KR100968367B1 - 카페인산 유도체 및 이를 유효성분으로 포함하는 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 신규 합성한 카페인산(caffeic acid) 유도체 및 이를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 본 발명의 신규 합성한 카페인산(caffeic acid) 유도체는 우수한 혈관신생 억제효과를 가진다. 본 발명의 신규 합성한 카페인산 유도체는 원물질인 카페인산과 비교하여 VEGF 유전자의 전사 활성을 억제하여 효과적으로 혈관신생을 억제한다. 이러한 VEGF 유전자의 전사 활성의 억제는 STAT3의 활성, 즉 STAT3 Tyr-705의 인산화를 억제함으로써, 다양한 약리학적 활성을 발휘한다. 보다 상세하게는, 본 발명의 유효성분인 카페인산 유도체는 STAT3 Tyr-705의 인산화, STAT3 신호 경로, 핵 내 이동 , VEGF 프로모터상의 STAT3/HIF-1a/p300사이의 전사 단위 형성를 억제하고, VEGF에 의해 유도되는 혈관내피세포의 증식, 이동, 혈관형성 및 종양 성장을 억제한다. 또한, 본 발명의 카페인산 유도체를 유효성분으로 하여 약제학적, 기능성 화장료(cosmeceutical), 화장료, 기능성 식품(neutraceutical) 또는 식품 조성물을 제조할 수 있다. 또한, 상기 조성물은 혈관신생과 염증성 아토피, 전선 등과 같은 피부염과 관련된 다양한 질병, 질환 또는 상태를 예방 또는 치료할 수 있다.

카페인산, 카페인산 유도체, 혈관신생, 종양, 저산소

Description

카페인산 유도체 및 이를 유효성분으로 포함하는 조성물{Caffeic Acid Derivatives and Compositions Comprising the Same as an Active Ingredient}

본 발명은 신규합성한 카페인산 유도체 및 이를 유효성분으로 포함하는 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 신규합성한 카페인산 유도체가VEGF(vascular endothelial growth factor) 유전자의 전사 활성을 효과적으로 억제하여, 이를 유효성분으로 포함하는 조성물에 관한 것이다.

종전 연구에서, 본 발명자들은 전사 신호 전달 및 활성 인자 3(signal transducer and activator of transcription 3; STAT3)이 저산소 유도 인자-1α(hypoxia inducible factor-1α; HIF-1α) 단백질 안정성에 중요한 역할을 하고, 인간 신장암 세포의 HIF-1α와 상호작용 함으로써 혈관 내피 성장 인자(vascular endothelial growth factor; VEGF)의 HIF-1-매개 발현을 개선시킨다는 사실을 알 수 있었다(1). 상기 사실은 STAT3이 고형암 세포에서 저산소-매개 VEGF 발현을 조절하는 중요한 상향-조절자임을 입증한다.

VEGF는 혈관 신생 및 종양 진행에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있고 (2), VEGF 억제는 동물 모델 및 암 환자의 종양 항-혈관신생 치료법으로서 유망한 결과를 가져왔다(3). 종양 세포의 증식이 혈관 형성 속도보다 빠르기 때문에 고형암 내부에 저산소 상태는 일반적으로 발생하여, 종양에 혈액을 원활히 공급할 수 없게 된다(4). 또한, 저산소 상태는 종양에서 VEGF 발현을 자극하고 종양 성장을 위한 물질 대사의 요구를 충족시키기 위하여 혈관신생을 촉진 한다 (5). 따라서 저산소 혈관신생을 조절하는 인자들은 확실한 항암 치료의 타깃이다. HIF-1은 VEGF 발현을 조절하는 중요한 전사 인자이기 때문에, 상기 타깃 중 하나이다. HIF-1은 HIF-1α 및 HIF-1β 서브유닛으로 구성된 헤테로 다이머이고(6), 생물학적 활성은 HIF-1α의 양에 의존하며, 이는 산소 분압에 의해 조절된다. 정상 산소 조건 하에서, HIF-1α단백질은 불안정하다. 저산소 상태 하에서 유도할 수 있는 HIF-1α를 타깃으로 하는 항암제 개발을 위하여 많은 연구를 하였다(7).

최근에, STAT3이 VEGF 유전자의 직접적인 전사 활성 인자임을 확인하였고, 다양한 인간의 암에서 VEGF 발현을 상향-조절함이 입증되었으며(8), 이는 STAT3 활성이 종양에서 VEGF의 과다생산에 크게 기여한다는 것을 의미한다. STAT3은 티로신 705 잔기(Y705)의 인산화로 활성화 되고, 이는 다이머 형성, 핵 내 이동, DNA 결합, 및 타깃 유전자 전사를 야기 한다(9). STAT3의 티로신 705(Y705)의 인산화는 STAT3 활성화의 필수 조건인 이합체 형성 및 핵 내 이동에 중요하다(10). 따라서, 본 발명자들은 STAT3 705 잔기의 인산화를 억제하면 종양 세포에서 VEGF 발현을 감소시킬 수 있다고 판단하였다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있 다. 인용된 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 신규 합성한 항혈관신생 물질을 개발하고자 노력하였고, 그 결과 카페인산 유도체가 STAT3(signal transducer and activator of transcription 3)의 활성화, 즉 인산화를 억제하여, HIF-1α(hypoxia inducible factor-1α) 및 VEGF(vascular endothelial growth factor) 유전자의 전사 활성을 효과적으로 억제함으로써, 효율적으로 혈관신생 및 종양 성장 억제효과를 가짐을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 신규 합성한 카페인산(caffeic acid) 유도체를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 카페인산 유도체를 유효성분으로 포함하는 혈관신생 억제용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 카페인산(caffeic acid) 유도체를 제공한다:

화학식 1

상기 화학식 1에서, R₁, R₂, R₃ 및 R₄는 각각 서로 독립적으로, 수소 또는 C₁-C₅ 알킬기이다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 상기 화학식 1로 표시되는 카페인산 유도체를 유효성분으로 포함하는 혈관신생 억제용 조성물을 제공한다.

본 발명자들은 신규 합성한 항혈관신생 물질을 개발하고자 노력하였고, 그 결과 카페인산 유도체가 STAT3(signal transducer and activator of transcription 3)의 활성화, 즉 인산화를 억제하여, HIF-1α(hypoxia inducible factor-1α) 및 VEGF(vascular endothelial growth factor) 유전자의 전사 활성을 효과적으로 억제함으로써, 효율적으로 혈관신생 및 종양 성장 억제효과를 가짐을 확인하였다.

본 발명의 카페인산 유도체의 원물질인 카페인산(caffeic acid, CA)은 과일, 야채, 포도주, 식물성오일 및 커피성분 등 자연계에 광범위하게 존재하는 페놀산(phenolic acid)계 화합물이다(20). 카페인산의 IUPAC 명은 (E)-3-(3,4-디하이 드록시페닐)프로프-2-에노산이다. 카페인산은 잘 알려진 항산화 활성을 가지고 있으며(11-13, 21-24), 리포옥시게나제(lipoxygenases), 사이클로옥시게나제(cyclooxygenase), 클루타사이온 S-트랜스페라제(glutathione S-transferase), 잔틴옥시다제(xanthine oxidase) 등의 효소들을 저해하는 활성을 가진다(Chan, W.S. et al, Anticancer Res. 15: 703-707(1995); Schefferlie, J.G., and van Bladeren, P.J. Food Chem . Toxicol. 31: 475-482(1993); Koshihara, Y.et al, Biochim . Biophys . Acta. 792: 92-97(1984); Mirzoeva, O. K.et al, FEBS Lett. 396: 266-270(1996)). 또한, 카페인산은 항종양활성(Tanaka, T.et al, Carcinogenesis. 14: 1321-1325(1993); Frenkel, K.et al, Cancer Res., 53: 1255-1261(1993)), 항염증성 활성(14, 15, 24-26), 에이즈 바이러스 HIV 복제억제능[Kashiwada, Y.et al, J. Nat . Prod. 58: 392-400(1995); Fesen, M. R.et al, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 90: 2399-2403(1993)이 보고되어 있다. 그러나, 카페인산 유도체가 저산소 유도 STAT3의 활성을 억제하고 VEGF의 전사 활성을 억제함으로써 혈관신생 및 종양 성장을 효과적으로 억제한다는 활성은 보고된 바가 없다.

