bacterias, existen dos vías principales para secretar proteínas a través de la membrana citoplasmática. La ruta de secreción general, denominada vía Sec, cataliza la translocación transmembrana de proteínas en su conformación desplegada, tras lo que se pliegan en su estructura nativa en la superficie de la membrana.
[0358] La ruta de translocación de gemelo-argenina, denominada ruta Tat, cataliza la translocación de proteínas secretoras en su estado plegado.
[0359] Las secuencias señal secretoras adecuadas incluyen, por ejemplo, un péptido señal.
[0360] Preferiblemente, la secuencia señal secretora es el péptido o propéptido señal nativo del factor heterólogo respectivo codificado por la secuencia de ácidos nucleicos, que preferiblemente es un precursor y/o preproproteína del factor respectivo.
[0361] En una realización más preferida, dicha secuencia señal secretora es una secuencia secretora homóloga de dichas bacterias probióticas recombinantes, preferiblemente dicha secuencia señal secretora es la secuencia señal de peptidasa 45 específica de ubiquitina (Usp 45) de Lactococcus sp. La señal de secreción Usp 45 tiene una eficacia de secreción muy alta. Los expertos en la materia conocen otras señales de secreción e incluyen, por ejemplo, SP310, SPEXP4 y AL9 de Lactococcus sp.
[0362] Por ejemplo, el péptido señal nativo del factor heterólogo puede ser reemplazado por una secuencia señal secretora homóloga de las bacterias probióticas utilizadas para expresar dicho factor heterólogo.
[0363] Una secuencia señal secretora mejora preferiblemente la eficacia de secreción del factor heterólogo respectivo. Por ejemplo, en lactococcus lactis, la mayoría de las proteínas se secretan a través de la vía Sec. Las proteínas se sintetizan como precursores que contienen el resto maduro de las proteínas con un péptido señal N-terminal. El péptido señal dirige la proteína a la membrana citoplasmática. Después de la escisión del péptido señal, la proteína madura se libera extracelularmente.
[0364] Más preferiblemente, la señal secretora comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N° 34.
[0365] En una realización más preferida, el factor heterólogo respectivo se expresa como un propéptido con o sin un factor potenciador de la secreción. El propéptido puede ser escindido por proteasas para liberar el factor heterólogo maduro.
[0366] En una realización más preferida, las bacterias probióticas recombinantes comprenden al menos un gen inactivado que codifica una proteína esencial necesaria para la viabilidad de dichas bacterias probióticas.
[0367] En una realización preferida, la proteína esencial necesaria para la viabilidad de dichas bacterias probióticas es una proteína, más preferiblemente una enzima, necesaria para la síntesis de un compuesto orgánico necesario para la viabilidad de dichas bacterias probióticas.
[0368] Después de la inactivación de dicha proteína esencial, preferiblemente enzima, el compuesto orgánico respectivo es un factor auxotrófico requerido para la viabilidad de las bacterias probióticas recombinantes y que debe complementarse para mantener la viabilidad de las bacterias probióticas recombinantes.
[0369] Preferiblemente, dicho factor auxotrófico es una vitamina, aminoácido, ácido nucleico y/o un ácido graso.
[0370] Por ejemplo, los aminoácidos y los nucleótidos son compuestos orgánicos biológicamente importantes, que son precursores de proteínas y ácidos nucleicos, respectivamente.
[0371] En una realización más preferida, el al menos un gen necesario para la viabilidad de las bacterias probióticas se selecciona del grupo que consiste en alanina racemasa (alaR), timidilato sintasa (thyA), asparagina sintasa (asnH), CTP sintasa (pyrG), triptófano sintasa (trbBA) y combinaciones de los mismos.
[0372] Por ejemplo, la alanina racemasa es una enzima que cataliza la conversión de L-alanina en D-alanina. La D-alanina producida por la alanina racemasa se usa para la síntesis de peptidoglucano. El peptidoglucano se encuentra en las paredes celulares de todas las bacterias.
[0373] El experto en la materia sabe que la inactivación del gen de la alanina racemasa (alaR) en bacterias da como resultado la necesidad de que las bacterias usen una fuente externa de D-alanina para mantener la integridad de la pared celular.
[0374] El experto en la materia sabe que, por ejemplo, el lactococcus lactis y el lactobacillus plantarum contienen un solo gen de alaR. La inactivación del gen afecta a la incorporación de D-alanina en la pared celular.
[0375] Las bacterias Lactococcus lactis, por ejemplo, con un gen inactivado de alanina racemasa (alaR) dependen del suministro externo de D-alanina para poder sintetizar peptidoglucano e incorporar D-alanina en el ácido lipoteicoico (LTA). Estas bacterias se lisan rápidamente cuando se elimina la D-alanina, por ejemplo, en un crecimiento medio exponencial.
[0376] Las cepas deficientes de alanina racemasa de bacterias de ácido láctico podrían, por ejemplo, generarse por procedimientos conocidos en la técnica.
[0377] La timidilato sintasa es una enzima que cataliza la conversión de monofosfato de desoxiuridina (dUMP) en monofosfato de desoxitimidilato (dTMP). dTPM es uno de los tres nucleótidos que forman timina (dTMP, dTDP y dTTP). La timidina es un ácido nucleico en el ADN.
[0378] El experto en la materia sabe que la timidilato sintasa desempeña un papel crucial en la etapa inicial de la biosíntesis de ADN. Por ejemplo, el daño o la eliminación del ADN tienen lugar diariamente como resultado de factores endógenos y ambientales.
[0379] Además, para la proliferación de las bacterias probióticas es necesario sintetizar ADN.
[0380] La inactivación del gen de la timidilato sintasa (thyA) en bacterias da como resultado la necesidad de las bacterias de usar una fuente externa de timidina para mantener la integridad del ADN.
[0381] La asparagina sintetasa es una enzima que genera el aminoácido asparagina a partir del aspartato. La inactivación del gen de la asparagina sintetasa (asnH) da como resultado la incapacidad para sintetizar el aminoácido respectivo, que se convierte en un factor auxotrófico.
[0382] La CTP-sintasa es una enzima implicada en la síntesis de pirimidina. La CTP sintasa interconvierte uridina-5'-trifosfato (UTP) y citidina trifosfato (CTP). La inactivación del gen de CTP-sintasa (pyrG) hace que las bacterias no puedan sintetizar nucleótidos de citosina tanto de la síntesis de novo como de la vía de la pared celular de la uridina.
[0383] El CTP se convierte en un factor auxotrófico, que debe suplementarse para la síntesis de ARN y ADN.
[0384] La triptófano sintasa es una enzima que cataliza los dos pasos finales en la biosíntesis del aminoácido triptófano.
[0385] La inactivación del gen de triptófano sintasa (trpBA) hace que las bacterias no puedan sintetizar el aminoácido respectivo, que se convierte en un factor auxotrófico.
[0386] Los expertos conocen los procedimientos para la inactivación de dicho gen necesario para la viabilidad de las bacterias probióticas e incluyen la deleción del gen, la mutación del gen, la modificación epigenética de dicho gen, el silenciamiento genético mediado por la interferencia de ARN (ARNi) de dicho gen, inhibición traduccional de dicho gen o combinaciones de los mismos.
[0387] En una realización más preferida, el factor auxotrófico respectivo se proporciona junto con dichas bacterias probióticas.
[0388] En una realización más preferida de la invención, dicho gen inactivado necesario para la viabilidad de las bacterias probióticas se usa para la contención ambiental.
[0389] Después de la aplicación de las bacterias probióticas recombinantes que comprenden al menos un gen inactivado necesario para la viabilidad de dichas bacterias probióticas, el factor auxotrófico respectivo debe proporcionarse externamente, por ejemplo, con un medio de aplicación o un medio de crecimiento.
[0390] En caso de que las bacterias probióticas recombinantes se liberen al medio ambiente, falta el factor auxotrófico y, preferiblemente, las bacterias probióticas recombinantes mueren.
[0391] Además, la aplicación del factor auxotrófico suplementado externamente permite un control de la biosíntesis y la liberación de los factores heterólogos respectivos.
[0392] Preferiblemente, al menos uno de dicho primer factor, dicho segundo factor y dicho tercer factor es liberable de dichas bacterias probióticas recombinantes. Más preferiblemente, al menos uno de dicho primer factor, dicho segundo factor y dicho tercer factor es secretado por dicha bacteria probiótica recombinante.
[0393] Por ejemplo, en las bacterias grampositivas, tales como las bacterias del ácido láctico, las proteínas que se secretan de las bacterias se sintetizan preferiblemente como un precursor que contiene un péptido señal N-terminal y el resto maduro de la proteína. Los precursores son reconocidos por la maquinaria de secreción de la bacteria y se translocan a través de la membrana citoplasmática. El péptido señal se escinde y degrada y la proteína madura se secreta de la bacteria, por ejemplo, al sobrenadante del cultivo o al área de una disfunción inflamatoria de la piel.
[0394] Por ejemplo, el lactococcus lactis es capaz de secretar proteínas que varían desde una masa molecular baja, por ejemplo, menor que 10 kDa, hasta una masa molecular alta, por ejemplo, un peso molecular superior a 160 kDa, a través de una ruta dependiente de Sec.
[0395] Alternativamente, al menos uno de dicho primer factor, dicho segundo factor y dicho tercer factor se libera de dichas bacterias probióticas recombinantes a través de una membrana citoplasmática con fugas.
[0396] Por ejemplo, cuando se usa nisina como inductor para la síntesis de proteínas en dichas bacterias probióticas recombinantes, la nisina también forma poros dentro de la membrana citoplasmática a través de los cuales se libera al menos uno de dicho primer factor, dicho segundo factor y dicho tercer factor de las bacterias probióticas.
[0397] Alternativamente, la membrana citoplasmática de dichas bacterias probióticas recombinantes se vuelve permeable debido a una síntesis deteriorada de los componentes de la pared celular.
[0398] Por ejemplo, dichas bacterias probióticas recombinantes comprenden un gen inactivado de alanina racemasa (alaR). En ausencia de D-alanina, dichas bacterias probióticas recombinantes no pueden mantener la integridad de la membrana citoplasmática y, posteriormente, al menos uno de dicho primer factor, dicho segundo factor y dicho tercer factor se libera de dichas bacterias probióticas recombinantes.
[0399] Durante el proceso de curación de dicha disfunción inflamatoria de la piel, el primer factor heterólogo, el segundo factor heterólogo y/o el tercer factor heterólogo liberados pueden sufrir degradación, por ejemplo, por la escisión de la proteasa, lo que puede conducir a una pérdida de la actividad biológica de dicho factores heterólogos [0400] La degradación o agotamiento de dichos factores heterólogos puede compensarse mediante una liberación sostenida de dichos factores heterólogos de dichas bacterias probióticas recombinantes. Preferiblemente, dichas bacterias probióticas recombinantes expresan al menos uno de dicho primer factor heterólogo, dicho segundo factor heterólogo y dicho tercer factor heterólogo de manera constante. Preferiblemente, dichas bacterias probióticas recombinantes liberan dichos factores heterólogos constantemente.
[0401] En una realización preferida, dichas bacterias probióticas se proporcionan en una composición farmacéutica para usar en el tratamiento de dicha disfunción inflamatoria de la piel.
[0402] Preferiblemente, dicha composición farmacéutica comprende al menos un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable que, más preferiblemente, es adecuado para la vía de administración prevista.
[0403] Preferiblemente, dicho vehículo farmacéuticamente aceptable o dicho excipiente farmacéuticamente aceptable comprende al menos un vehículo polimérico, preferiblemente seleccionado del grupo que consiste en polisacáridos, poliésteres, polimetacrilamida y mezclas de los mismos. Por ejemplo, dicho vehículo farmacéuticamente aceptable es un hidrogel, que, por ejemplo, proporciona un entorno de humedad adicionalmente óptimo para promover la cicatrización de heridas. Además, el vehículo farmacéuticamente aceptable ayuda a la adhesión de dichas bacterias probióticas recombinantes al sitio de dicha disfunción inflamatoria de la piel después de la aplicación.
[0404] Preferiblemente, dicha composición farmacéutica comprende además al menos un nutriente para dichas bacterias probióticas recombinantes, preferiblemente seleccionadas del grupo que consiste en carbohidratos, vitaminas, minerales, aminoácidos, oligoelementos y mezclas de los mismos.
[0405] Más preferiblemente, dicha composición farmacéutica comprende además al menos un componente para estabilizar al menos uno de dicho primer factor, dicho segundo factor y dicho tercer factor.
[0406] Dicho compuesto estabilizante se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en agentes antimicrobianos, crioprotectores, inhibidores de proteasas, agentes reductores, quelantes metálicos y mezclas de los mismos.
[0407] En una realización más preferida, dichas bacterias probióticas recombinantes están en una solución, congeladas o secas, preferiblemente liofilizadas o secadas por pulverización.
[0408] Preferiblemente, dichas bacterias probióticas recombinantes se deben aplicar en una solución, por ejemplo, en forma de dicha composición farmacéutica.
[0409] En una realización alternativa, dichas bacterias probióticas recombinantes se congelan o secan, preferiblemente se liofilizan o se secan por pulverización. Las bacterias probióticas recombinantes pueden reconstituirse antes de su uso.
[0410] Después de la aplicación, las bacterias probióticas recombinantes pueden ponerse en contacto con dicho al menos un inductor, preferiblemente para inducir la expresión de al menos uno de dicho primer factor, dicho segundo factor y dicho tercer factor.
[0411] Más preferiblemente, después de la inducción de la expresión, al menos uno de dicho primer factor, dicho segundo factor y dicho tercer factor se libera de dicha bacteria.
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Secuencias
[0413]
Las SEQ ID Nos. 1 a 3 corresponden al precursor de ¡soforma 1 a 3 de CSF-1 humano, respectivamente, que incluye un péptido señal.
La SEQ ID No. 4 corresponde al CSF-1 humano maduro.
La SEQ ID No. 5 corresponde a la construcción sintética de CSF-1 usada en el Ejemplo 1, que incluye la señal de secreción Usp45 de Lactococcus lactis, que abarca los aminoácidos 1 a 27 de la proteína, y CSF-1 humano maduro, que abarca la aminoácidos 28 a 185 de la proteína.
La SEQ ID No. 6 corresponde a la construcción sintética de CSF-1 generada después de la secreción de Lactococcus lactis que expresa pCSF1.
Las SEQ ID Nos. 7 y 8 corresponden al precursor de las isoformas 1 y 2 de IL-34 humano, respectivamente, que incluye un péptido señal.
La SEQ ID No. 9 corresponde a la IL-34 humana madura.
Las SEQ ID N° 10 y 11 corresponden a los precursores de isoforma 1 y 2 de IL-4 humana, respectivamente, que incluyen un péptido señal.
La SEQ ID No. 12 corresponde a la IL-4 humana madura.
La SEQ ID No. 13 corresponde a la construcción sintética de IL-4 humana usada en el Ejemplo 1, que incluye la señal de secreción Usp45 de Lactococcus lactis, que abarca los aminoácidos 1 a 27 de la proteína, y la IL-4 humana madura, que abarca los aminoácidos 28 a 185 de la proteína.
La SEQ ID No. 14 corresponde a la construcción sintética de IL-4 generada después de la secreción de Lactococcus lactis que expresa pIL4.
La SEQ ID No. 15 corresponde al precursor de IL-10 humano que incluye un péptido señal.
La SEQ ID No. 16 corresponde a la IL-10 humana madura.
La SEQ ID No. 17 corresponde al precursor de IL-13 humano que incluye un péptido señal.
La SEQ ID No. 18 corresponde a la IL-13 humana madura.
La SEQ ID No. 19 corresponde al precursor de TGF-p1 humano que incluye un péptido señal.
La SEQ ID No. 20 corresponde al TGF-p1 humano maduro.
Las SEQ ID N° 21 y 22 corresponden a los precursores de las isoformas 1 y 2 del TGF-p2 humano, respectivamente, que incluyen un péptido señal.
La SEQ ID No. 23 corresponde al TGF-p2 humano maduro.
La SEQ ID No. 24 corresponde a la preproproteína TGF-p3 humana que incluye un péptido señal.
La SEQ ID No. 25 corresponde al TGF-p3 humano maduro.
La SEQ ID No. 26 corresponde a la preproproteína FGF-2 humana, que incluye un propéptido.
La SEQ ID No. 27 corresponde al fGF-2 humano maduro después de la secreción (hFGF2-155).
La SEQ ID No. 28 corresponde a la secuencia parcial del FGF-2 humano maduro.
La SEQ ID No. 29 corresponde al constructo sintético de FGF-2 humano usado en el Ejemplo 1, que incluye la señ de secreción Usp45 de Lactococcus lactis, que abarca los aminoácidos 1 a 27 de la proteína, y FGF-2 humano maduro, que corresponde a los aminoácidos 136 a 288 de SEQ ID No. 26.
La SEQ ID No. 30 corresponde a la variante humana FGF-2 hFGF2-153 usada en el Ejemplo 1 después de la secreción de Lactococcus lactis que expresa pFGF.
La SEQ ID No. 31 corresponde a HGF humano.
La SEQ ID No. 32 corresponde a la cadena alfa de HGF humano.
La SEQ ID No. 33 corresponde a la cadena beta de HGF humano.
La SEQ ID No. 34 corresponde a la señal de secreción Usp45 de Lactococcus lactis.
