KR102291591B1 - 페룰산 및 이의 유사체를 포함하는 유전자 돌연변이에 의한 피부질환 예방 및 치료용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 페룰산, 이의 유사체 또는 이의 염을 포함하는 유전자 돌연변이에 의한 피부질환 예방 또는 치료용 조성물, 화장료 및 식품 조성물에 관한 것이다.

Description

페룰산 및 이의 유사체를 포함하는 유전자 돌연변이에 의한 피부질환 예방 및 치료용 조성물{COMPOSITION FOR PREVENTION AND TREATMENT OF SKIN DISEASES CAUSED BY GENETIC MUTATION COMPRISING FERULIC ACID AND ANALOGS THEREOF}
본 발명은 페룰산, 이의 유사체 또는 이의 염을 포함하는 유전자 돌연변이에 의한 피부질환 예방 또는 치료용 조성물, 화장료 및 식품 조성물에 관한 것이다.
피부는 인체의 일차 방어막으로서 체내의 온도 및 습도 변화와 자외선, 공해물질 등 외부환경의 자극으로부터 보호해주며, 체온조절 등의 생체 항상성 유지에 중요한 역할을 하고 있다. 그 중에서 진피-표피 경계부는 피부의 진피층과 표피층이 접합하는 부분으로 피부장벽기능을 수행할 뿐 아니라 표피와 진피의 단단한 부착과 상처 치료 시 재상을 위한 표피 세포의 정렬에 도움을 준다.
한편 케라틴 돌연변이에 의해 유발되는 유전성 피부질환에서, 진피-표피 경계부는 가장 중요한 요소이다. 대표적으로 수포성 표피박리증(Epiermolysis Bullosa)의 경우 표피-진피의 부착을 담당하는 단백질 부족으로 인해 층이 분리되면서 피부가 연약해져 사소한 외상이나 외부 압력 등에 의해서 3도 화상에 해당하는 극심한 고통과 함께 수포가 형성된다.
이러한 수포성 표피박리증과 같은 유전성 피부질환의 치료방법으로는 현재까지 피부에서 생산되는 케라틴 혼합물을 변형시키는 방법, 스테로이드제 계열 처리 및 처방, 골수이식 등의 방법이 연구되고 있기는 하나 아직 질환의 완치 방법은 없고, 증상이나 합병증의 완화를 위한 대중 요법이 주된 치료 방법이다. 그 중 이미 생긴 수포가 감염되는 것을 막는 것이 가장 중요하며, 수포가 생겼을 때 통증을 경감시키기 위한 진통제를 사용하기도 한다. 이에 따라, 케라틴 돌연변이로 인한 유전성 피부질환을 근본적으로 치료하거나 예방할 수 있는 새로운 치료제 개발이 요구되고 있다.
한국등록특허 제10-1750468호
본 발명의 목적은 페룰산, 이의 유사체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 유전성 피부질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 페룰산, 이의 유사체 또는 이의 화장품학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 유전성 피부질환 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 페룰산, 이의 유사체 또는 이의 식품학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 유전성 피부질환 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명의 일 측면은 하기 화학식 1의 페룰산, 이의 유사체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 유전자 돌연변이에 의한 피부질환 치료용 조성물에 관한 것이다.
[화학식 1]
Figure 112019123124513-pat00001
상기 R1은 H, F, Br, Cl 또는 I이며,
상기 R2는 OH, SH, NH, SeH, F, Br, Cl 또는 I이고,
상기 R3는 OCH3, CH3, OC2H5 또는 OC3H7이고,
상기 R4는 COOH, PO4, CH3, NH3 또는 NHCOCH3이다.
본 발명에서 “페룰산”은 자연에서 얻을 수 있는 성분으로 주로 식물 등에 함유되어 있으며, 주로 유리 산 혹은 에스테르 상태로 씨, 잎 또는 껍질에 존재한다.
본 발명에서 “페룰산의 유사체”란 페룰산 구조 중 작용기의 도입, 산화, 환원, 일부 원자의 치환 등 모체의 구조와 성질을 크게 변화시키지 않는 범위 내에서 변경된 화합물 등을 포함한다. 예컨대, 페룰산의 유사체는 파라쿠마린산(p-Coumarinic acid), 카페산(Caffeic acid), 시나핀산(sinapinic acid), 디페룰산(Diferulic acid)를 포함하는 하이드록시시나믹산(hydroxycinamic acid) 등이 있다.
구체적으로 상기 화학식 1은 화학식 2 내지 5로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있다.
[화학식 2]
Figure 112019123124513-pat00002
[화학식 3]
Figure 112019123124513-pat00003
[화학식 4]
Figure 112019123124513-pat00004
[화학식 5]
Figure 112019123124513-pat00005
상기 페룰산 또는 이의 유사체는 화학적으로 합성하거나 천연 물질로부터 분리할 수 있으며, 국내외에서 시판되는 것을 구입하여 사용할 수도 있다.
상기 페룰산은 산소분자로부터 유래되는 다양한 활성 산소종들에 대해 온화한 항산화력을 가지며, 산화성 전이금속들에 대한 강력한 항산화 효과를 가진다고 알려져 있다. 또한 페룰산은 DNA 변형, ROS생성 등을 억제 및/또는 감소시킬 수 있어 피부를 자외선으로부터 보호해주는 효과가 탁월하며 콜라겐 분해를 억제하여 피부 탄력 유지에도 도움이 되는 물질로 알려져 있다.
한편, 상기 페룰산 또는 이의 유사체가 케라틴의 단백질 양 및/또는 활성을 조절하여 유전성 피부질환 예방, 치료 및/또는 개선에 효과적인 물질이라는 점에 대하여는 개시되거나 교시된 바 없다. 이에 본 발명자들은 페룰산이 케라틴의 단백질 발현을 증가시킬 수 있음을 규명하였으며, 페룰산 및 이의 유사체를 포함하는 케라틴 단백질 관련 유전성 피부질환 치료 또는 예방용 조성물을 개발하였다. 나아가 페룰산이 베타-카테닌 및 c-myc를 포함한 종양억제 유전자의 발현을 조절할 수 있는 기능을 확인함으로써, 페룰산 및 이의 유사체가DNA 손상에 의한 피부암 등의 치료 또는 예방용 조성물을 개발하였다.
본 발명에서 “유전자 돌연변이에 의한 피부질환”이란 피부질환과 직·간접적으로 관련 있는 유전자 내 돌연변이가 일어나 발생하는 질환으로서, 케라틴 유전자의 발현이 억제된 것일 수 있다. 예컨대 케라틴 단백질 내 돌연변이로 인해 발생하는 유전성 피부질환 또는 DNA 손상에 의해 베타-카테닌 및/또는 종양억제유전자 발현 조절 이상으로 발생하는 피부암 등을 포함한다.
구체적으로, 상기 페룰산 및 이의 유사체는 케라틴 6A (K6A)의 단백질 발현을 증가시킬 수 있다.
