KR102253283B1 - 비피도박테리움 비피덤을 이용한 인간 egf 단백질의 생산방법 및 이를 함유하는 조성물 - Google Patents
비피도박테리움 비피덤을 이용한 인간 egf 단백질의 생산방법 및 이를 함유하는 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은비피도박테리움 비피덤을 이용한 인간 EGF 단백질의 생산방법 및 인간 EGF 단백질을 생산하는 비피도박테리움 비피덤을 함유하는 화장품, 약품, 식품 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 인간 EGF 생산능이 있는 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum) BGN4 (KCCM 12754P)는 뛰어난 피부 재생 촉진, 피부 상처 치유, 주름개선 등의 효과를 발휘한다.
Description
본 발명은 미생물을 이용한 인간 EGF 단백질의 생산방법 및 이를 함유하는 조성물에 관한 것으로, 더욱 구체적으로는 비피도박테리움 비피덤을 이용한 인간 EGF 단백질의 생산방법 및 인간 EGF 단백질을 생산하는 비피도박테리움 비피덤을 함유하는 화장품, 약품, 식품 조성물에 관한 것이다.
피부는 여러 자극이나 외부 환경으로부터 신체를 보호하는 기능, 몸의 체온 조절 및 수분 손실 방지와 같은 몸의 항상성을 유지하는 등의 다양한 기능을 하는 기관이다.
피부가 미의 기준이 되면서 다양한 기능성 화장품을 사용하게 되는데, 화장품에는 계면활성제, 방부제, 향료, 색소 등의 부가 성분들이 포함되어 피부 염증, 트러블 등을 발생시키고, 피부 장벽을 무너뜨릴 수 있다.
EGF(epidermal growth factor)는 상피세포의 증식을 촉진하는 펩티드 중 하나로, 피부이식, 피부 상처의 회복촉진 등에 사용된다. 이와 같은 효능으로 인해 EGF는 피부 장벽 개선 및 피부 주름 개선용 화장품, 피부 상처 치유용 약제 등으로 다양하게 사용되고 있다.
EGF는 대장균, 효모 등의 미생물을 호스트로 이용하여 생산되고 있는데, 점차 그 대상 호스트의 스펙트럼은 다양해지고 있는 실정이다. 하지만, 미생물을 이용한 EGF의 생산은 생산량이 많지 않아 상업적 규모로의 생산성은 떨어지고 있는 실정이다.
본 발명은 인간 EGF 단백질을 생산하는 새로운 형질전환 박테리아를 개발하여 제공하고자 하며, 이를 포함하는 피부 재생 촉진 화장료 조성물, 피부 상처 치유용 약품 조성물 또는 피부 노화 개선용 식품 조성물로 개발하여 제공하고자 한다.
본 발명은 인간 EGF 단백질을 암호화하는 유전자가 도입되어 형질전환된 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum)을 배양하는 것을 특징으로 하는 인간 EGF 단백질의 생산방법을 제공한다.
본 발명의 인간 EGF 단백질의 생산방법에 있어서, 인간 EGF 단백질을 암호화하는 유전자는, 인간 EGF 단백질과 동일한 아미노산 서열을 암호화하되, 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum)에서 원활히 발현될 수 있도록 일부 핵산이 변화된 것이 좋다.
본 발명의 인간 EGF 단백질의 생산방법에 있어서, 상기 인간 EGF 단백질을 암호화하는 유전자는 바람직하게 서열번호 1에 기재된 핵산 서열로 구성된 gap 프로모터에 의해 발현이 조절되는 것이 좋다.
본 발명의 인간 EGF 단백질의 생산방법에 있어서, 상기 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum)에서 발현된 인간 EGF 단백질은, 바람직하게 서열번호 2에 기재된 핵산 서열이 암호화하는 시그날펩타이드가 결합되어 있는 것이 좋다.
본 발명은 인간 EGF 단백질을 암호화하는 유전자가 도입되어 형질전환된 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum)을 제공한다.