본 발명에 따르면, 하기 화학식 2의 카페인산에 여러 가지 화학적 잔기를 유기화학공정으로 결합시켜 물성이 개선된 신규물질을 제공한다. 본 발명의 신규 화합물의 다양한 생리 생화학적인 효능검정을 해 본 결과 원물질인 카페인산에 비하여 그 효능이 증가된다.

화학식 2

본 명세서에서, 용어 “알킬”은 직쇄 또는 분쇄 포화 탄화수소기를 의미한다. 예를 들어, 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, 이소부틸, n-부틸 및 t-부틸을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 화학식 1의 유도체의 R₁, R₂, R₃ 및 R₄는 각각 서로 독립적으로, 수소 또는 C₁-C₃ 알킬기이고, 보다 바람직하게는, 수소 또는 메틸기이다. 가장 바람직하게는, 상기 화학식 1의 유도체의 R₁, R₂, R₃ 및 R₄는 각각 수소이며, 이러한 화학식을 가지는 유도체를 CADPE((3-(3,4-디하이드록시-페닐)-아크릴산 2-(3,4-디하이드록시-페닐)-에틸 에스테르))라 명명한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에 이용되는 유효성분은 VEGF 유전자의 전사 활성을 억제하여 혈관신생을 억제한다. 이러한 VEGF 유전자의 전사 활성의 억제는 STAT3의 활성, 즉 STAT3 Tyr-705의 인산화 억제함으로써, 다양한 약리학적 활성을 발휘한다. 보다 상세하게는, 본 발명의 유효성분인 카페인산 유도체는 STAT3 Tyr-705의 인산화, STAT3 신호 경로, 핵 내 이동 , VEGF 프로모터상의 STAT3/HIF-1a/p300사이의 전사 단위 형성를 억제하고, VEGF에 의해 유도되는 혈 관내피세포의 증식, 이동, 혈관형성 및 종양 성장을 억제한다.

본 발명의 조성물에 의해 예방 또는 치료될 수 있는 질병, 질환 또는 상태는 혈관신생과 관련된 다양한 질환을 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 조성물에 의해 예방 또는 치료될 수 있는 질환은, 당뇨병성 망막증, 미숙아 망막증, 각막 이식 거부, 신생혈관 녹내장, 홍색증, 증식성 망막증, 암, 건선, 혈우병성 관절, 아테롬성 동맥경화 플라크 내에서의 모세혈관 증식, 켈로이드, 상처 과립화, 혈관 접착, 류마티스 관절염, 골관절염, 자가면역 질환, 아토피, 알러지, 크론씨병, 재발협착증, 아테롬성 동맥경화, 장관 접착, 캣 스크래치 질환, 궤양, 간경병증, 사구체신염, 당뇨병성 신장병증, 악성 신경화증, 혈전성 미소혈관증, 기관 이식 거부, 신사구체병증, 당뇨병, 염증 또는 신경퇴행성 질환이다.

본 발명의 조성물에 의해 예방 또는 치료될 수 있는 암은 위암, 대장암, 폐암, 유방암, 난소암, 간암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 췌장암, 방광암, 결장암, 자궁경부암, 뇌암, 전립선암, 골암, 피부암, 갑상선암, 백혈병, 림프종, 부신피질암, 부갑상선암 , 요관암 및 신장암을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 조성물에 의해 예방 또는 치료될 수 있는 자가면역질환은 알로페시아 그레아타(alopecia greata), 강직성 척추염, 항인지질 증후군, 자가면역 아디슨 질환, 부신의 자가면역 질환, 자가면역 용혈성 빈혈, 자가면역 간염, 자가면역 난소염 및 고환염, 자가면역 혈소판감소증, 베체트병, 수포성 유천포창, 심근병증, 복강 스프루우-피부염(celiac sprue-dermatitis), 만성 피로 면역이상 증후군, 만성염증성 탈수초 다발성 신경병증, Churg-Strauss 증후군, 반흔성유천포창, CREST 증후군, 한냉 응집소 질환, 크론씨병, 원판성 낭창, 복태성복합한냉글로불린혈증, 섬유근통-섬유근염, 사구체신염, 그레이브스 질환, 귈레인 바레 증후군, 하시모토 갑상선염, 특발성 폐섬유화증, 특발성 혈소판 감소성 자반증, IgA 신경염, 연소자성 관절염, 편평태선, 홍반성 루푸스, 메니에르병, 혼합성 연결 조직 질환, 다발성 경화증, 타입 I 또는 면역-매개 당뇨병, 중증근무력증, 심상성 천포창, 악성 빈혈, 결정성 다발동맥염, 다발연골염, 자가면역성 다선 증후군, 류마티스 다발성근통, 다발성 근염과 피부근염, 일차성 무감마글로불린혈증, 일차성 담증성 간경변, 건선, 건선성 관절염, 레이노 현상, 라이터 증후군, 류마티스 관절염, 사르코이드증, 공피증, 강직인간 증후군, 전신성 홍반성 루푸스, 홍반성 루푸스, 다가야스 동맥염, 일시적 동맥염, 거대세포 동맥염, 궤양성 대장염, 포도막염, 백반증 및 베게너 육아종증을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 조성물에 의해 예방 또는 치료될 수 있는 염증성 질환의 예는, 천식, 엔세필리티스(encephilitis), 염증성 장염, 만성 폐쇄성 폐질환, 알러지, 아토피, 건선, 폐혈병성 쇼크증, 폐섬유증, 미분화 척추관절증, 미분화 관절병증, 관절염, 염증성 골용해, 및 만성 바이러스 또는 박테리아 감염에 의한 만성 염증을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

보다 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물에 의해 예방 또는 치료될 수 있는 질병, 질환 또는 상태는 당뇨병성 망막증, 미숙아 망막증, 각막 이식 거부, 신생혈관 녹내장, 홍색증, 증식성 망막증, 암, 건선, 아테롬성 동맥경화 플라크 내에서의 모세혈관 증식, 혈관 접착, 류마티스 관절염, 골관절염, 자가면역 질 환, 알러지, 아토피, 크론씨병, 재발협착증, 아테롬성 동맥경화, 당뇨병, 염증 또는 신경퇴행성 질환이다. 가장 바람직하게는, 암(특히, 고형암)은 신장암 또는 피부암이다.

본 발명의 조성물은 약제학적 조성물, 기능성 화장료(cosmeceutical) 조성물, 화장료 조성물, 기능성 식품(neutraceutical) 조성물 또는 식품 조성물로 제조될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 (a) 상술한 본 발명의 화학식 1의 카페인산 유도체의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물이다.

본 명세서에서 용어 “약제학적 유효량”은 상술한 화학식 1의 카페인산 유도체의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.