본 발명에서 “케라틴(keratin)”은 세포 외 케라틴과 세포 내 케라틴으로 이루어진 여러 조직에서 주요 구성을 이루는 단백질로, 체모(예를 들어, 머리카락), 동물의 뿔, 손톱, 발톱에서 이황화결합에 의해 물리적으로 단단히 결합되어 있다. 또한, 세포 내에서는 중간 섬유를 만드는 단백질의 일원으로 특히 피부 등과 같은 표피세포에서 각질 섬유를 만드는 중요 구성 단백질이다. 케라틴은 서열의 특성에 따라 타입-1 케라틴인 K14, K16, 17 등이 있고, 타입-2 케라틴 K6A, K6B, K5 등이 있다.
상기 케라틴 6A 단백질을 암호화하는 유전자는 하기와 같을 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다: 인간 케라틴 6A 단백질(e.g., NCBI Accession No. NP_005545)을 암호화하는 유전자, 예컨대, NCBI Accession No. NM_005554 등으로 표현되는 KRT6A.
본 발명의 실시예에서는 배양된 피부 조직 및 쥐 성체의 피부 조직 단면에 페룰산을 처리한 경우, 페룰산을 처리하지 않은 대조군에 비해 케라틴 6A 단백질 발현량이 증가하였음을 확인하였으며(도 1 내지 도3), 페룰산이 케라틴 6A 단백질의 발현을 증가시킬 수 있음을 증명하였다.
본 발명의 “유전성 피부질환”은 피부 성장 또는 유지에 관여하는 물질을 암호화하는 유전자 내에 돌연변이가 발생하여 정상적 기능을 하지 못하는 경우 발생하는 질환을 모두 포함하며, 상염색체 우성 유전형과 상염색체 열성 유전형으로 나누어질 수 있다.
구체적으로, 상기 유전성 피부질환은 케라틴을 암호화하는 유전자 내에 돌연변이가 일어나 발생하는 질환일 수 있으며, 더욱 구체적으로 케라틴의 발현이 억제됨으로써 발생한 것일 수 있다.
보다 더 구체적으로, 상기 케라틴을 암호화하는 유전자 내 돌연변이로 인해 발생할 수 있는 질환은 건선(Psoriasis), 수포성 표피박리증(dystrophic epidermolysis bullosa, DEB), 단순 수포성 표피박리증(Epidermolysis Bullosa Simplex, EBS), 그물색소피부병(Dermatopathia pigmentosa reticularis, DPR), 다울링-데고스병(Dowling-Degos Disease, DDD), 표피박리 각화과다증(Epidermolytic Hyperkeratosis, EHK), 선천물집비늘증모양홍색피부증(Bullous Congenital ichthyosiform erythroderma, BCIE), 수포성 어린선(비늘증)(Ichthyosis Bullosa of Siemens, IBS), 손발바닥 각질피부증(Palmoplantar keratoderma, PPK), 표피박리 손발바닥 각질피부증(Epidermolytic Palmoplantar keratoderma, EPPK), 선천손발톱비대증(Pachyonychia congenital), 다발성 피지낭종(Steatocystoma multiplex) 및 피부암(skin cancer)으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 “건선(Psoriasis)”은 피부에 은백색의 비늘로 덮여 있는 경계가 뚜렷하여 크기가 다양한 홍반성 구진 및 판을 형성하는 질환으로, 조직학적으로 상피의 과다 증식을 특징으로 하는 만성 염증성 피부질환의 일종이다. 원인이 명확히 알려지지는 않았으나 주로 유전적 요인에 생활 습관에 따른 환경적 요인이 유발 인자로 작용하여, 각질세포 형성의 증식과 염증반응이 과다해지면서 면역체계가 피부를 외부물질로 오인, 공격하는 일종의 자가면역질환으로 알려져 있다. 상기 건선의 경우 사이토카인을 포함한 면역체계 활성으로 인하여 케라틴 17의 발현이 상향조절되는 것으로 알려지면서, 케라틴 17 발현의 억제가 건선의 감소 및/또는 치료와 관련이 있는 것으로 알려져 있다.
본 발명에서 “수포성 표피박리증(Epidermolysis bullosa)”이란 표피와 표피-진피 경계부 및 상피 유두 진피를 구성하는 단백질을 만드는 유전자의 변이에 의하여, 가벼운 외상에도 쉽게 물집이 발생되어 피부와 점막에 통증이 생기는 희귀한 유전성 질환으로, 피부에 생성되는 케라틴 5번 및/또는 14번의 돌연변이가 병을 유발하는 주된 원인으로 알려져 있다. 수포성 표피박리증의 경우 단순 수포성 표피박리증(epidermolysis bullosa simplex, EBS), 접합형 수포성 표피박리증(junctional epidermolysis bullosa, JEB), 이영양성 수포성 표피박리증(dystrophic epidermolysis bullosa, DEB) 등이 있으며 대부분의 환자가 단순 수포성 표피박리증인 것으로 알려져 있다.
본 발명에서 “그물색소피부병(Dermatopathia pigmentosa reticularis, DPR)”이란 외배엽 이형성증의 한 형태인 희귀한 상 염색체 우성 선청성 장애로, 구체적으로 피부에 생성되는 케라틴 5 및/또는 케라틴 14번의 돌연변이가 병을 유발하는 주된 원인으로 알려져 있다. 증상으로는 땀샘 부족, 얇은 머리카락, 부서지기 쉬운 손톱, 얼룩진 피부, 지문 부족 등이 있다.
본 발명에서 “다울링-데고스병(Dowling-Degos Disease, DDD)”은 희소한 유전성 피부염의 상염색체 우성 선청성 장애로, 구체적으로 케라틴 5 및/또는 케라틴 14번의 돌연변이가 병을 유발하는 주된 원인으로 알려져 있다. 증상으로는 굴근, 몸통 및 사지에 여러 개의 무증상 색소 침착형 황반이 나타난다.
본 발명에서 “표피박리 각화과다증(Epidermolytic Hyperkeratosis, EHK)”은 출생시 존재하는 피부질환으로 케라틴 1 및/또는 케라틴 10 번의 돌연변이가 병을 유발하는 주된 원인으로 알려져 있다. 이 질환을 가진 신생아는 붉은 피부, 심각한 수포가 있으며, 관절, 두피 또는 목 부위 등에는 정상 피부색보다 어둡게 나타난다.
본 발명에서 “선천물집비늘증모양홍색피부증(Bullous Congenital ichthyosiform erythroderma, BCIE)”은 출생 시 홍반, 물집, 부식 등을 수반하는 피부질환으로 케라틴 1 및/또는 케라틴 10번의 돌연변이가 병을 유발하는 주된 원인이다.
본 발명에서 “수포성 어린선(비늘증)(Ichthyosis Bullosa of Siemens, IBS)”은 희소한 유전성 피부염의 상염색체 우성 선청성 장애로, 구체적으로 케라틴 2번 돌연변이에 의해 유발된다. 증상으로는 표피 박리성 각화증과 유사한 증상을 나타내지만 표피 박리성 각화증과 달리, 표피의 상층에만 영향을 주는 질환이다.
본 발명에서 “손발바닥 각질피부증(Palmoplantar keratoderma, PPK) 또는 표피박리 손발바닥 각질피부증(Epidermolytic Palmoplantar keratoderma, EPPK)”은 상염색체 우성 장애로서 손바닥 및/또는 발바닥에 국한되어 나타나는 질환으로, 구체적으로 케라틴 1, 케라틴9 및 케라틴 16 번 중 어느 하나 이상의 돌연변이로 인하여 발생되는 질환이다.