La SEQ ID No. 35 corresponde a la secuencia de ácidos nucleicos del plásmido pNZ8149.
Las SEQ ID N° 36 a 43 corresponden a los cebadores utilizados en los Ejemplos.
La SEQ ID No. 44 corresponde a la secuencia de ácidos nucleicos del promotor de nisina A de Lactococcus lactis.
La SEQ ID No. 45 corresponde a la secuencia de ácidos nucleicos de la construcción sintética ssUsp45-FGF2-153 que contiene el promotor nisinA, la secuencia señal Usp45 y el gen hFGF2-153.
La SEQ ID No. 46 corresponde a la secuencia de ácidos nucleicos del plásmido pFGF2.
La SEQ ID No. 47 corresponde a la secuencia de ácidos nucleicos de la construcción sintética ssUsp45-hIL4 que contiene el promotor nisinA, la secuencia señal Usp45 y el gen hIL4.
La SEQ ID No. 48 corresponde a la secuencia de ácidos nucleicos del plásmido pIL4.
La SEQ ID No. 49 corresponde a la secuencia de ácidos nucleicos de la construcción sintética ssUsp45-hCSF1 que contiene el promotor nisinA, la secuencia señal Usp45 y el gen hCSF1.
La SEQ ID No. 50 corresponde a la secuencia de ácidos nucleicos del plásmido pCSF1.
SEQ ID No. 51 a SEQ ID No. 53 corresponden a secuencias de ácido nucleico que proporcionan los sitios de unión a ribosomas respectivos que incluyen el codón de inicio (ATG) del marco de lectura abierto respectivo usado en los Ejemplos.
La s Eq ID No. 54 corresponde a la secuencia de ácidos nucleicos del extremo 3' del ARN ribosómico 16S (ARNr) de Lactococcus lactis.
La SEQ ID No. 55 corresponde a la secuencia de ácidos nucleicos de la construcción sintética CSF-RBS1-FGF-RBS2-IL4 representada en la Figura 24b. La SEQ ID No. 56 corresponde a la secuencia de ácidos nucleicos de la construcción sintética FGF-RBS1-IL4-RBS2-CSF representada en la Figura 24c. La SEQ ID No. 57 corresponde a la secuencia de ácidos nucleicos de la construcción sintética IL4-RBS1-CSF-RBS2-FGF representada en la Figura 24d.
La SEQ ID No. 58 corresponde a la secuencia de aminoácidos de la preproproteína isoforma 1 del factor de crecimiento epidérmico del Homo sapiens. La SEQ ID No. 59 corresponde a la secuencia de aminoácidos de la preproproteína isoforma 2 del factor de crecimiento epidérmico del Homo sapiens. La SEQ ID No. 60 corresponde a la secuencia de aminoácidos de la preproproteína isoforma 3 del factor de crecimiento epidérmico de1Homo sapiens. La SEQ ID No. 61 corresponde a la secuencia de aminoácidos del factor de crecimiento epidérmico maduro de Homo sapiens. La SEQ ID No. 62 corresponde a la secuencia de aminoácidos del precursor del factor de crecimiento similar a EGF que se une a heparina de Homo sapiens. La SEQ ID No. 63 corresponde a la secuencia de aminoácidos del factor de crecimiento tipo EGF que se une a la heparina madura de Homo sapiens. La SEQ ID No. 64 corresponde a la secuencia de aminoácidos de la preproproteína alfa isoforma 1 del factor de crecimiento transformante de Homo sapiens. La SEQ ID No. 65 corresponde a la secuencia de aminoácidos de la preproproteína alfa isoforma 2 del factor de crecimiento transformante de Homo sapiens. La SEQ ID No. 66 corresponde a la secuencia de aminoácidos de la preproproteína alfa isoforma 3 del factor de crecimiento transformante de Homo sapiens. La SEQ ID No. 67 corresponde a la secuencia de aminoácidos de la preproproteína alfa isoforma 4 del factor de crecimiento transformante de Homo sapiens. La SEQ ID No. 68 corresponde a la secuencia de aminoácidos de la preproproteína alfa isoforma 5 del factor de crecimiento transformante de Homo sapiens. La SEQ ID No. 69 corresponde a la secuencia de aminoácidos del factor de crecimiento transformante maduro alfa del Homo sapiens.
La SEQ ID No. 70 corresponde a la secuencia de aminoácidos de la preproproteína de anfiregulina de Homo sapiens. La SEQ ID No. 71 corresponde a la secuencia de aminoácidos de la anfiregulina madura de Homo sapiens. La SEQ ID No. 72 corresponde a la secuencia de aminoácidos de la preproproteína de epiregulina de Homo sapiens. La SEQ ID No. 73 corresponde a la secuencia de aminoácidos de la epiregulina madura de Homo sapiens. La SEQ ID No. 74 corresponde a la secuencia de aminoácidos del precursor de isoforma 1 de epigen de Homo sapiens. La SEQ ID No. 75 corresponde a la secuencia de aminoácidos del precursor de isoforma 2 epigen de Homo sapiens. La SEQ ID No. 76 corresponde a la secuencia de aminoácidos del precursor de isoforma 3 de epigen de Homo sapiens. La SEQ ID No. 77 corresponde a la secuencia de aminoácidos del precursor de isoforma 4 de epigen de Homo sapiens. La SEQ ID No. 78 corresponde a la secuencia de aminoácidos del precursor de la isoforma 5 de epigen del Homo sapiens. La SEQ ID No. 79 corresponde a la secuencia de aminoácidos del precursor de isoforma 6 de epigen del Homo sapiens. La SEQ ID No. 80 corresponde a la secuencia de aminoácidos del precursor de isoforma 7 de epigen de Homo sapiens. La SEQ ID No. 81 corresponde a la secuencia de aminoácidos del epígeno maduro del Homo sapiens.
La SEQ ID No. 82 corresponde a la secuencia de aminoácidos del precursor de betacelulina de Homo sapiens. La SEQ ID No. 83 corresponde a la secuencia de aminoácidos de la betacelulina madura de Homo sapiens.
[0414] Las siguientes Figuras y Ejemplos se proporcionan solo con fines ilustrativos. La invención no debe interpretarse como limitada a los siguientes ejemplos:
Figuras:
[0415] La Figura 1 muestra una SDS-PAGE de una proteína de referencia FGF2 humana.
La Figura 2 muestra un mapa plasmídico del vector de expresión pNZ8149. "lacF" es un marcador de selección para el crecimiento de la cepa huésped NZ3900 en lactosa; "Pnis" es el promotor de nisina A del operón de nisina de Lactococcus lactis; "T" es un terminador; "repC" y "repA" son genes de replicación. La secuencia de ácidos nucleicos también se muestra en SEQ ID No. 35. La
Figura 3 muestra la secuencia de ácidos nucleicos del promotor nisinA de L. lactis, que también se muestra en SEQ ID No. 44.
Las Figuras 4a, 4b y 4c muestran lecturas de SignalP 4.1 obtenida con la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID No. 29, SeQ ID No. 13 y SEQ ID No. 5, respectivamente.
Las Figuras 5a, 5b y 5c muestran los insertos sintetizados utilizados en el Ejemplo 1, así como la secuencia de aminoácidos correspondiente. "FGF2-153" indica el inserto de codificación de FGF-2 humano. "hIL4" indica el inserto de codificación de IL4 humano. "hCSF1" indica el inserto de codificación CSF1 humano. "PnisA" indica el promotor de nisina A del operón de nisina Lactococcus lactis. "ssUsp45" indica la secuencia señal del gen usp45 de Lactococcus lactis. Un asterisco indica un codón de parada. Las secuencias de ácido nucleico respectivas también se representan en SEQ ID No. 45, SEQ ID No. 47, y SeQ ID No. 49.
Las Figuras 6a, 6b y 6c muestran los resultados del análisis de PCR de colonias de colonias potenciales de Lactococcus lactis NZ3900 con pFGF2, pIL4 y pCSF1, respectivamente.
Las Figuras 7a, 7b y 7c muestran mapas de plásmidos, así como la secuencia de ácidos nucleicos de los plásmidos pFGF2, pIL4 y pCSF1, respectivamente, para la expresión y secreción de hFGF2, hIL4 y hCSF1, respectivamente, en Lactococcus lactis. "Pnis" es el promotor de nisina A del operón de nisina de Lactococcus lactis; "T" es un terminador; "repC" y "repA" son genes de replicación. Las secuencias de ácido nucleico de los plásmidos pFGF2, pIL4 y pCSF1, se representan en SEQ ID No. 46, SEQ ID No. 48 y SEQ ID No. 50, respectivamente.
La Figura 8 muestra un análisis de transferencia Western de muestras de fermentación de Lactococcus que expresan NZ3900 (pFGF2) en diferentes condiciones de inducción. "0.5/5" indica inducción a DO 600 = 0.5 con 5 ng/mL de nisina; "3/5" indica inducción a DO 600 = 3 con 5 ng/ml de nisina, "T" indica el punto de tiempo, en el que se tomó una muestra de la fermentación.
La Figura 9 muestra un análisis SDS-PAGE de muestras de sobrenadante (Sup) de pruebas de fermentación controladas después de la tinción con Coomassie (Coom) y un análisis de transferencia Western (WB) de muestras de fermentación de Lactococcus que expresan NZ3900 (pIL4). 0.5/5 "indica inducción a DO 600 = 0.5 con 5 ng/mL de nisina;" 3/5 "indica inducción a DO 600 = 3 con 5 ng/mL de nisina," T "indica el punto de tiempo, en el que una muestra fue tomado de la fermentación.
La Figura 10 muestra un análisis SDS-PAGE de muestras de sobrenadante (Sup) de pruebas de fermentación controladas después de la tinción con Coomassie (Coom) de muestras de fermentación de Lactococcus que expresa NZ3900 (pCSF1). 0.5/5 "indica inducción a DO 600 = 0,5 con 5 ng/ml de nisina; "3/5" indica inducción a DO 600 = 3 con 5 ng/ml de nisina, "T" indica el punto de tiempo, en el que se tomó una muestra de la fermentación. La Figura 11 muestra un análisis de transferencia Western (WB) de muestras de fermentación de Lactococcus que expresan NZ3900 (pCSF1). 0.5/5 "indica inducción a DO 600 = 0.5 con 5 ng/mL de nisina;" 3/5 "indica inducción a DO 600 = 3 con 5 ng/mL de nisina," T "indica el punto de tiempo, en el que una muestra fue tomado de la fermentación.
La Figura 12 muestra el crecimiento de cultivos acidificantes para el experimento de inducción en condiciones que se asemejan a las circunstancias de curación de heridas.
La Figura 13 muestra el análisis SDS-PAGE y Western blot de la producción de hFGF2 en el sobrenadante después de la inducción a pH 5 o con DO 600 = 3.
La Figura 14a muestra el resultado de un ensayo de migración de fibroblastos humanos descrito en el Ejemplo 4a después de 72 h de exposición con bacterias probióticas recombinantes que expresan hFGF2 o el producto disponible comercialmente Fiblast.
La Figura 14b muestra el resultado de un ensayo de migración de fibroblastos humanos descrito en el Ejemplo 4a después 72 h de exposición con bacterias probióticas recombinantes que expresan hIL4 o IL4 humana recombinante.
La figura 14c muestra el resultado de la inducción de la fosforilación de ERK 1 2 en células NHDF por medio de cultivo AUP-10 que contiene 0,4-80 ng/ml de FG F2 y por rhFGF2.
La Figura 14d muestra el resultado de la inducción de la fosforilación de ERK 1 2 en células M-NFS-60 por medio de cultivo AUP-14 que contiene 0,2-40 ng/ml de CSF1 y por rhCSF1.
La Figura 14e muestra la inhibición de la producción de ARNm de TNF alfa inducida por LPS en células humanas THP-1 descritas en el Ejemplo 4c.
La Figura 14f muestra la inducción de la expresión de ARN de genes M2 para el receptor de manosa de macrófagos 1 (Mrc1) y el factor similar a Kruppel 4 (KLF4) en macrófagos derivados de THP1 como se describe en el Ejemplo 4d.
La figura 14g muestra la actividad transcripcional STAT-6 de AUP-12 y rhlL-4 en la línea celular híbrida glial humana MO3.13 como se describe en el ejemplo 4e.
La figura 14h muestra la actividad transcripcional STAT-6 de AUP-12 y rhlL-4 en células 293T de riñón embrionario humano como se describe en el ejemplo 4e.
La Figura 15a muestra los resultados de los experimentos de curación de heridas descritos en el Ejemplo 5.
La Figura 15b muestra una comparación del estado de curación de heridas del control, control positivo y tejido tratado con AUP-16 después de los puntos de tiempo indicados descritos en el Ejemplo 5.
La Figura 15c muestra una comparación de el área restante de la herida después del día 8 y el día 12 del control positivo (grupo de tratamiento 17) y el tejido tratado con AUP-16 (grupo de tratamiento 18) descrito en el Ejemplo 5. La Figura 16a muestra la secuencia de aminoácidos de la isoforma del factor 1 estimulante de colonias de macrófagos un precursor del Homo sapiens. La Figura 16b muestra la secuencia de aminoácidos del precursor de isoforma b del factor 1 estimulante de colonias de macrófagos de Homo sapiens. La Figura 16c muestra la secuencia de aminoácidos del precursor de isoforma c del factor 1 estimulante de colonias de macrófagos de Homo sapiens. La Figura 16d muestra la secuencia de aminoácidos del factor estimulante de colonias de macrófagos humanos maduros 1.
La Figura 17a muestra la secuencia de aminoácidos del precursor de la isoforma 1 de interleucina-34 de Homo sapiens. La Figura 17b muestra la secuencia de aminoácidos del precursor de isoforma 2 de interleucina-34 de Homo sapiens. La Figura 17c muestra la secuencia de aminoácidos de la interleucina-34 de Homo sapiens.
La Figura 18a muestra la secuencia de aminoácidos del precursor de isoforma 1 de interleucina-4 de Homo sapiens. La Figura 18b muestra la secuencia de aminoácidos del precursor de isoforma 2 de interleucina-4 de Homo sapiens. La Figura 18c muestra la secuencia de aminoácidos de la interleucina-4 de Homo sapiens.
La Figura 19a muestra la secuencia de aminoácidos del precursor de interleucina-10 de Homo sapiens. La Figura 19b muestra la secuencia de aminoácidos de interleucina-10 de Homo sapiens.
La Figura 20a muestra la secuencia de aminoácidos del precursor de interleucina-13 de Homo sapiens. La Figura 20b muestra la secuencia de aminoácidos de la interleucina-13 de Homo sapiens.
La Figura 21a muestra la secuencia de aminoácidos del precursor del factor de crecimiento transformante beta-1 de Homo sapiens. La Figura 21b muestra la secuencia de aminoácidos del factor de crecimiento transformante beta-1 de Homo sapiens. La Figura 21c muestra la secuencia de aminoácidos del precursor de la isoforma 1 del factor de crecimiento transformante beta-2 de Homo sapiens. La Figura 21d muestra la secuencia de aminoácidos del precursor de isoforma 2 del factor de crecimiento transformante beta-2 de Homo sapiens. La Figura 21e muestra la secuencia de aminoácidos del factor de crecimiento transformante beta-2 de Homo sapiens. La Figura 21f muestra la secuencia de aminoácidos de la preproproteína beta-3 del factor de crecimiento transformante de Homo sapiens. La Figura 21g muestra la secuencia de aminoácidos del factor de crecimiento transformante beta-3 de Homo sapiens. La Figura 22a muestra la secuencia de aminoácidos del precursor del factor de crecimiento de fibroblastos 2 de Homo sapiens. La Figura 22b muestra la secuencia de aminoácidos de un fragmento del factor de crecimiento de fibroblastos 2 de Homo sapiens.
Figura 23a: Secuencia de aminoácidos del factor de crecimiento de hepatocitos de Homo sapiens. Figura 23b: Secuencia de aminoácidos de la cadena alfa del factor de crecimiento de hepatocitos de Homo sapiens. Figura 23c: Secuencia de aminoácidos de la cadena beta del factor de crecimiento de hepatocitos de Homo sapiens.
La Figura 24a muestra una visión general de los tres sitios de unión a ribosomas usados en el Ejemplo 2d. Las secuencias respectivas de las secuencias de ADN sintetizadas CSF-RBS1-FGF-RBS2-IL4, FGF-RBS1-IL4-RBS2-CSF e IL4-RBS-CSF-RBS2-FGF utilizadas en el Ejemplo 2d se representan en las Figuras 24b a 24d, respectivamente, así como en SEQ ID No. 55, SEQ ID No. 56, y SEQ ID No. 57, respectivamente. Las Figuras 24e a 24g muestran los geles SDS-PAGE respectivos, así como las transferencias Western obtenidas con las construcciones de operón individuales usadas en el Ejemplo 2d).
La Figura 25a muestra la secuencia de aminoácidos de la preproproteína isoforma 1 del factor de crecimiento epidérmico del Homo sapiens. La Figura 25b muestra la secuencia de aminoácidos de la preproproteína isoforma 2 del factor de crecimiento epidérmico del Homo sapiens. La Figura 25c muestra la secuencia de aminoácidos de la preproproteína isoforma 3 del factor de crecimiento epidérmico del Homo sapiens. La Figura 25d muestra la secuencia de aminoácidos del factor de crecimiento epidérmico maduro de Homo sapiens.
