JP6758279B2

JP6758279B2 - ケモカインを含む皮膚美白用組成物

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Publication number: JP6758279B2
Application number: JP2017504075A
Authority: JP
Inventors: ウンキュンリ; ジヨンハン; ウンギュンチョ; テリョンリ; ヒュンジュンチェ
Original assignee: Amorepacific Corp
Current assignee: Amorepacific Corp
Priority date: 2014-07-31
Filing date: 2015-07-24
Publication date: 2020-09-23
Anticipated expiration: 2035-07-24
Also published as: WO2016018001A1; CN106572956A; EP3162358A1; CN106572956B; JP2017523177A; TWI680770B; KR102152637B1; EP3162358A4; US20170209358A1; KR20160015745A; TW201603826A; EP3162358B1; US10045926B2

Description

本発明はケモカイン（ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ）、特にＩＴＡＣ（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅＴ−ｃｅｌｌａｌｐｈａｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ；インターフェロン誘導性Ｔ細胞α走化性因子）を含有することによりメラニン形成細胞でメラニン色素生成関連因子の遺伝子発現を減少させて皮膚美白効果を奏することができる組成物に関する。

メラニン形成細胞は、皮膚表皮の基底膜（ｂａｓａｌｅｐｉｄｅｒｍｉｓ）に存在し、ＵＶのような外部因子によってメラニン色素を生成して生成されたメラニン色素を周辺角質細胞に伝達し、それにより、該角質細胞のＤＮＡ損傷を抑制する役割を果たす。しかし、このようなメラニン形成細胞の活性は、遺伝的要因、ホルモン及び各種疾病要因によって非正常的に調節されて、正常な色素生成段階を脱して色素の過剰な生成及び過剰な増殖を引き起こし、それによって、シミやほくろのような過色素性疾患を発生させたり白斑症などの低色素疾患の要因となる。

過剰なメラニン形成細胞の活性化は、紫外線などの外部の刺激に慢性的に露出されることによってメラニン色素の生成において恒常性が崩れた状態である。皮膚は精巧に調節される免疫器官として、各種サイトカイン、ケモカイン、その他の炎症媒介物質を分泌する。紫外線はこのような皮膚を構成する免疫細胞、例えば、角質形成細胞、大食細胞、Ｔ細胞などを刺激して免疫物質の分泌を誘導する。このような免疫物質は、メラニン形成細胞の周りを取り囲んでいる微細環境に免疫細胞を集積させて慢性炎症状態を作るだけでなく、メラニン形成細胞の増殖、移動、メラニン色素の過剰な生成などのメラニン細胞自体にも影響を及ぼす。一般的に、免疫媒介物質としてよく知られているサイトカインは、アトピー、接触性皮膚炎などの皮膚生理に重要な役割を果たしていることが既によく知られている。一方、約８〜１４ｋＤの大きさの小さい免疫反応媒介物質であって、周辺の細胞に選択的な走化性を表して細胞の移動及び標的器官への集積を誘導する機能を有するケモカインは、皮膚生理においてその役割がよく知られていない。同様に、メラニン形成細胞の超活性化による過色素性疾患を調節するための免疫調節療法のために、多様な免疫物質に対する研究が行われているが、皮膚の免疫細胞由来因子であると同時にケモカインであるＩＴＡＣがメラニン形成細胞に直接的に及ぶ影響は、よく知られていない。

感染や内外部的な傷によって発生する免疫反応は、非常に精密な調節機構であることがよく知られている。しかし、このような免疫系の精密な調節能力に問題が発生する場合、慢性炎症が発生し、このような微細環境の変化は周辺細胞の活性などに影響を及ぼす。最近では、免疫反応を媒介するサイトカインの変化が後成遺伝体パターンを変化させて遺伝子を変化させるという報告があり、後成遺伝体調節物質を通じる慢性炎症、さらに、炎症による癌の治療に対する研究が活発に行われている。しかし、ケモカインによるメラニン形成細胞自体、或いは細胞周辺の微細環境調節に対する後成遺伝的なアプローチは全くない状態である。

韓国特許公開第１０−２０１３−００５６９５５号（公開日：２０１３年５月３１日）

本発明者は免疫系の調節を通じてメラニン形成細胞の活性または細胞周辺の微細環境を調節することができる方法を見つけようとして、ケモカインの中で、特にＩＴＡＣを処理することにより、メラニン形成細胞の活性化を調節することができることを見出して、本発明の完成に至った。