본 발명에서 “선천손발톱비대증(Pachyonychia congenital)”은 케라틴 6A, 케라틴 6B, 케라틴 16 및 케라틴 17번 중 어느 하나 이상의 돌연변이로 인하여 발생하는 질환으로, 두꺼운 발톱, 발바닥 각막증, 또는 발바닥의 심각한 통증이 있는 질환이다.
본 발명에서 “다발성 피지낭종(Steatocystoma multiplex)”은 케라틴 17번의 돌연변이로 인하여 발생하는 질환으로, 주로 목, 등, 복부와 사지에 전체적으로 퍼진 여러 크기의 붉은색의 단단하고 고정된 피하 결절들이 발견되는, 낭종성 질환이다.
본 발명에서, “피부암(Skin cancer)”는 피부에 발생되는 악성 종양을 의미하며, 원발성 피부 악성 종양은 기저세포암, 편평세포암, 악성 흑생종 등이 대부분 차지한다. 주요 원인으로는 햇빛의 자외선이 DNA에 손상을 입혀 세포 성장과 분화에 영향을 주면서 발생하는 것으로 알려져 있다. 피부암 중 약 75%에서 베타-카테닌 돌연변이가 존재함이 밝혀졌고, 피부암 형성과정에서 제일 먼저 변이되는 유전체로 알려져 있다.
상기 케라틴을 암호화하는 유전자의 경우 발현 위치와 시기는 각각 다르나 유전자 중복이 자주 발생하며, 이로 인하여 분자적 상동성이 매우 높다는 특징이 있다.
상기 분자적 상동성이 높은 케라틴끼리는 상호 유전자 발현에 영향을 줄 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서 케라틴 5유전자에 돌연변이를 유발시킨 결과 케라틴 6A의 mRNA발현도 함께 감소된 것을 확인하였다(도 5).
또한, 돌연변이가 유발된 케라틴은 다른 케라틴 단백질의 과발현으로 대체할 수 있다. 예컨대, 직렬상동(paralogous)케라틴의 과발현을 통해 병증의 원인이 된 돌연변이 케라틴 유전자의 효과를 상쇄할 수 있다(Kerns et al, 2007, PNAS).
본 발명의 일 실시예에서 케라틴 5유전자가 녹다운(knock down)된 표피 각질 형성 세포에 페룰산을 처리한 결과 케라틴 6A 의 mRNA 발현량이 증가한 것을 확인하였으며(도 6), 상기 실험들을 통해 케라틴 5 유전자 내 돌연변이와 케라틴 6A 단백질은 분자적 상동성이 높으며, 한 유전자 내 돌연변이로 인한 증상을 다른 유전자의 과발현으로 상쇄시킬 수 있음을 시사한다.
상기와 같은 결과를 통해 본 발명의 페룰산 및 이의 유사체는 케라틴 6A 단백질 발현을 유도할 수 있고, 케라틴을 암호화하는 유전자 내 돌연변이로부터 기인한 다양한 유전성 피부질환에 대해 근본적인 치료용 조성물을 제공할 수 있을 것이다.
또한 구체적으로, 상기 페룰산 및 이의 유사체는 베타-카테닌 단백질의 발현을 조절할 수 있다.
본 발명에서 “베타-카테닌(beta-catenin)”은 세포 간 부착과 유전자 전사의 조절과 조정에 관여하는 단백질이다. 베타-카테닌은 Wnt 신호 전달 경로에서 세포 내 신호 변환하는데 관여한다. 베타 카테닌의 돌연변이 및/또는 과발현은 피부 암, 간세포 암, 자궁 내막 암 등 많은 암을 유발하는 원인이 되는 것으로 알려져 있다.
상기 페룰산 및 이의 유사체는 베타-카테닌 및/또는 c-myc 단백질의 발현을 조절하여 피부암 치료에 사용될 수 있다. 상기 페룰산 및 이의 유사체는 피부 세포의 표피층 및 진피층에서의 베타 카테닌의 발현을 각각 다르게 조절할 수 있으며, 구체적으로 상기 페룰산 및 이의 유사체는 피부 세포의 표피층에서는 베타-카테닌 단백질 발현을 억제하는 기능을 할 수 있는 반면, 피부 세포의 진피층에서는 베타-카테닌 단백질 발현을 증가시킬 수 있다.
이에 따라, 상기 페룰산 및 이의 유사체는 베타-카테닌의 발현을 조절하여 피부암 세포의 전이 및 침투를 조절하고, 피부암 치료 후 상처 조직에서 베타-카테닌 및 케라틴 14 등의 인자들을 조절하여 회복 속도를 가속화시킬 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 피부 표피 줄기세포에서의 베타-카테닌 단백질 및 c-myc 단백질의 발현량을 확인한 결과, 페룰산과 함께 처리할 때 베타-카테닌 및 c-myc 단백질 발현이 억제됨을 확인하였다(도 7 및 도 8).
본 발명의 일 실시예에서 피부 진피 줄기세포에서의 베타-카테닌 단백질 및 c-myc 단백질의 발현량을 확인한 결과, 페룰산과 함께 처리할 때 베타-카테닌 및 c-myc 단백질 발현량이 증가하였음을 확인하였다(도 9 및 도 10).
상기와 같은 결과는, 본 발명의 페룰산 및 이의 유사체가 진피까지 침투하여 표피 및 진피에서 각각 다르게 발현량을 조절함으로써 피부암 치료에 효과적으로 활용될 수 있음을 시사한다.
상기 페룰산, 이의 유사체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 유전성 피부질환 치료용 조성물일 수 있다.
본 발명에서 “약학적으로 허용 가능한 염”은 유리산(free acid)에 의해 형성된 산 부가염일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 약학적으로 허용가능한 염은 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 것이면 특별히 제한은 없으며, 구체적인 예로는 염산, 브롬산, 술폰산, 아미도황산, 인산 및 질산과 같은 무독성의 무기산이나 아세트산, 프로피온산, 숙신산, 글리콜산, 스테아르산, 젖산, 타르타르산, 시트르산, 파라톨루엔설폰산 및 메탄설폰산과 같은 무독성의 유기산을 이용하여 염을 형성할 수 있다. 또한, 설페이트, 피로설페이트, 바이설페이트, 설파이트, 바이설파이트, 니트레이트, 포스페이트, 모노하이드로겐 포스페이트, 다이하이드로겐 포스페이트, 메타포스페이트, 피로포스페이트 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드, 플루오라이드, 아세테이트, 프로피오네이트, 데카노에이트, 카프릴레이트, 아크릴레이트, 포메이트, 이소부티레이트, 카프레이트, 헵타노에이트, 프로피올레이트, 옥살레이트, 말로네이트, 석시네이트, 수베레이트, 세바케이트, 푸마레이트, 말리에이트, 부틴-1,4-디오에이트, 헥산-1,6-디오에이트, 벤조에이트, 클로로벤조에이트, 메틸벤조에이트, 디니트로 벤조에이트, 하이드록시벤조에이트, 메톡시벤조에이트, 프탈레이트, 테레프탈레이트, 벤젠설포네이트, 톨루엔설포네이트, 클로로벤젠설포네이트, 크실렌설포네이트, 페닐아세테이트, 페닐프로피오네이트, 페닐부티레이트, 시트레이트, 락테이트, β-하이드록시부티레이트, 글리콜레이트, 말레이트, 타트레이트, 메탄설포네이트, 프로판설포네이트, 나프탈렌-1-설포네이트, 나프탈렌-2-설포네이트, 만델레이트 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 투여를 위하여, 상기 본 발명의 페룰산 또는 이의 유사체 외에 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물은 어떠한 제형으로도 적용가능하며, 보다 구체적으로는 경피 투과형 제형일 수 있다. 경피 투과형 제형은 연고, 젤, 크림, 분무제 등일 수 있으나, 종류, 사용, 목적에 따라 당업자는 어려움 없이 적의 선정하여 배합할 수 있다.