본 발명은 상기 형질전환된 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum) 또는 이의 배양물을 포함하는 피부 재생 촉진용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명은 상기 형질전환된 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum) 또는 이의 배양물을 포함하는 피부 주름 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명은 상기 형질전환된 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum) 또는 이의 배양물을 포함하는 피부 재생을 통한 상처 치유용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명은 상기 형질전환된 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum) 또는 이의 배양물을 포함하는 피부 재생을 통한 피부 노화 개선 또는 피부 주름 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명은 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum)를 이용하여 인간 EGF를 효율적으로 생산할 수 있는 방법을 제공하는데, 본 발명의 인간 EGF 생산능이 있는 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum) BGN4 (KCCM 12754P)는 뛰어난 피부 재생 촉진, 피부 상처 치유, 주름개선 등의 효과를 발휘한다.
도 1은 인간 EGF 단백질의 오리지날 아미노산 서열과 본 발명에서 코돈 최적화된 합성 인간 EGF 유전자의 뉴클레오티드 서열을 정렬한 그림이다.
도 2는 본 발명에서 사용된 pBEShEGF의 구조를 나타내었다.
도 3은 본 발명 pBEShEGF으로 형질전환이 이루어졌는지를 확인하기 위해 수행한 pBEShEGF의 제한 분석(restriction assay)을 나타낸 결과이다.
도 4에 OD600nm에서 본 발명의 형질전환 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum) BGN4 [pBEShEGF]의 배양 그래프를 나타내었다.
도 5는 샌드위치 ELISA에 의해 pH-제어 MRS 배지에서 배양하는 동안 본 발명의 형질전환 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum) BGN4 [pBEShEGF] CFCS(Cell Free Culture Supernatant)에 의해 생성된 인간 EGF의 정량을 나타낸 결과 그래프이다. 모든 데이터는 평균 ± 표준편차 (n = 4)로 표시되었다.
도 2는 본 발명에서 사용된 pBEShEGF의 구조를 나타내었다.
도 3은 본 발명 pBEShEGF으로 형질전환이 이루어졌는지를 확인하기 위해 수행한 pBEShEGF의 제한 분석(restriction assay)을 나타낸 결과이다.
도 4에 OD600nm에서 본 발명의 형질전환 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum) BGN4 [pBEShEGF]의 배양 그래프를 나타내었다.
도 5는 샌드위치 ELISA에 의해 pH-제어 MRS 배지에서 배양하는 동안 본 발명의 형질전환 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum) BGN4 [pBEShEGF] CFCS(Cell Free Culture Supernatant)에 의해 생성된 인간 EGF의 정량을 나타낸 결과 그래프이다. 모든 데이터는 평균 ± 표준편차 (n = 4)로 표시되었다.
본 발명은 인간 EGF 단백질을 암호화하는 유전자가 도입되어 형질전환된 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum)을 배양하는 것을 특징으로 하는 인간 EGF 단백질의 생산방법을 제공한다. 하기 본 발명의 실험에 의할 경우, 호스트로 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum)을 사용하여 인간 EGF 단백질을 암호화하는 유전자를 발현시킬 경우, 다른 프로바이오틱스 균주들에 비해 월등히 높은 생산 농도로 인간 EGF 단백질을 발현함이 확인되었다 (하기 표 3). 이는 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum)이 인간 EGF 단백질을 발현하기에 최적의 호스트임을 확인시켜 주는 결과이다.
본 발명의 인간 EGF 단백질의 생산방법에 있어서, 인간 EGF 단백질을 암호화하는 유전자는, 인간 EGF 단백질과 동일한 아미노산 서열을 암호화하되, 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum)에서 원활히 발현될 수 있도록 일부 핵산이 변화된 것이 좋다 (소위 'codon usage'). 인간 EGF 단백질을 암호화하는 유전자는 인간 EGF 단백질을 발현할 수 있는 것이라면 공지의 어느 것을 사용하여도 무방하나, 바람직하게는 비피도박테리움에서의 발현에 최적화되도록 핵산 일부를 변화하여 사용하는 것이 좋은 것이다. 더욱 바람직하게는 서열번호 3에 기재된 핵산서열을 사용하는 것이 좋다.