そこで、本発明は、ケモカインを利用してメラニン形成細胞の活性化を調節することにより、皮膚美白効果を表す組成物を提供することを目的とする。

上述した目的を達するために、本発明は、インターフェロン誘導性Ｔ細胞α走化性因子を含有する皮膚美白用の組成物を提供する。

本発明の組成物は、メラニン形成細胞の活性化を調節することにより皮膚の美白効果を提供することができ、さらには、シミまたはほくろのような過色素性皮膚疾患の症状を緩和及び治療することにも効果的である。

図１は、ＩＴＡＣを処理したヒトメラニン形成細胞でのメラニン色素生成関連因子の遺伝子発現が減少した結果を表すグラフである。図２は、ＩＴＡＣを処理したヒトメラニン形成細胞でのＨＤＡＣ５の遺伝子発現とタンパク質量、そしてＨＤＡＣ５の酵素活性が増加した結果を表すグラフである。図３は、ＨＤＡＣ５過剰発現システムを取り入れたヒトメラニン形成細胞でメラニン色素の形成が減少した結果を表すグラフである。

本発明は、メラニン形成細胞の活性化を調節して、メラニン色素生成関連因子の遺伝子発現を調節することにより、皮膚の美白効果を提供することができる組成物に関するもので、本発明の組成物は、ケモカイン、特にＩＴＡＣ（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅＴ−ｃｅｌｌａｌｐｈａｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ；インターフェロン誘導性Ｔ細胞α走化性因子；配列番号１）を有効成分として含有する。

本発明で用いられるＩＴＡＣは、多数の適当な起源（例えば、ヒト組み換えＩＴＡＣ、Ｒ＆Ｄシステムの製品番号６７２−ＩＴ）から手に入れることができる。これは組み換えＤＮＡ方法論、例えば、多量の純粋なヒトＩＴＡＣの生産を許容しながら、ヒトＩＴＡＣを暗号化する遺伝子がクローニングされて宿主システムで発現される方法によって生産されることができる。生物学的に活性であるＩＴＡＣの構成単位または断片も、本発明で使用することができる。

本発明の組成物は、有効成分として用いられるＩＴＡＣを、組成物の総重量に対して０．０００１〜０．０００５重量％の量で含有する。０．０００１重量％未満で含有されると、皮膚の美白のためにチロシナーゼの活性を阻害させるのに不十分であり、０．０００５重量％を超えて含有されると、他の成分の含有及び剤形化に適切でない。

本発明による組成物は、優れた皮膚美白効果を提供し、また過色素性皮膚疾患、例えば、シミまたはほくろの症状、にきびなどの炎症後の色素沈着を緩和及び治療することにも効果的である。

本発明による組成物については、皮膚外用剤組成物として、通常の外用製剤、化粧料剤形または薬学剤形に剤形化することができる。

本発明による組成物については、化粧品学または皮膚科学的に許容可能な媒質または基剤を含んで剤形化することができる。これは、局所適用に適切な全ての剤形として、例えば、溶液、ゲル、固体、ペースト無水生成物、水相に油相を分散させて得たエマルジョン、懸濁液、マイクロエマルジョン、マイクロカプセル、微粒剤もしくはイオン型（リポソーム）及び非イオン型の小胞分散剤の形態で、またはクリーム、スキン、ローション、パウダー、軟膏、スプレーもしくはコンシールスティックの形態で提供することができる。また、泡沫（ｆｏａｍ）の形態または圧縮された推進剤をさらに含有したエアロゾル組成物の形態でも用いることができる。これらの組成物については、本発明が属する技術分野において通常の方法によって製造することができる。

また、本発明による組成物については、脂肪物質、有機溶媒、溶解剤、濃縮剤、ゲル化剤、軟化剤、抗酸化剤、懸濁剤、安定化剤、発泡剤（ｆｏａｍｉｎｇａｇｅｎｔ）、芳香剤、界面活性剤、水、イオン型もしくは非イオン型乳化剤、充填剤、金属イオン封鎖剤、キレート化剤、保存剤、ビタミン、遮断剤、湿潤化剤、必須オイル、染料、顔料、親水性もしくは親油性活性剤、脂質小胞、または化粧品に通常用いられる何れの他の成分の化粧品学もしくは皮膚科学の分野で通常的に用いられる補助剤を含むことができる。上記補助剤は、化粧品学または皮膚科学の分野で一般的に用いられる量で導入される。

