TWI680770B - 干擾素誘導性T細胞α趨化因子在製備用於美白皮膚的組合物中的用途 - Google Patents

干擾素誘導性T細胞α趨化因子在製備用於美白皮膚的組合物中的用途 Download PDF

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Abstract

本發明涉及一種干擾素誘導性T細胞α趨化因子在製備用於美白皮膚的組合物中的用途，所述組合物含有趨化因子，尤其含有干擾素誘導性T細胞α趨化因子而減少黑色素形成細胞中的黑色素生成相關因子的基因表現，從而能夠獲得美白皮膚的效果。

Description

干擾素誘導性T細胞α趨化因子在製備用於美白皮膚的組 合物中的用途
本發明涉及一種干擾素誘導性T細胞α趨化因子在製備用於美白皮膚的組合物中的用途，所述組合物含有趨化因子(chemokine)，尤其含有干擾素誘導性T細胞α趨化因子(interferon-inducible T-cell alpha chemoattractant，ITAC)而減少黑色素形成細胞中的黑色素生成相關因子的基因表現，從而能夠獲得美白皮膚的效果。
黑色素形成細胞存在於皮膚表皮的基底表皮(basal epidermis)中，其通過紫外線等外部因素來生成黑色素，並將生成的黑色素傳遞到周圍的角質細胞中，從而起到抑制該角質細胞的DNA受到損傷的作用。然而，因遺傳因素、激素及各種疾病因素等使得這種黑色素形成細胞的活性不能正常地進行調節，導致脫離正常的色素生成步驟，從而引起過多的色素生成及過增殖，由此使得黑色素形成細胞成為引起雀斑或黑斑等色素過度性疾病或白斑症等低色素疾病的原因。
過多的黑色素形成細胞的活性化是指黑色素生成的恆常性因慢性地暴露在紫外線等外部刺激中而被破壞的狀態。皮膚作為得到細微調節的免疫器官，其分泌各種細胞介素(cytokines)、趨化因子，以及其它的炎症介質。紫外線通過刺激這種組成皮膚的免疫細胞，例如，角質細胞、巨噬細胞及T細胞等來誘導免疫物質的分泌。這種免疫物質將免疫細胞積聚在圍繞黑色素形成細胞周圍的微環境中，從而不僅造成慢性炎症狀態，而且因黑色素形成細胞的增殖、移動，以及黑色素的生成過多等而對黑色素細胞本身也產生影響。通常，已知為免疫介質的細胞介素對過敏性、接觸性皮膚炎等皮膚生理起到重要的作用，相反，趨化因子對皮膚生理的作用鮮為人知，趨化因子作為大小為8~14kD左右的小的免疫反應介質，對周圍的細胞表現出選擇性趨化，從而具有誘導細胞的移動及向目標器官積聚的功能。同樣，為了實現用於調節由黑色素形成細胞的過活性化而引起的色素過度性疾病的免疫調節療法，正在對各種免疫物質進行研究，然而，既為皮膚免疫細胞衍生因子又為趨化因子的ITAC對黑色素形成細胞直接產生的影響鮮為人知。
已知因感染或內外部傷口而產生的免疫反應為非常精密的調節機制。然而，當這種免疫系統的精密的調節能力出現問題時，則將產生慢性炎症，這種微環境的變化將對周圍細胞的活性等產生影響。最近有報道稱，介導免疫反應的細胞介素的變化會改變後天修飾的模式，從而改變基因。人們正在對通過後天修飾調節物質來治療慢性炎症，進而治療由炎症引起的癌的方面展開廣泛的研究。然而，對於使用趨化因子來調節黑色素形成細胞本身及細胞周圍的微環境的後天修飾方面的研究還是空白狀態。
現有技術文獻：(專利文獻1)韓國專利公開第10-2013-0056955號(公開日：2013年5月31日)
發明人希望找到一種能夠通過調節免疫系統來調節黑色素形成細胞的活性或細胞周圍的微環境的方法，並且發現，在趨化因子中尤其是在使用ITAC進行處理的情況下，能夠調節黑色素形成細胞的活性化，從而完成了本發明。
因此，本發明的目的在於，提供一種通過利用趨化因子來調節黑色素形成細胞的活性化，從而顯示出皮膚美白效果的組合物。
為了實現上述目的，本發明提供一種干擾素誘導性T細胞α趨化因子在製備用於美白皮膚的組合物中的用途，所述組合物含有干擾素誘導性T細胞α趨化因子。
本發明的組合物可以通過調節黑色素形成細胞的活性化來提供皮膚美白效果，進而對緩解及治療雀斑或黑斑等過色素性皮膚疾病的症狀也有效。