본 발명의 인간 EGF 단백질의 생산방법에 있어서, 상기 인간 EGF 단백질을 암호화하는 유전자는 바람직하게 서열번호 1에 기재된 핵산 서열로 구성된 gap 프로모터에 의해 발현이 조절되는 것이 좋다. 인간 EGF 단백질을 암호화하는 유전자는 서열번호 1에 기재된 핵산서열로 구성된 갭(gap) 프로모터에 의해 발현이 조절되는 것이 좋은데, 서열번호 1에 기재된 핵산서열로 구성된 갭(gap) 프로모터는 항시 (constitutive) 발현 유도 프로모터이다.
본 발명의 인간 EGF 단백질의 생산방법에 있어서, 상기 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum)에서 발현된 인간 EGF 단백질는, 바람직하게 서열번호 2에 기재된 핵산 서열이 암호화하는 시그날펩타이드가 결합되어 있는 것이 좋다. 발현된 hEGF는 시그날펩타이드에 의해 세포 밖으로 이동된다.
본 발명은 갭(gap) 프로모터, 시그날 펩티드, 인간 EGF 단백질 암호화 유전자가 삽입된 플라스미드를 제공하는데, 본 발명의 갭(gap) 프로모터, 시그날 펩티드, 인간 EGF 단백질 암호화 유전자 외에 플라스미드를 구성하는 다른 요소들 (back bone)은 공지의 것들을 사용하여 플라스미드를 구축할 수 있다. 다만, 바람직하게는 공지의 pBES2 플라스미드에 본 발명의 갭(gap) 프로모터, 시그날 펩티드, 인간 EGF 단백질 암호화 유전자를 삽입하여 구축한 것을 사용하는 것이 좋다.
본 발명은 인간 EGF 단백질을 암호화하는 유전자가 도입되어 형질전환된 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum)을 제공한다.
본 발명은 상기 형질전환된 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum) 또는 이의 배양물을 포함하는 피부 재생 촉진용 화장료 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 형질전환된 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum) 또는 이의 배양물을 포함하는 피부 주름 개선용 화장료 조성물을 제공한다. 인간 EGF는 피부 재생, 주름 개선 또는 상처 치유의 효과가 알려져 있는데, 본 발명의 상기 형질전환된 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum) 또는 이의 배양물은 인간 EGF를 함유하고 있기 때문에 피부 재생, 주름 개선 또는 상처 치유의 효과가 발휘되는 것이다.
본 발명의 화장료 조성물은, 일 예로, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 화장수, 젤, 수용성 리퀴드, 크림, 에센스, 계면활성제 함유 클렌징, 오일, 수중유(O/W)형 및 유중수(W/O)형 중 선택되는 어느 하나의 기초 화장료 제형; 스킨; 로션; 아이크림; 수딩젤; 연고; 마스크팩용 제형; 바디워시용 제형; 필링젤; 수중유형 및 유중수형 메이크업베이스; 파운데이션; 스킨커버; 립스틱, 립그로스, 페이스파우더, 투웨이케익, 아이새도, 치크칼라 및 아이브로우 펜슬류 중 선택되는 어느 하나의 색조화장료 제형; 두피용 제형; 중에서 선택되는 어느 하나인 것일 수 있다.
한편, 본 발명의 화장료 조성물은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제 예컨대 친수성 또는 친유성 활성제, 보존제, 항산화제, 용매, 방향제, 충전제, 차단제, 안료, 흡취제, 염료 등을 함유할 수 있다. 이들 다양한 보조제의 양은 당해 분야에서 통상적으로 사용되는 양이며, 예컨대 조성물 총 중량에 대해 0.001 내지 30 중량% 이다. 다만, 어떠한 경우라도 보조제 및 그 비율은 본 발명에 따른 화장료 조성물의 바람직한 성질에 악영향을 미치지 않도록 선택될 것이다.