본 발명의 조성물이 약제학적 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여, 점막 투여 및 점안 투여 등으로 투여할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 성인 기준으로 0.001-100 ㎎/kg(체중)이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 (a) 화학식 1의 카페인산 유도체의 화장품학적 유효량(cosmetically effective amount); 및 (b) 화장품학적으로 허용되는 담체를 포함하는 화장료 조성물(또는 기능성 화장료 조성 물)이다.

본 명세서에서 용어 “화장품학적 유효량”은 상술한 본 발명의 효능을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.

본 발명의 화장품 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸 글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 화장품 조성물에 포함되는 성분은 유효 성분으로서의 화학식 1의 카페인산 유도체와 담체 성분 이외에, 화장품 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제를 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물이 식품 조성물(또는 기능성 식품 조성물)로 제조되는 경우, 유효성분으로서 화학식 1의 카페인산 유도체뿐만 아니라, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 [타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등]) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다.

예컨대, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제로 제조되는 경우에는 본 발명의 화학식 1의 카페인산 유도체 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 두충 추출액, 대추 추출액, 감초 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(ⅰ) 본 발명의 신규한 카페인산(caffeic acid) 유도체는 우수한 혈관신생 억제효과를 가진다.

(ⅱ) 본 발명의 신규한 카페인산 유도체는 원물질인 카페인산과 비교하여 VEGF 유전자의 전사 활성을 억제하여 효과적으로 혈관신생을 억제한다. 이러한 VEGF 유전자의 전사 활성의 억제는 STAT3의 활성, 즉 STAT3 Tyr-705의 인산화를 억제함으로써, 다양한 약리학적 활성을 발휘한다. 보다 상세하게는, 본 발명의 유효성분인 카페인산 유도체는 STAT3 Tyr-705의 인산화, STAT3 신호 경로, 핵 내 이동 , VEGF 프로모터상의 STAT3/HIF-1a/p300사이의 전사 단위 형성를 억제하고, VEGF에 의해 유도되는 혈관내피세포의 증식, 이동, 혈관형성 및 종양 성장을 억제 한다.

(ⅲ) 본 발명의 카페인산 유도체를 유효성분으로 하여 약제학적, 기능성 화장료(cosmeceutical), 화장료, 기능성 식품(neutraceutical) 또는 식품 조성물을 제조할 수 있다.

(ⅳ) 또한, 상기 조성물은 혈관신생과 관련된 다양한 질병, 질환 또는 상태를 예방 또는 치료할 수 있다.

이상에서 상세히 설명한 바와 같이, 본 발명은 신규한 카페인산(caffeic acid) 유도체 및 이를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 본 발명의 신규한 카페인산(caffeic acid) 유도체는 우수한 혈관신생 억제효과를 가진다. 본 발명의 신규한 카페인산 유도체는 원물질인 카페인산과 비교하여 VEGF 유전자의 전사 활성을 억제하여 효과적으로 혈관신생을 억제한다. 이러한 VEGF 유전자의 전사 활성의 억제는 STAT3의 활성, 즉 STAT3 Tyr-705의 인산화 억제함으로써, 다양한 약리학적 활성을 발휘한다. 보다 상세하게는, 본 발명의 유효성분인 카페인산 유도체는 STAT3 Tyr-705의 인산화, STAT3 신호 경로, 핵 내 이동 , VEGF 프로모터상의 STAT3/HIF-1a/p300사이의 전사 단위 형성를 억제하고, VEGF에 의해 유도되는 혈관내피세포의 증식, 이동, 혈관형성 및 종양 성장을 억제한다. 또한, 본 발명의 카페인산 유도체를 유효성분으로 하여 약제학적, 기능성 화장료(cosmeceutical), 화장료, 기능성 식품(neutraceutical) 또는 식품 조성물을 제조할 수 있다. 또한, 상기 조성물은 혈관신생과 관련된 다양한 질병, 질환 또는 상태를 예방 또는 치료할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명 하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험재료 및 실험방법

실험재료 및 세포

카페인산(CA)을 CH Kim(성균관 대학교, 수원, 대한민국)으로부터 공급받았고, 500 mg/ml 스톡 농도의 디메틸술폭사이드(DMSO)에서 재현탁 하였으며, -20°C에서 보관하였다. 카페이산 유도체(CADPE)는 Imagene 사(대한민국)가 합성한 것을 이용하였고, 500 mg/ml 농도의 디메틸술폭사이드(DMSO)에서 재현탁 하였으며, -20°C에서 보관하였다. 이용하는 Caki-I 인간 신장암 및 COS7 멍키 신장 세포주를 종전 기재된 바와 같이 배양하였다(1).

웨스턴 블롯 및 분획 분석

웨스턴 블롯 분석을 종래 기재된 바와 같이 실시하였다 (1). 세포를 2회 세척한 다음 정지 완충액(10 mM Tris, pH 7.4, 10 mM EDTA, 5 mM EGTA, 0.1 M NaF, 0.2 M 수크로스, 100 ?M 소듐 오르토바나데이트 및 5 mM 소듐 피로포스페이트를 포함하고, 단백질분해효소 억제제가 보충됨)에서 스크래핑 하였다. 400 g, 4°C에서 10분 동안 원심분리한 후, Diagram's 완충액 A(10 mM HEPES (pH 7.9), 0.1 mM EDTA, 0.1 mM EGTA, 10 mM KCl, 및 1% NP-40를 포함하고, 1 mM DTT, 100 ?M 소듐 오르토바나데이트 및 단백질분해효소 억제제가 보충됨)에서 세포를 용해하였다. 용해액의 분획을 제거하고 4 x SDS 전기영동 완충액을 혼합하며 용해액에서 총 단백질을 검출하기 위하여 이용하였다. 남은 잔여물을 4°C에서 10분 동안 배양한 다음, 핵을 펠릿화하기 위하여 13,000 g, 4°C에서 2분 동안 원심분리 하였다. 상층액을 수집하고 세포질 단백질을 분석하고, 상기 펠릿을 완충액 A로 세척하였으며, 다시 원심분리 하였다. 수득한 상기 핵 펠릿을 Dignam's 완충액 C(20 mM HEPES, pH 7.9, 0.42 M NaCl, 1 mM EDTA, 0.1 mM EGTA, 1.0 mM DTT, 100 ?M 소듐 오르토바나데이트 및 단백질분해효소 억제제)로 재현탁한 다음, 볼텍스 하고 15분 동안 4°C에서 쉐이킹 하였다. 13,000 g 및 4°C에서 5분 동안 원심분리한 후, 상층액의 핵 단백질을 회수하였고 Dignam's 완충액 D(20 mM HEPES, pH 7.9, 20% glycerol, 0.1 M KCl, 1 mM EDTA, 0.1 mM EGTA, 1% NP-40, 1 mM DTT, 100 ?M 소듐 오르토바나데이트 및 단백질분해효소 억제제)와 혼합하였다.

일시적 형질전환 및 루시퍼라아제 분석

루시퍼라아제 분석을 종전 기재된 바와 같이 실시하였다 (1). 하기 컨스트럭트의 다양한 조합을 세포에 동시 형질전환 하였다; 24 bp의 이중가닥 올리고리보뉴클레오티드를 포함하는 STAT3 특이적 siRNA로서, 센스 가닥 5’-CAGCAAAGAAUCACAUGCCACUUU-3’(siRNA 1로 명명) 및 안티센스 가닥 5’-CCUGCAAGAGUCGAAUGUUCUCUAU-3’(siRNA 2로 명명); 도미넌트 네가티브 변이-STAT3YF(STAT3의 티로신 705 잔기를 페닐알라닌으로 치환하였음), 250 ng의 인간 VEGF 프로모터 리포터 플라스미드 m67과 관련한 야생형 STAT3(각 플라스미드 250 ng), 상기 서열은 인간 VEGF 유전자의 5’-인접 영역의 약 2.7 kb에 삽입되었다.