第1圖為示出用ITAC處理的人類黑色素形成細胞中的黑色素生成相關因子的基因表現得到減少的結果的圖表。
第2圖為示出用ITAC處理的人類黑色素形成細胞中的HDAC5的基因表現和蛋白質含量、以及HDAC5的酶活性得到增加的結果的圖表。
第3圖為示出導入HDAC5過表現系統的人類黑色素形成細胞中黑色素的形成得到減少的結果的圖表。
本發明涉及一種能夠對皮膚提供美白效果的組合物，所述效果是通過調節黑色素形成細胞的活性化來調節黑色素生成相關因子的基因表現來實現的，本發明的組合物含有趨化因子，尤其含有干擾素誘導性T細胞α趨化因子(SEQ ID NO：1)作為有效成分。
本發明中使用的ITAC可以從多種的適當的來源(例：人重組ITAC，R&D系統的產品編號672-IT)得到。其可以通過重組DNA方法論，例如，可以通過以下方法來生產。所述方法為允許大量生產純粹的人類ITAC的同時，對編碼人類ITAC的基因進行複製，並在宿主系統中進行表現的方法。作為生物學活性的ITAC的組成單元或片段也可以在本發明中使用。
本發明的組合物，以組合物總重量計，含有0.0001~0.0005重量%的作為有效成分使用的ITAC。如果含量小於0.0001重量%，則不能充分地抑制酪胺酸酶的活性以用於皮膚美白，如果含量大於0.0005重量%，則不適合包含其它成分及製劑化。
根據本發明的組合物提供優異的皮膚美白效果，並且，對緩解及治療色素過度性皮膚病，例如，雀斑或黑斑的症狀、痤瘡等炎症後的色素沉著也有效。
根據本發明的組合物作為皮膚外用劑組合物，可以劑型化為常規的外用製劑、化妝品劑型或藥學劑型。
根據本發明的組合物可以含有化妝品學或皮膚科學上可接受的介質或基材而被劑型化。這可以提供為適合於局部使用的所有劑型，例如，溶液、凝膠、固體、漿糊無水生成物、水包油型乳液、懸浮液、微乳液、微膠囊、微細顆粒或離子型(脂質體)及非離子型的小囊分散劑的形態，或乳霜、化妝水、洗劑、粉、軟膏、噴霧劑或遮瑕棒的形態。另外，可以以泡沫(foam)形態或進一步含有被壓縮的推進劑的氣霧劑組合物的形態使用。這些組合物可以通過該領域中使用的常規方法來製得。
另外，根據本發明的組合物可以含有化妝品學或皮膚科學領域通常使用的輔助劑，例如有脂肪物質、有機溶劑、溶解劑、濃縮劑、凝膠劑、軟化劑、抗氧化劑、懸浮劑、穩定劑、發泡劑(foaming agent)、芳香劑、表面活性劑、水、離子型或非離子型乳化劑、填充劑、螯合劑、錯合劑、保存劑、維生素、阻斷劑、濕潤劑、精油、染料、顏料、親水性或親油性活性劑、脂質小囊或化妝品中通常使用的任何其它成分等。所述輔助劑以在化妝品學或皮膚科學領域中通常使用的量加入。
另外，根據本發明的組合物可以進一步含有藥學上可接受的適當的載體、賦形劑及稀釋劑而劑型化為藥物組合物。
本發明的藥學給藥形態不受特別的限制，但可以單獨或與其它藥學活性化合物組合使用。
根據本發明的藥物組合物根據常規的方法可以分別被劑型化為適合於藥劑學製劑的任何形態而使用，所述藥劑學製劑的任何形態包括洗劑、軟膏、凝膠、霜、貼片(patch)、噴霧劑等皮膚給藥型劑型的形態。
本發明的藥物組合物的優選的給藥量根據使用對象的年齡、性別、體重、症狀、疾病的程度、藥物形態、給藥途徑及期間會有所不同，但所屬領域具有通常知識者可以適當地進行選擇。然而，為了得到優選的效果，本 發明的藥物組合物可以以1mg/kg/天至5000mg/kg/天的範圍給藥，但並不限定於此。可以一天進行一次給藥，也可以分幾次給藥。另外，其給藥量可以根據年齡、性別、體重、疾病的程度及給藥途徑等會有所不同。因此，所述給藥量從任何方面都不能限定本發明的範圍。
另外，為了增加皮膚美白效果，本發明的組合物可以含有皮膚吸收促進物質。
具體實施方式
以下，將通過實施例及試驗例來更加具體地說明本發明的內容。這些實施例僅是為了理解本發明的內容而提出的，本發明的申請專利範圍並不限定於這些實施例及試驗例，可以進行本發明所屬技術領域中已知的變形、取代及插入等，這些也包含在本發明的範圍內。
[參考例1]
黑色素形成細胞的準備