La Figura 26a muestra la secuencia de aminoácidos del precursor del factor de crecimiento similar a EGF de unión a heparina de Homo sapiens. La Figura 26b muestra la secuencia de aminoácidos del factor de crecimiento tipo EGF de unión a heparina maduro de Homo sapiens.
La Figura 27a muestra la secuencia de aminoácidos de la preproproteína isoforma 1 del factor de crecimiento transformante alfa de Homo sapiens. La Figura 27b muestra la secuencia de aminoácidos de la preproproteína isoforma 2 del factor de crecimiento transformante alfa de Homo sapiens. La Figura 27c muestra la secuencia de aminoácidos de la preproproteína isoforma 3 del factor de crecimiento transformante alfa de Homo sapiens. La Figura 27d muestra la secuencia de aminoácidos de la preproproteína alfa isoforma 4 del factor de crecimiento transformante de Homo sapiens. La Figura 27e muestra la secuencia de aminoácidos de la preproproteína isoforma 5 del factor de crecimiento transformante alfa de Homo sapiens. La Figura 27f muestra la secuencia de aminoácidos del factor de crecimiento transformante maduro alfa del Homo sapiens.
La Figura 28a muestra la secuencia de aminoácidos de la preproproteína de anfiregulina de Homo sapiens. La Figura 28b muestra la secuencia de aminoácidos de la anfiregulina madura de Homo sapiens.
La Figura 29a muestra la secuencia de aminoácidos de la preproproteína de epiregulina de Homo sapiens. La Figura 29b muestra la secuencia de aminoácidos de la epiregulina madura de Homo sapiens.
La Figura 30a muestra la secuencia de aminoácidos del precursor de isoforma 1 de epígen humano de Homo sapiens. La Figura 30b muestra la secuencia de aminoácidos del precursor de isoforma 2 de epígen humano del Homo sapiens. La Figura 30c muestra la secuencia de aminoácidos del precursor de isoforma 3 de epígen humano de Homo sapiens. La Figura 30d muestra la secuencia de aminoácidos del precursor de isoforma 4 de epígen humano de Homo sapiens. La Figura 30e muestra la secuencia de aminoácidos del precursor de isoforma 5 de epígen humano del Homo sapiens. La Figura 30f muestra la secuencia de aminoácidos del precursor de isoforma 6 de epígen humano de Homo sapiens. La Figura 30g muestra la secuencia de aminoácidos del precursor de isoforma 7 de epígen humano de Homo sapiens. La Figura 30h muestra la secuencia de aminoácidos del epígeno maduro del Homo sapiens.
La Figura 31a muestra la secuencia de aminoácidos del precursor de betacelulina de1Homo sapiens. La Figura 31b muestra la secuencia de aminoácidos de la betacelulina madura de Homo sapiens.
La Figura 32a muestra la secuencia de aminoácidos del factor de crecimiento de fibroblastos maduro 2 de Homo sapiens. La Figura 32b muestra la secuencia de aminoácidos de la variante del factor de crecimiento de fibroblastos 2 hFGF2-153 utilizada en los Ejemplos.
La Figura 33 muestra la secuencia de aminoácidos de la variante de interleucina 4 humana (hIL-4) utilizada en los Ejemplos.
La Figura 34 muestra la secuencia de aminoácidos de la variante del factor estimulante de colonias humano 1 (hCSF-1) utilizada en los Ejemplos.
La Figura 35 muestra la secuencia de aminoácidos de la señal de secreción de la proteína Lactococcus Usp45 utilizada en los Ejemplos.
Ejemplos:
1. Procedimientos experimentales generales:
[0416] A menos que se indique lo contrario, los ejemplos se llevaron a cabo siguiendo el protocolo del fabricante de los sistemas analíticos. A menos que se indique lo contrario, los productos químicos indicados se obtuvieron comercialmente de Sigma-Aldrich Chemie Gmbh (Munich, DE), Merck KGaA (Darmstadt, DE), Thermo Fisher Scientific Inc. (Waltham, MA, EE. UU.) O Becton, Dickinson and Company (Franklin Lakes, NJ, EE. UU.).
1.1 Medios de crecimiento
[0417] Para diferentes propósitos, se cultivaron células en diferentes medios. Para los procedimientos de clonación generales, se usó medio M17 (Oxoid Deutschland GmbH, Wesel, DE) que contenía 0,5% de glucosa o lactosa.
[0418] Para controlar la selección de grado alimenticio se usó el medio Elliker, en el cual las colonias lactocócicas se colorean de amarillo cuando crecen en lactosa. La coloración amarilla es un efecto de pH que cambia el color del colorante indicador bromocresol púrpura en las proximidades de una colonia en crecimiento y de la propia colonia.
[0419] La receta del medio Elliker es la siguiente:
20 g/l triptona
5 g/l Extracto de levadura
4 g/l NaCl
1,5 g/l Na-acetato (sin agua)
0,5 g/l L (+) Ácido ascórbico
15 g/L agar
pH 6,8
Esterilización: 15 min a 121 °C
[0420] Después de la esterilización y enfriamiento, se añadió lactosa al 1% a partir de una solución madre al 20% esterilizada por calor o por filtro y púrpura de bromocresol al 0,004% (solución madre al 0,4%, esterilizada por filtro).
[0421] Para las fermentaciones y otros experimentos de crecimiento funcional se usó el medio IM1, que está libre de ingredientes derivados de animales. La lactosa, el único ingrediente derivado de animales restante, se puede obtener en calidad farmacéutica.
[0422] La receta para el medio IM1 es la siguiente:
5% monohidrato de lactosa (Scharlab S.L., Barcelona, ES)
1.5% Peptona de soja
1% Extracto de levadura
1 mM MgSO4 x 7 H2O
0,1 mM MnSO4 x 4 H2O
pH 6,7
Esterilización: 110 °C 15 min.
[0423] Durante la fermentación no se agrega tampón ya que el pH se reguló automáticamente usando NaOH 2,5 M. Para cultivos en tubos de ensayo acidificantes, se añadió Na-beta-glicerofosfato de sodio al 2% al medio.
[0424] Este tampón neutraliza el lactato producido y permite que el cultivo alcance una densidad celular de DO 600 = 4 - 5.
[0425] Las soluciones madre de las construcciones finales NZ3900 (pFGF2), NZ3900 (pIL4) y NZ3900 (pCSF1) se prepararon después del crecimiento en medio IM1 con lactosa y Na-beta-glicerofosfato mediante la adición de glicerol hasta una concentración final de 20%. Las soluciones madre se almacenaron a -80 °C.
1.2 Inducción de la producción de proteínas utilizando el sistema NICE
[0426] El sistema NICE se indujo usando concentraciones de nisina entre 0,1 - 10 ng/ml de nisina. La nisina de Lactococcus lactis se obtuvo de Sigma (número de producto N5764).
1.3 Técnicas de clonación molecular
[0427] Para la clonación molecular se utilizaron técnicas estándar como, por ejemplo, las descritas en Green y Sambrook (2012): "Molecular clonin: a laboratory manual", cuarta edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press (Cold Spring Harbor, NY, EE. UU.).
[0428] La secuenciación de nucleótidos, la síntesis de genes y la síntesis de cebadores se subcontrataron a BaseClear (Leiden, NL).
1.4 Fermentaciones
[0429] Las fermentaciones se llevaron a cabo en una matriz de 6 fermentadores múltiples de 0,5 litros (Infors Benelux, Velp, NL). La inoculación se realizó con 1% de precultivo en medio IM-1; la velocidad del agitador fue de 200 rpm y la temperatura de incubación fue de 30 °C. Durante las pruebas, el pH se controló usando NaOH 2,5 M. El pH, la temperatura y la adición de NaOH se controlaron continuamente.
[0430] La inducción con nisina se llevó a cabo en diferentes momentos del ciclo de crecimiento con diferentes cantidades de nisina, tal como se indica en la sección de resultados. También se tomaron muestras, tal como se indica en la sección de resultados.
1.5 Fermentaciones Cinac
[0431] Para la monitorización de cultivos acidificantes, se usó la unidad de monitorización de pH Cinac (AMS France, Frepillion, FR) para la medición continua de los cambios de pH. Para garantizar un pH homogéneo, los cultivos se mezclaron con un agitador magnético a 200 rpm.
1.6 Tratamiento de muestra
[0432] Para SDS-PAGE y transferencia Western, las muestras se procesaron para producir tres fracciones: (i) fracción de sobrenadante, (ii) extracto celular total (que contiene extracto libre de células, fragmentos de pared celular y otras partículas) y (iii) extracto libre de células.
[0433] La fracción de sobrenadante se preparó mezclando 1 ml de sobrenadante de fermentación con 150 ul de TCA y se incubó a 4°C durante al menos 1 h. El precipitado se recogió por centrifugación a 20.000 x g. El sedimento se usó inmediatamente o se almacenó a -20 °C; después de una etapa de centrifugación adicional para eliminar trazas de TCA, se resuspendió en 15 gl de Tris-HCI 5 mM, pH 7,5.
[0434] Posteriormente, se añadieron 5 gl de 4x tampón de muestra (que contenía 75 mM de DTT) y la suspensión se calentó durante 20 minutos a 70°C. En todos los casos, se aplicaron volúmenes de 20 gl al gel.
[0435] Los extractos celulares totales se prepararon de la siguiente manera: el sedimento de 10 ml de muestra de un cultivo discontinuo o 1 ml de un cultivo de fermentación se disolvió en 1 ml de Tris-HCI 5 mM, pH 7,5 y se transfirió a un tubo de batido de perlas con 500 mg de perlas de zirconio y se congelaron a - 20 °C hasta su posterior procesamiento. Después de descongelar, esta suspensión se agitó con un batidor de bolas FastPrep (MP Biomedicals LLP, Santa Ana, CA, EE. UU.) 4 x 30 segundos a velocidad 4 con enfriamiento intermitente durante 1 minuto en hielo. Después de que las perlas sedimentaron durante 1 minuto, se mezclaron 15 ul de sobrenadante con 5 ul de tampón de carga y se trataron como se mencionó anteriormente.
[0436] El extracto libre de células se preparó centrifugando el extracto celular total durante 1 minuto a 20.000 x g. Se llevó a cabo una preparación adicional para SDS-PAGE, tal como se describió anteriormente.
1.7 Electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE)
[0437] El SDS-PAGE se realizó con el sistema NuPage disponible comercialmente (Life Technologies GmbH, Darmstadt, DE) siguiendo el protocolo del fabricante.
[0438] La proteína de referencia FGF2 humana se obtuvo de Sigma Aldrich. Se disolvieron 50 gg en 25 gl de Tris 5 mM, pH 7,5 para dar una concentración final de 2 gg/gl. En una prueba de funcionamiento, se aplicaron 5 y 10 gg al gel SDS-PAGE después de mezclar con 4 x tampón de carga concentrado, dando como resultado 1 x concentración de tampón de carga.
[0439] Tal como se representa en la Figura 1, el gel muestra monómeros, una pequeña cantidad de dímero y una cantidad muy pequeña de trímero de hFGF2. Carriles 1 y 4 = marcador SeeBlue; carril = 25 gg de FGF2 y carril 3 = 10 gg de hFGF2. Este gel se desarrolló sin la adición de DTT al tampón de carga y al tampón de gel.
[0440] La proteína de referencia IL4 humana se obtuvo de los sistemas de I D (Minneapolis, MN, EE. UU.). La IL4 humana se disolvió en PBS (Na2HPÜ45,8 mM, NaH2PÜ44,2 mM, NaCl 145 mM) para dar una concentración final de 100 gg/ml. Como referencia, se aplicó 1 gg por carril para la tinción con Coomassie y 0,1 gg para la tinción con plata y las transferencias Western.
[0441] La proteína de referencia CSF-1 humano se obtuvo de Abcam PLC (Cambridge, GB). El CSF1 humano se disolvió en agua estéril para dar una concentración final de 100 gg/ml. Como referencia, se aplicó 1 gg por carril para la tinción con Coomassie y 0,1 gg para la tinción con plata y las transferencias Western.
1.8 Transferencia Western
[0442] La transferencia de proteínas también se llevó a cabo utilizando el sistema de NuPage (XCell Blot Module) de acuerdo con el protocolo de Life Technologies. Las membranas de transferencia eran membranas de nitrocelulosa precortadas de Thermo Fisher Scientific Inc. El tampón de transferencia era el tampón de transferencia NuPage (20x) de Life Technologies. La transferencia de las proteínas se realizó a 35 V durante 1 h.
[0443] Para la detección de FGF2 humano se usó un anticuerpo monoclonal anti-FGF2 humano de ratón purificado (BD Transduction Laboratory, Heidelberg, DE) a una dilución de 1:250. El segundo anticuerpo era IgG anti-ratón ligado a peroxidasa de rábano picante (HRP) a una dilución de 1:10.000 obtenido de Bioké BV (Leiden, NL).
[0444] Para la detección de IL4 humana se usó una IgG1 anti-IL4 humana de ratón monoclonal de sistemas de I D (clon # 3007) a una dilución de 1:500. El segundo anticuerpo era IgG anti-ratón de anticuerpo unido a HRP a una dilución de 1:10.000 obtenida de Bioké BV (Leiden, NL).
[0445] Para la detección de CSF1 humano, se usó un anticuerpo policlonal de conejo para MCSF humano de Abcam PLC (clon ab9693) a una dilución de 1:2.000. El segundo anticuerpo era un anticuerpo IgG anti-conejo unido a HRP a una dilución de 1:2.000 obtenido de Bioké BV (Leiden, NL).
[0446] Las transferencias Western se revelaron con sustrato SuperSignal West Pico Chemiluminiscent obtenido de Thermo Fisher Scientific Inc.
1.9 Secuenciación de aminoácidos N-terminal
[0447] Para la secuenciación de aminoácidos N-terminal de hFGF2, hIL4 y hCSF1 del sobrenadante de cultivos de fermentación controlada, las bandas de dos carriles de una SDS-PAGE teñida con Coomassie se cortaron y se enviaron a Eurosequence Groningen, NL).
Ejemplo 1: Generación de plásmidos de expresión.
1.1 Secuenciación del plásmido pNZ8149
[0448] El plásmido pNZ8149 se usó como vector para la expresión del factor de crecimiento de fibroblastos humano 2 (hFGF2), la interleucina 4 humana (hIL4) y el factor estimulante de colonias humano 1 (hCSF1) en L. lactis. El plásmido pNZ8149 se selecciona en las células huésped a través de un mecanismo de calidad alimentaria basado en el crecimiento en lactosa.
[0449] Para fines de referencia, el ADN plasmídico se aisló y secuenció (para los cebadores, véase la Tabla 1). No se encontraron diferencias en relación con la secuencia actualmente disponible. La secuencia de pNZ8149 se proporciona en la SEQ ID No.35.
1.1.1 Factor de crecimiento de fibroblastos humanos 2 (hFGF-2)
[0450] La forma madura de hFGF-2 contiene 155 aminoácidos y se designa a continuación como hFGF2-155. Tiene un peso molecular de 17,3 kDa y un pl de 9,85. La molécula contiene 4 residuos de cisteína.
[0451] La variante hFGF-2 utilizada para la clonación y expresión en L. lactis carece de los dos primeros aminoácidos, metionina y alanina, y por lo tanto contiene 153 aminoácidos. Por lo tanto, esta variante se designa a continuación como hFGF2-153. hFGF2-153 tiene un peso molecular de 17,1 kDa y un pl de 9,85. Esta variante también contiene cuatro residuos de cisteína.
[0452] La secuencia de aminoácidos correspondiente del FGF2-155 humano se muestra a continuación, en la Figura 32a y en la SEQ ID N° 27:
MAAGSITTLP ALPEDGGSGA FPPGHFKDPK RLYCKNGGFF LR1HPDGRVD GVREKSDPHI KLQLQAEERG VVSIKGVCAN RYLAMKEDGR LLASKCVTDE CFFFERLESN NYNTYRSRKY TSWYVALKRT GQYKLGSKTG PGQKAILFLP MSAKS
[0453] Los aminoácidos subrayados indican los dos primeros aminoácidos metionina y alanina que faltan en la variante hFGF2-153. La secuencia de aminoácidos de la variante hFGF2-153 se representa en la Figura 32b y en la SEQ ID No. 30.
[0454] La secuencia de FGF2-155 es la secuencia de FGF2 humano maduro después de la secreción. In vivo, esta secuencia se procesa adicionalmente. Sin embargo, varios productos recombinantes existentes han usado esta secuencia de 155 aminoácidos con o sin el residuo de metionina N-terminal.
1.1.2 Interleucina 4 humana (hIL-4)
[0455] La proteína madura de hIL-4 contiene 129 aminoácidos, que corresponden a los aminoácidos 25 a 153 de la secuencia de aminoácidos disponible con el número de acceso de NCBI NP_000580.1. La proteína madura tiene un peso molecular de 14,96 kDa y un pl de 9,36. La molécula contiene 6 residuos de cisteína.