RT-PCR

RNA 분리 및 RT-PCR을 종전 기재된 바와 같이 실시하였다 (1). 다음의 VEGF에 특이적인 프라이머를 이용하여 PCR로 cDNA 단편을 증폭하였다; 센스 5’-AGGAGGGCAGAATCATCACG-3’및 안티센스 5’-CAAGGCCCACAGGGATTTTCT-3’.

크로마틴 항체침전법(ChIP) 분석

크로마틴 항체침전법을 종전 기재된 바와 같이 실시하였다 (16). 프로모터-특이적 프라이머는 인간 VEGF, 5’-AGACTCCACAGTGCATACGTG-3’및 5’-AGTGTGTCCCTCTGACAATG-3’을 포함하고, 이는 STAT3-결합 요소, HIF-1α-결합 요소에 인접한 235 bp 단편을 증폭한다.

ELISA

Quantikine 인간 VEGF 면역분석 키트(R&D Systems, Minneapolis, MN)를 이용하여 조건화 배지에서 VEGF 레벨을 결정하였고, 브래드포드 분석을 이용하여 결정한 바와 같이 총 단백질 함량과 비교하여 정규화 하였다.

혈관 형성 분석

Caki-I 세포를 1시간 동안 CA 또는 CADPE로 전처리 하거나 전처리 하는 것 없이 24시간 동안 저산소 상태에 노출하였다. 상층액에서 VEGF 생물학적 활성을 결정하기 위하여, 24시간 동안 저산소 또는 정상 산소 조건 하에서 CA 또는 CADPE의 존재/부존재에서 배양된 Caki-I 세포의 상층액에서 HUVECs를 14시간 동안 배양하였다. 내피세포에 의해 생성된 모세관-유사 네트워크 구조의 형성을 관찰함으로써 생물학적 활성을 평가하였다. 성장인자-결핍 마트리겔을 하룻밤 동안 4°C에서 녹였다. 그런 다음 메트리겔을 24/웰 플세포배양 접시(200 ?l/웰)에 넣고 최소 1시간 동안 37°C에서 고형화시켰다. HUVECs를 1.5시간 동안 RPMI 1640에서 혈청 없이 배양한 다음 RPMI 1640에서 재현탁 하였다. 재현탁된 HUVECs를 24-웰 플레이트(150,000 HUVECs/웰)에 놓았다. 또한, 모든 조건을 신선한 RPMI 1640로 보충하여 각 웰의 총 부피를 2 ml가 되게 하였다. 상기 플레이트를 14시간 동안 37°C에서 배양하였다. 혈관 형성을 관찰하였고, 올림푸스 디지털 카메라(New Hyde Park, NY)를 이용하여 디지털 사진 촬영 하였다.

인간 종양의 제노그래프트

웅성 누드(BALB/cAnNCrj-nu/nu) 마우스를 Charles River Japan Inc. (Shin-Yokohama, 일본)으로부터 구입하였다. 동물을 조절된 온도 및 습도하의 무균실에서 사육하였다. 모든 동물 사육 과정은 서울 국립 대학교 실험 동물 유지 매뉴얼에 기재된 방법에 따라 실시하였다. 25 마리, 7주령 마우스의 양 옆구리에 Caki-I 세포(5 x 10⁶, 피하)를 주입하였다. 그런 다음 마우스를 임의로 5 개 군 중 하나로 할당하였다. 첫 번째 군(n=5; 대조군)은 비히클(DMSO)로 처리하였다. 두 번째, 세 번째, 및 네 번째 군(n=5)은 종양의 크기가 100-150 mm³에 도달한 후(Caki-I 주입 후 약 15 일째), 4주 동안 3일 마다 CA(5 mg/kg, 복강 내) 또는 CADPE(5 mg/kg, 복강 내)을 주입 받았다. 종양을 2 또는 3 일 마다 캘리퍼스를 이용하여 2 차원적으로 측정하였고, 종양 부피는 a x b²/ 2 (여기서 a는 종양의 가장 넓은 지점의 너비이고 b는 a에 수직한 너비이다)를 이용하여 계산하였다.

종양 조직학 및 CD31 , p- STAT3 , 및 HIF -1α의 면역 염색

최종 CA, CADPE, 또는 비히클의 주입 이후, 마우스를 희생시키고 종양을 제거하였다. 종양을 포르말린으로 고정하고 파라핀으로 포매 시켰다. 연속 절편(6 μm 두께)을 각 파라핀 블록으로부터 절단하였다. 조직학적 평가를 하기 위하여 하나의 절편을 헤마톡실린-에오신으로 염색하였다. 다른 절편들을, p-STAT3, HIF-1α 및 내피세포 마커 CD31에 대하여 염색하였다. 절편의 파라핀을 제거하고, 알코올 농도 상승 순으로 재수화한 다음, 항원을 복원하기 위하여 마이크로파로 5분 동안 10 mM 소듐 사이트레이트(pH 6.0)에서 가열하였다. PBS(pH 7.4) 내 2.5% 우 혈청 알부민(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) 및 2% 정상 염소 혈청(Life Technologies)을 포함하는 용액으로 1시간 동안 비특이적인 부분을 블록킹 한 다음, 래빗 다클론 항-CD31 항체(블록킹 용액에 1:100으로 희석; Santa Cruz Biotechnology)와 4°C에서 하룻밤 동안 반응시켰다. 일차 항체가 없는 상태에서 음성 대조군 절편을 희석제(블록킹 용액)와 반응시켰다. 그 다음, 절편을 세척하고 적당한 바이오틴으로 표지된 이차항체와 반응시켰고, 아비딘-바이오틴-호스래디쉬 퍼옥시다아제복합체를 이용하여 결합된 항체의 위치를 결정하였다. 디아미토벤지딘을 최종 크로모겐으로 이용하였다. 제노그래프트 종양 마다 다른 절편을 분석하였다. 조직학적 평가를 위하여, p-STAT3-양성, HIF-1α-양성 세포, 및 CD31 양성 미세 혈관을 각각 400배, 400배, 및 600배 배율에서 확인하였고, 소니 XC-77 CCD 카메라 및 마이크로컴퓨터 이미지 장치 모델 4 이미지 분석 시스템을 이용하여 분석하였다. 각 이미지의 면적(mm²)당 면역양성 세포 및 혈관 프로파일(CD31 염색에 의해 확인함)의 수를 계산함으로써 HIF-1α 및 p-STAT3의 발현, 및 혈관 밀도를 측정하였다.

통계적 분석

모든 데이터를 마이크로소프트 엑셀 2000 소프트웨어(Microsoft Corp., Remond, WA)를 이용하여 분석하였다. 배양배지에서의 VEGF 레벨, p-STAT3 및 HIF-1α-양성 세포의 수, 및 혈관의 수를 비교하기 위하여 맨-휘트니 U 검정(SPSS, 버젼 10.0; Statistical Package for the Social Sciences, Chicago, IL)을 이용하였다. 분산 분석(ANOVA)에 이어 Duncan의 다중 범위 검정으로 무처리된 대조군, 및 CA 또는 CADPE가 처리된 군의 종양 부피를 비교하였다. 차이가 P<.05 인 경우, 통계학적으로 유의성이 있는 것으로 간주한다. 모든 통계학적 검정은 양측 검정이다.

실험 결과

CA 및 CADPE 는 저산소 -유도 STAT3 의 활성 및 핵으로의 위치 이동을 억제한다.

