CN106572956B

CN106572956B - 含有趋化因子的皮肤美白用组合物

Info

Publication number: CN106572956B
Application number: CN201580040962.2A
Authority: CN
Inventors: 李恩憬; 韩枝娟; 曹恩敬; 李泰龙; 崔贤贞
Original assignee: Amorepacific Corp
Current assignee: Amorepacific Corp
Priority date: 2014-07-31
Filing date: 2015-07-24
Publication date: 2020-07-03
Anticipated expiration: 2035-07-24
Also published as: KR20160015745A; TW201603826A; CN106572956A; EP3162358B1; WO2016018001A1; US10045926B2; JP6758279B2; TWI680770B; US20170209358A1; KR102152637B1; EP3162358A1; EP3162358A4; JP2017523177A

Abstract

本发明涉及含有趋化因子，特别是ITAC(interferon‑inducible T‑cell alpha chemoattractant；干扰素诱导性T‑细胞α趋化因子)的组合物，该组合物减少在黑色素形成细胞中黑色素生成相关因子的基因表达，从而能够获得皮肤美白效果。

Description

含有趋化因子的皮肤美白用组合物

技术领域

本发明涉及含有趋化因子、特别是ITAC(interferon-inducible T-cell alphachemoattractant；干扰素诱导性T-细胞α趋化因子)的组合物，该组合物能够降低在黑色素形成细胞中黑色素生成的相关因子的基因表达，从而能够获得皮肤美白效果。

背景技术

黑色素形成细胞存在于皮肤表皮的基底层(basal epidermis)，会因紫外线(UV)等外部因素而生成黑色素，并将生成的黑色素传达到周边角质细胞，由此就会起到抑制相应角质细胞的DNA损伤的作用。但是，这些黑色素形成细胞的活性会因遗传因素、激素以及各种疾病因素而被非正常的调节，从而偏离正常的色素生成阶段，引起过度的色素生成及过度增殖，因此就会成为产生褐斑或黑痣等过度色素性疾病，或白斑症等低色素疾病的因素。

黑色素形成细胞的过度活性化是在因紫外线等外部刺激的慢性暴露等而引起生成黑色素中稳定性受破坏的状态。皮肤作为精细调节的免疫器官，分泌各种细胞因子、趋化因子、其他炎症介质。紫外线就会刺激这些构成细胞的免疫细胞，例如角质形成细胞、巨噬细胞、T细胞等，从而诱导免疫物质的分泌。这些免疫物质能够将免疫细胞聚集在围绕在黑色素形成细胞周围的微细环境，因此不仅会形成慢性炎症状态，而且也会影响黑色素形成细胞的增殖、移动、黑色素的过多生成等从而影响到黑色素细胞自身。一般来说，已经公知的是，作为免疫介质被广泛公知的细胞因子对过敏性皮炎、接触性皮肤炎等皮肤生理起到重要作用，相反，不为公知的是，其作为约8～14kD大小的小的免疫反应介质的趋化因子，对周边细胞显示选择性趋化，具有能够诱导细胞移动和向标的器官聚集的性能，该趋化因子在皮肤生理方面具有的该作用还未被公知。与此相同，为了得到用于调节黑色素生成细胞的过度活性化引起的过度色素性疾病的免疫调节方法，对于免疫物质的各种研究正被进行，但是目前为止，即作为皮肤免疫细胞来源因子又是趋化因子的ITAC对黑色素形成细胞的直接影响还未被公知。

人们知道，感染或内外伤引起的免疫反应是非常精密的调节过程。但是，这种免疫系统的精密调节性能存在问题时，就会引起慢性炎症，并且这种微细环境的变化就会影响周边细胞的活性等。最近有报告作为免疫反应介质的细胞因子的变化会改变表观遗传模式，从而会改变基因；目前活跃进行着利用表观遗传调节物质来治疗慢性炎症以及因炎症引起的癌症的研究。但是，对于利用趋化因子的黑色素形成细胞自身，或细胞周边微细环境调节的接近于表观遗传的研究还是全无状态。

现有技术文献：

专利文献1：韩国专利公开第10-2013-0056955号(公开日：2013年5月31日)

发明内容

本发明人为了寻找通过调节免疫系统来调节黑色素形成细胞的活性或细胞周边微细环境的方法，利用趋化因子，特别是ITAC的处理，发现能够调节黑色素形成细胞，由此完成了本发明。