구체적으로, 상기 경피 투과를 위해 페룰산 또는 이의 유사체는 바세린과 혼합될 수 있으며, 경피 투과를 위해 필요한 부형제, 첨가제 등 제한없이 혼합되어 사용될 수 있다.
본 발명의 다른 측면은 페룰산, 이의 유사체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 약학적 조성물을 치료를 필요로 하는 개체에 약학적으로 유효한 양으로 투여하는 단계를 포함하는, 유전자 돌연변이에 의한 피부질환 치료방법에 관한 것이다.
“페룰산”, “유사체” 및 '유전자 돌연변이에 의한 피부질환'은 상기 설명한 바와 같다.
본 발명에서 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 성병, 연령, 질병의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있다. 또한 본 발명의 약학적 조성물은 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 용어 “개체”는 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 증상이 호전될 수 있는 유전성 피부질환을 가진 동물 또는 인간을 포함한다. 본 발명에 따른 치료용 조성물을 개체에게 투여함으로써, 유전성 피부질환을 효과적으로 예방 및 치료할 수 있다.
본 발명의 용어 "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 인간 또는 동물에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명에 따른 치료용 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 경구 또는 비경구 투여될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 치료용 조성물은 유효성분이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 하기 화학식 1의 페룰산, 이의 유사체 또는 이의 화장품학적으로 허용 가능한 염을 포함하는, 유전자 돌연변이에 의한 피부질환의 예방 또는 개선용 화장료 조성물에 관한 것이다.
[화학식 1]
Figure 112019123124513-pat00006
상기 R1은 H, F, Br, Cl 또는 I이며,
상기 R2는 OH, SH, NH, SeH, F, Br, Cl 또는 I이고,
상기 R3는 OCH3, CH3, OC2H5 또는 OC3H7이고,
상기 R4는 COOH, PO4, CH3, NH3 또는 NHCOCH3이다.
구체적으로 상기 화학식 1은 화학식 2 내지 5로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있다.
[화학식 2]
Figure 112019123124513-pat00007
[화학식 3]
Figure 112019123124513-pat00008
[화학식 4]
Figure 112019123124513-pat00009
[화학식 5]
Figure 112019123124513-pat00010
“페룰산”, “유사체” 및 “유전자 돌연변이에 의한 피부질환”은 상기 설명한 바와 같다.
본 발명의 일 실시예에서 케라틴 5유전자에 돌연변이를 유발시킨 결과 케라틴 6A의 mRNA발현도 함께 감소된 것을 확인하였다(도 5).
본 발명의 일 실시예에서 케라틴 5유전자가 녹다운(knock down)된 표피 각질 형성 세포에 페룰산을 처리한 결과 케라틴 6A 의 mRNA 발현량이 증가한 것을 확인하였으며(도 6), 상기 실험들을 통해 케라틴 5 유전자 내 돌연변이와 케라틴 6A 단백질은 분자적 상동성이 높으며, 한 유전자 내 돌연변이로 인한 증상을 다른 유전자의 과발현으로 상쇄시킬 수 있음을 시사한다.
상기와 같은 결과는 본 발명의 페룰산은 케라틴 6A 단백질 발현을 유도할 수 있고, 케라틴을 암호화하는 유전자 내 돌연변이로부터 기인한 다양한 유전성 피부질환 개선에 효과적일 수 있음을 시사하는 바, 상기 페룰산, 이의 유사체를 화장료 조성물에 활용할 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 용액, 외용 연고, 크림, 폼, 영양 화장수, 유연 화장수, 팩, 유연수, 유액, 메이크업 베이스, 에센스, 비누, 액체 세정료, 입욕제, 선 스크린 크림, 선 오일, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 로션, 파우더, 비누, 계면 활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 패취 및 스프레이로 구성된 군으로부터 선택되는 제형으로 제조할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 화장료 조성물은 일반 피부 화장료에 배합되는 화장품학적으로 허용 가능한 담체를 1 종 이상 추가로 포함할 수 있으며, 통상의 성분으로 예를 들면 유분, 물, 계면 활성제, 보습제, 저급 알코올, 증점제, 킬레이트제, 색소, 방부제, 향료 등을 적절히 배합할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 화장품학적으로 허용 가능한 담체는 화장료 조성물의 제형에 따라 다양하다.
본 발명의 제형이 연고, 페이스트, 크림 또는 젤인 경우에는, 담체 성분으로서 동물성 유, 식물성 유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크, 산화 아연 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.
본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는, 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록사이드, 칼슘 실케이트, 폴리아미드 파우더 등이 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로하드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진제를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.
본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제 등이 이용될 수 있으며, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일 등이 이용될 수 있고, 특히, 목화씨 오일, 땅콩 오일, 옥수수 배종 오일, 올리브 오일, 피마자 오일 및 참깨 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.
본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타하이드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 피부에 직접 도포하거나 살포하는 등의 경피 투여 방법으로 사용될 수 있으며, 본 발명 조성물의 투여 경로는 목적조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다.
본 발명의 조성물의 사용량은 연령, 병변의 정도 등의 개인 차이나 제형에 따라 적절하게 조절될 수 있으며, 1일 1회 내지 수회 적?韜?을 피부에 도포하여 1 주일 내지 수개월 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 하기 화학식 1의 페룰산, 이의 유사체 또는 이의 식품학적으로 허용 가능한 염을 포함하는, 유전자 돌연변이에 의한 피부질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물에 관한 것이다.
[화학식 1]
Figure 112019123124513-pat00011
상기 R1은 H, F, Br, Cl 또는 I이며,
상기 R2는 OH, SH, NH, SeH, F, Br, Cl 또는 I이고,
상기 R3는 OCH3, CH3, OC2H5 또는 OC3H7이고,
상기 R4는 COOH, PO4, CH3, NH3 또는 NHCOCH3이다.
구체적으로, 구체적으로 상기 화학식 1은 화학식 2 내지 5로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있다.
[화학식 2]
Figure 112019123124513-pat00012
[화학식 3]
Figure 112019123124513-pat00013
[화학식 4]
Figure 112019123124513-pat00014
[화학식 5]
Figure 112019123124513-pat00015
“페룰산”, “유사체” 및 “유전자 돌연변이에 의한 피부질환”은 상기 설명한 바와 같다.