STAT3 Tyr-705의 인산화는 핵 내 이동 및 타깃 유전자상의 특이적 프로모터 서열 결합에 필요하기 때문에, Tyr-705의 인산화 블록킹은 인간 암의 STAT3 신호 경로를 억제하는 효과적인 방법을 제공한다. 따라서 본 발명자들은 Caki-I 세포를 이용하여 시험관 내 STAT3 인산화에 대한 CA 및 CADPE의 활성을 조사 하였다. 도 1a 및 도 1b에서 볼 수 있듯이, 티로신 705(Y705)에의 STAT3의 인산화는 저산소 상태에 따라 증가하였고, 농도-의존적으로 CA 또는 CADPE에 의해 감소하였다. 또한, 이러한 STAT3의 비활성화는 단백질 레벨의 감소에 의해 초래되지 않았다. 또한, CA 또는 CADPE의 세포독성 효과가 STAT3의 탈인산화에 영향을 줄 수 있다는 가능성을 배제하기 위해서, 본 발명자들은 MTT 분석을 이용하여 10-300 μM의 CA 또는 CADPE를 처리한 후에 세포 생존율을 평가하였다.

그 다음 본 발명자들은 CA 또는 CADPE가 핵으로의 STAT3의 위치 이동을 감소시켰는지 여부를 조사하였다. CA 및 CADPE의 저산소-유도 STAT3 위치 이동에 대한 억제 효과를 확인하기 위하여, 본 발명자들은 야생형 STAT3을 COS7(STAT3 결핍 세포주)로 형질 전환한 다음, 총 세포 추출물을 분획하여 핵 및 세포질 단백질을 얻었다. 그 다음 웨스턴 블롯팅을 항-STAT3 및 p-STAT3(Y705) 항체를 이용하여 실시하였다. 도 1c에서 볼 수 있듯이, 인산화된 STAT3은 저산소 상태에 따라 세포질에서 핵으로 위치 이동하였으나, 저산소성 자극에도 불구하고 100 μM의 CA 또는 30 μM의 CADPE를 전처리한 세포에서는 STAT3가 세포질에 남아있다. 또한, 본 발명자들은 핵 분획에서 라민 B의 발현을 확인하였다.

이상의 결과를 종합하면, CA 또는 CADPE는 STAT3의 핵 내 위치 이동을 위해 필요한 STAT3(Y705) 인산화를 억제하고, 핵으로의 STAT3의 저산소-유도 위치 이동을 억제한다.

CA 또는 CADPE 에 의한 STAT3 의 활성 파괴는 Src 티로신 키나아제를 억제함으로써 이루어진다.

STAT3 억제 기작을 확인하기 위하여, 본 발명자들은 STAT3의 몇몇 티로신 키나아제 업스트림 활성을 조사하였다. Src 티로신 키나아제는 Jak 및 STAT3 경로를 활성화하는 것으로 알려져 있고(17), Src 티로신 키나아제-유도 VEGF 발현은 마우스 3T3 섬유아세포에서 필요함이 밝혀졌다(8). 또한, STAT3은 췌장 및 전립선 암에서 Src-의존적 저산소-유도 VEGF 발현을 조절하는 것으로 보고 되어있다(18). Src 티로신 키나아제가 저산소 조건 하에서 HIF-1α 유도를 상향 조절하는 STAT3 신호 전달에 관련되어 있는지 여부를 명확히 하기 위하여, 본 발명자들은 웨스턴 블롯팅에 의해 저산소 조건 하의 STAT3 신호전달계를 조사하였다. 도 1d는 저산소 상태가 순서대로 Src(Y416), STAT3(Y705), 및 HIF-1α 유도를 증가시키고 있음을 보여준다. 흥미롭게는, 100 μM의 CA 또는 30 μM의 CADPE가 Src/STAT3/HIF-1α 경로를 크게 억제하였다.

Src가 저산소-유도 STAT3 활성의 업스트림 조절자 및 CA 또는 CADPE의 첫 번째 타깃인지를 확인하기 위하여, 본 발명자들은 Caki-I 신장암 세포를 Src의 구조적 활성형(Y527F) 또는 Src의 도미넌트 네가티브형(Y416F)으로 형질전환한 다음, 저산소 조건하에서 CA 또는 CADPE에 의한 STAT3 억제 및 HIF-1α 유도를 확인하였다. 본 발명자들은 심지어 CA 또는 CADPE가 세포에 전처리 되었음에도 불구하고 Src(Y527F)의 과발현된 활성형에서 STAT3 인산화 및 HIF-1α 유도를 확인하였다. 그러나, 본 발명자들은 Src(Y416F)의 과발현된 도미넌트 네가티브형에서 STAT3 인산화 및 HIF-1α 유도를 검출할 수 없었다(도 2e).

이러한 결과는 Src 티로신 키나아제는 저산소 조건 하에서 STAT3 매개 HIF-1α 유도를 위해 필요하고, CA 또는 CADPE에 의한 STAT3 활성의 파괴는 Src 티로신 키나아제 억제에 의해 이루어짐을 나타낸다.

CA 또는 CADPE 는 저산소 상태에 따라 STAT3 을 억제하고, VEGF 프로모터의 조절자가 작용하는 것을 억제함으로써 VEGF 의 전사 활성을 억제한다.

종전 연구에서, 본 발명자들은 STAT3가 신장암 세포의 저산소 조건하에서 HIF-1-매개 VEGF 발현을 상향-조절함을 알 수 있었다(1). 따라서 본 발명자들은 CA 또는 CADPE가 STAT3을 억제함으로써 VEGF 발현을 억제하는지 여부를 조사하였다. 우선, 본 발명자들은 인간 VEGF 유전자의 약 2.7 kb의 5’플랭킹 영역이 삽입된, m67(VEGF 프로모터 리포터 플라스미드)을 이용하여 Caki-I 세포에서 루시퍼라아제 분석을 실시하였다. 저산소 상태는 Caki-I 세포에서 리포터 활성(약 4배)을 증가시켰으나(도 2a, 처음 두 개의 컬럼), 100 μM CA 또는 30 μM CADPE로 전처리한 세포에서는 그러하지 아니하였다(도 2a, 세 번째 및 네 번째 컬럼). 그 다음, 본 발명자들은 STAT3 특이적 siRNA로 세포를 형질전환하고 VEGF 프로모터의 저산소-유도 리포터 활성을 평가하였으며, 이는 STAT3의 siRNA-매개 억제에 의해 크게 감소하였음을 알 수 있었다(도 2a, 다섯 번째 및 여섯 번째 컬럼). 또한, 상기 VEGF 프로모터의 리포터 활성은 STAT3YF(도미넌트 네가티브 STAT3)로 형질전환된 세포에서 크게 낮았다.

CA 또는 CADPE의 VEGF 전사 활성에 대한 억제 효과가 STAT3 억제 때문인지를 확인하기 위하여, 본 발명자들은 COS7 세포(STAT3-결손 세포주)를 이용하여 루시퍼라아제 분석을 실시하였다. 도 2b에서 볼 수 있듯이, 저산소 상태는 정상산소 상태에 비하여 VEGF 프로모터(약 5배) 리포터 활성을 유도하였고(처음 두개의 컬럼), 이는 HIF-1 때문이다. 왜냐하면, HIF-1 및 STAT3 모두 VEGF 발현을 조절하는데 관련되어 있기 때문이다(1). 그러나 100 μM CA 또는 30 μM CADPE를 처리한 후, COS7 세포에서는 VEGF 프로모터의 저산소-유도 리포터 활성이 감소하지 않았음을 알 수 있었고(도 2b, 세 번째 및 네 번째 컬럼), 이는 Caki-I 세포(STAT3-포함 세포주)에서의 관찰 결과와 대조적이다.