본 발명은 상기 형질전환된 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum) 또는 이의 배양물을 포함하는 피부 재생을 통한 상처 치유용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 약학 조성물에 있어서, 상기 약학 조성물의 제형은 사용방법에 따라 다양한 형태일 수 있으나, 일 예로 정장제일 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 유효성분 이외에 약제학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 더욱 포함할 수 있다. 사용가능한 담체, 부형제 또는 희석제로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자이리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유가 있으며, 이들은 1종 이상 사용될 수 있다. 또한, 예방 및 치료제가 약제인 경우 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 또는 방부제 등이 추가적으로 포함될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 투여량은 투여방법, 복용자의 연령, 성별 및 체중, 및 질환의 중증도 등을 고려하여 결정하는 것이 좋다. 일 예로, 1일 0.1 내지 100㎎/㎏(체중)으로 1회 이상 투여 가능하다. 그러나 상기의 투여량은 예시하기 위한 일 예에 불과하며, 복용자의 상태에 따라 의사의 처방에 의해 변화될 수 있다. 또한, 일종의 정장제인 본 발명의 경우, 투여량은 성인을 기준으로 하루에 1천만 마리에서 1,000억마리를 투여 가능하다.
본 발명은 상기 형질전환된 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum) 또는 이의 배양물을 포함하는 피부 재생을 통한 피부 노화 개선 또는 피부 주름 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 식품 조성물은 일 예로, 육류, 곡류, 카페인 음료, 일반음료, 초콜릿, 빵류, 스낵류, 과자류, 사탕, 피자, 젤리, 면류, 껌류, 유제품류, 아이스크림류, 알코올성 음료, 술, 비타민 복합제 및 그 밖의 건강보조식품류 중 선택되는 어느 하나일 수 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 식품 조성물은 원하는 조성물의 형태에 따라 통상의 보조제 또는 첨가제, 또는 감미료, 예를 들면 감초, 비타민 C, 구연산, 니코틴산, 안식향산나트륨, 아스파탐, 사카린, 펙틴, 말티톨, 솔비톨, 자일리톨, 구아검, 탈지분유 및 올리고당으로 이루어진 군 중에서 선택되는 하나 이상의 성분을 추가하여 기호도나 미감을 증대시킬 수 있다.
한편, 본 발명에 있어서, 상기 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum)은, 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum)에 속하는 미생물들 중 어느 하나로 제한되지 않으나, 바람직하게는 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum) BGN4 (KCCM 12754P)을 사용하는 것이 좋다.
이하, 본 발명의 내용을 하기 실시예 또는 실험예를 통해 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예 또는 실험예에만 한정되는 것은 아니고, 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.
[실시예 1 : 형질전환 비피도박테리움 비피덤(
Bifidobacterium bifidum
) BGN4 [pBEShEGF]의 구축]
1) 형질전환 비피도박테리움 비피덤(
Bifidobacterium bifidum
) BGN4 [pBEShEGF]의 구축
1-1) 갭 프로모터(
gap
Promoter)의 분석
글리세르 알데히드-3-포스페이트 탈수소효소(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, Pgap)를 암호화하는 갭(gap) 유전자 (bbif_0612) 상류 프로모터 영역은, 대장균 σ70 타입 시그마 인자의 인식 모티프에 기초한 박테리아 프로모터 예측을 위해 개발된 BPROM 온라인 소프트웨어 툴 (http://linuxl.softberry.com/BPROM)을 사용하여 예측되었다. 이 분석은 디폴트의 변경 불가능한 임계값이 0.2 일 때 갭(gap) 앞에서 비교적 높은 선형 식별 함수 (LDF)를 갖는 단일 프로모터를 제공하였다. BPROM에 의해 예측된 갭(gap) 프로모터의 프로모터 요소는 -10 및 -35 서열 스페이서 길이가 컨센서스 프로모터(consensus promoter)보다 상당히 짧았기 때문에 이상적이지 않았다. 따라서, 잠재적인 -35, -10 영역 및 전사 개시 부위 (transcription start site, TSS)는 silico에서 제안되었다. 예측된 TSS는 갭(gap) ATG 시작 코돈의 상류에서 114 bp 상류 였고, 갭(gap)의 ATG 시작 코돈 상류의 5'- 번역되지 않은 영역(untranslated region)은 추정(putative) 리보솜 결합 부위 (RBS)를 포함하였다.