본 발명의 “식품 조성물”은 육류, 스낵류, 낙농제품, 음료수 등을 예시할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니며, 통상적인 건강기능식품을 모두 포함하는 개념으로 이해될 수 있다.
본 발명의 페룰산 또는 이의 유사체를 첨가할 수 있는 식품은 육류, 빵, 소시지, 초콜릿류, 스넥류, 캔디류, 과자류, 라면, 피자, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 비타민 복합제, 건강기능성 보조식품 등이 있다.
상기 식품의 종류는 구체적으로 건강기능식품일 수 있다. 상기 건강기능 식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 증진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 점증제, pH 조절제, 안정화제, 보존제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 단독으로 또는 조합으로 사용될 수 있으며, 이러한 첨가제의 비율은 조성물 전체 중량당 0.001 내지 50 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
상기 건강기능식품은 식품의 생체 조절 기능을 강조한 식품으로 물리적, 생화학적, 생물공학적인 방법을 이용하여 특정 목적에 작용 및 발현하도록 부가가치를 부여한 식품이다. 이러한 건강기능 식품의 성분은 생체 방어와 신체 리듬의 조절, 질환의 방지 및 회복에 관계하는 신체 조절 기능을 생체에 대하여 충분히 발휘하도록 설계하여 가공하게 되며, 식품으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제, 감미료 또는 기능성 원료를 함유할 수 있다.
상기 건강기능식품은 유전성 피부질환 개선을 위한 목적으로 정제, 과립, 분말, 캅셀, 액상의 용액 및 환으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 제형일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 구체적으로 상기 정제 형태의 건강기능식품은 페룰산 또는 이의 유사체, 부형제, 결합제, 붕해제 및 다른 첨가제 혼합물을 통상의 방법으로 과립화한 다음, 활택제 등을 넣어 압축 성형하거나, 상기 혼합물을 직접 압축 성형하여 제조할 수 있다. 또한, 상기 정제 형태의 건강기능식품은 필요에 따라 고미제 등을 함유할 수 있으며, 필요에 따라 적당한 제피제로 제피할 수도 있다.
상기 캅셀 형태의 건강기능식품 중 경질캅셀제는 통상의 경질캅셀에 페룰산 또는 이의 유사체 및 부형제 등의 첨가제와의 혼합물 또는 그의 입상물 또는 제피한 입상물을 충진하여 제조할 수 있다. 연질캅셀제는 페룰산 또는 이의 유사체 및 부형제 등의 첨가제와의 혼합물을 젤라틴 등 캅셀기제에 충진하여 제조할 수 있다. 상기 연질캅셀제는 필요에 따라 글리세린 또는 솔비톨 등의 가소제, 착색제, 보존제 등을 함유할 수 있다.
상기 환 형태의 건강기능식품은 페룰산 또는 이의 유사체, 부형제, 결합제, 붕해제 등의 혼합물을 적당한 방법으로 성형하여 조제할 수 있으며, 필요에 따라 백당이나 다른 적당한 제피제로 제피를, 또는 전분, 탈크 또는 적당한 물질로 환의를 입힐 수도 있다.
상기 과립 형태의 건강기능식품은 페룰산 또는 이의 유사체, 부형제, 결합제, 붕해제 등의 혼합물을 적당한 방법으로 입상으로 제조할 수 있으며, 필요에 따라 착향제, 고미제 등을 함유할 수 있다.
상기 부형제, 결합제, 붕해제, 활택제, 고미제, 착향제 등에 대한 용어 정의는 당업계에 공지된 것으로 그 기능 등의 동일 내지 유사한 것들을 포함할 수 있다.
또한, 상기 식품의 종류는 식품 첨가제일 수 있으며, 상기 식품 첨가제는 식품의 제조, 가공, 또는 보존을 위해 식품에 첨가, 혼합, 침윤 기타의 방법에 의해 사용되는 물질을 의미한다. 상기 식품 첨가제는 천연물과 합성품이 있으며, 기능과 용도에 따라 분류할 수 있다. 현재 한국에 식품첨가물로 허가되어 있는 품목은 화학적 합성품 370여종, 천연첨가물 50여종이며, 주로 용도에 따라 보존료, 살균제, 산화방지제, 착색료, 발색제, 표백제, 조미료, 감미료, 착향료, 팽창제, 강화제, 개량제, 유화제, 증점제(호료) 및 안정제, 피막제, 껌 기초제, 소포제, 용제, 이형제, 방충제, 품질개량제와 기타 식품제조용 첨가제 등으로 분류되어 쓰이고 있다.
상기 식품첨가제의 형태는 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 액상 형태를 포함할 수 있으며 구체적으로는 캡슐의 형태일 수 있으나, 상기 형태에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 페룰산 또는 이의 유사체를 식품용 조성물로 사용할 경우, 상기 페룰산 또는 이의 유사체를 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용하고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 상기 페룰산 또는 이의 유사체의 혼합량은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 개선, 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
본 발명의 페룰산 또는 이의 유사체는 천연 물질에 함유되어 있는 성분으로, 상기 페룰산 또는 이의 유사체를 포함하는 조성물은 케라틴 단백질의 발현을 유도하여 유전성 피부질환 치료, 예방 및 개선에 널리 활용될 수 있다.
본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
도 1은 배양된 피부 조직 내에 페룰산을 처리한 후 케라틴 6A단백질 양을 면역형광염색법을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 쥐의 성체의 피부 조직에 페룰산을 처리한 후 케라틴 6A 단백질의 양을 웨스턴 블롯을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 쥐의 성체의 피부 조직 내에 페룰산을 처리한 후 케라틴 6A 단백질 양을 면역형광염색법을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 세포 내에서 케라틴5가 녹다운(knock-down)되었는지를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 케라틴5가 녹다운된 세포 내에서 케라틴5 및 케라틴 6A mRNA 발현량을 qPCR을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 케라틴5가 녹다운된 세포 내에 페룰산을 처리하여 케라틴6A 단백질 발현이 증가했는지를 웨스턴블롯을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 배양된 피부 표피 줄기세포에 페룰산을 처리한 후 베타-카테닌 단백질 양을 면역형광염색법을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 배양된 피부 표피 줄기세포에 페룰산을 처리한 후 베타-카테닌 단백질의 양을 웨스턴 블롯을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 배양된 피부 진피 줄기세포에 페룰산을 처리한 후 베타-카테닌 단백질 양을 면역형광염색법을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 배양된 피부 진피 줄기세포에 페룰산을 처리한 후 베타-카테닌 단백질의 양을 웨스턴 블롯을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 쥐의 피부 조직에 페룰산 처리 후, 케라틴 6A단백질 발현량 확인
쥐의 피부 조직으로부터 페룰산이 케라틴 6A 단백질 발현을 유도시키는지 여부를 확인하기 위하여, 배양된 피부 조직 및 쥐의 성체의 피부 조직 단면에 페룰산을 처리하여 케라틴 6A 단백질 발현량을 웨스턴 블롯 및 면역 형광 염색법을 이용하여 확인하였다.