또한, COS7 세포에서 저산소-유도 리포터 활성은 mock 대조군과 비교하여 야생형 STAT3을 과발현 함으로써 보다 더 증가(약 2.5 배)하였다(도 2b, 두 번째 및 네 번째 컬럼). 흥미롭게는, 100 μM CA 또는 30 μM CADPE는 야생형 STAT3을 과발현하는 COS7세포에서 VEGF 프로모터의 저산소-유도 리포터 활성을 크게 억제하였고(도 2b, 네 번째, 여섯 번째 및 일곱 번째 컬럼), 반면에 CA 또는 CADPE에 의한 리포터 활성의 감소를 STAT3의 부존재하에서 관찰할 수 없었다.

Caki-I 세포에서 STAT3 단백질에 대한 웨스턴 블롯을 실시하여 STAT3 siRNA의 형질전환 효율을 조사하였다(도 2c). 흥미롭게는, siRNA를 이용한 STAT3의 방해는 저산소 상태에서 HIF-1α 단백질 레벨을 감소시켰다. RT-PCR을 이용하여 CA 또는 CADPE의 VEGF 유전자 발현에 대한 억제 효과를 추가적으로 조사하였다. Caki-I 세포를 CA 또는 CADPE로 전처리하거나 CA 또는 CADPE 없이 전처리한 다음, 저산소 상태에 두었다. 도 2d에서 볼 수 있듯이, CA 또는 CADPE는 농도-의존적으로 저산소-유도 VEGF mRNA 발현을 감소시켰다. 이러한 결과를 요약하면, CA 및 CADPE의 VEGF 발현에 대한 억제 효과는 STAT3 억제 때문이다.

상기 결과는 CA 또는 CADPE가 STAT3을 억제함으로써 VEGF의 저산소-유도 전사 활성을 감소시킴을 보여준다. 따라서 CA 또는 CADPE가 저산소 상태에 따라 VEGF 프로모터 상의 STAT3의 작용을 억제시키는지 여부를 명확히 하기 위하여, 본 발명자들은 크로마틴 면역침전 분석법을 실시하였다. 도 2e에서 볼 수 있듯이, 인간 VEGF 프로모터상의 STAT3의 증가된 결합을 저산소 상태에서 관찰하였다. 또한, 인간 VEGF 프로모터상의 HIF-1α 및 p300의 결합은 저산소 상태에서 증가하였다. 그러나 인간 VEGF 프로모터상의 이들의 결합은 100 μM CA 또는 30 μM CADPE로 전처리한 저산소 세포에서 감소하였다. 이러한 결과는 이전 발견(도 1c), 즉, CA 또는 CADPE는 핵으로의 저산소-매개 STAT3의 위치 이동을 억제한다는 사실과 일치한다.

이러한 결과를 종합하면, CA 및 CADPE 모두 STAT3의 작용 및 VEGF 프로모터상의 STAT3, HIF-1a, 및 p300사이의 전사 단위 형성을 블록킹 함으로써 VEGF 유전자의 전사를 억제한다.

CA 및 CADPE 는 마트리겔 기질 상에 VEGF 분비 및 HUVECs 혈관 형성을 억제한다.

CA 또는 CADPE의 혈관신생에 대한 억제 효과를 분석하기 위하여, 본 발명자들은 저산소 조건하에서 CA 또는 CADPE으로 전처리 하거나 CA 또는 CADPE 없이 전처리한 Caki-I 세포에 의해 분비된 VEGF의 양을 측정하였다. 도 3a에서 볼 수 있듯이, VEGF 분비는 오직 저산소 상태인 경우와 비교하여, 100 μM CA 또는 30 μM CADPE로 전처리한 세포에서 크게 감소하였다(도 3a, 두 번째, 세 번째 및 네 번째 컬럼). 또한, VEGF 분비는 siRNA-매개 STAT3 억제에 의해 크게 감소하였고(도 3a, 다섯 번째 및 여섯 번째 컬럼), STAT3YF(STAT3의 도미넌트 네가티브)로 형질전환한 세포에서 크게 감소하였다(도 4a, 일곱 번째 및 여덟 번째 컬럼).

그 다음, 본 발명자들은 CA 또는 CADPE의 항-혈관신생 활성을 확인하기 위하 여 혈관신생 과정을 미미킹 3-차원(3D) HUVECs 혈관 형성 분석법을 이용하였다. Caki-I 세포를 1시간 동안 100 μM CA 또는 30 μM CADPE로 또는 100 μM CA 또는 30 μM CADPE 처리 없이 24시간 동안 저산소 상태로 자극한 다음, 상층액을 수집하였다. 상기 상층액에서 VEGF의 생물학적 활성을 분석하기 위하여, HUVECs을 수집된 상층액에서 배양하고, 내피세포에 의한 모세관-유사 네트워크구조 형성을 평가하였다. HUVECs에 의한 혈관 형성은 100 μM CA 또는 30 μM CADPE 존재 하에서 감소하였음을 알 수 있었다(도 3b). 이러한 결과는 CA 및 CADPE 모두 저산소-유도 VEGF 분비를 억제하고, 이들은 항-혈관신생 활성을 가지고 있음을 입증한다.

CA 또는 CADPE 의 제노그래프트된 인간 종양의 발전에 대한 효과.

CA 및 CADPE의 관찰된 시험관 내 효과 때문에, 본 발명자들은 CA 또는 CADPE가 생체 내 STAT3를 억제함으로써 혈관신생 및 종양 성장을 억제하는지 여부를 조사하였다. 살아있는 Caki-I 세포(5 x 10⁶)를 마우스의 옆구리에 피하 주입한 다음, 임의로 세 개의 군 중 하나로 할당하였다. 첫 번째 군(n=5)은 대조군이고 비히클(DMSO)만을 주입하였다. 두 번째 및 세 번째 군(n=5)은 100-150 mm³의 종양을 측정(약 15일)한 후, CA(5 mg/kg) 또는 CADPE(5 mg/kg)를 4주 동안 3일 마다 복강 내 주입을 하였다. CADPE-처리 마우스의 종양은 CA 또는 비히클-처리 마우스의 종양보다 시각적으로 더 작았다(도 4a). 종양 크기의 변화를 측정하고, 시간 대 평균 종양 크기로 플로팅 하였다(도 4b). 종양이 안정된 뒤, CA 또는 CADPE가 처 리된 마우스에서 종양 성장은 정지하였다(비히클-처리군에 비교하여 P<.05). 그러나 CA- 또는 CADPE-처리군의 체중은 비히클-처리군과 비교하여 감소하지 않았다. 이러한 결과는 CA 또는 CADPE는 Caki-I 종양이 있는 마우스에서 종양 성장을 크게 억제함을 나타낸다.

누드 마우스의 Caki -I의 조직 병리학 및 면역조직화학.

CA 또는 CADPE의 종양 성장에 대한 억제 효과가 혈관신생 억제와 관련이 있는지 여부를 결정하기 위하여, 본 발명자들은 종양 조직에서 내피세포 마커 CD31의 분포를 분석하였다. CD31-면역양성 혈관을 CA 또는 CADPE 처리 마우스의 종양 절편에서 거의 관찰하지 못하였으나, 비히클-처리 마우스의 종양 절편에서 많은 혈관을 관찰하였다(도 5a, 상 패널). 본 발명의 시험관 내 데이터에서 볼 수 있듯이, STAT3는 혈관신생에서 중요하므로, 본 발명자들은 비히클-, 및 CA- 또는 CADPE-처리 마우스의 종양 절편에서 STAT3의 활성을 평가하였다. 비히클-처리 마우스의 Caki-I 종양은 많은 p-STAT3 면역반응 세포를 보여주었으나(도 5a, 중 패널), 반대로 CA 또는 CADPE 처리 마우스의 종양 절편은 p-STAT3 면역반응 세포를 거의 보여주지 않았다.