4개의 다른 추정 프로모터의 전사 활성은 β-글루쿠로니다아제(glucuronidase) 활성에 의해 분석되었다. Pgap의 전사 활성은 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum)의 다른 프로모터 (Phup, PhuxS, P16S rRNA)의 전사 활성보다 현저히 높은 것으로 밝혀졌다. 갭(gap) 유전자의 프로모터 영역이 시험된 프로모터 중에서 가장 높은 전사 활성을 나타내었으므로, Pgap가 본 발명에서 플라스미드의 프로모터로서 사용되었다.
1-2) 시그날 펩티드(signal peptide) 분석
비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum) S17, 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) E18 및 비피도박테리움 브레이브(Bifidobacterium breve) S27의 세가지 bifidobacterial 균주에서 나온 다양한 시그날 펩티드의 기능은 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum)의 상청액(supertanant)에서 피타아제(phytase) 활성에 기초하여 시험되었다.
비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum) S17 유래의 시그날 펩티드 S6(bbif_1671)이 가장 효과적인 단백질 분비 시그날로 확인되어, 이 시그날 펩티드 S6이 본 발명에서 시그날 펩티드로 선택되었다. 시그날 펩티드 S6 (bbif_1671)의 DNA 서열 및 아미노산 서열은 표 1과 같다.
| 서열정보 | |
| 시그날 펩티드 S6의 DNA 서열 | ATGAAATCACTGATGAAAAAGGTTTTCGCTGCCGCCGCGGCGATTGCCACCGTATTTGGATTGGCTGCGACGACAGTCGCCACGGCCAACGCAGCGGAT |
| 시그날 펩티드 S6의 아미노산 서열 | MKSLMKKVFAAAAAIATVFGLAATTVATANA * AD |
(* 기호는 예상 절단 부위를 나타냄)
1-3) 최적화된 합성 인간 EGF 유전자
합성 인간 EGF 유전자는 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum)의 코돈 사용빈도(codon usage)에 맞게 발현되도록 설계되었다. 표적 인간 EGF 유전자 단편은 상업적 공급 업체 (IDT DNA, 미국 코네티컷 주 코럴 빌)에 의해 생산된 것으로, 비피도박테리움 비피덤에 코돈-최적화되었다. 최적화된 합성 인간 EGF 유전자는 도 1과 같이 원래 유전자(인간 EGF wild -type)와 79 %의 염기서열 상동성을 가지는 것으로 나타났다.
한편, 상기에서 살펴본 바와 같이, 갭(gap) 유전자의 프로모터 서열은 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) 게놈 데이터베이스 (GenBank AD052817)로부터 수득되었다. 또한, 상기에서 살펴본 바와 같이, 시그날 펩티드 유전자는 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum) S17 (GenBank NC_014616.1)로부터 수득되었다.
1-4) pBEShEGF의 구성
Bifidobacterium-E.coli 셔틀 벡터 pBES2는 (대한민국 특허공개번호 제KR20040072545A에 공개), 암피실린 및 클로람페니콜 내성 마커를 보유하기 위해 대장균 벡터 pUC19과 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) MG1의 플라스미드(plasmid)를 재조합하여 구축되었다.
프로모터, 시그날 펩티드 및 종결자(terminator)를 갖는 인간 EGF ORF를 PCR을 통해 증폭시키고, 인퓨전(In-fusion) 클로닝 PCR을 통해 벡터 pBES2와 연결시켰다. 인퓨전 키트(In-fusion Kit) PCR (Takara Bio, Tokyo, Japan)에 사용된 프라이머는 Takara In-Fusion Cloning Tool로 설계되었다. pBEShEGF은 상용 공급 업체(Macrogen, Seoul, South Korea)에서 수행한 시퀀싱 프로세스에 의해 올바른 벡터인 것으로 입증되었으며, 도 2와 표 2에 pBEShEGF의 구조 및 구성을 나타냈다.
| Oligonucleotides | Gene Sequences |
| Gap promoter (bbif_0612) |
서열번호1 |
| Signal sequence (bbif_1761) |
서열번호2 |
| Human EGF optimized to B. bifidum | 서열번호3 |
| Terminator | 서열번호4 |
pBEShEGF의 크기는 8245bp이며, pBEShEGF을 먼저 대장균 DH5α에 형질전환하여 콜로니를 얻은 후, plasmid prep kit(Qiagen, USA)를 이용하여 벡터를 얻은 후, 제한효소 (BamHI, EcoRI)를 사용하여 플라스미드가 대장균 DH5α로 올바르게 형질전환되었는지 확인하였다. 그 결과, 도 3과 같이 제한효소로 절단된 pBEShEGF은 크기가 7.9kb인 큰 단편(절단 pBES2+gap promoter+S6)과 0.28kb(흰색 화살표)인 삽입 단편을 나타냈다. 이를 통해 pBEShEGF이 잘 구축되었음을 확인할 수 있었다.