먼저, 생후 1일 이내의 쥐의 피부를 벗겨낸 후, 4 mm 펀치(Kai industries)를 이용하여 원형의 피부 조각을 24 웰 플레이트에 깔아주었다. 세포 배지는 셀엔텍(CELLnTEC)의 방법에 따라 성장인자 Cnt-57을 조심스럽게 넣어주며, 이틀에 한번씩 배지를 교체해주었다. 상기 피부 조직 배양 방법은 비특허문헌 Mazzalupo et al., J Invest Dermatol, 2002를 참고할 수 있다. 이후 페룰산을 처리해준 그룹과 미처리한 대조군을 12일간 배양한 뒤, 면역형광염색법을 이용하여 피부세포 내 케라틴6A 단백질의 발현을 확인하였다
구체적으로 세포 형광염색은 4% 파라폼알데하이드(paraformaldehyde) 용액 (용매, PBS) 500 μl를 20분간 반응 시킨 후 세척 완충액(0.1 M, PBS)으로 3회 세척하였다. 이후 1차 항체 케라틴 6A (토끼 항-케라틴 6A, 1: 200, 코반스, 뉴저지, 미국)를 15시간 반응시켜 주었다. 세척 완충액(0.1 M, PBS)으로 3회 세척한 후, 2차 항체 Alexa 488(당나귀에서 추출한 항-토끼 IgG, 1: 1000, 인비트로겐, 캘리포니아, 미국)를 1시간 반응시켜 주었다. 이후 세척 완충액(0.1 M, PBS)으로 3회 세척시킨 후 DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole, 1: 1000, 인비트로겐, 캘리포니아, 미국) 용액과 3분 동안 반응시켜 주었다. 세척 완충액(0.1 M, PBS)로 다시 3회 세척시킨 후 FluoView FV1000 공초점 현미경(올림푸스, 도쿄, 일본)을 이용하여 형광 사진을 촬영하였다.
조직 형광염색은 파라핀으로 코팅되어 있는 피부조직의 파라핀을 제거시킨 후 세척 완충액(0.1 M, PBS)으로 3회 세척하였으며, 과산화수소 함유 용액(0.1M PBS, 0.2% H2O2)으로 30분 동안 반응을 시켜 내재성 과산화효소(endogenous peroxidase)의 활성을 제거해주었다. 블로킹 용액(5% 소혈청, 0.1% 트리톤 X-100)으로 2시간 동안 반응시켜주고, 세척 완충액(0.1 M, PBS)으로 3회 세척시켜 주었다. 이후 1차 항체 케라틴 6A(토끼 항-케라틴 6A, 1: 200, 코반스, 뉴저지, 미국) 및 베타-카테닌(쥐에서 추출한 항-베타 카테닌, 1: 200, 인비트로겐, 캘리포니아, 미국)을 15시간 반응시켜 주었다. 세척 완충액(0.1 M, PBS)으로 3회 세척시킨 후, 2차 항체 Alexa 488(당나귀에서 추출한 항-토끼 IgG, 1: 1000, 인비트로겐, 캘리포니아, 미국) 및 Alexa 647(염소에서 추출한 항-쥐 IgG, 1: 1000, 인비트로겐, 캘리포니아, 미국)을 1시간 동안 반응시켜 주었다. 세척 완충액(0.1 M, PBS)으로 3회 세척시킨 후 DAPI(1: 1000, 인비트로겐, 캘리포니아, 미국) 용액과 3분간 반응시켜 주었다. 이후 세척 완충액(0.1 M, PBS)으로 3회 세척한 후, FluoView FV1000 공초점 현미경(올림푸스, 도쿄, 일본)을 이용하여 형광 사진을 촬영하였다.
또한 웨스턴 블롯을 이용하여 단백질 발현량을 확인하였다.
먼저 케라틴 6A 및 베타-카테닌 두 단백질의 발현량을 확인하기 위하여 피부조직을 채취하여 용해 완충액(pH 7.4, 50 mM, Tris-HCL, 150mM NaCL, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 10 mg/mL 아프로티닌, 10 mg/mL 류펩틴, 5 mM 페닐메틸설포닐 플루오라이드 및 1 mM DTT)을 이용하여 단백질을 추출하였다. 추출한 단백질은 브래드퍼드 반응액(바이오래드, 캘리포니아, 미국)을 사용하여 정량화하였으며, 20 μL의 단백질을 10% SDS-PAGE로 전기 영동하고, 니트로셀룰로오스 멤브레인(머크, 매사추세츠, 미국)에 옮겼다. 멤브레인은 1차 항체 케라틴 6A(토끼 항-케라틴 6A, 1: 200, 코반스, 뉴저지, 미국) 및 β-액틴(마우스에서 추출한 항-β-액틴, 1: 1000, 산타크루즈, 텍사스, 미국)과 반응시키고, TBS-T(Tris Buffered Saline with Tween 20)로 10분간 3회 세척시킨 후 멤브레인을 2차 항체(산타크루즈, 텍사스, 미국)로 1시간 반응시켰다. 항체들에 대한 발현 분석은 겨자무과산화효소(Horseradish peroxidase, HRP)-연결된 2차 항체에 의해 발현되는 ECL(enhanced chemiluminescence)을 이용하였으며, chemidoc 이미징 시스템(바이오레드, 캘리포니아, USA)을 이용하여 분석하였다.
그 결과, 페룰산을 처리한 피부 조직에서 페룰산을 처리하지 않은 대조군에 비해 케라틴 6A 단백질 발현량이 증가되었음을 확인하였다(도 1).
또한 쥐 성체의 피부조직에 3일 및 7일 동안 페룰산을 처리하한 후 케라틴 6A단백질 발현량을 확인한 결과, 케라틴 6A단백질 발현량이 유의하게 증가됨을 확인하였다. 구체적으로, 쥐 성체 피부 조직에 페룰산을 처리하고 3일이 지난 후 케라틴 6A단백질 발현량이 특히 높음을 확인하였다(도 2, 도 3).
상기 결과들은 페룰산이 피부 조직 내 케라틴6A 단백질의 발현을 유도할 수 있는 물질임을 시사한다.
실시예 2. 케라틴 5가 녹다운(knock-down)된 표피 각질 형성세포(Epidermal keratinocytes)에서의 케라틴 6A 단백질 발현량 확인
케라틴5 단백질 발현의 감소가 케라틴6A 단백질 발현에 영향을 주는지 여부를 확인하기 위하여, 표피 각질 형성 세포인 kera308세포 내 케라틴5를 암호화하는 유전자를 녹다운시킨 후, 케라틴 6A 단백질 발현량을 확인하였다.
2-1. Kera308세포 준비
Kera308 (Cell line service, 독일, #400429)를 10%(v/v) 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS)이 보충된 고농도 포도당(High Glucose) DMEM 배지에서 배양하였다. 세포들은 37℃ 및 5% CO2 조건 하의 인큐베이터에서 배양하였다. 특정 유전자를 높은 효율로 녹아웃 할 수 있는 gRNA를 찾기 위해서 상기 배양된 1x105개의 Kera308세포에 하기의 실시예 2-2 및 2-3에서 설명한 것처럼 in vitro transcribed sgRNA 1 μg 및 Cas9단백질 (툴젠) 4 μg을 리포펙타민 2000 (ThermoFisher Scientific, 뉴욕, 미국)을 이용하여 sgRNA 및 Cas9 단백질을 세포 내로 도입시켰다(in vitro).