また、本発明による組成物については、薬学的に許容可能な適切な担体、賦形剤及び希釈剤をさらに含有して薬学組成物として剤形化することができる。

本発明の薬学的投与形態は、特に制限されるのではないが、単独または他の薬学的活性化合物と組み合わせて用いることができる。

本発明による薬学組成物については、それぞれ通常の方法によってローション、軟膏、ゲル、クリーム、パッチ、スプレーのような経皮投与型剤形を含めて、薬剤学的製剤に適切な何れの形態でも剤形化して用いることができる。

本発明の薬学組成物の好ましい投与量については、対象者の年齢、性別、体重、症状、疾病の程度、薬物形態、投与経路及び期間によって異なるが、当業者によって適切に選択することができる。好ましい効果のために、本発明の薬学組成物は、１日に１ｍｇ／ｋｇ〜５０００ｍｇ／ｋｇの範囲で投与することができるが、これに制限されるものではない。投与は一日に一回にすることもでき、数回分けて投与することもできる。また、その投与量については、年齢、性別、体重、疾病の程度、投与経路などによって増減することができる。従って、上記投与量は、何れの面であれ本発明の範囲を限定するのではない。

また、本発明の組成物については、皮膚美白効果を増加させるために皮膚吸収促進物質を含有することができる。

以下、本発明の内容を、実施例及び試験例を通じてより具体的に説明する。これら実施例は、本発明の内容を理解するために提示されるだけであり、本発明の権利範囲がこれらの実施例及び試験例に限定されるのではなく、本発明が属する技術分野において通常周知された変形、置換及び挿入などを行うことができ、これに対するものも本発明の範囲に含まれる。

［参考例１］メラニン形成細胞の準備
Ｃａｓｃａｄｅ社から購入したヒトメラニン形成細胞（ＮｏｒｍａｌＨｕｍａｎＥｐｉｄｅｒｍａｌＭｅｌａｎｏｃｙｔｅ−Ｍｏｄｅｒａｔｅｌｙｐｉｇｍｅｎｔｅｄ、製品番号Ｃ−１０２−５Ｃ）を、１００ｃｍ^２のプレートに６×１０^５個を植え、基本培地はＨＭＧＳ（ＨｕｍａｎＭｅｌａｎｏｃｙｔｅＧｒｏｗｔｈＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔ；製品番号Ｓ−００２−５、Ｇｉｂｃｏ）を含む２５４培地（製品番号Ｍ−２５４−５００、Ｇｉｂｃｏ）を用い、３７℃で、５％のＣＯ_２インキュベーターで培養した。約７０〜８０％の密度になったとき継代培養をし、その後に行われる実験に、継代培養したメラニン形成細胞を提供した。

［試験例１］ＩＴＡＣによるヒトメラニン形成細胞のメラニン色素生成関連因子の遺伝子発現減少の有無
ＩＴＡＣによってメラニン形成細胞の色素生成が減少されるか否かを確認するために、ヒトメラニン形成細胞にＩＴＡＣを処理した。ＩＴＡＣはＲ＆Ｄシステムで製造した製品番号６７２−ＩＴを利用した。

上記参考例１で培養されたヒトメラニン形成細胞に、ＩＴＡＣを２００ｎｇ／ｍｌの濃度で処理し、対照群には何も処理しない（ｎｏｎ−ｔｒｅａｔｅｄ）メラニン細胞を利用して、３７℃で、５％のＣＯ_２で４８時間培養した。上記培養されたヒトメラニン細胞の総ｍＲＮＡを抽出してｃＤＮＡを合成し、合成されたｃＤＮＡを利用してリアルタイムＰＣＲ（Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅＰＣＲ、アプライドバイオシステムズ、７５００Ｆａｓｔ）を行った。リアルタイムＰＣＲ実験については、９５℃で１５秒、６０℃で６０秒間のサイクルを合計４０回繰り返して行い、対照群の遺伝子発現に比べて該遺伝子の発現がどれぐらい増加したのか、相対的な値を測定した。代表的なメラニン色素生成促進因子であるチロシナーゼ（ＴＹＲ）、ＭＩＴＦ、ＴＹＲＰ１、ＤＣＴ、ＭＡＲＴ１、ｇｐ１００プライマーを利用して、サンプルの間の相対的な遺伝子発現の差を測定した。プライマーはアプライドバイオシステムズで製造したＴａｑＭａｎ製品であり、それぞれ次の通りである：チロシナーゼ（ＴＹＲ、製品番号：Ｈｓ０１０９９９６５＿ｍ１）、ＭＩＴＦ（製品番号：Ｈｓ０１１１７２９４＿ｍ１）、ＴＹＲＰ１（製品番号：Ｈｓ００１６７０５１＿ｍ１）、ＤＣＴ（製品番号：Ｈｓ０１０９５８５６＿ｍ１）、ＭＡＲＴ１（製品番号：Ｈｓ００１９４１３３＿ｍ１）、ｇｐ１００（ＰＭＥＬ、製品番号：Ｈｓ００１７３８５４＿ｍ１）。測定結果は図１に表した。