[0456] La secuencia de aminoácidos de la IL-4 madura humana se muestra a continuación, en la Figura 18c, y en la SEQ ID No. 12:
HKCDITLQEI IKTLNSLTEQ KTLCTELTVT DIFAASKNTT EKETFCRAAT VLRQFYSHHE KDTRCLGATA QQFHRHKQLI RFLKRLDRNL WGLAGLNSCP VKEANQSTLE NFLERLKTIM REKYSKCSS
[0457] La variante hIL-4 variante que se utiliza para la clonación y expresión en L. lactis contiene un residuo de alanina adicional en el extremo N-terminal de la proteína madura y por lo tanto contiene 130 aminoácidos. Tiene un peso molecular de 15,03 kDa y un pl de 9,36. Esta variante también contiene 6 residuos de cisteína.
[0458] La secuencia de aminoácidos correspondiente de la variante hIL-4 humana que se usa para la clonación y la expresión se muestra a continuación, en la Figura 33 y en la SEQ ID N° 14:
AHKCDITLQE IIKTLNSLTE QKTLCTELTV TDIFAASKNT TEKETFCRAA TVLRQFYSHH EKDTRCLGAT AQQFHRHKQL IRFLKRLDRN LWGLAGLNSC PVKEANQSTL ENFLERLKTI MREKYSKCSS
[0459] El resto de alanina adicional en el extremo N terminal está subrayado en la secuencia de aminoácidos anterior.
1.1.3 Factor estimulante de colonias humanas 1 (hCSFI)
[0460] La secuencia de aminoácidos usada para la expresión se deriva de la secuencia de 554 aminoácidos del precursor de CSF1 humano disponible con el número de acceso de NCBI NP_000748.3. La secuencia utilizada comienza en el aminoácido 33 (E), que es el primer aminoácido del hCSF1 maduro, y termina en el aminoácido 181 (Q).
[0461] Además, se han añadido 9 aminoácidos adicionales en el extremo C-terminal que ocupan en la proteína nativa las posiciones 480 - 488 (GHERQSEGS). Para mejorar la eliminación del péptido señal por la peptidasa señal, se añadió un residuo de alanina adicional en el extremo N-terminal. La secuencia de aminoácidos resultante se muestra a continuación, en la Figura 34 y en la SEQ ID No. 6:
AEEVSEYCSH MIGSGHLQSL QRLIDSQMET SCQITFEFVD QEQLKDPVCY LKKAFLLVQD IMEDTMRFRD NTPNAIAIVQ LQELSLRLKS CFTKDYEEHD KACVRTFYET PLQLLEKVKN VFNETKNLLD KDWNIFSKNC NNSFAECSSQ GHERQSEGS
[0462] El residuo de alanina adicional en el extremo N-terminal está subrayado en la anterior secuencia de aminoácidos. Los 9 aminoácidos adicionales agregados en el extremo C terminal se muestran en negrita. La proteína codificada por esta secuencia contiene 159 aminoácidos, tiene un peso molecular de 18,5 kDa y un pl de 4,72. La proteína contiene 7 residuos de cisteína.
1.2 Construcción de un plásmido para la expresión de hFGF2, hIL4 y hCSF1 en Lactococcus lactis [0463] Para L. lactis el objetivo era expresar y secretar hFGF2, hIL4 y hCSF1, por ejemplo, en el sobrenadante del medio de crecimiento. Para ello se utilizaron señales de transcripción, traducción y secreción de proteínas. Las señales para la transcripción y traducción estaban presentes en el sistema de expresión NICE de L. lactis y se originaron en el promotor nisinA de L. lactis. El promotor nisinA de L. lactis se representa en la Figura 3 y la SEQ ID N° 44 y, por ejemplo, se describe en de Ruyter et al. (1996)
[0464] La figura 3 muestra además el elemento -10 y el elemento -35 del promotor, así como el sitio de unión ribosomal (RBS). El codón de inicio ATG de la proteína diana respectiva sigue directamente los dos residuos de cisteína en el extremo 3 de la secuencia.
[0465] La señal de secreción se derivó de la proteína Lactococcus Usp45, que se describe, por ejemplo, en van Asseldonk et al. (1993) y van Asseldonk et al. (1990)
[0466] La señal de secreción de la proteína Lactococcus Usp45 se muestra a continuación, en la Figura 35, y en la SEQ ID No. 34:
MKKKIISAIL MSTVILSAAA PLSGVYA
[0467] En la célula existe un mecanismo que asegura que después de la secreción de una proteína, esta secuencia señal se separa de la proteína diana. Esta reacción es catalizada por la señal peptidasa que tiene una preferencia específica por ciertos aminoácidos en las posiciones alrededor del sitio de escisión.
[0468] Para optimizar el sitio de escisión se utilizó el programa basado en la web SignalP 4.1 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignaIP/).
[0469] Para la secuencia de aminoácidos de hFGF2, este programa mostró que la escisión óptima ocurre cuando se eliminan los dos primeros aminoácidos de hFGF2-155, dejando una proteína hFGF2-155 que comienza con un residuo Ala y una longitud total de 153 aminoácidos (Variante hFGF2-153).
[0470] La secuencia de aminoácidos respectiva de la proteína precursora hFGF2-153 utilizada para el análisis con el programa SignalP 4.1 se muestra a continuación y en la SEQ ID N° 29:
MKKKIISAIL MSTVILSAAA PLSGVYAAGS ITTLPALPED GGSGAFPPGH FKDPKRLYCK NGGFFLR1HP DGRVDGVREK SDPHIKLQLQ AEERGVVSIK GVCANRYLAM KEDGRLLASK CVTDECFFFE RLESNNYNTY RSRKYTSWYV ALKRTGQYKL GSKTGPGQKA ILFLPMSAKS
[0471] Los aminoácidos subrayados indican la señal de secreción de la proteína de Lactococcus Usp45.
[0472] Para la secuencia de aminoácidos de hIL4, este programa mostró que la escisión óptima se produce cuando se añade un residuo de alanina al extremo N-terminal de la proteína IL4 madura, dando como resultado una proteína de 130 aminoácidos.
[0473] La secuencia de aminoácidos respectiva de la proteína precursora hIL4 utilizada para el análisis con el programa SignalP 4.1 se muestra a continuación y en la SEQ ID N° 13:
MKKKIISAIL MSTVILSAAA PLSGVYAAHK CDITLQEIIK TLNSLTEQKT LCTELTVTDI FAASKNTTEK ETFCRAATVL RQFYSHHEKD TRCLGATAQQ FHRHKQLIRF LKRLDRNLWG LAGLNSCPVK EANQSTLENF LERLKTIMRE KYSKCSS
[0474] Los aminoácidos subrayados indican la señal de secreción de la proteína de Lactococcus Usp45.
[0475] Para la secuencia de aminoácidos de hCSF1, este programa mostró que la escisión óptima se produce cuando se agrega un residuo de alanina al extremo N de la proteína madura hCSF1 que da como resultado una proteína de 159 aminoácidos.
[0476] La secuencia de aminoácidos respectiva de la proteína precursora hCSF1 usada para el análisis con el programa SignalP 4.1 se muestra a continuación y en la SEQ ID No. 5:
MKKKIISAIL MSTVILSAAA PLSGVYAAEE VSEYCSHMIG SGHLQSLQRL IDSQMETSCQ ITFEFVDQEQ LKDPVCYLKK AFLLVQDIME DTMRFRDNTP NAIAIVQLQE LSLRLKSCFT KDYEEHDKAC VRTFYETPLQ LLEKVKNVFN ETKNLLDKDW NIFSKNCNNS FAECSSQGHE RQSEGS
[0477] Los aminoácidos subrayados indican la señal de secreción de la proteína de Lactococcus Usp45.
[0478] La Figura 4a muestra una lectura de SignalP 4.1 obtenida con la secuencia de aminoácidos representada en la SEQ ID N° 29, en la que la señal secretora de la proteína Usp45 se fusiona con el extremo N-terminal de hFGF2-153. La lectura muestra un sitio de escisión claro entre los aminoácidos 27 y 28 del precursor de hFGF2-153 y las puntuaciones para este sitio de escisión.
[0479] La Figura 4b muestra una lectura de SignalP 4.1 obtenida con la secuencia de aminoácidos representada en la SEQ ID N° 13, en la que la señal secretora de la proteína Usp45 se fusiona con el extremo N-terminal de hIL4. La lectura muestra un sitio de escisión claro entre los aminoácidos 27 y 28 del precursor de hIL4 y las puntuaciones para este sitio de escisión.
[0480] La Figura 4c muestra una lectura de SignalP 4.1 obtenida con la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID No. 5, en la que la señal secretora de la proteína Usp45 se fusiona con el extremo N-terminal de hCSF1. La lectura muestra un sitio de escisión claro entre los aminoácidos 27 y 28 del precursor de hCSF1 y las puntuaciones para este sitio de escisión.
[0481] El uso de codones para los respectivos genes, que codifican hFGF2-153, hIL4, y hCSF1 fueron adaptados al uso del codón general de L. lactis. Este es un procedimiento rutinario del proveedor de la síntesis génica.
[0482] Además, se utilizó la misma secuencia señal Usp45 para las tres proteínas. De este modo, se mejoró la expresión de las tres proteínas y el procesamiento postraduccional del péptido señal en la misma célula bacteriana.
[0483] Para hFGF2 se sintetizó un fragmento que contenía el promotor de nisina A, la secuencia señal Usp45 y el gen de hFGF2-153. La secuencia nucleica de la construcción artificial ssUsp45-FGF2-153 se representa en la SEQ ID No. 45 y la Figura 5a. El uso de codones se optimizó para el uso general de codones de L. lactis.
[0484] La figura 5a muestra el inserto sintetizado así como la secuencia de aminoácidos correspondiente obtenida después de la transcripción y traducción. FGF2-153 indica el inserto de codificación de FGF-2 humano. PnisA indica el promotor de nisina A del operón de nisina de Lactococcus lactis. ssUsp45 indica la secuencia de señal del gen usp45 de Lactococcus lactis. Un asterisco indica un codón de parada. Además, en la secuencia de ácidos nucleicos, los sitios de reconocimiento de restricción para las endonucleasas BamHI (posición 1 a 6) y Xbal (posición 751 a 756) se indican mediante subrayado.
[0485] Para hIL4 se sintetizó un fragmento que contenía el promotor de nisina A, la secuencia señal Usp45 y el gen de hIL4. La secuencia nucleica de la construcción artificial ssUsp45-hIL4 se representa en la SEQ ID N° 47 y la Figura 5b. El uso de codones se optimizó para el uso general de codones de L. lactis.
[0486] La figura 5b muestra el inserto sintetizado, así como la secuencia de aminoácidos correspondiente obtenida después de la transcripción y traducción. hIL4 indica el inserto de codificación de IL4 humana. PnisA indica el promotor de nisina A del operón de nisina de Lactococcus lactis. ssUsp45 indica la secuencia señal del gen usp45 de Lactococcus lactis. Un asterisco indica un codón de parada. Además, en la secuencia de ácidos nucleicos, los sitios de reconocimiento de restricción para las endonucleasas BamHI (posición 1 a 6) y Xbal (posición 682 a 687) se indican mediante subrayado.
[0487] Para hCSF1 se sintetizó un fragmento que contenía el promotor de nisina A, la secuencia de señal Usp45 y el gen de hCSF1. La secuencia nucleica de la construcción artificial ssUsp45-hCSF2 se representa en la SEQ ID N° 49 y en la Figura 5c. El uso de codones se optimizó para el uso general de codones de L. lactis.
[0488] La figura 5c muestra el inserto sintetizado, así como la secuencia de aminoácidos correspondiente obtenida después de la transcripción y traducción. hCSF1 indica el inserto de codificación de CSF1 humano. PnisA indica el promotor de nisina A del operón de nisina de Lactococcus lactis. ssUsp45 indica la secuencia señal del gen usp45 de Lactococcus lactis. Un asterisco indica un codón de parada. Además, en la secuencia de ácidos nucleicos, los sitios de reconocimiento de restricción para las endonucleasas BamHI (posición 1 a 6) y Xbal (posición 769 a 774) se indican mediante subrayado.
[0489] Los productos de síntesis génica terminados se obtuvieron de BaseClear cada uno como un fragmento clonado en el vector pUC57 de E. coli.
[0490] Los fragmentos se clonaron en el plásmido pNZ8149 al digerir los plásmidos pUC57 con los respectivos productos de síntesis génica con las enzimas de restricción BamHI y Xbal. Los fragmentos BamHI y Xbal que contienen los productos de síntesis génica respectivos se aislaron y se ligaron en el plásmido pNZ8149 cortado con Psul y Xbal para dar como resultado los plásmidos respectivos pFGF2, pIL4 y pCSF1. Las respectivas endonucleasas de restricción se obtuvieron de Thermo Fisher Scientific Inc.
[0491] La mezcla de ligación respectivo se transformó en la cepa de L. lactis NZ3900. La verificación del plásmido se llevó a cabo mediante análisis de PCR de colonias. Las secuencias de ácido nucleico respectivas de los cebadores utilizados se representan en la Tabla 1 a continuación. Los resultados se muestran en las Figuras 6a a 6c.
[0492] La Figura 6a muestra el resultado de un análisis de PCR de colonias de colonias potenciales de la cepa de L. lactis NZ3900 con pFGF2. Carril 1: ADN lambda digerido con HindIII; carril 2: pNZ8149 (vector vacío) amplificado con los cebadores nis2 y seqlacF (tamaño de fragmento esperado 391 pb); carriles 3 y 4: colonias aisladas amplificadas con cebadores nis2 y seqlacF (tamaño de fragmento esperado 907 pb).
[0493] La Figura 6b muestra el resultado de un análisis de PCR de colonias de colonias potenciales de la cepa de L. lactis NZ3900 con pIL4. Carril 1: ADN lambda digerido con HindIII; carril 2: pNZ8149 (vector vacío) amplificado con los cebadores nis2 y seqlacF (tamaño de fragmento esperado 391 pb); carriles 11 y 12 colonias aisladas amplificadas con cebadores nis2 y seqlacF (tamaño de fragmento esperado 838 pb).
[0494] La Figura 6c muestra el resultado de un análisis por PCR de colonias de colonias potenciales de la cepa de L. lactis NZ3900 con pCSF1. Carril 1: ADN lambda digerido con HindIII; carril 2: pNZ8149 (vector vacío) amplificado con los cebadores nis2 y seqlacF (tamaño de fragmento esperado 391 pb); carril 3: colonia aislada amplificada con cebadores nis2 y seqlacF (tamaño de fragmento esperado de 925 pb).
Tabla 1: Cebadores usados.
Cebadores Secuencia SEQ ID NO:
seqlacF 5' TGTGATTCATCACCTCATCG 3' 36
seq2F 5' CGTGGCTTTGCAGCGAAGATG 3' 37
seq3F 5' GACTCAATTCCTAATGATTGG 3' 38
seq4F 5' TCAGTGTGGATATAGAGCAAG 3' 39
seq6R 5' CTGTAATTTGTTTAATTGCC 3' 40
seq7R 5' TTGAGCCAGTTGGGATAGAG 3' 41
seq8R 5' GTATCTCAACATGAGCAACTG 3' 42
nis2 5' TTGAACGTTTCAAGCCTTGGCAA 3' 43
[0495] La Figura 7a muestra un mapa plasmídico y una secuencia de ácidos nucleicos del plásmido pFGF2 para la expresión y secreción de hFGF2 en Lactococcus lactis. lacF indica un marcador de selección para el crecimiento de la cepa huésped NZ3900 en lactosa; PnisA indica un promotor de nisina A del operón de nisina de Lactococcus lactis; ssUSP45 indica una secuencia señal del gen usp45 de L. lactis. T indica un terminador; repC y repA indican genes de replicación. La secuencia de ácidos nucleicos del plásmido pFGF2 también se representa en la SEQ ID N° 46.
[0496] La figura 7b muestra un mapa plasmídico y una secuencia de ácidos nucleicos del plásmido pIL4 para la expresión y secreción de hIL4 en Lactococcus lactis. lacF indica un marcador de selección para el crecimiento de la cepa huésped NZ3900 en lactosa; PnisA indica un promotor de nisina A del operón de nisina de Lactococcus lactis; ssUSP45 indica una secuencia señal del gen usp45 de L. lactis. T indica un terminador; repC y repA indican genes de replicación. La secuencia de ácidos nucleicos del plásmido pIL4 también se representa en la SEQ ID N° 48.
[0497] La Figura 7c muestra un mapa plasmídico y una secuencia de ácidos nucleicos del plásmido pCSF1 para la expresión y secreción de hCSF1 en Lactococcus lactis. lacF indica un marcador de selección para el crecimiento de la cepa huésped NZ3900 en lactosa; PnisA indica un promotor de nisina A del operón de nisina de Lactococcus lactis; ssUSP45 indica una secuencia señal del gen usp45 de L. lactis. T indica un terminador; repC y repA indican genes de replicación. La secuencia de ácidos nucleicos del plásmido pCSF1 también se representa en la SEQ ID No. 50.
Ejemplo 2: Prueba de producción de factores recombinantes en Lactococcus lactis.
[0498] Para probar si los factores recombinantes respectivos hFGF2, hIL4 o hCSF1 se producen y secretan de Lactococcus lactis, se seleccionaron cinco colonias de la transformación inicial para un análisis posterior. Estas colonias se purificaron primero mediante sembrado y aislamiento de colonias individuales. Las cinco colonias se inocularon individualmente en medio de lactosa M17 y se cultivaron hasta un DO 600 = 0,5 y se indujeron con 1 ng/ml de nisina.