2-2. Kera308세포 형질감염: sgRNA 설계
CRISPR RGEN Tools (htto://www.rgenome.net/cas-designer) 을 사용하여 케라틴5 (케라틴5; NCBI Accession No. NM_027011.3)의 CRISPR/Cas9 표적 부위 선별 및 추정 오프-타겟 검사를 수행하였다. CRISPR/Cas9 표적 부위로서 내에서 온타겟 서열부위를 제외하고 0-, 1-, 또는 2bp미스매치(mismatch)부위가 없는 DNA 서열들을 sgRNA 타겟부위로 선정하였다.
2-3. Kera308세포 형질감염: sgRNA 합성
2개의 상보적 올리고뉴클레오타이드를 어닐링 및 연장시켜 sgRNA합성을 위한 주형들을 PCR-증폭시켰다. 이때 사용된 타겟 부위 서열, 이를 증폭시키기 위한 프라이머 서열, 및 이로부터 얻어진 sgRNA이 타겟팅하는 DNA 타겟 서열(PAM 포함)을 표 1에 정리하였다.
서열번호 프라이머 서열 서열
1 Oligo primer forward 5'-caccgTTCAGCTCGGTGTCCCGCAG-3'
2 Oligo primer reverse 5'-aaacCTGCGGGACACCGAGCTGAAc-3'
서열번호 DNA 타겟 서열(PAM 서열 포함) 서열
3 Krt5 5'-TTCAGCTCGGTGTCCCGCAGTGG-3'
2-4 Kera308세포 내 케라틴 5 및 케라틴 6A 발현량 확인
세포 내에서 케라틴5를 암호화하는 유전자가 녹다운되었는지 확인하고자, 유전자 발현 양상을 Real-time PCR로 조사하였다. 또한 케라틴 5를 암호화하는 유전자의 녹다운이 케라틴 6A를 암호화하는 유전자의 발현에 영향을 미치는지 여부를 확인하기 위해, 케라틴 6A유전자 발현 향상도 Real-time PCR을 이용하여 확인하였다. mRNA수준은 GADPH에 대해 정규화되었으며, 정상 케라틴5유전자를 포함하는 야생형(wild-type)을 대조군으로 설정하였다.
먼저, 쥐의 세포주 kera308로부터 RNA-isolation 키트, 하이브리드-RTM (진올, 서울, 한국)을 이용하여 RNA를 추출하였다. 추출한 RNA로 cDNA를 합성하기 위해 1 μg RNA및 하이퍼스크립트 키트(HyperScript kit, 진올, 서울, 한국)을 이용하였다. 이후, 합성된 cDNA를 이용하여 Real-time PCR(어플라이드 바이오시스템즈, 캘리포니아, 미국)의 가이드라인 절차대로 SYBR 및 타겟 유전자(케라틴 5, 케라틴 6A, 케라틴 14, 케라틴 17)의 프라이머를 혼합하여 96 웰 플레이트에 넣은 후 플레이트를 Real-time PCR 기기에 삽입하였다. 타겟 유전자의 프라이머 시퀀스는 하기와 같다.
서열번호 타겟 유전자 정방향 프라이머
(Forward primer)
4 Krt 5 5'-TGCCCTGCCGTTTCTCTACT-3'
5 Krt 6A 5'-CCCTCTGAACCTGCAAATCG-3'
6 Krt 14 5'-ACGAGAAGATGGCGGAGAAG-3'
7 Krt 17 5'-GGCCAGGTGGGCGGCGAAATCAAC-3'
8 Gapdh 5'-CATGGCCTTCCGTGTTCCTA-3'
서열번호 타겟 유전자 역방향 프라이머
(Reverse primer)
9 Krt 5 5'-TGATCTGCTCCCTCTCCTCA-3'
10 Krt 6A 5'-GATCTGCTCCCTCTCCTCAGT-3'
11 Krt 14 5'-CTCTGTCTTGCTGAAGAACCATTC-3'
12 Krt 17 5'-GAGCCTGGACCCTTCCCGAAGTCAG-3'
13 Gapdh 5'-GCGGCACGTCAGATCCA-3'
그 결과, 케라틴5의 mRNA 발현량이 감소됨을 확인하였으며 이는 케라틴 5 유전자가 정상적으로 녹다운되었음을 의미한다.
또한 케라틴 5와 분자적 상동성이 높은 케라틴 6A의 mRNA 발현량을 확인한 결과, 케라틴 5를 암호화하는 유전자가 녹다운된 세포에서 그렇지 않은 세포와 비교하여 mRNA 발현량이 약 50% 감소함을 확인하였다(도 5).
상기 결과를 통해 분자적 상동성이 높은 케라틴끼리는 상호 유전자 발현에 영향을 줄 수 있음을 시사한다.
실시예 3. 케라틴5 녹다운(knock-down)된 세포에 페롤산을 처리한 후 케라틴 6A 단백질 발현량 확인
페롤산이 케라틴6A 단백질 발현에 영향을 주는지 확인하기 위하여 kera308세포에 페롤산을 처리한 후 케라틴6A의 단백질 양을 웨스턴 블롯(western blot)을 이용하여 확인하였다.
kera308 세포를 1×106 cells/well개의 세포를 부착시킨 후 15시간 전 배양하였고, 페룰산 100 νM 처리 후 24시간 동안 배양하였다. 수확한 세포를 13,000 rpm에서 5분간 원심 분리하여 그 상층액을 취한 후, 단백질 농도는 Bradford assay (바이오레드)를 이용하여 정량하였다.
웨스턴 블롯은 상기 실시예 1의 방법을 참고한다.
그 결과, 페룰산을 처리 시 페룰산을 처리하지 않은 것에 비해 케라틴6A 단백질 발현량이 현저히 증가되는 것을 확인하였다(도 6).
상기 결과를 통해 페룰산은 케라틴 6A 단백질 발현량을 증가시킬 수 있는 물질임을 시사하며, 따라서 케라틴 6A의 돌연변이 또는 케라틴 6A와 분자적 상동성이 높은 다른 케라틴의 돌연변이로 인한 유전성 피부질환을 치료하는 용도로 널리 활용될 수 있음을 시사한다.
실시예 4. 쥐의 피부 조직에 페룰산 처리 후, 베타-카테닌(beta-catenin) 단백질 발현량 확인
페룰산이 베타-카테닌 단백질을 조절하는지 여부를 확인하기 위하여, 피부 표피 세포 및 피부 진피 세포에서 베타-카테닌 단백질과 c-myc 단백질의 발현량을 확인하는 실험을 수행하였다.
4-1. 피부 표피줄기세포에서 베타-카테닌 단백질 억제 효과 확인
피부 표피줄기세포에 페룰산을 처리한 후 베타-카테닌 단백질과 c-myc 단백질의 발현량 및 베타-카테닌 단백질 유도제인 LiCl을 페룰산과 함께 처리한 후의 베타-카테닌 단백질과 c-myc단백질의 발현량을 면역형광염색법 및 웨스턴 블롯을 이용하여 확인하였다.