図１に表した結果を通じて、ＩＴＡＣの処理によって色素生成促進因子の遺伝子発現量が減少し、特にチロシナーゼ（ＴＹＲ）、ＴＹＲＰ１、ＤＣＴ、ＭＡＲＴ１、ｇｐ１００の発現量が有意的に減少することを確認した。これを通じて、このような機構でＩＴＡＣがメラニン色素生成阻害能を有することが分かる。

［試験例２］ＩＴＡＣによるヒストン脱アセチル化酵素であるＨＤＡＣ５の発現量及び酵素活性の増加
上記参考例１で培養されたヒトメラニン形成細胞に、５０ｎｇ／ｍｌのＩＴＡＣ（製品番号６７２−ＩＴ、Ｒ＆Ｄシステム）を４８時間処理した。これから分離したＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、ＨＤＡＣ５（Ｈｉｓｔｏｎｅｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ５；ヒストン脱アセチル化酵素）のプライマーを利用して、Ｑ−ＰＣＲ（アプライドバイオシステムズ、７５００Ｆａｓｔ）でｍＲＮＡ量の変化を測定した。Ｑ−ＰＣＲの実験については、９５℃で１５秒、６０℃で６０秒間のサイクルを合計４０回繰り返し、対照群の遺伝子発現に比べて該遺伝子の発現がどれぐらい増加したのか、相対的値を測定した。上記実験に利用したＨＤＡＣ５プライマーは、アプライドバイオシステムズで製造したＴａｑＭａｎ製品で、製品番号：Ｈｓ００６０８３６６＿ｍ１を利用した。

測定結果を表した図２のＡによれば、何も処理しない対照群に比べて、５０ｎｇ／ｍｌのＩＴＡＣを処理した場合は、ＨＤＡＣ５のｍＲＮＡの発現量を顕著に増加させることが分かる。

また、上記参考例１で培養されたヒトメラニン形成細胞に５０ｎｇ／ｍｌのＩＴＡＣ（製品番号６７２−ＩＴ、Ｒ＆Ｄシステム）を４８時間処理した。上記細胞の溶解物３０μｇをローディングしてウエスタンブロット（ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ）でＨＤＡＣ５のタンパク質の発現量を確認した。

これに対する結果を表した図２のＢによれば、対照群であるＧＡＰＤＨの発現においては変化が現れなかったが、ＩＴＡＣを処理した場合はＨＤＡＣ５のタンパク質発現量が顕著に増加したことを確認することができる。

また、ＩＴＡＣによるＨＤＡＣ５のｍＲＮＡとタンパク質の量の増加が実際の酵素活性に及ぶ影響を検証するために、上記参考例１で培養されたヒトメラニン形成細胞に５０ｎｇ／ｍｌまたは２００ｎｇ／ｍｌのＩＴＡＣ（製品番号６７２−ＩＴ、Ｒ＆Ｄシステム）を４８時間処理した後、溶解物を製造した。上記細胞の溶解物については、実験直前まで低温を保持して酵素活性を保持するようにした。ＨＤＡＣ分析のための助剤バッファー（ＨＤＡＣアッセイバッファー）１０μｌ或いは対照群であるＨＤＡＣ阻害剤ＴＳＡ（トリコスタチンＡ、ＴｒｉｃｈｏｓｔａｔｉｎＡ）４μＭが含有された助剤バッファー１０μｌを、９６ウェルプレート（ｗｅｌｌｐｌａｔｅ）に分注した。細胞溶解物２０μｌを添加した後、最大酵素活性が現われるように３７℃のインキュベーターで約１０分間保管した。４ｍＭの基質を１０μｌ入れて１時間反応させた。２０μｌの酵素活性増幅バッファー（ａｃｔｉｖａｔｏｒｓｏｌｕｔｉｏｎ）を入れて、常温で２０分間反応させた後、４０５ｎｍで吸光度を測定した（ＢｉｏＴｅｋ、Ｓｙｎｅｒｇｙ２）。この時、対照群対比活性（％）で酵素活性を定量的に算出した。一方、この実験系では、広範囲ＨＤＡＣ阻害剤であるＴＳＡが含まれた実験群でＨＤＡＣ５酵素活性が７０〜１００％阻害される時、本実験系が効果的に作動したと判断した。ＨＤＡＣ５酵素活性の測定はアップステートで製造したＨＤＡＣアッセイキット（１７−３７４）を利用して測定した。