이후, 대장균 DH5α로부터 pBEShEGF을 수득하고, 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum) BGN4 (KCCM 12754P)을 형질전환하였다. 이렇게 형질전환된 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum) BGN4 [pBEShEGF]는 인간 EGF 단백질을 생산하여 분비하게 된다.
2) 형질전환 비피도박테리움 비피덤(
Bifidobacterium bifidum
) BGN4 [pBEShEGF]의 성장 패턴 확인
본 발명의 형질전환 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum) BGN4 [pBEShEGF]를 100mL의 MRSC 배지에서 혐기성 조건 하 37℃로 밤새 (18시간) 전배양을 하였다. 이후, 1L의 신선한 MRS broth (pH 6.5)에 37℃에서 10 % (v/v)로 접종하였다. pH 5.5에 도달할 때까지 배양하고, 배양 동안 알칼리 용액을 첨가하여 pH 를 5.5로 유지하였다. 그 결과, 도 4와 같이 본 발명의 형질전환 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum) BGN4 [pBEShEGF] 성장 곡선을 확인할 수 있었다. 이를 통해, pBEShEGF으로 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum) BGN4를 형질전환하여도 균주 성장에 있어서는 큰 문제가 없는 것으로 결론내릴 수 있었다.
[실험예 1: 형질전환 비피도박테리움 비피덤(
Bifidobacterium bifidum
) BGN4 [pBEShEGF]에 의한 인간 EGF 발현량 분석]
1) 비피도박테리움의 생육에 따른 인간 EGF 생산
인간 EGF의 생산을 위해, 본 발명의 형질전환 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum) BGN4 [pBEShEGF]을 1.2 L 발효기 내 6.8로 pH-조절된 MRS broth에서 배양하였다. 대조군으로 인간 EGF이 없는 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum) BGN4 [pBES2]를 동일한 조건에서 배양하였다.
상기 비피도박테리움을 10 % (v/v)로 접종하고 10시간 후에 샘플링한 후, 배양액을 20시간 동안 매2시간 마다 수집하였다. OD600nm 값을 측정한 후, 샘플링된 박테리아 배양액을 이용하여 인간 EGF의 생산량을 분석하고자 하였다. 분석을 위해 샌드위치 효소-연결 면역 흡착 분석법 (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)을 사용하였다.
분석 결과, 도 5와 같이 형질전환 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum) BGN4 [pBEShEGF]은 인간 EGF의 성장 관련 생성을 나타내었으며, 제1박테리아 상층액(10h)은 약 5 ug/mL (ppm)의 인간 EGF을 함유하고, 제4박테리아 상청액(16h)은 약 20 ug/mL (ppm)의 인간 EGF을 함유하였고, 마지막 박테리아 상청액(20h)은 약 28.5 ug/mL (ppm)의 인간 EGF을 함유하는 것으로 나타났다.
비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum) BGN4 [pBEShEGF]는 성장에 따라 인간 EGF의 발현량이 많아졌고, 시간이 지날수록 배양 상층액에 인간 EGF이 축적되는 것을 확인하였다. 음성 대조군 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum) BGN4 [pBES2]은 검출 한계 미만의 인간 EGF 농도를 나타냈다 (미도시).
[실험예 2: 형질전환 비피도박테리움 비피덤(
Bifidobacterium bifidum
) BGN4 [pBEShEGF]에 의한 인간 EGF 생산 효능 확인]
여러 형질전환 프로바이오틱스(Probiotics)와 본 발명의 형질전환 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum) BGN4 [pBEShEGF]의 인간 EGF 생산능을 비교하고자 하였다. 분석 샘플로는 도 5에서의 20시간 배양된 본 발명의 형질전환 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum) BGN4 [pBEShEGF]와 동일한 조건으로 20시간 배양된 다른 형질전환 프로바이오틱스들의 배양 결과와 문헌서치 결과를 사용하였다.