[0499] Los cultivos se terminaron y se recogieron 2 h después de la adición de nisina. Todos los cultivos mostraron el mismo comportamiento después de la adición de nisina y una cierta cantidad de retraso del crecimiento (datos no mostrados).
a) Producción de hFGF2 en L. lactis NZ3900 (pFGF2) en condiciones de fermentación controlada
[0500] Para establecer el rendimiento de un cultivo NZ3900 (pFGF2), se llevaron a cabo pruebas de fermentación controladas.
[0501] Se llevaron a cabo las siguientes cinco pruebas de fermentación:
1. NZ3900 (pFGF2) no inducido
2. NZ3900 (pFGF2) inducido a DO 600 = 0,5 con 5 ng/mL de nisina
3. NZ3900 (pFGF2) inducido a DO 600 = 3 con 5 ng/mL de nisina
4. NZ3900 (pNZ8149) inducido a DO 600 = 0,5 con 5 ng/ml de nisina
5. NZ3900 (pNZ8149) inducido a DO 600 = 3 con 5 ng/ml de nisina
Se tomaron muestras a t = 0 (antes de la inducción), t = 2 horas, t = 4 horas y t = 6 horas después de la inducción con la cantidad indicada de nisina.
[0502] Los cultivos 4 y 5 se realizaron para establecer si 5 ng/ml de nisina tiene un efecto sobre el crecimiento de un cultivo debido a la activación del promotor de nisina, que en este caso no es seguido por un gen diana. No se observó ningún efecto sobre el crecimiento (datos no mostrados).
[0503] Las transferencias Western se han llevado a cabo con muestras de ambas condiciones de inducción. La detección de hFGF2 se realizó con los anticuerpos descritos anteriormente en el punto 1.8.
[0504] La Figura 8 muestra en la transferencia Western en los carriles 3 y 4, la expresión basal de FGF2 sin inducción por nisina.
[0505] Además, la Figura 8 muestra que después de la inducción del cultivo a DO 600 = 0,5, la producción de hFGF2 está fuertemente inducida y aumenta hasta 6 horas después del momento de la inducción.
[0506] Se aislaron bandas de hFGF2 de un gel SDS-PAGE (inducción a DO 600 = 0,5 con 5 ng/ml de nisina, puntos de tiempo t = 4 yt = 6) y se enviaron a Eurosequence BV (Groningen, NL) para secuenciación N-terminal de aminoácidos.
[0507] Después de la limpieza de las muestras se determinó una secuencia de aminoácidos N-terminal tentativa. La secuencia determinada es: Ala-Gly-Ser-Ile-Thr-Thr.
[0508] Esta secuencia coincide exactamente con la secuencia esperada después de que la secuencia señal se separe. La secuencia esperada es: AGSITTLPAL. Esto significa que hFGF2 se expresa, secreta y procesa correctamente en L. lactis.
[0509] El sobrenadante del cultivo de NZ3900 (pFGF2) inducido a una DO 600 = 0,5 con 5 ng/ml de nisina fue utilizado en los Ejemplos siguientes. El cultivo se designó AUP-10.
b) Producción de hIL4 en L. lactis NZ3900 (pIL4) en condiciones de fermentación controlada
[0510] Para establecer el rendimiento de un cultivo de NZ3900 (pIL4), se llevaron a cabo pruebas de fermentación controladas con las siguientes pruebas de fermentación:
1. NZ3900 (pIL4) no inducido
2. NZ3900 (pIL4) inducido a DO 600 = 0,5 con 5 ng/ml de nisina
3. NZ3900 (pIL4) inducido a DO 600 = 3 con 5 ng/mL de nisina
[0511] Se tomaron muestras a t = 0 (antes de la inducción), t = 2 h, t = 4 h y t = 6 h después de la inducción con la cantidad indicada de nisina.
[0512] La producción de hIL4 se analizó mediante SDS-PAGE de la fracción sobrenadante y el extracto libre de células en combinación con transferencia Western. La detección de hIL4 se realizó con los anticuerpos descritos anteriormente en el punto 1.8.
[0513] Durante SDS-PAGE, se añadió DTT al tampón de muestra y al tampón de desarrollo para facilitar la disociación de los puentes disulfuro. Estos mismos geles de SDS-PAGE también se usaron para ejecutar una transferencia Western para la detección específica de hIL4.
[0514] El efecto de la adición de DTT es que hIL4 forma una única banda de proteína en el gel teñido de Coomassie y en la transferencia Western (ver Figura 9).
[0515] Además, se usó una preparación de proteína de referencia hIL4 sin una proteína transportadora. La banda de proteína de referencia está a la misma altura que la proteína producida por las células de L. lactis NZ3900 (pIL4).
[0516] La transferencia Western muestra más detalles sobre la expresión de hIL4 en L. lactis NZ3900 (pIL4).
[0517] La inducción tiene lugar cuando el cultivo se induce a DO 600 = 0,5 con 5 ng/ml de nisina pero no cuando se induce a DO 600 = 3 con 5 ng/ml de nisina. La producción de hIL4 continúa hasta al menos 6 h. En este período aumenta la concentración de IL4 en el sobrenadante.
[0518] Se aislaron bandas de hIL4 de un gel de SDS-PAGE (inducción a DO 600 = 0,5 con 5 ng/ml de nisina, puntos de tiempo t = 4 yt = 6) y se enviaron a Eurosequence BV para la secuenciación de aminoácidos N-terminal.
[0519] Después de la limpieza de las muestras se determinó una secuencia de aminoácidos N-terminal tentativa. La secuencia determinada es: Ala-His-Lys-Cys.
[0520] Esta secuencia coincide exactamente con la secuencia esperada después de que la secuencia señal se separe. La secuencia esperada es: AHKCDITLQE.
[0521] Esto significa que hIL4 se expresa, secreta y procesa correctamente en L. lactis. El sobrenadante de cultivo de NZ3900 (pIL4) inducido a DO 600 = 0,5 con 5 ng/ml de nisina se usó en los siguientes ejemplos. El cultivo se designó Au P-12.
c) Producción de hCSFI en L. lactis NZ3900 (pCSFI) en condiciones de fermentación controlada
[0522] Para establecer el rendimiento de un cultivo NZ3900 (pCSF1), se llevaron a cabo pruebas de fermentación controladas. Se llevaron a cabo las siguientes tres fermentaciones.
1. NZ3900 (pCSF1) no inducido
2. NZ3900 (pCSF1) inducido a DO 600 = 0,5 con 5 ng/mL de nisina
3. NZ3900 (pCSF1) inducido a DO 600 = 3 con 5 ng/mL de nisina
[0523] El cultivo NZ3900 (pCSF1) se designó AUP-14.
[0524] Se tomaron muestras a t = 0 (antes de la inducción), t = 2 horas, t = 4 horas y t = 6 horas después de la inducción con la cantidad indicada de nisina.
[0525] La producción de hCSF1 se analizó por SDS-PAGE de la fracción sobrenadante y el extracto libre de células en combinación con transferencia Western. La detección de hCSF1 se realizó con los anticuerpos descritos anteriormente en el punto 1.8.
[0526] Durante SDS-PAGE, se añadió DTT al tampón de muestra y al tampón de desarrollo para facilitar la disociación de los puentes disulfuro. Estos mismos geles SDS-PAGe también se usaron para ejecutar una transferencia Western para la detección específica de hCSF1.
[0527] En la transferencia Western (ver Figura 11), el carril con la proteína de referencia todavía muestra una pequeña cantidad de dímero. Además, el gel teñido de Coomassie (ver Figura 10) también muestra bandas del mismo tamaño que la proteína de referencia.
[0528] En cultivos no inducidos casi no se puede detectar ninguna producción de referencia. En los cultivos inducidos a DO 600 = 0,5 con 5 ng/ml de nisina, la producción de CSF1 aumenta con el tiempo hasta al menos 6 h. Solo se pudo observar una pequeña cantidad de productos de degradación.
[0529] Se aislaron bandas de hCSF1 de un gel SDS-PAGE (inducción a DO 600 = 0,5 con 5 ng/ml de nisina, puntos de tiempo t = 4 y t = 6) y se sometieron a secuenciación de aminoácidos N-terminal.
[0530] Después de la limpieza de las muestras, se determinó una secuencia de aminoácidos N-terminal tentativa. La secuencia determinada es: Ala-Glu-Glu-Val-Ser.
[0531] Esta secuencia coincide exactamente con la secuencia esperada después de que la secuencia de señal se separe. La secuencia esperada es: AEEVSEYCSH.
[0532] Esto significa que hCSF1 se expresa, secreta y procesa correctamente en L. lactis.
[0533] El sobrenadante de cultivo de NZ3900 (pCSF1) inducido a DO 600 = 0,5 con 5 ng/ml de nisina se usó en los siguientes Ejemplos. El cultivo se designó AUP-14.
d) Producción de hFGF2, hlL4 y hCSF1 en L. lactis NZ3900 a partir de un único operón en condiciones de fermentación controlada
[0534] Se realizaron 3 construcciones con 3 de las 6 permutaciones de los tres genes (FGF2, IL4, CSF1):
a) hFGF2, hIL4, hCSF1,
b) hCSF1, hFGF2, hIL4,
c) hIL4, hCSF1, hFGF2.
[0535] Para el diseño de los operones, a cada gen se le proporcionó su propio sitio de unión al ribosoma para el inicio de la traducción y su propio péptido señal para la secreción de proteínas. En relación con el péptido señal, se había decidido antes utilizar para los tres genes la misma secuencia señal (ssUsp45). Para evitar grandes regiones de nucleótidos idénticas en el plásmido en estrecha proximidad (posibilidad de recombinación/deleciones intraplásmidas), el mismo péptido señal fue codificado por diferentes codones sobre la base de la degeneración de codones y el uso de codones de L. lactis.
[0536] Para cada uno de los primeros genes de las 3 construcciones, se usó el sitio de unión al ribosoma del gen de Nisina A (nisA). Para los otros dos genes de cada una de las 3 construcciones, los sitios de unión al ribosoma del gen de la subunidad gamma de ATP sintasa (atpG) y el gen de la galactosida O-acetiltransferasa (lacA) se eligieron sobre la base de un buen ajuste con el extremo 3' del ARNr 16S de L. lactis, tal como se describe en Bolotin et al. (2001) ("The complete genome sequence of the lactic acid bacterium lactococcus lactis ssp.lactis IL1403", Genome Res. Volumen 11, páginas 731 a 753). La secuencia de nucleótidos del genoma de L. lactis IL1403 está disponible de NCBI con el número de acceso. AE005176.1.
[0537] Una visión general de los tres sitios de unión a ribosomas se proporciona en la Figura 24a. Además, las secuencias de ácido nucleico que proporcionan los sitios de unión a ribosomas respectivos que incluyen el codón de inicio (ATG) del marco de lectura abierto respectivo también se muestran en la SEQ ID N° 51 a la SEQ ID N° 53.
[0538] El extremo 3' del ARNr 16S de L. lactis (5' GGAUCACCUCCUUUCU 3 ') se muestra en la SEQ ID N° 54. En la Figura 24a, el ARNr 16S se muestra como ADNr 16S, en el que se reemplazó el uracilo (U) por timidina (T).
[0539] La Figura 24a también muestra la secuencia consenso de seis bases de la secuencia Shine-Dalgarno (5' AGGAGG 3'). La secuencia Shine-Dalgarno es un sitio de unión ribosomal en el ARN mensajero procariota, generalmente ubicado alrededor de 8 bases en dirección 5' del codón de inicio. La secuencia de ARN ayuda a reclutar el ribosoma en el ARNm para iniciar la síntesis de proteínas alineando el ribosoma con el codón de inicio.
[0540] Los tres operones se diseñaron de tal manera que las secuencias sintetizadas se pueden clonar en un solo paso en el plásmido pNZ8149 usando los sitios Psul y Ncol del vector (BamHI y Psul son compatibles). Además, los sitios Mlul se introdujeron delante de los sitios de unión al ribosoma delante de los genes dos y tres. De este modo, la creación de los tres operones restantes se permitió mediante la eliminación del gen medio y la clonación del tercer gen mediante PCR utilizando los sitios Ncol y Xbal del plásmido.
[0541] Las secuencias respectivas de los ácidos nucleicos sintetizados se representan en las Figuras 24b a 24d y en SEQ ID No. 55 a SEQ ID No. 57. El uso de codones de los tres genes se ha adaptado para L. lactis.
[0542] La expresión de las 3 construcciones está controlada cada una por un solo promotor de nisina A seguido de las secuencias de ácido nucleico indicadas anteriormente que codifican la proteína precursora hFGF2-153, la proteína precursora hIL4 y la proteína precursora hCSF1 obtenida en el Ejemplo 1.
[0543] Los productos de síntesis génica terminados se obtuvieron de BaseClear, cada uno como un fragmento clonado en el vector E. coli pUC57.
[0544] Los fragmentos se clonaron en el plásmido pNZ8149 al digerir los plásmidos pUC57 que contenían los respectivos productos de síntesis génica con las enzimas de restricción BamHI y Ncol. Los fragmentos BamHI/Ncol que contienen los respectivos productos de síntesis génica se aislaron y se ligaron en el plásmido pNZ8149 cortado con Psul y Ncol para dar como resultado los plásmidos respectivos
- pC-FI (que contiene el fragmento BamHI/Ncol del producto de síntesis génica CSF-RBS1-FGF-RBS2-IL4), - pF-I-C (que contiene el fragmento BamHI/Ncol del producto de síntesis génica FGF-RBS1-IL4-RBS2-CSF) y - pl-CF (que contiene el fragmento BamHI/Ncol del producto de síntesis génica IL4-RBS-CSF-RBS2-FGF).
[0545] Las respectivas endonucleasas de restricción utilizadas se obtuvieron de Thermo Fisher Scientific Inc.
[0546] Las construcciones respectivas se transformaron en L. lactis NZ3900.
[0547] Cada una de las 5 colonias de las tres construcciones se cultivaron en series de fermentación con pH regulado y se indujeron a DO600 = 0,5 con 5 ng/ml de nisina y se recogieron después de 4 horas.
[0548] Se precipitó 1 ml del sobrenadante con TCA y se aplicó a un pocillo del gel SDS-PAGE. Un gel se tiñó con azul de Coomassie y el otro como transferencias Western para las tres proteínas diana.
[0549] Los geles de SDS-PAGE respectivos, así como las transferencias Western se procesaron, tal como se describe anteriormente y se representan en las Figuras 24e a 24g.
[0550] Como se puede ver en la Figura 24e, la construcción a) pF-IC (FGF2, hIL4, hCSF1) dio como resultado la expresión y secreción de mucho FGF2, poca IL4 así como poca CSF1.
[0551] Como se puede ver en la Figura 24f, la construcción b) pC-FI (hCSF1, hFGF2, hIL4) dio como resultado la expresión y secreción de mucho CSF1 y FGF2, así como medio de IL4.
[0552] Como se puede ver en la Figura 24g, la construcción c) pl-CF (hIL4, hCSF1, hFGF2) dio como resultado la expresión y secreción de mucha IL4 y un poco menos de CSF1 y FGF2. El gel teñido con coomassie mostró la mejor producción e inducción de las tres proteínas.
[0553] Las tres proteínas diana pueden clonarse y expresarse a partir de una estructura de operón dando como resultado la liberación de las proteínas respectivas hIL4, hCSF1 y hFGF2 en el sobrenadante.
Ejemplo 3: Inducción de la producción de FGF2 en condiciones que se parecen a las circunstancias de curación de heridas.
[0554] Las condiciones fisiológicas en una herida son diferentes de las de un tubo de ensayo o fermentador.
[0555] Por lo tanto, se estableció un experimento para probar la inducción del sistema NICE y, por lo tanto, la producción de hFGF2 en condiciones en las que la cepa NZ3900 no crece o crece solo mínimamente. Estas condiciones están presentes cuando el pH de un cultivo ha alcanzado 5,0 y cuando el cultivo entra en la fase estacionaria.
[0556] El experimento se llevó a cabo en botellas de 200 ml con agitación y monitorización del pH. Como medio de crecimiento, se usó medio IM1 con 2% en peso en volumen de Na-beta-glicerofosfato y 0,5% en peso en volumen de lactosa. Se realizaron las siguientes fermentaciones:
1. NZ3900 (pFGF2) - sin inducción
2. NZ3900 (pFGF2) - inducción cuando el cultivo alcanza pH = 5 con 1 ng/ml de nisina
3. NZ3900 (pFGF2) - inducción cuando el cultivo alcanza pH = 5 con 0,1 ng/ml de nisina
4 NZ3900 (pFGF2) - inducción cuando el cultivo alcanza DO 600 = 3 con 1 ng/mL de nisina
5. NZ3900 (pFGF2) - inducción cuando el cultivo alcanza DO 600 = 3 con 0,1 ng/mL de nisina.
[0557] Los cultivos se recogieron 3 h después de la inducción. El cultivo de control se recogió al mismo tiempo que los cultivos que se indujeron a pH 5,0. Los resultados se muestran en la Figura 11.
[0558] La Figura 12 muestra que el crecimiento y el desarrollo del pH son idénticos en los cinco cultivos y que la inducción con nisina no tiene ningún efecto sobre el crecimiento o el desarrollo del pH.