먼저, 면역형광염색법의 경우 상기 실시예 1의 세포 형광염색법을 참고하였다. 이때 1차 항체는 케라틴 6A 대신에 베타-카테닌(쥐에서 추출한 항-베타 카테닌, 1: 200, 인비트로겐, 캘리포니아, 미국)을 사용하고, 2차 항체는 Alexa 488(당나귀에서 추출한 항-토끼 IgG, 1: 1000, 인비트로겐, 캘리포니아, 미국) 대신 Alexa 647(염소에서 추출한 항-쥐 IgG, 1: 1000, 인비트로겐, 캘리포니아, 미국)를 사용하였다.
또한, 웨스턴 블롯은 상기 실시예 1의 웨스턴 블롯 방법을 참고하였다. 이때 1차 항체는 케라틴 6A 대신에 베타-카테닌(쥐에서 추출한 항-베타 카테닌, 1: 200, 인비트로겐, 캘리포니아, 미국)을 사용하였다.
그 결과 도 7 및 도 8에 나타난 바와 같이 페룰산을 처리한 피부 표피줄기세포에서 베타-카테닌 및 c-myc 단백질 발현이 모두 억제됨을 확인하였다.
4-2. 피부 진피줄기세포에서 베타-카테닌 단백질 억제 효과 확인
피부 진피줄기세포에 페룰산을 처리한 후 베타-카테닌 단백질과 c-myc 단백질의 발현량 및 베타-카테닌 단백질 유도제인 LiCl을 페룰산과 함께 처리한 후의 베타-카테닌 단백질과 c-myc단백질의 발현량을 면역형광염색법 및 웨스턴 블롯을 이용하여 확인하였다.
먼저, 면역형광염색법의 경우 상기 실시예 1의 세포 형광염색법을 참고하였다. 이때 1차 항체는 케라틴 6A 대신 베타-카테닌(쥐에서 추출한 항-베타 카테닌, 1: 200, 인비트로겐, 캘리포니아, 미국)을 사용하고, 2차 항체는 Alexa 488(당나귀에서 추출한 항-토끼 IgG, 1: 1000, 인비트로겐, 캘리포니아, 미국) 대신 Alexa 647(염소에서 추출한 항-쥐 IgG, 1: 1000, 인비트로겐, 캘리포니아, 미국)를 사용하였다.
또한, 웨스턴 블롯은 상기 실시예 1의 웨스턴 블롯 방법을 참고하였다. 이때 1차 항체는 케라틴 6A 대신에 베타-카테닌(쥐에서 추출한 항-베타 카테닌, 1: 200, 인비트로겐, 캘리포니아, 미국)을 사용하였다.
그 결과, 도 9 및 도10에 나타난 바와 같이 피부 진피 줄기세포에서는 베타-카테닌 및 c-myc단백질 양이 증가하였음 확인하였다.
상기 결과를 통해 페룰산은 피부 조직에서 베타-카테닌 단백질을 조절할 수 있는 성분으로서, 피부에 도포했을 경우 진피층까지 내려갈 수 있는 작은 크기를 가지고 있으며 표피층 및 진피층에서 베타 카테닌의 발현을 다르게 조절함으로써 피부암을 치료에 활용될 수 있음을 시사한다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.
본 발명의 범위는 후술하는 청구범위에 의하여 나타내어지며, 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> University-Industry Cooperation Group of Kyung Hee University DGIST office of University-Industry Cooperation <120> COMPOSITION FOR PREVENTION AND TREATMENT OF SKIN DISEASES CAUSED BY GENETIC MUTATION COMPRISING FERULIC ACID AND ANALOGS THEREOF <130> 18PP30984 <160> 13 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligo primer forward <400> 1 caccgttcag ctcggtgtcc cgcag 25 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligo primer reverse <400> 2 aaacctgcgg gacaccgagc tgaac 25 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Krt5 <400> 3 ttcagctcgg tgtcccgcag tgg 23 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Krt5_forward primer <400> 4 tgccctgccg tttctctact 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Krt 6A_forward primer <400> 5 ccctctgaac ctgcaaatcg 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Krt 14_forward primer <400> 6 acgagaagat ggcggagaag 20 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Krt 17_forward primer <400> 7 ggccaggtgg gcggcgaaat caac 24 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Gapdh_forward primer <400> 8 catggccttc cgtgttccta 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Krt 5_reverse primer <400> 9 tgatctgctc cctctcctca 20 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Krt 6A_reverse primer <400> 10 gatctgctcc ctctcctcag t 21 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Krt 14_reverse primer <400> 11 ctctgtcttg ctgaagaacc attc 24 <210> 12 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Krt 17_reverse primer <400> 12 gagcctggac ccttcccgaa gtcag 25 <210> 13 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Gapdh_reverse primer <400> 13 gcggcacgtc agatcca 17

Claims (14)

  1. 하기 화학식 1의 페룰산 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는, 유전자 돌연변이에 의한 피부질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서,
    [화학식 1]
    Figure 112021087840453-pat00016

    상기 R1은 H이며,
    상기 R2는 OH이고,
    상기 R3는 OCH3이고,
    상기 R4는 OH이고,
    상기 유전자 돌연변이에 의한 피부질환은 수포성 표피박리증, 단순 수포성 표피박리증, 그물색소피부병, 다울링-데고스병 및 선천손발톱비대증으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인, 약학적 조성물.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서,
    상기 페룰산은 케라틴 6A단백질 발현을 증가시키는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서,
    상기 페룰산은 베타-카테닌 단백질 발현을 조절하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물로서,
    상기 페룰산은 피부 표피층에서는 베타-카테닌 단백질 발현을 억제하고, 진피층에서는 베타-카테닌 단백질 발현을 유도하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  6. 삭제
  7. 제1항에 있어서,
    상기 약학적 조성물은 경구, 비강, 국소, 피부 또는 비경구 경로로 투여되는 것인, 약학적 조성물.
  8. 하기 화학식 1의 페룰산 또는 이의 화장품적으로 허용 가능한 염을 포함하는, 유전자 돌연변이에 의한 피부질환의 예방 또는 개선용 화장료 조성물로서,
    [화학식 1]
    Figure 112021087840453-pat00021

    상기 R1은 H이며,
    상기 R2는 OH이고,
    상기 R3는 OCH3이고,
    상기 R4는 OH이고,
    상기 유전자 돌연변이에 의한 피부질환은 수포성 표피박리증, 단순 수포성 표피박리증, 그물색소피부병, 다울링-데고스병 및 선천손발톱비대증으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인, 화장료 조성물.
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 하기 화학식 1의 페룰산 또는 이의 식품학적으로 허용 가능한 염을 포함하는, 유전자 돌연변이에 의한 피부질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물로서,
    [화학식 1]
    Figure 112021087840453-pat00026

    상기 R1은 H이며,
    상기 R2는 OH이고,
    상기 R3는 OCH3이고,
    상기 R4는 OH이고,
    상기 유전자 돌연변이에 의한 피부질환은 수포성 표피박리증, 단순 수포성 표피박리증, 그물색소피부병, 다울링-데고스병 및 선천손발톱비대증으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인, 식품 조성물.
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 제11항에 있어서, 상기 식품 조성물은 건강기능식품인 것인, 식품 조성물.


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