실험 결과, 다른 형질전환 프로바이오틱스와 비교하여 본 발명의 형질전환 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum) BGN4 [pBESIL10]의 인간 EGF 생산량이 28.5 ug/mL (ppm)으로 가장 높았다.
| Host | Protein | Vector | Promoter | Amount | 비고 |
| E. coli | Human EGF | pFLAG-ATS (hEGF) | IPTG induction | peri: 196.5, cyto: 167 ng/mL |
https://link.springer.com/article/10.1007/s12010-007-8019-9 |
| Pichia pastoris GS115 | Human EGF | pPIC9K | PAOX (inducible) | 2.27 ug/mL | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5470459/ |
| HEK 293 cells | Human EGF | AdenoVator™ | PGK (constitutive) | 1.3 ng/mL | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4794936/ |
| B. longum RAPO | Human EGF | pBESAmyEGF | Pamy (constitutive) |
3.21 ng/mL | 비교예 |
| B. pseudocatenul.atum CRAPO | Human EGF | pBESAmyEGF | Pamy (constitutive) |
0.42 ng/mL | 비교예 |
| B. bifidum BGN4 |
Human EGF |
pBEShEGF |
Pgap (constitutive) |
28.5 ug/mL |
본 실시예 |
기탁기관명 : 한국미생물보존센터(국외)
수탁번호 : KCCM12754P
수탁일자 : 2020624
<110> BIFIDO CO., LTD.
<120> Method for production of human EGF with Bifidobacterium bifidum
and composition thereof
<130> YP-20-214
<160> 4
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 204
<212> DNA
<213> Bifidobacterium longum
<400> 1
agatctgcgg aatgcctcgc atcgaatcgc cgcaggctgt acagacatat ttgttagcgt 60
taacgaaata tggccgtttt atgctcaaag caagcgcgac accgttgctc tagtacagac 120
ggcgcattac agtagacact gttggtaaac aaaggccata gcgcatccat gcgcaaacgg 180
tctaccctac aaagggagct cgag 204
<210> 2
<211> 99
<212> DNA
<213> Bifidobacterium bifidum
<400> 2
atgaaatcac tgatgaaaaa ggttttcgct gccgccgcgg cgattgccac cgtatttgga 60
ttggctgcga cgacagtcgc cacggccaac gcagcggat 99
<210> 3
<211> 159
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Human EGF optimized to Bifidobacterium bifidum
<400> 3
aactccgact ccgagtgccc gctgtcccac gacggctact gcctgcacga cggcgtctgc 60
atgtacatcg aggccctgga caagtacgcc tgcaactgcg tcgtcggcta catcggcgag 120
cgctgccagt accgcgacct gaagtggtgg gagctgcgc 159
<210> 4
<211> 117
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> Terminator
<400> 4
gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc cgttatcaac ttgaaaaagt 60
ggcaccgagt cggtgctttt tttctagacc cagctttctt gtacaaagtt ggcatta 117
Claims (9)
- 인간 표피 성장 인자(EGF) 단백질을 암호화하는 유전자가 도입되어 형질전환된 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum)을 배양하되,
상기 형질전환된 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum)은 서열번호 1에 기재된 핵산 서열로 구성된 gap 프로모터, 서열번호 2에 기재된 핵산 서열로 구성된 시그널 시퀀스 및 인간 표피 성장 인자(EGF) 단백질과 동일한 아미노산 서열을 암호화하되, 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum)에서 원활히 발현될 수 있도록 일부 핵산이 변화된 서열번호 3에 기재된 핵산서열을 가지는 유전자가 도입된 것을 특징으로 하는 인간 표피 성장 인자(EGF) 단백질의 생산방법.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 서열번호 1에 기재된 핵산 서열로 구성된 gap 프로모터, 서열번호 2에 기재된 핵산 서열로 구성된 시그널 시퀀스 및 인간 표피 성장 인자(EGF) 단백질과 동일한 아미노산 서열을 암호화하되, 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum)에서 원활히 발현될 수 있도록 일부 핵산이 변화된 서열번호 3에 기재된 핵산서열을 가지는 유전자가 도입된 것을 특징으로 하는 인간 표피 성장 인자(EGF) 단백질을 암호화하는 유전자가 도입되어 형질전환된 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum).