[0559] La formación de hFGF2 se midió en 1 ml de sobrenadante de cultivo usando SDS-PAGE y transferencia Western. La Figura 13 muestra que, en condiciones donde las células no crecen o están en la fase de desaceleración del crecimiento, la nisina no induce la expresión génica. En relación con la producción de base de FGF2 (sin inducción), hay poco o ningún aumento en la cantidad de FGF2 en el sobrenadante del cultivo.
[0560] El análisis de transferencia Western muestra que hFGF2 es detectable en el sobrenadante de cultivo de los cinco cultivos. Además, dos productos de descomposición de hFGF2 son detectables.
[0561] Esto significa que todo el FGF2 con secuencia señal que se produce en la célula se procesa y secreta.
[0562] El gen para FGF2 humano se ha clonado en un vector de expresión NICE de calidad alimentaria para Lactococcus lactis.
[0563] La expresión del gen de FGF2 puede ser inducida por la adición de nisina. El hFGF2 se secreta en el sobrenadante a aproximadamente 100-200 ng/ml. La determinación de la secuencia de aminoácidos N-terminal del FGF2 secretado ha demostrado que la proteína se procesa correctamente
[0564] La inducción de la producción de FGF2 conduce a un retraso del crecimiento limitado, pero no a la detención del crecimiento.
[0565] En una fermentación controlada, la producción de FGF2 se ha inducido en una ventana amplia en la curva de crecimiento (entre DO 600 = 0,5 - 3). La producción más alta de FGF2 se ha observado después de la inducción a DO 600 = 0,5 con 5 ng/ml de nisina.
[0566] El plásmido pFGF2 es estable durante al menos 100 generaciones en la cepa NZ3900 también en condiciones no selectivas, como el crecimiento en glucosa.
Ejemplo 4a: Ensayo de migración de fibroblastos humanos
[0567] La actividad biológica de FGF2 liberado de Lactococcus lactis NZ3900 (pFGF2) y de IL4 liberada de Lactococcus lactis NZ3900 (pIL4) en la cicatrización de heridas se evaluó midiendo la migración de fibroblastos dérmicos humanos normales (NHDF) a una zona de migración artificial. El efecto del compuesto de prueba se evaluó usando un análisis de imagen de la recuperación de la herida.
[0568] Lactococcus lactis NZ3900 (pFGF2) del Ejemplo 2a y Lactococcus lactis NZ3900 (pIL4) del Ejemplo 2b se indujeron cada una a DO 600 = 0,5 con 5 ng/ml de nisina. Después de 6 h de fermentación, los sobrenadantes de cultivo respectivos se aislaron, se liofilizaron y se almacenaron a -20°C como se describió anteriormente.
[0569] Para pruebas adicionales, se prepararon soluciones madre de los sobrenadantes liofilizados en una concentración de 1 mg/ml reconstituyendo el polvo con tris HCl (5 mM, pH 7,6). La solución madre de AUP-10 se obtuvo del sobrenadante de cultivo de Lactococcus lactis NZ3900 (pFGF2) del Ejemplo 2a. La solución madre de AUP-12 se obtuvo del sobrenadante de cultivo de Lactococcus lactis NZ3900 (pIL4) del Ejemplo 2b.
[0570] Las soluciones madre se diluyeron con medio de ensayo n° 1 hasta la concentración final de 0,5 ng/ml, 1 ng/ml, 2,5 ng/ml y 5 ng/ml, respectivamente, para AUP-10 (FGF2) y a la concentración final de 0,1 ng/ml, 1 ng/ml, 5 ng/ml y 10 ng/ml, respectivamente, para AUP-12 (IL4).
[0571] Las concentraciones indicadas para las soluciones madre, así como las diluciones, se refieren a la cantidad total de proteína, que está presente en la solución respectiva y que corresponde principalmente a la cantidad de FGF2 e IL4 en los sobrenadantes de cultivo de Lactococcus lactis NZ3900 (pFGF2) del Ejemplo 2a y Lactococcus lactis NZ3900 (pIL4) del Ejemplo 2b, respectivamente.
[0572] Además, el bFGF humano recombinante (Fiblast,), que se adquirió de Kaken Pharmaceutical Co., Inc (Tokio, Japón), se diluyó con medio de ensayo n ° 1 hasta la concentración final de 0,5 ng/ml, 1 ng/ml, 2,5 ng/ml y 5 ng/ml, respectivamente.
[0573] La IL-4 recombinante humana, que fue adquirida de R & D systems (Minneapolis, MN, EE.UU.), se diluyó con Tris HCl (5 mM, pH 7,6) hasta la concentración final de 0,1 ng/ml, 1 ng/ml, 5 ng/ml y 10 ng/ml, respectivamente. Los fibroblastos dérmicos humanos normales (NHDF) se obtuvieron de Lonza Group a G (Basilea, CH).
[0574] Se sembraron fibroblastos en microplacas de 96 pocillos dedicadas al análisis de migración y se incubaron durante 24 horas.
- Condiciones de cultivo: 37 °C, 5% de CO2.
- Medio de cultivo: medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con L-glutamina 2 mM, penicilina 50 U/ml, estreptomicina 50 jg/ml y suero de ternera fetal (FCS) al 10% en volumen.
[0575] En estas placas, los pocillos se recubrieron con una solución de colágeno y se colocó un tapón de siembra de células en el centro del pozo para restringir la siembra de células a las regiones anulares externas de los pozos, creando así una herida artificial (zona de migración). A continuación, se marcaron las células usando calceína-AM obtenida de Thermo Fisher Scientific.
[0576] La calceína-AM es un colorante que penetra en las células que se puede usar para determinar la viabilidad celular en la mayoría de las células eucariotas. En células vivas, la calceína AM no fluorescente se convierte en una calceína verde fluorescente después de la hidrólisis del éster acetoximetílico por esterasas intracelulares.
[0577] Después de 30 minutos de incubación, se retiraron los tapones y se reemplazó el medio de cultivo por medio de ensayo n° 1 que contiene los compuestos de prueba (FGF2, Fiblast, IL4 o hIL4 recombinante) o solo medio de ensayo n° 1 (control) o la referencia (FCS al 10%). Las células fueron incubadas durante 72 horas. Todas las condiciones experimentales se realizaron en n = 5.
- Medio de ensayo n° 1: DMEM suplementado con L-glutamina 2 mM, penicilina 50 U/ml y estreptomicina 50 jg/ml.
[0578] Se observó la migración de las células en la zona de migración después de 0, 24, 48 y 72 horas de incubación, usando un microscopio Nikon Diaphot 300 (lente x 4) y las imágenes se capturaron utilizando una cámara NIKON DX-1200.
[0579] La superficie de la herida artificial se midió en cada punto de tiempo y se comparó con el área de pre­ migración medida a T0 con el fin de visualizar y cuantificar la recuperación de la herida. Los efectos de los compuestos de prueba sobre la migración celular se compararon con el control no tratado.
[0580] Las concentraciones respectivas aplicadas fueron 0,5 ng/ml, 1,0 ng/ml, 2,5 ng/ml y 5,0 ng/ml para hFGF2 y 0,1 ng/ml, 1 ng/ml, 5 ng/ml y 10 ng/ml para hIL4. Después de 72 h de exposición, se comparó la migración de los fibroplastos con los fibroblastos incubados con medio de crecimiento (control).
[0581] El % de recuperación del área de la herida artificial se muestra en las Figuras 14a y 14b.
[0582] La figura 14a muestra un aumento significativo de fibroblastos migratorios después de la incubación con bacterias probióticas recombinantes que expresan hFGF2. Bajo las condiciones experimentales del ensayo, el bFGF humano recombinante (Fiblast,) adquirido de Kaken Pharmaceutical Co., Inc (Tokio, Japón), no moduló la migración y proliferación de NHDF.
[0583] hFGF2 expresado en bacterias probióticas recombinantes AUP-10 obtenidas en el Ejemplo 2a posee actividad biológica.
[0584] La figura 14b muestra que el medio de cultivo AUP-12 que contiene 0,1-10 ng/ml de hIL4 induce una proliferación de NHDF similar a rhIL4.
[0585] hIL4 expresado en bacterias probióticas recombinantes AUP-12 obtenidas en el Ejemplo 2b posee actividad biológica.
Ejemplo 4b: Fosforilación de ERK1 y ERK2 en fibroblastos dérmicos humanos normales y en linfoblastos de ratón.
[0586] La actividad biológica de FGF2 liberado de Lactococcus lactis NZ3900 (pFGF2) fue evaluada midiendo la fosforilación de quinasa regulada por señal extracelular 1 (ERK1) y quinasa regulada por señal extracelular 2 (ERK2) en fibroblastos dérmicos humanos normales (NHDF).
[0587] La actividad biológica de CSF1 liberado de Lactococcus lactis NZ3900 (pCSF1) se evaluó midiendo la fosforilación de quinasa regulada por señal extracelular 1 (ERK1) y quinasa regulada por señal extracelular 2 (ERK2) en células M-NFS-60 de linfoblastos de ratón.
[0588] La solución madre de AUP-10 se preparó como se describe anteriormente en el Ejemplo 4a.
[0589] Además, Lactococcus lactis NZ3900 (pCSF1) del Ejemplo 2c (AUP-14) se indujo a una DO 600 = 0,5 con 5 ng/ml de nisina. Después de 6 h de fermentación, el sobrenadante de cultivo se aisló, se liofilizó y se almacenó a -20 °C. Para realizar más pruebas, se preparó una solución madre del sobrenadante liofilizado en una concentración de proteína total de 1 mg/ml reconstituyendo el polvo con tris HCl (5 mM, pH 7,6) obteniendo la solución madre de AUP-14.
[0590] Las soluciones madre se diluyeron adicionalmente con el medio libre de suero respectivo a una concentración final de 0,4 ng/ml, 4 ng/ml, 40 ng/ml y 80 ng/ml, respectivamente, para AUP-10 (FGF2) y a la concentración final de 0.2 ng/ml, 2 ng/ml, 20 ng/ml y 40 ng/ml, respectivamente, para Au P-14 (CSF1).
[0591] El bFGF humano recombinante de Kaken Pharmaceutical Co. se diluyó con medio libre de suero (medio de ensayo n ° 1) a una concentración final de 0,5 ng/ml, 5 ng/ml, 50 ng/ml, y 100 ng/ml, respectivamente.
[0592] El CSF-1 humano recombinante, que fue adquirido de Abcam PLC (Cambridge, GB), se diluyó con medio libre de suero (medio de ensayo n ° 2) a una concentración final de 0,2 ng/ml, 2 ng/ml, 20 ng/ml y 40 ng/ml, respectivamente.
[0593] Se sembraron fibroblastos dérmicos humanos normales (NHDF) en microplacas de 96 pocillos y se incubaron durante 24 horas en las condiciones descritas anteriormente en el Ejemplo 4a.
[0594] Células M-NFS-60 de ratón (ATCC® CRL-1838™) se obtuvieron de LGC Standards GmbH (Wesel, Alemania). Las células se sembraron en microplacas de 96 pocillos y se incubaron durante 24 horas en las siguientes condiciones:
- Condiciones de cultivo: 37 °C.
- Medio de cultivo: medio RPMI-1640 (Life Technologies Corporation, Carlsbad, CA, EE. UU.) suplementado con 0,05 mM de 2-mercaptoetanol, 62 ng/ml de factor estimulante de colonias de macrófagos humanos recombinantes (M-CSF), penicilina 50 U/ml, estreptomicina 50 gg/ml, y suero de ternera fetal a una concentración final de 10% en volumen.
- Medio de ensayo n ° 2: medio RPMI-1640, suplementado con 0,05 mM de 2-mercaptoetanol, penicilina 50 U/ml y estreptomicina 50 gg/ml.
[0595] NHDF en crecimiento exponencial se incubaron en medio sin suero (medio de ensayo n° 1) durante 24 horas, se transfirieron a tubos eppendorf (0,5 x 105 células/tubo) y se incubaron durante 15 minutos a 37 °C en medio sin suero (Medio de ensayo n° 1) que contenía 0,5 ng/ml, 5 ng/ml, 50 ng/ml y 100 ng/ml de rhFGF2 o diluciones de la solución madre de AUP-10 a las concentraciones finales, tal como se indicó anteriormente. Las células se lavaron a continuación con PBS y se resuspendieron en tampón de lisis.
[0596] Células M-NFS-60 de ratón en crecimiento exponencial se incubaron en medio libre de suero (medio de ensayo n° 2) durante 24 horas, se transfirieron a tubos eppendorf (2 x 106 células/tubo) y se incubaron con Ki-20227 a una concentración de 1 |jM por 1 hora. El inhibidor de c-fms Ki-20227, que se obtuvo de Abcam PLC, se incluyó como control para la especificidad del receptor CSF-1 (CSF-1R).
[0597] Después de 1 h de preincubación con Ki-20227, las células se incubaron durante 15 minutos a 37 °C en el medio de ensayo n° 2 que contenía 0,2, 2, 20 y 40 ng/ml de rhCSF1 o diluciones de la solución madre de AUP-14 a concentraciones finales, tal como se indicó anteriormente. Las células se lavaron a continuación con PBS y se resuspendieron en tampón de lisis.
[0598] La receta del tampón de lisis es la siguiente: 0,5% en volumen de Surfact-Amps NP-40 (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, EE. UU.), Hepes 20 mM (pH 8,0), NaCl 0,35 M, EGTA 0,1 mM, EDTA 0,5 mM, MgCl21 mM , 20% en volumen de glicerol, DTT 1 mM, leupeptina 1 jg/ml, pepstatina 0,5 jg/ml, apronitina 0,5 jg/ml y fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1 mM.
[0599] Cada una de las células se incubó durante 15 minutos en hielo, y las proteínas celulares se obtuvieron por centrifugación. La concentración de proteínas se determinó mediante el ensayo de Bradford (Bio-Rad), y se hirvieron 50 jg de proteínas en tampón Laemmli y se sometieron a electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio al 10%. Las proteínas separadas se transfirieron a membranas de nitrocelulosa (24 V) durante 30 minutos. Las transferencias se bloquearon en solución salina tamponada con Tris que contenía Tween 20 al 0,1% y leche en polvo sin grasa al 5%, y se determinó la expresión de ERK 1 2 fosforilada y ERK 1 2 total utilizando los siguientes anticuerpos específicos.
[0600] Para la detección de ERK1 y ERK2 se usó un anticuerpo policlonal anti-ERK1 y ERK2 de conejo humano (antisuero completo, obtenido de Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Munich, Alemania, producto no. M5670) a una dilución de 1:10000. El segundo anticuerpo era IgG anti-conejo ligada a peroxidasa de rábano picante (HRP) a una dilución de 1:10.000 obtenida de Bioké bV (Leiden, NL).
[0601] Para la detección de ERK1 y ERK2 fosforiladas, se usó un anticuerpo monoclonal anti-p-ERK (E-4) de ratón purificado (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Heidelberg, Alemania, producto no. Sc-7383) a una dilución de 1:1000. p-ERK (E-4) es un epítopo de anticuerpo monoclonal de ratón que corresponde a una secuencia que contiene ERK fosforilado Tyr 204 de origen humano. El anticuerpo monoclonal detecta ERK 1 fosforilada en Tyr 204 y correspondientemente ERK 2 fosforilada de ratón, rata y origen humano.
[0602] El segundo anticuerpo era IgG anti-ratón ligada con peroxidasa de rábano picante (HRP) a una dilución de 1:10.000 obtenida de Bioké BV (Leiden, NL).
[0603] La inducción de la fosforilación de ERK1 2 se cuantificó utilizando el software Image J (National Institutes of Health, Bethesda, MD, EE. UU.).
[0604] Como se puede ver en la Figura 14c, el medio de cultivo AUP-10 que contiene 0,4-80 ng/ml de FGF2 induce la fosforilación de ERK 1 2 en NHDF de forma similar a rhFGF2.
[0605] Como se puede ver en la Figura 14d, el medio de cultivo AUP-14 que contiene 0,2-40 ng/ml de CSF1 induce la fosforilación de ERK 1 2 en células M-NFS-60 de ratón de forma similar a rhCSF1.
Ejemplo 4c: Inhibición de la activación de M1 inducida por lipopolisacárido (LPS) de células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC)
[0606] Se obtuvieron células THP-1 humanas (ATCC® TIB-202™) de LGC Standards GmbH. Las células se sembraron en microplacas de 96 pocillos y se incubaron durante 24 horas en las siguientes condiciones:
- Condiciones de cultivo: 37 °C, 5% de CO 2.
- Medio de cultivo: medio RPMI-1640 (Life Technologies Corporation, Carlsbad, CA, EE. UU.) suplementado con 2-mercaptoetanol 0,05 mM, penicilina 50 U/ml, estreptomicina 50 jg/ml y suero de ternera fetal a una concentración final del 10% por volumen.
- Medio de ensayo n ° 2: medio RPMI-1640, suplementado con 0,05 mM de 2-mercaptoetanol, penicilina 50 U/ml y estreptomicina 50 jg/ml.
[0607] THP1 es una línea celular monocítica humana derivada de un paciente con leucemia monocítica aguda. Las células THP-1 se diferenciaron en células de macrófagos y se polarizaron según los protocolos establecidos. Se usó para la polarización lipopolisacárido derivado de Escheria coli (LPS) (serotipo 026: b6 - obtenido de Sigma-Aldrich) e interferón gamma (IFN-y) obtenido de U-Cytech (Utrecht, Países Bajos).