因此，本发明的目的是提供利用趋化因子来调节黑色素形成细胞的活性化，从而显示皮肤美白效果的组合物。

为了达到上述目的，本发明提供含有干扰素诱导性T-细胞α趋化因子的皮肤美白用组合物。

本发明的组合物能够通过调节黑色素形成细胞的活性化来提供皮肤美白效果，而且对缓和及治疗褐斑或黑痣等过度色素性皮肤疾病症状也有效。

附图说明

图1是表示利用ITAC处理的人类黑色素形成细胞中，黑色素生成相关因子的基因表达的减少结果的图谱。

图2是表示利用ITAC处理的人类黑色素形成细胞中，组蛋白去乙酰化酶5抗体(HDAC5)的基因表达和蛋白质量以及HDAC5的酶活性的增加结果的图谱。

图3是表示导入HDAC5过量表达系统的人类黑色素形成细胞中黑色素形成减少结果的图谱。

具体实施方式

本发明涉及通过调节黑色素形成细胞的活性化来调节黑色素生成相关因子的基因表达从而提供皮肤美白效果的组合物，本发明的组合物含有作为有效成分的趋化因子，特别是ITAC(interferon-inducible T-cell alpha chemoattractant；干扰素诱导性T-细胞α趋化因子；序列号1)。

本发明中使用的ITAC可以从多个适当的来源(例如，人类重组ITAC，研究与发展系统(R&D system)的产品号672-IT)获得。这可以通过重组DNA方法论来生产，例如，允许大量纯粹的人类ITAC的生产，克隆将加密人类ITAC的基因，在宿主系统中表达的方法。本发明中也可以使用生物学活性的ITAC的组成单位或断片。

本发明的组合物中作为有效成分使用的ITAC的含量为相对于组合物总重量的0.0001～0.0005重量％。当其含量不足0.0001重量％时，不能充分抑制酪氨酸酶的活性，难以得到皮肤美白效果；而当其含量超过0.0005重量％时，在含有其他成分以及剂型化方面不适当。

本发明涉及的组合物可提供优异的皮肤美白效果，而且对缓和和治疗过度色素性皮肤疾病，例如褐斑或黑痣的症状、粉刺等炎症后的色素沉积也有效。

本发明涉及的组合物为皮肤外用剂组合物，可以剂型化为通常的外用制剂、化妆品剂型或药学剂型。

本发明涉及的组合物可以含有化妆品学或皮肤科学上允许的介质或基剂从而进行剂型化。这可以提供适用于局部的所有剂型，例如，溶液、凝胶、固体、膏状无水生成物，或油相分散在水相里得到的乳液、悬浮液、微乳液、微胶囊、微细颗粒或者离子型(脂质体)和非离子型胶囊分散剂的形态；或者，面霜、护肤水、柔肤水、散粉、软膏、喷剂或遮瑕棒等形态。另外，也能够以泡沫(foam)形态或者进一步含有压缩的推进剂的气溶胶组合物的形态使用。这些组合物可以根据本领域的通常方法制备。

另外，本发明涉及的组合物可以含有化妆品学或皮肤科学领域中通常使用的辅助剂，例如，脂肪物质、有机溶剂、溶解剂、浓缩剂、凝胶剂、软化剂、抗氧化剂、悬浊剂、稳定剂、发泡剂(foaming agent)、芳香剂、表面活性剂、水、离子型或非离子型乳化剂、填充剂、金属离子封锁剂、螯合剂、保鲜剂、维生素、阻断剂、湿润剂、必需油、颜料、染料、亲水性或亲油性活性剂、脂质小囊或化妆品中通常使用的任意其他成分等。上述辅助剂的加入量是在化妆品学或皮肤学科领域中通常使用的量。

另外，本发明涉及的组合物可以进一步含有药学上可允许的适当的载体、赋形剂以及稀释剂，从而剂型化为药学组合物。

本发明的药学给药形态没有特别限定，可以单独使用或与其他药学活性化合物组合使用。

本发明涉及的药学组合物可以使用适用于药剂学制剂的任意形态剂型，上述剂型包括分别通过通常方法剂型化的水剂、软膏、凝胶、面霜、贴片、喷雾剂等经皮给药型剂型。

本发明的药学组合物的优选给药量是根据所用对象的年龄、性别、体重、症状、疾病程度、药物形态、给药途径以及用药期间而不同，可以由本领域人员适当选择。但是，为了得到优选效果，本发明药学组合物的给药量可以为1mg/kg/日至5000mg/kg/日的范围，但是并不限定于此。给药可以为一天一次，也可以分几次。另外，其给药量可以根据年龄、性别、体重、疾病程度、给药途径等而增减。因此，上述给药量在任何方面都不限定本发明的范围。