흥미롭게는, CA 또는 CADPE 처리 마우스의 종양 절편은 상기 종양이 저산소 상태에 있고 고형암 임에도 불구하고 HIF-1α 단백질을 거의 보여주지 않았다(도 5a, 하 패널). 이러한 결과는 STAT3가 저산소 조건하에서 HIF-1α 단백질의 안정성을 상향-조절한다는 이전 결과와 일치한다. 본 발명자들은 비히클-, 및 CA 또 는 CADPE- 처리 마우스의 종양 절편에서 p-STAT3-양성, HIF-1α-양성 세포, 및 CD31-양성 혈관의 수를 정량화하였다(도 5b). HIF-1α, p-STAT3 면역반응 세포, 및 혈관 형성의 레벨은 비히클-처리 마우스보다 CA 또는 CADPE를 처리한 마우스에서 크게 낮았다.

Caki-I 종양에서 CA 및 CADPE의 STAT3에 대한 억제효과를 재확인하기 위하여, 본 발명자들은 항-포스포-STAT3(Y705) 항체를 이용하여 웨스턴 블롯팅으로 Caki-I 종양 용해액에서 STAT3의 인산화를 조사하였다. STAT3(Y705) 인산화 레벨은 비히클-처리 종양에서보다 CA- 또는 CADPE-처리 마우스 유래의 종양 용해액에서 현저하게 낮음을 알 수 있었다. 또한, HIF-1α 발현은 비히클-처리 종양에서보다 CA- 또는 CADPE-처리 종양에서 낮았다(도 5c). 또한, VEGF mRNA 레벨은 비히클-처리 종양에서 보다 CA- 또는 CADPE-처리 종양에서 낮았다(도 5d).

이러한 결과를 요약하면, CA 또는 CADPE에 의한 STAT3의 억제는 HIF-1α 및 VEGF 발현을 감소시키고, Caki-I 종양에서 종양 성장 및 혈관신생을 블록킹한다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

참고문헌

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도 1a-1e는 CA 및 CADPE 모두 STAT3의 저산소-유도 인산화 및 핵으로의 위치 이동을 억제하는 것을 보여준다. CA는 카페인산(caffeic acid), CADPE는 이의 합성 유도체(3-(3,4-디하이드록시-페닐)-아크릴산 2-(3,4-디하이드록시-페닐)-에틸 에스테르)), 및 STAT3은 전사 신호 전달 및 활성 인자 3(signal transducer and activator of transcription 3)을 나타낸다. 도 1a 및 도 2a에서, Caki-I 세포를 정상산소(20% O₂ vol/vol) 또는 저산소(1% O₂ vol/vol) 조건 하에서 3시간 동안 배양하기 전에, 표시된 농도의 CA(도 1a) 또는 CADPE(도 1b)로 1시간 동안 처리하였다. STAT3의 인산화 및 STAT3의 발현을 anti-pSTAT3(Y705) 및 anti-STAT3를 이용하여 면역블롯팅으로 분석하였다. 도 1c에서, COS7 세포를 ml당 1 x 10⁶ 세포 밀도로 세포배양 접시에 플레이팅 하였다. 세포를 24시간 동안 STAT3으로 과발현한 다음, 1시간 동안 100 μM CA 또는 30 μM CADPE로 처리하고 3시간 동안 정상산소(20% O₂ vol/vol) 또는 저산소(1% O₂ vol/vol) 조건에서 배양하였다. 그 다음 세포를 세포질 및 핵 단백질로 분리하였다. STAT3 인산화, 및 STAT3과 라민 B의 발현을 anti-pSTAT3(Y705), anti-STAT3 및 anti-Lamin B를 이용하여 면역블롯팅으로 분석하였다. 도 1d에서, Caki-I 세포를 표시된 시간동안 정상산소(20% O₂ vol/vol) 또는 저산소(1% O₂ vol/vol) 조건 하에서 배양하기 전, 1시간 동안 100 μM CA 또는 30 μM CADPE로 처리하였다. Src 및 STAT3의 인산화, 및 STAT3의 발현 을 anti-Src(Y416), anti-STAT3(Y705) 및 anti-STAT3으로 면역블롯팅 함으로써 분석하였다. 도 1e에서, ml 당 1 x 10⁶으로 Caki-I 세포를 세포배양 접시에 플레이팅 하였다. Src의 활성형(Y527F) 또는 Src의 도미넌트 네가티브형(Y416F) plasmid DNA를 Lipofectamine™을 이용하여 세포에 transfection하고, 세포를 1시간 동안 100 μM CA 또는 30 μM CADPE로 처리하였다. 그 다음 세포를 정상산소 또는 저산소 조건 하에서 3시간 동안 배양하였다. Src 및 STAT3의 인산화, 및 STAT3의 발현을 anti-Src(Y416), anti-STAT3(Y705) 및 anti-STAT3을 이용하여 면역블롯팅으로 분석하였다.

도 2a-2e는 CA 및 CADPE가 저산소 상태에 따라 전사 활성 및 VEGF 프로모터에 조절자가 작용하는 것을 억제하는 것을 보여준다. VEGF는 혈관 내피 성장 인자(vascular endothelial growth factor) 및 HIF-1α는 저산소 유도 인자-1α(hypoxia inducible factor-1α)를 나타낸다. 도 3a 및 도 3b에서, Caki-I(도 3a) 또는 COS7(도 3b) 세포를 웰 당 4 x 10⁴ 세포의 밀도로 24-웰 플레이트 상에 씨딩 하였다. VEGF 리포터 plasmid DNA를 Lipofectamine™을 이용하여 세포에 STAT3의 특이적 siRNA 또는 도미넌트 네가티브 STAT3 (STAT3YF) 또는 야생형 STAT3(STAT3WT)의 조합으로 동시에 형질전환 하였다. 그 다음 세포를 정상산소 또는 저산소 조건 하에서 24시간 동안 배양하기 전, 1시간 동안 100 μM CA 또는 30 μM CADPE로 처리하였다. 그 다음 세포를 용해하고 루시퍼라아제 분석법을 실시하였다. 데이터는 4개의 독립된 실험 결과에 대한 평균± SD이다. 도 2c에 서, Caki-I 세포를 STAT3-특이적 siRNA로 형질전환하고 24시간 동안 정상산소 또는 저산소 조건 하에서 24시간 동안 배양하였다. STAT3, HIF-1α 및 β-액틴의 발현을 anti-STAT3, anti-HIF-1α 및 anti-β액틴 항체를 이용하여 면역블롯팅 으로 분석하였다. 도 2d에서, Caki-I 세포를 1시간 동안 50 또는 100 μM CA, 또는 15 또는 30 μM CADPE로 전처리한 다음, 24시간 동안 저산소 상태에 노출하였다. RT-PCR(Reverse transcriptase-polymerase chain reaction)을 VEGF 및 β액틴에 대한 특이적 프라이머를 이용하여 실시하였다. 도 2e에서, Caki-I 세포를 1시간 동안 100 μM CA 또는 30 μM CADPE를 처리한 다음, 정상산소 또는 저산소 조건 하에서 3시간 동안 배양하였다. 그 다음 세포를 포름알데히드로 고정하였다. 가용성 크로마틴 시료를 하룻밤 동안 4℃에서 anti-STAT3, anti-HIF-1α 또는 anti-p300 항체로 면역침전 하였다. 그 다음 면역침전된 물질로부터 분리된 DNA를 PCR을 이용하여 증폭하였다. 프로모터-특이적 프라이머는 인간 VEGF, 5’-AGACTCCACAGTGCATACGTG-3’및 5’-AGTGTGTCCCTCTGACAATG-3’를 포함하고, 이는 STAT3-결합 요소, HIF-1α-결합 요소에 인접한 235 bp 단편을 증폭한다.