將購自Cascade公司的人類黑色素形成細胞(Normal Human Epidermal Melanocyte-Moderately pigmented，產品編號：C-102-5C)，以6×105的數量接種於100cm2的板中，並將包含人類黑素細胞生長添加成分(HMGS，Human Melanocyte Growth Supplement；產品編號：S-002-5，Gibco)的254培養基(產品編號M-254-500,Gibco)作為基本培養基使用，並使用37℃、5%的CO2細胞培養器來進行培養。當密度達到約70~80%時，進行繼代培養，並在之後進行的試驗中提供了繼代培養的黑色素形成細胞。
[試驗例1]
使用ITAC的人類黑色素形成細胞的黑色素生成相關因子的基因表現減少與否
為了確認使用ITAC是否使黑色素形成細胞的色素生成得到減少，用ITAC來對人類黑色素形成細胞進行處理。並使用R&D系統中製備的產品編號為672-IT的ITAC。
使用200ng/ml濃度的ITAC對上述參考例1中培養的人類黑色素形成細胞進行處理，使用未做任何處理的(non-treated)黑色素細胞作為對照組，並於37℃、5%的CO2中培養48小時。提取出上述培養的人類黑色素細胞的總mRNA來合成cDNA，利用合成的cDNA實施即時聚合酶鏈反應(Real-time PCR，美國應用生物系統公司，7500 Fast)。通過重複實施95℃下15秒、60℃下60秒的40次循環來進行即時PCR實驗，並測定該基因表現相比於對照組基因表現所增加的相對值，利用具代表性的黑色素生成促進因子酪胺酸酶(TYR)、MITF、TYRP1、DCT、MART1、gp100引子來測定樣品之間基因表現的相對差異。引子為美國應用生物系統公司中製備的TaqMan產品，分別如下所述：酪胺酸酶(TYR，產品編號：Hs01099965_m1)、MITF(產品編號：Hs01117294_m1)、TYRP1(產品編號：Hs00167051_m1)、DCT(產品編號：Hs01095856_m1)、MART1(產品編號：Hs00194133_m1)、gp100(精密測量設備實驗所(PMEL)，產品編號：Hs00173854_m1)。測定結果如第1圖所示。
通過第1圖中示出的結果，確認了通過ITAC的處理，色素生成促進因子的基因表現量得到減少，尤其是酪胺酸酶(TYR)、TYRP1、DCT、MART1、gp100的表現量顯著減少。由此，可以知道ITAC通過這種機制而具有黑色素生成抑制能力。
[試驗例2]
由ITAC帶來的組蛋白去乙醯化酶HDAC5的表現量及酶活性的增加
使用50ng/ml的ITAC(產品編號672-IT，R&D系統)對上述參考例1中培養的人類黑色素形成細胞處理48小時。用由此分離的RNA來合成 cDNA，利用HDAC5(Histone deacetylase 5；組蛋白去乙醯化酶)的引子，並通過Q-PCR(美國應用生物系統公司，7500 Fast)來測定mRNA量的變化。通過重複實施95℃下15秒、60℃下60秒的40次循環來進行Q-PCR實驗，並測定該基因表現相比於對照組基因表現所增加的相對值。所述實驗中所使用的HDAC5引子為美國應用生物系統公司製備的TaqMan產品，其產品編號為Hs00608366_m1。
從示出測定結果的第2圖中的A可知，與未進行任何處理的對照組相比，使用50ng/ml的ITAC進行處理時，能夠顯著增加HDAC5的mRNA的表現量。
另外，使用50ng/ml的ITAC(產品編號672-IT，R&D系統)對上述參考例1中培養的人類黑色素形成細胞處理48小時。加載30μg的所述細胞的溶解物，並用西方墨點轉漬法(western blot)確認HDAC5的蛋白質表現量。
從示出其結果的第2圖(B)中可知，HDAC5的蛋白質表現量，在對照組的GAPDH的表現時，沒有出現變化，但是處理ITAC的情況下，顯著增加。