另外，为了提高皮肤美白效果，本发明的组合物可以含有皮肤吸收促进物质。

下面通过实施例和试验例进一步详细说明本发明的内容。这些实施例或试验例仅仅是为了理解本发明的内容而提出，本发明的权利范围不限定于这些实施例和试验例，本领域技术人员可以实施本领域中通常周知的变化、替换以及插入等，这些也包括在本发明的范围。

参考例1：黑色素形成细胞的准备

将从Cascade公司购买的人类黑色素形成细胞(Normal Human EpidermalMelanocyte-Moderately pigmented，产品号C-102-5C)以6×10⁵个数接种在100cm²的板上，基础培养基使用包括人类黑色素细胞生长添加剂(HMGS(Human Melanocyte GrowthSupplement；产品号S-002-5，Gibco))的254培养基(产品号M-254-500，Gibco)，在37℃、5％CO₂培养箱中培养。达到约70～80％的密度时，进行传代培养，将传代培养的黑色素形成细胞提供给之后进行的实验。

试验例1：利用ITAC处理的人类黑色素形成细胞的黑色素生成相关因子的基因表达的减少与否

为了确认利用ITAC处理的黑色素形成细胞的色素生成是否减少，对人类黑色素形成细胞利用ITAC进行处理。ITAC使用R&D system制备的产品号672-IT。

将ITAC以200ng/ml的浓度处理上述参考例1中培养的人类黑色素形成细胞；作为对照群，将不实施任何处理(non-treated)的黑色素细胞在37℃、5％CO₂中培养48小时。提取上述培养的人类黑色素细胞的总mRNA，合成cDNA，利用合成的cDNA进行实时聚合酶链反应(PCR(Real-time PCR，Applied biosystems(应用生物系统)，7500Fast))。实时PCR实验是将在95℃温度中15秒、在60℃温度中60秒的循环进行总40次反复实施，测定相应基因表达与对照群的基因表达相比增加的相对值，利用典型的黑色素生成促进因子—酪氨酸酶(TYR)、MITF、TYRP1、DCT、MART1、gp100引物(primer)，测定样品之间相对的基因表达差异。引物是在应用生物系统(Applied Biosystems)制备的TaqMan产品，分别如下：酪氨酸酶(TYR，产品号：Hs01099965_m1)、MITF(产品号：Hs01117294_m1)、TYRP1(产品号：Hs00167051_m1)、DCT(产品号：Hs01095856_m1)、MART1(产品号：Hs00194133_m1)、gp100(PMEL，产品号：Hs00173854_m1)。测定结果如图1所示。

通过图1所示的结果可以确认，利用ITAC处理时，减少了色素生成促进因子的基因表达量，特别是，显著减少了酪氨酸酶(TYR)、TYRP1、DCT、MART1、gp100的表达量。由此可知，ITAC以这样的机理具有黑色素生成的抑制性能。

试验例2：利用ITAC处理的组蛋白脱乙酰化酶HDAC5的表达量和酶活性增加

用50ng/ml的ITAC(产品号：672-IT，R&D system)处理上述参考例1中培养的人类黑色素形成细胞48小时。利用从其分离的RNA，合成cDNA，利用HDAC5(Histone deacetylase5；组蛋白脱乙酰化酶)的引物，以Q-PCR(Applied biosystems，7500Fast)测定mRNA量的变化。Q-PCR实验是将在95℃温度15秒、在60℃温度60秒的循环进行总40次反复实施，测定相应基因表达与对照群的基因表达相比增加的相对值。上述实验中利用的HDAC5引物是在Applied Biosystems制备的TaqMan产品，产品号：Hs00608366_m1。

从表示测定结果的图2的A中可知，与没有实施任何处理的对照群相比，利用50ng/ml的ITAC处理时，显著增加了HDAC5的mRNA的表达量。

另外，用50ng/ml的ITAC(产品号：672-IT，R&D system)处理上述参考例1中培养的人类黑色素形成细胞48小时。加载30μg的上述细胞的溶解物，利用蛋白质印迹法(免疫印迹试验，Western Blot)确认HDAC5的蛋白质表达量。