도 3a-3b는 CA 및 CADPE가 메트리겔 기질상의 VEGF 분비 및 HUVECs 혈관 형성을 크게 억제하는 것을 보여준다. HUVECs은 인간 탯줄 혈관 내피세포(human umbilical vein endothelial cell)를 나타낸다. 도 3a에서, Caki-I 세포를 24시간 동안 STAT3에 특이적 siRNA 또는 STAT3YF로 형질전환하거나, 100 μM CA 또는 30 μM CADPE로 처리하였다. 조건화 배지(conditioned media)에서 Caki-I 세포의 VEGF 단백질의 양은 ELISA 키트를 이용하여 측정하였다. 상기 Caki-I 세포는 CA 또는 CADPE로 처리하거나 STAT3YF 또는 siRNA로 형질전환하고, 24시간 동안 정상산소 또는 저산소 조건 하에서 배양하였다. VEGF 농도는 상기 분석 키트에 포함된 일련의 VEGF 표준 시료와 비교하여 2배로 정량화 하였다. 바(Bar)는 4개의 독립된 실험 결과의 평균 및 95% 신뢰 구간을 나타낸다. ^*는 정상산소 조건 하에서 배양된 세포의 상층액 대조군과 비교하여 유의적인 차이가 있음을 나타낸다(P<0.001); #은 저산소 조건 하에서 배양된 세포의 상층액 대조군과 비교하여 유의적인 차이가 있음을 나타낸다(P<0.001). 도 3b에서, 성장 인자-결핍 메트리겔을 예냉 피펫팁 및 세포배양 접시를 이용하여 24-웰 세포배양 접시에 넣었다. 저산소 상태에 이르기 전, 1시간 동안 100 μM CA 또는 30 μM CADPE로, 또는 CA 또는 CADPE 처리 없이 저산소 자극을 주지 않거나 혹은 자극을 주지 않은 Caki-I 세포의 상층액에서 HUVECs을 14시간 동안 배양하였다. 14시간 동안 37℃에서 플레이트를 반응시킨 후 내피세포에 의한 모세관-유사 네트워크 구조 형성을 평가함으로써 생물학적 활성을 결정하였다. 올림푸스 디지털 카메라를 이용하여(New Hyde Park, NY) 디지털 사진 촬영 하였다.

도 4a-4b는 CA 및 CADPE의 제노그래프트된 인간 종양의 성장에 대한 효과를 보여준다. 도 4a에서, Caki-I 신장암 세포(5 x 10⁶)를 웅성 누드 마우스의 옆구리에 피하 주입하였다. 종양의 크기가 100-150 mm³에 이른 후(약 15일), 마우스를 4주 동안 CA(5 mg/kg), CADPE (5 mg/kg) 또는 비히클(DMSO)로 3일 마다 복강 내 주입하였다. 도 4b에서, 비히클- 및 CA- 또는 CADPE-처리군의 종양 크기간의 차이 점을 편차 분석을 이용하여 비교하였다. 데이터는 평균± SEMs를 나타낸다; ^*는 대조군과 비교하여 P < 0.05를 나타낸다. 솔리드 다이아몬드는 비히클, 솔리드 삼각형은 CA 및 솔리드 사각형은 CADPE를 나타낸다. 데이터 포인트는 평균을 나타낸다(대조군 n=5; CA n=5; CADPE n=5 ).

도 5a-5d는 누드 마우스에서 성장한 Caki-I 종양의 조직병리학 및 면역조직화학을 보여준다. 도 5a에서, Caki-I 신장암 세포(5 x 10⁶)를 웅성 누드 마우스의 옆구리에 피하 주입하였다. 종양의 크기가 100-150 mm³에 이른 후(주입 후 15일), 마우스에 4주 동안 3일 마다 CA(5 mg/kg, 복강 내), CADPE(5 mg/kg, 복강 내) 또는 비히클(DMSO)을 주입하였다. 그 다음 마우스를 안락사 시키고 종양을 제거하여 포르말린으로 고정시키고 파라핀으로 포매시켰다. 파라핀 블록으로부터 종양 절편을 절단하고 내피세포를 검출하기 위하여 anti-CD31 항체 또는 anti-pSTAT3 항체 또는 anti-HIF-1α 항체로 면역조직화학 염색을 하였다. 도 5b에서, STAT3 인산화, HIF-1α 발현 및 혈관 밀도의 정량. 제노그래프트 당 두 절편(절편 당 5-10 필드)에 대하여 조직학적 평가를 하였다. (5개의 대조군, 5개의 CA 및 5개의 CADPE-처리 제노그래프트군을 조사하였음). 바(Bar)는 평균 및 낮거나 높은 95% 신뢰 구간을 나타낸다. 처리군 간의 차이점의 통계학적 유의성은 맨-휘트니 U 검정을 이용하여 비교하였다. 에러 바(bar) 위의 수는 대조군 관련하여 P 값의 차이를 나타낸다. 도 5c에서, 최종 처리 후, 마우스를 안락사 시키고, 종양을 제거하여 면역블롯팅을 하기 위하여 용해액(lysates)을 준비하였다. 비히클-처리 마 우스 및 CA- 및 CADPE-처리 마우스의 종양 용해액을 STAT3 인산화를 위하여 평가하였다. 도 5d에서, 종양 용해액에서 VEGF 및 β-액틴의 mRNA 레벨을 RT-PCR로 측정하였다.

Claims (9)

1. 하기 화학식 1로 표시되는 카페인산(caffeic acid) 유도체를 유효성분으로 포함하는 혈관신생 억제용 조성물로서, 상기 조성물은 각막 이식 거부, 신생혈관 녹내장, 증식성 망막증, 당뇨병성 망막증, 미숙아 망막증, 암, 건선, 혈우병성 관절, 켈로이드, 상처 과립화, 혈관 접착, 류마티스 관절염, 골관절염, 자가면역 질환, 아토피, 알러지, 크론씨병, 재발협착증, 아테롬성 동맥경화, 장관 접착, 궤양, 사구체신염, 당뇨병성 신장병증, 악성 신경화증, 기관 이식 거부, 신사구체병증, 당뇨병, 염증 또는 신경퇴행성 질환의 치료 또는 예방을 위한 조성물인 것을 특징으로 하는 혈관신생 억제용 조성물:

   화학식 1

   

   상기 화학식 1에서, R₁, R₂, R₃ 및 R₄는 각각 수소이다.
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제
6. 제 1 항에 있어서, 상기 유효성분은 VEGF(vascular endothelial growth factor) 유전자의 전사 활성을 억제하여 혈관신생을 억제하는 것을 특징으로 하는 조성물.
7. 제 6 항에 있어서, 상기 유효성분은 저산소-유도 STAT3(signal transducer and activator of transcription 3)의 활성을 억제하고 VEGF 프로모터의 조절자가 작용하는 것을 억제하여 VEGF의 전사 활성을 억제하는 것을 특징으로 하는 조성물.
8. 삭제
9. 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 약제학적 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.

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