[0608] Brevemente, 1 millón de células THP1 se sembraron en placas de 6 pocillos en 3 ml de medios DMEM más 100 ng/ml de forbol-12-miristato-13-acetato (PMA), que se obtuvo de Sigma-Aldrich, durante 24 horas para inducir la diferenciación a macrófagos no polarizados (macrófagos derivados de THP-1 no polarizados).
[0609] Después de la diferenciación, los macrófagos derivados de THP-1 no polarizados se trataron en medio DMEM durante 48 horas con LPS (1 gg/ml) e IFN-y (100 U/ml) para inducir el fenotipo M1 que da lugar a la generación de macrófagos derivados de THP-1 polarizados M1.
[0610] Para la inhibición de la polarización M1, los macrófagos THP-1 no polarizados se incubaron primero con diluciones de la solución madre de AUP-12 obtenida en el Ejemplo 4a o con diluciones de una solución madre de IL4 humana recombinante (rhlL4) durante 18 horas y a continuación se estimularon, tal como se describió anteriormente con LPS e IFN-y durante 48 horas adicionales.
[0611] La solución madre de AUP-12, que tenía una concentración de proteína total de 1 mg/ml, se diluyó a concentraciones de 0,1%, 1%, 10% y 20% en volumen con medio DMEM. La solución madre de rhlL4 se diluyó a concentraciones de 0,1 ng/ml, 1 ng/ml, 10 ng/ml y 20 ng/ml en volumen con medio DMEM.
[0612] Se recogieron las células y se extrajo el ARN total usando el kit de aislamiento de ARN de alta pureza (Roche Diagnostics). El ARN total (1 gg) se retrotranscribió utilizando el kit de síntesis de ADNc iScriptTM (Bio-Rad; Hercules, CA, EE. UU.), y el ADNc generado se analizó por PCR en tiempo real, utilizando la supermezcla verde iQTM SYBR (Bio-Rad; Hercules , CA, EE. UU.). La PCR en tiempo real se realizó utilizando un sistema de detección de PCR en tiempo real CFX96 (Bio-Rad; Hercules, CA, EE. Uu .). El gen de HPRT se usó para estandarizar la expresión de ARNm en cada muestra y la expresión génica se cuantificó utilizando el procedimiento 2-AACt. Un marcador de polarización M1 fue la producción de ARNm del factor de necrosis tumoral alfa (TNF-a).
[0613] La Figura 14e muestra la inhibición de la producción de ARNm de TNF alfa inducida por LPS en células THP-1 humanas.
[0614] Tal como se puede observar en la Figura 14e, el medio de cultivo AUP-12 inhibe la producción de ARNm de TNF alfa inducida por LPS en células THP-1 humanas similares a rhlL4. La dosis efectiva de rhlL4 está entre 1-20 ng/ml.
[0615] Un * en la Figura 14e significa un valor p P <0,05 en comparación con LPS solo. Las barras de error representan la desviación estándar.
Ejemplo 4d: Inducción de polarización M2 en macrófagos derivados de Thp1
[0616] Para inducir la polarización M2, los macrófagos derivados de THP-1 no polarizados obtenidos en el Ejemplo 4c se incubaron con diluciones de la solución madre de AUP-12 obtenida en el Ejemplo 4a o con diluciones de una solución madre de lL4 humana recombinante (rhlL4) que tiene una concentración final de 20 ng/ml durante 18 horas.
[0617] La solución madre de AUP-12, que tenía una concentración de proteína total de 1 mg/ml, se diluyó a concentraciones de 0,1% y 1% en volumen con medio DMEM.
[0618] Las células se analizaron, tal como se describe anteriormente. Después de la polarización, se recogieron las células y se extrajo el ARN total. El ARN total se retrotranscribió y el ADNc generado se analizó por PCR en tiempo real. La PCR en tiempo real se realizó utilizando un sistema de detección de PCR en tiempo real CFX96. El gen de HPRT se usó para estandarizar la expresión de ARNm en cada muestra y la expresión génica se cuantificó utilizando el procedimiento 2-AACt. Los marcadores para la polarización M2 fueron el receptor 1 de manosa de macrófagos (Mrc1) y el factor 4 similar a Kruppel (KLF4).
[0619] La Figura 14f muestra la inducción de la expresión de ARN de genes M2 para el receptor 1 de manosa de macrófagos (Mrc1) y el factor 4 similar a Kruppel (k LF4) en macrófagos derivados de THP1.
[0620] Como se puede ver en la Figura 14f, el medio de cultivo AUP-12 induce la expresión de ARN de genes M2 para el receptor 1 de manosa de macrófagos (Mrc1) y el factor similar a Kruppel 4 (k LF4) en macrófagos derivados de THP1 de forma similar a rhlL4. La dosis efectiva de rhlL4 está entre 2-20 ng/ml.
[0621] Un * en la Figura 14f significa un valor p P <0,05 en comparación con M0 (M0 = THP1 inducido por PMA) y Mn = THP1 no inducido. Un ** en la Figura 14f significa un valor p P <0,05 en comparación con Mn = THP1 no inducido. Las barras de error representan la desviación estándar.
Ejemplo 4e: Actividad transcripcional STAT-6 de AUP-12 en varias líneas celulares.
[0622] Para determinar la actividad biológica de lL-4 recombinante y AUP-12 en la actividad transcripcional STAT6, las células MO3.13 (humanas) y HEK293T (humanas) se cotransfectaron transitoriamente con los plásmidos STAT-6 y STAT6-Luc (Addgene Inc, Cambridge, MA, EE. UU.).
[0623] Las células 293T de riñón embrionario humano HEK293T (ATCC® CRL-3216™) se obtuvieron de LGC Standards GmbH. Las células se sembraron en microplacas de 96 pocillos y se incubaron durante 24 horas en las siguientes condiciones:
- Condiciones de cultivo: 37 °C, 5% de CO2.
- Medio de cultivo: medio DMEM, penicilina 50 U/ml, estreptomicina 50 gg/ml y suero fetal de ternero hasta una concentración final de 10% en volumen.
[0624] La línea celular híbrida glial humana (oligodendrocítica) MO3.13 se obtuvo de tebu-bio GmbH (Offenbach, Alemania). Las células se sembraron en microplacas de 96 pocillos y se incubaron durante 24 horas en las siguientes condiciones:
- Condiciones de cultivo: 37 °C.
- Medio de cultivo: medio DMEM, penicilina 50 U/ml, estreptomicina 50 gg/ml y suero fetal de ternero hasta una concentración final de 10% en volumen.
[0625] Las transfecciones con los plásmidos STAT-6 y STAT6-Luc se realizaron usando el reactivo RotiFect ™ (Carl Roth GmbH Co. KG, Karlsruhe, Alemania) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Las células se trataron con 0,1 ng/ml, 1 ng/ml, 10 ng/ml, 20 ng/ml y 100 ng/ml de IL4 humana recombinante (rhIL-4) y diluciones de la solución madre de AUP-12 durante 6 horas. La solución madre de AUP-12 se diluyó a concentraciones de 0,1%, 1%, 10% y 20% en volumen con medio DMEM.
[0626] A continuación, las células se lisaron en 25 mM de Tris-fosfato pH 7,8, 8 mM de MgCl2, 1 mM de DTT, 1% Triton X-100 y 7% glicerol.
[0627] La actividad de luciferasa se midió usando un Autolumat LB 953 (EG&G Berthold, EE. UU.) siguiendo las instrucciones del kit de ensayo de luciferasa (Promega, Madison, WI, EE. UU.). Los resultados de la transactivación específica se expresan como el número de veces de inducción sobre las células no tratadas.
[0628] La figura 14g muestra la actividad transcripcional STAT-6 de AUP-12 y rhlL-4 en la línea celular híbrida glial humana (MO3.13).
[0629] La figura 14h muestra la actividad transcripcional STAT-6 de AUP-12 y rhlL-4 en células de riñón embrionario humano 293.
[0630] Como se puede ver en las Figuras 14g y 14h, el medio de cultivo AUP-12 induce la actividad transcripcional de STAT-6 en una Línea Celular Híbrida Glial Humana (MO3.13) así como 4 en Células 293 de Riñón Embrionario Humano de forma similar a rhIL4. La dosis efectiva de rhIL4 está entre 0,1 y 20 ng/ml.
Ejemplo 5: Experimentos de cierre de heridas
[0631] La consecuencia de la aplicación de bacterias probióticas que expresan FGF-2 humano, CSF-1 e IL-4 solos o en combinación a heridas por escisión de grosor completo en ratones diabéticos db/db se examinó en un estudio de eficacia combinada farmacocinética (PK)/farmacodinámica (PD). En el mismo, las bacterias que expresan FGF2 (AUP-10), IL4 (AUP-12) y CSF1 (AUP-14) se evaluaron solas o combinadas como una combinación de tres partes (es decir, AUP-10 AUP-12 AUP14) y se compararon con respecto a la eficacia para un control positivo (es decir, una combinación de proteína recombinante TGF-alfa PDGF-BB). Además, las bacterias que expresan FGF2, IL4 y CSF1 en una sola célula bacteriana (AUP-16) se evaluaron y compararon con un tratamiento de vehículo (es decir, solución salina vendaje de película o medio IM1 vendaje de película) y el control positivo (TGF-alfa PDGF -BB).
[0632] Los pacientes con diabetes son propensos a una cicatrización de heridas alterada, siendo particularmente frecuente la ulceración del pie. Este retraso en la cicatrización de heridas también se extiende a los animales diabéticos, incluido el ratón espontáneamente diabético (db/db), que se obtuvo comercialmente del Laboratorio Jackson (Bar Harbor, ME, EE. UU.).
[0633] 99 ratones diabéticos (nombre de la cepa BKS.Cg-Dock 7m /+ Lepr db/J - Stock Code 00642), todos machos y de edades de aproximadamente 10 semanas, se utilizaron en un primer estudio y un segundo estudio posterior.
[0634] Las bacterias probióticas recombinantes que expresan FGF-2 humano, CSF-1 o IL-4 solos o como una combinación de tres partes, así como las bacterias probióticas recombinantes que expresan FGF2, IL4 y CSF1 en una sola célula bacteriana se aplicaron a las heridas en el día de heridas (día 0) y se examinó su supervivencia 6 horas después de la aplicación. Para facilitar la determinación de la producción de FGF-2, CSF-1 y/o IL-4 por bacterias aplicadas a las heridas, se tomaron muestras de líquido de la herida de las heridas después de 6 horas y 1, 2 y 7 días. La sangre sistémica y los órganos clave se recolectaron después de 6 y 24 horas y 7 días para facilitar el análisis PK/PD. Las heridas en la recepción del medio IM1 solo se usaron como controles para el componente PK/PD de este estudio.
[0635] Para examinar el impacto de estas bacterias probióticas recombinantes en el proceso de curación de heridas, bacterias que expresan FGF-2 humano, CSF-1 e IL-4, así como bacterias que expresan FGF-2 humano, CSF-1 o IL4 solos, se aplicaron a las heridas el día de la herida (día 0) y diariamente a partir de entonces hasta el día 6. Después de la herida, la curación de las heridas que recibieron estas bacterias probióticas recombinantes se comparó con la de heridas similares expuestas a medio IM1 fresco solamente.
[0636] Además, el factor de crecimiento derivado de plaquetas recombinante humano BB (rh-PDGF-BB) en combinación con el factor de crecimiento transformante alfa recombinante humano (rh-TGF-a) se usó como el "control positivo" en este estudio. El control positivo se preparó en un vehículo de hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC) al 0,25%, que se preparó disolviendo 0,5 g de hidroxipropilmetilcelulosa, obtenido de Sigma Aldrich (St. Louis, MO, EE. UU.) En 100 ml de agua destilada y añadiendo hidróxido de sodio para elevar el pH a 7,0.
[0637] La combinación de PDGF-BB y TGF se basa en un estudio realizado por Brown RL et al. (Brown RL, Breeden MP, Greenhalgh DG.: "PDGF y TGF-alfa actúan sinérgicamente para mejorar la cicatrización de heridas en ratones genéticamente diabéticos. J. Surg. Res. 56 (6), 1994, páginas 562 a 570). Brown et al. al. describen que se observaron mejoras en el cierre de la herida con una combinación de PDGF-BB y TGF-alfa en comparación con el tratamiento con los factores de crecimiento individuales.
[0638] La curación de heridas se estudió tanto a nivel macroscópico como histológico. La curación de heridas se estudió a nivel macroscópico en términos de (i) inicio de respuestas de reparación neodérmica y (ii) cierre de heridas.
[0639] El cierre de la herida, y sus componentes, la contracción de la herida y la reepitelización de la herida, se determinaron a partir de fotografías digitales tomadas en los días posteriores a la herida 0, 4 y 7 después de la herida. Se realizaron evaluaciones histológicas de la formación de tejido de granulación (profundidad) y el ancho de la herida (contracción cráneo-caudal) en secciones teñidas de rutina (H&E). Estas evaluaciones histológicas se realizaron en tejidos recogidos el día 7 posterior a la herida.
[0640] El desarrollo de efectos adversos se controló y se documentó completamente.
Creación de heridas experimentales de grosor completo y aplicación de tratamientos.
[0641] Después de la herida experimental, los animales fueron alojados en jaulas individuales (tamaño de la jaula 500 cm2 con lecho de serrín, cambiado tres veces por semana), en un ambiente mantenido a una temperatura ambiente de 23 °C con ciclos de luz/oscuridad de 12 horas. Se les proporcionó alimentos (CRM-P, código de producto 801722, dietas SDS, Reino Unido) y agua a voluntad. Para aclimatar a los animales a su entorno, antes de la experimentación, se alojaron durante un período de 5 a 7 días sin molestias, aparte de refrescar su ropa de cama y reponer sus alimentos y agua. Después de todos los eventos anestésicos, los animales se colocaron en un ambiente cálido y se monitorearon hasta que se recuperaron completamente del procedimiento. Todos los animales recibieron analgesia apropiada (buprenorfina) después de la cirugía y recibieron analgésicos adicionales, según se requirió.
[0642] Todos los procedimientos con animales se llevaron a cabo en un establecimiento autorizado del Ministerio del Interior del Reino Unido bajo Licencias del Ministerio del Interior del Reino Unido (PCD: 50/2505; PPL: 40/3614; PIL: IBCEFDF55; PIL: 134817249). La salud de los animales fue controlada diariamente durante todo el estudio.
[0643] Los animales fueron asignados al azar a uno de los 18 regímenes de tratamiento de acuerdo con las Tablas 2a y 2b.
[0644] El día 0, los animales fueron anestesiados (isofluorano y aire) y el dorso fue afeitado y limpiado con una gasa empapada en solución salina. A continuación se frotó la piel con EtOH al 70% y se secó con una gasa estéril. Se creó una única herida estandarizada de grosor completo (10,0 mm x 10,0 mm) en la piel del flanco dorsal izquierdo de cada animal experimental.
[0645] Las heridas en animales en todos los grupos fueron a continuación cubiertas con una banda circunferencial del apósito o vendaje de película transparente Bioclusive (Systagenix Wound Management, Gatwick, Reino Unido); después de lo cual recibieron uno de los tratamientos que se describen a continuación (ver Tabla 2a y 2b) que se aplicó mediante inyección a través de la película Bioclusiva usando una aguja de calibre 27.
[0646] Para cada tratamiento, se proporcionaron las respectivas bacterias probióticas recombinantes no inducidas en 10 ml de medio IM1 que tiene la siguiente densidad de células (unidades formadoras de colonias (UFC) por ml de medio):
Designación Muestra UFC/ml AUP-10 NZ3900 no inducido (pFGF2) obtenido en el Ejemplo 2a 3 x 108
AUP-14 NZ3900 no inducido (pCSF1) obtenido en el Ejemplo 2c 3 x 108
AUP-12 NZ3900 no inducido (pIL4) obtenido en el Ejemplo 2b 3 x 108 Combinación NZ3900 no inducido (pFGF2) obtenido en el Ejemplo 2a 1 x 108
NZ3900 no inducido (pCSFI) obtenido en el Ejemplo 2c 1 x 108 NZ3900 no inducido (pIL4) obtenido en el Ejemplo 2b 1 x 108
AUP-16 células NZ3900 (pC-FI) no inducidas obtenidas en el ejemplo 2d 3 x 108
[0647] El esquema de tratamiento "Combinación" representa una combinación de tres partes que resulta de una mezcla de NZ3900 no inducidas (pFGF2) obtenidas en el Ejemplo 2a, NZ3900 no inducidas (pCSF1) obtenidas en el Ejemplo 2c, y NZ3900 no inducidas (pIL4) obtenidas en el ejemplo 2b. La mezcla tiene una densidad celular total de 3 x 108 UFC/ml.
[0648] Antes de la aplicación del tratamiento, las respectivas bacterias probióticas recombinantes no inducidas proporcionadas en 10 ml de medio IM1 se incubaron a 30 °C sin agitación y la densidad óptica se determinó espectrofotométricamente a una longitud de onda de 600 nm (DO600).
[0649] A una DO600 de 0,5, se añadió nisina a una concentración final de 5 ng/ml. Después de una incubación adicional durante 30 min a 30 °C, el cultivo inducido se transfirió a 10 °C. Posteriormente, el cultivo inducido respectivo se aplicó mediante inyección a través de la película Bioclusiva usando una aguja de calibre 27.