从表示测定结果的图2的B中可知，在对照群的GAPDH的表达上没有变化，而利用ITAC处理时，就会显著增加HDAC5的蛋白质表达量。

为了验证利用ITAC处理的HDAC5的mRNA和蛋白质量的增加对实际酶活性的影响，用50ng/ml或200ng/ml的ITAC(产品号：672-IT，R&D system)处理上述参考例1中培养的人类黑色素形成细胞48小时后，制备成了溶解物。上述细胞的溶解物是在实验之前为止保持低温，从而使其保持酶活性。将用于分析HDAC的10μl配制缓冲剂(HDAC assay buffer)或10μl的含有4μM对照群—HDAC抑制剂TSA(曲古抑菌素A，Trichostatin A)的配制缓冲剂分注在96孔板(well plate)上。添加20μl的细胞溶解物后，为了最大限度体现酶活性，在37℃的培养箱保管约10分钟。加入10μl的4mM基质，反应一小时。加入20μl的酶活性增幅缓冲剂(activator solution)，在常温反应20分钟后，测定405nm的吸光度(BioTek，Synergy2)。此时，以对照群对比活性(％)定量计算酶活性。另外，在该实验系中，含有广范围HDAC抑制剂的TSA的实验群中HDAC5的酶活性被抑制70～100％时，可以判断为本实验系有效工作，HDAC5酶活性测定是利用upstate制备的HDAC assay kit(17-374)测定。

从测定结果所示的图2的C可知，ITAC在本发明中使用的50～200ng/ml的范围，就会依赖于浓度来增加HDAC5的酶活性。

试验例3：利用HDAC5处理的黑色素生成抑制

利用HDAC5的过量表达载体(HDAC5overexpression vector)，使HDAC5的蛋白质比对照群细胞的量多，并对其黑色素生成细胞实施离心分离(eppendorf，centrifuge 5415R，Germany)，分离其颗粒，并观察颜色。

将没有实施处理的群作为对照群利用，进行比较的结果如图3的A所示，HDAC5的过量表达依赖于浓度减少了黑色素生成量。

用氢氧化钠溶解上述颗粒中的内容物，测定黑色素特有的OD490的吸光度(BioTek，Synergy2)，用整体蛋白质量进行了修正。

从表示测定结果的图3中可知，HDAC5的过量表达能够依赖于浓度来诱导黑色素量的减少。

序列目录

序列号1表示ITAC的序列。

SEQUENCE LISTING

<110> 株式会社爱茉莉太平洋

<120> 含有趋化因子的皮肤美白用组合物

<130> P43526YOL

<160> 1

<170> KopatentIn 2.0

<210> 1

<211> 94

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ITAC

<400> 1

Met Ser Val Lys Gly Met Ala Ile Ala Leu Ala Val Ile Leu Cys Ala

1 5 10 15

Thr Val Val Gln Gly Phe Pro Met Phe Lys Arg Gly Arg Cys Leu Cys

20 25 30

Ile Gly Pro Gly Val Lys Ala Val Lys Val Ala Asp Ile Glu Lys Ala

35 40 45

Ser Ile Met Tyr Pro Ser Asn Asn Cys Asp Lys Ile Glu Val Ile Ile

50 55 60

Thr Leu Lys Glu Asn Lys Gly Gln Arg Cys Leu Asn Pro Lys Ser Lys

65 70 75 80

Gln Ala Arg Leu Ile Ile Lys Lys Val Glu Arg Lys Asn Phe

85 90

Claims

1.一种含有作为有效成分的干扰素诱导性T-细胞α趋化因子的组合物在制备用于预防和治疗过度色素性皮肤疾病的药学组合物中的用途，其中，干扰素诱导性T-细胞α趋化因子的含量为相对于组合物总重量的0.0001～0.0005重量％。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述组合物抑制黑色素形成细胞的黑色素生成相关因子的基因表达。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述组合物增加组蛋白脱乙酰化酶的基因表达。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述过度色素性皮肤疾病为褐斑或黑痣。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述过度色素性皮肤疾病由炎症后的色素沉着引起。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述组合物配制为皮肤外用剂组合物的形式。