- 제5항의 형질전환된 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum) 또는 이의 배양물을 포함하는 피부 재생 촉진용 화장료 조성물.
- 제5항의 형질전환된 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum) 또는 이의 배양물을 포함하는 피부 주름 개선용 화장료 조성물.
- 제5항의 형질전환된 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum) 또는 이의 배양물을 포함하는 피부 재생을 통한 상처 치유용 약학 조성물.
- 제5항의 형질전환된 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum) 또는 이의 배양물을 포함하는 피부 재생을 통한 피부 노화 개선 또는 피부 주름 개선용 식품 조성물.
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|---|---|---|---|
| KR1020200179614A KR102253283B1 (ko) | 2020-12-21 | 2020-12-21 | 비피도박테리움 비피덤을 이용한 인간 egf 단백질의 생산방법 및 이를 함유하는 조성물 |
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| KR1020200179614A KR102253283B1 (ko) | 2020-12-21 | 2020-12-21 | 비피도박테리움 비피덤을 이용한 인간 egf 단백질의 생산방법 및 이를 함유하는 조성물 |
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| KR1020200179614A KR102253283B1 (ko) | 2020-12-21 | 2020-12-21 | 비피도박테리움 비피덤을 이용한 인간 egf 단백질의 생산방법 및 이를 함유하는 조성물 |
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|---|---|
| KR (1) | KR102253283B1 (ko) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR102362828B1 (ko) * | 2021-06-17 | 2022-02-15 | 주식회사 비피도 | 비피도박테리움 비피덤 bgn4를 함유한 신부전 개선용, 치료용 또는 예방용 조성물 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| KR20140047886A (ko) * | 2012-10-15 | 2014-04-23 | 연성대학교 산학협력단 | 비피도박테리움 아니말리스 서브스피시스 락티스 sh5 유래 글루코시다아제의 과발현 시스템 및 이에 의해 형질전환된 비피도박테리움 비피둠 bgn4 |
| KR20170118772A (ko) * | 2015-02-04 | 2017-10-25 | 아우리얼리스 오와이 | 재조합 프로바이오틱 세균 |
-
2020
- 2020-12-21 KR KR1020200179614A patent/KR102253283B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| KR20170118772A (ko) * | 2015-02-04 | 2017-10-25 | 아우리얼리스 오와이 | 재조합 프로바이오틱 세균 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 대한민국 특허공개번호 제1019960007776호 (1996.03.22)에는, 인체 표피세포의 성장을 촉진하고 위산의 분비를 억제하는 인자인 인체 EGF(human Epidermal Growth Factor)의 유전자를 메타노 자화 효모인 한세눌라 폴리모르파를 이용하여 발현시키고 이를 배지내로 효율적으로 분비시키기 위해서 한세눌라 폴리모르파의 메탄올 옥시다제(MOX)유전자의 코돈 사용에 따라 이 유전자를 화학적으로 합성하고, 메타놀에 의해 발현 유도되는 강력한 프로모터인 MOX 프로코터와 S. cerevisiae의 교배인자 α의 분비 신호인 프리-프로리더 서열을 이용하여 인체 EGF의 발현 및 분배 벡터를 제조하여 이 벡터를 숙주세포의 염색체 DNA에 도입하는 방법이 기재되어 있다. |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR102362828B1 (ko) * | 2021-06-17 | 2022-02-15 | 주식회사 비피도 | 비피도박테리움 비피덤 bgn4를 함유한 신부전 개선용, 치료용 또는 예방용 조성물 |
| WO2022265151A1 (ko) * | 2021-06-17 | 2022-12-22 | 주식회사 비피도 | 비피도박테리움 비피덤 bgn4를 함유한 신부전 개선용, 치료용 또는 예방용 조성물 |
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