[0650] Los tratamientos se aplicaron de acuerdo con el esquema descrito en las Tablas 2a y 2b. Los animales de los grupos de tratamiento 1 a 9 recibieron una sola aplicación de 50 pl en el día 0. Los animales de los grupos de tratamiento 10 a 18 recibieron siete aplicaciones consecutivas divididas como una sola aplicación de 50 pl por día en los días 0, 1, 2, 3, 4, 5 y 6.
[0651] Seis horas después de la primera aplicación de tratamiento, el líquido de la herida se recogió de todos los animales en los grupos 1 a 4. El líquido de la herida recogido del grupo de combinación (grp 1) se procesó de tal manera que permitiera el recuento de UFC de las bacterias probióticas recombinantes. El líquido tomado de las heridas en los grupos restantes se mantuvo en hielo húmedo antes de transferir a -80 °C para un almacenamiento a largo plazo. Después de la recolección de líquido de la herida, todos los animales en estos grupos fueron sacrificados (por un procedimiento aprobado por el Ministerio del Interior del Reino Unido). Antes del sacrificio, se extrajo sangre sistémica por punción cardíaca en tubos tratados con EDTA. La mitad de la muestra de sangre se centrifugó para obtener plasma; la mitad restante se mantuvo a 4 °C durante la noche antes del envío a Langford Veterinary Services Ldt. (Bristol, Reino Unido), donde se realizaron recuentos sanguíneos completos y diferenciales. Se tomaron muestras post mortem de hígado, riñón, bazo, corazón, tejido pulmonar y ganglios linfáticos drenantes de todos los animales (el plasma y los tejidos se colocaron en crioviales que se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido, después de lo cual se almacenaron a -80 °C).
[0652] 24 horas después de la primera aplicación de tratamiento, el líquido de la herida se recogió de todos los animales en los grupos 5 a 9 y se almacenaron como se describió anteriormente. Se recogió y almacenó sangre y los animales se sacrificaron a continuación. Se recogieron y almacenaron muestras de líquido de la herida, sangre completa, plasma y tejido, tal como se describió anteriormente.
[0653] Un día después de la primera aplicación y a intervalos diarios hasta el día 6, los tratamientos se volvieron a aplicar a todas las heridas en los grupos 10 a 15.
[0654] 2 días después de la primera aplicación de tratamiento (1 día después de la segunda aplicación), el líquido de la herida se recogió de todos los animales en los grupos 10 a 15 y se almacenó como se describió anteriormente.
[0655] 7 días después de la primera aplicación de tratamiento (un día después de la aplicación final del tratamiento en el día 6), se recogió líquido de la herida de todos los animales en los grupos 10 a 15 y se almacenó como se describió anteriormente. Se recogió y almacenó sangre y los animales se sacrificaron a continuación. Después del sacrificio, la herida y el tejido marginal se recogieron y procesaron para investigación histológica (ver sección 3.7). Se recogieron y almacenaron muestras de líquido de la herida, sangre completa, plasma y tejido como se describió anteriormente.
[0656] En los días 4 y 7 posteriores a la herida, los animales en los grupos 10 a 15 se volvieron a anestesiar y se evaluaron sus heridas y se fotografiaron digitalmente junto con una placa de calibración/identidad. El día 4, se realizó con el vendaje de película bioclusiva en su lugar. El día 7, se retiraron los vendajes y se extrajo cualquier residuo libre y a continuación se limpiaron las heridas con una gasa estéril empapada con solución salina y se secaron con una gasa estéril. Las heridas se evaluaron y se fotografiaron digitalmente junto con una placa de calibración/identidad.
Tabla 2a: Grupos experimentales del estudio
Figure imgf000053_0001
Figure imgf000054_0001
Tabla 2b: Grupos experimentales de estudio 2
Figure imgf000054_0002
_ _________
Análisis de imagen del cierre de la herida.
[0657] Se usó el software de análisis de imagen Image Pro (versión 4.1.0.0, Media Cybernetics, EE. UU.) para medir el cierre de heridas a partir de imágenes de heridas en los grupos 10 a 15 y 16 a 18 a lo largo del tiempo. Para cada herida en cada punto de tiempo (días 4 y 7 para los grupos 10 a 15 y días 4, 7, 8 y 12 para los grupos 16 a 18), se midió el área abierta de la herida y se expresó en términos de % de área de la herida con respecto al día 0.
Supervivencia de bacterias probióticas recombinantes después de 6 horas después de la aplicación.
[0658] Seis horas después de introducir la combinación de bacterias que expresan FGF2, IL4 y CSF1 en la herida, se extrajo el líquido de la herida y se realizó un recuento de unidades formadoras de colonias bacterianas (UFC). Los resultados del recuento de UFC de 5 heridas se proporcionan en la Tabla 3.
[0659] El resultado confirma que las bacterias son viables en la herida y aún eran capaces de proliferar, después de estar en la herida durante 6 horas, destacando el hecho de que las bacterias probióticas recombinantes mencionadas anteriormente pueden usarse para administrar combinaciones terapéuticas de proteínas a las heridas.
Tabla 3: Resultados del recuento de UFC
Figure imgf000055_0001
Respuesta de curación de heridas en los diferentes grupos de tratamiento.
[0660] La respuesta de curación de heridas en los diferentes grupos de tratamiento después de la herida se evaluó mediante inspección visual 4 y 7 días después de comenzar el tratamiento.
[0661] La inspección visual a simple vista, así como el análisis cuantitativo por el software de análisis de imagen Image Pro de los grupos 10 a 15, revela que la curación de la herida tiene lugar incluso a los cuatro días después de comenzar el tratamiento. Además, en el día siete, los ratones tratados con la combinación de tres partes de bacterias probióticas recombinantes que expresan FGF2, IL4 y CSF1 (grupos de tratamiento 1, 5 y 10) demuestran una respuesta curativa superior (que demuestra la deposición de tejido de granulación rosa/rojo, así como la epitelización de la herida) en comparación con los grupos de tratamiento individuales de bacterias probióticas que expresan FGF2 (AUP-10), bacterias probióticas que expresan IL4 (AUP-12) y bacterias probióticas que expresan CSF1 (AUP-14), así como en comparación con el control positivo (es decir, TGF-alfa y PDGF-BB). Los resultados se representan en la Figura 15a.
[0662] La figura 15a ilustra la respuesta de curación de heridas en diferentes grupos de tratamiento.
[0663] Los grupos de tratamientos individuales muestran una respuesta de curación comparable, que es superior al grupo tratado con medio IM1 (grupo tratado con vehículo). Los resultados mostraron el efecto sinérgico de combinar FGF2, IL4 y CSF1 en la cicatrización de heridas.
[0664] Los ratones tratados con FGF2 (AUP-10) mostraron además formación de tejido de granulación, así como vascularización, pero no epitelización. También se puede ver que hay fugas de los vasos sanguíneos cuando se usa solo la bacteria probiótica que expresa FGF2. Las bacterias probióticas que expresan IL4 (AUP-12) y las bacterias probióticas que expresan CSF1 (AUP-14) mostraron principalmente epitelización de la herida, pero no granulación, mientras que las heridas tratadas con la combinación de tres partes de bacterias probióticas recombinantes (AUP-10 AUP-12 AUP-14) demuestran la formación de tejido de granulación, así como la epitelización de la herida. No se pueden observar fugas en los vasos sanguíneos.
[0665] Es importante saber que en las úlceras del pie diabético (en humanos) la epitelización depende de la formación de tejido de granulación. Sin la formación de tejido de granulación, la epitelización no puede tener lugar y la herida no se cierra.
[0666] En los grupos 16 a 18, AUP-16 (bacterias recombinantes que expresan FGF2, IL4 y CSF-1 en una única célula bacteriana) se comparó con el tratamiento con vehículo (solución salina apósito) y el control positivo (es decir, TGF-alfa PDGF-BB). A lo largo de los días 4, 8 y 12, AUP-16 demostró superioridad en la cicatrización de heridas en comparación con el grupo de control positivo (TGF-alfa PDGF-BB). Los resultados se representan en la

Claims (20)

REIVINDICACIONES
1. Bacterias probióticas recombinantes, que comprenden
(a) una secuencia o secuencias de ácido nucleico que codifican un primer factor heterólogo, (a) una secuencia o secuencias de ácido nucleico que codifican un segundo factor heterólogo y preferiblemente (a) una secuencia o secuencias de ácido nucleico que codifican un tercer factor heterólogo, con la condición de que dicho primer factor, dicho segundo factor y dicho tercer factor son funcionalmente diferentes entre sí,
en las que dicho primer factor es un factor de crecimiento, en las que dicho segundo factor se selecciona del grupo que consiste en factores de polarización M2, y en las que preferiblemente dicho tercer factor se selecciona del grupo que consiste en factores de polarización de M2 y factores de crecimiento,
en las que dicho factor de polarización M2 se selecciona del grupo que consiste en interleucina 4 (IL-4), interleucina 10 (IL-10), interleucina 13 (IL-13), factor estimulante de colonias-1 (CSF1), interleucina 34 (IL34) y mezclas de los mismos, y
en las que dicho factor de crecimiento se selecciona del grupo que consiste en factores de crecimiento de fibroblastos (FGF), factores de crecimiento endotelial vascular (VEGF), factores de crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento similar a EGF de unión a heparina (HB-EGF), factor de crecimiento transformante-a (TGF-a), factores de crecimiento similares a la insulina (IGF), factores de crecimiento derivados de plaquetas (PDGF), factor de crecimiento transformante beta (TGF-p) y mezclas de los mismos.
2. Bacterias probióticas recombinantes, según la reivindicación 1, en las que dicha secuencia o secuencias de ácido nucleico están situadas en al menos uno de un cromosoma y un plásmido de dichas bacterias probióticas recombinantes.
3. Bacterias probióticas recombinantes, según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en las que la expresión de dicha secuencia o secuencias de ácido nucleico está controlada por un promotor constitutivo o un promotor inducible.
4. Bacterias probióticas recombinantes, según la reivindicación 3, en las que la expresión de dicha secuencia o secuencias de ácido nucleico está controlada por un promotor inducible, siendo dicha secuencia o secuencias de ácido nucleico expresables en presencia de al menos un inductor.
5. Bacterias probióticas recombinantes, según cualquiera de las reivindicaciones 3 ó 4, en las que dicho promotor inducible, que es inducible por un inductor, es un promotor para un gen microbiano que codifica un péptido lantibiótico o un análogo funcional del mismo, en las que preferiblemente dicho promotor inducible es PnisA, PnisZ, PnisQ, PnisF, PnisU o combinaciones de los mismos de L a c to co ccu s lactis .
6. Bacterias probióticas recombinantes, según cualquiera de las reivindicaciones 4 o 5, en las que el inductor es al menos un péptido lantibiótico o un análogo funcional del mismo, preferiblemente seleccionado del grupo que consiste en nisina A, nisina Z, nisina Q, nisina F, nisina U, análogos funcionales de las mismas, y mezclas de las mismas.
7. Bacterias probióticas recombinantes, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en las que dichas bacterias probióticas comprenden, además, al menos un gen inactivado que codifica una proteína esencial necesaria para la viabilidad de dichas bacterias probióticas.
8. Bacterias probióticas recombinantes, según la reivindicación 7, en las que dicho al menos un gen inactivado necesario para la viabilidad de dichas bacterias probióticas se selecciona del grupo que consiste en alanina racemasa (alaR), timidilato sintasa (thyA), asparagina sintasa (asnH), CTP sintasa (pyrG), triptófano sintasa (trpBA), y combinaciones de los mismos.
9. Bacterias probióticas recombinantes, según cualquiera de las reivindicaciones 7 u 8, en las que dicho gen se inactiva por deleción de dicho gen, mutación de dicho gen, modificación epigenética de dicho gen, silenciamiento génico mediado por ARN de interferencia (ARNi) de dicho gen, inhibición de la traducción de dicho gen, o combinaciones de los mismos.
10. Bacterias probióticas recombinantes, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en las que al menos uno de dicho primer factor, dicho segundo factor y dicho tercer factor es liberable de dichas bacterias probióticas recombinantes.
11. Bacterias probióticas recombinantes, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en las que dichos factores de crecimiento de fibroblastos (FGF) se seleccionan del grupo que consiste en factor de crecimiento de fibroblastos 1, factor de crecimiento de fibroblastos 2, factor de crecimiento de fibroblastos 7 (factor de crecimiento de queratinocitos), factor de crecimiento de fibroblastos 10 (factor de crecimiento de queratinocitos 2), y mezclas de los mismos.
12. Bacterias probióticas recombinantes, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en las que dichos primer, segundo y tercer factor heterólogo es una combinación de:
- factor de crecimiento de fibroblastos 2 factor de estimulación de colonias 1 e interleucina 4,
- factor de crecimiento de fibroblastos 2 interleucina 34 e interleucina 4,
- factor de crecimiento de fibroblastos 2 factor de estimulación de colonias 1 e interleucina 13,
- factor de crecimiento de fibroblastos 2 interleucina 34 e interleucina 13,
- factor de crecimiento de fibroblastos 2 factor de estimulación de colonias 1 e interleucina 10,
- factor de crecimiento de fibroblastos 2 interleucina 34 e interleucina 10,
- factor de crecimiento de fibroblastos 7 factor de estimulación de colonias 1 e interleucina 4,
- factor de crecimiento de fibroblastos 7 interleucina 34 e interleucina 4,
- factor de crecimiento de fibroblastos 7 factor de estimulación de colonias 1 e interleucina 13,
- factor de crecimiento de fibroblastos 7 interleucina 34 e interleucina 13,
- factor de crecimiento de fibroblastos 7 factor de estimulación de colonias 1 e interleucina 10,
- factor de crecimiento de fibroblastos 7 interleucina 34 e interleucina 10,
- factor de crecimiento transformante beta factor estimulante de colonias 1 e interleucina 4,
- factor de crecimiento transformante beta interleucina 34 e interleucina 4,
- factor de crecimiento transformante beta, factor estimulante de colonias 1 e interleucina 13,
- factor de crecimiento transformante beta, interleucina 34 e interleucina 13
- factor de crecimiento transformante beta, factor estimulante de colonias 1 e interleucina 10,
- factor de crecimiento transformante beta, interleucina 34 e interleucina 10,
- factor de crecimiento transformante alfa, factor estimulante de colonias 1 e interleucina 4,
- factor de crecimiento transformante alfa, interleucina 34 e interleucina 4,
- factor de crecimiento transformante alfa, factor estimulante de colonias 1 e interleucina 13,
- factor de crecimiento transformante alfa, interleucina 34 e interleucina 13,
- factor de crecimiento transformante alfa, factor estimulante de colonias 1 e interleucina 10,
- factor de crecimiento transformante alfa, interleucina 34 e interleucina 10
- factor de crecimiento derivado de plaquetas BB, factor estimulante de colonias 1 e interleucina 4,
- factor de crecimiento derivado de plaquetas BB, interleucina 34 e interleucina 4,
- factor de crecimiento derivado de plaquetas BB, factor estimulante de colonias 1 e interleucina 13,
- factor de crecimiento derivado de plaquetas BB, interleucina 34 e interleucina 13,
- factor de crecimiento derivado de plaquetas BB, factor estimulante de colonias 1 e interleucina 10, o
- factor de crecimiento derivado de plaquetas BB, interleucina 34 e interleucina 10.
13. Bacterias probióticas recombinantes, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en las que dichos primer, segundo, tercer factor heterólogo es una combinación de factor de crecimiento de fibroblastos 2, factor estimulante de colonias 1 e interleucina 4, análogos funcionales de los mismos y biosimilares de los mismos.
14. Bacterias probióticas recombinantes, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en las que dichas bacterias probióticas recombinantes son bacterias de ácido láctico, preferiblemente una especie de L a c to b a c illu s o L a c tococcu s .
15. Bacterias probióticas recombinantes, según la reivindicación 14, en las que dicha especie de L a c to co ccu s es L a c to co ccu s lac tis , preferiblemente la subespecie c re m o ris de L a c to co ccu s lactis.
16. Bacterias probióticas recombinantes, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en las que dichas bacterias probióticas recombinantes están en una solución, congeladas o secas, preferiblemente están liofilizadas o secadas por pulverización.
17. Bacterias probióticas recombinantes, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en las que dichas bacterias probióticas recombinantes se administran por vía tópica y/o mediante inyección subcutánea.
18. Bacterias probióticas recombinantes para usar en el tratamiento de una herida crónica, en las que dichas bacterias probióticas recombinantes son bacterias probióticas recombinantes, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en las que dichos primer, segundo, tercer factor heterólogo es una combinación de factor de crecimiento de fibroblastos 2, factor estimulante de colonias 1 e interleucina 4.
19. Bacterias probióticas recombinantes para usar, según la reivindicación 18, en las que dicha herida crónica es al menos una de una úlcera venosa crónica, una úlcera arterial crónica, una úlcera diabética crónica, una úlcera por presión crónica y una úlcera en etapa de preulceración crónica.
20. Composición farmacéutica para usar en el tratamiento de una herida crónica, que comprende bacterias probióticas recombinantes, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en las que dichos primer, segundo, tercer factor heterólogo es una combinación de factor de crecimiento de fibroblastos 2, factor estimulante de colonias 1 e interleucina 4.
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