另外，為了驗證使用ITAC帶來的HDAC5的mRNA和蛋白質量的增加對實際酶活性產生的影響，使用50ng/ml或200ng/ml的ITAC(產品編號672-IT，R&D系統)對上述參考例1中培養的人類黑色素形成細胞處理48小時後，製得溶解物。將所述細胞的溶解物維持低溫直到實驗開始之前，以維持酶活性。將10μl的用於HDAC分析的調製緩衝液(HDAC assay buffer)或10μl的含有4μM的作為對照組的HDAC抑制劑TSA(曲古抑菌素A，Trichostatin A)的調製緩衝液接種於96孔盤(wellplate)上。添加20μl的細胞溶解物後，在37℃的恆溫箱中存放10分鐘左右，以使其表現出最大酶活性。添加10μl的4mM的底物，並反應1小時。添加20μl的酶活性擴增溶液(activator solution)，並在常溫下反應20分鐘後，在405nm下測定吸光度(美國伯騰儀器有限公司，Synergy2)。此時，用對照組對比活性(%)來定量算出酶活性。另外，對於該實驗系統，在包含作為廣泛HDAC抑制劑的TSA的實驗組中，當HDAC5酶活性得到70~100%的 抑制時，判斷為本實驗系統有效運作，並利用upstate公司製備的HDAC分析試劑盒(17-374)來測定HDAC5酶活性。
從示出測定結果的第2圖(C)中可知，在本發明中使用的50~200ng/ml的範圍內，HDAC5的酶活性伴隨ICTC濃度的增加而增加。
[試驗例3]
HDAC5引起的對於黑色素生成的抑制
利用HDAC5過表現載體(HDAC5 overexpression vector)，將相對於對照組細胞產生過多的HDAC5的蛋白質的黑色素形成細胞進行離心分離(艾本德公司，centrifuge 5415R，德國)，從而分離其小球(pellet)並觀察顏色。
如第3圖(A)中所示，利用沒有進行任何處理的組作為對照組進行比較的結果，HDAC5的過表現隨著濃度的增加而降低了黑色素生成量。
用氫氧化鈉來溶解所述小球中的內容物，並且在對黑色素有特異性反應的OD490下測定吸光度(美國伯騰儀器有限公司，Synergy2)，並校正為整體蛋白質的量。
從示出其結果的第3圖中可知，HDAC5過表現隨著濃度的增加而誘導黑色素量的減少。
<110> 愛茉莉太平洋股份有限公司
<120> 含有趨化因子的用於美白皮膚的組合物
<140> 104124487
<141> 2015-07-29
<150> 10-2014-0098395
<151> 2014-07-31
<160> 1
<170> Kopatent In 2.0
<210> 1
<211> 94
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ITAC
<400> 1
Figure 104124487-A0305-02-0011-1
Figure 104124487-A0305-02-0012-2

Claims (7)

  1. 一種含有干擾素誘導性T細胞α趨化因子作為有效成分的醫藥組合物的用途，其係用於製備治療或預防色素沉著過度性皮膚疾病的藥物。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中以該醫藥組合物總重量計，該醫藥組合物含有0.0001~0.0005重量%的該干擾素誘導性T細胞α趨化因子。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該醫藥組合物抑制黑色素形成細胞的黑色素生成相關因子的基因表現。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該醫藥組合物增加組蛋白去乙醯化酶的基因表現。
  5. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該色素沉著過度性皮膚疾病為雀斑或黑斑。
  6. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該色素沉著過度性皮膚疾病是由炎症後的色素沉著引起的疾病。
  7. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該醫藥組合物為皮膚外用劑的醫藥組合物。
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