測定結果を表した図２のＣによれば、ＩＴＡＣは、本発明で利用した５０〜２００ｎｇ／ｍｌの範囲で濃度依存的にＨＤＡＣ５の酵素活性を増加させることが分かる。

［試験例３］ＨＤＡＣ５によるメラニン色素生成阻害
ＨＤＡＣ５過剰発現ベクター（ＨＤＡＣ５ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒ）を利用して、ＨＤＡＣ５のタンパク質を対照群細胞より過剰に作り出すメラニン形成細胞を、遠心分離〔エッペンドルフ（ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）、ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ５４１５Ｒ、Ｇｅｒｍａｎｙ〕し、そのペレットを分離して色を観察した。

何も処理しない群を対照群として利用して比較した結果、図３のＡに表したように、ＨＤＡＣ５の過剰発現は濃度依存的にメラニン色素の生成量を減少させた。

水酸化ナトリウムで上記ペレットの中の内容物を溶解させ、メラニン色素に特異的なＯＤ４９０で吸光度を測定して（ＢｉｏＴｅｋ、Ｓｙｎｅｒｇｙ２）、全体タンパク質の量に補正した。

これに対する結果を表した図３によれば、ＨＤＡＣ５過剰発現は濃度依存的にメラニン量の減少を誘導するということが分かる。

配列番号１は、ＩＴＡＣの配列を表す。

Claims

インターフェロン誘導性Ｔ細胞α走化性因子を有効成分として含有することを特徴とする、メラニン形成細胞のメラニン色素生成関連因子の遺伝子発現抑制用の組成物〔ここで、メラニン形成細胞のメラニン色素生成関連因子は、チロシナーゼ（TYR）、MITF、TYRP1、DCT、MART1及びgp100から選ばれる少なくとも一つである〕。
インターフェロン誘導性Ｔ細胞α走化性因子を有効成分として含有することを特徴とする、ヒストン脱アセチル化酵素の遺伝子発現増加用の組成物。
インターフェロン誘導性Ｔ細胞α走化性因子を有効成分として含有することを特徴とする、過色素性皮膚疾患の改善用の組成物。
前記インターフェロン誘導性Ｔ細胞α走化性因子は、組成物の総重量に対して、０．０００１〜０．０００５重量％の量で含有されることを特徴とする請求項１〜３の何れか一項に記載の組成物。
前記インターフェロン誘導性Ｔ細胞α走化性因子の濃度が、５０〜２００ｎｇ／ｍｌであることを特徴とする請求項１〜３の何れか一項に記載の組成物。
前記過色素性皮膚疾患は、シミまたはほくろであることを特徴とする請求項３に記載の組成物。
前記過色素性皮膚疾患は、炎症後の色素沈着によるものであることを特徴とする請求項３に記載の組成物。
前記組成物は、皮膚外用剤組成物であることを特徴とする請求項１〜７の何れか一項に記載の組成物。
前記組成物は、化粧料組成物であることを特徴とする請求項１〜７の何れか一項に記載の組成物。
インターフェロン誘導性Ｔ細胞α走化性因子を有効成分として含有する組成物の、メラニン形成細胞のメラニン色素生成関連因子の遺伝子発現を抑制するための使用方法（但し、ヒトに対する医療行為を除く）〔ここで、メラニン形成細胞のメラニン色素生成関連因子は、チロシナーゼ（TYR）、MITF、TYRP1、DCT、MART1及びgp100から選ばれる少なくとも一つである〕。